CN115227774A

CN115227774A - 大白蝴蝶兰萃取物用于制备抑制糖化终产物生成的组合物的用途

Info

Publication number: CN115227774A
Application number: CN202210701346.9A
Authority: CN
Inventors: 林咏翔
Original assignee: TCI Co Ltd
Current assignee: TCI Co Ltd
Priority date: 2019-08-14
Filing date: 2019-12-11
Publication date: 2022-10-25
Also published as: TW202106324A; TW202106329A; CN112386643A; TWI772723B; CN112386655A; CN112386627A; TWI819235B; CN112386665B; TW202106330A; TW202106323A; TWI729618B; TWI809299B; CN112386534A; CN112386665A; TW202106328A

Abstract

本发明涉及植物萃取物，特别是关于一大白蝴蝶兰萃取物用于制备抑制糖化终产物生成的组合物的用途。本发明提供一种大白蝴蝶兰萃取物用于抑制糖化终产物生成的用途，以及大白蝴蝶兰萃取物用于制备提升角蛋白14基因、及母抗Dpp同源物基因表现量的组合物的用途，所述大白蝴蝶兰萃取物是大白蝴蝶兰以水、醇、或醇水混合物的溶剂所萃取而得。所述大白蝴蝶兰萃取物能提升清除糖化终产物的能力、提升KRT14基因、及SMAD1基因的表现量、提高角质细胞分泌玻尿酸的量、提升个体皮肤的光泽度，有助于推迟老化的进展、维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，并提升皮肤保水力、及改善皮肤暗沉、枯黄的情况使皮肤透亮有光泽。

Description

大白蝴蝶兰萃取物用于制备抑制糖化终产物生成的组合物的用途

本申请为申请人根据母案申请(申请号：201911264809.4，发明名称：大白蝴蝶兰萃取物用于制备抗醣化与改善皮肤外观的组合物的用途)所提出的分案申请。

技术领域

本发明涉及植物萃取物，特别是关于一大白蝴蝶兰萃取物用于制备抑制糖化终产物生成的组合物的用途。

背景技术

表皮层为皮肤的最外层，由外往内依序为角质层、颗粒层、有棘层及基底层，表皮层主要由基底层中未分化的圆柱型角质细胞持续向上进行分化形成，此过程称为角质化。角质细胞内含水量高，随着细胞向上代谢分化，角质细胞形状会逐渐变成扁平状，且细胞核及胞器开始退化萎缩，并在角质层形成不具细胞核与胞器的死细胞。表皮层的主要功能为使皮肤保水，并形成皮肤屏障以抵御各种外来伤害，其中表皮层最外层由一弱酸性的皮脂膜以及如砖墙结构的角质层所构成，此屏障能锁住皮肤的水分和油脂、抵抗皮肤表面病菌入侵，及对抗外界异物及紫外光等伤害，对人体有非常重要的保护作用。

表皮层中的角质层，其角质细胞虽然为死细胞，但其主要成分为角蛋白(keratin)，角蛋白能吸收水分使皮肤保持湿润，角质细胞也会分泌如玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层皮肤屏障的结构完整，以防止皮肤水分散失及形成完整防护。当皮肤接触过冷或过热的环境以及照射紫外光等刺激，会导致角质细胞无法维持正常的代谢循环，且皮肤保水能力也会下降，并导致皮肤表皮层屏障受损，让皮肤变得粗糙、干燥脱屑、脆弱易受刺激、敏感泛红，因此角质层的健康与保水能力对于抵御外来伤害着实非常重要。

然而，随着年纪渐长皮肤会逐渐地老化(Ageing)，皮肤老化形成原因与过程非常地复杂，且牵涉了无数的生理现象，其中紫外线伤害、自由基伤害、胶原蛋白减少、细胞更新减缓、异常细胞的出现、皮肤脂肪减少、细胞间质缺乏、细胞生长休止、荷尔蒙下降等是较常见的因素。但截至目前为止，市售的皮肤抗老化产品大多只能着手在增加抗氧化活性，并无法直接且有效地改善或推迟皮肤老化的发生。

糖化终产物(Advanced Glycation End Products,AGEs)是一群高度氧化的化合物，因此被认为是一种糖毒素(Glycotoxin)，研究显示糖化终产物会与细胞表面的接受器结合，而改变其结构与功能，并促使细胞的氧化压力与发炎反应增加，更与糖尿病、动脉硬化及肾脏慢性疾病等的形成关系密不可分。而除了人体正常代谢过程中会产生糖化终产物外，许多加工食品中也会含有糖化终产物，研究也已指出避免从食物摄取糖化终产物，能有助于推迟慢性疾病与老化的进展。

综合上面所述，为了改善因角质细胞受损、保水能力下降、以及皮肤老化所导致皮肤变得脆弱、易敏等问题，开发一种能直接且有效地改善或推迟皮肤老化发生，同时又能有效维持角质细胞的正常生理代谢、维持角质层结构完整的组合物、及增加抗醣化活性的有效成分组成的，着实有其必要性。

发明内容

缘此，本发明的一目的在提供一种大白蝴蝶兰萃取物用于制备提升角蛋白14(Keratin 14,KRT14)基因、及母抗Dpp同源物(Mothers against decapentaplegichomolog,SMAD)基因表现量的组合物的用途，其中该大白蝴蝶兰萃取物是以一溶剂萃取一大白蝴蝶兰所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。

本发明的又一目的在提供一种大白蝴蝶兰萃取物用于制备抗醣化及改善皮肤外观的组合物的用途，其中该大白蝴蝶兰萃取物是以一溶剂萃取一大白蝴蝶兰所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物。

在本发明的一实施例中，该大白蝴蝶兰与该溶剂的重量比为1-5:5-20；且该萃取的温度是75-95℃。

在本发明的又一实施例中，该大白蝴蝶兰萃取物是维持皮肤角质细胞排列、及使皮肤角质层结构完整。

在本发明的又一实施例中，该大白蝴蝶兰萃取物是提高角质细胞分泌玻尿酸的量。

在本发明的又一实施例中，该大白蝴蝶兰萃取物是提升皮肤的保水力。

在本发明的又一实施例中，该大白蝴蝶兰萃取物是提升个体皮肤的光泽度。

在本发明的另一实施例中，该大白蝴蝶兰萃取物的浓度为至少0.0625mg/mL。

本发明的大白蝴蝶兰萃取物具有强效的抑制糖化反应的活性，可有效提升清除糖化终产物的能力，抗醣化能够抑制非酵素褐变，以避免体内功能性蛋白质的变性，有助于推迟慢性疾病与老化的进展；还能有效提高角质细胞分泌玻尿酸的量、有效提升皮肤细胞中KRT14基因、及SMAD1基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，以使皮肤角质层结构完整，并提升皮肤保水力，及提升皮肤屏障及防御功能，以防止皮肤水分散失，使皮肤处于保水的状态、及维持皮肤年轻光滑有弹性；另外，其亦能有效提升个体皮肤的光泽度，具有改善皮肤暗沉、枯黄的情况使皮肤透亮有光泽的功效。因此，本发明的大白蝴蝶兰萃取物可用于制备抗醣化与改善皮肤外观的组合物的用途，其中该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。

以下将配合图式进一步说明本发明的实施方式，下述所列举的实施例是用以阐明本发明，并非用以限定本发明的范围，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰，因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

附图说明

图1是本发明的一实施例的大白蝴蝶兰萃取物抗醣化活性的效果的柱形图；。

图2是本发明的一实施例的大白蝴蝶兰萃取物促进细胞分泌玻尿酸的效果的柱形图；

图3是本发明的一实施例的大白蝴蝶兰萃取物提升KRT14基因、及SMAD1基因表现量的效果的柱形图；*p<0.05；**p<0.01；

图4是本发明的一实施例的大白蝴蝶兰萃取物提升个体皮肤光泽度的效果的柱形图。

具体实施方式

本文中所使用数值为近似值，所有实验数据皆表示在20％的范围内，较佳为在10％的范围内，最佳为在5％的范围内。

使用Excel软件进行统计分析。数据以平均值±标准偏差(SD)表示，各组之间的差异以学生t检验(student's t-test)分析。

大白蝴蝶兰(Phaaenopsis Sogo Yukidianukid或Phaaenopsis Sogo YukidianV3)为兰科(Orchidaceae)蝴蝶兰属(Phalaenopsis)单轴多年生草本植物，为Phal.Yukimai与Phal.TaisucoKochdian配种所得的兰花品系。

如本文中所使用的，用语「大白蝴蝶兰萃取物」意为大白蝴蝶兰的花与溶剂以1-5:5-20(w/w)比例经一特定时间与温度萃取而得。

本文所述的「有效浓度」或「有效量」是表示能有效提升清除糖化终产物的能力、有效提高角质细胞分泌玻尿酸的量、有效提升皮肤细胞中KRT14基因、及SMAD1基因的表现量、及/或有效提升个体皮肤的光泽度所需本发明的大白蝴蝶兰萃取物的浓度。有效浓度依所作用的对象而可能不同，但可藉由例如剂量递增试验(Dose escalation)以实验决定其有效浓度。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于非经肠地道(parenterally)或局部地(topically)投药的剂型，这包括，但不限于：注射品(injection)[例如，无菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)]、无菌的粉末(sterile powder)、外部制剂(external preparation)以及类似物。

依据本发明，医药品可进一步包含有一被广泛地使用于药物制造技术的医药上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该医药上可接受的载剂可包含一或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、黏结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、安定剂(stabilizingagent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorptiondelaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，该医药上可接受的载剂包含有一选自于由下列所构成的群组中的溶剂：水、生理盐水(normalsaline)、磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline,PBS)、含有醇的水性溶液(aqueous solution containing alcohol)以及它们的组合。

依据本发明，该医药品可以一选自于由下列所构成的群组中的非经肠道途径(parenteral routes)来投药：皮下注射(subcutaneous injection)、表皮内注射(intraepidermal injection)、皮内注射(intradermal injection)以及病灶内注射(intralesional injection)。

依据本发明，医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。

依据本发明，该外部制剂是藉由将本发明的医药品与一为熟习此项技艺者所详知的基底(base)相混合而被制备。

依据本发明，该基底可包含有一或多种选自于下列的添加剂(additives)：水、醇(alcohols)、甘醇(glycol)、碳氢化合物(hydrocarbons)[诸如石油胶(petroleum,jelly)以及白凡士林(white petrolatum,)]、蜡(wax)[诸如石蜡(paraffin)以及黄蜡(yellowwax)]、保存剂(preserving agents)、抗氧化剂(antioxidants)、界面活性剂(surfactants)、吸收增强剂(absorption enhancers)、安定剂(stabilizing agents)、胶凝剂(gelling agents)[诸如卡波普

974P

微结晶纤维素(microcrystalline cellulose)以及羧基甲基纤维素(carboxymethylcellulose)]、活性剂(active agents)、保湿剂(humectants)、气味吸收剂(odor absorbers)、香料(fragrances)、pH调整剂(pH adjusting agents)、螯合剂(chelating agents)、乳化剂(emulsifiers)、闭塞剂(occlusive agents)、软化剂(emollients)、增稠剂(thickeners)、助溶剂(solubilizing agents)、渗透增强剂(penetration enhancers)、抗刺激剂(anti-irritants)、着色剂(colorants)以及推进剂(propellants)等。有关这些添加剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可进一步包含有一被广泛地使用于保养品制造技术的可接受的佐剂(acceptable adjuvant)。例如，该可接受的佐剂可包含有一或多种选自于下列的试剂：溶剂、胶凝剂、活性剂、防腐剂、抗氧化剂、遮蔽剂(screening agent)、螯合剂、界面活性剂、染色试剂(coloring agent)、增稠剂(thickening agent)、填料(filler)、香料以及气味吸收剂。有关这些试剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，保养品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成一适合于护肤(skincare)或化妆(makeup)的形式，这包括，但不限于：水性溶液(aqueous solution)、水-醇溶液(aqueous-alcohol solution)或油性溶液(oily solution)、呈水包油型(oil-in-water type)、油包水型(water-in-oil type)或复合型的乳剂、凝胶、软膏、乳霜、面膜(mask)、贴片、贴布(pack)、擦剂、粉末、气溶胶、喷雾、乳液、乳浆、糊剂、泡沫、分散液、滴剂、慕斯(mousse)、防晒油(sunblock)、化妆水(tonic water)、粉底(foundation)、卸妆产品(makeup remover products)、肥皂(soap)以及其他身体清洁产品(body cleansingproducts)等。

依据本发明，保养品亦可与一或多种选自于下列的已知活性的外用剂

(external use agents)一起合并使用：美白剂(whitening agents)[诸如维生素A酸(tretinoin)、儿茶素(catechin)、曲酸、熊果苷以及维生素C]、保湿剂、抗发炎剂(anti-inflammatory agents)、杀菌剂(bactericides)、紫外线吸收剂(ultravioletabsorbers)、植物萃取物(plant extracts)[诸如芦荟萃取物(aloe extract)]、皮肤营养剂(skin nutrients)、麻醉剂(anesthetics)、抗痘剂(anti-acne agents)、止痒剂(antipruritics)、止痛剂(analgesics)、抗皮肤炎剂(antidermatitis agents)、抗过角化剂(antihyperkeratolytic agents)、抗干皮肤剂(anti-dry skin agents)、抗汗剂(antipsoriatic agents)、抗老化剂(antiaging agents)、抗皱剂(antiwrinkle agents)、抗皮脂溢出剂(antiseborrheic agents)、伤口治疗剂(wound-healing agents)、皮质类固醇(corticosteroids)以及激素(hormones)。有关这些外用剂的选用与数量是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。

依据本发明，食品产品可被当作食品添加物(food additive)，藉由习知方法于原料制备时添加，或是于食品的制作过程中添加，而与任一种可食性材料配制成供人类与非人类动物摄食的食品产品。

依据本发明，食品产品的种类包括但不限于：饮料(beverages)、发酵食品(fermented foods)、烘培产品(bakery products)、健康食品(health foods)以及膳食补充品(dietary supplements)。

本发明提供一种大白蝴蝶兰萃取物用于抗醣化与改善皮肤外观的用途，本发明的大白蝴蝶兰萃取物是以一溶剂萃取一大白蝴蝶兰所获得，该溶剂为水、醇、或醇水混合物，本发明的大白蝴蝶兰萃取物具有强效的抗醣化活性、亦能有效提高角质细胞分泌玻尿酸的量、有效提升皮肤细胞中KRT14基因、及SMAD1基因的表现量、及/或能有效提升个体皮肤的光泽度。

同时，本发明的大白蝴蝶兰萃取物可用于制备抗醣化与改善皮肤外观的组合物，其中可包含一有效量的大白蝴蝶兰萃取物及一医药上可接受的载体，该组合物是一医药品、一食品或一保养品。

以下将详细说明本发明大白蝴蝶兰萃取物的详细萃取方法、该大白蝴蝶兰萃取物抗醣化活性的功效的测试、该大白蝴蝶兰萃取物促进角质细胞分泌玻尿酸的功效的测试、该大白蝴蝶兰萃取物提升KRT14基因、及SMAD1基因表现量的功效的测试、及该大白蝴蝶兰萃取物于提升个体皮肤光泽度的功效的测试，以证实本发明的大白蝴蝶兰萃取物能有效提升清除糖化终产物的能力、有效维持皮肤角质细胞排列、及/或有效提升个体皮肤的光泽度，能有助于推迟慢性疾病与老化的进展，并能使皮肤角质层结构完整、提升皮肤保水力，及提升皮肤屏障及防御功能，亦能改善皮肤暗沉、枯黄的情况使皮肤透亮有光泽。

实施例1本发明的大白蝴蝶兰萃取物的制备方法

在本发明的一实施例中，将大白蝴蝶兰的花清洗并切成每块12毫米的大小后，取洗净后的大白蝴蝶兰与水、醇、或醇水混合物的萃取溶剂，萃取溶剂较佳为水，以1-5:5-20的体积比混合，均质后在溶剂中以75-95℃进行萃取0.5-3小时后，将粗萃取后冷却至室温后进行离心，离心条件为以300g离心10分钟后取得上清液；再以400目的滤网过滤该上清液以获得滤液。最后，将该滤液于50-60℃进行减压浓缩后，即得到本发明的大白蝴蝶兰萃取物。

实施例2本发明的大白蝴蝶兰萃取物抗醣化(AGEs)的功效

本实施例是为了进行本发明大白蝴蝶兰萃取物抗醣化活性的功效的测试，以抑制D-果糖(D-fructose)使胶原蛋白(Collagen)产生糖化的效率，进行糖化活性的定量；抗醣化能够抑制非酵素褐变，以避免体内功能性蛋白质的变性。首先，分别取0.2mL浓度为2.5％的本发明的大白蝴蝶兰萃取物溶液，以及0.2mL的水作为控制组溶液，并加入0.2mL的60mg/mL的胶原蛋白溶液(以200mM的磷酸盐缓冲溶液配置，pH7.4，其中含有0.06％的迭氮化钠(Sodium azide,NaN₃))以及0.2mL的1.5M的D-果糖溶液(以200mM的磷酸盐缓冲液配置，pH7.4)混合均匀后，再取0.1mL的混合溶液于激发光360nm、放射光460nm下测定荧光值，以此为反应前的零点，并取0.1mL的混合溶液于50℃下培养24小时后，取出0.1mL测定荧光值，以此为反应的终点；其中该大白蝴蝶兰萃取物是以水为溶剂进行萃取。并以等量的3mM的氨基胍(Aminoguanidine,AG)(以200mM的磷酸盐缓冲液配置，pH7.4)回溶溶剂至相等体积以作为正对照组，其中已知Aminoguanidine(AG)具有抑制糖化作用的功效。最后，以下列公式计算清除糖化终产物能力的效率，以此代表各组样品抗醣化的活性。

本发明的大白蝴蝶兰萃取物抗醣化活性的功效测试结果如图1所示。经本发明的大白蝴蝶兰萃取物作用后，能够减少约20％的糖化终产物的生成量，此结果显示本发明的大白蝴蝶兰萃取物具有强效的抑制糖化反应的活性，可有效提升清除糖化终产物的能力，有助于推迟慢性疾病与老化的进展。

实施例3本发明的大白蝴蝶兰萃取物促进角质细胞分泌玻尿酸的功效

由于已知角质细胞会分泌玻尿酸等物质作为细胞间质，以维持表皮层屏障的完整，及防止皮肤水分散失及形成完整防护，因此本发明的一实施例以人类初代皮肤角质细胞(Human primary epidermal keratinocytes,HPEK)进行本发明的大白蝴蝶兰萃取物促进角质细胞分泌玻尿酸的功效的测试。该人类初级皮肤角质细胞是购自CELLnTEC公司(瑞士)编号HPEK-50，该细胞是培养于无血清的角质细胞培养液(Keratinocyte-SFM)(购自Thermo公司，美国，编号为

#17005042)，并于含有5％CO₂的37℃细胞培养箱中进行培养。

首先，于96孔培养盘中，每孔加入200μL的上述培养液并植入1x10⁴个人类初代皮肤角质细胞，并于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成三组：(1)仅加入细胞培养液的控制组、(2)加入0.125mg/mL本发明的大白蝴蝶兰萃取物的实验组、及(3)加入0.0625mg/mL本发明的大白蝴蝶兰萃取物的实验组，并将各组分别于37℃培养24小时后，在不扰动贴附细胞的情况下，每孔分别收集100μL的培养液；其中该大白蝴蝶兰萃取物是以水为溶剂进行萃取。

接着，利用玻尿酸(Human Hyaluronic Acid,HA又称人类透明质酸)的ELISA分析检测试剂套组(购自Cusabio Biotech公司，中国，编号CSB-E04805h)进行分析。首先，于在底部覆盖一层人类透明质酸捕捉抗体的96孔培养盘中，加入前述100μL的每孔收集的培养液，或溶于含1％牛血清白蛋白的磷酸盐缓冲溶液的标准品，于37℃下与该捕捉抗体进行结合2小时，时间到后将液体移除，并直接于每孔中加入100μL的生物素(Biotin)侦测抗体，于37℃下侦测捕捉抗体1小时后，移除每孔中的溶液，并以200μL的清洗溶液(Washingsolution，其中含0.05％聚氧乙烯无水山梨醇单月桂酸酯(tween 20)的磷酸盐缓冲溶液)冲洗96孔培养盘中每个孔洞共3次；其中每次加入清洗溶液后须静置2分钟，并且须完全地去除所有清洗溶液，特别是最后一次清洗后须以抽吸(Aspirating)或倾析(Decanting)去除任何剩余的清洗溶液，并将96孔培养盘倒置以干净的纸巾擦拭干剩余的清洗溶液，以使后续量测的结果较为准确。接着，再于每孔中加入100μL的1倍辣根过氧化物酶标记抗生物素蛋白(1x HRP-avidin)，并于37℃下作用1小时，以使其与侦测抗体进行结合，接着再以前述方法加入200μL的清洗溶液，冲洗96孔培养盘中每个孔洞共5次，接着再于每孔中加入90μL的TMB(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)呈色溶液，于37℃下作用15-30分钟并且避光，再于每孔中加入50μL的终止溶液以终止反应，其中以轻拍的方式以使溶液混合均匀，最后以酵素免疫分析仪(ELISA reader,BioTek)测量其5分钟内于450nm的吸光值。再以Excel软件进行student t-test以决定各组的变异系数是否在统计上具有显著差异性(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

本发明的大白蝴蝶兰萃取物促进角质细胞分泌玻尿酸的功效的测试结果如图2所示。人类初代皮肤角质细胞经0.125mg/mL本发明的大白蝴蝶兰萃取物作用后，相较于控制组，能提高11.83％的玻尿酸分泌量；而经0.0625mg/mL本发明的大白蝴蝶兰萃取物作用后，相较于控制组，能提高24.75％的玻尿酸分泌量。此结果显示本发明的大白蝴蝶兰萃取物能有效提高角质细胞分泌玻尿酸的量，能有效使皮肤保水力提升，以使皮肤角质层结构完整，并提升皮肤屏障功能。

实施例4本发明的大白蝴蝶兰萃取物提升角质细胞中保湿基因表现量的功效

本发明的一实施例以人类初代皮肤角质细胞HPEK-50进行本发明的大白蝴蝶兰萃取物提升KRT14基因、及SMAD1基因表现量的功效的测试。首先，将1.5x10⁵个人类初代皮肤角质细胞培养于每孔含有2mL上述培养液的6孔培养盘中，于37℃培养16-18小时，接着将细胞分成以下两组：(1)仅加入细胞培养液的控制组、及(2)加入0.25mg/mL本发明的大白蝴蝶兰萃取物的实验组，并将该二组分别于37℃下作用24小时后，测试各组人类初代皮肤角质细胞中目标基因的表现量；其中该大白蝴蝶兰萃取物是以水为溶剂进行萃取。首先，将该两组的细胞以细胞裂解液(RB buffer，购自Geanaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)回收细胞后，使用RNA萃取试剂套组(购自Geneaid公司，中国台湾，Cat No.RBD300)分别收集该二组细胞内的总RNA，接着利用

III反转录酶(购自Invitrogene公司，美国，编号18080-051)以2000ng的萃取RNA为模板，并以表一的组合引物及反转录酶进行反转录作用，以产生该些基因的mRNA所相应的cDNA产物，接着利用ABI StepOnePlus^TM Real-TimePCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美国)，以及KAPA SYBR FAST(购自Sigma公司，美国，编号38220000000)将该二组反转录后产物分别以表一的组合引物进行定量实时聚合酶连锁反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)试验，条件为95℃反应1秒，60℃反应20秒，总共40个循环。用以定量该二组人类初代皮肤角质细胞中KRT14基因、及SMAD1基因的mRNA的表现量，其中定量数值是取由阈值循环数(Ct)，而目标基因的mRNA相对量是推导自方程式2^-ΔΔCt，其中ΔC_T＝C_{T比较组或实验组目标基因/控制组目标基因}-C_T _TBP(TATA结合蛋白，TATA-binding protein)；ΔΔC_T＝C_{T比较组或实验组目标基因}-C_{T控制组目标基因}；各组中各基因的差异倍数(fold change)则为2^-ΔΔCt。接着，再利用Excel软件决定变异系数与是否在统计上具有显著差异(*p值<0.05；**p值<0.01；***p值<0.001)。

表一、定量实时反转录聚合酶连锁反应的组合引物

本发明的大白蝴蝶兰萃取物提升KRT14基因、及SMAD1基因表现量的功效的测试结果如图3所示。其中，KRT会形成角蛋微丝，与维持角质细胞结构相关；而SMAD是一种讯号传递因子与调控胶原蛋白表现相关。人类初代皮肤角质细胞经0.25mg/mL本发明的大白蝴蝶兰萃取物作用后，相较于控制组，能分别显著提升KRT14基因、及SMAD1基因的表现量达控制组的1.24倍、及1.28倍。此结果显示本发明的大白蝴蝶兰萃取物能有效提升皮肤细胞中KRT14基因、及SMAD1基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，使皮肤角质层结构完整，以强化皮肤屏障及防御功能、防止皮肤水分散失，使皮肤处于保水的状态、及维持皮肤年轻光滑有弹性。

实施例5本发明的大白蝴蝶兰萃取物提升个体皮肤光泽度的功效

本发明的一实施例为进行本发明的大白蝴蝶兰萃取物于提升个体皮肤光泽度的功效的测试。首先，制备添加1％(w/w)本发明的大白蝴蝶兰萃取物的精华液的大白蝴蝶兰萃取物面膜；以及不含本发明大白蝴蝶兰萃取物的精华液的面膜作为控制组；其中，该精华液成分皆为水、馨鲜酮、己二醇、1,3-丁二醇、三仙胶、增稠剂以及三乙醇胺；其中该大白蝴蝶兰萃取物是以水为溶剂进行萃取。接着，进行瞬效实验检测，募集8位受试者，每位受试者于每日早晚清洗完脸部后，将控制组面膜、及含本发明的大白蝴蝶兰萃取物的面膜分别贴敷于左右半脸的皮肤15分钟后取下，并以指腹稍加按摩促进吸收，并于敷面膜前与敷面膜后以C+K

MPA 580多探头肤质分析仪(C+K electronic，德国)中的Glossymeter_GL200光泽探头进行全脸皮肤光泽度的检测。藉由仪器打到皮肤表面的反射光和散射光，可以精确且便利的测试肌肤的光泽度，其平行白光是由探头顶部的LED所产生；其中，以敷面膜前的肌肤光泽度为100％，相对于敷面膜前所得出的百分比，可得到敷面膜后相对的肌肤光泽度改善百分比。

本发明的大白蝴蝶兰萃取物于提升个体皮肤光泽度的结果如图4所示。使用含本发明的大白蝴蝶兰萃取物的面膜后，比使用前提高了皮肤光泽度10.4％，未含本发明的大白蝴蝶兰萃取物的控制组仅提高3.6％。此结果显示本发明的大白蝴蝶兰萃取物能有效提升个体皮肤的光泽度，具有改善皮肤暗沉、枯黄的情况使皮肤透亮有光泽的功效。

综上所述，本发明的大白蝴蝶兰萃取物具有强效的抑制糖化反应的活性，可有效提升清除糖化终产物的能力，有助于推迟慢性疾病与老化的进展；还能有效提高角质细胞分泌玻尿酸的量、有效提升皮肤细胞中KRT14基因、及SMAD1基因的表现量，能有效维持皮肤角质细胞排列，以使皮肤角质层结构完整，并提升皮肤保水力，及提升皮肤屏障及防御功能，以防止皮肤水分散失，使皮肤处于保水的状态、及维持皮肤年轻光滑有弹性；另外，其亦能有效提升个体皮肤的光泽度，具有改善皮肤暗沉、枯黄的情况使皮肤透亮有光泽的功效。因此，本发明的大白蝴蝶兰萃取物可用于制备抗醣化与改善皮肤外观的组合物的用途，其中该组合物是一医药品、一食品或一保养品，可藉由口服、皮肤涂抹等方式给予一个体。

【序列表】

<110>百岳特生物技术（上海）有限公司

<120>大白蝴蝶兰萃取物用于制备抑制糖化终产物生成的组合物的用途

<150>US 62/886,404

<151>2019-08-14

<160> 6

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400> 1

ttctgaacgagatgcgtgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400> 2

gcagctcaatctccaggttc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400> 3

ctgactctcgggttctctgg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400> 4

tccaccatgtcatcctcaaa 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400> 5

tataatcccaagcggtttgc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成引物

<400> 6

gctggaaaacccaacttctg 20

Claims

1.一种大白蝴蝶兰萃取物用于制备提升角蛋白14基因、及母抗Dpp同源物基因表现量的组合物的非医药用途，其特征在于，所述大白蝴蝶兰萃取物是以一溶剂于75-95℃下萃取一大白蝴蝶兰所获得，所述溶剂为水。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述大白蝴蝶兰萃取物是维持皮肤角质细胞排列、及使皮肤角质层结构完整。

3.一种大白蝴蝶兰萃取物用于制备抑制糖化终产物生成的组合物的用途，其特征在于,所述大白蝴蝶兰萃取物是以一溶剂萃取一大白蝴蝶兰所获得，所述溶剂为水、醇、或醇水混合物。

4.根据权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述大白蝴蝶兰与所述溶剂的重量比为1-5:5-20。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述萃取的温度是75-95℃。

6.根据权利要求1或3所述的用途，其特征在于，所述大白蝴蝶兰萃取物的浓度为至少0.0625mg/mL。

7.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述组合物进一步包含一医药上可接受的载体。

8.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组合物是一食品或一保养品。

9.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述组合物是一医药品、一食品或一保养品。