BR112015031018B1 - Composição compreendendo um tetrapeptídeo para tratamento de condições da pele - Google Patents

Abstract

TETRAPEPTÍDEO ISOLADO, COMPOSIÇÃO E COMPOSIÇÃO PARA USO. Tetrapeptídeos que consistem em (I ou V)-X1-K-X2, o nde X1 pode ser selecionado a partir de E, Q ou K, e X2 pode se r selecionado a partir de M, F, I, W, ou V, exibem diversas bioatividades. Eles são moléculas efetoras multifuncionais para estimular a migração de queratinócitos; neutralizar o efeito pró- inflamatório dos componentes da parede celular bacteriana, tais como ácidos lipoteicoicos de bactérias gram-positivas S. aureus; e induzir angiogênese em células endoteliais da veia umbilical humana em cultura. A down-regulação da condição pró-inflamatória também foi demonstrada usando modelo de pele com psoríase SOR-300- FT para o peptídeo representativo.A bioatividade também foi comprovada pelo estudo de perfilagem genética sobre o tratamento de tecidos de pele normais usando substitutos de pele EPIDERM TM . Os peptídeos da invenção com diversas bioatividades são úteis para o tratamento de várias condições da pele incluindo, mas não limitadas a, feridas agudas ou crônicas, estrias de distensão, envelhecimento da pele, controle de pelos, peles em inflamação, tais como psoríase, dermatite atópica e rosácea, e para a remoção de pelos indesejados ou para condições tais como a remoção de pólipos fibroepiteliais.(...).

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório No. US61/835.424, depositado em 14 de junho de 2013, o qual é incorporado neste documento por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO

[002] A presente invenção refere-se a tetrapeptídeos que têm atividade biológica, cosmética e terapêutica. Particularmente, a invenção refere-se a tetrapeptídeos derivados de uma região conservada de várias quimiocinas C-X-C. Esses peptídeos mostraram atividade para promover a migração celular, angiogênese, neutralizam componentes de células bacterianas, tais como sinais pró-inflamatórios induzidos por LTA, e estimulam substitutos de pele epiderme normal. A invenção refere-se adicionalmente a métodos de uso desses peptídeos para promover a reparação de feridas e tratar vários insultos que afetam a pele e outras superfícies corporais relacionadas, tais como a cavidade oral.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[003] Queratinócitos e células endoteliais da derme são a principal fonte de fatores solúveis que regulam a cicatrização de feridas e úlceras da pele. Anormalidades devido a atividades diminuídas, incluindo a produção de fator de crescimento, resposta angiogênica, função dos macrófagos, acúmulo de colágeno, função da barreira epidérmica, e proliferação e migração de queratinócitos e de fibroblastos, todas contribuem para a cicatrização incompleta de feridas. Fatores de crescimento e citocinas têm sido usados em cenários clínicos para o tratamento de feridas. Exemplos incluem, mas não se limitam a, PDGF (fator de crescimento derivado de plaquetas (Rees et al, 1999) e GM-CSF (fator de estimulação de colônias de granulócitos-macrófagos) que mostraram exercer efeitos benéficos sobre a cicatrização de feridas em pacientes que sofrem de várias feridas e úlceras cutâneas crônicas de etiologia diversa, incluindo úlceras de perna relacionadas a hidroxiureia (Stagno et al, 1999), úlceras venosas de perna (Da Costa et al, 1999), úlceras relacionadas a hemoglobinopatias (Voskaridou et al, 1999), e feridas resultantes de amputação (Gaches et al, 1998). Além disso, a administração intradérmica de GM-CSF a pacientes com lepra com lesões de pele conduz a uma melhor cicatrização da ferida e números e camadas aumentados de queratinócitos (Kaplan et al, 1992; Braunstein et al, 1994).

[004] Tanto os fatores de crescimento quanto as citocinas são proteínas. Dificuldades com o uso de terapêutica de proteínas para o tratamento de feridas epidérmicas são muitas vezes relacionadas ao grande tamanho das proteínas envolvidas. A estrutura complexa e o custo de produção de proteínas naturais são proibitivos para o uso clinico amplo. Estabilidade e compatibilidade de tais proteínas naturais na formulação também são uma grande preocupação. A fraca penetração devido ao grande tamanho de proteínas naturais para alcançar a camada alvo de pele muitas vezes reduz a eficácia e é a causa de efeitos benéficos fracassados de proteínas terapêuticas. Para superar esses problemas, peptídeos curtos que contêm a atividade de proteínas grandes devem preencher a necessidade de produção de baixo custo e menos dispendiosa, e manuseio e manipulação simples. Além disso, os peptídeos bioativos curtos são melhor absorvidos e retidos pelo tecido da ferida devido a uma menor susceptibilidade a proteases. A vantagem de características de absorção de peptídeos bioativos curtos também os torna opção viável para usos além do cuidado de feridas agudas e crônicas, tal como para o tratamento dos problemas de pele associados com o envelhecimento e exposição ao sol.

[005] Quimiocinas são estruturalmente relacionadas e representam uma grande superfamília de proteínas de 8 a 150kD que possuem diversas atividades biológicas. Elas são geralmente secretadas mediante a estimulação de células para controlar o tráfego de leucócitos durante a homeostase, bem como durante a inflamação, e são necessárias para a ligação entre a imunidade inata e adaptativa. Juntamente com moléculas de adesão, tais como integrinas e selectinas, quimiocinas e seus receptores atuam principalmente como parte de uma rede molecular complexa que facilita o movimento seletivo de tipos celulares específicos para, e para fora de, o microambiente tecidual alvo (Chave et al, 2003;. Ono et al., 2003). Quimiocinas mediam seletivamente o recrutamento regionalmente específico de neutrófilos, macrófagos e linfócitos. Além de serem fatores quimiotáticos, as quimiocinas também desempenham papéis importantes na manutenção da homeostase, angiogênese/angiostase, diferenciação e ativação celular, cicatrização de feridas, crescimento de tumores e metástase, migração de linfócitos e desenvolvimento de tecido linfoide, e influenciam o equilíbrio da resposta imune de tipo geral 1/tipo 2 (Behm et al, 2012;. Gillitzer et al, 2001;. Raman et al, 2011;. Romagnani et al, 2004;. Rossi et al., 2000).

[006] Definidas por um motivo de tetra cisteína, as quimiocinas são subdivididas em quatro famílias distintas de acordo com as configurações dos resíduos de cisteína na sua extremidade amino terminal. Existem duas grandes subfamílias, subfamília CCL (CCL1 até CCL28) e subfamília CXCL (CXCL1 até CXCL16), bem como duas pequenas subfamílias, subfamília XCL (XCL1 até XCL2) e subfamília CX3CL1 (Bacon et al. 2003). A subfamília de quimiocinas CXC desempenha um papel importante em diversos processos, incluindo inflamação, cicatrização de feridas, regulação do crescimento, angiogênese e tumorigênese (Keeley et al, 2008;. 2011). Muitas quimiocinas interagem com as frações glicosaminoglicanos (GAG) de proteoglicanos em células endoteliais e na matriz extracelular (Handel et al., 2005). A heparina, que serve como um composto modelo para o sulfato de heparina, é a classe mais ubíqua de GAG que é expressa em praticamente todas as células do corpo. Todas as quimiocinas interagem com heparina GAG.

[007] Nos nossos estudos, nós notamos que as quimiocinas C-X-C mostraram algumas semelhanças de sequência em suas sequências de aminoácidos primárias, embora altamente conservadas nas estruturas secundárias. O exame das sequências primárias de aminoácidos de nove quimiocinas C-X-C humanas revela uma região altamente conservada situada na porção C-terminal, a qual está envolvida na ligação de GAG usando o número de acesso NCBI de cada quimiocina mostrada abaixo na "Descrição detalhada da invenção, 1 o parágrafo". Nós geramos tetrapeptídeos a partir da região de ligação de GAG e testamos a bioatividade. Os tetrapeptídeos mostraram diversas bioatividades, incluindo a promoção da migração de queratinócitos, indução da angiogênese em células endoteliais da veia umbilical humana, neutralização das citocinas pró-inflamatórias induzidas por LTA, e modulação do crescimento celular e produção de fator de crescimento. Os tetrapeptídeos são úteis tanto como produtos farmacêuticos quanto como cosméticos para melhorar várias condições de pele.

RESUMO DA INVENÇÃO

[008] A presente invenção refere-se a peptídeos bioativos curtos que são úteis para promover a cicatrização de feridas em mamíferos. As feridas preferencialmente visadas pelos peptídeos isolados são as que afetam a pele e as superfícies mucosas associadas. Apesar de não estarem limitados a qualquer mecanismo particular, os peptídeos da invenção são capazes de efetuar a cicatrização de feridas através da estimulação da migração celular e angiogênese. Os peptídeos da invenção são úteis tanto in vitro quanto in vivo, e são capazes de induzir as atividades supramencionadas em queratinócitos.

[009] Uma modalidade da presente invenção é desenhada para tetrapeptídeos isolados da fórmula (I ou V)-X1 -K-X2, onde X1 pode ser selecionado a partir de E, Q e K; e X2 pode ser selecionado a partir de M, F, I, W, V, e L. Os peptídeos isolados podem conter formas enantioméricas L ou D dos aminoácidos, ou uma combinação das mesmas. De acordo com ainda outra modalidade da invenção, os peptídeos isolados podem ser conjugados com uma proteína transportadora, ou modificados por meio de amidação C-terminal ou acilação N-terminal com ácidos graxos (isto é, lipidação). Essas adições potencializam a bioatividade dos peptídeos quando aplicadas à pele e feridas da mesma.

[0010] De acordo com certas modalidades preferenciais da presente invenção, todos os peptídeos isolados contêm uma lisina na posição 3. Modalidades específicas dos peptídeos isolados compreendem as SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7, todas as quais apresentam atividades estimuladoras para a migração celular e efetuam a reparação de feridas.

[0011] Os tetrapeptídeos derivados mostrados abaixo se encaixam na fórmula (I ou V)-X1 -K-X2 , onde X1 pode ser selecionado a partir de E, Q e K; e X2 pode ser selecionado a partir de M, F, I, W, V, e L.

[0012] Outra modalidade da presente invenção é relacionada a composições terapêuticas ou cosméticas que contêm um veículo farmaceuticamente ou cosmeticamente aceitável e um ou mais dos peptídeos supramencionados. As composições supramencionadas são úteis para a produção de medicamento ou de composições cosméticas para uso em aplicação para a cicatrização de feridas de pele de mamíferos. O peptídeo em tais composições varia preferencialmente em concentração de cerca de 0,1 μg/mL a cerca de 500 μg/mL, ou de cerca de 0,1 μg/mL a cerca de 20 mg/mL. Formas preferenciais da composição são aerossóis, emulsões, líquidos, soluções, loções, cremes, pastas, pomadas, pós, géis e espumas.

[0013] Além disso, os peptídeos da presente invenção, e as composições que os contêm, podem prover características úteis para inclusão em formulações de cuidados com a pele em geral e cosméticas, tais como vários cosméticos para a pele, cremes, loções, protetores solares, e loções ou cremes terapêuticos para a pele, tais como formulações antiacne para cuidado após procedimentos a laser.

[0014] A presente invenção também é dirigida a métodos de uso das composições supramencionadas para a cicatrização de feridas em mamíferos. Tipicamente, o método de tratamento envolve a administração de uma quantidade eficaz de composições contendo peptídeos em feridas e ou condições inflamatórias, especialmente aquelas da pele (epiderme) e tecidos mucosos associados, por uma quantidade eficaz de tempo. Tais feridas incluem feridas cirúrgicas, escoriações, bolhas, queimaduras, lacerações, contusões, úlceras, erupções cutâneas, cicatrizes, estrias e danos de pele devido a efeitos intrínsecos e extrínsecos de envelhecimento e exposição ambiental, incluindo rugas, flacidez da pele e foto-danos. Condições inflamatórias da pele incluem psoríase, dermatite atópica e rosácea e inflamação decorrente da remoção de pelos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0015] Quimiocinas modulam a cicatrização de feridas, atividades inflamatórias/anti-inflamatórias e angiogênicas/angiostáticas. Elas exercem sua função através da ligação à classe de receptores acoplados à proteína G (GPCR) em leucócitos e glicosaminoglicanos (GAGs) da superfície celular em tecidos alvo. A ligação de quimiocinas a GAGs é mediada através de forças iônicas geradas pelas interações de cadeias carregadas negativamente sobre os GAGs com agregados de resíduos básicos nas quimiocinas (Handel et al., 2005). In vivo, a situação é mais complicada, e foi proposto que as quimiocinas agem através da produção de gradientes imobilizados ou haptotáticos, os quais dirigem a migração de células para os locais de inflamação (Proudfoot, 2006). As interações GAG-quimiocina podem desempenhar um papel central no estabelecimento de gradientes ao longo da matriz extracelular e podem facilitar a ligação das quimiocinas aos seus receptores acoplados à proteína G. Proteoglicanos GAG ou sulfato de heparina (HS) também podem comportar-se como coreceptores funcionais de quimiocinas para sinalização, levando à formação de um complexo ternário de GAG/quimiocina e receptor de quimiocina (Handel et al. 2005). Estudos sobre quimiocinas específicas mapearam os locais de ligação dos GAGs às quimiocinas. Em exame minucioso da sequência primária de aminoácidos do local de ligação a GAG conservado de nove proteínas precursoras de quimiocina C-X-C humanas, incluindo precursor de GRO-alfa (CXCL-1), precursor de quimiocina 2 (CXCL-2), precursor de quimiocina 3 (CXCL-3), precursor de quimiocina 4 (CXCL-4), precursor de quimiocina 5 (CXCL-5), precursor de quimiocina 6 (CXCL-6), precursor de IL-8 (CXCL8), precursor de quimiocina 9 (CXCL-9), precursor de quimiocina 11 (CXCL -11), encontramos uma região de tetrapeptídeo conservada que é de particular interesse. O trecho de tetrapeptídeo conservado definido neste estudo está localizado dentro de uma região de ligação a GAG parcial. Abaixo está uma ilustração esquemática do alinhamento das sequências C-terminais de precursores de quimiocinas C-X-C humanas selecionados e destaque do tetrapeptídeo curto conservado. O alinhamento é gerado usando o programa COBALT para várias sequências de alinhamento de proteínas no site do NCBI (ncbi.nlm.nih.gov). Apenas a porção C-terminal de cada quimiocina no alinhamento é mostrada e os números são o início e fim dos resíduos nas sequências. A. precursor de GRO-alfa (número de acesso NCBI P09341.1); B. precursor de quimiocina 2 (número de acesso NCBI NP_002080.1); C. precursor de quimiocina 3 (número de acesso NCBI NP_002081.2); D. precursor de quimiocina 4 (número de acesso NCBI P80162.4); E. precursor de quimiocina 5 (número de acesso NCBI NP_002985.1); F. precursor de quimiocina 6 (número de acesso NCBI NP_002984.1); G. precursor de IL-8 (número de acesso NCBI); H. precursor de quimiocina 9 (número de acesso NCBI NP_002407.1); I. precursor de quimiocina 11 (número de acesso NCBI EAX05774.1).

[0016] É mostrado no alinhamento um motivo de tetrapeptídeo curto que é altamente conservado entre as quimiocinas CXC. * Indica um local de ligação a GAG parcial de quimiocinas. Os tetrapeptídeos mostram uma cadeia conservada de I-K-. Exceto por IL-8, que tem uma valina (V), todos os outros têm uma isoleucina (I) na posição 1 e uma lisina (K) na posição 3 do motivo de tetrapeptídeo. Portanto, a fórmula (I ou V)-X1 -K-X2 pode ser usada para representar os tetrapeptídeos gerados e mostrados na Tabela 1. Vale a pena notar que a região de ligação a GAG das quimiocinas também está envolvida na formação de dímeros, como a maioria das quimioquinas CXC existem reversivelmente como monômeros e dímeros, e por isso, o perfil de recrutamento seria influenciado não apenas pela constante de equilíbrio monômero-dímero, mas também pelas interações de ligação de monômero e dímero a receptores em neutrófilos e a GAGs na superfície celular e espaço intersticial no tecido alvo (Gangavarapu et al., 2012).

[0017] Os tetrapeptídeos derivados mostrados abaixo se encaixam na fórmula I(V)-X1 -K-X2 , onde X1 pode ser selecionado a partir de E, Q e K; e X2 pode ser selecionado a partir de M, F, I, W, V, e L.

Quimiocinas C-X-C são bem conhecidas pela sua atividade quimiotática em relação a muitos tipos de células. Para avaliar se os tetrapeptídeos recém-derivados possuem a atividade para estimular a migração de queratinócitos, as SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 foram submetidas a um teste de ferida por raspagem de queratinócitos, um ensaio bem aceito para avaliar a capacidade de o composto ativo induzir a migração de células e o fechamento da ferida in vitro. O experimento foi desempenhado no meio de crescimento de queratinócitos sem soro na ausência de suplemento, a fim de restringir a proliferação de células. A área ferida foi examinada por microscopia de contraste de fase nos tempos indicados. Como mostrado na Tabela 1, os tetrapeptídeos induzem significativamente o fechamento da ferida por raspagem. A 20 μg/mL, a porcentagem de fechamento da ferida induzido pelas SEQ IDs 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 varia de 165% a 240% em comparação àquela dos tratados com PBS, a qual foi concebida como 100% (Tabela 1). Um peptídeo gerado aleatoriamente SEQ ID NO 8 não induz migração de células e fechamento de ferida por raspagem. Para confirmar que os peptídeos não são tóxicos para os queratinócitos nas concentrações testadas para o fechamento de ferida por raspagem, todos os peptídeos foram submetidos ao teste de citotoxicidade MTT. Nenhum dos peptídeos foi citotóxico para queratinócitos de pele normais in vitro após 24 horas de incubação em concentrações até 500 μg/mL. Em conclusão, o tratamento com tetrapeptídeos SEQ ID NOs 1-7 induziu significativamente a migração de células de queratinócitos epidérmicos humanos normais para a área de raspagem como indicado pela porcentagem de fechamento da área ferida após 7 hr de tratamento em comparação com aquele de células de controle tratadas com PBS.

[0018] A angiogênese, a formação de novos capilares a partir da rede vascular pré-existente, é uma etapa essencial da cicatrização de feridas. Os peptídeos gerados na presente invenção, SEQ ID NOs 1-7, também estimulam a formação de tubos capilares. O ensaio de angiogênese in vitro usa células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) para medir uma série de eventos que levam à formação de novos tubos capilares. Mediante indução, as HUVEC sofrem migração para alinhamento e, então, brotam de células individuais. O evento de brotamento conduz à formação de novos tubos capilares que se desenvolvem adicionalmente para formar polígonos fechados. Eventualmente uma estrutura complexa semelhante a malha é desenvolvida. O peptídeo catelicidina humana, LL-37, é um exemplo bem estudado para promover a angiogênese. É usado como controle positivo na avaliação. O brotamento de novos tubos capilares torna-se visível apenas após 3 hr de tratamento com LL-37 (Tabela 2). Depois de 5 hr de tratamento com o LL-37, os polígonos fechados são formados. Em comparação com LL-37, as SEQ ID NOs. 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 induziram alterações semelhantes em HUVEC, resultando na nova formação de tubos capilares e estruturas poligonais complexas em 3 e 5 hr de tratamento (Tabela 2). Em contraste, o peptídeo gerado aleatoriamente SEQ ID NO 8 (KMG) e PBS não induzem tal alteração no momento em que a atividade angiogênica foi observada para LL-37 e os peptídeos da invenção (Tabela 2).

[0019] O peptidoglicano componente da parede celular Gram- positiva (PGN) é bem conhecido por estimular a expressão de citocinas pró- inflamatórias. Ácido lipoteicoico (LTA) é a molécula-chave em PGN que provoca um aumento dependente de concentração e do tempo em sinais pró-inflamatórios, incluindo a up-regulação de óxido nítrico sintase (iNOS), ciclo-oxigenase-2 (COX-2), IL-1 beta, TNF-alfa e IL-6 (Lin et al., 2010). Portanto, nós pré-tratamos LTA com os peptídeos da invenção e então avaliamos a atividade estimuladora de IL-6 mediante contato com queratinócitos de pele humanos. Como mostrado na Tabela 3, o pré- tratamento de LTA com as SEQ ID NOs 1, 2, 3, 4, 5, 6, e 7 reduz significativamente o nível de expressão de IL-6 estimulada por LTA em cultura de queratinócitos de pele humanos, sugerindo que os peptídeos podem neutralizar o efeito tóxico de LTAs livres. É muito provável que os resíduos carregados positivamente dos tetrapeptídeos se liguem ao LTA carregado negativamente bloqueando, assim, a interação de LTA com seus receptores. Isso é significativo, uma vez que componentes da parede celular bacteriana têm sido implicados em condições inflamatórias da pele, tais como acne, rosácea, dermatite atópica, etc.

[0020] A modulação da proliferação celular é outra etapa importante no reparo de feridas. Nós testamos o peptídeo da invenção para a atividade proliferativa em queratinócitos de pele humanos. Em comparação à atividade quimiotáctica medida no teste de raspagem, a angiogênese e bloqueio da expressão de IL-6 induzida por LTA, os peptídeos da invenção mostraram várias atividades ainda moderadas na modulação da proliferação de queratinócitos. A SEQ ID NO 1 (HB2233) mostrou uma atividade inibitória sobre a proliferação de queratinócitos, tal como atividade inibidora também foi observada para a SEQ ID NO 3 (HB2270). A SEQ ID NO 6 parece estimular a proliferação de queratinócitos, mas tal atividade é apenas marginal. A atividade inibidora sobre a proliferação de queratinócitos leva-nos a testar a expressão de TGF-β1, uma vez que esse fator de crescimento é bem conhecido por inibir a proliferação celular. Como mostrado na Tabela 4, tanto a SEQ ID NO 1 quanto a 3 induziram um nível moderado de expressão de TGF-β1 em queratinócitos em cultura.

[0021] SOR-300-FT, desenvolvido por MatTek Corporation (Ashland MA), é um tecido de psoríase altamente diferenciado in vitro composto por queratinócitos derivados de humanos normais e fibroblastos psoriáticos. Morfologicamente, o tecido é de espessura uniforme e expressa níveis elevados de células hiperproliferadas, bem como marcadores pró- inflamatórios, tais como psoriasina, elafina, beta-defensina-2 humana, e LL- 37, etc (Ayehunie et al., 2012). A condição pró-inflamatória do tecido leva- nos a testar os peptídeos da invenção para ver se eles modulam a resposta inflamatória. Devido ao elevado custo do modelo de tecido, um peptídeo representativo SEQ ID NO 1, HB2233, foi selecionado como uma prova de conceito para o estudo usando o modelo de tecido SOR-300-FT. Os tecidos SOR- 300-FT foram tratados com HB2233 em duplicata, a 200 μg/mL. Um total de 12 marcadores de genes associados com a condição de psoríase são estudados. O estudo foi executado em paralelo com calcipotriol. Análise de qPCR revelou que, após tratamento por 72hr, a SEQ ID NO 1 (HB2233) down-regula significativamente o nível de expressão de LL-37 (3,7 vezes), a qual é superexpressa em pele inflamada por psoríase (Tabela 5). A droga contra psoríase calcipotriol down-regula significativamente HBD-2 (9,0 vezes) e psoriasina (2,3 vezes). Tanto HB2233 quanto calcipotriol down-regulam a expressão de Ki67, que é responsável pela hiperproliferação e maturação precoce de queratinócitos em pele com psoríase. Além disso, a SEQ ID NO 1 (HB2233) também down-regula a expressão de CXCL1 (GRO alfa) e CXCL5 (ENA- 78), ambas as quais são significativamente up-reguladas em pele com psoríase em comparação com a pele saudável normal (Ayehunie S., 2012); no entanto, o calcipotriol não parece afetar o nível de ambos os genes. Isso sugere claramente que HB2233 poderia ser uma nova terapêutica que funciona através de um mecanismo diferente daquele da droga atual calcipotriol para o tratamento de condições inflamatórias da pele, tais como psoríase.

[0022] Para melhor compreender como o mesmo peptídeo afeta tecidos normais de pele saudável, nós colocamos a SEQ ID NO: l, HB2233, para um estudo de perfilagem de genes realizado por Sunny Biodiscovery (Santa Paula, CA) usando substitutos de pele humana normal EPIDERM™, adquiridos de MatTek Corporation (Ashland, MA). Os substitutos de pele foram equilibrados durante a noite antes do tratamento com o peptídeo de controle ou controle de água em duplicatas por 24 hrs. No final do tratamento, RNA foi extraído e submetido a análise de PCR. Como mostrado na Tabela 6, a SEQ ID NO 1, HB2233, estimula genes que estão envolvidos na síntese de ECM (colágeno e integrinas). Como esperado, ela modula quimiocinas (CXCL11 e MAPK3 etc) e fatores de crescimento (TGF-βl e VEGF, etc.). O estudo de perfilagem gênica confirma a atividade observada in vitro que os peptídeos da invenção modulam a proliferação celular, angiogênese e atividades de cicatrização de feridas.

[0023] Todos os peptídeos incluídos na presente invenção foram sintetizados usando química de fase sólida de Fmoc (9- fluorenilmetoxicarbonila) padrão. Os peptídeos podem ser preparados como sequências de ácidos livres ou amidados usando aminoácidos padrão. Amidação do terminal carboxi pode tornar os peptídeos da invenção menos suscetíveis à degradação por protease e aumentar a sua solubilidade em comparação com a forma de ácido livre, provendo, portanto, potência terapêutica intensificada. Os peptídeos podem compreender enantiômeros L ou D de aminoácidos, contendo resíduos de uma forma enantiomérica ou uma combinação de ambas as formas. Os peptídeos podem ser modificados tanto na extremidade N terminal quanto na C terminal. Por exemplo, é discutido que a lipidação ou acilação N-terminal pode melhorar a penetração do peptídeo através da pele sem alterar a função bioativa do peptídeo (Samah, 2011). Portanto, os peptídeos também podem ser lipidados, o que pode proporcionar penetração na pele melhorada. Exemplos de ácidos graxos saturados ou insaturados que podem ser usados para prover o componente lipídico C12-18 dos compostos da invenção incluem ácido láurico, ácido mirístico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido miristoleico, ácido palmitoleico, ácido oleico e ácido linoleico. A extremidade carboxi terminal dos peptídeos pode ser modificada com ácido (-COOH) ou amidado (por exemplo, -CONH2, -CONHR, ou - CONR2-). A amidação da extremidade carboxi terminal pode tornar os peptídeos da invenção menos suscetíveis à degradação por protease e aumentar a sua solubilidade em comparação com as formas de ácido livre, provendo, portanto, potência terapêutica intensificada. Além disso, os grupos funcionais de peptídeos que podem ser modificados tipicamente incluem hidroxila, amina, guanidínio, carboxila, amida, fenol, anéis de imidazol ou sulfidrila.

[0024] Os peptídeos também podem ser conjugados com moléculas transportadoras solúveis ou insolúveis para modificar suas propriedades de solubilidade conforme necessário e para aumentar as concentrações locais de peptídeos em tecidos alvo. Exemplos de moléculas transportadoras solúveis incluem, mas não se limitam a, polímeros de polietilenoglicol (PEG) e polivinilpirrolidona; exemplos de polímeros insolúveis incluem, mas não se limitam a, silicatos, poliestireno e celulose. Os peptídeos podem ser microencapsulados usando tecnologia de lipossomas ou nano-tecnologia para melhorar sua estabilidade e para liberação controlada. Em geral para o protocolo acima, os peptídeos podem ser produzidos usando qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica, tais como aqueles descritos em Merrifield (J Am Chem Soc. 85:2149, 1963); Carpino et al. (J Org Chem. 51:3732, 1986); Merrifield et al. (Anal Chem. 38: 1905, 1966); ou Kent et al. [High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, IN: PEPTIDES 1984 (Ragnarsson, ed.) Almqvist e Wiksell Int., Estocolmo (Suécia), pp. 185-188], todos os quais são incorporados neste documento por referência em sua totalidade.

[0025] A presente invenção é dirigida a métodos de uso dos peptídeos acima descritos, tais como em formulações ou como agentes terapêuticos. Esses métodos podem envolver o uso de um único peptídeo ou vários peptídeos em combinação. Em certos casos, a composição da invenção pode ser disposta dentro de dispositivos colocados sobre, dentro, ou embaixo da pele. Tais dispositivos incluem adesivos transdérmicos, implantes e injeções que liberam as substâncias de modo tal a contactar a pele ou folículo de pelo por mecanismos de liberação passivos ou ativos. As composições usadas para entregar os peptídeos nos métodos descritos neste documento podem ser na forma de um aerossol, emulsão, líquido, loção, solução, gel, micro-encapsulamento, creme, pasta, pomada, pó, espuma, ou outra formulação farmaceuticamente aceitável. Além disso, os peptídeos podem ser entregues usando formulações menos envolvidas, tais como água deionizada/destilada, PBS ou soluções salinas médicas padrão.

[0026] A formulação pode opcionalmente ter apelo cosmético e/ou conter outros agentes, tais como retinoides, vitamina C ou outros peptídeos que podem atuar como adjuvantes para a ação terapêutica dos peptídeos da invenção. Antibióticos também podem ser adicionados à formulação a fim de evitar infecção, permitindo, assim, que o processo de cicatrização máxima ocorra.

[0027] A formulação pode conter inibidores da protease. Um inibidor de protease pode ser selecionado para visar especificamente proteases que possivelmente degradariam o peptídeo bioativo selecionado; tal seleção seria determinada com base no comprimento e/ou sequência do peptídeo bioativo. No entanto, inibidores da protease não devem necessariamente ser selecionado de qualquer maneira específica; por exemplo, um coquetel de inibidores de protease, que contém dois ou mais inibidores, pode ser empregado na presente invenção. Os seguintes tipos de inibidores da protease podem ser incorporados na invenção: inibidores de serina protease, inibidores de cisteína protease, inibidores de aspartato protease, inibidores de metaloproteinase, inibidores de tiol protease e inibidores de treonina protease. O inibidor da protease usado na invenção pode ser um peptídeo ou proteína ou substâncias químicas. Exemplos não limitantes de tais inibidores são as serpinas, as quais incluem alfa-1- antitripsina, inibidor de complemento 1, antitrombina, alfa-1- antiquimotripsina, inibidor do ativador do plasminogênio 1, e neuroserpina, ou substâncias químicas, incluindo, mas não se limitando a, ácido ursólico e ácido tranexâmico, que podem atuar como adjuvantes para a ação terapêutica dos peptídeos da invenção.

[0028] Geralmente, uma formulação farmaceuticamente aceitável incluiria qualquer veículo adequado para uso sobre a pele humana. Tais veículos farmaceuticamente e cosmeticamente aceitáveis incluem etanol, dimetil sulfóxido, glicerol, sílica, alumina, amido, e veículos e diluentes equivalentes. A formulação pode opcionalmente ter apelo cosmético e/ou conter outros agentes, tais como retinoides ou outros peptídeos que podem atuar como adjuvantes para a ação terapêutica dos peptídeos da invenção. Antibióticos também podem ser adicionados à formulação a fim de evitar infecção, permitindo, assim, que o processo de cicatrização máxima ocorra. A concentração do peptídeo na composição pode ser de cerca de 0,1 μg/mL a cerca de 500 μg/mL ou cerca de 0,1 μg/mL a cerca de 10%; no entanto, a concentração final empregada pode variar fora dessas faixas, dependendo da natureza da condição da ferida/tecido, da bioatividade do peptídeo da invenção e do uso de qualquer adjuvante ou técnica para se obter absorção da composição potencializada. O CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, Segunda Edição (1992) descreve uma grande variedade de ingredientes cosméticos e farmacêuticos não limitantes normalmente usados na indústria de cuidados com a pele, os quais são adequados para uso nas composições da presente invenção. Exemplos dessas classes de ingredientes incluem: abrasivos, absorventes, componentes estéticos, tais como fragrâncias, pigmentos, tinturas/corantes, óleos essenciais, substâncias sensoriais da pele, adstringentes, etc (por exemplo, óleo de cravo, mentol, cânfora, óleo de eucalipto, eugenol, lactato de mentila, destilado de hamamélis), agentes antiacne, agentes antiagregantes, agentes antiespumantes, agentes antimicrobianos (por exemplo, butilcarbamato de iodopropila), antioxidantes, aglutinantes, aditivos biológicos, agentes tamponantes, agentes de volume, agentes quelantes, aditivos químicos, biocidas cosméticos, desnaturantes, adstringentes de drogas, analgésicos externos, formadores de filme ou materiais, agentes opacificantes, ajustadores de pH, propelentes, agentes redutores, sequestrantes, agentes de branqueamento da pele e de clareamento (por exemplo, hidroquinona, ácido kójico, ácido ascórbico, ascorbil fosfato de magnésio, ascorbil glucosamina), agentes de condicionamento da pele (por exemplo, umectantes), agentes calmantes e/ou de cicatrização da pele (por exemplo, pantenol e seus derivados, aloe vera, ácido pantotênico e seus derivados, alantoína, bisabolol, e glicirrizinato dipotássico), agentes de tratamento da pele, espessantes, e vitaminas e seus derivados .

[0029] A administração dos peptídeos da invenção e composições associadas pode ser feita para seres humanos e animais, incluindo todos os mamíferos. A aplicação também pode ser feita em combinação com materiais típicos e/ou experimentais, tais como enxertos de tecidos, substitutos de pele, produtos de cultura de tecidos e ataduras. Exemplos incluem, mas não se limitam a, gazes (tecidos e não-tecidos, impregnados, não aderentes, de embalagem, de desbridamento); ataduras e sistema de compressão; preenchimentos e produtos de limpeza de feridas; camadas de contato; colágenos; membranas amnióticas; derme humana acelular; matrizes acelulares e produtos de combinação; e várias ataduras comumente usadas.

[0030] Lista de ataduras geralmente usadas

[0031] Em geral, a composição pode ser administrada topicamente, oralmente, transdermicamente, sistemicamente, ou por qualquer outro método conhecido por aqueles versados na técnica como sendo útil para entregar os peptídeos da invenção para o tecido alvo. As composições também podem ser aplicadas em uma maneira in vitro ou ex vivo, em células ou enxertos de pacientes crescendo em cultura, por exemplo.

[0032] As composições da presente invenção podem conter um ou mais agentes adicionais que exercem atividade de cuidado com a pele. Além do componente peptídeo bioativo, a presente invenção pode conter outros agentes ativos, tais como ácido hialurônico, niacinamida, fitantriol, farnesol, bisabolol, ácido salicílico, retinol, ácido retinoico, alfahidroxi ácidos, ácido ascórbico e ácido algurônico. Espera-se que certos agentes ativos adicionais atuem sinergicamente com o componente peptídeo bioativo, ou aumentem a vida de prateleira da formulação.

[0033] Além disso, as abreviações para os aminoácidos seguem o uso convencional:

[0034] Detalhes sobre as técnicas para formulação e administração de produtos farmacêuticos podem ser encontrados na última edição de Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co, Easton Pa.). Embora a entrega tópica local seja desejável, existem outros meios de entrega, por exemplo: administração oral, parenteral, aerossol, intramuscular, subcutânea, transcutânea, intramedular, intratecal, intraventricular, intravenosa, intraperitoneal, ou intranasal. A presente invenção pode ser formulada em um número de veículos de transporte, por exemplo, em um pulverizador; um aerossol; uma emulsão do tipo água e uma do tipo óleo; uma emulsão do tipo óleo e água; um creme para o rosto ou creme para o corpo; uma loção solar ou loção pós-sol; ou outro veículo de administração tópica. Além disso, os peptídeos da presente invenção, e as composições que os contêm, podem prover características úteis para inclusão em formulações de cuidados com a pele em geral e cosméticas, tais como vários cosméticos para a pele, cremes, loções, protetores solares, e loções ou cremes terapêuticos para a pele, tais como formulações antiacne.

Áreas de aplicação

[0035] Os peptídeos da presente invenção podem ser usados para o tratamento de feridas da pele. Danos na pele e nos tecidos da mucosa ocorrem quando a camada epidérmica é violada, tal como a partir de uma laceração, queimadura ou bolha. Lesão também pode envolver esmagamento ou contusão, o que envolve danos dos tecidos sem fissura concomitante da epiderme. Infecções da pele bem como certas doenças crônicas, tais como câncer e doenças autoimunes, também podem produzir um danos em superfícies epidérmicas. Úlceras, tais como aquelas que afetam diabetes ou aquelas associadas com feridas de pressão, são outra forma de dano da pele; essas feridas são muitas vezes bastante intratáveis, sendo inflamadas, propensas a infecção, e exigem um processo de cicatrização demorado. A persistência de uma úlcera ou de outro tipo de feridas crônicas é devida a uma falha de processos celulares envolvidos na cicatrização e uma na geração de novos vasos sanguíneos devido à capacidade diminuída d angieogênese. A angiogênese é o processo de formação de nova rede capilar (microvascular) em resposta à hipóxia ou outros estímulos (Folkman et al., 1992). O processo envolve a secreção local de fatores angiogênicos tanto a partir do endotélio hipóxico quanto de pericitos de apoio que induzem a proliferação endotelial e brotamento de neovasos. A angiogênese insuficiente contribui para a cicatrização de feridas e úlceras da pele prejudicada (Galiano et al., 2004). A falha na cicatrização de feridas também pode ser um resultado da incapacidade de epitelizar a lesão parcialmente devido ao fato de que os queratinócitos na borda da ferida não migram para fechar ou cobrir a ferida (Enoch e Price, 2004). A cicatrização de feridas da pele e das mucosas é orquestrada, em parte, através da ativação de queratinócitos basais. Mediante a ativação, os queratinócitos localizados no perímetro da ferida migram para formar uma única camada sobre a ferida em um processo referido como epitelização. Mostrou-se que queratinócitos na borda não cicatrizante de feridas crônicas são hiperproliferativos, mas não migratórios, e a falta de migração leva à incapacidade de epitelizar e desempenha um papel importante na patogênese de úlceras crônicas (Harsha et al., 2008). A presente invenção também pode ser usada para tratar danos associados com queratinócitos em tecidos de pele e mucosos. O termo "tecidos mucosos associados" refere-se a qualquer tecido organizado de uma maneira semelhante à pele e contém células epiteliais/queratinócitos, incluindo, mas não se limitando a, as superfícies de revestimento interno associadas com a boca, nariz, garganta, ouvido, ânus, genitália e a conjuntiva palpebral do olho. Exemplos de feridas ou lesões/machucados que podem afetar esses tecidos e são suscetíveis a tratamento com os peptídeos da invenção são escoriações, queimaduras, bolhas, lacerações, perfurações, úlceras, contusões, cicatrizes e erupções cutâneas. Trauma pós-cirúrgico também pode ser tratado com os peptídeos.

[0036] Outra forma de dano epidérmico é sutil e resulta ao longo de um longo período de tempo, eventualmente comprometendo a função da pele, assim chamado pele em envelhecimento. Existem dois processos principais que induzem o envelhecimento da pele; intrínseco (envelhecimento cronológico) em pele protegida do sol, e extrínseco (fotoenvelhecimento) em áreas expostas ao sol. O envelhecimento intrínseco reflete o fundo genético e depende do tempo. Independentemente disso, a pele em envelhecimento ganha um ou mais dos seguintes: rugas, linhas finas, hiperpigmentação, eritema, perda de brilho, suavidade, firmeza, clareza e uniformidade do tom de pele, e alterações na aparência dos poros. Subjacente a esses sinais visíveis estão várias alterações histológicas e citológicas induzidas por exposição aguda ou crônica a estímulos ambientais, tais como a radiação ultravioleta (UV) e poluições, além de predisposição genética. Problemas cosméticos, tais como rugas, secura, afinamento, flacidez e maior susceptibilidade a contusões normalmente são sinais externos de dano epidérmico que, adicionalmente ao envelhecimento, também podem ocorrer precocemente devido à exposição prolongada a agentes prejudiciais, tais como raios ultravioleta e poluições. Portanto, os peptídeos descritos podem ser usados para problemas associados com o envelhecimento da pele causado tanto por estímulos intrínsecos quanto extrínsecos, para prevenir e reparar o dano; portanto, para regenerar o tecido da pele saudável para reverter os efeitos do envelhecimento. De um modo relacionado, os peptídeos podem ser aplicados a tecido que tenha sido danificado pela exposição a vários agentes externos, tais como a luz solar. A invenção também pode ser usada como um cosmético com esse fim para gerar uma aparência e textura mais jovens. Os peptídeos curtos em si inalterados, ou através de modificação química e/ou entrega especializada, podem ser feitos para penetrar através da epiderme a afetar processos contrários àqueles que causam afinamento da pele, rugas, fragilidade e rugosidade/endurecimento. Uma vez que os queratinócitos são o componente principal de superfícies epidérmicas e são diminuídos na pele envelhecida e danificada, espera-se que o reabastecimento dos mesmos por estimulação peptídica reverta o problema supramencionado.

[0037] A pele é relativamente elástica, mas há limites para a sua capacidade de se esticar. Estrias são uma forma de cicatrizes na pele com um tom de cor distoante. Elas são causadas pela ruptura da derme, o que pode diminuir ao longo do tempo, mas não desaparecem totalmente. Elas aparecem primeiramente como linhas avermelhadas ou violeta, mas tendem a desvanecer-se gradualmente para uma coloração mais leve. Estrias são muitas vezes o resultado do rápido estiramento da pele associado com crescimento rápido ou rápida perda de peso. Estrias podem aparecer em qualquer lugar em locais do corpo que não sofram nenhum alongamento ou distensão notável ou excessiva. Os lugares mais comuns são o abdômen, seios, braços, axilas, costas, coxas, quadris e nádegas. As estrias são muitas vezes causadas pelas mudanças hormonais de algumas das principais fases da vida, como puberdade e gravidez, mas tratamento com corticosteroides, obesidade, cirurgia estética e fisiculturismo intenso podem levar a estrias. Sob a ação de corticosteroides o crescimento tanto dos queratinócitos quanto dos fibroblastos pode ser severamente danificado e, consequentemente, a síntese de colágeno I e III, bem como a síntese de fibronectina também é significativamente reduzida até mais de 90% em comparação com a pele normal (Rogalski et al., 2002 ). Tem-se mostrado que a combinação de doses elevadas de corticosteroides e terapia anti- fator de crescimento endotelial vascular (antiangeogênese) pode agravar a condição das estrias e deve ser evitada (Wheeler et al., 2012). Reparar e restaurar a função dos queratinócitos na seção dérmica/epidérmica pode ser a chave para a correção das estrias. Os peptídeos da presente invenção que promovem o fechamento de feridas por raspagem e estimulam a angiogênese essencial para a cicatrização de feridas são, portanto, ideais para o tratamento de estrias.

[0038] Queratinócitos produzem e secretam peptídeos antimicrobianos (AMPs) que funcionam como antibióticos endógenos e como moléculas de sinalização dentro do sistema imune inato cutâneo. AMPs são o componente-chave do sistema de defesa imune inata doe hospedeiro e proveem a primeira linha de defesa e morte de microorganismos patogênicos. Além disso, eles também modulam e modificam as respostas inflamatórias do hospedeiro por uma variedade de mecanismos. No entanto, a expressão anormal desses peptídeos tem sido associada à patogênese de doenças inflamatórias da pele. Estudos recentes indicam que LL-37 pode desempenhar um papel importante na patogênese da psoríase e rosácea.

[0039] Psoríase é uma doença inflamatória crônica da pele que afeta aproximadamente 2% da população geral (Lowes et al, 2007). A psoríase é caracterizada pelo acúmulo de células T do tipo Thl e neutrófilos, hiperproliferação e diferenciação de queratinócitos, e potencialização da produção epidérmica de AMPs. Nas lesões psoriáticas, muitos AMPs são altamente expressos, tais como catelicidina (LL-37), beta-defensinas, proteínas S100, quimiocinas, RNase 7, lisozima, elafina, lipocalina associada à neutrófilo gelatinase, e assim por diante. Em particular, a catelicidina LL-37 é superexpressa em pele inflamada na psoríase, liga-se ao auto-DNA extracelular liberada por células em processo de morte celular e converte auto-DNA em um estímulo potente para células dendríticas plasmocitoides (Dombrowski et al., 2012). Embora haja controvérsia sobre o papel de LL-37 na psoríase, é evidente que esse peptídeo induz a proliferação de queratinócitos e a produção de citocinas pró-inflamatórias em queratinócitos em cultura. Adicionalmente à psoríase, LL-37 foi recentemente implicada no desenvolvimento de lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide (RA). LL-37 é altamente expressa na pele de pacientes com lúpus eritematoso sistêmico (Sun et al., 2011). Na RA, granulócitos de neutrófilos causam inflamação e dano tecidual na articulação pela liberação de agentes citotóxicos, AMPs, proteases e outros mediadores inflamatórios. Foi demonstrado em modelos animais que LL-37 é fortemente up-regulada nas membranas sinoviais de RA e nas articulações de ratos com artrite em comparação com as articulações saudáveis (Hoffmann et al., 2012). A observação de que HB2233 significativamente down-regula a expressão de LL-37, bem como vários outros fatores altamente associados com inflamação sugere que os peptídeos da invenção podem ser agentes terapêuticos potenciais para doenças inflamatórias, incluindo, mas não se limitando a, psoríase, lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide.

[0040] Rosácea é uma das dermatoses mais comuns de adultos. Conceitos atuais sugerem que fatores clínicos de gatilho conhecidos, tais como a radiação UV, calor, frio, estresse, comida picante, e micróbios modulam a sinalização do receptor do tipo Toll, induzem espécies reativas de oxigênio, bem como potencializam AMPs e a produção de neuropeptídeo (Kenshi et al., 2009;. Yamasaki et al, 2009). O excesso de catelicidina sob a forma de LL-37 foi relatado em rosácea, o que parece resultar da função anormal de reconhecimento de padrões imunes inatos por TLRs, e proteases que processam hCAP18 (Yamasaki et al, 2007;. 2011). Semelhante à psoríase e lúpus eritematoso sistêmico, especula-se que o excesso de presença de LL-37 na rosácea permita o reconhecimento de auto-ácidos nucleicos tanto pelas células dendríticas plasmocitoides quanto pelos queratinócitos, o que pode exacerbar a inflamação, contribuindo, assim, para a doença, através da permissão de sinalização auto-inflamatória (Gilliet et al., 2008; Ganguly et al., 2009). A down- regulação de LL-37 em tecidos da pele SOR-300-ft pelos peptídeos da invenção justifica um tratamento promissor e potencialmente útil para melhorar a condição inflamatória associada a LL-37 na rosácea.

[0041] Além de condições inflamatórias da pele, níveis mais elevados de LL-37 estão também associados com vários tipos de tumores sólidos agressivos. Mostrou-se que LL-37 é superexpressa progressivamente em tumores da próstata humanos conforme a pontuação de Gleason aumenta e em metástases ósseas (Jonathan et al., 2011). Observação clínica semelhante foi feita em carcinomas de câncer dos ovários (Coffelt et al., 2008), de mama (Heilborn et al., 2005) e cânceres do pulmão (von Haussen et al., 2008). Embora LL-37 seja normalmente clivada do seu precursor, proteína 18 antimicrobiana catelicidina humana (PACS- 18), por neutrófilo protease 3 para tornar-se ativada, evidências sugerem que células cancerosas também produzem uma enzima para clivar proteoliticamente sua hCAP-18 secretada independentemente de neutrófilos (Sorensen et al., 2001). Isso pode explicar os níveis elevados de LL-37 em cânceres. Embora o envolvimento de LL-37 em cânceres permaneça a ser esclarecido, a propriedade de LL-37 para aumentar a proliferação, a angiogênese, a proteção contra a apoptose e a transição epitelial-mesenquimal podem servir como marcas de câncer e podem ser usadas por células transformadas/malignas para promover o crescimento de tumores e metástase. A down-regulação de LL-37 pelo peptídeo da invenção, tal como HB2233, pode prover um meio eficaz para reduzir o nível de LL-37, evitando, assim, que as células cancerosas se espalhem. O benefício potencial pode ser aumentado adicionalmente em combinação com drogas contra o câncer.

[0042] Infecção com bactérias pode provocar sepse e levar a choque séptico, caracterizado por hipotensão refratária e, eventualmente, insuficiência de múltiplos órgãos e morte (Ulevitvh et al., 1995). Sepse gram-positiva tem sido reconhecida como uma importante condição clínica (Ulevitvh et al., 1995). Seus agentes causadores são componentes da parede celular de bactérias Gram-positivas, tais como peptidoglicano (PGN) e ácido lipoteicóico (LTA). Além de choque séptico, LTA também é um agente causador de outras condições inflamatórias. Dermatite atópica (AD) é uma doença inflamatória crônica da pele comum. A patogênese da AD não é totalmente compreendida e o nível de expressão de catelicidina (LL- 37) e sua associação com a gravidade da doença de eczema tem sido controverso. Pacientes com AD são particularmente suscetíveis a infecções cutâneas estafilocócicas, as quais são associadas com a piora de suas condições de pele. Embora os mecanismos pelos quais as bactérias estafilococos podem piorar a AD ainda não estejam claros, a produção de citocinas após a infecção direta ou interação com componentes bacterianos ou detritos por queratinócitos ou células do sistema imunológico parece desempenhar um papel importante (Bieber et al., 2008). Infecções por S. aureus são gatilhos conhecidos para a inflamação da pele e podem modular respostas imunes devido a invasão direta por bactérias ou por produtos bacterianos. Estudos indicam níveis elevados de LTA de S. aureus sobre lesões cutâneas de AD (Travers et al., 2010). Verifica-se que o fluido de lavagem derivado de lesões de AD induz a produção de IL-1β, IL-6, IL-10, e fator de necrose tumoral-a por DC derivadas de medula óssea de murino (Travers JB et al., 2010). Os presentes peptídeos da invenção mostram níveis elevados de ligação a LTA estafilocócica in vitro e tal atividade pode prover um tratamento promissor para a neutralização do efeito tóxico de LTA ou LPS de bactérias gram-negativas liberadas durante infecção ou tratamento com antibióticos para melhorar condições associadas com choque séptico e pele com AD.

[0043] O potencial dos peptídeos da invenção para modular a expressão de TGF-β (fator de crescimento transformante beta) em queratinócitos é particularmente interessante. TGF-β é uma citocina pleitrópica/fator de crescimento que regula a proliferação celular, diferenciação, apoptose, remodelação da matriz, adesão, invasão e migração. Em geral, TGF-β1 pode ser produzido por muitos tipos de células diferentes. Verificou-se que todas as isoformas de TGF-β estimulam a síntese e turnover de proteínas da matriz extracelular por fibroblastos.

[0044] O folículo capilar é um componente integral da pele, e cada pelo é um produto queratinizado do folículo. Cada um e todos os folículos capilares são submetidos a um ciclo de atividade: o pelo cresce até um comprimento máximo, então o crescimento cessa e o pelo é eliminado e substituído. As fases do ciclo de crescimento do pelo são descritas como anágena, um longo período de crescimento; catágena, o período de transição de crescimento a repouso, com duração de 2 a 4 semanas; telógena, um período de inatividade com duração de 2-4 meses. Embora falte evidência direta em seres humanos, estudos em camundongos sugerem que a inibição da proliferação de queratinócitos e a indução da produção de TGF-β1 estão diretamente ligadas à regressão da catágena (Foitzik et al., 2000). A observação in vitro de que folículos capilares isolados em anágena de humanos e de ratos cultivados em órgãos têm o crescimento inibido por TGF-β1 se assemelha a estágios iniciais de uma transformação semelhante a catágena em vários aspectos. A atividade da SEQ ID NO 1, HB2233, para inibir o crescimento dos queratinócitos e modulação da expressão de TGF-β1 pode sugerir que os peptídeos da invenção têm potencial uso terapêutico como para a remoção de pelos indesejáveis. Além disso, a up-regulação de TGF-β também tem sido associada a imaturidade de melanócitos por down-regulação de MITF, bem como genes melanogênicos que resultam em cabelos brancos (Nishimura et al., 2010). Portanto, os peptídeos da invenção também têm grande potencial para aplicações tais como despigmentação de manchas escuras ou clareamento da pele.

[0045] Papilomas cutâneos (STs), fibromas moles, pólipos fibroepiteliais ou acrocórdons são todos termos alternativos para descrever uma condição benigna comum da pele, que consiste em um pedaço de pele se projeta da pele circundante. Histologicamente, STs são uma lesão polipoide com epiderme moderadamente acantótica sobreposta, um núcleo fibrovascular edematoso solto exibindo inflamação crônica leve e uma derme sem nervos. Pólipos cutâneos são considerados as lesões fibrosas mais comuns da pele. Embora a etiologia exata não seja totalmente compreendida, uma relação com obesidade, diabetes mellitus, fricção, acromegalia, transplante de órgão, papiloma vírus humano e outras condições tem sido relatada (Zaher et al., 2007). Fatores de crescimento e hormônios, bem como seus receptores, têm sido implicados por desempenhar um papel importante na formação de pólipos cutâneos (Safoury et al., 2010ab). O fato de que pólipos cutâneos são causados por fatores que estimulam a proliferação de queratinócitos epidérmicos e fibroblastos da derme, compostos, tais como os peptídeos da invenção, que inibem a proliferação celular podem ser potencialmente úteis para retardar a progressão e prevenir a formação de pólipos cutâneos.

[0046] Os exemplos a seguir são incluídos para demonstrar certas modalidades preferenciais da invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1: Identificação de peptídeos que estimulam a migração celular e o fechamento de feridas por raspagem

[0047] Queratinócitos de pele humana (ATCC CRL-2404) foram cultivados em meio de crescimento de queratinócito isento de soro suplementado com fator de crescimento epitelial humano recombinante (EGF) 5 ng/mL (Life Technologies, Grand Island, NY). As células foram semeadas em placas de 12 poços e permitidas alcançar 100% de confluência. Privou-se a monocamada de células de nutrientes por 24 horas, então uma ferida por raspagem foi feita usando uma ponta de pipeta P200 (200 μL). As feridas por raspagem foram lavadas e fotografadas no tempo 0. O peptídeo foi adicionado em uma concentração final de 20 μg/mL. As células foram mantidas em uma incubadora a 37 °C, 5% de CO2 com > 90% de umidade, exceto quando as imagens estavam sendo capturadas por um curto período à temperatura ambiente. O fechamento das feridas por raspagem foi acompanhado após 7-8 horas de tratamento e os resultados são mostrados na Tabela 1. Tabela 1. Estimulação da migração celular foi avaliada usando fechamento de ferida por raspagem de queratinócitos. Após 7 hr de tratamento, a porcentagem da área fechada de ferida tratada com PBS foi considerada como 100%; o fechamento de ferida tratada com peptídeo foi calculado e apresentado em relação àquele da tratada com PBS.

Exemplo 2: Citotoxicidade em queratinócitos de pele humana normais

[0048] Para garantir que os peptídeos não são citotóxicos para as células, queratinócitos epidérmicos humanos normais foram semeados em uma placa de 96 poços. A placa foi incubada a 37 °C na presença de 5% de CO2 para permitir que as células crescessem a > 95% de confluência. Os peptídeos foram diluídos em soluções de estoque a concentrações de 50, 100, 200, e 500 μg/mL. Os meios de cultura celular foram substituídos por meios frescos contendo peptídeos em várias concentrações, então incubados a 37 °C e 5% de CO2 por 24 hr. No final do tratamento, a viabilidade celular foi medida usando o kit de ensaio de MTT adquirido de ATCC (Manassas VA). Os resultados são mostrados na Tabela 1. Nas concentrações de 50 a 500 μg/mL, os peptídeos alteraram a viabilidade celular como medida usando o ensaio de MTT.

Exemplo 3: Identificação de peptídeos que estimulam a angiogênese

[0049] O ensaio de angiogênese foi desempenhado usando o Kit de Ensaio de Angiogênese In Vitra adquirido de Millipore. Resumidamente, a camada de matriz foi preparada com uma solução ECMATRIX™ de acordo com as instruções do fabricante. As células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) (ATCC, Manassas, VA) foram cultivadas em meio F12K completo (ATCC, Manassas, VA) suplementado com 0,1 mg/mL de heparina (Sigma-Aldrich), 30 μg/mL de ECGS (Sigma-Aldrich) e 10% de soro bovino fetal (ATCC, Manassas, VA). As células foram coletadas e ressuspensas em meio completo. O peptídeo foi misturado com as células a aproximadamente 5 x 103 a 1 x 104 células por poço em uma placa de 96 poços antes de semear as células sobre a superfície da solução de ECMATRIX™ polimerizada. A placa foi incubada a 30 °C, 5% de CO2 por até 9-12 hr. A formação do tubo foi inspecionada sob um microscópio de luz invertida periodicamente e fotos foram tiradas em intervalos de 3 e 5 hr e atribuiu-se um valor numérico para cada padrão como mostrado abaixo.

[0050] Como mostrado na Tabela 2. SEQ ID NOs 1-7 estimulam significativamente a formação de tubo capilar em células endoteliais da veia umbilical humana. Como esperado, LL-37 é usada como controle positivo e também estimula a angiogênese. PBS é usado como controle negativo e as células começam a migrar e alinhar-se, mas nenhum brotamento ou polígono fechado é formado a 5 hr. Tabela 2. Resultados da indução da formação de novos tubos capilares. Valores > 3 são considerados como indução significativa da angiogênese

Exemplo 4: Identificação de peptídeos para bloquear a expressão de IL-6 induzida por LTA

[0051] Estimulação de IL-6 induzida por LTA de S. aureus em queratinócitos epidérmicos humanos. Queratinócitos humanos foram cultivados até > 80 de confluência em meio de cultura de queratinócitos isento de soro. LTA de S. aureus 10 μg/mL foi pré-incubada com cada peptídeo (50 μg/ml) à temperatura ambiente por 30 min, então a mistura foi transferida para a cultura de queratinócitos. O tratamento foi permitido por 24 hrs. O sobrenadante foi removido. Após uma breve centrifugação para remover possíveis restos celulares, o sobrenadante foi submetido a teste de IL-6 usando kit ELISA adquirido de CellSciences (Canton, MA) de acordo com as instruções do fabricante. Como mostrado na Tabela 3, SEQ ID NOs 1-7 neutralizam ou antagonizam claramente o efeito de LTA de estimular a expressão de IL-6 em queratinócitos de pele humana. Tabela 3. Bloqueio da expressão de IL-6 induzida por LTA em queratinócitos de pele humana

Exemplo 5: Identificação de peptídeos para modular a proliferação de células e expressão de TGF-β em queratinócitos de pele humana.

[0052] Queratinócitos de pele humana (ATCC CRL-2404) foram cultivados em meio de crescimento de queratinócitos isento de soro suplementado com fator de crescimento epitelial (EGF) humano recombinante 5 ng/mL (Life Technologies, Grand Island, NY). As células foram examinadas ao microscópio diariamente. Conforme a cultura tornava- se 50-75% confluente, o meio na placa era aspirado e 0,25% de tripsina/EDTA era adicionado. Quando as células se tornavam arredondadas e desaderidas, a tripsina era neutralizada pela adição de meio de cultura fresco. As células foram então centrifugadas e o pellet foi ressuspenso em meio de cultura fresco. Um hemacitômetro foi usado para contar a suspensão de células e o número total de células foi ajustado para cerca de 500-1000 células por poço pela adição de 100 μL de suspensão de células a cada poço. Tipicamente, os 60 poços centrais são usados e os poços externos são preenchidos com meio fresco para minimizar a evaporação. Quando as células se aderiram em cada poço após 6-8hr de incubação, 100 μL de meio fresco contendo PBS ou 2x as concentrações desejadas de peptídeo foram adicionados em triplicatas. A microplaca foi então incubada a 37 graus C e 5% de CO2 por 48-72hr.

[0053] No final da incubação, as células foram submetidas a ensaio de citotoxicidade celular SRB CYTOSCAN™ (GBiosciences, St. Louis, MO) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram fixadas anteriormente em coloração suforodamina B (SRB). Após lavagem extensiva, a cor foi solubilizada usando tampão de solubilização. A absorbância foi medida a 565 nm com um leitor de microplacas. Os resultados apresentados na Tabela 5 são o valor médio de tratamento em triplicata e os valores acima de +10% do controle foram considerados significativos.

[0054] A estimulação de TGF-β foi desempenhada por Sunny Biodiscovery Lab (Santa Paula, CA). Resumidamente, os queratinócitos epidérmicos humanos neonatais normais foram cultivados em meio de crescimento de queratinócitos cellnTec (Suíça). O meio não continha nenhum TGF-β, de acordo com o fornecedor do meio. No dia do experimento, o meio de crescimento foi renovado e as células foram tratadas com 50 μg/mL de peptídeo em triplicata por 72 hr. No final do tratamento, o sobrenadante foi removido, ativado e quantificado usando Kit ELISA de TGF-β1 total LEGEND MAXTM (BioLegend, San Diego, CA). Tabela 4. Atividade dos peptídeos da invenção sobre a proliferação celular e a produção de TGF-β em queratinócitos de pele humana

Exemplo 6: Efeito do peptídeo representativo sobre construto de tecido humano com psoríase SOR-300-FT.

[0055] Tecidos SOR-FT-300™ foram transferidos para placas de 6 poços contendo 0,9 mL de meio de ensaio pré-aquecido e equilibrado para as condições de cultura padrão (37 °C, 5% de CO2) por 1 hora. Após o equilíbrio de 1 hora, os tecidos foram realimentados com meio fresco como segue: 1) para o ponto de tempo de 24 hr, os tecidos foram alimentados com 0,9 mL de meio e 2) para pontos de tempo > 24 hr, os tecidos foram alimentados com 5 mL de meio de cultura através da colocação dos insertos de cultura de células na parte superior das anilhas (Parte # EPI WSHR, MatTek Corporation). Em seguida, 50 μL dos artigos de teste foram aplicados topicamente aos tecidos com psoríase (n = 3) e o artigo de teste foi adicionado ao meio de cultura nas 3 concentrações escolhidas pelo Patrocinador. Nos tempos 24 e 48 horas: a) os tecidos foram lavados topicamente 3X com 300-400 μL de PBS, b) os insertos contendo os tecidos foram mantidos firmemente com fórceps estéreis e o artigo de teste foi lavado suavemente por imersão do inserto em PBS e decantando-se o meio do inserto, e c) artigo de teste fresco foi reaplicado ao tecido imediatamente depois da lavagem e decantação (50 μL topicamente). A análise foi desempenhada em t = 72 h (aplicações repetidas 3x). cDNA foi gerado usando o Kit Qiagen RT2 First Strand (cat# 330401). A expressão gênica relativa foi medida usando Qiagen RT2 SYBR Green qPCR Mastermix (cat# 330502) e primers Qiagen RT2. A análise foi realizada usando software Bio-Rad CFX. Tabela 5. Mudança nos níveis de expressão gênica após o tratamento de HB2233 e calcipotriol sobre o tecido SOR-300-FT

Exemplo 7: Análise da perfilagem gênica em substitutos de pele humana normal.

[0056] Os 84 genes que codificam a matriz extracelular e moléculas de adesão foram analisados usando arranjos de PCR realizados por Sunny Biodiscovery, Inc. (Santa Paula, CA). Resumidamente, substitutos de pele EPIDERM™ (Cat.# EPI-212) foram obtidos de MatTek (Ashland, MA) e foram tratados de acordo com as instruções do fabricante. Após equilíbrio durante a noite, o meio foi trocado e HB2233 (330 μg/mL) ou controles de água foram aplicados no topo do tecido de pele em duplicata e o tratamento foi permitido por 24 horas. No final do tratamento, tecidos foram coletados e preservados em solução RNAlater (Ambion, Austin, TX). O RNA foi extraído e purificado com o kit Illustra mini RNAspin (Cat. # 95017-489, GE Healthcare, Piscataway, NJ). RNA total purificado foi avaliado a 260 nm e 280 nm com espectrofotômetro de arranjo de diodos Agilent HP-8452A. A concentração de RNA foi equalizada ao longo das amostras e a expressão de genes de interesse foi medida por PCR quantitativo em tempo real com Sistema de Detecção BioRad iCycler iQ usando arranjos de PCR HAP-121A, com kit de síntese de 1a fita. Master mix SYBR Green e condições de execução de PCR de Qiagen. Método de eficiência ΔΔCt foi usado para a quantificação dos resultados, após a normalização da expressão gênica para 5 genes intrínsecos realizada com a análise por software RT2 Profiler PCR Array Data versão 3.5. Os genes foram considerados diferencialmente expressos se o nível de expressão fosse razoavelmente elevado (menos de 30 ciclos para detecção) e a modulação foi de 1,5 ou mais em cada série de duplita. Tabela 6. Perfilagem de expressão gênica selecionada em tecido de pele EPIDERMTM tratado com HB2233 vs. controle de água tratada, representada como mudança em vezes

[0057] Todas as composições ou métodos divulgados e reivindicados neste documento podem ser feitos e executados sem experimentação indevida à luz da presente divulgação. Embora as composições e métodos desta invenção tenham sido descritos em termos de modalidades preferenciais, será evidente para aqueles versados na técnica que variações podem ser aplicadas às composições e/ou métodos e nas etapas ou na sequência de etapas dos métodos descritos neste documento sem afastamento do conceito, espírito e escopo da invenção. Mais especificamente, será aparente que certos agentes que são química e fisiologicamente relacionados podem ser substituídos pelos agentes descritos neste documento, sendo que resultados iguais ou semelhantes seriam atingidos. Todos os substitutos e modificações semelhantes aparentes àqueles versados na técnica são considerados como estando dentro do escopo da invenção.

[0058] Todas as patentes e publicações identificadas neste pedido são incorporadas neste documento por referência na sua totalidade. Referências

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Claims (4)

1. Composição compreendendo um tetrapeptídeo e um carreador farmaceuticamente aceitável, caracterizada pelo fato de que o tetrapeptídeo consiste na sequência de peptídeos de SEQ ID NO: 1 (IEKM), SEQ ID NO: 2 (VEKF), SEQ ID NO: 3 (IEKI), SEQ ID NO: 4 (IQKI), SEQ ID NO: 5 (IKKW), SEQ ID NO: 6 (IKKV) ou SEQ ID NO: 7 (IKKL), em que o C-terminal está na forma de ácido livre e o N-terminal está lipidado ou não modificado.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende um ou ambos enantiômeros de aminoácido L e D.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o tetrapeptídeo está presente em uma concentração que varia entre cerca de 0,1 μg/mL a cerca de 500 μg/mL, ou cerca de 0,1 μg/mL a cerca de 20 mg/mL.

4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a composição está na forma de um aerossol, emulsão, líquido, loção, solução, gel, microencapsulada, creme, pasta, pomada, pó ou espuma, ou é incorporada em um dispositivo adaptado para aplicação à superfície da pele ou sob o tecido da pele.