ES2404669T3

ES2404669T3 - Péptidos bioactivos cortos para modulación celular e inmunológica

Info

Publication number: ES2404669T3
Application number: ES07868047T
Authority: ES
Inventors: Scott M. Harris; Lijuan Zhang; Timothy J. Falla
Original assignee: Helix Biomedix Inc
Current assignee: Helix Biomedix Inc
Priority date: 2007-01-05
Filing date: 2007-12-27
Publication date: 2013-05-28
Anticipated expiration: 2027-12-27
Also published as: PL2125878T3; EP2125878A1; BRPI0720874A2; JP2010515679A; CY1114002T1; MX2009007248A; CA2673791C; EP2125878B1; DK2125878T3; AU2007342353A1; RU2458069C2; CN101679495A; BRPI0720874C1; RU2009129950A; AU2007342353B2; US7696174B2; SI2125878T1; CA2673791A1; WO2008085494A1; BRPI0720874B1

Abstract

Un péptido aislado, en el que la secuencia del péptido consiste en de cuatro a catorce restos de aminoácidoscontiguos de la SEC ID NO:1, y en el que el péptido comprende las SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SECID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15.

Description

Péptidos bioactivos cortos para modulación celular e inmunológica

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad para la Solicitud Provisional de los Estados Unidos Nº 60/878.849, presentada el 5 de enero del 2007.

Campo de la Invención

La invención se refiere a péptidos que tienen actividad biológica y terapéutica. De manera particular, la invención se refiere a péptidos cortos que tienen de cuatro a catorce restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1 que presentan actividades proliferativa, migratoria y antiinflamatoria hacia células tales como queratinocitos. Adicionalmente la invención se refiere a procedimientos de uso de estos péptidos para tratar diversas agresiones que afectan a la piel y a otras superficies corporales relacionadas, tales como la cavidad oral.

Antecedentes de la Invención

La epidermis de la piel consta de cuatro a cinco capas estratificadas, comprendiendo todas principalmente queratinocitos; otros tipos de células tales como fibroblastos también se encuentran en la epidermis. Los queratinocitos se originan a partir de la capa basal más inferior de la epidermis, y gradualmente migran a la parte más exterior de la piel, donde se transforman en corneocitos y eventualmente se desprenden. Durante esta migración, los queratinocitos se diferencian para expresar las enzimas y proteínas estructurales necesarias para la cornificación (Presland y Dale, 2000). Dada su importante función en la formación de la epidermis, los queratinocitos representan un objetivo principal para tratar piel dañada.

Los queratinocitos también son el constituyente principal de los tejidos mucosos que se encuentran a continuación de la epidermis (Presland y Dale, 2000). Dichos tejidos carecen de la capa de epidermis, impermeable, cornificada, y forman las superficies de revestimiento internas asociadas con la boca, nariz, garganta, oído, ano y genitales. Similar a la piel, las superficies mucosas son importantes para prevenir la entrada de agentes infecciosos en el organismo; por tanto, si se produce una lesión en cualquiera de estos tipos de tejidos puede comprometer la salud de un individuo.

Los daños en la piel y en el tejido mucoso se producen cuando la capa epidérmica se rompe, tal como cuando se produce una laceración, quemadura o ampolla. La lesión también puede implicar aplastamiento o hematoma, lo que implica daño del tejido sin fisura simultánea de la epidermis. Las infecciones en la piel, así como determinadas dolencias crónicas, tales como cáncer y enfermedades autoinmunes, también pueden tener un efecto negativo sobre las superficies epidérmicas. Las úlceras, tales como las que afectan a diabéticos o las asociadas con escaras, son otra forma de daño en la piel; frecuentemente estas heridas son bastante intratables, inflamándose, propensas a infecciones, y requiriendo un lento proceso de curación. Generalmente se ha postulado que la persistencia de una úlcera, o cualquier otra herida crónica, se debe a un fallo en los procesos celulares implicados en la curación, tales como la señalización celular (Enoch y Price, 2004; Sweitzer y col., 2006). Un fallo es la incapacidad de epitelizar la lesión, aunque los queratinocitos que se encuentran en los bordes de la herida pueden proliferar, no se desplazan para tapar la llaga (Enoch y Price, 2004). Con relación a úlceras diabéticas, otro fallo es la falta de determinadas moléculas de señalización; esta deficiencia puede imposibilitar los procesos de remodelación que son necesarios para orquestar el cierre de heridas (Sweitzer y col., 2006).

Otras formas de daño epidérmico son sutiles y se producen durante un largo de periodo de tiempo, comprometiendo eventualmente la función de la piel en la cara de la lesión aguda; la curación de heridas se prolonga en el tiempo y puede no ser perfecta (por ejemplo, formación de cicatrices). Problemas cosméticos tales como arrugas, sequedad, adelgazamiento, descolgamiento y mayor susceptibilidad a hematomas son síntomas externos habituales de dichas enfermedades. De manera no sorprendente, estos síntomas de desgaste están normalmente asociados con el envejecimiento, pero también pueden producirse prematuramente debido a una exposición prolongada a agentes dañinos tales como rayos ultravioleta (foto-envejecimiento). Los procesos foto-reactivos, inducidos por la luz solar, pueden contribuir a reducir el espesor y la elasticidad de piel, así como a endurecer la piel (Pelicci, 2004; Fisher y col., 2002).

La curación de heridas agudas en la piel y en las mucosas se orquesta, en parte, a través de la activación de queratinocitos basales que siguen una trayectoria de proliferación, migración y diferenciación para efectuar el cierre de las heridas. Este proceso viene acompañado por una serie de actividades de remodelación en el sitio de la lesión (Enoch y Price, 2004). Los queratinocitos localizados en el perímetro de la herida proliferan y migran para formar una sola capa sobre la herida en un proceso denominado epitelialización. La proliferación y diferenciación adicional de los queratinocitos establece una capa epidérmica que comprende las capas estratificadas normales. Los procesos inflamatorios pueden facilitar la curación de las heridas; los monocitos infiltrantes combaten la infección y también liberan factores que estimulan la epitelialización de las heridas. Sin embargo, los procesos inflamatorios también pueden agravar la curación; por ejemplo, la deposición de fibrina por macrófagos contribuye a la cicatrización. Siempre y cuando se mantengan condiciones antisépticas, se ha demostrado que el cierre de heridas epidérmicas se produce de una manera mas rápida y con menos cicatrización cuando se reduce la implicación inmunológica (Martin y Leibovich, 2005). Teniendo en cuenta estos conocimientos actualmente se contemplan

modos para modular negativamente la inflamación en lesiones epidérmicas.

Se ha demostrado que diversos factores estimulan la epitelialización por parte de los queratinocitos durante la curación de heridas en la piel y en tejidos mucosos asociados, que incluyen el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), el factor de crecimiento de queratinocitos (KGF), y los factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF) (Enoch y Price, 2004). Curiosamente, también se sabe que, diversas proteínas antimicrobianas, que están presentes en las superficies de piel y mucosas, desempeñan una función estimulando la proliferación y migración celular necesarias para curar heridas epidérmicas (Shaykhiev y col., 2005; Braff y Gallo, 2006; Zhang y Falla, 2006).

Sabiendo que determinados factores de crecimiento están naturalmente vinculados durante la curación de heridas, el trabajo se ha dirigido a desarrollar procedimientos basados en factores de crecimiento para tratar heridas, especialmente las que son generalmente crónicas. Por ejemplo, el tratamiento de úlceras diabéticas con PDGF-BB (Mustoe y col., 1994; Steed, 1995) ha obtenido la aprobación de la FDA. Sin embargo, la mayoría de los intentos que emplean dicha estrategia no han podido lograr resultados clínicamente significativos, debido en parte a dificultades asociadas con el uso de proteínas terapéuticas. Un problema se refiere a la administración ineficaz de factores de crecimiento en el lugar de la herida; la aplicación tópica de estas proteínas solo permite la exposición de tejido exterior, principalmente muerto, a la proteína terapéutica. Otros inconvenientes se refieren a la alta inestabilidad y escasa retención de las proteínas de factores de crecimiento después de la administración en el lugar de la herida.

Las dificultades con el uso de factores de crecimiento y otras proteínas para tratar heridas epidérmicas se relacionan con el gran tamaño de las proteínas implicadas. El amplio uso de terapias con factores de crecimiento también sufre la complejidad y los altos costes asociados con la preparación de proteínas grandes. Por lo tanto, en lo que respecta al uso de factores de proteína en regímenes de curación de heridas, actualmente se buscan preparaciones menos costosas y más eficaces. Los péptidos cortos que llevan la actividad de las proteínas más grandes de las cuales derivan (es decir, la proteína parental) cumplen esta necesidad. Se han descrito ejemplos previos de dichos péptidos cortos (Patentes de Estados Unidos 6.861,406 y 6.693,077; Lee y col., 2004). Además de los beneficios inmediatos de producción, manejo y manipulación menos costosos y más sencillos, el tejido herido también absorbe y retiene mejor los péptidos bioactivos pequeños. Las características de absorción avanzadas de los péptidos bioactivos cortos también los convierte en una opción viable para usos más allá del cuidado de lesiones agudas y crónicas, tal como para el tratamiento de problemas de la piel asociados con el envejecimiento y exposición solar.

Sumario de la Invención

La presente invención se dirige a péptidos bioactivos cortos que son útiles para promover la curación de heridas en mamíferos. Las heridas a las que se dirigen preferentemente los péptidos aislados son las que están relacionadas con la piel y las superficies mucosas asociadas. Aunque sin limitarse a ningún mecanismo particular, los péptidos de la invención pueden curar heridas estimulando la proliferación y migración celular, así como inhibiendo la inflamación, la cual puede perjudicar a los procesos de curación óptimos. Los péptidos de la invención son útiles tanto in vitro como in vivo, y pueden inducir las actividades anteriormente mencionadas en queratinocitos.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un péptido aislado, en el que la secuencia del mismo consta de cuatro a catorce restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1, y en el que el péptido comprende la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7. SEC ID NO:8 SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15. Dichos péptidos representan fragmentos cortos del péptido HB-107. Los péptidos aislados pueden contener formas enantioméricas de aminoácidos ya sea L o D, o combinaciones de las mismas. De acuerdo aun con otra realización de la invención, los péptidos aislados pueden conjugarse con una proteína vehículoa, o modificarse mediante amidación o lipidación. Estas adiciones mejoran la bioactividad de los péptidos cuando se aplican a piel y a sus heridas.

De acuerdo con determinadas realizaciones preferidas de la presente invención, los péptidos aislados pueden contener un resto de aminoácido de metionina, de valina, de lisina o de glutamato en el extremo amino. Los péptidos aislados también pueden tener un resto de aminoácido de lisina, valina, glicina, o asparagina en el extremo carboxilo. Los péptidos aislados de la invención comprenden las SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15, presentando todas ellas una o más actividades estimuladoras hacia la proliferación, migración, y antiinflamación celular. Todas las SEC ID Nos: 2, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11 y 12 de estos péptidos específicos poseen actividad celular proliferativa; y de estos péptidos, las SEC ID Nos: 2, 3, 5, 6 y 9 presentan la actividad proliferativa mas fuerte. Los péptidos de las SEC ID Nos:3 y 6 poseen actividad celular tanto proliferativa como migratoria. La SEC ID NO:12 posee actividad celular tanto proliferativa como antiinflamatoria, mientras que las SEC ID NOs:8 y 15 poseen actividad celular antiinflamatoria.

Otra realización de la presente invención se dirige a composiciones que contienen un vehículo farmacéuticamente aceptable y uno o más de los péptidos de la invención anteriormente mencionados. Preferentemente, en dichas composiciones la concentración del péptido varía de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 20 μg/ml, o de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 50 μg/ml. Son formas preferidas de la composición los aerosoles, emulsiones, líquidos, lociones, cremas, pastas, pomadas, polvos y espumas.

De acuerdo con un aspecto adicional de la invención, se proporciona un medicamento para su uso en la curación de heridas en un mamífero cuando se aplica una cantidad terapéuticamente eficaz durante una cantidad de tiempo eficaz, en el que dicho medicamento comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un péptido, en el que la secuencia del péptido consta de cuatro a catorce restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1, y en el que el péptido comprende las SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7. SEC ID NO:8 SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15.

La presente invención también se refiere a procedimientos de uso de las composiciones anteriormente mencionadas para curar heridas en mamíferos. Normalmente, el procedimiento de tratamiento supone administrar a las heridas una cantidad eficaz de las composiciones que contienen el péptido, especialmente heridas de la piel (epidermis) y tejidos mucosos asociados, durante una cantidad de tiempo eficaz. Dichas heridas incluyen abrasiones, ampollas, quemaduras, laceraciones, úlceras, hematomas, sarpullidos, cicatrices, y los efectos del envejecimiento y la exposición ambiental.

Breve Descripción de las Figuras

FIG. 1: Se muestra como se alinean los péptidos de la invención con el péptido parental HB-107 (SEC ID NO:1).

FIG 2: Expresión de IL6 por células epiteliales de piel en respuesta a exposición a luz ultravioleta B (UVB). Las células se expusieron a radiación UVB durante determinados periodos de tiempo (0-35 segundos) y veinticuatro horas después de la radiación UVB la expresión de IL6 se midió por ELISA. Cada tratamiento se realizó por triplicado. Véase el Ejemplo 4.

FIG 3: Efecto de péptidos cortos sobre la expresión de IL6 inducida por UVB en células epiteliales de piel. Las células se expusieron a radiación UVB durante 35 segundos, después de lo cual las células se incubaron en medio completo (sin suero) con 40 μg/ml de péptido [HB-107 (SEC ID NO:1), HB-802 (SEC ID NO:12), HB-1410 (SEC ID NO:15), HB-801 (SEC ID NO:31)] durante veinticuatro horas. Después, la expresión de IL6 se midió por ELISA. Véase el ejemplo 4.

Descripción Detallada de la Invención

Las patentes de Estados Unidos 5,962,410 y 5,861,478 proporcionan divulgaciones útiles para el entendimiento de la presente invención. La invención se refiere a péptidos bioactivos, cortos que, por ejemplo, derivan del péptido HB107 (SEC ID NO:1), y a procedimientos de su uso. El propio péptido HB-107 constituye un fragmento de cecropina B, una proteína antimicrobiana presente en una especie de polilla. Aunque HB-107 no presenta los efectos bacteriostáticos de la proteína de la cual deriva, presenta cualidades para la curación de heridas epidérmicas (Lee y col., 2004).

Los péptidos de la presente invención presentan actividades que son importantes para regular positivamente procesos de curación en tejidos epidérmicos tales como piel y mucosa asociada (por ejemplo, cavidad oral). Sin limitarse a ningún mecanismo particular, estas actividades se dirigen a queratinocitos, las células epiteliales responsables del cierre de heridas (es decir, epitelialización) y del desarrollo de las superficies epidérmicas. Las actividades específicas que los péptidos de la invención dirigen hacia los queratinocitos, que son de relevancia directa en la curación de heridas, son estimulación de proliferación y migración celular, así como la capacidad para regular negativamente la señalización inflamatoria por los queratinocitos. Aunque el péptido HB-107 es capaz de inducir todas de estas actividades en queratinocitos, de manera bastante sorprendente, los péptidos de la presente invención lo hacen a niveles iguales o mayores que HB-107. Estos resultados son tanto sorprendentes como significativos, dado que los péptidos de la invención tienen solo una longitud del 26 %-74 % con respecto a la del péptido HB-107.

Debido a esta diferencia de tamaño, los péptidos de la presente invención son más fáciles y por tanto menos costosos de preparar, en comparación con la producción de HB-107 y proteínas de tamaño completo tales como PDGF-BB. A diferencia también de lo que ocurre con péptidos más grandes, los péptidos divulgados se solubilizan, se manipulan (por ejemplo, modificación química) y conservan de una manera más directa. Su facilidad de manipulación permite un gran número de opciones de administración de fármaco, tales como el vehículo que va a usarse y la forma en la que este va a aplicarse. El tamaño y la mayor solubilidad de los péptidos de la invención permiten aumentar su fuerza de curación aumentando la absorción y retención en el lugar de la herida; los queratinocitos locales y otras células se exponen a mayores concentraciones de péptidos durante periodos de tiempo más prolongados.

Las actividades biológicas suscitadas por los péptidos de la presente invención son proliferación y migración celular, así como la inhibición de inflamación. Los dos primeros procesos desempeñan un gran papel mediando en la función de curación de heridas de los péptidos. En primer lugar los péptidos pueden estimular la migración de queratinocitos que rodean el borde de la herida, y en segundo lugar, pueden estimular la proliferación de estas células para crear una nueva capa epidérmica sobre el lugar de la lesión. La tercera actividad, inhibir la inflamación, se consigue mediante el efecto negativo de los péptidos divulgados sobre la secreción de la citocina interleucina-6 (IL6) por las células en la herida. Se ha demostrado que los queratinocitos epidérmicos liberan IL6 en respuesta a factores asociados con el daño tisular (Sugawara y col., 2001); esta citocina señaliza la infiltración celular inmunológica en la

herida, un proceso que puede de hecho empeorar la curación y ocasionar cicatrización (Martin y Leibovich, 2005; Liechty, 2000). Aunque la inflamación es importante para prevenir la infección de heridas, la adquisición de buenas prácticas antisépticas durante el cuidado de heridas convencionales anula cualquiera de los inconvenientes que puedan asociarse con el bloqueo de la inflamación. Aunque las actividades anteriores son probablemente aquellas a través de las cuales la invención efectúa la curación de heridas, se observa que la solicitud no está limitada por ningún conjunto de mecanismos biológicos en particular.

Con respecto a inducir la proliferación y migración celular, se prefieren los péptidos SEC ID NO:3 (HB-1061) y SEC ID NO:6 (HB-1072). Estos péptidos producen aumentos significativos en la proliferación celular en comparación con la inducción por HB-107, pero son incluso mas cortos que HB-107 (véanse los Ejemplos 1 y 2). También pueden, al igual que HB-107, inducir la migración celular. Con respecto a la inducción de la actividad antiinflamatoria celular, se prefieren los péptidos SEC ID NO:8 y SEC ID NO:12. (Véase el Ejemplo 3).

Los péptidos de la invención también presentan efectos beneficiosos para problemas asociados con el envejecimiento de la piel, o piel muy expuesta a agentes dañinos tales como radiación solar. Los péptidos cortos, de por sí inalterados, pueden fabricarse mediante modificación química y/o administración especializada, para absorberse a través de la epidermis para efectuar procesos contrarios a aquellos que ocasionan adelgazamiento de la piel, arrugas, fragilidad y aspereza/endurecimiento. Un modo principal mediante el cual la invención estimula la conservación de la piel es a través del efecto positivo de los péptidos hacia el crecimiento de queratinocitos. Como estas células son el componente principal de las superficies epidérmicas y disminuyen en piel envejecida y dañada (Enoch y Price, 2004), se espera que su reposición, por estimulación de péptidos, invierta los problemas anteriormente mencionados. La expresión de IL6 está implicada en procesos subyacentes al engrosamiento anómalo de la epidermis en pacientes con determinados problemas autoinmunes (Sato y col., 2001; Oyama y col., 1998); los péptidos de la invención pueden bloquear dicho resultado relacionado con la inflamación inhibiendo la expresión de IL6.

Péptidos

Solamente como un punto de guía, los péptidos de la invención pueden derivar del fragmento HB-107 (Tabla 1) de la proteína cecropina B de la polilla. Las características metabólicas asociadas con estos péptidos son su capacidad para inducir actividades de proliferación, migración, y/o antiinflamación celular. Todos los péptidos de la invención comparten la característica común de tener de cuatro a catorce restos de aminoácidos contiguos de HB-107 (SEC ID NO:1). Por lo tanto, los péptidos de la invención pueden constar de cuatro, cinco, siete, nueve, once o catorce restos de aminoácidos contiguos de HB-107 (SEC ID NO:1).

Aparte de tener las composiciones de aminoácidos anteriores, los péptidos anteriormente descritos pueden contener adicionalmente los siguientes aminoácidos (nombre completo/abreviatura de tres letras/abreviatura de una sola letra): alanina/ala/A, arginina/arg, R, asparagina/asn/N, aspartato/asp/D, cisteína/cys/C, glutamina/gln/Q, glutamato/glu/E, glicina/gly/G, histidina/his/H, isoleucina/ile/I, leucina/leu/L, lisina/lys/K, metionina/met/M, fenilalanina/phe/F, prolina/pro/P, serina/ser/S, treonina/thr/T, triptofano/trp/W, tirosina/tyr/Y y valina/val/V. Estos restos de aminoácidos se caracterizan de la siguiente manera: alifáticos (alanina, glicina, isoleucina, leucina, prolina, valina), aromáticos (fenilalanina, triptófano, tirosina), ácidos (aspartato, glutamato), básicos (arginina, histidina, lisina), hidroxílicos (polares) (serina, treonina), conteniendo azufre (polares) (cisteína, metionina),y amídicos (asparagina, glutamina). También pueden incorporarse en el péptido divulgado restos de aminoácidos no convencionales, incluyendo, pero sin limitación, selenocisteína, pirolisina y varias formas cíclicas de aminoácidos.

Los siguientes péptidos son ejemplos de la presente invención y se muestran con fines ilustrativos (Tabla 1).

Tabla 1: Péptidos de la presente invención 5

SEC ID NO:: Péptido Secuencia

1: HB-107 MPKEKVFLKIEKMGRNIRN

2: HB-1059 EKMGRNIRN

3: HB-1061 MGRNIRN

4: HB-1062 GRNIRN

5: HB-1071 VFLKIEKMG

6: HB-1072 KIEKMG

7: HB-1074 VFLKIEK

8: HB-1076 KEKVLFKIE

9: HB-1057 KIEKMGRNIRN

10: HB-912 MPKEKVFLKIEKMG

11: HB-801 PKEKV

12: HB-802 MPKEK

13: HB-1056 LKIEKMGRNIRN

14: HB-1060 KMGRNIRN

15: HB-1410 PKEK

Los péptidos SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 y SEC ID NO:15 son ejemplos de péptidos asociados con una o mas de las actividades (proliferativa, migratoria, antiinflamatoria) descritas anteriormente. Los péptidos SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11 y SEC ID NO:12 son ejemplos de péptidos que pueden inducir proliferación celular. Los péptidos SEC ID NO:3 y SEC ID NO:6 son ejemplos de péptidos que pueden inducir proliferación y migración celular. El péptido SEC ID NO:12 es un ejemplo de un péptido que presenta actividad tanto proliferativa como antiinflamatoria. Los péptidos SEC ID NO:8 y SEC ID NO:15 son ejemplos de péptidos que tienen actividad antiinflamatoria.

Cada uno de los péptidos anteriormente descritos puede comprender enantiómeros de aminoácidos L o D, ya sea conteniendo restos de una forma enantiomérica o una combinación de ambas formas. Los péptidos pueden además aumentarse o modificarse, ya sea química o enzimáticamente, como se describe en los siguientes ejemplos no limitantes. El extremo carboxilo de los péptidos puede ser ácido (-COOH) o puede amidarse (por ejemplo, -CONH2, -CONHR, o -CONR2). La amidación del extremo carboxilo puede hacer que los péptidos de la invención sean menos susceptibles a la degradación por proteasas y aumentar su solubilidad en comparación con las formas de ácido libre, proporcionando de esta manera una fuerza terapéutica intensificada. Los péptidos también pueden lipidarse lo que puede proporcionar una penetración potenciada en la piel. Pueden realizarse modificaciones peptídicas de tal modo que un hidrógeno del grupo amino N-terminal se reemplace, un grupo hidroxilo (OH) del grupo carboxílico C-terminal se reemplace, todo el grupo amino N-terminal se reemplace, o todo el grupo carboxílico C-terminal se reemplace. Uno o mas de los enlaces moleculares que enlazan a los aminoácidos de cada péptido puede ser un enlace no peptídico. Dichos enlaces no peptídicos incluyen, pero sin limitación, enlaces imido, éster hidrazina, semicarbazoide y azo.

En los péptidos pueden realizarse diversas modificaciones siempre y cuando se conserven las actividades proliferativa, migratoria y antiinflamatoria características de los mismos. Para aumentar la fuerza del péptido pueden usarse algunas modificaciones, mientras que otras modificaciones pueden facilitar la manipulación del péptido. Los grupos funcionales de péptidos que pueden modificarse normalmente incluyen hidroxilo, amino, guanidinio, carboxilo, amida, fenol, anillos de imidazol o sulfhidrilo. Las reacciones no limitativas, típicas de estos grupos incluyen las siguientes: acetilación de grupos hidroxilo por haluros de alquilo; esterificación, amidación o hidrogenación (es decir, reducción a alcohol) de grupos carboxilo; desamidación, acilación, alquilación, arilación de grupos amino (por ejemplo, grupo amino primario del péptido o el grupo amino de restos de lisina); halogenación o nitración de grupos de fenol de la tirosina.

Los péptidos pueden conjugarse con moléculas vehículo solubles o insolubles para modificar sus propiedades de solubilidad según sea necesario y para aumentar las concentraciones locales de péptidos en tejidos diana. Los ejemplos de moléculas vehículo solubles incluyen polímeros de polietilenoglicol (PEG) y polivinilpirrolidona; los ejemplos de polímeros insolubles incluyen silicatos, poliestireno y celulosa. Los péptidos también pueden estar microencapsulados para potenciar su estabilidad durante y después de la aplicación terapéutica; normalmente, se usan microesferas de poliéster y PEG para encapsular y estabilizar a los péptidos.

Pueden emplearse diversos procedimientos de preparación de microesferas para la encapsulación de péptidos dependiendo de la naturaleza hidrófila o hidrófoba de la composición peptídica a encapsular. Ejemplos de protocolos de dichos procedimientos se encuentran en Wang HT y col., (1991, J. Control. Release 17:23-25) y en la patente de Estados Unidos 4,324,683, ambas referencias se incorporan en el presente documento en su totalidad. Pueden realizarse estudios de liberación de péptidos in vitro para determinar la disponibilidad relativa del péptido después de haberse incorporado en una microesfera. Las microesferas (200 mg) se suspenden en una solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,2 (2,5 ml) y se agitan a 37 grados C y a 100 rpm en un agitador incubador ambiental (G-24, New Brunswick Scientific Co., Edison, N.J). A tiempos de muestreo específicos (cada día durante los 4 primeros días y posteriormente cada dos días) la solución tampón se elimina por completo y se sustituye por PBS reciente. El contenido peptídico de la PBS se mide usando el procedimiento de Bradford u otro ensayo cuantitativo adecuado normalmente usado para análisis de proteínas.

Todos los péptidos divulgados pueden sintetizarse usando química de fase sólida Fmoc (9-fluroenilmetoxicarbonilo) en un Sintetizador Peptídico Múltiple Apex 396 de Advanced ChemTech. El Apex 396 se equipa con un bloque de reacción de 40 pocillos para la producción de hasta 40 péptidos simultáneamente a una escala de 0,15 mmol. Los péptidos pueden prepararse como secuencias amidadas o de ácido libre usando aminoácidos convencionales. La resina se lavó primero y se pre-hinchó con N,N-dimetil formamida (DMF). El tiempo de hinchamiento fue de una hora para resinas de amida Rink. El grupo protector Fmoc se eliminó con piperidina al 25 % en DMF durante 25 minutos, después de lo cual la piperidina se lavó por completo de la resina. Para controlar los procesos de racemización, los monómeros de aminoácidos Fmoc se pre-activaron en una solución equimolar de 1-hidroxi-benzotriazol (HOBt) o 1hidroxi-7-aza-benzotriazol (HOAt) en DMF a una concentración de 0,5 M. Los acoplamientos amida se realizaron usando hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HATU) PyBop® o hexafluorofosfato de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio (HBTU) como un agente de activación y 2,5-5,0 veces de exceso molar de aminoácido en condiciones básicas usando una base impedida (diisopropiletilamina). Los tiempos de acoplamiento fueron de 1-1,5 horas seguido de un lavado y re-acoplamiento para lograr un acoplamiento doble o triple antes de la desprotección y continuación del aumento de la cadena peptídica. La eficiencia del acoplamiento se controló usando el ensayo de Kaiser convencional. Una vez completada la síntesis peptídica en la resina, el grupo Fmoc final se eliminó como se ha indicado anteriormente y las secuencias se dejaron como la base libre.

La escisión del enlace ácido inestable del péptido de la resina se realizó usando ácido trifluoroacético (TFA) al 95 % y agua, añadiendo los eliminadores apropiados. Después se permitió que la escisión procediera durante aproximadamente 30 minutos a una hora, los péptidos liberados se eliminaron inmediatamente del bloque de escisión y se transfirieron a tubos para eliminar el TFA a presión reducida. Después, los péptidos quedaron listos para la purificación y el análisis mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) usando una columna C18 de fase inversa y espectrometría de masas. La confirmación de la secuencia primaria y la purificación preparativa se logró usando un sistema LC/MS/MS (ABI API2000).

General al protocolo anterior, los péptidos pueden producirse usando cualquier procedimiento conocido por los expertos en la materia tales como los divulgados en Merrifield, R. B., Solid Phase Peptide Synthesis I., J. AM. CHEM. SOC. 85:2149-2154 (1963); Carpino, L. A. y col., [(9-Fluorenylmethyl)Oxy] Carbonyl (Fmoc) Amino Acid Chlorides: Synthesis, Characterization, And Application To The Rapid Synthesis Of Short Peptides, J. ORG. CHEM. 37:51:3732-3734; Merrifield, R. B. y colaboradores, Instrument For Automated Synthesis Of Peptides, ANAL. CHEM. 38:1905-1914 (1966); o Kent, S. B. H. y col., High Yield Chemical Synthesis Of Biologically Active Peptides On An Automated Peptide Synthesizer Of Novel Design, en PEPTIDES 1984 (Ragnarsson U., ed.) Almqvist y Wiksell Int., Estocolmo (Suecia), páginas 185-188, todos incorporados por referencia en el presente documento en su totalidad. Preferentemente, una máquina capaz de añadir secuencialmente aminoácidos a una cadena peptídica en crecimiento producirá los péptidos. Sin embargo, los péptidos también pueden fabricarse usando una metodología de fase en solución convencional, que puede prestarse a proyectos de producción a gran escala.

Procedimientos de Uso

La presente invención se refiere a procedimientos para usar los péptidos anteriormente descritos, tales como en formulaciones o como agentes terapéuticos. Estos procedimientos pueden implicar el uso de un solo péptido, o de múltiples péptidos en combinación.

Los péptidos de la presente invención pueden usarse para tratar heridas de la piel (epidermis, dermis e hipodermis) y tejidos mucosos asociados. Como se usa en el presente documento, el término “tejidos mucosos asociados” se refiere a cualquier tejido organizado de una manera similar a la piel y contiene células epiteliales. Los queratinocitos son un ejemplo no limitante de dichas células epiteliales. Son ejemplos de dichos tejidos las superficies oral, nasofaríngea, ótica y urogenital, así como la conjuntiva palpebral ocular. Otros ejemplos de tejidos mucosos asociados incluyen todo el revestimiento (es decir, el lumen) del canal alimentario, incluyendo el esófago, estómago, intestino delgado, intestino grueso (colon), y recto. Estos últimos ejemplos pueden sufrir heridas/lesiones muy similares a las que pueden afectar la piel, y como tales pueden ser objeto de la presente invención. Ejemplos de heridas/lesiones/daños que pueden afectar a estos tejidos y que son sensibles a tratamiento con los péptidos de la presente invención son abrasiones, ampollas, quemaduras, laceraciones, punciones, úlceras, hematomas, sarpullidos y cicatrices. Los traumatismos de tejidos post-quirúrgicos también pueden tratarse con los péptidos.

Los péptidos de la invención también pueden usarse para prevenir o invertir los efectos del envejecimiento en todos los tejidos anteriormente mencionados. En una manera relacionada, los péptidos podrían aplicarse a tejido que ha sido dañado por exposición a varios agentes externos tales como luz solar. Son ejemplos de debilitamiento relacionado con el envejecimiento y con la exposición, las arrugas en la piel, la sequedad, el adelgazamiento, el descolgamiento y una mayor susceptibilidad a hematomas. Teniendo esto en cuenta, los péptidos de la invención también pueden usarse como un producto cosmético para ofrecer un aspecto y una textura más juveniles, y proporcionar un mejor funcionamiento.

Otros problemas relacionados con el tejido que se tratan de manera eficaz usando los péptidos de la presente invención se refieren a alergia o autoinmunidad. Dichas dolencias incluyen dermatitis, psoriasis, esclerodermia, pénfigo y enfermedad inflamatoria intestinal.

Las composiciones usadas para administrar los péptidos en el procedimiento terapéutico anterior pueden ser un aerosol, emulsión, líquido, loción, crema, pasta, pomada, polvo, o espuma, u otra formulación farmacéuticamente aceptable. Adicionalmente, los péptidos pueden administrarse usando formulaciones más sencillas, tales como agua desionizada/destilada, PBS o soluciones salinas medicinales convencionales. Generalmente, una formulación farmacéuticamente aceptable incluiría cualquier vehículo adecuado para su uso en la piel humana. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen etanol, sulfóxido de dimetilo, glicerol, sílice, alúmina, almidón, y vehículos y diluyentes equivalentes. La formulación puede opcionalmente tener atractivo cosmético, y/o contener otros agentes tales como retinoides u otros péptidos que pueden actuar como adyuvantes para la acción terapéutica de los péptidos de la invención. También pueden añadirse antibióticos a la formulación para la protección contra infecciones, permitiendo así que se produzcan al máximo los procesos de curación. La concentración del péptido en la composición puede ser de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 50 μg/ml o de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 20 μg/ml; sin embargo, la concentración final empleada puede variar fuera de estos intervalos, dependiendo de la naturaleza de la herida/afección tisular, de la bioactividad del péptido de la invención y del uso de cualquier adyuvante o técnica para obtener una mayor absorción de la composición.

Las composiciones de la presente invención pueden contener uno o mas agentes adicionales que ejercen actividad de cuidado de la piel.

En la aplicación preferida de la presente invención, en la que la composición va a estar en contacto con el tejido queratinoso humano, cualquier componente adicional, además de los péptidos de la invención, deberá ser adecuado para la aplicación al tejido queratinoso; es decir, que cuando se incorporen en la composición, dichos otros componentes no muestren una toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, respuesta alérgica, y similares indebida dentro del alcance del buen criterio médico. El CTFA Cosmetic Ingredient Handbook, segunda edición (1992) describe una amplia variedad de principios cosméticos y farmacéuticos no limitativos comúnmente usados en la industria del cuidado de la piel, que son adecuados para su uso en las composiciones de la presente invención. Los ejemplos de estas clases de principios incluyen: abrasivos, absorbentes, componentes estéticos tales como fragancias, pigmentos, coloraciones/colorantes, aceites esenciales, productos para pieles sensibles, astringentes, etc. (por ejemplo, aceite de clavo, mentol, alcanfor, aceite de eucalipto, eugenol, lactato de mentilo, agua de Hamamelis), agentes antiacné, agentes antiapelmazantes, agentes antiespumantes, agentes antimicrobianos (por ejemplo, butilcarbamato de yodopropilo), antioxidantes, aglutinantes, aditivos biológicos, agentes tamponantes, agentes formadores de volumen, agentes quelantes, aditivos químicos, biocidas cosméticos, desnaturalizantes, astringentes farmacológicos, analgésicos externos, formadores de película o materiales peliculares, agentes opacificantes, ajustadores de pH, propulsores, agentes reductores, secuestrantes, agentes blanqueadores y aclaradores de la piel (por ejemplo, hidroquinona, ácido kójico, ácido ascórbico, fosfato de magnesio ascorbilo, ascorbil glucosamina), agentes de acondicionamiento de la piel (por ejemplo, humectantes), agentes relajantes y/o curativos de la piel (por ejemplo, pantenol y sus derivados, aloe vera, ácido pantoténico y sus derivados, alantoína, bisabolol, y glicirrizinato de dipotasio), agentes para el tratamiento de la piel, espesantes, y vitaminas y sus derivados.

La administración de los péptidos de la invención y composiciones asociadas puede realizarse en seres humanos y en animales, incluyendo todos los mamíferos. La aplicación también puede realizarse en combinación con materiales típicos y/o experimentales tales como injertos de tejido, productos de cultivo de tejido, oxígeno y gasas. En general, la composición puede administrarse por vía tópica, oral, transdérmica, sistémica, o por cualquier otro procedimiento conocido por los expertos en la materia que sea útil para administrar los péptidos de la invención en el lugar de la lesión. Las composiciones también pueden aplicarse de una manera in vitro o ex vivo, ya sea a células o a injertos del paciente que crecen en un cultivo, por ejemplo.

Debido a su pequeño tamaño, se espera que los péptidos sean capaces de obtener por si mismos algún nivel de permeabilidad a través de la piel; sin embargo, para amplificar este movimiento pueden usarse determinadas técnicas. Por ejemplo, pueden añadirse grupos lipófilos (no polares) a los péptidos, o los péptidos pueden administrarse en la piel en un excipiente lipófilo, para potenciar la accesibilidad de péptido al estrato córneo para permitir la translocación a las capas de epidermis inferiores. De esta manera dichas modificaciones lipófilas pueden considerarse como un pro-fármaco. En el excipiente pueden usarse potenciadores de permeabilidad tales como solventes y tensioactivos conocidos para permitir una mejor absorción de los péptidos. Técnicas especiales que se espera que sean útiles para potenciar la entrada del péptido al tejido/lesión diana incluyen iontoforesis, electroforesis y ultrasonido. Un dispositivo de iontoforesis consiste de dos electrodos sumergidos en una solución electrolítica y colocados en la piel. Cuando se aplica una corriente eléctrica a través de los electrodos, se crea un campo eléctrico a través del estrato córneo que impulsa la administración de los péptidos. La electroporación implica la aplicación de impulsos eléctricos de alto voltaje para incrementar la infiltración a través de bicapas lipídicas. Esta se diferencia de la iontoforesis en la duración e intensidad de la aplicación de la corriente eléctrica (la iontoforesis usa un campo eléctrico de bajo voltaje relativamente constante). Se cree que el impulso eléctrico de alto voltaje de la electroporación induce una formación reversible de poros hidrófilos en las membranas lipídicas laminares que puede proporcionar un alto grado de mejora de infiltración. El ultrasonido aplica a la piel ondas de sonido que tienen una frecuencia mayor que 16 kHz, lo que produce compresión y expansión del tejido a través del cual se desplazan las ondas de sonido. Las variaciones de presión resultantes producen diversos procesos (por ejemplo, cavitación, mezclado, aumento de temperatura) que pueden mejorar la infiltración de los péptidos.

En la materia se conocen bien todas las formulaciones y usos de los péptidos anteriores. Se describen modos adicionales para preparar y usar los péptidos de la invención, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 6,492,326 y 6,974,799, ambas incorporadas en el presente documento por referencia en su totalidad.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar determinadas formas de realización preferidas de la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Identificación de péptidos que estimulan la proliferación celular.

Como previamente se demostró que el fragmento del péptido HB-107 (SEC ID NO:1) estimulaba la curación de heridas in vivo (Lee y colaboradores, 2004), se realizó la hipótesis de que dentro de la secuencia de HB-107 pudiesen existir fragmentos de péptidos aun mas pequeños que pudiesen estimular, de manera similar o mejor, la curación de heridas y procesos relacionados. Para examinar esta cuestión, se generó un conjunto solapante de fragmentos peptídicos de HB-107 usando química de péptidos de fase sólida convencional. Después, estos péptidos se sometieron a ensayo para determinar la actividad de proliferación celular a concentraciones de 0,22, 2,15, 21,5 y 46,4 μg/ml. Diversos péptidos ocasionaron un aumento significativo en la proliferación de queratinocitos epidérmicos a concentraciones bajas (Tabla 2), incluyendo los péptidos HB-1061 (SEC ID NO.3) y HB-1072 (SEC ID NO.6) cada uno de los cuales, solo contiene, respectivamente, siete y seis aminoácidos. Diversos otros péptidos presentaron actividad estimuladora a niveles iguales a, o por encima de, los de HB-107 (Tabla 2). En conclusión, la proliferación celular inducida por diversos péptidos de la invención superó el nivel inducido por el péptido parental HB-107. Cabe destacar que varios de estos fragmentos son significativamente más cortos que HB-107. Tabla 2: Inducción de la proliferación de queratinocitos epidérmicos murinos PAM 212 por los péptidos de la invención. Los valores representan la proliferación celular como un porcentaje de la proliferación celular de control (células tratadas solo con PBS). Los valores en negrita indican niveles de proliferación que superan el 150 % de la proliferación celular de control.

SEC ID NO:: Péptido 0,22 μg/ml 2,15 μg/ml 21,5 μg/ml 46,4 μg/ml

1: HB-107 57 75 121 126

12: HB-802 121 130 135 133

11: HB-801 101 100 113 131

10: HB-912 100 84 125 137

7: HB-1074 97 93 120 149

5: HB-1071 106 127 188 155

13: HB-1056 48 39 64 97

9: HB-1057 121 118 171 167

6: HB-1072 98 107 185 237

2: HB-1059 95 128 162 186

14: HB-1060 57 52 90 83

3: HB-1061 122 156 163 241

Los ensayos de proliferación celular procedieron del siguiente protocolo experimental: Ensayo de proliferación celular usando una línea celular de queratinocitos de ratón OBJETIVO: determinar el potencial antiproliferativo o citotóxico de un artículo de ensayo cuando se aplica a

queratinocitos epidérmicos en cultivo.

SISTEMA DE ENSAYO: Aunque pueden usarse otras células, los modelos preferidos son la línea celular de queratinocitos murinos PAM212 o de queratinocitos epidérmicos humanos normales (NHEK, de Clonetics). REACTIVOS:

1. Medio de crecimiento celular: Medio Eagles modificado por Dulbecco que contiene suero de ternero recién nacido al 10 % (DMEM-10), penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (0,1 mg/ml), y gentamicina (50 μg/ml) o medio de

crecimiento de queratinocitos (KGM, de Clonetics) para células humanas.

2.: Medio vehículo: Medio Eagles modificado por Dulbecco que contiene suero de ternero recién nacido al 1,0 % (DMEM-1), penicilina (100 unidades/ml), y estreptomicina (0,1 mg/ml), o medio basal de queratinocitos (KBM, de Clonetics) para células humanas.

3.: Solución madre de rojo neutro: se añade polvo rojo neutro a solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) a una concentración de 3 mg/ml. Después, la solución resultante se filtra estéril.

4.: Medio rojo neutro: se añade solución madre de rojo neutro a DMEM o KBM a una concentración final de 50 μg/ml.

5.: Medio MTT: se añade polvo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) a DMEM o KBM a 1 mg/ml y se filtra o centrifuga para eliminar cualquier precipitado. La solución de MTT se usa a las 24 horas.

6.: Solución de fijación que consiste en formaldehído al 1 % y cloruro de calcio al 1 % en una solución acuosa.

7.: Solución de lavado que consiste en PBS.

8.: Solución de lisado: ácido acético glacial al 1,0 % y etanol al 50 % en una solución acuosa para rojo neutro, o isopropanol acidificado para células tratadas con MTT.

SIEMBRA DE CÉLULAS EN PLACAS:

Los queratinocitos se examinaron todos los días al microscopio. A medida que el cultivo alcanzaba una confluencia del 50-75 %, se aspiraban los medios de la placa y se añadía tripsina al 0,25 %/EDTA (tripsina al 0,05 % para células humanas). Cuando las células se volvieron redondeadas, la tripsina se neutralizó por adición de un volumen equivalente de DMEM o KBM complementado con aproximadamente suero bovino al 10 % o usando una solución neutralizante de tripsina (TNS, de Clonetics). Después, las células se centrifugaron y el sedimento se resuspendió en 1 ml de DMEM-1 o KBM. Para contar la suspensión celular se usó un hemacitómetro y el número total de células/ml se ajustó a 1,5-2,5x104 células/ml con DMEM-1 o KBM. Después, las células se sembraron en placas de 96 pocillos a una concentración de 3,0-5,0x103 células/pocillo, añadiendo a cada pocillo 200 μl de la suspensión celular. Normalmente, se usaron los 60 pocillos centrales y para minimizar el efecto de la evaporación los pocillos exteriores se llenaron con DMEM o PBS.

PREPARACIÓN DE MUESTRAS:

Se preparó una solución madre del artículo de ensayo usando DMEM-1 o KBM, y las diluciones restantes se prepararon a partir de esta solución. Normalmente, antes de aplicar al cultivo celular, cada dilución se filtró a través de un filtro de 0,2 μm. Se preparó una solución o una suspensión al 1,0 % (p/v o v/v) y en el medio de cultivo se realizaron diluciones en serie con factor de dilución 10 o 3 .

DOSIFICACIÓN:

Después de 18-24 horas de poner las células en las placas estas se examinaron para garantizar la unión y división celular, y después se aspiraron 100 μl de los medios, dejando en cada pocillo 100 μl. Después, a los pocillos duplicados se añadieron 100 μl de una concentración 2x de cada dilución de artículo de ensayo. Para el control negativo, se añadieron 100 μl del medio vehículo (DMEM-1 o KBM) a los pocillos de control. A continuación, la microplaca se incubó a 37 grados C y CO2 al 5,0 % durante 48-72 horas después de dosificar, y se permitió que las células proliferasen sin cambios. Tras esta exposición de 48-72 horas, todos los medios se aspiraron y la proliferación se evaluó mediante uno de los siguientes procedimientos.

Opción A: captación de rojo neutro. Después de la exposición y aspiración de los medios, a cada pocillo se añadieron inmediatamente 200 μl de medio rojo neutro. La microplaca se volvió a llevar a la incubadora durante tres horas adicionales. Tras este periodo de captación de colorante, la microplaca se retiró de la incubadora y se invirtió suavemente, y el medio rojo neutro se decantó en una bandeja de recogida. Después, las células se fijaron con solución fijadora durante aproximadamente un minuto. La solución fijadora se decantó, y la microplaca se lavó suavemente tres veces con solución de lavado. La solución de lavado se decantó, y se añadieron 200 μl de solución de lisado. Después de al menos 15 minutos, el contenido de cada pocillo se re-pipeteó para garantizar una distribución de color uniforme en cada pocillo, y se leyó una alícuota en el espectrofotómetro como se detalla mas adelante.

Opción B: ensayo de conversión de MTT. Después de exposición y aspiración del medio, a cada pocillo se añadieron inmediatamente 200 μl de medio de ensayo MTT. (el MIT solo deberá usarse si el artículo de ensayo no reduce MIT directamente, según se determina por un experimento de descubrimiento de intervalo o ensayo de compatibilidad de MIT). La microplaca se volvió a llevar a la incubadora durante tres horas adicionales. Tras este periodo de captación de colorante, la microplaca se retiró de la incubadora y se invirtió suavemente, y el medio MTT se decantó en una bandeja de recogida. Después, las células se lavaron suavemente tres veces con solución de lavado. La solución de lavado se decantó, y se añadieron 200 μl de solución de lisado. Después de efectuar la lisis

durante al menos 60 minutos, cada pocillo se re-pipeteó para garantizar la distribución de color uniforme en cada pocillo, y la absorbancia se leyó en el espectrofotómetro según se detalla mas adelante.

Opción C: análisis basado en citometría de flujo. Después de la exposición, el medio se ajustó a 10 μM de bromodesoxiuridina (BrdU) y se incubó a 37 grados C durante 45 minutos. Durante esta incubación, la BrdU, un análogo de timidina, se incorporó en el ADN de células proliferativas. Después, las células se recogieron por tripsinización. Después de la centrifugación, el sedimento celular se re-suspendió en 0,5 ml de PBS y las células se fijaron por la adición de etanol al 70 %. Después, las células se lavaron y se tiñeron con el colorante fluorescente específico de ADN (rojo) yoduro de propidio. Las células proliferativas se tiñeron con un anticuerpo fluorescente específico de BrdU (verde). El análisis del ciclo celular así como la cantidad de células proliferativas teñidas positivas para BrdU se determinó usando citometría de flujo. (Nota: para estudios de citometría de flujo, las células se cultivan en placas de 24 pocillos o de 6 cm).

ANÁLISIS DE DATOS

Estudios de Captación de Colorante: Para los criterios de valoración basados en colorante la densidad óptica de los pocillos se lee usando un Titerek Multiskan MCC/340 a una longitud de onda de 540 nm restando la absorbancia a una longitud de onda de referencia de 620 nm para rojo neutro, o de 670 a 680 nm de longitud de onda de referencia para MIT. El lector de placa genera un listado de valores de absorbancia. Para cada grupo de tratamiento se calcula la absorbancia promedio y las desviaciones típicas y los resultados se expresan como porcentaje de absorbancias de control. Cálculo de CE50: Los datos se representan como porcentaje de las absorbancias de control frente a concentraciones para cada muestra de ensayo. La CE50 se extrapola desde la línea de regresión trazada a través de los datos en una gráfica de Excel 5.0. Además, la CE50 se calcula usando la ecuación para la línea de regresión facilitada por la gráfica de Excel 5.0 o usando una macro de Excel 5.0.

Estudios de Citometría de Flujo: Para el análisis de citometría de flujo el porcentaje positivo marcado con BrdU se determinará y se calculará un índice de proliferación (es decir, el % de células que proliferan de manera activa en el momento de la recogida). Opcionalmente, en las muestras también pueden determinarse otros parámetros, tales como la viabilidad porcentual de células y el porcentaje de células apoptóticas.

Ejemplo 2: Identificación de péptidos que estimulan la migración celular

Por sí misma, la proliferación celular no es suficiente para ayudar en la curación de heridas. Tras sufrir una lesión, las células que rodean a la herida proliferan; la migración de dichas células recién formadas para cerrar la lesión (o lesión crónica de tejido disfuncional envejecido) es también importante. Para tratar este problema, el HB-107 y sus fragmentos de péptido se examinaron usando un ensayo de migración celular de queratinocitos basado en un ensayo de raspado de cultivo tisular. Este ensayo demostró que los péptidos tales como HB-1072 (SEC ID NO:6) y HB-1061 (SEC ID NO:3) podían aumentar la migración de células de una manera similar a la del péptido parental HB-107 (Tabla 3). Cabe destacar que los péptidos HB-1072 y HB-1061 se solapan como parte de HB-107, y que el análogo HB-1062 (SEC ID NO:4) no presenta actividad migratoria celular. El protocolo para este ensayo es convencional y fue descrito por Shanley y col.,(2004, Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45:1088-1094), cuyo artículo se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Tabla 3: Inducción de la migración de queratinocitos epidérmicos humanos por los péptidos de la invención, medida por un ensayo de raspado. Los valores representan el cierre porcentual del raspado en comparación con la anchura inicial del raspado en la monocapa celular, después de 6 a 10 horas de exposición al péptido.

SEC ID Nº:: Péptido 6 h 10 h

ND: PBS control 11 33

1: HB-107 52 78

6: HB-1072 55 77

3: HB-1061 44 67

4: HB-1062 0 24

Ejemplo 3: Identificación de péptidos que estimulan la actividad antiinflamatoria en células en reposo

Además de incrementar la tasa de curación, se demostró también que el péptido HB-107 disminuía el nivel de inflamación asociada con una herida. Para identificar fragmentos de péptidos pequeños que pueden presentar dicha actividad, los fragmentos de HB-107 se exploraron para determinar la actividad reductora de una citocina inflamatoria clave, la IL6. Se encontró que los fragmentos peptídicos de HB-802 (SEC ID NO:12) y HB-1076 (SEC ID NO:8) disminuían el nivel de expresión de IL6 al mismo grado que el péptido parental HB-107 (Tabla 4). El protocolo

para este ensayo es convencional y fue descrito por Murakami y col., (2004, J. Immunol. 172:3070-3037), cuyo artículo se incorpora en el presente documento por referencia en su totalidad.

Tabla 4: Represión de la expresión de IL6 en células epiteliales expuestas a los péptidos de la invención. La cantidad de IL6, expresada en pg/ml (columnas 3-5), se determinó 24 y 48 horas después de la adición de medios que contenían 20 μg/ml de péptido. En la columna 8 se proporciona el cambio porcentual de la expresión de IL6.

24 h

SEC ID Nº:: Ensayo Pocillo 1 Pocillo 2 Promedio DT Cambio Cambio %

PBS control: 334,26 292,09 313,175 21,085 ND ND

PBS control: 311,02 335,98 323,5 12,48 ND ND

PBS control: 319,63 349,75 334,69 15,06 ND ND

12: HB-802 278,32 288,65 283,485 5,165 -40,435 -12,50 %

1: HB-107 307,58 264,55 286,065 21,515 -37,435 -11,60 %

8: HB-1076 278,32 255,08 266,7 11,62 -56,8 -17,60 %

48 h

PBS control: 1049,2 1007,3 1028,25 20,95 ND ND

PBS control: 927,27 1022,8 975,035 47,765 ND ND

PBS control: 1002,1 904,89 953,495 48,605 ND ND

12: HB-802 774,07 762,02 768,045 6,025 -206,99 -21,20 %

1: HB-107 690,58 786,12 738,35 47,77 -236,685 -24,30 %

8: HB-1076 726,73 728,45 727,59 0,86 -247,445 -25,40 %

Ejemplo 4: Identificación de péptidos que inhiben la actividad inflamatoria inducida por luz ultravioleta B (UVB) en células

Dado que determinados péptidos pequeños pudieron promover la actividad antiinflamatoria en células en reposo (véase el Ejemplo 3), fue interesante conocer si péptidos pequeños podrían promover dicha actividad en células que estuvieron expuestas a radiación UVB, La radiación UVB daña la piel y promueve su envejecimiento. Dado que la inflamación en el tejido dañado es un contribuyente al envejecimiento en ese tejido, la reducción de inflamación epidérmica resultante de daño inducido por luz ultravioleta aminorará los efectos de su envejecimiento.

Se realizó un ensayo para determinar si los fragmentos peptídicos de HB-107 podían inducir actividad antiinflamatoria en células expuestas a luz ultravioleta. Se sembraron células epiteliales de piel humana (ATCC CRL2592) en placas de 6 pocillos y se cultivaron a una confluencia mayor del 95 % en DMEM con L-glutamina 4 mM ajustada para contener 1,5 g/l de bicarbonato de sodio y 4,5 g/l de glucosa (medio completo) complementado con suero bovino fetal al 10 %. No se administró suero a las células durante las 5 horas previas al tratamiento con UVB. La UVB se generó usando una lámpara UVLMS (modelo 4 W, conjunto 3UV, Upland, CA) con la longitud de onda de radiación fija a 302 nm. La lámpara UV se colocó 12 cm por encima de la placa de cultivo tisular (placa de 6 pocillos) y dos pocillos se trataron a la vez para permitir una radiación UVB homogénea. Las células se expusieron a radiación UVB (450 μW/cm2, medido usando un radiómetro) en PBS para la generación de productos fotoquímicos tóxicos, inducida por luz ultravioleta. La expresión de IL6 se midió como un indicador de actividad inflamatoria celular en respuesta a UVB. Como se muestra en la FIG 2, la expresión de IL6 en células epiteliales de piel se indujo de una manera dependiente de la dosis de UVB, demostrando así que la luz ultravioleta estimula procesos inflamatorios celulares en células epiteliales de piel.

Se exploraron péptidos individuales para determinar sus efectos en la expresión de IL6 inducida por UVB en células epiteliales de piel. Las células se expusieron a UVB (450 μW/cm2) durante 35 segundo en PBS, después de lo cual el PBS se reemplazó con medio completo sin suero en presencia o ausencia de 40 μg/ml de péptido y se incubaron a 37 °C/ CO2 al 5 % durante veinte horas. Después se recogió el medio sobrenadante y se centrifugó a 10.000 rpm para eliminar los residuos, antes del ensayo ELISA para IL6 humana (CellSciencies, MA). Se descubrió que, las

secuencias específicas dentro del péptido HB-107, podían reducir significativamente la expresión de IL6 en células sometidas a un fuerte estímulo inflamatorio. (Tabla 5, resultados mostrados gráficamente en la FIG: 3).

Tabla 5: Efecto de péptidos cortos sobre la expresión de IL6 inducida por UVB en células epiteliales de piel. Las células se expusieron a UVB seguido de incubación con péptido. Las células de control no recibieron tratamiento con UVB o péptido. La expresión de IL6 se midió por ELISA usando un espectrómetro de luz (DO 450).

SEC ID NO:: Tratamiento con UV/péptido IL 6 (DO 450) DT

Control: 0,0730 0,001414

Solo UV: 0,7305 0,062933

1: HB-107 0,7315 0,043134

12: HB-802 0,6500 0,035423

15: HB-1410 0,5105 0,013435

11: HB-801 0,8275 0,204354

Los resultados de este estudio muestran que los péptidos tales como HB-1401 (PKEK, SEC ID NO:15) pueden reducir significativamente el nivel de IL6 producido por células epiteliales de piel en respuesta a radiación UV. Esta actividad es de aplicación particular al cuidado de la piel después de exposición solar y también tiene amplia aplicación para reducir la inflamación asociada a una diversidad de afecciones en la piel que producen heridas y envejecimiento. Cabe destacar que incluso cambios más pequeños en la secuencia del péptido pueden alterar significativamente la actividad inhibidora del péptido hacia la expresión de IL6 en células epiteliales de piel [comparar, por ejemplo, actividades de HB-801 (PKEKV) y HB-802 (MPKEK) con la actividad inhibidora de HB1410], De manera interesante, HB-802 ha demostrado la capacidad de reducir IL6 en células en reposo (véase el Ejemplo 3, Tabla 4).

REFERENCIAS

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Harris, Scott M. Zhang, Lijuan Falla, Timothy J.

<120> PÉPTIDOS BIOACTIVOS CORTOS PARA MODULACIÓN CELULAR E INMUNOLÓGICA

<130> 11181.0035.00PC00

<150> 60/878.849

<151>

<160> 15

<170> PatentIn versión 3.4

<210> 1

<211> 19

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 1

<210> 2

<211> 9

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 2

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 3

<210> 4

<211> 6

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 4

<210> 5

<211> 9

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 5

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 6

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 7

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 8

<210> 9

<211> 11

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 9

<210> 10

<211> 14

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 10

<210> 11

<211> 5

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 11

<210> 12

<211> 5

<212> PRT 5 <213> Hyalophora cecropia

<400> 12

<210> 13

<211> 12 10 <212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 13

<210> 14 15 <211> 8

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 14

20 <210> 15

<211> 4

<212> PRT

<213> Hyalophora cecropia

<400> 15

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un péptido aislado, en el que la secuencia del péptido consiste en de cuatro a catorce restos de aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1, y en el que el péptido comprende las SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15.
2.

El péptido de la reivindicación 1, en el que

(i)

el péptido comprende cualquiera de los enantiómeros de aminoácidos L y D o ambos,

(ii)

el péptido se conjuga con una molécula vehículoa, amidada o lipidada,

(iii) un resto de metionina, de valina, de lisina o de glutamato está en el extremo amino del péptido

(iv)

un resto de lisina, de valina, de glicina o de asparagina está en el extremo carboxilo del péptido, o

(vi)

cualquier combinación de (i)-(iv).
3.

El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido comprende las SEC ID NO:3, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15.
4.

El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido comprende las SEC ID NO:2, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10 o SEC ID NO:11.
5.

El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido es la SEC ID NO:3.
6.

El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido es la SEC ID NO:12.
7.

El péptido de la reivindicación 1, en el que la secuencia del péptido es la SEC ID NO:15.
8.

Una composición que comprende al menos un péptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
9.

La composición de la reivindicación 8, en la que el péptido está presente en una concentración que varía de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 50 μg/ml, o de aproximadamente 0,1 μg/ml a aproximadamente 20 μg/ml.
10.

La composición de la reivindicación 8, en la que la composición está en forma de aerosol, emulsión, líquido, loción, crema, pasta, pomada, polvo o espuma,
11.

La composición de la reivindicación 8, en la que la secuencia del péptido es la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15,
12.

Un medicamento para su uso en la curación de una herida en un mamífero cuando se aplica en una cantidad terapéuticamente eficaz durante una cantidad de tiempo eficaz, en el que dicho medicamento comprende un vehículo terapéuticamente eficaz y un péptido en el que la secuencia del péptido consiste en de cuatro a catorce aminoácidos contiguos de la SEC ID NO:1 y en el que el péptido comprende las SEC ID NO:2, SEC ID NO 3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15.
13.

El medicamento de la reivindicación 12, en el que la herida afecta a la piel o al tejido mucoso asociado de dicho mamífero.
14.

El medicamento de la reivindicación 12, en el que la herida se debe a una abrasión, ampolla, quemadura, laceración, úlcera, hematoma, erupción, cicatriz, o a los efectos del envejecimiento o a una exposición ambiental.
15.

El medicamento de la reivindicación 12, en el que la secuencia del péptido es la SEC ID NO:2, SEC ID NO:3, SEC ID NO:5, SEC ID NO:6, SEC ID NO:7, SEC ID NO:8, SEC ID NO:9, SEC ID NO:10, SEC ID NO:11, SEC ID NO:12 o SEC ID NO:15.