JP2008541762A - 胚性幹細胞から樹状細胞を生成する方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、ヒト胚性幹(ES)細胞からの樹状細胞の培養に関する。ヒトES細胞は、先ず、ストローマ細胞との同時培養により造血細胞に培養される。ここで造血系統に分化された細胞は、次にGM−CSFと共に培養されて、骨髄球系前駆細胞の培養を作製する。サイトカインGM−CSF及びIL−4を伴う骨髄球系前駆細胞の培養により、機能性樹状細胞を生じさせる。樹状細胞は、細胞表面マーカーのそれらの組合せにより示されるような独自の表現型を有する。
【選択図】図1A
【選択図】図1A
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許仮出願第60/686,145号(2005年6月1日提出)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)の利益を主張する。
本出願は、米国特許仮出願第60/686,145号(2005年6月1日提出)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)の利益を主張する。
(連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載)
未確定
未確定
(発明の背景)
胚性幹細胞は、細胞培養中での増殖並びに多能特性を示す種々の系統制限細胞集団への分化をともに可能にする多能性細胞である(Odorico et al.,(2001)Stem Cells 19:193-204)。したがってヒト胚性幹(ES)細胞は、種々の系統限定経路への拘束及び分化を可能にして、独自の機能を実施する非常に特異的な細胞型を生じる。
胚性幹細胞は、細胞培養中での増殖並びに多能特性を示す種々の系統制限細胞集団への分化をともに可能にする多能性細胞である(Odorico et al.,(2001)Stem Cells 19:193-204)。したがってヒト胚性幹(ES)細胞は、種々の系統限定経路への拘束及び分化を可能にして、独自の機能を実施する非常に特異的な細胞型を生じる。
一般にES細胞は高度に均質であり、自己複製のための能力を示し、そして身体中の任意の機能性細胞に分化する能力を有する。この自己複製特性は、適切な条件下で、細胞培養中での非限定性拡張に関する潜在性を伴う長期増殖能力をもたらし得る。さらにヒトES細胞が望ましくない様式で分化させられる場合、複数の異なる組織型に対するマーカーを発現する細胞の異質集団が得られる、と理解される(国際公開第01/51616号;Shamblott et al.,(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98:113)。これらの特徴は、これらの細胞を、治療的有用性を有する細胞の産生のための独自の均質出発集団にする。
ヒトES細胞から種々の子孫細胞型を培養するための方法を開発するために、当該技術分野の研究者により努力がなされてきた。例えば米国特許第6,280,718号は、ヒトES細胞をストローマ細胞と共に培養することによるヒトES細胞を造血細胞に培養する方法を記載する。ヒトES細胞から子孫細胞型を作製するためのいくつかの方法は、培養中のES細胞により形成され得る三次元構造である、また、種々の分化子孫系統へのES細胞の多様な分化を促す胚様体の作製を包含する。子孫系統を作製するための他の方法は、特定方向での分化を助長する因子にES細胞を曝露するために特定の培地、作用物質又は細胞型と共にヒトES細胞を培養することによっている。これらの方法はすべて、共通の目的を有しており、これは、科学的調査及び実験のための特定の細胞型に関する、また、いくつかの細胞型に関しては治療目的のためにヒト身体中への最終的移植のための供給源を提供することである。
樹状細胞は、哺乳類免疫系における重要な機能を果たす免疫細胞である。樹状細胞(ここではDCと呼ぶ場合もある)は、環境と接触する身体の組織、例えば皮膚、並びに鼻、肺、胃及び腸の内張りにおいて低頻度で存在する強力な抗原提示細胞である。樹状細胞は、抗原を取り込み、そして主要T細胞応答を誘導して、病原体に対する全身性免疫系応答を開始する。樹状細胞は、樹状細胞形態に特徴的である樹状突起と呼ばれるそれらの長い突起又は腕のために、そのように命名されている。
樹状細胞は、造血系統からの骨髄中で連続的に生成され、そして血中で成熟する。一個体の樹状細胞は、不均一な表現型及び機能を有する。樹状細胞はいくつかの方法で発達し、そして誘導のそれらの系統に応じて、樹状細胞間に差が存在し得る。2つの独立した経路に沿ってCD34+造血性始原細胞から発達する樹状細胞は、ランゲルハンス島及び間質性樹状細胞になる。単球由来の又は形質細胞様T細胞由来の樹状細胞は、それぞれ単球由来DC又は形質細胞様DCと呼ばれる。それらの細胞起源表現型に基づいて、樹状細胞は普通は広範に2つの主な区分、即ち骨髄球系又はリンパ球系に分類される。骨髄球系DCは共通の骨髄球系前駆体から発達し、一方、リンパ球系DCは共通のリンパ球系前駆体から発達すると考えられるが、しかし共通骨髄球系DC前駆体はすべての樹状細胞系統を生じる、ということも、目下提案されている。
ヒト未成熟樹状細胞の利用可能性は、抗原プロセシング及び提示の研究のために、並びに免疫及び寛容性の誘導のメカニズムを理解するために有用である。ヒト樹状細胞サブセットの機能的分析は、CD34+造血幹細胞及び単球からの樹状細胞の分化のためのin vitro系の開発により有意に促進された。しかしながらこれら既存プロトコルを用いて、多数のヒト樹状細胞始原細胞を獲得することは労力を要するプロセスであり、ドナーに対する潜在的危険と関連する。樹状細胞生物学の他の側面、例えば樹状細胞個体発生は、早期発生中に組織を獲得するのが困難であるため、ヒトにおいては研究されていない。ヒトES細胞の出現は、これらの制限を克服する機会を提示する。
機能性樹状細胞は、胚様体を用いて、また、マウスマクロファージコロニー刺激因子欠乏性骨髄ストローマ細胞株OP9との同時培養により、マウスES細胞から生成されてきた。OP9細胞は、ヒトES細胞から造血細胞を誘導するために用いられ得る、ということを本発明者らは以前に実証した。種々の系統の子孫を生じるそれらの造血細胞の十分な潜在能力は、以前に調査されなかった。
(発明の簡単な要約)
一実施態様において、本発明は、ヒト胚性幹細胞を樹状細胞に培養する方法であって、ヒト胚性幹細胞をマクロファージコロニー刺激因子を発現しないストローマ細胞と同時培養する工程であって、幹細胞が多能性リンパ−造血性始原細胞に分化するように誘導され、そして培養がサイトカインの存在下でない、同時培養する工程、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−SCF)と共に始原細胞を培養する工程であって、それにより、骨髄球系前駆細胞の拡大を引き起こす、培養する工程、及び、未成熟樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程を包含する方法である。好ましくは、樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程は、IL−4、TFN−α、IFN−α及びGM−CSFから成る群から選択される少なくとも1つのサイトカインと共に骨髄球系前駆細胞を培養することを包含する。好ましくは、ストローマ細胞はOP9細胞であり、そして工程(b)の培養は非接着性条件下である。
一実施態様において、本発明は、ヒト胚性幹細胞を樹状細胞に培養する方法であって、ヒト胚性幹細胞をマクロファージコロニー刺激因子を発現しないストローマ細胞と同時培養する工程であって、幹細胞が多能性リンパ−造血性始原細胞に分化するように誘導され、そして培養がサイトカインの存在下でない、同時培養する工程、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−SCF)と共に始原細胞を培養する工程であって、それにより、骨髄球系前駆細胞の拡大を引き起こす、培養する工程、及び、未成熟樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程を包含する方法である。好ましくは、樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程は、IL−4、TFN−α、IFN−α及びGM−CSFから成る群から選択される少なくとも1つのサイトカインと共に骨髄球系前駆細胞を培養することを包含する。好ましくは、ストローマ細胞はOP9細胞であり、そして工程(b)の培養は非接着性条件下である。
別の実施態様では、本発明はGM−SCF及びTNFα又はGM−SCF及びINFαと共に骨髄球系前駆細胞を培養し、且つ調節性補助細胞を回収する工程を包含し、調節性補助細胞がマーカーCD1alow、CD9、CD80low及びCD86lowにより特性化される。
本発明はまた、ヒト樹状細胞の培養であって、当該培養中の細胞の大多数がCD1a+、DC−SIGN+、CD4+、CD9low、CD11c+、CD40low、CD86+、CD80+、CD86+、HLA−ABC+、HLA−DR+の表現型を有し、そしてCD207及びCD208に関して陰性である培養である。
別の実施態様では、本発明は、当該骨髄球系前駆細胞の培養であって、細胞の大多数が骨髄球系前駆体の表現型を有し、そして当該細胞の少なくとも90%がCD45+、CD4+、CD123lowであり、HLA−DRに関して陰性であり、そしてMPO、M−CSFR、CD11b、CD11c、CD15及びCD16を発現する細胞の亜集団を含む培養である。
別の実施態様では、本発明は、細胞性ワクチンを製造する方法であって、以下の:
マーカーCD1a、CD80、CD86、DC−SIGN、HLA−DRhighによって特徴付けられたヒト胚性幹細胞を樹状細胞の一集団に分化させること、患者から腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を獲得し、且つ調製すること、及び、細胞性ワクチンが作製されるように、胚性幹細胞由来の樹状細胞を腫瘍細胞と融合することを包含する方法である。
マーカーCD1a、CD80、CD86、DC−SIGN、HLA−DRhighによって特徴付けられたヒト胚性幹細胞を樹状細胞の一集団に分化させること、患者から腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を獲得し、且つ調製すること、及び、細胞性ワクチンが作製されるように、胚性幹細胞由来の樹状細胞を腫瘍細胞と融合することを包含する方法である。
本発明の他の実施態様は、明細書、特許請求の範囲及び図面を再検討すれば、当業者に明らかになる。
(発明の詳細な説明)
樹状細胞はヒトES細胞から多数作製され得る、ということをここに本発明者らは報告する。マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)欠乏性ストローマ細胞株、例えばネズミOP9株との同時培養系は、造血細胞へのヒトES細胞の分化を促す。これらの造血細胞は樹状細胞を生成する能力を有し、その能力は造血細胞のGM−CSF培養により利用される。ヒトES細胞に由来する樹状細胞は、in vivoで自然に産生される間質性ヒト樹状細胞と形態学的、表現型的及び機能的に適合性である。
樹状細胞はヒトES細胞から多数作製され得る、ということをここに本発明者らは報告する。マクロファージコロニー刺激因子(M−CSF)欠乏性ストローマ細胞株、例えばネズミOP9株との同時培養系は、造血細胞へのヒトES細胞の分化を促す。これらの造血細胞は樹状細胞を生成する能力を有し、その能力は造血細胞のGM−CSF培養により利用される。ヒトES細胞に由来する樹状細胞は、in vivoで自然に産生される間質性ヒト樹状細胞と形態学的、表現型的及び機能的に適合性である。
Slukvin,et al.,J.Immunology,2006,176:2924-2932は、本発明を記載している本発明者らによる学術論文である。それは以下で詳細に記述されるように、参照により本明細書中で援用される。
全体的方法は、図1A及び図Bに模式的に示されており、この場合、当該プロセスは3つの全体的工程に細分化され、以下の実施例における、並びに上記のSlukvin,2006におけるその好ましい形態で実証される。「多能性リンパ造血始原細胞」、「骨髄球系樹状細胞(DC)前駆細胞」、「未成熟DC」、「成熟DC」及び「調節性DC」とは、図1Bに開示された細胞集団を本発明者らは意味する。
工程1では、ヒトES細胞は、ストローマ細胞、好ましくはM−CSF欠乏性ストローマ細胞と同時培養されて、多能性リンパ造血性始原細胞への当該細胞の分化を誘導する。好ましくは、細胞はOP9細胞である。
工程2では、その培養からの解離ES由来細胞は次に、骨髄球様細胞拡大が起こるように培養される。好ましくはこれは、好ましくは以下の実施例に記載されるように、顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)と共に細胞を培養することにより実行される。さらにまた好ましくは、この工程は、非接着性条件下で実施される。好ましい非接着性条件は、下記のようにポリ2−ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA、Sigma)で組織培養フラスコを被覆することを要する。プラスチック容器を被覆するために非接着特性を有することが既知である物質を用いて、又は市販の非接着性組織フラスコを用いて、細胞振盪のような他の手段により、細胞接着を防止することも可能である。
この拡大工程の結果は、骨髄球系前駆体が豊富な培養であり、そしてその培養は次に、工程3に用いられて、GM−CSF及びIL−4、又は樹状細胞への発達を調整するサイトカインの他の組合せ(下記)と共に無血清培地中で培養することにより、樹状細胞を作製する。
パーコール分離で実行され得る任意の分離手法は、工程2及び3の間で示され、そして樹状細胞生成を誘導する前に培養から細胞の凝集塊及び死細胞を共に除去するために用いられる。
下記の実施例では、サイトカイン付加を伴わずに、M−CSF欠乏性ストローマ細胞と共にヒトES細胞を同時培養することにより得られる骨髄球系前駆細胞の選択的拡大により、ヒトES細胞から樹状細胞は生成される。同時培養工程に起因する造血細胞は、骨髄球系前駆細胞に分化するように、次に未成熟樹状細胞に分化するように誘導されるべき応答能を有する。
DCを生成するための本発明者らのプロトコルにおいて重要な工程は、ヒトES細胞/OP9同時培養における造血性分化の効率であった。少数のCD34+CD43+Lin−多能性リンパ造血性始原細胞(3%未満)は骨髄球系前駆細胞を拡大できず、その後、樹状細胞に分化できなかった。「Lin−」は、これらの始原細胞が、特定の造血系統に拘束されるより成熟した細胞上に存在するCD11b、CD14、CD2、CD3、CD7、CD19、CD38、CD45RA及びHLA−DRマーカーを発現しない、ということを示す。
樹状細胞に分化し得る骨髄球系前駆細胞の拡大を媒介するために顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)が用いられる次の工程のために、単離リンパ造血性前駆細胞というよりむしろ、同時培養からの全細胞懸濁液を本発明者らは用いた。本発明者らの見方では骨髄球系前駆細胞にこの拡大を受けさせる最も有効な因子は、本発明者らの見方では骨髄球系樹状細胞前駆体の拡大にほとんど影響を及ぼさない他の因子、例えばSCF及びFLT3−Lと対比して、GM−CSFであった。
ヒトES細胞由来の、そしてGM−CSFで拡大される骨髄球系前駆体は、骨髄球様コロニー形成細胞(CFC)を、並びに樹状細胞表現型を有するより成熟した細胞の小集団を含有した。しかしながら細胞の大多数は骨髄単球性系統の芽細胞と形態学的に類似し、そしてCD4、CD45、CD123low及び低レベルのCD14を発現した。これらの細胞は、HLA−DR陰性であった。これらの細胞は、MPO、M−CSFR、CD11b、CD11c、CD15及びCD16を発現する細胞の亜集団を包含することが判明した。
本発明者らの方法により得られるヒトES細胞由来の未成熟樹状細胞は、CD1a+、DC−SIGN+、CD4+、CD9low、CD11c+、CD40low、CD80+、CD86+、HLA−ABC+、HLA−DR+、CD207−及びCD208−の表現型(臍帯血又は骨髄CD34+造血性幹細胞から分化された間質性樹状細胞と比較可能な表現型)を有した。好ましくは、これらの未成熟樹状細胞は、この時点での培養細胞の少なくとも70%を構成する。しかしながらヒトES由来の樹状細胞の異なる表現型特徴は、CD14の同時発現であった。CD14発現のレベルは、IL−4を用いて分化された細胞中で最低であったが、しかしTNF−αを用いて分化された細胞に関しては実質的により高かった。GM−CSF及びTNF−αの存在下でヒトCD34+造血性幹細胞から発達する樹状細胞は、それぞれCD1a+CD14−及びCD1a−CD14+である表現型を有する中間体を介して、ランゲルハンス細胞並びに皮膚樹上細胞及び間質性樹状細胞に分化する。今までのところ、本発明者らの培養では、CD1a発現は常に、CD14の少なくとも低レベルの発現に関連しており、そして本発明者らは、細胞培養中に異なるCD1a+CD14−又はCD1a−CD14+集団を観察していない。したがって、樹状細胞へのヒトES細胞の分化のために用いられる培養条件は、in vivoでのCD45+造血性幹細胞からの分化の対応する経路の反復を必要とし得ない独特の経路を用いると思われる。
以下の実施例は、本発明の別の実施態様、少なくとも70%が成熟DCである細胞の一集団を記載する。
さらに、本発明の別の実施態様は、調節性DC細胞の一集団である。GM−CSF及びTNF−α又はGM−CSF及びIFNαと共に培養される骨髄球系DC前駆細胞は、低刺激活性を有するCD1alow、CD9−、CD80low、CD86low補助細胞に発達する。これらの細胞は、調節性DCを代表し得る。
M−CSF欠乏性ストローマ細胞(OP9細胞)と共にここで用いられる同時培養系は、ネズミES細胞と共に用いられるOP9細胞を基礎にした系と異なる。ここに記載される方法は、マウス系と違って、OP9細胞との二次同時培養を用いない。最大量の骨髄球系始原細胞が生成され、次に無支持細胞非接着条件でGM−CSFを有するそれらの始原細胞を拡大すると、同時培養からのヒトES細胞誘導体を本発明者らは収集した。この技法は、樹状細胞発達のさらなる研究のために有用である樹状細胞前駆体の異なる集団を生じた。
胚体分化中、HLA−DRを発現し、そして成人リンパ球の増殖を誘発し得る細胞が生成された、ということが近年示されている(Zhan,et al.,2004,Lancet Jul 10;364(9429):163-71)。しかしながら、この系で生成される細胞の抗原提示特性及び表現型は、実証されなかった。この報告に記載されたようにして得られた細胞はマクロファージであった、という可能性がある。ヒトES細胞が抗原提示樹状細胞の形態学、表現型及び機能的特性を有する細胞に直接分化され得る、という証拠を、本発明者らの結果は初めて提供する。さらにこのプロセスは、すでに相対的に効率的である。107の最初に平板培養されたヒトES細胞から同時に4×107個という多くの樹状細胞を増殖し得た。
樹状細胞は明白な科学的利益及び適用性を有するが、それらはヒト医療における潜在的用途も有する。in vivoで運搬されるペプチドパルス樹状細胞はマウスにおける抗腫瘍免疫応答を効率的に誘導し得た、ということを、いくつかの研究は実証している。これらの試験は、ヒトにおける癌免疫療法のための樹状細胞ベースのワクチンのその後の開発を助長した。これらの技法では、末梢血から単離される未成熟樹状細胞前駆体又は末梢血単核球及びCD34+造血系始原細胞から生成される樹状細胞は、樹状細胞ベースのワクチンの臨床試験で用いられる。しかしながらこれらの技法は労力を要し、各ワクチンのための新規の樹状細胞の反復生成を必要とし、そして標準化するのが難しい。胚性幹細胞は、制限なしに拡大され得るし、そして多数の型の細胞に分化し、したがって樹状細胞ワクチンのための細胞の普遍的且つ秤量可能な供給源であり得る。潜在的には、主要HLAハプロタイプ組合せを有する樹状細胞は、ドナーMHCハプロタイプを整合させるためにヒトES細胞から獲得され得る。臨床的設定では、ヒトES細胞由来の樹状細胞は、慣用的供給源からの樹状細胞を上回るいくつかの利点を有する。大きな絶対数の樹状細胞は同一ドナー細胞株から生成され、そして同一系統の樹状細胞が多重ワクチン接種のために用いられ得る。ヒトES細胞からの樹状細胞の誘導は、バイオリアクター技術の履行を伴う標準化のためにあまり労力を要さず、そしてより改善可能であり得る。病原体汚染の低危険性並びに無危険ドナー収集は、ヒトES細胞由来の樹状細胞の臨床的使用の別の重要な利点である。
別の実施態様では、本発明は、樹状細胞の一集団にヒト胚性幹細胞を分化させることを含む、細胞性ワクチンを製造する方法であって、樹状細胞がCD1a+、CD80+、CD86+、DC−SIGN+、HLA−DRhighであり、患者から腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を獲得し、調製すること、及び胚性幹細胞由来の樹状細胞を腫瘍細胞と融合することを特徴とする方法である。Gong,et al.,J.Immunology,2000,165:1705-1711及びParkhurst,et al.,2003,J.Immunology,170:5317-5325(これらはともに参照により本明細書中で援用される)は、細胞融合のための一般的技法を記載する。
別の実施態様では、本発明は、ヒト胚性幹細胞から分化する樹状細胞を含む癌を治療するための樹状細胞ワクチンの生成方法であって、樹状細胞が同種異系癌細胞と融合されている、方法である。腫瘍ワクチンを作製する種々の方法を、当業者は理解及び認識し得る。例えば米国特許出願公開US2002/0131962A1号及び同第US2006/0063255A1号は、いくつかの方法を開示する。
別の実施態様では、本発明は、癌を治療するための樹状細胞ワクチンを製造する方法であって、CD11b、CD11c及びCD16を発現する細胞の亜集団を含むCD45+CD4+CD123low骨髄球系前駆体にヒト胚性幹細胞を分化させること、免疫原性腫瘍タンパク質/ペプチドを発現するよう骨髄球系前駆細胞を遺伝子的に変更すること、及び遺伝子修飾骨髄球系前駆体を免疫原性樹状細胞に分化させることを包含する方法である。例えば、免疫応答の標的である腫瘍細胞で細胞をトランスフェクトすることが望まれ得る。例えば、黒色腫抗原−3(MAGE−3)、前立腺酸性ホスファターゼ(PAP)又は前立腺特異的膜抗原(PSMA)で細胞をトランスフェクトすることが望まれ得る。
別の実施態様では、本発明は、同一細胞株から得られるヒト胚性幹細胞由来組織の拒絶の治療のために用いられ得る寛容原特性を有する樹状細胞を作製する方法である。「寛容原特性」とは、細胞が宿主免疫系により移植片の拒絶を抑制することを意味する。細胞は、移植組織に対する宿主の有害免疫応答を下向き調節する。この目的のために、GM−CSF及びTNF−α又はGM−CSF及びIFNαと共に培養することにより、hES細胞由来の骨髄球系前駆体は調節性DCに分化するよう誘導される。
実験プロトコル及び結果
GM−CSFを伴うヒトES細胞由来の骨髄球系始原細胞の拡大
近年、本発明では、フィーダー細胞としてマウスM−CSF欠乏性骨髄ストローマ細胞株OP9の細胞を用いて、ヒトES細胞からの造血性分化のためのin vitro培養系(ここで記載されるプロトコルを開始するために用いられる工程)を開発した。ヒトES細胞をOP9細胞と同時培養し、コロニー形成細胞で高度に濃化され、そして赤血球、骨髄球並びにリンパ球系始原細胞を含有するCD34+細胞に分化し、そしてCD34+CD43+Lin−多能性造血性始原細胞の一集団を包含するようにした。この工程は、サイトカイン付加を必要としない。分化の9〜10日目に、OP9同時培養系中の骨髄球系コロニー形成細胞(CFC)の最大拡大を観察した。骨髄球系始原細胞の選択的拡大を誘導するために、ヒトES細胞/OP9同時培養の9又は10日目から生じる細胞を収穫し、そしてGM−CSFの存在下で非接着性条件下で細胞を培養した。培養開始時に、大型細胞の集合体が形成された。GM−CSF培養の開始後約3日目に、個々の細胞が出現し、迅速に拡大した。GM−CSFを伴う培養の9〜10日後に、且つパーコール分離による凝集塊及び死細胞の除去後に、90%がCD45陽性である細胞の一集団を得た。これらのCD45+細胞の90%より多くが、細胞内MPO(ミエロペルオキシダーゼ、骨髄性細胞のマーカー)を含有したが、しかしTdT(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、リンパ球系細胞のマーカー)を含有せず、そして骨髄球系始原細胞のマーカーCD33を発現した。さらに、これらのヒトES細胞由来の骨髄球系細胞はCD4陽性であり、そしてIL−3受容体α鎖CD123を弱く発現した。これらの細胞の50%より多くが、CD16、CD15、CD11b及びCD11cを発現した(表2)。形態学的には、GM−CSF拡大細胞は、多裂片化又は円形核、並びに骨髄骨髄性単球系前駆細胞(bone marrow myelomonocytic precursors)に類似する可視的粒子を伴わない中等度量の灰色がかった、時折空胞化した細胞質(図2B)を有した。GM−CSF拡大細胞のいくつかは骨髄球系CFC能力を保有したが、しかし赤血球系又は多系統CFC能力は検出されなかった(図2C)。さらに、中等度レベルのCD14、低レベルのCD1a並びにHLA−DR、CD80及びCD86同時刺激分子を発現する成熟の進行段階で、細胞の相対的小集団が存在した(表2)。
GM−CSFを伴うヒトES細胞由来の骨髄球系始原細胞の拡大
近年、本発明では、フィーダー細胞としてマウスM−CSF欠乏性骨髄ストローマ細胞株OP9の細胞を用いて、ヒトES細胞からの造血性分化のためのin vitro培養系(ここで記載されるプロトコルを開始するために用いられる工程)を開発した。ヒトES細胞をOP9細胞と同時培養し、コロニー形成細胞で高度に濃化され、そして赤血球、骨髄球並びにリンパ球系始原細胞を含有するCD34+細胞に分化し、そしてCD34+CD43+Lin−多能性造血性始原細胞の一集団を包含するようにした。この工程は、サイトカイン付加を必要としない。分化の9〜10日目に、OP9同時培養系中の骨髄球系コロニー形成細胞(CFC)の最大拡大を観察した。骨髄球系始原細胞の選択的拡大を誘導するために、ヒトES細胞/OP9同時培養の9又は10日目から生じる細胞を収穫し、そしてGM−CSFの存在下で非接着性条件下で細胞を培養した。培養開始時に、大型細胞の集合体が形成された。GM−CSF培養の開始後約3日目に、個々の細胞が出現し、迅速に拡大した。GM−CSFを伴う培養の9〜10日後に、且つパーコール分離による凝集塊及び死細胞の除去後に、90%がCD45陽性である細胞の一集団を得た。これらのCD45+細胞の90%より多くが、細胞内MPO(ミエロペルオキシダーゼ、骨髄性細胞のマーカー)を含有したが、しかしTdT(末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、リンパ球系細胞のマーカー)を含有せず、そして骨髄球系始原細胞のマーカーCD33を発現した。さらに、これらのヒトES細胞由来の骨髄球系細胞はCD4陽性であり、そしてIL−3受容体α鎖CD123を弱く発現した。これらの細胞の50%より多くが、CD16、CD15、CD11b及びCD11cを発現した(表2)。形態学的には、GM−CSF拡大細胞は、多裂片化又は円形核、並びに骨髄骨髄性単球系前駆細胞(bone marrow myelomonocytic precursors)に類似する可視的粒子を伴わない中等度量の灰色がかった、時折空胞化した細胞質(図2B)を有した。GM−CSF拡大細胞のいくつかは骨髄球系CFC能力を保有したが、しかし赤血球系又は多系統CFC能力は検出されなかった(図2C)。さらに、中等度レベルのCD14、低レベルのCD1a並びにHLA−DR、CD80及びCD86同時刺激分子を発現する成熟の進行段階で、細胞の相対的小集団が存在した(表2)。
末梢血CD34+細胞上の皮膚リンパ球関連抗原(CLA)発現はランゲルハンス細胞にさらに分化する始原細胞を明らかにするが、一方、CD34+CLA−細胞は間質性DC様細胞を生じる。OP9同時培養又は単離されたヒトES細胞由来CD34+細胞から得られる全体的細胞集団では、有意のCLA発現は検出されなかった。しかしながらCLA発現は、GM−CSFを用いて生成される骨髄球系始原細胞の小サブセットで見出された。
GM−SCFは、骨髄球系前駆細胞の拡大において最も重要な因子であると思われた。別個に、GM−SCF補足培養へのSCF、FLT3L又はSCF+FLT3Lの付加は、10日間の培養中の総細胞産出量及び骨髄球系CFC数にほとんど影響を及ぼさなかった(表1)。これらのデータは、GM−CSFを有するOP9系で生成される分化されたヒトES細胞の培養は主に、MPO、M−CSFR、CD11b、CD11c、CD15及びCD16を発現する細胞の亜集団を含むCD45+CD4+CD123low骨髄球系前駆細胞の独特の集団に拡大する、ということを実証する。
ヒトES細胞由来の骨髄球系前駆細胞の樹状細胞への分化
骨髄球系前駆細胞の樹状細胞への分化を誘導するために、GM−CSFを有する前駆細胞並びにIL−4、TNF−α及びIFN−αの種々の組合せの培養を培養した。典型的実験では、GM−SCF及びIL−4を伴う7〜10日の培養後、細胞のほとんどは凝集塊に見えた。さらに、明瞭な樹状突起を有する個々の遊走細胞が培養中に出現した。形態学的には、これらの細胞は大型であり、高い核細胞質比を有し、そして卵形又は腎臓形の核並びに非常に細い細胞質突起を有する非空胞化の、時として粒状の細胞質を有した(図3A及び図C)。サイズ及び粒状度のフローサイトメトリー分析に基づいて、2つの細胞集団が観察された(図3D):R1(高散乱プロファイル及び樹状細胞表現型を有する細胞);並びにR2(低散乱プロファイルを有し、樹状細胞マーカーを欠き、そして第2工程で生成される骨髄球系始原細胞と表現型的により類似する細胞)。R1依存性細胞(R1 gated cell)として同定される樹状細胞は、CD1a、DC−SIGN、CD4、CD11c、HLA−ABC及びHLA−DR、CD80及びCD86を発現した。さらにこれらの細胞は、低レベルのCD9、CD11b、CD123及びCD40を発現した。CD14発現は非常に弱かったが、しかし検出可能であり、CD14陽性細胞のほとんどがCD1aを同時発現した。しかしながらすべての細胞は、CD83発現を欠いていた。
骨髄球系前駆細胞の樹状細胞への分化を誘導するために、GM−CSFを有する前駆細胞並びにIL−4、TNF−α及びIFN−αの種々の組合せの培養を培養した。典型的実験では、GM−SCF及びIL−4を伴う7〜10日の培養後、細胞のほとんどは凝集塊に見えた。さらに、明瞭な樹状突起を有する個々の遊走細胞が培養中に出現した。形態学的には、これらの細胞は大型であり、高い核細胞質比を有し、そして卵形又は腎臓形の核並びに非常に細い細胞質突起を有する非空胞化の、時として粒状の細胞質を有した(図3A及び図C)。サイズ及び粒状度のフローサイトメトリー分析に基づいて、2つの細胞集団が観察された(図3D):R1(高散乱プロファイル及び樹状細胞表現型を有する細胞);並びにR2(低散乱プロファイルを有し、樹状細胞マーカーを欠き、そして第2工程で生成される骨髄球系始原細胞と表現型的により類似する細胞)。R1依存性細胞(R1 gated cell)として同定される樹状細胞は、CD1a、DC−SIGN、CD4、CD11c、HLA−ABC及びHLA−DR、CD80及びCD86を発現した。さらにこれらの細胞は、低レベルのCD9、CD11b、CD123及びCD40を発現した。CD14発現は非常に弱かったが、しかし検出可能であり、CD14陽性細胞のほとんどがCD1aを同時発現した。しかしながらすべての細胞は、CD83発現を欠いていた。
IL−4のほかに、骨髄球系前駆細胞の樹状細胞への分化は、他のサイトカイン、例えばTNF−α及びIFN−α又はそれらの組合せを用いることにより達成された。しかしながらTNF−αを有する培養中の細胞のほとんどは、低レベルのCD1a、高レベルのCD14を同時発現し、CD9の発現を欠いていた。さらに、TNF−αを有する培養中では、細胞は同時刺激性分子の発現を下向き調節した。予測どおり、これらの細胞培養へのIFN−αの付加は、MHCクラスI分子の発現増大を生じた。しかしながらIFN−α培養は、CD1a+細胞の数の低減を、CD14発現の低減と同様に生じた。単球−DC分化経路と同様に、ヒトES細胞由来の樹状細胞上でのDC−SIGNの発現は、主にIL−4に依存した。細胞収率、表現型及び機能特性(表1及び表2)に基づいて、GM−CSF及びIL−4の組合せはヒトES細胞からの機能性樹状細胞の生成のための最良の条件を提供すると結論づけた。
免疫細胞化学により、ヒトES細胞由来の樹状細胞はCD68に関して陽性であったが、しかしそれほど強くはなく、非常に低レベルの細胞質内CD83(しかし膜CD83ではない)を発現した。成熟樹状細胞の高度選択的マーカーであることが示されているアクチン結合タンパク質であるファシンは、検出されなかった。このことから、今までに記載されたプロセスにより生成される樹状細胞は未成熟であると結論づけた。これらの未成熟樹状細胞がさらに成熟され得るか否かを調べるために、カルシウムイオノフォアA23187で上記プロトコルから生成される細胞を処理した。この処理は、CD83、CD86及びHLA−DR発現の上向き調節を生じた。細胞質内CD68染色の強度は実質的に増大し、そしてCD68の核周囲濃縮はそのように産生された細胞中で明白であった。さらに、いくつかの細胞はファシン陽性になった。LPS、TNF−α、IL−1β、PGE2及びIL−6は、hES細胞由来DCの成熟の誘導において効率的ではなかった。合わせて考えると、これらのデータは、典型的樹状細胞形態及び表現型を有する細胞がヒトES細胞から生成され得る、ということを実証する。
樹状細胞は同種異系T細胞応答を誘導し、抗原プロセシング及び提示を可能にし得る
次に、本発明のヒトES細胞由来の樹状細胞が樹状細胞として十分に機能性であるか否かを確定するために、研究した。DQ卵白アルブミン検定により確定した場合、ヒトES細胞由来の樹状細胞は抗原を取り込み、プロセシングすることができた。GM−SCF及びIL−4で処理された培養中で得られる細胞は抗原プロセシングにおいて最も効率的であったが、一方、GM−CSF及びTNF−αを用いて分化された樹状細胞は低効率であった。
次に、本発明のヒトES細胞由来の樹状細胞が樹状細胞として十分に機能性であるか否かを確定するために、研究した。DQ卵白アルブミン検定により確定した場合、ヒトES細胞由来の樹状細胞は抗原を取り込み、プロセシングすることができた。GM−SCF及びIL−4で処理された培養中で得られる細胞は抗原プロセシングにおいて最も効率的であったが、一方、GM−CSF及びTNF−αを用いて分化された樹状細胞は低効率であった。
樹状細胞の機能性のホールマークは、ナイーブ細胞を刺激するそれらの能力である。本発明の試験によれば、ヒトES細胞由来の樹状細胞は、完全にナイーブである臍帯血T細胞を誘発することができた。付加されたGM−CSF及びIL−4を有する培養中で生成された未成熟樹状細胞は最も強力な刺激細胞であったが、一方、細胞培養へのTNF−αの付加は、ナイーブTリンパ球を刺激する細胞の能力を有意に減少した。さらに、樹状細胞は成人ドナーT細胞を刺激することができた。
MHCクラスI経路により抗原を提示する樹状細胞の能力を評価するために、HLA−A02 H1細胞株由来の樹状細胞を不活性化CMVウイルスでパルス標識して、CMVpp65NLVPMVATVペプチドに対する特異性を有するHLA−A0201制限CMV特異的T細胞クローンHLAを刺激する細胞の能力を評価した。T細胞への樹状細胞の付加は同種異系応答を誘導するが、T細胞による応答の有意の増大は、細胞がCMVパルス化H1由来の樹状細胞で刺激された場合に得られた(表3)。全体的に見て、これらのデータは、樹状細胞に特徴的な表現型、形態学及び独特の抗原提示特性を有する細胞の生成を本発明の培養系が可能にする、ということを実証する。
方法及び材料
細胞株、サイトカイン及びモノクローナル抗体(mAb)
マウス胚性繊維芽細胞での毎週の継代により、ヒトES細胞株H1(32〜51継代)及びH9(40〜44継代)を、非分化状態に保持した。マウス骨髄ストローマ細胞株OP9は、Toru Nakano博士(Research Institute for Microbial Diseases,Osaka University,Japan)から入手した。この細胞株を、20%限定ウシ胎仔血清(FBS;HyClone Laboratories,Logan,UT)を補足したα−MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)から成るOP9増殖培地中で、ゼラチン化10cm皿(BD Bioscience,Bedford,MA)上で保持した。滅菌組換え内毒素及び無発熱物質SCF、FLT3−L、TNF−α、IL−4は、Peprotech(Rocky Hill,NJ)から、GM−SCFはBerlex Laboratories(Richmond,CA)から、そしてIFN−αはSchering Corporation(Kenilworth,NJ)から入手した。ネズミ細胞との検出可能な交差反応性を有さない以下のマウス抗ヒトmAbは、フローサイトメトリー分析のために用いられている:CD1a−PE、CD4−PE、CD11b−FITC、CD16−PE、CD33−FITC、CD80−PE、CD86−PE、HLA−DR−PE、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)−FITC、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)−FITC(Caltag,Burlingame,CA);CD9−PE、CD14−FITC、CD40−PE、CD43−FITC、CD45−PE、CD209(DC−SIGN)−FITC、CLA−FITC(BD Pharmingen);CD11c−PE、CD34−PerCP−Cy5.5(Becton Dickinson Immunocytometry Systems[BDIS],San Jose,CA);CD83−FITC、CD208(DC−LAMP;Beckman Coulter,Miami,FL);CD123−FITC(Miltenyi Biotech,Aubum,CA);HLA−ABC−FITC(Sigma,St.Louis,MO);CD207(Vector Laboratories)。
細胞株、サイトカイン及びモノクローナル抗体(mAb)
マウス胚性繊維芽細胞での毎週の継代により、ヒトES細胞株H1(32〜51継代)及びH9(40〜44継代)を、非分化状態に保持した。マウス骨髄ストローマ細胞株OP9は、Toru Nakano博士(Research Institute for Microbial Diseases,Osaka University,Japan)から入手した。この細胞株を、20%限定ウシ胎仔血清(FBS;HyClone Laboratories,Logan,UT)を補足したα−MEM(Invitrogen,Carlsbad,CA)から成るOP9増殖培地中で、ゼラチン化10cm皿(BD Bioscience,Bedford,MA)上で保持した。滅菌組換え内毒素及び無発熱物質SCF、FLT3−L、TNF−α、IL−4は、Peprotech(Rocky Hill,NJ)から、GM−SCFはBerlex Laboratories(Richmond,CA)から、そしてIFN−αはSchering Corporation(Kenilworth,NJ)から入手した。ネズミ細胞との検出可能な交差反応性を有さない以下のマウス抗ヒトmAbは、フローサイトメトリー分析のために用いられている:CD1a−PE、CD4−PE、CD11b−FITC、CD16−PE、CD33−FITC、CD80−PE、CD86−PE、HLA−DR−PE、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)−FITC、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)−FITC(Caltag,Burlingame,CA);CD9−PE、CD14−FITC、CD40−PE、CD43−FITC、CD45−PE、CD209(DC−SIGN)−FITC、CLA−FITC(BD Pharmingen);CD11c−PE、CD34−PerCP−Cy5.5(Becton Dickinson Immunocytometry Systems[BDIS],San Jose,CA);CD83−FITC、CD208(DC−LAMP;Beckman Coulter,Miami,FL);CD123−FITC(Miltenyi Biotech,Aubum,CA);HLA−ABC−FITC(Sigma,St.Louis,MO);CD207(Vector Laboratories)。
OP9細胞との同時培養におけるヒトES細胞の造血系分化
造血細胞へのヒトES細胞分化の誘導を、上述されたように実行した(Vodyanik,et al.2005.Blood 105:617)(参照により本明細書中で援用される)。要するに、非分化ヒトES細胞を、1mg/mlコラゲナーゼIV(Invitrogen)で処理することにより収穫し、10%FBS(HyClone)及び100μMのメチルβ−D−チオガラクトピラノシド(MTG)(Sigma,St.Louis,MO)を補足したα−MEM中の10cm皿当たりの1.5×106/20mlのおよその密度でOP9培養に付加した。サイトカインを付加せずに4、6及び8日目に培地を半分交換しながら、ヒトES細胞/OP9同時培養を9〜10日間インキュベートした。ヒトES細胞はその後、造血細胞に分化した。
造血細胞へのヒトES細胞分化の誘導を、上述されたように実行した(Vodyanik,et al.2005.Blood 105:617)(参照により本明細書中で援用される)。要するに、非分化ヒトES細胞を、1mg/mlコラゲナーゼIV(Invitrogen)で処理することにより収穫し、10%FBS(HyClone)及び100μMのメチルβ−D−チオガラクトピラノシド(MTG)(Sigma,St.Louis,MO)を補足したα−MEM中の10cm皿当たりの1.5×106/20mlのおよその密度でOP9培養に付加した。サイトカインを付加せずに4、6及び8日目に培地を半分交換しながら、ヒトES細胞/OP9同時培養を9〜10日間インキュベートした。ヒトES細胞はその後、造血細胞に分化した。
ヒトES細胞由来の樹状細胞の生成
ヒトES細胞からの樹状細胞の生成のために用いられるプロトコルの模式図を、図1に示す。ヒトES細胞/OP9同時培養の9〜10日目に、コラゲナーゼIV(Invitrogen;α−MEM中1mg/ml)で37℃で20分間処理し、その後、0.05%トリプシン−0.5mM EDTA(Invitrogen)で37℃で15分間処理することにより、ヒトES細胞の分化誘導体を収穫した。FBSによるトリプシン不活性化後、これらの細胞を、10%FBS(HyClone)及び100ng/mlのGM−CSFを補足したα−MEM中に再懸濁し、ポリ2−ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA、Sigma)で被覆した組織培養フラスコ(BD Bioscience)中に移して、細胞接着を防止した。次に細胞を8〜10日間培養して、4日ごとに培地を半分取り替えながら、樹状細胞前駆体を拡大した。これらのヒトES細胞由来の樹状細胞前駆体の拡大に及ぼすSCF及びFLT3−Lの影響を評価するために、(1)100ng/mlのGM−SCF+20ng/mlのSCF;(2)100ng/mlのGM−SCF+50ng/mlのFLT3−L;又は(3)100ng/mlのGM−SCF+20ng/mlのSCF+50ng/mlのFLT3−Lの存在下で、細胞を培養した。その後、細胞を20%パーコール(Sigma)上で回転させて、死細胞及び細胞集合体を除去した。第3工程として、脂質混合物1(Sigma)及び100ng/mlのGM−CSFを補足したStemSpan登録商標無血清拡大培地(SFEM;Stem Cell Technologies,Vancouver,Canada)においてHEMA被覆フラスコ中で、以下のサイトカイン:(1)100ng/mlのIL−4;(2)20ng/mlのTNF−α;(3)104U/mlのIFN−α;及び(4)100ng/mlのIL−4+20ng/mlのTNF−αを付加して、パーコール単離細胞を、7〜9日間培養した。細胞は4日ごとに半量の培地を取り替えながら7〜9日間培養した。樹状細胞をさらに成熟させるために、400ng/mlのA23187カルシウムイオノフォア(Sigma)を含有するSFEM培地中で工程3で得られた細胞を48時間培養した。
ヒトES細胞からの樹状細胞の生成のために用いられるプロトコルの模式図を、図1に示す。ヒトES細胞/OP9同時培養の9〜10日目に、コラゲナーゼIV(Invitrogen;α−MEM中1mg/ml)で37℃で20分間処理し、その後、0.05%トリプシン−0.5mM EDTA(Invitrogen)で37℃で15分間処理することにより、ヒトES細胞の分化誘導体を収穫した。FBSによるトリプシン不活性化後、これらの細胞を、10%FBS(HyClone)及び100ng/mlのGM−CSFを補足したα−MEM中に再懸濁し、ポリ2−ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA、Sigma)で被覆した組織培養フラスコ(BD Bioscience)中に移して、細胞接着を防止した。次に細胞を8〜10日間培養して、4日ごとに培地を半分取り替えながら、樹状細胞前駆体を拡大した。これらのヒトES細胞由来の樹状細胞前駆体の拡大に及ぼすSCF及びFLT3−Lの影響を評価するために、(1)100ng/mlのGM−SCF+20ng/mlのSCF;(2)100ng/mlのGM−SCF+50ng/mlのFLT3−L;又は(3)100ng/mlのGM−SCF+20ng/mlのSCF+50ng/mlのFLT3−Lの存在下で、細胞を培養した。その後、細胞を20%パーコール(Sigma)上で回転させて、死細胞及び細胞集合体を除去した。第3工程として、脂質混合物1(Sigma)及び100ng/mlのGM−CSFを補足したStemSpan登録商標無血清拡大培地(SFEM;Stem Cell Technologies,Vancouver,Canada)においてHEMA被覆フラスコ中で、以下のサイトカイン:(1)100ng/mlのIL−4;(2)20ng/mlのTNF−α;(3)104U/mlのIFN−α;及び(4)100ng/mlのIL−4+20ng/mlのTNF−αを付加して、パーコール単離細胞を、7〜9日間培養した。細胞は4日ごとに半量の培地を取り替えながら7〜9日間培養した。樹状細胞をさらに成熟させるために、400ng/mlのA23187カルシウムイオノフォア(Sigma)を含有するSFEM培地中で工程3で得られた細胞を48時間培養した。
フローサイトメトリー分析
2%正常マウス血清(Sigma)を補足したPBS−FBS(0.05%アジ化ナトリウム、1mMのEDTA及び2%FBSを含有するPBS)中で細胞を調製し、mAbの組合せで標識した。FACSCaliburフローサイトメータ(BDIS)をCellQuest獲得ソフトウエア(BDIS)と共に用いて、試料を分析した。FlowJoソフトウエア(Tree Star,Inc.,Ashland,OR)により、リスト・モード・ファイルを分析した。適切なアイソタイプ整合対照mAb(BD Pharmingen)を用いた対照染色が、陽性染色及びバックグラウンド線形スケール平均蛍光強度(MFI)値に関する閾値を確立するように含まれた。陽性細胞のパーセンテージ(%)は、(特定mAbで染色された陽性細胞の%)−(対応するアイソタイプ対照によるバックグラウンド染色の%)として算定された。ΔMFIは、(特定mAbで染色された細胞のMFI)−(対応するアイソタイプ対照で染色された細胞のMFI)として算定された。線形スケールMFIは、所定の細胞に関する相対抗原密度の指標として用いられた。
2%正常マウス血清(Sigma)を補足したPBS−FBS(0.05%アジ化ナトリウム、1mMのEDTA及び2%FBSを含有するPBS)中で細胞を調製し、mAbの組合せで標識した。FACSCaliburフローサイトメータ(BDIS)をCellQuest獲得ソフトウエア(BDIS)と共に用いて、試料を分析した。FlowJoソフトウエア(Tree Star,Inc.,Ashland,OR)により、リスト・モード・ファイルを分析した。適切なアイソタイプ整合対照mAb(BD Pharmingen)を用いた対照染色が、陽性染色及びバックグラウンド線形スケール平均蛍光強度(MFI)値に関する閾値を確立するように含まれた。陽性細胞のパーセンテージ(%)は、(特定mAbで染色された陽性細胞の%)−(対応するアイソタイプ対照によるバックグラウンド染色の%)として算定された。ΔMFIは、(特定mAbで染色された細胞のMFI)−(対応するアイソタイプ対照で染色された細胞のMFI)として算定された。線形スケールMFIは、所定の細胞に関する相対抗原密度の指標として用いられた。
抗原プロセシング検定
タンパク質分解時に明緑色蛍光を示す卵白アルブミンの自己消光型接合体(DQ−OVA;Molecular Probes,Eugene,OR)を用いて、卵白アルブミン(OA)プロセシング検定を実施した。図1の工程3で得られた樹状細胞を、2%FBS及び1%の非必須アミノ酸を含有するDMEM/F12(Invitrogen)中で、100μg/mlのDQ−OVAと共に、37℃で30分間インキュベートした。4℃でインキュベートした細胞を、バックグラウンド蛍光に関する対照として用いた。フローサイトメトリーにより、OVAタンパク質分解を評価した。
タンパク質分解時に明緑色蛍光を示す卵白アルブミンの自己消光型接合体(DQ−OVA;Molecular Probes,Eugene,OR)を用いて、卵白アルブミン(OA)プロセシング検定を実施した。図1の工程3で得られた樹状細胞を、2%FBS及び1%の非必須アミノ酸を含有するDMEM/F12(Invitrogen)中で、100μg/mlのDQ−OVAと共に、37℃で30分間インキュベートした。4℃でインキュベートした細胞を、バックグラウンド蛍光に関する対照として用いた。フローサイトメトリーにより、OVAタンパク質分解を評価した。
クローン原性始原細胞検定
1ml/皿のMethoCult GFを、1%メチルセルロース、30%FBS、1%BSA、50ng/mlのSCF、20ng/mlの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、20ng/mlのIL−3、20ng/mlのIL−6、20ng/mlの顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)及び3単位/mlのエリスロポイエチンを含有するH4435半固体培地(Stem Cell Technologies)と共に用いて、35mm低接着性プラスチック皿(Stem Cell Technologies)中で、造血コロニー原性検定を実施した。全コロニー原性始原細胞検定を二重反復実験で実施し、そして、赤血球系(E−CFC)、顆粒球、マクロファージ、巨核球(GEMM−CFC)、顆粒球−マクロファージ(GM−CFC)、顆粒球(G−CFC)及びマクロファージ(M−CFC)としてそれらのコロニー形態により、14〜21日のインキュベーション後に、CFCをスコアした。106総細胞当たりで、CFCの頻度を算定した。
1ml/皿のMethoCult GFを、1%メチルセルロース、30%FBS、1%BSA、50ng/mlのSCF、20ng/mlの顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子(GM−CSF)、20ng/mlのIL−3、20ng/mlのIL−6、20ng/mlの顆粒球コロニー刺激因子(G−CSF)及び3単位/mlのエリスロポイエチンを含有するH4435半固体培地(Stem Cell Technologies)と共に用いて、35mm低接着性プラスチック皿(Stem Cell Technologies)中で、造血コロニー原性検定を実施した。全コロニー原性始原細胞検定を二重反復実験で実施し、そして、赤血球系(E−CFC)、顆粒球、マクロファージ、巨核球(GEMM−CFC)、顆粒球−マクロファージ(GM−CFC)、顆粒球(G−CFC)及びマクロファージ(M−CFC)としてそれらのコロニー形態により、14〜21日のインキュベーション後に、CFCをスコアした。106総細胞当たりで、CFCの頻度を算定した。
同種異系混合リンパ球反応(MLR)
Histopaque−1077での密度勾配遠心分離により、健常な実験室有志から得た末梢血試料から、成人単核細胞を単離した。臍帯血単核細胞もまた、Cambrex Bio Science(Walkersville,MD)から購入した。単核細胞をプラスチック接着により単球から除去し、そして応答細胞として用いた。5%ヒトAB血清(Sigma)を含有するRPPMI 1640中の96ウエル平底プレート(Corning)中で6日間、段階的数(1×103〜3×104/ウエル)の照射(35Gy)刺激細胞を1×105応答細胞と同時培養した。インキュベートの最後の16時間で[3H]チミジン(Sigma)を加えた(1μCi/ウエル)細胞をガラス繊維フィルター上に収穫し、[3H]チミジンの取り込みをシンチレーション計数により測定した。
Histopaque−1077での密度勾配遠心分離により、健常な実験室有志から得た末梢血試料から、成人単核細胞を単離した。臍帯血単核細胞もまた、Cambrex Bio Science(Walkersville,MD)から購入した。単核細胞をプラスチック接着により単球から除去し、そして応答細胞として用いた。5%ヒトAB血清(Sigma)を含有するRPPMI 1640中の96ウエル平底プレート(Corning)中で6日間、段階的数(1×103〜3×104/ウエル)の照射(35Gy)刺激細胞を1×105応答細胞と同時培養した。インキュベートの最後の16時間で[3H]チミジン(Sigma)を加えた(1μCi/ウエル)細胞をガラス繊維フィルター上に収穫し、[3H]チミジンの取り込みをシンチレーション計数により測定した。
理解を容易にする目的のために図解及び実施例により本発明を上記で多少詳細に記載してきたが、本発明の或る種の適応は当業者にとって慣例的な最適化の問題であり、そして本発明の精神又は添付の特許請求の範囲を逸脱しない限り実行され得る、と理解される。
Claims (15)
- 以下の:
(a)ヒト胚性幹細胞をマクロファージコロニー刺激因子を発現しないストローマ細胞と同時培養する工程であって、幹細胞が多能性リンパ・造血性始原細胞に分化するように誘導され、そして培養がサイトカインの存在下でない、同時培養する工程、
(b)顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子(GM−SCF)と共に始原細胞を培養する工程であって、それにより、骨髄球系前駆細胞の拡大を引き起こす、培養する工程、及び
(c)未成熟樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程
を包含する、ヒト胚性幹細胞を樹状細胞に培養する方法。 - 前記の樹状細胞の表現型を有する細胞を回収する工程が少なくとも1つのサイトカインと共に前記骨髄球系前駆細胞を培養することを包含する、請求項1記載の方法。
- 前記サイトカインがIL−4、TFN−α、IFN−α及びGM−CSFから成る群から選択される、請求項2記載の方法。
- 前記ストローマ細胞がOP9細胞である、請求項1記載の方法。
- 前記工程(b)の培養が非接着性条件下である、請求項1記載の方法。
- 工程(b)及び工程(c)間に、細胞培養から細胞の凝集塊及び死細胞を分離する工程をさらに包含する、請求項1記載の方法。
- GM−SCF及びTNFα又はGM−SCF及びINFαと共に前記骨髄球系前駆細胞を培養し、そして調節性補助細胞を回収する工程を付加的に包含し、前記調節性補助細胞がマーカーCD1alow、CD9、CD80low及びCD86lowにより特性化される、請求項1記載の方法。
- 前記骨髄球系前駆細胞の拡大が無血清条件下である、請求項1記載の方法。
- 前記培養中の細胞の大多数がCD1a+、DC−SIGN+、CD4+、CD9low、CD11c+、CD40low、CD86+、CD80+、CD86+、HLA−ABC+、HLA−DR+の表現型を有し、そしてCD207及びCD208に関して陰性である、ヒト樹状細胞の培養。
- 前記細胞の大多数が骨髄球系前駆体の表現型を有し、そして前記細胞の少なくとも90%がCD45+、CD4+、CD123lowであり、HLA−DRに関して陰性であり、そしてMPO、M−CSFR、CD11b、CD11c、CD15及びCD16を発現する細胞の亜集団を含む、骨髄球系前駆細胞の培養。
- 前記細胞の大多数がCD1alow、CD80low、CD86low表現型を発現し、そしてナイーブT細胞の増殖を誘導する能力減少を示す、ヒト調節性DCの培養。
- 以下の:
a. マーカーCD1a、CD80、CD86、DC−SIGN、HLA−DRhighによって特徴付けられたヒト胚性幹細胞を樹状細胞の一集団に分化させること、
b. 患者から腫瘍細胞の単一細胞懸濁液を獲得し、且つ調製すること、及び
c. 細胞性ワクチンが作製されるよう、胚性幹細胞由来の樹状細胞を腫瘍細胞と融合すること
を包含する、細胞性ワクチンを製造する方法。 - 癌を治療するための樹状細胞ワクチンを製造する方法であって、以下の:
a. CD11b+、CD11c+、CD16+細胞の亜集団を含むCD45+CD4+CD123low骨髄球系前駆体にヒト胚性幹細胞を分化させること、
b. 免疫原性腫瘍タンパク質又はペプチドを発現するように骨髄球系前駆細胞を変更すること、及び
c. 遺伝子修飾骨髄球系前駆体を免疫原性樹状細胞に分化させること、
を包含する、前記樹状細胞ワクチンを製造する方法。 - 変更骨髄球系前駆細胞がMAGE3、PAP及びPSMAから成る群から選択されるペプチドを発現する、請求項13記載の方法。
- 同一細胞株から得られるヒト胚性幹細胞由来組織の拒絶の治療のために用いられ得る寛容原特性を有する樹状細胞を作製する方法であって、以下の:
a. 骨髄球系前駆細胞にhES細胞を分化させる工程、及び
b. 調節性樹状細胞を獲得する工程であって、GM−CSF及びTNFα又はGM−CSF及びIFNαと共に骨髄球系前駆体を培養することにより、前記細胞はCD1alow、CD9−、CD80low、CD86lowにより特性化される、調節性樹状細胞を獲得する工程
を包含する、前記樹状細胞を作製する方法。
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