BR112015022770B1 - Meio e sistema de cultivo da célula livre de xenógeno, livre de albumina, forma concentrada, métodos de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, para a produção de mesenquimoangioblastos e sistema definido de cultivo da célula para diferenciação hematoendotelial das células- tronco pluripotentes humanas - Google Patents
Meio e sistema de cultivo da célula livre de xenógeno, livre de albumina, forma concentrada, métodos de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, para a produção de mesenquimoangioblastos e sistema definido de cultivo da célula para diferenciação hematoendotelial das células- tronco pluripotentes humanas Download PDFInfo
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Abstract
MEIO E SISTEMA DE CULTIVO DA CÉLULA LIVRE DE XENÓGENO, LIVRE DE ALBUMINA, FORMA CONCENTRADA, MÉTODOS DE DIFERENCIAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES HUMANAS, PARA A PRODUÇÃO DE MESENQUIMOANGIOBLASTOS E SISTEMA DEFINIDO DE CULTIVO DA CÉLULA PARA DIFERENCIAÇÃO HEMATOENDOTELIAL DAS CÉLULAS-TRONCO PLURIPOTENTES HUMANAS. A presente invenção refere-se aos métodos e composições para diferenciação de células-tronco pluripotentes nas células das linhagens endoteliais e hematopoéticas que são descritos.
Description
[001] A presente invenção refere-se ao pedido que reivindica o benefício do Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos No. de Série 61/ 779.564 depositado em 13 de março de 2013.
[002] Esta invenção foi feita com apoio do governo sob Cessões No. HL099773 e HL116221 concedidas pelos National Institutes of Health. O governo tem certos direitos na invenção.
[003] O advento das tecnologias da célula-tronco pluripotente humana tem fornecido a oportunidade de produzir células endoteliais e hematopoiéticas in vitro para terapias e estudos funcionais. Anteriormente, os sistemas de co-cultivos empregando a linhagem de célula estromal da medula óssea de camundongo, OP9, foram empregados para estabelecer diferenciação escalável e eficiente das células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) nas linhagens de sangue e endotelial. De qualquer modo, os sistemas de co-cultivos que dependem do soro e células alimentadoras do camundongo (isto é, fontes xenogênicas) têm utilidade limitada para estudo da resposta a hPSC para os fatores específicos de crescimento. Além do mais, tais sistemas têm limitações adicionais quando considerados no contexto de produção células de sangue terapêuticas de grau clínico.
[004] Levando em consideração as deficiências dos sistemas de cultivos anteriores, novos sistemas de cultivos são necessários para fornecer fontes de linhagens de sangue e endotelial que são adequadas para uso em aplicações clínicas sem o risco de introdução de contaminação xenogênica.
[005] Em um aspecto fornecido aqui está um método para a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas compreendendo: (a) fornecimento de células-tronco pluripotentes humanas; e (b) cultivar as células-tronco pluripotentes humanas sob condições hipóxicas em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl durante um período de cerca de dois dias para formar uma população de células de células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto.
[006] Em algumas modalidades, o método também inclui as etapas de (c) exposição das células na etapa mesoderma primitiva da etapa (b) para uma mistura compreendendo os componentes FGF2 e VEGF sob condições hipóxicas durante um período de cerca de 1 a 2 dias para se obter uma população compreendendo mesoderma primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e células mesodermas hematovasculares (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-/-) com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9. Em algumas modalidades, o método também inclui as etapas de: (d) exposição das células na fase de mesoderma hematovascular da etapa (c) a uma mistura compreendendo os componentes FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, e IL3 durante cerca de um dia para se obter a formação de progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD73+CD235a/ CD43- (não HEP), progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43- (HEPs), progenitores hematopoiéticos angiogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- (AHP), e células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+. Em outras modalidades, o método também compreende as etapas de: (e) continuar a expor os HEPs e emergir as células progenitoras hematopoiéticas a uma mistura de FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 sob normóxia durante cerca de três dias resultando em expansão hematopoiética para se obter uma população de progenitores hematopoiéticos CD43+ dos compostos de eritromegacariocítico progenitores CD43+CD235a+CD41a+ e progenitores hematopoiético multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-/-.
[007] Em algumas modalidades, a mistura a ser empregada em qualquer um dos métodos anteriores consiste essencialmente nos componentes mencionados. Em algumas modalidades, a mistura a ser empregada é livre de xenógeno.
[008] Em algumas modalidades, as células-tronco pluripotentes humanas são fornecidas em um substrato tratado com Tenascina-C.
[009] Em um outro aspecto fornecido aqui é um meio de cultivo livre de xenógeno para diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, compreendendo meio de IF9S suplementado com: de cerca de 50 a cerca de 250 ng/ml de BMP4; de cerca de 10 a cerca de 15 ng/ml de Ativina A; de cerca de 10 a cerca de 50 ng/ml de FGF2; e cerca de 1 mM a cerca de 2 mM de LiCl.
[0010] Em um aspecto relacionado aqui é um meio de cultivo livre de xenógeno para diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, compreendendo meio de IF9S suplementado com: de cerca de 10 a cerca de 50 ng/ml de FGF2; e de cerca de 20 a cerca de 50 ng/ml de VEGF. Em algumas modalidades, onde o meio contém FGF2 and VEGF, o meio também inclui uma citocina hematopoiética. Em algumas modalidades, a citocina hematopoiética compreende: de cerca de 50 a cerca de 100 ng/ml de SCF; de cerca de 50 a cerca de 100 ng/ml de TPO; de cerca de 50 a cerca de 100 ng/ml de IL-6; e de cerca de 5 a cerca de 15 ng/ml IL-3. Em algumas modalidades, qualquer um dos meios anteriores consiste essencialmente no meio de IF9S e os componentes suplementados. Em algumas modalidades, qualquer um dos meios anteriores é fornecido em uma forma concentrada.
[0011] Em outro aspecto fornecido aqui está um sistema de cultivo de célula livre de xenógeno para a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas nas células progenitoras hematopoiéticas, mesodermas, e endoteliais, compreendendo: células-tronco pluripotentes humanas semeada como uma única suspensão de célula em um substrato compreendendo uma camada de Tenascina C em uma concentração de pelo menos cerca de 0,25 μg/cm2 a μg/cm2; e um meio de cultivo livre de xenógeno compreendendo meio de IF9S suplementado com: de cerca de 50 a cerca de 250 ng/ml de BMP4; de cerca de 10 a cerca de 15 ng/ml de Ativina A; de cerca de 10 a cerca de 50 ng/ml de FGF2; e de cerca de 1 a cerca de 2 mM de LiCl.
[0012] Em outro aspecto fornecido aqui é um método de diferenciação de células-tronco pluripotentes, compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de células-tronco pluripotentes humanas; (b) semear as células como uma única suspensão de célula em um substrato tratado com Tenascina C; e (c) cultivar as células semeadas no meio de IF9S suplementado com BMP4, Ativina A, FGF2, e LiCl sob condições hipóxicas durante um período de cerca de dois dias para se obter cerca de 30 % de células mesodermas primitivas EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto.
[0013] Em algumas modalidades, o método acima também compreende as etapas de cultivar as células na etapa mesoderma primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ no meio de IF9S suplementado com FGF2 e VEGF sob condições hipóxicas durante cerca de 1 a 2 dias para se obter mesoderma primitiva EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e precursores mesodermais hematovasculares EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-/- com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9.
[0014] Em um outro aspecto fornecido aqui estão as populações purificadas das células geradas por meio de qualquer um do métodos anteriores para diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, em que as células não foram expostas aos componentes não humanos.
[0015] Em um aspecto relacionado aqui é uma população purificada de células criadas pelos métodos descritos aqui, em que as células são maiores do que 35 % das células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com um potencial para formar as colônias mesenquimongioblastas.
[0016] Em outro aspecto fornecido aqui é uma população purificada de células, onde as células são maiores cerca de 35 % da mesoderma primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e 30 % das células mesodermais hematovasculares EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-/- com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9.
[0017] Em um outro aspecto fornecido aqui é uma população purificada de células, em que a população inclui mais do que cerca de 40 % das células CD144+ compreendendo progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73-CD235a/43- (HEPs), progenitores hematopoiéticos angiogênicos CD144+CD73-CD235a/ CD43+CD41a-, e progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD73+CD235a/43- (não HEPs).
[0018] Em outro aspecto fornecido aqui é uma população de células, em que a população inclui mais do que cerca de 30 % de células progenitoras hematopoiéticas CD43+ compostas de progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ e progenitores hematopoiéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-.
[0019] Em um outro aspecto fornecido aqui é um método de produção dos mesenquimoangioblastos, compreendendo as etapas de: (a) fornecimento de células-tronco pluripotentes humanas; (b) semear as células em um substrato tratado com uma quantidade eficaz de colágeno; e (c) exposição das células-tronco a uma mistura compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl sob condições hipóxicas durante um período de cerca de dois dias para formar uma população de células mesodermas primitivas EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto. Em algumas modalidades, o colágeno a ser empregado compreende o Colágeno IV.
[0020] Ainda em outro aspecto fornecido aqui está um meio de cultivo da célula para diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, compreendendo: 64 mg/L de sal de Mg2+ de 2-fosfato de Ácido L-Ascórbico, 40 μl/ L de monotioglicerol, 8,4 μg/L de selenita de sódio adicional, 10 mg/L de álcool de polivinila, 1x de GLUTAMAX (dipeptídeo L-glutamina estável), 1x de aminoácidos não essenciais, 0,1x de concentrado de lipídeo quimicamente definido, 10,6 mg/L de Holo-Transferrina, de 20 mg/L de insulina.
[0021] Em um outro aspecto descrito aqui está um método para a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas compreendendo: (a) fornecimento de células-tronco pluripotentes humanas; e (b) cultivar as células-tronco pluripotentes humanas sob condições hipóxicas em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl durante um período de cerca de dois dias para formar uma população de células de células mesoderma primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa com potencial de mesenquimoangioblasto.
[0022] Em algumas modalidades, as células-tronco pluripotentes humanas são cultivadas em Tenascina C. Em algumas modalidades, o meio de cultivo da célula compreende um meio de cultivo da célula IF9S. Em algumas modalidades, a concentração, no meio de cultivo da célula, de: BMP4 é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 250 mg/ ml; Ativina A é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 15 ng/ml; FGF2 é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; e LiCl é de cerca de 1 mM a cerca de 2 mM.
[0023] Em algumas modalidades, o método também compreende (c) cultivar, sob condições hipóxicas, a população de células obtida na etapa (b) em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2 e VEGF durante um período de cerca de 1 a 2 dias para se obter uma população de células compreendendo mesoderma primitiva EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa + com potencial de hemangioblasto (HB- CFC) e células mesodermas hematovasculares (EMHlin- KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-) com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9. Em algumas modalidades, a concentração, no meio de cultivo da célula, de FGF2 é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; e VEGF é de cerca de 20 ng/ml a cerca de 50 ng/ml.
[0024] Em algumas modalidades, o método também compreende (d) cultivara as células mesodermas hematovasculares da etapa (c), sob condições hipóxicas, em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, e IL3 durante cerca de um dia para se obter uma população de células compreendendo progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD73+CD235a/ CD43- (não HEP), progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73- CD235a/ CD43- (HEPs), progenitores hematopoiéticos angiogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- (AHP), e células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+. Em algumas modalidades, a concentração, no meio de cultivo da célula, de: FGF2 é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; VEGF é de cerca de 20 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; SCF é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml; TPO é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml; IL-6 é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, e IL-3 é de cerca de 5 ng/ml a cerca de 15 ng/ml.
[0025] Em algumas modalidades, o método também compreende (e) cultivar, sob normóxia, os HEPs e as células progenitoras hematopoiéticas em um meio de cultivo compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante cerca de três dias para se obter uma população expandida de progenitores hematopoiéticos CD43+ compreendendo progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ e progenitores hematopoiéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-/-.
[0026] Em algumas modalidades, o método também compreende co-cultivar a população expandida de progenitores hematopoiéticos CD34+CD43+ durante um período de cerca de três semanas em DLL4 super-expressando as células OP9 para se obter uma população de células compreendendo células T positivas duplas CD4+CD8+, em que as células-tronco pluripotentes humanas da etapa (b) são cultivadas em um substrato de Tenascina C.
[0027] Em um aspecto relacionado aqui é um método de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, compreendendo pelo menos um de: (i) cultivar células-tronco pluripotentes humanas sob condições hipóxicas em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl durante um período de cerca de dois dias para formar uma população de células de células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto; (ii) cultivar, sob condições hipóxicas, células mesodermas primitivas EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2 e VEGF durante um período de cerca de 1 a 2 dias para se obter uma população de células compreendendo mesoderma primitiva EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa + com potencial de hemangioblasto (HB- CFC) e células mesodermas hematovasculares (EMHlin- KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-) enriquecidas nas células com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9; (iii) cultivar células mesodermas hematovasculares (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-) das células, sob condições hipóxicas, em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, e IL3 durante cerca de um dia para se obter a formação de progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD73+CD235a/ CD43- (não HEP), progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73-CD235a/ CD43- (HEPs), progenitores hematopoiéticos angiogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- (AHP), e células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+; (iv) cultivar, sob normóxia, progenitores endoteliais hemogênicos (HEPs) e células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+ em um meio de cultivo compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante cerca de três dias para se obter uma população expandida de progenitores hematopoiéticos CD43+ compreendendo progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ e progenitores hematopoiéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+/-; e (v) cocultivar os progenitores hematopoiéticos CD34+CD43+ durante um período de cerca de três semanas em DLL4 super-expressando as células OP9 para se obter uma população de células compreendendo células T CD4+CD8+.
[0028] Em outro aspecto fornecido aqui é um meio de cultivo da célula adequado para diferenciação hematoendotelial das células- tronco pluripotentes humanas, compreendendo um meio de base, sal de Mg2+ de 2-fosfato de ácido L-ascórbico, monotioglicerol, selenita de sódio adicional, álcool de polivinila, Glutamax™ (dipeptídeo L- glutamina estável), aminoácidos não essenciais (NEAA), concentrado de lipídeo quimicamente definido, Holo-Transferrina, e insulina.
[0029] Em algumas modalidades, o meio de cultivo da célula também compreende BMP4, Ativina A, FGF2, e LiCl.
[0030] Em outras modalidades o meio de cultivo também compreende FGF2 e VEGF.
[0031] Em outras modalidades o meio de cultivo também compreende FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL-6, e IL-3.
[0032] Em algumas modalidades, o meio de cultivo da célula compreende um meio de IF9S. Em algumas modalidades, o meio de cultivo da célula IF9S tem a formulação do meio de cultivo da célula IF9S da Tabela 2.
[0033] Em um aspecto relacionado aqui é um suplementado médio concentrado 9S, em que a diluição do suplementado médio concentrado 9S em um meio de base de IMDM/ F12 produz um meio de cultivo da célula IF9S. Em uma modalidade está um kit compreendendo o suplementado médio concentrado 9S, e um ou mais de BMP4, Ativina A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, IL-3, e Tenascina C.
[0034] Em um outro aspecto fornecido aqui está um sistema definido de cultivo da célula para a diferenciação hematoendotelial das células-tronco pluripotentes humanas, compreendendo um meio de cultivo da célula IF9S e um substrato de Tenascina C para crescimento aderente das células-tronco pluripotentes humanas ou sua progênie diferenciada juntamente com a linhagem hematoendotelial. Em algumas modalidades, o meio de cultivo da célula IF9S é mantido sob condições hipóxicas. Em algumas modalidades, o sistema definido de cultivo da célula também compreende o crescimento das células-tronco pluripotentes humanas no substrato de Tenascina C.
[0035] Todas as publicações, patentes, e pedidos de patentes mencionados nesta especificação são aqui incorporados por referência à mesma extensão como se cada publicação, patente, e pedido de patente individual foi especificamente e individualmente indicado para serem incorporados por referência.
[0036] A Figura 1 mostra um diagrama esquemático da diferenciação hematopoiética mostrando vias de desenvolvimentos hematopoiéticos, marcadores específicos e ensaios funcionais empregados para identificar cada etapa de desenvolvimento, e condições empregadas para diferenciação de hPSC em meio quimicamente definido. Os principais subgrupos de células observados nos estudos anteriores de diferenciação empregando o co-cultivo com alimentadores OP9 e culturas atuais quimicamente definidas são mostradas.
[0037] Figura 2. Identificação de uma assinatura molecular única das células estromais OP9 crescida em excesso (a) diagrama de Venn mostrando a sobreposição entre os genes diferencialmente expressos na OP9 crescida em excesso no dia 8 versus OP9 recentemente confluente no dia 4, e MS5 e S17. 21 genes marcados com fundo cinza são singularmente super-expressos nas células OP9 no dia 8 como em comparação a todas outras linhagens de célula testadas. (b) Mapa térmico dos genes sobrepostos diferencialmente expressos como mostrado em (a). Tenascina-C (Tnc) é um dos genes superiores diferencialmente super-expressos nas células OP9 mais que confluentes.
[0038] Figura 3. Desenvolvimento mesodérmico nos cultivos da hESC diferenciados no ColIV vs na TenC durante 2, 3, e 4 dias nas condições quimicamente definidas (a) Gráficos e plotagens da citometria de fluxo comparando a porcentagem da população mesodérmica primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ (A+P+) nos dias 2 e 3. (b) Gráficos e plotagens da citometria de fluxo comparando a porcentagem de KDRhiCD31- (HVMP), CD31+, e populações de KDRloCD31- no dia 4. (c) Comparação do potencial de formação da colônia MB/ HB dos cultivos do dia 2, dia 3, e dia 4. (d) Potenciais hematopoiéticos e endoteliais das células KDRhiCD31- e KDRloCD31- isoladas a partir das células diferenciadas no dia 4 nas condições quimicamente definidas após o co-cultivo com OP9 durante 7 dias. Os painéis superiores mostraram citometria de fluxo das células humanas controladas por TRA-1-85+ e os painéis inferiores mostram coloração com imunofluorescência das células a partir dos co-cultivos de OP9 com as células KDRhiCD31- e KDRloCD31-. As barras (a), (b), e (c) são a média + SE dos 3 experimentos (*p < 0,01).
[0039] Figura 4. Desenvolvimento dos progenitores endoteliais nos cultivos diferenciados no ColIV ou na TenC durante 5 dias nas condições quimicamente definidas (a) A análise citométrica de fluxo demonstra os subgrupos principais de progenitores de VE-caderina+ (VEC; CD144+) gerados após 5 dias de cultivo da hESC nas condições quimicamente definidas no ColIV e na TenC. (b) As porcentagens de subgrupos e células VEC+ (CD144+) gerados nos cultivos de ColIV e a TenC. As barras de erro são a média + SE dos 3 experimentos (*p < 0,01). (c) potencial de CFC do subgrupo da VEC+ (CD144+) isolada no meio clonogênico livre de soro com FGF2 e citocinas hematopoiéticas. (d) Endotelial e hematopoiético potenciais dos subgrupos VEC+ (CD144+) do dia 5. Os subgrupos progenitores classificados e cultivados em ambas as condições endoteliais com subsequente formação do tubo de ensaio, ou em OP9 com resultados da citometria de fluxo e imunofluorescente após 7 dias. Barras de escala, 100 μm.
[0040] Figura 5. Desenvolvimento dos progenitores hematopoiéticos nos cultivos diferenciados no ColIV durante 8 dias nas condições quimicamente definidas (a) A análise citométrica de fluxo mostra os subgrupos principais das células CD43+ geradas no cultivo no ColIV e na TenC. (b) Os cultivos na TenC produzem significantemente mais células CD43+ através de 3 experimentos (*p<0.01). (c) Potencial de CFC hematopoiético no meio contendo soro está limitado às subpopulações de CD43+. (d) Os cultivos diferenciados na TenC têm potencial mais elevado de CFC do que nos cultivos diferenciados no ColIV, estatisticamente significante através de 3 experimentos (*p < 0,01).
[0041] Figura 6. Potencial da célula T das células CD43+ coletadas a partir das hESCs H1 diferenciadas durante 9 dias nas condições quimicamente definidas no ColIV e na TenC (a) A análise citométrica de fluxo das células coletadas a partir das condições de ColIV e a TenC após cultivos em OP9DLL4 durante 3 semanas. (b) Análise para arranjo do receptor de célula T por meio da PCR genômica. A célula T H1 são as células T derivadas da diferenciação de H1; o controle de PB é controle positivo do Sangue Periférico; hESC H1 é hESCs H1 não diferenciado.
[0042] Figura 7. O efeito do inibidor de TGFβ no desenvolvimento hematopoiético das hESCs H1 nas condições quimicamente definidas. Gráficos de pontos representativos coletados da citometria de fluxo do dia 3, 4, 5, e 8 da diferenciação após a adição do inibidor de TGFβ, SB-431542 do dia 2 até o dia 4 apenas. No dia 3, SB-431542 diminui expressão PDGFRalfa, mas aumenta os progenitores endoteliais nos dias 4 e 5. No dia 8, existe um aumento significante nos progenitores hematopoiéticos CD43+.
[0043] Figura 8. Geração de progenitores hematoendoteliais KDRhiCD31+ nos cultivos empregando diferentes meios basais e meio de base TeSR1 da proteína da matriz é TeSR1 sem citocinas. DF4S é o meio com base em DMEM/ F12 suplementado com 4 suplementos; 64 mg/L de sal de Mg2+ de 2-fosfato de Ácido L-Ascórbico, 8,4 μg/L de selenita de sódio, 10,6 mg/L de Holo-Transferrina, e 20 mg/L de Insulina. I4S é DF4S com meio com base em IMDM ao invés de meio com base em DMEM/ F12, mas com os quatros suplementos anteriormente mencionados. IF4S é DF4S com meio com base em IMDM/ F12 ao invés de meio com base em DMEM/ F12, mas com os 4 suplementos anteriormente mencionados. A VTN é matriz de vitronectina; MTG é substrato de Matrigel®; ColIV é matriz de Colágeno IV. As plotagens da citometria de fluxo mostram a porcentagem dos precursores endoteliais KDRhiCD31+ das células diferenciadas do dia 4 em cada meio suplementado com 50 ng/ml de FGF2, BMP4 de VEGF nas condições hipóxicas.
[0044] Figura 9. Diferenciação hematopoiética de iPSCs e hESCs H9 nas condições quimicamente definidas. O painel superior representa o número de células geradas nos cultivos iniciados a partir do dia -1 quando as células são semeadas em ambos TenC ou ColIV, até o dia 9 de diferenciação. Os números das células CD31+ e CD43+ foram calculados com base no número total de células vezes a porcentagem de células positivas com base na citometria de fluxo. O painel inferior mostra gráficos de pontos da porcentagem das células CD43+ e seus subgrupos de linhagem de iPSC de fibroblasto humano 19-9-7T. A linhagem de iPSC derivada da medula óssea humana BM19-9, e linhagem de ESC humana H9 diferenciadas durante oito dias em ambos ColIV ou TenC.
[0045] A Figura 10 é um diagrama de uma linha de tempo de diferenciação hematopoiética comparando a eficiência da diferenciação no Colágeno IV versus Tenascina C.
[0046] As tecnologias com célula-tronco pluripotente humana (hPSC) fornecer a oportunidade de estudar o desenvolvimento humano in vitro e de se desenvolver nas células do sangue específicas do paciente sem depender dos doadores compatíveis com o HLA. Anteriormente, um protocolo eficiente para a diferenciação de células progenitoras/ tronco hematopoiéticas/empregando um método de co- cultivo na linhagem de célula estromal de camundongo, OP9, foi desenvolvida, (Vodyanik, e outros, 2005; Vodyanik, e outros, 2006). Este sistema reproduz ondas primitivas e definitivas de hematopoese e pode ser empregado para se obter progenitores hematopoiéticos definitivos multipotentes lin-CD34+CD38-CD45RA- CD90+CD117+CD43+CD45-/+ com células com linfóide e fenótipo HSC, incluindo células B e T (Carpenter, e outros, 2011; Kutlesa, e outros, 2009; Schmitt and Zuniga-Pflucker, 2002; Vodyanik, e outros, 2005).
[0047] O co-cultivo de célula-tronco pluripotente humana com células OP9 induz a diferenciação endotelial hemogênica e mesendodérmica. Após o plaqueamento das hPSCs nas células OP9, as hPSCs começam a expressar o marcador mesodérmico do receptor de apelina (APLNR), VEGFR2 (KDR), e PDGFRalfa e adquirir potencial de mesenquimoangioblasto (MB) e hemangioblasto (HB) (dias 2 e 3 de diferenciação). Com maturação avançada, células mesodérmicas KDR+APLNR+ super-regulando a expressão KDR e sub-regular PDGFRα, que é enriquecida nas células com o potencial de formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9.
[0048] No dia 2-3.5 de diferenciação, as células KDR+APLNR+ necessitam de marcadores típicos Endoteliais (CD31, VE-caderina (CD144)), Mesenquimais/ endoteliais (CD73, CD105) e Hematopoiéticos (CD43, CD45), isto é têm um EMHlin- fenótipo. As células EMHlin- necessitam de marcadores endoteliais (CD31 e CD144), endoteliais/ mesenquimais (CD73, CD105), e hematopoiéticos (CD43 and CD45), apesar de que as células lin- necessitam de marcadores das células hematopoiéticas diferenciadas incluindo CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD14, CD15, CD16, CD19, e CD20. No dia 4, a VE-Caderina+ (CD144) das células apareceram. O surgimento das células VE-caderina+ representa uma população heterogênea, que inclui progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD235a/ 43- CD73+ (não HEPs), progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73-CD235a/ 43- (HEPs) e CD144+73-CD43+CD235a+CD41a- , progenitores hematopoiéticos angiogênicos. Os HEPs têm o potencial de dar origem aos progenitores hematopoiéticos lin- CD34+CD43+CD45+/- multipotentes.
[0049] Infelizmente, o sistema com OP9 depende do soro e células alimentadoras do camundongo, que limita sua utilidade de estudar a resposta da hPSC aos fatores específicos de crescimento e produção de células de sangue terapêuticas de grau clínico. Além disso, o sistema de co-cultivo OP9 é muito sensível as variações na qualidade do soro, a manutenção da célula estromal, e o tamanho das colônias de PSC empregados para diferenciação.
[0050] Se bem que outros pesquisadores têm desenvolvidos os protocolos de diferenciação livres do alimentador, estes protocolos dependem da formação de corpos embrióides (EBs) para diferenciação hematopoiética. os métodos com EB muitas vezes dependem do soro e também têm desvantagens significantes, tais como, diferenciação assíncrona e elevada variabilidade. Recentemente vários protocolos foram desenvolvidos para induzir a hematopoese nas condições livres de soro (Salvagiotto, e outros, 2011; Wang, e outros, 2012); de qualquer modo, elas ainda necessitam de componentes xenogênicos, albumina de soro, e/ou propriedade dos suplementos. Também permanece obscuro se estes protocolos reproduzem as ondas distintas de hematopoese como visto na OP9.
[0051] Além disso, a maioria dos protocolos se diferenciam das hPSCs cultivadas em MEFs ou Matrigel®. Uma vez que uma nova, matriz e meio livres de xenógeno completamente quimicamente definidos para derivação da hPSC e a manutenção foi descrita (Chen, e outros, 2011) existe uma necessidade de se desenvolver um protocolo de diferenciação semelhante direcionada livre de xenógeno quimicamente definido para derivação dos progenitores hematopoiéticos das hPSCs.
[0052] A não ser que de outra forma definido nesta especificação, os termos técnicos e científicos empregados aqui têm o mesmo significado como geralmente entendido por alguém de ordinária versatilidade na técnica à qual esta invenção pertence e por referência aos textos publicados.
[0053] É para ser observado que o termo "um" ou "uma," se refere a uma ou mais, por exemplo, "uma molécula," é entendido representar uma ou mais moléculas. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais," e "pelo menos um" são empregados alternadamente aqui. O termo "cerca de" como empregado aqui considera uma faixa de valores para um determinado número de +/- 10 % da magnitude daquele número. Por exemplo, "cerca de 3 gramas" indica um valor de 2,7 a 3,3 gramas, e assim por diante.
[0054] Como referidos aqui, os termos "condições definidas" ou "meio definido" significam a identidade e quantidade de cada ingrediente é conhecida. O termo "ingrediente," como empregado aqui, se refere a um componente da identidade e da quantidade molecular da qual é conhecida.
[0055] Aqui descritos estão métodos reproduzíveis e eficientes e composições de apoio que se recapturam, em um sistema livre de xenógeno, completamente definido, o desenvolvimento hematopoiético observado no OP9 sistema de co-cultivo até o início das etapas mesodermas, precursor de mesoderma hematovascular, e endotelial hemogênico.
[0056] A Tabela 1 fornece uma lista de tipos de células, fenótipos associados de marcadores de células, e abreviações correspondentes empregadas aqui.
[0057] Métodos para Diferenciação Hematoendotelial das Células- tronco Pluripotentes Humanas (hPSCs)
[0058] Aqui descritos estão os métodos para a diferenciação das células-tronco pluripotentes humanas (ou células-tronco pluripotentes induzidas humanas ou embrionárias humanas) sob condições definidas, e, de preferência, na ausência de formação de corpo embrióide. Pelo menos um resultado desejado desta diferenciação está a provisão de populações de células endoteliais e hematopoiéticas que podem ser uma fonte de estudos funcionais destas linhagens, assim como, uma fonte para as terapias clínicas.
[0059] Em algumas modalidades, o método de diferenciação fornecido aqui inclui as etapas de (a) fornecimento de células-tronco pluripotentes humanas (por exemplo, células-tronco embrionárias humanas (hESCs) ou células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs)) e (b) cultivação das células-tronco pluripotentes humanas sob condições hipóxicas em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl durante um período de cerca de dois dias para formar uma população de células de células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto. De preferência, as células-tronco pluripotentes humanas são cultivadas sem a formação de corpos embrióides.
[0060] Em algumas modalidades, as células-tronco pluripotentes humanas são semeadas em uma densidade inicial de cerca de 5.000 células/cm2 a cerca de 15.000 células/cm2, por exemplo, 6.000 células/cm2, 7.000 células/cm2, 8.000 células/cm2, 9.000 células/cm2, ou outra densidade do plaqueamento de cerca de 5.000 células/cm2 a cerca de 15.000 células/cm2. Em algumas modalidades, o método de diferenciação também inclui as etapas de (c) cultivar, sob condições hipóxicas, a população de células obtida na etapa (b) em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2 e VEGF durante um período de cerca de 1 a 2 dias para se obter uma população de células compreendendo mesoderma primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e células mesodermas hematovasculares (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /-) enriquecidas nas células com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9. Em outras modalidades, o método de diferenciação também inclui as etapas de (d) cultivar as células mesodermas hematovasculares da etapa (c), sob condições hipóxicas, em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, e IL3 durante cerca de um dia para se obter a formação de progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD73+CD235a/CD43- (não HEP), progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43- (HEPs), progenitores hematopoiéticos angiogênicos CD144+CD73- CD235a/CD43+41a- (AHP), and células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+.
[0061] Em algumas modalidades, o método de diferenciação também inclui as etapas de (e) cultivar, sob normóxia, os HEPs e células progenitoras hematopoiéticas em um meio de cultivo compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante cerca de três dias para se obter uma população expandida de progenitores hematopoiéticos CD43+ compreendendo progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ e progenitores hematopoiéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+ /-.
[0062] Em algumas modalidades, um método de diferenciação descrito aqui inclui as etapas de pelo menos um de: (i) cultivar células- tronco pluripotentes humanas, sem formação de corpo embrióide, sob condições hipóxicas em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl durante um período de cerca de dois dias para formar uma população de células de células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto; (ii) cultivar, sob condições hipóxicas, células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2 e VEGF durante um período de cerca de 1 a 2 dias para se obter uma população de células compreendendo mesoderma primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e células mesodermas hematovasculares (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /-) enriquecidas nas células com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9; (iii) cultivar células mesodermas hematovasculares (EMHlin- KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /-) das células, sob condições hipóxicas, em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, e IL3 durante cerca de um dia para se obter a formação de progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD73+CD235a/ CD43- (não HEP), progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73- CD235a/ CD43- (HEPs), progenitores hematopoiéticos angiogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- (AHP), e células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+; e (iv) cultivar, sob normóxia, progenitores endoteliais hemogênicos (HEPs) e células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+ em um meio de cultivo compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 durante cerca de três dias para se obter uma população expandida de progenitores hematopoiéticos CD43+ compreendendo progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a+CD41a+ e progenitores hematopoiéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+ /-.
[0063] Em algumas modalidades, as condições hipóxicas se referem a um nível de oxigênio ambiental (por exemplo, uma mistura de gás da incubadora do cultivo de célula) de cerca de 3 % de O2 a cerca de 10 % de O2. Em algumas modalidades, as condições hipóxicas é de cerca de 5 % de O2. Nas modalidades em que um meio de cultivo da célula é deixado equilibrar sob condições hipóxicas, o meio de cultivo das células torna-se um meio de cultivo da célula hipóxica devido ao nível mais baixo de oxigênio dissolvido em relação a um meio equilibrado de cultivo da célula sob condições normóxicas (por exemplo, uma mistura de gases contendo cerca de 20 % de oxigênio).
[0064] Em algumas modalidades, o meio de cultivo a ser empregado em qualquer um dos métodos de diferenciação acima descritos compreende um meio de IF9S, como descrito aqui. Em uma modalidade, o meio de IF9S a ser empregado é o meio de IF9S tendo a formulação apresentada na Tabela 2.
[0065] Em algumas modalidades, qualquer uma das células acima referenciadas (por exemplo, células-tronco pluripotentes humanas) são cultivadas na Tenascina C. Em algumas modalidades, qualquer uma das células referenciadas são semeadas em um substrato tratado com uma quantidade de Tenascina-C suficiente para aderir as 10.000 células/cm2 ao substrato. Em algumas modalidades, a Tenascina-C a ser empregada é Tenascina C humana. Em algumas modalidades, o substrato é tratado com Tenascina C em uma concentração de pelo menos cerca de 0,25 μg/cm2 a 1 μg/cm2, por exemplo, 0,4 μg/cm2, 0,5 μg/cm2, 0,7 μg/cm2, 0,8 μg/cm2, ou outra concentração de pelo menos cerca de 0,25 μg/cm2 a 1 μg/cm2
[0066] Em algumas modalidades, o meio de cultivo da célula a ser empregado nos métodos de diferenciação acima descritos, a concentração de: BMP4 é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 250 mg/ ml; a Ativina A é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 15 ng/ml; o FGF2 é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; LiCl é de cerca de 1 mM a cerca de 2 mM; VEGF é de cerca de 20 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; SCF é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml; TPO é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml; IL-6 é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, e IL-3 é de cerca de 5 ng/ml a cerca de 15 ng/ml.
[0067] Em algumas modalidades, qualquer uma das células acima referenciadas são cultivadas em um meio de cultivo de célula livre de xeno-. De importância central para terapias clínicas está a ausência de materiais xenogênicos nas populações de células derivadas, isto é, sem células não humanas, fragmentos de células, soros, proteínas, e assim por diante. De preferência, a presente invenção atinge as células diferenciadas livres de xenógeno pelo uso de Tenascina C ou Colágeno IV como uma plataforma, que essencialmente substitui o contato com as células OP9 empregadas nos sistemas anteriores de diferenciação. Além disso, os meios aqui descritos são quimicamente definidos e, em algumas modalidades, são feitos livres de xeno-, e incorporam as proteínas humanas, que podem ser produzidas empregando a tecnologia recombinante ou derivadas de placenta ou de outros tecidos humanos em vez das proteínas derivadas de animal. Em algumas modalidades, todas as proteínas adicionadas ao meio são proteínas recombinantes.
[0068] Ao mesmo tempo que os processos de diferenciação incluem eventos ordenados, sequenciais, o momento dos eventos pode ser variado em pelo menos 20 %. Por exemplo, ao mesmo tempo que uma etapa específica pode ser descrita em uma modalidade como a duração de um dia, o evento pode durar por mais ou menos do que um dia. Por exemplo, "um dia" pode incluir um período de cerca de 18 a cerca de 30 horas. Os períodos de tempo indicaram que são de múltiplos períodos de dias podem ser múltiplos de "um dia," tais como, por exemplo, dois dias podem abranger um período de cerca de 36 a cerca de 60 horas, e assim por diante. Em outra modalidade, a variação de tempo pode ser reduzida, por exemplo, quando o dia 2 é de 48 +/- 3 horas a partir de d0; o dia 4 é de 96 +/- 3 horas a partir de d0, e o dia 5 é de 120 horas +/- 3 horas a partir de d0.
[0069] Os exemplos de linhagens potenciais diferenciadas e/ou comprometidas obteníveis pela presente invenção incluem células mesodermas primitivas KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com o potencial de CFC de MB e HB, células mesodermas hematovasculares EMHlin- KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /- com potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9, células do subgrupo VE-Caderina+ (CD144+), tais como, HEPs (CD144+CD73-CD235a/ 43-, não HEPS (CD144+CD73+CD235a/ 43-, e AHPs (CD144+CD73-CD235a/ 43+41a-), células progenitoras hematopoéticcomo CD43+, tais como, progenitores hematopoiéticos eritromegacariocíticos CD43+CD235a+41a+, e progenitores hematopoiéticos multipotentes lin-CD34+CD43+CD45+ /-. O termo linhagem- ("lin-), como empregado aqui, se refere a um precursor hematopoiético ou célula progenitora que não comprometem a qualquer uma de suas linhagens de células do sangue derivativas até o momento, uma vez que mantem a capacidade de se diferenciar em qualquer uma delas. Esta característica é monitorada pela procura à ausência dos marcadores de superfície da célula indicativo da diferenciação em qualquer uma das linhagens derivativas. Uma outra vantagem significante da presente descrição é a capacidade de usar populações de células clonais devido à plataforma de Tenascina C, que remove a dependência de eventos estocásticos indefinidos comuns aos aglomerados de células, tal como, corpos embrióides, para gerar populações diferenciadas. Além do mais, as populações de células clonais apresentam maior uniformidade durante o processo de diferenciação, que fornece uma produção mais elevada de células sincronizadas do que anteriormente visto nos sistemas de células alimentadoras. Por esse motivo, a presente descrição também descreve um sistema mais eficiente, melhor diferenciação escalável do que anteriormente disponível.
[0070] Algumas modalidades aqui descrevem um meio de diferenciação compreendendo um meio de base, sal de Mg2+ de 2- fosfato de ácido L-ascórbico, monotioglicerol, selenita de sódio (além de qualquer um presente no meio de base), álcool de polivinila, Glutamax™, aminoácidos não essenciais (NEAA), concentrado de lipídeo quimicamente definido, Holo-Transferrina, e insulina. Os meios de base adequados para os meios de diferenciação descritos aqui incluem, mas não estão limitados a, Meio de Dulbecco Modificado por Iscove/ F12 (IMDM/ F12), meio de base TeSR1, que é meio de base mTeSR1™, (Stem Cell Technologies, ver Ludwig and Thomson (2007), Curr Protoc Stem Cell Biol., Capítulo 1: Unidade 1C.2 e Patente dos Estados Unidos No. 7.449.334), sem FGF2 e TGF-beta; meio de base DF4S, que é o meio Essential 8™ (Life Technologies; também conhecido como meio "E8", ver Chen and Thomson (2011), Nat Methods, 8(5):424-429 e Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20120178166) sem FGF2 e TGF-beta, meio de base I4S, que é a base DF4S com meio de Dulbecco Modificado por Iscove (IMDM) ao invés de DMEM/ F12, e a base de IF4S é base DF4S com IMDM/ F12 ao invés de DMEM/ F12. De preferência, o meio de base a ser empregado é livre de albumina. O IMDM/ F12 é um meio sintético altamente enriquecido adequado para proliferação rapidamente, cultivos com alta densidade celular com uma mistura de nutrientes adicionados.
[0071] Em algumas modalidades, os meios de diferenciação empregados aqui, referidos genericamente aqui como meios de "IF9S", compreendem IMDM/ F12, sal de Mg2+ de 2-fosfato de ácido L- ascórbico, monotioglicerol, selenita de sódio (além de qualquer um presente no meio de base), álcool de polivinila, Glutamax™, aminoácidos não essenciais (NEAA), concentrado de lipídeo quimicamente definido (Life Technologies; Cat. No. 1905031), Holo- Transferrina, e insulina.
[0072] Em uma modalidade, um meio de IF9S compreende IMDM/ F12 (1 x), sal de Mg2+ de 2-fosfato de ácido L-ascórbico (64 mg/L), monotioglicerol (50 mg/L), selenita de sódio (além de qualquer um presente no meio de base; 8,4 ug/L), álcool de polivinila (10 mg/L), Glutamax™ (1 x), NEAA (1 x), concentrado de lipídeo quimicamente definido (0,1 x), Holo-Transferrina (10,6 mg/L), e insulina (20 mg/L).
[0073] Tal como descrito aqui, em várias fases/momentos de diferenciação hematoendotelial das hPSCs, o meio completo de diferenciação a ser empregado contém várias combinações de citocinas, fatores de crescimento, e/ou moléculas pequenas. Dependendo da fase de diferenciação hematoendotelial de acordo com os métodos descritos aqui, um meio de diferenciação completo adequado deve ser suplementado com diferentes combinações de citocinas com concentrações dentro das faixas descritas para o meio completo de diferenciação descrito aqui.
[0074] Em algumas modalidades, o meio de diferenciação completo compreende um meio de IF9S, BMP4, Ativina A, FGF2, e LiCl. Em outras modalidades, o meio de diferenciação completo compreende um meio de IF9S, FGF2, e VEGF. Em outras modalidades, o meio de diferenciação completo compreende um meio de IF9S, FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL-6, e IL-3. Em algumas modalidades, a concentração média completa final de: BMP4 é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 250 mg/ ml; a Ativina A é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 15 ng/ml; FGF2 é de cerca de 10 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; LiCl é de cerca de 1 mM a cerca de 2 mM; VEGF é de cerca de 20 ng/ml a cerca de 50 ng/ml; SCF é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml; TPO é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml; IL-6 é de cerca de 50 ng/ml a cerca de 100 ng/ml, e IL-3 é de cerca de 5 ng/ml a cerca de 15 ng/ml. Em algumas modalidades, todas as proteínas empregadas no meio completo de diferenciação são proteínas humanas recombinantes. Em outras modalidades, o meio completo de diferenciação compreende uma ou mais proteínas não humanas (por exemplo, proteínas não humanas recombinantes).
[0075] Em algumas modalidades, um meio de diferenciação completo compreende um meio de IF9S e uma das combinações da "citocina" listadas na Tabela 3 nas concentrações indicadas. Em algumas modalidades, a formulação do meio de IF9S empregada nos meios de diferenciação completos recentemente mencionados é a formulação do meio de IF9S apresentada na Tabela 2.
[0076] Ao mesmo tempo que os meios atualmente descritos podem incluir os morfogênios específicos, moléculas pequenas, e citocinas hematopoiéticas como descritos aqui, é considerado que os componentes adicionais com as mesmas, equivalente, ou semelhantes propriedades podem ser empregados, além de ou no lugar de daqueles descritos, como são conhecidos na técnica.
[0077] Em algumas modalidades, os meios descritos aqui podem incluir materiais xenogênicos (isto é, não humanos, biologicamente derivados). Por exemplo, um material xenogênico pode ser uma proteína recombinante de origem xenogênica. Os meios descritos aqui também podem ser feitos nas formas concentradas as quais são diluídas antes do uso, tais como, concentrações de 2X, 10X, 100X, ou 1.000X.
[0078] Além do mais, a substituição de certos materiais xenogênicos nos meios da presente invenção forneceu maiores, benefícios inesperados que apenas fornecem as condições de cultivo livres de xenógeno. Por exemplo, é acreditado que a substituição de albumina de soro bovino com álcool de polivinila leva a um meio "mais grosso" que inesperadamente contribui para a sobrevivência da célula.
[0079] Tabela 2. Descrição de uma modalidade exemplar de um meio de IF9S.
[0080] Tabela 3. Visão geral das Combinações de Suplementos de Citocina e Concentrações Exemplares em Diferentes Dias Após o Início da Diferenciação Hematoendotelial das hPSCs (em um meio de IF9S).
[0081] Também descrito aqui está um suplemento médio "9S" concentrado, compreendendo sal de Mg2+ de 2-fosfato de ácido L- ascórbico, monotioglicerol, selenita de sódio adicional, álcool de polivinila, Glutamax™ (ou glutamina), aminoácidos não essenciais (NEAA), concentrado de lipídeo quimicamente definido, Holo- Transferrina, e insulina. Em algumas modalidades, o suplemento médio 9S concentrado compreende cada componente em uma concentração de 10x a 1000x da concentração final de trabalho uma vez diluído em um meio de base. Em algumas modalidades, as concentrações de todos os componentes de 9S no suplemento concentrado é de 10x a 1000x as concentrações listadas na Tabela 3. Em algumas modalidades, o suplemento é para ser diluído em meio IMDM/ F12 para se obter meio de IF9S, tal como descrito aqui.
[0082] Também considerados aqui estão os kits úteis para diferenciação hematoendotelial das hPSCs. Em algumas modalidades, um kit compreende um suplementado médio concentrado 9S, tal como descrito aqui, um ou mais de BMP4, Ativina A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, e IL-3, e instruções para gerar um meio de IF9S e um método para a diferenciação hematoendotelial das hPSCs, tal como descrito aqui. Em algumas modalidades, um kit também inclui o meio IMDM/ F12. Em algumas modalidades, o kit compreende um suplementado médio concentrado 9S, Ativina A, FGF2, LiCl, SCF, TPO, IL-6, IL-3, e instruções para gerar um meio de IF9S e um método para a diferenciação hematoendotelial das hPSCs, tal como descrito aqui. Em outras modalidades, qualquer um dos kits acima mencionado também inclui Tenascina C (por exemplo, Tenascina C humana), que é empregada como um substrato para o crescimento aderente de acordo com os métodos de diferenciação descritos aqui.
[0083] Também descrito aqui está um sistema definido de cultivo da célula para diferenciação hematoendotelial das hPSCs. Tais sistemas de cultivos de células incluem uma diferenciação definida do meio de cultivo tal como descrito aqui, por exemplo, um meio de IF9S, um substrato da proteína Tenascina C para crescimento aderente das hPSCs ou sua progênie diferenciada juntamente com a linhagem hematoendotelial. Em algumas modalidades, a Tenascina C é empregada em pelo menos 0,25 μg/cm2 a cerca de 1 μg/cm2 para gerar um substrato aderente adequado.
[0084] Em algumas modalidades, o sistema de cultivo da célula inclui um meio de IF9S suplementado com BMP4, Ativina A, FGF2, e LiCl. Em algumas modalidades, o meio de IF9S é suplementado com FGF2 e VEGF. Em algumas modalidades, o meio de IF9S utilizado no sistema de cultivo da célula é suplementado com FGF2, VEGF, SCF, TPO, IL6, e IL-3. Em algumas modalidades, o meio de IF9S empregado no sistema de cultivo da célula é formulado de acordo com o meio descrito na Tabela 2. Em algumas modalidades, o sistema definido de cultivo da célula compreende um meio de cultivo da célula que é hipóxico, que é facilmente obtido pelo uso de um incubador do cultivo de células permitindo a regulação do nível de oxigênio, e por meio do equilíbrio do meio de cultivo da célula em um conjunto incubador do cultivo de células de cerca de 3 % de O2 a cerca de 10 % de O2 (por exemplo, 5 % de O2).
[0085] Em outras modalidades, o sistema definido de cultivo da célula também inclui as células-tronco pluripotentes humanas aderentes cultivadas no substrato de Tenascina C no meio de IF9S de acordo com os métodos descritos aqui.
[0086] As células podem ser cultivadas em, por exemplo, pratos de cultivo de célula revestido com Tenascina C, placas de cultivos de células de múltiplas cavidades, ou bolas microtransportadoras. De preferência, a proteína Tenascina C é Tenascina C humana (GenBank Accession No. CAA55309.1; disponível comercialmente, por exemplo, Millipore Cat. No. CC065)
[0087] O uso de Tenascina C e as condições hipóxicas permitem a geração de populações enriquecidas de células endoteliais e hematopoiéticas nas porcentagens mais elevadas do que em relação as células semeadas no Colágeno IV ou células OP9, tal como, maior do que 10 %, ou maior do que cerca de 20 %, maior do que cerca de 50 %, ou maior do que cerca de 60 % quando comparado por fase por plataforma (ver a Figura 10 e os Exemplos). Em uma modalidade, as porcentagens de populações alvo obteníveis pela presente invenção podem ser maiores do que cerca de 35 % para as células mesodermas KDR+APLNR+PDGFRalfa+ ou maior do que cerca de 20 % das células endoteliais VE-Caderina+CD43- e maior do que cerca de 40 % de células progenitoras hematopoiéticas CD34+CD43+. Além disso, no que diz respeito à Figura 10, as porcentagens das células obtidas na plataforma Tenascina C são da porcentagem indicada ou maior. Além disso, a Figura 10 representa a porcentagem da população alvo (por exemplo, progenitor mesodermo, progenitor endotelial, progenitores hematopoiéticos com os fenótipos correspondentes como de acordo com citometria de fluxo) do cultivo total quando diferenciada em ambos Col IV ou TenC.
[0088] Os atuais materiais e métodos podem ser combinados nos sistemas de cultivos de células para fornecer novas plataformas de diferenciação. Em uma modalidade, um sistema básico de cultivo da célula inclui células-tronco pluripotentes semeada na Tenascina C. Em outra modalidade, um sistema de cultivo da célula inclui células-tronco semeadas no Colágeno IV, em um meio suplementado com Ativina A. estes sistemas têm a capacidade de produzir populações de células enriquecidas com células progenitoras hematopoiéticas.
[0089] Os sistemas de cultivos de células considerados aqui podem ser modulares, pelo fato de que podem incorporar os componentes adicionais que alteram as populações de células resultantes derivadas do sistema. Por exemplo, o sistema de cultivo da célula pode incorporar os meios que são livres de xenógeno para certos resultados desejados. De qualquer modo, podem incluir os meios contendo xenógeno se, por exemplo, as terapias clínicas não consideradas para as populações de células derivadas. Além disso, os sistemas de cultivos de células podem ser com base em vários recipientes para cultivos feitos sob medida, como são conhecidos na técnica, para atingir a escala desejada de produção de população de células.
[0090] Em alguns casos, um pode substituir alguns dos componentes de um meio de IF9S. Por exemplo, o ácido ascórbico e o monotioglicerol podem ser substituídos por um suplemento opcional de um composto e/ou um composto contendo tiol com propriedades antioxidantes. O GLUTAMAX™ pode ser substituído por um suplemento opcional de L-glutamina. Os "aminoácidos não essenciais (NEAA)," que é um termo geral para os aminoácidos que o corpo humano pode produzir a partir de outros aminoácidos podem ser substituídos por um suplemento opcional de aminoácidos. O "concentrado de lipídeo quimicamente definido," que é uma solução especificamente distribuída pela Life Technologies, pode ser substituído por um suplemento opcional de lipídeos. Holo-transferrina, insulina, e selenita adicionais podem ser substituídos por qualquer suplemento de ITS. ITS significa "Insulina-Transferrina-Selenita." Algumas companhias (por exemplo, Life Technologies), vendem solução de ITS a empregada como suplementos em outros meios basais (DMEM, por exemplo). De qualquer modo, o fabricante não fornece as concentrações de cada componente. O álcool de polivinila pode ser substituído por um suplemento opcional de um composto espessante do meio biologicamente inativo.
[0091] Os exemplos que seguem apresentaram os métodos e materiais preferidos para a realização da invenção. É para ser entendido, de qualquer modo, que estes exemplos são fornecidos a título de ilustração e nada aqui deve ser tomado como uma limitação no escopo global da invenção.
[0092] Anteriormente, nosso laboratório desenvolveu o protocolo para a eficiente diferentiação de hPSC hematopoiético empregando um método de co-cultivo na linhagem de célula estromal de camundongo, OP9.9,13 Se bem que o sistema de OP9 suporta eficiente geração de HE e progenitores hematopoiéticos de multilinhagens (Figura 1), este sistema é muito sensível as variações na qualidade do soro, a manutenção da célula estromal, e tamanho das colônias de hPSC e aglomerados empregados para diferenciação.13,14 A formação dos corpos embrióides (EBs) é outra metodologia geralmente empregada para induzir formação de sangue e HE das hPSCs.7,15,16 De qualquer modo, os métodos com EB, muitas vezes, dependem de soro ou meio não definido e também têm as desvantagens significantes, tais como, diferenciação assíncrona, elevada variabilidade e dependência do tamanho inicial do aglomerado. Adicionalmente, a inconsistência na qualidade das hPSCs devido as variações nos lotes de albumina empregados para a manutenção de hPSC pode introduzir as variações na eficiência da produção de sangue.
[0093] Para superar estas limitações decidimos identificar o meio quimicamente definido e as proteínas das matrizes capazes de suportar a diferenciação hematoendotelial sem soro a partir da suspensão de célula única das células-tronco embrionárias humanas H1 (hESCs) expandida no meio E8 livre de xenógeno e completamente definido na vitronectina (VTN)17.
[0094] As células-tronco pluripotentes humanas (H1 e hESCs H9, fibroblasto derivados de iPSC 19-9-7T, e BM119-9 iPSCs derivadas das células mononucleares da medula óssea) foram mantidas na vitronectina ou matrigel nos meios E8 feitos em casa suplementados com FGF2 e TGFβ (Peprotech). As células foram passadas quando atingiram 80 % de confluência empregando 0,5 mM de EDTA em PBS. As células foram mantidas em condições normóxicas com 5 % de CO2.
[0095] As células-tronco pluripotentes humanas foram separadas de vitronectina ou matrigel quando atingiram 80 % de confluência empregando 1x TrypLE (Life Technologies) e semeadas em uma densidade otimizada variando de 5.000 células/cm2 a 15.000 células/cm2, dependendo da linhagem de célula nas placas de 6 cavidades revestidas com 0,5 μg/cm2 de ColIV (Sigma-Aldrich) ou 0,5 μg/cm2 de Tenascina-C (Millipore) em meio E8 suplementado com 10 μM de inibidor Rho Kinase (Tocris Y-27632). Após 24 horas (dia 0), o meio foi mudado para o meio IF9S suplementado com 50 ng/ml de BMP4 (Peprotech), 15 ng/ml de Ativina A (Peprotech), 50 ng/ml de FGF2 (Miltenyi Biotech), 2 mM de LiCl (Sigma), e na ocasião, 1 μM de inibidor Rho Kinase para aumentar a viabilidade celular. No dia 2, o meio foi mudado para o meio IF9S suplementado com 50 ng/ml de FGF2 e 50 ng/ml de VEGF, e 10 μM de SB-431542 (Tocris) foram mencionados. No dia 4, o meio foi mudado para o meio IF9S suplementado com 50 ng/ml de FGF2, VEGF, TPO, SCF, IL-6, e 10 ng/ml de IL-3. No dia 6, meio IF9S adicional suplementado com os mesmos 6 fatores foram adicionados aos cultivos sem sucção do meio antigo (Tabela 3). IF9S (IMDM/ F12 com 9 suplementos) foi feito em casa com o que segue: 50 % de IMDM, 50 % de F12 (Life Technologies) suplementados com 64 mg/L de sal de Mg2+ de 2- fosfato de Ácido L-Fosfato (Sigma-Aldrich), 40 ul/ L de monotioglicerol (Sigma-Aldrich), 8,4 μg/L de selenita de sódio adicional (Sigma- Aldrich), 10 mg/L de álcool de polivinila (Sigma-Alderich), 1x de glutamax (Life Technologies), 1x de aminoácidos não essenciais (Life Technologies), 0,1x de concentrado de lipídeo quimicamente definido (Life Technologies), 10,6 mg/L de Holo-Transferrina (Sigma-Aldrich), e 20 mg/L de Insulina (Sigma-Aldrich) (Tabela 2). A diferenciação foi administrada na condição hipóxica do dia 0 até o dia 5, e transferida para condição normóxica do dia 6 até o dia 9 (Figura 1). O 1x TrypLE foi empregado para decompor e colocar as células para análise.
[0096] MB e HB foram detectados empregando meio CFC livre de soro suplementado com ensaio FGF2 como anteriormente descrito. 11 Os cultivos do dia 2 ou 3 foram decompostos e preparados em uma suspensão de célula única empregando 1x TrypLE (Life Technologies) e 5.000 células do cultivo total foram semeadas no meio CFC. As colônias de MB e HB foram contadas 12 dias após o plaqueamento da suspensão de célula única.
[0097] CFC Hematopoiético foi detectado empregando H4436 Methocult™ contendo soro suplementado com G-CSF, GM-CSF, IL-3, IL-6, EPO, SCF recombinante humano (Stem Cell Technologies). O potencial hematopoiético das AHPs foi avaliado empregando SF H4236 methocult livre de soro com FGF2 adicionado (20 ng/ml), SCF (20 ng/ml), IL3 (10 ng/ml), IL6 (10 ng/ml), e EPO (2 U/ mL) (Stem Cell Technologies) como anteriormente descrito. 6 1.000 - 10.000 células diferenciadas foram semeadas no meio CFC e as colônias foram contadas após 14 dias de cultivo.
[0098] A citometria de Fluxo foi administrada empregando um citômetro de fluxo FACSCalibur e os anticorpos que seguem: CD31- FITC (clone de WM59), CD34-FITC (8G12), CD41a-FITC/APC (clone de HIP8), CD43-FITC/PE/APC (clone de 1G10), CD45-APC (clone de HI30), CD73-FITC/PE (clone de AD2), CD144-FITC/PE/AlexaFluor647 (clone de 55-7H1), CD235a-FITC/PE/APC (clone de GA-R2), KDR- PE/AlexaFluor647 (clone de 89106), PDGFRα-PE (clone de aR1) (BD Biosciences), TRA-1-85-FITC/PE (clone de TRA-1-85), e APLNR-APC (clone de 72133) (R&D Systems). A classificação foi administrada em um FACS Aria, como descrito anteriormente. A pureza das populações isoladas foi de 92 a 95 %.
[0099] As células OP9 foram mantidas em α-MEM (Gibco) suplementado com 20 % de FBS (Hyclone) como anteriormente descrito. 10 Os cultivos classificados do dia 4 ou dia 5 foram semeados em uma camada de células OP9 em α-MEM (Gibco) suplementada com 10 % de FBS (Hyclone) suplementado com 100 μM de MTG, 50 μg/ml de ácido ascórbico, 50 ng/ml de SCF, TPO, IL-6, e 10 ng/ml de IL-3 em uma densidade de 5.000 células/ cavidades de uma placa de 6 cavidades como anteriormente descrito. 6 Os cultivos foram preparados para citometria de fluxo de 4 a 7 dias mais tarde, por meio da coleta de células flutuantes e dissociação dos cultivos completos empregando 1x TrypLE.
[00100] Uma linhagem celular OP9 (OP9-DLL4) constitutivamente expressando o ligando de tipo delta humano 4 (DLL4) foi estabelecida pelo nosso laboratório empregando lentivírus e foi mantida similarmente à OP9. Depois as células-tronco pluripotentes humanas foram diferenciadas durante 9 dias, as células flutuantes foram coletas, filtradas através de um filtro celular de 70 μm (BD Biosciences) e lavadas. E em seguida, foram ressuspensas em meio de diferenciação de célula T consistindo em α-MEM (Gibco) suplementado com 20 % de FBS (Hyclone) suplementado com IL7 (5 ng/ml), Flt3L (5 ng/ml) e SCF (10 ng/ml). E em seguida, foram semeadas em OP9-DLL4 e cultivadas a 37 °C e 5 % de CO2. Após 4 dias, as células foram colhidas empregando solução de colagenase IV (Gibco) (1 mg/ml em DMEM/ F12, Gibco) e 1x TrypLE (Invitrogen), e passadas em uma camada fresca de OP9-DLL4. Após 3 dias, as células foram passadas novamente. As passagens subsequentes são administradas a cada 7 dias até 4 semanas, após as quais as células flutuantes são coletadas para análise de fluxo e extração de DNA genômico para o ensaio de rearranjo de TCR.
[00101] O DNA genômico foi isolado empregando quick-gDNA MiniPrep (Zymo Research). A clonalidade de TCRβ e de TCRy foi detectada empregando um kit amplificação de PCR (Invivoscribe) e DNA polymerase AmpliTaq Gold® (Applied Biosystems) como anteriormente descrito. 33 Os produtos da PCR foram analisados empregando análise de heteroduplex em um gel de poliacrilamida a 6 % colorida com brometo de etídio.
[00102] Uma linhagem de célula estromal da medula óssea de camundongo, OP9, foi obtida pelo Dr. Toru Nakano (Research Institute for Microbial Diseases, Osaka University, Japão), S17 foi obtido pelo Dr. Kenneth Dorshkind (University of California, Los Angeles) e MS-5 foi obtido pela German Tissue Culture Collection. As linhagens de células estromais foram cultivadas como descrito. 9 O RNA livre de DNA foi isolado empregando RiboPure™ RNA e DNAse empregando reagentes TURBO™ DNAfree (Ambion). Todas as amostras foram processadas no Gene Expression Center of the Biotechnology Center na University of Wisconsin, Madison e analisadas empregando ensaios padrões A4543-00-01 MM8 60mer expr Mus musculus 1-Plex Array produzidos pela NimbleGen Systems (Madison, WI). Os dados brutos da expressão de gene foram extraídos empregando software NimbleScan v2.1. Considerando que a distribuição de sinal da amostra de RNA é diferente daquela da amostra de gDNA, as intensidades de sinais de todos os canais de RNA em todos os oito arranjos foram normalizadas com um algoritmo Forte Multiple-chip Analysis (RMA). 47 Separadamente, o mesmo procedimento de normalização foi realizado naquelas amostras de gDNA. Para um determinado gene, a taxa média ajustada entre sua intensidade normalizada do canal de RNA e aquela o canal de gDNA foi e em seguida calculada como segue: Relação = intensidade de canal de RNA/ (intensidade de canal de gDNA + intensidade média de todos os do canal de gDNAl). Os genes com mais do que nas diferenças de 3 vezes na expressão foram considerados diferencialmente expressos. Apenas os genes com nível de expressão > 1 foram selecionados para análise.
[00103] As hESCs semeadas como células únicas e deixadas incorporar durante 24 horas em meio E8 suplementado com 10 μM de inibidor Rho Kinase em Matrigel (MTG), VTN, ou Colágeno IV (ColIV). E em seguida, o meio foi mudado para um dos três meios basais livres de proteínas animais, ou fator de crescimento livre de TeSR1, suplementado com fatores de VEGF, FGF2, e BMP4 recombinantes humanos que geralmente empregados para induzir a formação de sangue a partir de hPSCs. 18,19 Após 4 dias de diferenciação dos cultivos de células avaliados pela presença de células KDRhiCD31+ as quais são altamente enriquecidas nos progenitores hematoendoteliais. 6 A análise de citometria de fluxo a mostrou que as células diferenciadas nas placas revestidas com ColIV no meio IMDM/ F12 suplementado com sal de Mg2+ de 2-fosfato de ácido L-ascórbico, 8,4 μg/L de selenita de sódio adicional, Holo-Transferrina, e insulina diferenciado mais eficazmente nos precursores hematoendoteliais KDRhiCD31+ (Figura 8). Mais tarde, constatamos que a adição de álcool de polivinila, NEAA, Glutamax, concentrado de lipídeo quimicamente definido, e o monotioglicerol aumentou a viabilidade celular e eficiência da diferenciação (dados não mostrados). O meio basal subsequente é referido como IF9S (IMDM/ F12 mais 9 suplementos). Estes resultados demonstraram que o meio selecionado e os suplementos tornaram-os possíveis para se obter as células hematoendoteliais em uma das condições de xenógeno, quimicamente definidas, na matriz de ColIV das hPSCs mantidas em meio E8.
[00104] Anteriormente, mostramos que OP9 é superior às outras linhagens de células estromais, tais como, S17, e MS5 na indução de diferenciação hematopoiética9. Também foi constatado que no dia 8 os cultivos de OP9 crescida em excesso são superiores a OP9 recentemente confluente do dia 4 na indução de hematopoiético- CFCs, incluindo GEMM-CFCs multipotenciais. 9 Uma vez que a confluência das células estromais afeta a eficiência da diferenciação, isto leva a acreditar que existe uma matriz extracelular influenciando a diferenciação hematoendotelial. A fim de constatar a proteína (s) da matriz essencial para atividade sustentadora de hematopoese de OP9 realizamos caracterização molecular das linhagens de células estromais S17 e MS5 com baixo potencial de indução da hematopoese e células OP9. Além disso, comparamos a OP9 crescida em excesso (dia 8) com monocamadas de OP9 recentemente confluente (dia 4). A análise da transcriptoma revelou 21 genes diferencialmente expressos nas células OP9 crescidas em excesso do dia 8 como em relação a todas as outras células estromais (Figura 2a). Estas incluíram genes codificando Ptn (pleiotrofina), um regulador segregado de regeneração e expansão de HSC,20 Rspo3 (R-spondina 3), um importante regulador de sinalização de Wnt e desenvolvimento de angioblasto, 21 e uma das proteínas das matrizes extracelulares Postn (periostin) necessária para linfopoiese B. 22 Interessantemente, um gene que apresentou a alteração mais significante da expressão na OP9 superconfluente foi Tnc (Tenascina C) (Figura 2b). A TenC é expressa nas células mesenquimais sujeitas aos aglomerados hematopoiéticos na região da Aorta-Gônada-Mesonefros (AGM) e é necessário para hematopoese pósnatal e intraembrionária. 23-25 Também é expresso na colocação da célula-tronco da medula óssea. 25 Por causa destas propriedades únicas, testamos se a TenC poderia suportar a diferenciação hematopoiética mais eficazmente do que o ColIV.
[00105] Nossos estudos anteriores identificaram diferentes fases de desenvolvimento hematoendotelial seguintes a diferenciação de hPSC no co-cultivo com OP9 (Figura 1). 6,9-11,26 O plaqueamento das hPSCs nas células estromais OP induz a formação de linha primitiva e as células mesodérmicas que podem ser detectadas com base na expressão do receptor de apelina (APLNR) e KDR (VEGFR2) 11 e necessitam de expressão de marcadores Endoteliais (CD31, CD144(VE-caderina)), Mesenquimais/ endoteliais (CD73, CD105) e Hematopoiéticos (CD43, CD45), isto é, por EMHlin- fenótipo. As primeiras células mesodérmicas KDR+ apareceram no co-cultivo de OP9 no dia 2 de diferenciação expressa de APLNR e PDGFRalfa (EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ daqui em diante referida como células A+P+). Estas células apresentam potencial mesenquimoangioblasto (MB), isto é, capacidade de formar colônias com ambos célula-tronco mesenquimal (MSC) e potencial vascular. No dia 3 de diferenciação das células A+P+ adquiriram jato de (BL)-CFC ou potencial hemangioblasto (HB) 11. Ambos potenciais de MB e HB podem ser detectados empregando ensaio de formação de colônia em meio clonogênico livre de soro suplementado com FGF2 11. Com maturação avançada, as células mesodérmicas perdem a atividade BL-CFC e super-regulando a expressão de KDR e sub-regular PDGFRalfa, isto é, adquirir o fenótipo progenitor hematovascular KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /- (HVMP), que enriquece nas células com potencial de formar os aglomerados hematoendoteliais na OP9. 6 A fase endotelial fase do desenvolvimento é definida pela expressão de VE-caderina do marcador endoteliais específicos (CD144). A primeira VE-Caderina+ (CD144+) das células surgiu a partir das células mesodérmicas KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /- no dia 4 de diferenciação. O surgimento de VE-caderina+ (CD144+) das células representa uma população heterogênea que inclui progenitores endoteliais não hemogênicos CD43-CD73+ (CD144+CD43-CD73+) (não HEPs) e progenitores endoteliais hemogênicos CD43-CD73- (CD144+CD43+CD73-) (HEPs). 6 Os HEPs necessitam de potencial de CFC hematopoiético, mas de adquirir-los após o cultivo com as células estromais. A fase hematopoiética de desenvolvimento é definida pela expressão de CD43 do marcador específico hematopoiético. 6,10 As primeiras células CD43+ surgiram dentro de VE-caderina+ (CD144+) das células no dia 4-5 de diferenciação. Estas células expressam baixo nível de CD43 e coexpressar CD235a, mas necessitam de expressão de CD41a, isto é, tinham fenótipos CD144+CD43/ 235a+41a- . Porque estas células têm capacidade de formar colônias hematopoiéticas na presença de FGF2 e citocinas hematopoiéticas igualmente para cultivar as células endoteliais na fibronectina, as indicamos como progenitores hematopoiéticos angiogênicos (AHPs). A primeira célula CD41a surgiu dentro das células positivas CD235a. as células são altamente enriquecidas e progenitores erito- megacariocíticos e necessitam de potencial endothelial. Os progenitores com amplo potencial de mielolinfóide e fenótipo lin- CD34+CD43+CD45+ /- podem ser detectados nos cultivos de hPSC imediatamente após o surgimento das células CD235a+CD41a+. A aquisição da expressão de CD45 pelas células lin- está associada com prática de mielóide progressivo. 10
[00106] Para reproduzir o programa hematoendotelial observado no co-cultivo de OP9, decidimos selecionar as combinações ideais de morfogênios para indução da mesoderma e especificação hematoendotelial e definir os fatores específicos de crescimento necessários para progressão de forma gradativa de diferenciação para HE e células do sangue nos cultivos de hPSC (Figura 1) diferenciado nas condições quimicamente definidas no ColIV e na TenC. Durante o desenvolvimento embrionário, sinalização de BMP4, Wnt, e TGFβ/ Nodal/ Ativina A foi constatada ser essencial para iniciar a formação de linha primitiva e subsequente desenvolvimento de mesoderma. 27,28 Foi mostrado que a ativação destas séries de reações de sinalização é essencial para induzir à expressão de brachyury e KDR (Flk-1, VEGFR2), e iniciar a prática mesodérmica prática de PSCs humana e de camundongo. 18,19,29-32 Temos constatado que elevadas concentrações de BMP4 (50 ng/ml) combinadas com as concentrações de Ativina A (15 ng/ml) e um suplemento de LiCl (2 mM) da expressão consistentemente induzida dos marcadores de superfície mesodérmicos APLNR, KDR, e PDGFRalfa após 2 dias de cultivo da suspensão de célula única das hESCs no ColIV nas condições quimicamente definidas como descrevemos acima. De qualquer modo, estas condições mal suportaram a sobrevivência da célula e necessitaram a adição de FGF2 e uma das condições hipóxicas (5 % de O2, 5 % de CO2) para melhorar a viabilidade celular e produção das células mesodérmicas. As células mesodérmica KDR+ do dia 2 nestas condições expressaram APLNR e PDGFRalfa, isto é tornaram as células APLNR+PDGFRalfa+ e apresentaram potencial de formação de colônia de MB semelhante às células mesodérmicas APLNR+PDGFRalfa+ obtidas a partir do dia 2 das hPSCs diferenciadas no co-cultivo de OP9 11 (Fig. 3). Após 2 dias de diferenciação, constatamos que apenas FGF2 e VEGF são necessários para mesoderma APLNR+PDGFRalfa+ para se adquirir o potencial de HB no dia 3 de diferenciação e avanço da especificação da mesoderma para as HVMPs significada pelo aumento na expressão KDR e a diminuição na expressão PDGFRalfa nas células APLNR+ (KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /- fenótipo) nas células mesodérmicas CD31- no dia 4 de diferenciação. O padrão de desenvolvimento foi semelhante nas células cultivas no ColIV e na TenC, de qualquer modo, um mais tarde produziu as células APLNR+PDGFRalfa significantemente mais elevada +, colônias de MB e HB (Figura 3a, 3c).
[00107] A capacidade de perda das hESCs diferenciadas do dia 4 para formar colônias HB (Figura 3c), de qualquer modo, estas células foram capazes de formar os aglomerados hematoendoteliais quando classificados e semeados na OP9 em αMEM suplementado com 10 % de FBS, SCF, TPO, IL6, e IL3. O potencial de aglomerado hematoendotelial foi restrito a KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /-CD31- HVMPs (Figura 3d). As células KDRloCD31- apenas formaram aglomerados endoteliais com quase nenhuma atividade hemogênica atividade (Figura 3d), ao mesmo tempo que as células KDR- fracassaram para cultivar ambas as células do sangue e endoteliais (não mostradas). Isto também é consistente com a diferenciação no co-cultivo de OP9. 6 A porcentagem das células KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo /- HVMPs foi consistentemente mais elevada nos cultivos da TenC (Figura 3a).
[00108] Porque a formação de HVMPs nos co-cultivos de hPSC/ OP9 é detalhadamente seguida pelo desenvolvimento de progenitores de sangue e HE, suplementamos nossos cultivos com citocinas hematopoiéticas SCF, TPO, IL-6, e IL-3, além de VEGF e FGF2 iniciando a partir do dia 4 de diferenciação. Se bem que percebemos que o tratamento contínuo dos cultivos com FGF2 e VEGF foi suficiente para a indução de progenitores endoteliais e especificação hematopoiético, a adição das citocinas hematopoiéticas foi essencial para aumentar a produção destas células nos cultivos quimicamente definidos. No dia 5 de diferenciação nestas condições, os 3 subgrupos principais anteriormente identificados da populações de CD144+ 6 surgiram: CD144+CD43-CD73+, CD144+CD43-CD73- e CD144+CD43/ CD235a+CD41a- (Figura 4). Quando estes subgrupos foram classificados e semeados nas condições endoteliais, todos eles formaram uma monocamada de células expressando VE-caderina com capacidade de absorver AcLDL e formar os tubos vasculares na formação do tubo de ensaio, consistentes com o co-cultivo de OP9 (Figura 4d). De qualquer modo, o potencial de CFC hematopoiético foi, na maioria das vezes, restrito às células CD144+CD43/ CD235a+CD41a- (Figura 4c). Com importância, semelhante a descoberta com os subgrupos CD144+ do dia 5 gerados no co-cultivo com OP9, o potencial de CFC hematopoiético das células CD144+CD43/ CD235a+CD41a- foi detectado apenas no meio livre de soro na presença de FGF2 além das citocinas hematopoiéticas, indicando que estas células essencialmente semelhantes a AHP identificadas no co-cultivo de hPSC/ OP9. 6 Anteriormente definimos HEP conforme as células CD144+CD43-CD73- necessitam de potencial de CFC hematopoiético, mas capazes de adquiri-las após o cultivo na OP9. Para determinar ser CD144+CD43-CD73- gerada nas condições completamente definidas semelhantes às HEPs induzidas pela OP9, classificamos os subgrupos CD144+ do dia 5 e cultivados com OP9 como anteriormente descrito. 6 Nestas condições, os HEPs formaram igualmente células endoteliais e hematopoiéticas com grande número de aglomerados HE, ao mesmo tempo que, as AHPs formaram células predominantemente hematopoiéticas com poucas células endoteliais e aglomerados hematoendoteliais. As células CD144+CD43-CD73+ formaram aglomerados endoteliais apenas consistentes com fenótipo de não HEP (Figura 4d). Os cultivos diferenciados na TenC tiveram uma grande população de células totais CD144+, desse modo aumentando a população de HEPs, não HEPs, e AHPs em relação aos cultivos diferenciados no ColIV (Figura 4a, b).
[00109] Quando numerosos flutuantes em torna das células hematopoiéticas tornaram-se visíveis nos cultivos no dia 6, as condições hipóxicas não foram necessárias para manter o desenvolvimento hematopoiético. Por esse motivo, a partir do dia 6 de diferenciação, os cultivos foram das células transferidas para um incubador normóxico (20 % de O2, 5 % de CO2). No dia 8 de diferenciação, os cultivos apresentaram desenvolvimento de grande número de células hematopoiéticas CD43+ compostas de células CD235a+CD41a+ enriquecidas nos progenitores eritro-megacariocítico e células lin-CD43+CD45-/ + que expressaram CD34 (Figura 5) e necessitam de outros marcadores de linhagem (não mostrados). Consistentes com as células diferenciadas na OP9, o potencial de formação da colônia hematopoiética foi limitado às subpopulações CD43+ (Figura 5c). Os progenitores hematopoiéticos CD43+ expandiram significantemente mais na TenC em relação a ColIV (Figura 5b). Além disso, o potencial de GEMM-CFC dos cultivos na TenC foi significantemente maior do que nos cultivos no ColIV (Figura 5d).
[00110] Se bem que o protocolo de diferenciação foi inicialmente desenvolvido empregando hESCs H1, constatamos que as condições quimicamente definidas descritas aqui também suportam a formação de HE e sangue a partir de outras hESCs (H9) e hiPSCs geradas a partir de fibroblastos ou células mononucleares da medula óssea (Figura 9). Anteriormente, constatamos que as hiPSC obtidas através de reprogramação de células mononucleares do sangue da medula (CB hiPSCs) se diferenciam menos eficazmente nas células do sangue nos alimentadores OP9 em relação as hiPSCs derivadas do fibroblasto. 33 Estas descobertas foram reproduzidas quando diferenciamos CB e FB iPSCs no ColIV. De qualquer modo, a diferenciação na TenC restaurou o potencial de diferenciação hematopoiética da CB hiPSCs ao nível visto com as hESCs e FB hiPSCs (Figura 9), desse modo, confirmamos que TenC é superior sobre o ColIV na promoção de diferenciação hematopoiética a partir das hPSCs.
[00111] Para constatar ser nosso sistema de cultivo suporta o estabelecimento de programa hematopoiético definitivo a partir das hPSCs, analisamos o potencial da célula T das células do sangue gerado em nosso sistema como indicador de hematopoese definitiva. 7 Quando coletados as células flutuantes CD43+ dos cultivos diferenciados do dia 9, e as ressemeamos nas células OP9 expressando DLL-4 em α-MEM com 20 % de FBS, Flt3L, IL-7, e SCF, os progenitores linfóide CD7+CD5+ começaram a surgir perto da semana 2 do co-cultivo secundário. Perto da semana 3, as células T duplo positivas CD4+CD8+ surgiram (Figura 6a).
[00112] Interessantemente, as células CD43+ geradas em ambas as matrizes de ColIV e TenC tiveram uma capacidade de gerar os progenitores de linfóide CD5+CD7+. De qualquer modo, a progressão para as células T com linfóide CD4+CD8+ foi observada apenas a partir das células CD43+ geradas na TenC, mas não em ColIV. Para confirmar o desenvolvimento da célula T, analisamos o DNA genômico destes cultivos para a presença de rearranjos TCR. Esta análise demostrou a presença de múltiplos produtos da PCR dos rearranjos aleatórios V-J e D-J no local y e múltiplos rearranjos V-J no local Y indicativo de repertório de linhagem T policlonal (Figura 6b e 6c). Em geral, estas descobertas significam que uma Tenascina C da matriz extracelular é essencial para suportar a hematopoese definitiva em condições completamente quimicamente definidas.
[00113] Estudos recentes mostraram que a adição de os inibidores TGF-β após a especificação da mesoderma, mas antes do desenvolvimento endotelial aumenta a diferenciação hematopoiética definitiva. Constatamos que quando 10 μM de SB-431542, um inibidor de TGFβ potente, mas não específico, é adicionado do dia 2 ao dia 4, significantemente diminui o desenvolvimento das células mesodermas positivas PDGFRalfa no dia 3, e aumenta a diferenciação de CD31+ no dia 4. Após o dia 4, SB-431542 não é por mais tempo adicionado, mas o efeito do tratamento do dia 2 continua a aumentar a população de CD43+ no dia 9 (Figura 7).
[00114] Durante a última década significante progresso tem sido feito na diferenciação hematopoiética das hPSCs. Múltiplos protocolos para diferenciação hematopoiética foram desenvolvidos e se tornou possível rotineiramente produzir as células do sangue para a experimentação. De qualquer modo, a generação das células do sangue com potencial de reconstituição a longo prazo, HSCs, as hPSCs permanecem em significante desafio. No embrião, as células hematopoiéticas e as HSCs surgem a partir do subgrupo específico de endotélio (HE) 1-5, deste modo a capacidade de interrogar as séries de reações de sinalização levando à especificação de HE e transição nas células do sangue no ambiente completamente quimicamente definido é essencial para a identificação dos fatores necessários para especificação de HSC e eventualmente desenvolvimento das condições para geração de HSC de novo. Se bem que os protocolos originais para diferenciação hematopoiética têm empregado os istemas livres de alimentador e vários soros, xenogênicos, alimentadores e/ou soro para diferenciação hematopoiética foram descritos recentemente. 18,34,35 De qualquer modo, estes protocolos ainda necessitam dos componentes do soro (albumina), e permanecem obscurom se estes protocolos reproduzem as ondas distintas de hematopoese, incluindo a geração de HE com potencial definitivo de linfomielóide, observada nos sistemas originais de diferenciação. Mais recentemente Kennedy e outros,7 têm desenvolvidos condições livres de estroma e alimentador para a diferenciação hematopoiética com base em EB- da hPSCs e mostraram que estas condições reproduziram ondas primitivas e definitivas de hematopoese e geraram HE com potencial de linfóide T. De qualquer modo, este protocolo usa as hPSCs crescentes em MEFs para diferenciação hematopoiética com base em EB no meio proprietário com teor de proteína humana ou química não descrito. Desenvolvemos aqui para o primeiro protocolo de tempo que permite produção eficiente das células do sangue nas condições completamente quimicamente definidas livres de proteínas do soro e xenogênicas a partir de uma suspensão de célula punica das hPSCs mantidas em meio E8 quimicamente definido. 12 Este protocolo elimina a variabilidade associada com as albuminas de fonte animal ou humana, matriz xenogênica, tamanhos dos aglomerados e diferenciação assíncrona observados no sistema EB e reproduz ondas típicas de hematopoese, incluindo a formação de HE e progenitores hematopoiéticos definitivos, observada nas hPSCs diferenciadas na OP9. Com importância, com base na caracterização molecular de OP9 e linhagens de células estromais com diferente atividade de indução da hematopoese, constatamos que TenC da proteína da matriz singularmente expressa em P9 com forte potencial de hemato- indução, vigorosamente promove desenvolvimento de linfóide T e hematoendotelial das hPSCs. A TenC é glicoproteína hexamérica ligada ao dissulfeto que é principalmente expressa durante o desenvolvimento embrionário. Se bem que a TenC na maioria das vezes desaparece no organismo do adulto, sua expressão super- regulada durante cura da ferida, neovascularização e neoplasia. 36 Interessantemente, a TenC é encontrada na medula óssea de adulto quando expressada predominantemente na região endosteal 37, 38 e super-regulanda a mieloablação que segue 25. A TenC suporta a proliferação das células hematopoiéticas da medula óssea 39 e eritropoese 40. Os camundongos com deficiência em TenC tiveram menor potencial 24 de CFC da medula óssea, fracassou para reconstituir a hematopoese após a ablação da medula óssea e apresentou capacidade reduzida de suportar o enxerto de HSCs tipo selvagem 25. O elevado nível da expressão da TenC também foi detectado na região aorta-gônada-mesonefros (AGM) humana e do frango 23,41, o local em que a primeira HSC aparecer, e locais hematopoiéticas no fígado do feto humano 42. Porque a expressão TenC é altamente enriquecida no mesênquima subaórtica direita por baixo dos aglomerados hematopoiéticos, foi sugerido que a TenC desempenhe o papel central no desenvolvimento da HSC durante a embriogênese 23. A TenC também é fornecida envolvida na regulação de angiogênese e progenitores endoteliais cardíacos 43. Nossos estudos demonstraram as propriedades superiores da TenC na promoção de hematopoese a partir das hPSCs. O efeito positivo da TenC foi óbvio em todas as fases de diferenciação e incluiu o realce da mesoderma hemogênica, produção de progenitores hematopoiéticos HE e CD43+. Com importância, a TenC foi capaz de suportar o desenvolvimento das células hematopoiéticas definitivas com potencial de linfóide T, ao mesmo tempo que não fomos capazes de se obter tais células nos cultivos no ColIV. A molécula de TenC é composta de uma região oligomerização amino-terminal seguida por repetições heptavalentes, globo de fibrinogênio e repetições de fibronectina tipo III e tipo EGF. 36 A função destes domínios é mal entendida. É acreditado que o efeito e a interação da TenC com as células requer a ação integrada dos múltiplos domínios 44, se bem que vários domínios mitogênicos únicos capazes de induzir uma proliferação de células hematopoiéticas foram identificados dentro desta molécula 39. Vários mecanismos de sinalização envolvidos na interação da célula com a TenC foram identificados, incluindo a supressão de estimulação e sinalização mediada por Rho e cinase de adesão focal da fibronectina ativada de sinalização de Wnt (revista em45). Outros estudos destinados a identificar o mecanismo da ação de TenC nas hPSCs e seus derivados hematopoiéticos seriam de valor para compreender o papel desta proteína da matriz no desenvolvimento hematopoiético.
[00115] Em resumo, as descobertas fornecidas aqui identificaram as proteínas das matrizes da TenC e condições completamente quimicamente definidas livres de soro/componentes do soro e proteínas de animais capazes de suportar a produção escalável de HE e células do sangue definitivas das hPSCs. Estes sistemas de diferenciação permite a interrogação precisa das moléculas de sinalização na diferenciação hematopoiética e fornece a plataforma para produção de classificação de cGMP das células do sangue para aplicação clínica. Referências 1. Boisset, J. C. e outros. In vivo imaging of haematopoietic cells emerging from the mouse aortic endothelium. Nature 464, 116120, doi:nature08764 [pii] 10.1038/nature08764 (2010). 2. Kissa, K. & Herbomel, P. Blood stem cells emerge from aortic endothelium by a novel type of cell transition. Nature 464, 112115, doi:nature08761 [pii] 10.1038/nature08761 (2010). 3. Bertrand, J. Y. e outros. 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Claims (17)
1. Meio de cultivo da célula livre de xenógeno, livre de albumina adequado para diferenciação hematoendotelial das células- tronco pluripotentes humanas, caracterizado pelo fato de que o meio de cultura é adequado para produção de células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+ com potencial mesenquimoangioblastos; o meio de cultura compreendendo um meio de base, sal de Mg2+ de 2-fosfato de ácido L-ascórbico, monotioglicerol, selenita de sódio, álcool de polivinila, dipeptídeo L- glutamina estável, aminoácidos não essenciais (NEAA), concentrado de lipídeo quimicamente definido, Holo-Transferrina, insulina, BMP4, Ativina A, FGF2 e LiCl, em que o meio compreende de 50 a 250 ng/ml de BMP4; de 10 a 15 ng/ml de Ativina A; de 10 a 50 ng/ml de FGF2; e de 1 a 2 mM de LiCl.
2. Meio, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda (a) citocinas hematopoiéticas ou (b) de 50 a 100ng/ml SCF, de 50 a 100 ng/ml TPO, de 50 a 100 ng/ml IL-6, e de 5 a 15 ng/ml IL-3.
3. Meio, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende 64mg/L de sal de Mg2+ de 2-fosfato de ácido L-ascórbico, 40 μl/L de monotioglicerol, 8,4 μg/L selenita de sódio adicional, 10 mg/L de álcool polivinílico, 1x dipeptídeo L-glutamina estável, 1x aminoácidos não essenciais (NEAA), 0,1x concentrado de lipídeo quimicamente definido, 10,6 mg/L Holo-Transferrina e 20 mg/L insulina.
4. Forma concentrada, caracterizada pelo fato de que é dos meios, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 3.
5. Sistema de cultivo de célula livre de xenógeno, livre de albumina para diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas nas células progenitoras hematopoiéticas, mesodermas, e endoteliais, caracterizado pelo fato de que compreende; células-tronco pluripotentes humanas semeada como uma única suspensão de célula em um substrato compreendendo uma camada de Tenascina C em uma concentração de pelo menos de 0,25 μg/cm2 a 1 μg/cm2; e um meio de cultivo livre de xenógeno, livre de albumina, como definido na reivindicação 1.
6. Método de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) semear as células como uma única suspensão de célula em um substrato tratado com Tenascina C; e (b) cultivar as células semeadas no meio livre de xenógeno, livre de albumina, como definido na reivindicação 1, sob condições hipóxicas durante um período de dois dias para se obter 30% de células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial mesenquimoangioblasto.
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que compreende ainda as etapas de cultivo das células na etapa mesoderma primitivo EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ no meio de cultivo livre de xenógeno, livre de albumina, como definido na reivindicação 3, sob condições hipóxicas, durante 1 a 2 dias para se obter mesoderma primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e precursores mesodermais hematovasculares EMHlinKDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/- com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9.
8. Método para a produção de mesenquimoangioblastos, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) semear as células-tronco pluripotentes humanas em um substrato tratado com uma quantidade eficaz de colágeno; e (b) expor as células-tronco a uma mistura livre de xenógeno, livre de albumina compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl sob condições hipóxicas durante um período de dois dias para formar uma população de células mesodermas primitivas EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto, em que a concentração no meio celular de: BMP4 é de 50 ng/mL a 250 mg/mL; Ativina A é de 10 ng/mL a 15 ng/mL; FGF2 é de 10 ng/mL a 50 ng/mL; e LiCl é de 1 mM a 2mM.
9. Método, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o colágeno compreende Colágeno IV.
10. Método para a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar as células-tronco pluripotentes humanas sob condições hipóxicas em um meio de cultivo da célula livre de xenógeno, livre de albumina compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl durante um período de dois dias para formar uma população de células de células mesodermas primitivas EMHlin- KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto sem a formação de corpos embrióides ou co-cultivo com linhagens de célula estromal, em que a concentração no meio celular de: BMP4 é de 50 ng/mL a 250 mg/mL; Activina A é de 10 ng/mL a 15 ng/mL; FGF2 é de 10 ng/mL a 50 ng/mL; e LiCl é de 1 mM a 2mM.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as células-tronco pluripotentes humanas são cultivadas na Tenascina C.
12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende ainda: - a etapa de (b) de cultivar, sob condições hipóxicas, a população de células obtida na etapa (a) em um meio de cultivo da célula compreendendo FGF2 e VEGF durante um período de 1 a 2 dias para se obter uma população de células compreendendo mesoderma primitiva EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e células mesodermas hematovasculares (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalfalo/-) enriquecidas nas células com um potencial para formar os aglomerados hematoendoteliais quando cultivados em células OP9; ou - a etapa de cultivo (b) definida acima em que a concentração no meio de cultivo da célula, de VEGF é de 20 ng/ml a 50 ng/ml
13. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de compreender ainda - etapa (b) de cultivar, sob condições hipóxicas, a população de células obtida na etapa (a) em um meio de cultura de células compreendendo FGF2 e VEGF por um período de 1-2 dias para obter uma população de células compreendendo mesoderma primitiva EMHlin- KDR + APLNR + PDGFRalpha + com potencial de hemangioblasto (HB-CFC) e células mesoderme hematovasculares (EMHlin-KDRhiAPLNR+PDGFRalphallo/-) enriquecido em células com potencial para formar aglomerados hematoendoteliais quando cultivadas em células OP9 e na etapa (c) cultivar as células mesoderma hematovasculares da etapa (b), em condições hipóxicas, em um meio de cultura de células, compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO e IL3 por um dia para obter uma população de células compreendendo progenitores endoteliais não hemogênicos CD144+CD73+CD235a/CD43- (não-HEP), progenitores endoteliais hemogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43- (HEPs), progenitores hematopoiéticos angiogênicos CD144+CD73-CD235a/CD43+41a- (AHP), e células progenitoras hematopoiéticas CD43+CD41a+; - etapa (b) definida acima e etapa (c) definida acima em que a concentração, no meio de cultura de células, de: VEGF é de 20 ng/ml a 50 ng/ml; SCF é de 50 ng/ml a 100 ng/ml; TPO é de 50 ng/ml a 100 ng/ml; IL-6 é de 50 ng/ml a 100 ng/ml, e IL-3 é de 5 ng/ml a 15 ng/ml; - etapa (b) definida acima, etapa (c) definida acima e etapa (d) cultivar, sob normoxia, as células progenitoras HEPs e hematopoiéticas em um meio de cultura compreendendo FGF2, VEGF, IL6, SCF, TPO, IL3 por três dias para obter uma população expandida de progenitores hematopoiéticos CD43+ compreendendo progenitores eritromegacariocíticos CD43+CD235a/CD41a+ e progenitores hematopoiéticos lin-CD34+CD43+CD45+/- multipotentes; ou - etapas (b) a (d) definidas acima e compreendendo ainda o co-cultivo da população expandida de progenitores hematopoiéticos CD34+CD43+ por um período de três semanas nas células OP9 que superexpressam o DLL4 para obter uma população de células compreendendo células T duplas positivas para CD4+CD8+, em que as células-tronco pluripotentes humanas da etapa (a) são cultivadas em um substrato de Tenascin C.
14. Método de diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, caracterizado pelo fato de que compreende cultivar células- tronco pluripotentes humanas sob condições hipóxicas em um meio de cultivo da célula livre de xenógeno, livre de albumina compreendendo FGF2, BMP4, Ativina A, e LiCl durante um período de dois dias para formar uma população de células de células mesodermas primitivas EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalfa+ com potencial de mesenquimoangioblasto sem a formação de corpos embrióides ou co- cultivo com linhagens de célula estromal, em que a concentração do meio de cultura celular de: BMP4 é de 50 ng/mL a 250 mg/mL; Ativina A é de 10ng/mL a 15 ng/mL; FGF2 é de 10 ng/mL a 50 ng/mL; e LiCl é de 1 mM a 2mM.
15. Sistema definido de cultivo da célula para diferenciação hematoendotelial das células-tronco pluripotentes humanas, caracterizado pelo fato de que compreende um meio de cultivo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3, e um substrato de Tenascina C para crescimento aderente das células-tronco pluripotentes humanas ou sua progênie diferenciada juntamente com a linhagem hematoendotelial.
16. Sistema definido de cultivo da célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que o meio de cultivo é mantido sob condições hipóxicas.
17. Sistema definido de cultivo da célula, de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que compreende ainda crescimento de células-tronco pluripotentes humanas no substrato de Tenascina C.
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