CN112680410B - 诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液,所述方法包括:用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养得到心脏中胚层祖细胞;再用促第二心场祖细胞培养液继续分化培养得到第二心场祖细胞;最后再用心脏成纤维细胞培养液培养得到纯化的成熟心脏成纤维细胞。本发明所述的培养方法中,取材方便,培养时间短,分化效率高,且获得的心脏成纤维细胞可用于临床治疗心力衰竭,以及体外疾病建模研究、药物筛选和其他生物医学应用。
Description
技术领域
本发明属于干细胞治疗技术领域的干细胞分化技术,具体涉及一种诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法及其培养液。
背景技术
心脏成纤维细胞具有两个重要功能:细胞外基质的产生、重塑,以及能够分泌细胞外小泡中生长因子和调节分子的复杂混合物,具有调节心脏功能的作用。当心脏受损时,心脏成纤维细胞可被激活用来修复受损的心肌细胞。为恢复受损的心脏功能,移植心脏成纤维细胞是必要的,而心肌成纤维又是不同于体内其他成纤维细胞的组织特异性细胞,有限数量的可用供体是临床移植的一个明显且关键的限制。其中一个具有巨大临床应用潜力的方法是用诱导多能干细胞在体外分化为心脏成纤维细胞,并进一步用于人体心脏受损的移植治疗。此项技术不需要使用***或胚胎细胞,避开了胚胎干细胞研究应用带来的伦理道德问题;同时,该方法产生的心脏成纤维细胞能够在培养过程中大量地增殖,可以为病人提供同基因型心脏成纤维细胞的无限来源。病人自体细胞重编程来源的诱导多能干细胞经诱导分化获得的心脏成纤维细胞应用于个体治疗能有效地避免免疫排斥反应,可最大程度提高临床治疗效果。
心脏发育机制研究显示心外膜在发育早期支持心肌细胞增殖,并向发育中的心脏提供成纤维细胞和血管平滑肌细胞。现有的由多能干细胞分化为心脏成纤维细胞的方法主要集中于从人类多能干细胞中诱导分化产生心外膜细胞,随后分化为心脏成纤维细胞。如最新的一项专利(CN105518125A)采用人多能干细胞在BMP4、bFGF和活化素A作用下处理3~5天获得KDR+和PDFGα+心血管中胚层祖细胞群体,KDR+和PDFGα+心血管中胚层祖细胞群体与WNT抑制剂和BMP4渗透接触产生WT1+心血管祖细胞群体,再用包含VEGF成分的成熟混合液持续培养数天,产生表达WT1和EPDC的心外膜谱系细胞。该方法培养周期长,且获得的心脏成纤维细胞纯度较低,含有大量非成纤维细胞群体,如心血管平滑肌谱系细胞群体和表达视黄醇脱氢酶的心外膜谱系细胞群体等。另一专利(CN108148802A)则是通过激活WNT信号通路将多能干细胞诱导分化成中胚层细胞,再通过抑制WNT信号通路中胚层细胞转化成心肌前体细胞,然后通过激活成纤维细胞生长因子信号通路和WNT信号通路使获得的心肌前体细胞转化成TBX18和WT1双阳性的前心外膜细胞,再用前心外膜细胞制备心外膜细胞,用bFGF处理心外膜细胞,之后再用bFGF加胎牛血清处理得到心脏成纤维细胞。此分化***程序相当繁琐,且所用试剂复杂,含有动物源成份,对后期的临床治疗应用不利。因此,虽然有诱导多能干细胞向心外源细胞分化,进一步产生心脏成纤维细胞的方法,但获得特征良好的心脏成纤维细胞的有效分化方法尚未被描述。
综上所述,急需开发一种有效的由多能干细胞产生心脏成纤维细胞的培养液和方法,使体外获得的心脏成纤维细胞在疾病机制研究、药物筛选及临床细胞治疗中得到有效应用。
发明内容
本发明以诱导多能干细胞为原材料,采用WNT、BMP和FGF信号顺序调制来产生心脏中胚层祖细胞,进一步分化为第二心场祖细胞,最终有效地生成心脏成纤维细胞。本发明提供了一种由诱导多能干细胞培养心脏成纤维细胞,可大大缩短心脏成纤维细胞制备周期的方法,培养液成分明确且不含动物源成分,获得的心脏成纤维细胞可应用于临床治疗。
本发明的诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法包括如下步骤:
步骤S1,用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养得到心脏中胚层祖细胞;
步骤S2,心脏中胚层祖细胞用促第二心场祖细胞培养液继续分化培养得到第二心场祖细胞;
步骤S3,第二心场祖细胞经消化后再用心脏成纤维细胞培养液培养得到纯化的成熟心脏成纤维细胞。
在本发明一较佳实施例中,
步骤S1,具体为,于35~39℃优选37℃、3~7%优选5%CO2条件下,用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养1~3天优选2天,移除未贴壁的细胞,定向分化得到心脏中胚层祖细胞;
步骤S2,具体为,心脏中胚层祖细胞于35~39℃优选37℃、3~7%优选5%CO2条件下用促第二心场祖细胞培养液继续培养3~5天优选4天得到第二心场祖细胞,继续培养期间每1-2天优选2天更换一次培养液;
步骤S3,具体为,步骤S2得到的促第二心场祖细胞用TryplE消化,按3000-5000cells/cm2密度接种,于35-39℃优选37℃、3-7%优选5%CO2条件下,用心脏成纤维细胞培养液培养5~7天得到纯化的成熟心脏成纤维细胞,并进行传代培养。
在本发明中,所述诱导多能干细胞用外周血单核细胞电转质粒法获得。
本发明还提供一种促心脏中胚层祖细胞培养液,所述促心脏中胚层祖细胞培养液成分包括:RPMI1640基础培养基,人血清白蛋白(HSA),L-ascorbic acid 2-phosphate,聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol,PVA),Wnt激活剂,BMP拮抗剂和FGF激活剂。
所述Wnt激活剂为CHIR99021,所述BMP拮抗剂为BMP4,所述FGF激活剂为FGF2。
在本发明的促心脏中胚层祖细胞培养液中,所述HSA浓度为1~5mg/mL,优选2.5mg/mL,L-ascorbic acid 2-phosphate浓度为50~100μg/mL,优选75μg/mL;所述PVA浓度为0.1%~10%,优选2.5%;所述Wnt激活剂浓度为4~8μmol/L,优选6μmol/L;所述BMP拮抗剂浓度为1~10ng/mL,优选5ng/mL;所述FGF激活剂浓度为1~10ng/mL,优选5ng/mL。
本发明还提供一种心脏成纤维细胞培养液,所述心脏成纤维细胞培养液包括:DMEM高糖培养基(DMEM high glucose with GlutaMAX supplement,厂商:Thermo Fisher货号:10566016)10%KnockOutTM SR XenoFree CTSTM(厂商:Thermo Fisher货号:12618013)和MEM Non-Essential Amino Acids Solution,100X(MEM Non-EssentialAmino Acids Solution,厂商:Thermo Fisher货号:11140050)。
本发明还提供一种促第二心场祖细胞培养液,所述促第二心场祖细胞培养液包括本发明所述的心脏成纤维培养液、β-巯基乙醇(β-Mercaptoethanol,β-Me)和FGF激活剂。
在本发明所述的促第二心场祖细胞培养液中,所述β-巯基乙醇浓度为0.1~10mmol/L,优选1mmol/L;所述FGF激活剂为FGF2,所述FGF激活剂浓度为25~100ng/mL,优选50ng/mL。
由本发明的方法分化后的心脏成纤维细胞可以用于心肌间质重建,可用于心力衰竭疾病的临床细胞替代移植治疗,以及体外疾病建模研究、药物筛选和其他生物医学应用。
本发明3组培养液中的各组分可协同作用,促进诱导多能干细胞分化为心脏成纤维细胞。其中,本发明的促心脏中胚层祖细胞培养液中,RPMI1640作为基础培养基,营养成分丰富,能为心脏分化提供代谢所需的营养物质;HSA在配方中发挥多种作用,如可通过结合脂质和过量蛋白质来充当解毒剂/缓冲液,结合激素和生长肽来保持培养液的稳定,以及结合自由基来减少对细胞的氧化损伤;L-ascorbic acid 2-phosphate是一种抗氧化剂,具有良好改善心脏分化的作用,可通过增加胶原合成,促进心血管祖细胞的大量增殖。RPMI1640基础培养基,HSA,L-ascorbic acid 2-phosphate三种成分组合,能够有效地促进诱导多能干细胞向心脏中胚层祖细胞分化。另外,PVA作为一种高分子聚合物,具有很好的稳定性,本发明促心脏中胚层祖细胞培养液中加入一定浓度的PVA能够有效促进心脏成纤维细胞的增殖与分化,且明显降低培养成本。所述WNT激活剂为CHIR99021;所述BMP拮抗剂为BMP4,能促进中胚层标记物PDGFRα的表达;同时,在发育过程中,来自心脏成纤维细胞的信号是刺激心脏成纤维细胞分化和增殖所必需的,FGF传导路径活化分子FGF2,有助于产生心脏中胚层祖细胞。CHIR99021、BMP4和FGF2三者协同并在PVA有效的作用下能有效增强诱导多能干细胞向心脏中胚层祖细胞的分化。
本发明的促第二心场祖细胞培养液成分包括心脏成纤维细胞培养液,β-Me和FGF激活剂成纤维细胞生长因子FGF2。其中,β-Me作为一种强有效的还原剂,能够中和培养液中积累的氧自由基,起到诱导细胞增殖和分化的作用。FGF2作为成纤维细胞生长因子(FGF)信号有助于产生心脏中胚层祖细胞,并对BMP信号发挥主导作用,可以将心脏中胚层祖细胞导向非心肌细胞的命运,生成第二心场祖细胞。
本发明的心脏成纤维细胞培养液成分由DMEM high glucose with GlutaMAXsupplement,10%KnockOutTM SR XenoFree CTSTM和MEM Non-Essential Amino AcidsSolution,100X组成,营养丰富且不含动物源成分,可有效维持心脏成纤维细胞生长、增殖和成熟。
对培养得到的心脏成纤维细胞进行计数,活性统计,并进行细胞类型鉴定后,包括心脏成纤维细胞特征性蛋白表达、表面标志物表达,即可低温贮藏或者用于医学研究。
本发明的积极进步效果在于:本发明所述培养液成分简单明确,不含动物源成分,同时,一些成分的添加具有很大的新颖性,能有效促进诱导多能干细胞朝心脏成纤维细胞方向分化。如所述促心脏中胚层祖细胞培养液中添加2.5%PVA,不仅降低了培养成本,而且显著提高了心脏中胚层祖细胞的生成,具有明显的积极进步作用;培养液选用FGF2作为FGF激活剂,能够有效促进诱导多能干细胞向心脏中胚层祖细胞,进而向第二心场祖细胞分化,有效促进细胞向心脏成纤维细胞这种非心肌细胞命运分化;所述促第二心场祖细胞培养液成分包括DMEM high glucose withGlutaMAXsupplemen,10%KnockOutTMSR XenoFreeCTSTM,MEM nonessential amino acids 100X,β-Me和FGF激活剂FGF2,培养液只选用关键性成分,简单却能有效促进第二心场祖细胞的分化和增殖。所述方法采用所述培养液,通过控制关键信号通路,将诱导多能干细胞分化为第二心场祖细胞,进一步生成心脏成纤维细胞。所述方法,一方面原材料诱导多能干细胞可由患者血液的单核细胞电转而来,无数量限制,生成的心脏成纤维细胞可用于病人自体治疗,能够有效避免免疫排斥反应;另一方面,该***分化方案周期为12天,在较短的时间内即可获得大量的成熟心脏成纤维细胞,纯度高且功能齐全,具有临床实用性,是一种有效的获得心脏成纤维细胞的方法。
附图说明
图1为诱导多能干细胞的显微镜照片;
图2为不同培养液每1×106个诱导多能干细胞获得的数量;
图3A~3D分别对应实验组1-4所获得的心脏成纤维细胞显微镜照片;
图4为心脏成纤维细胞特征性蛋白表达的免疫荧光鉴定结果照片;
图5为心脏成纤维细胞表面标志物的流式鉴定照片;
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明作进一步的说明。
心脏成纤维细胞的定向分化培养步骤如下:
诱导多能干细胞铺板:通过外周血单核细胞电转质粒法获得诱导多能干细胞,将人诱导多能干细胞在37℃下用1mL/well Versene溶液(Gibco)解离5min,按密度0.25-0.6×106cells/cm2接种于12孔板上,基质胶选用LN521(BioLamina),并加入10μmol/L ROCK抑制剂(Y-27632)(Tocris)。细胞在mTeSR1培养基中培养5天,每天更换培养基,直到分化开始时达到100%汇合。观察细胞状态良好,且无分化现象。诱导多能干细胞的显微镜照片如图1所示。
诱导多能干细胞定向分化:将长满诱导多能干细胞的12孔板置于无菌操作台中,轻轻晃动12孔板,使用电动吸引器吸去培养基,用2mL移液管将死细胞以及未贴壁的细胞移除。并用5mL移液管沿着孔壁缓慢加入新鲜的促心脏中胚层祖细胞培养液,2mL/孔(若培养液存放于4℃冰箱中,需提前取出室温预热20分钟),放入培养箱中培养2天,对诱导多能干细胞进行定向分化。
2天后取出12孔板置于无菌操作台中,轻轻晃动12孔板,使用电动吸引器吸去培养液,用2mL移液管将死细胞以及未贴壁的细胞移除,然后用5mL移液管沿着孔壁缓慢加入新鲜的促第二心场祖细胞培养液继续培养,继续培养期间每2天更换一次培养基液,培养液2.5mL/孔,继续放入培养箱中培养10天;
6天后,取出12孔板培养液置于无菌操作台中,用TryplE消化培养板中细胞,按3000-5000cells/cm2密度接种到新的12孔板培养板上,此时培养液为新鲜的心脏成纤维细胞培养液,2mL/孔,继续放入培养箱中培养5~7天,每2天更换一次培养液。之后收集细胞,并进行检测。
效果实施例1培养液中部分成分对心脏成纤维细胞分化效率的影响
实验组1~4通过设计在培养液中是否添加CHIR99021、BMP4、PVA、FGF2等成分,采用上述的心脏成纤维细胞定向分化培养方法,研究CHIR99021、BMP4、PVA、FGF2等这几种小分子化合物对心脏成纤维细胞分化效率的影响。其中,各实验组培养液添加成分及含量如表1所示。
表1培养液的组分及含量
图2汇总了不同实验组每1×106个诱导多能干细胞获得的细胞数量;图3A~3D分别对应实验组1-4所获得的心脏成纤维细胞显微镜明场照片。由图2和图3A~3D可知,培养液中依次添加适宜浓度的CHIR99021、BMP4、PVA和FGF2,心脏成纤维细胞分化效率逐步增加,说明各成分均具有促进心脏成纤维细胞分化的功效。图3A~3D从形态学上观察,实验组3和4获得的细胞具有明显的心脏成纤维细胞形态,说明促心脏中胚层祖细胞培养液中添加FGF2具有定向促进诱导多能干细胞分化为心脏成纤维细胞功能。实验组4获得的细胞数量明显多于实验组1、2和3,原因是实验组4添加了2.5%PVA,说明培养液中添加PVA在促进诱导多能干细胞向心脏细胞分化方面具有显著的功效。综上,培养液中添加一定浓度的CHIR99021、BMP4、PVA和FGF2等成分,能有效促进诱导多能干细胞向心脏成纤维细胞分化,本发明所述培养液成分新颖且有效,是一种高效生成心脏成纤维细胞的培养液。
效果实施例2心脏成纤维细胞特征性蛋白表达的免疫荧光鉴定结果
免疫荧光处理步骤为:取培养完成的12孔板,吸去培养液后,沿12孔板板壁缓缓加入1×PBS,洗2次;然后沿板壁缓慢加入4%的PFA,室温放置18分钟固定细胞,轻柔地吸去PFA,加入1×PBS洗3次。加入0.3%Triton×100,于37℃孵育30分钟;然后加入5%的BSA封闭,于37℃孵育30分钟;直接向封闭液中加入一抗,一抗加入量为20μL/孔,于37℃孵育1小时,加入1×PBS洗3次。加入用1%BSA稀释(稀释比例1:200)后的二抗,37℃避光孵育30分钟后吸去二抗,加入1×PBS洗3次,每次5分钟;然后加入用1×PBS配好的终浓度为1μg/mL的DAPI,染色1分钟,吸去DAPI,加入1×PBS洗2次;最后加入1×PBS,荧光显微镜下观察并拍照处理。
图4中为经实验组4所述培养液和培养方法培养获得的细胞免疫荧光鉴定结果。心脏成纤维细胞特征性蛋白为FIBROBLASTS,此外心脏成纤维细胞具有分泌纤维连接蛋白(FIBRONECTIN)功能,通过检测FIBROBLASTS和FIBRONECTIN,即可鉴定产生的细胞是否为心脏成纤维细胞。免疫荧光鉴定显示,产生的细胞能够表达FIBROBLASTS,且能够强有力地产生FIBRONECTIN,说明生成的细胞为心脏成纤维细胞,且具有良好的功能性。结果表明,采用所述培养液,经所述的方法,能够有效获得功能性良好的心脏成纤维细胞。
效果实施例3心脏成纤维细胞表面抗原的流式鉴定
流式处理步骤为:细胞样本300rcf离心2分钟,去上清,加5mL PBS清洗一次,再加FACS buffer将细胞稀释到2×107个/mL,吹打混匀;准备流式专用管,向各流式专用管中加入50μL细胞样本悬液,再向样本细胞中加入50μL对应的抗体混匀,避光孵育30分钟;然后向抗体孵育后的细胞中各加入2mL FACS buffer,使用漩涡混合器振荡混匀,室温下300rcf离心3分钟,去上清,向流式管中加入100μL离心管中的二抗,室温避光孵育15分钟;最后向流式管中加入2mL流式buffer,涡旋振荡混匀,室温下300rcf离心2min,去上清,再向流式管中加入300μL流式buffer,涡旋振荡混匀,在BD FACSCaliur流式细胞仪的选择合适的通道检测标志物的阳性率。
图5为经实验组4所述培养液和所述方法获得的细胞表面标志物流式鉴定结果。对心脏成纤维细胞表面标志物clone TE-7检测,结果显示,所述方法获得的clone TE-7阳性表达率为99.58%,此结果不仅表明所述方法获得的细胞为心脏成纤维细胞,而且纯度较高,达99%以上。由此可见,采用本发明所述培养液以及所述培养方法能够高效获得人心脏成纤维细胞,因采用的培养液中不含有动物源成分,本发明具有临床实用性。
本发明可由取自心脏病患者血液中的单核细胞电转质粒法获得诱导多能干细胞,采用本发明所述培养液和本发明所述方法定向分化得到心脏成纤维细胞。所述培养液含有WNT激活剂CHIR99021,BMP拮抗剂BMP4,和FGF传导路径活化分子FGF2,通过控制关键信号通路,并在2.5%PVA作用下有效促进诱导多能干细胞向心脏中胚层分化,然后在β-Me、FGF2持续作用下生成第二心场祖细胞,进一步培养诱导获得成熟的心脏成纤维细胞。所述培养液成分简单明确,能有效促进心脏成纤维细胞生成,且不含动物源成分,具有临床适用性。同时所述方法另辟蹊径,采用人诱导多能干细胞经第二心场祖细胞获得心脏成纤维细胞,程序简单,培养周期只需要12天,大大提高了心脏成纤维细胞的制备速度,降低了制备成本,是一种有效的心脏成纤维细胞获得方法,可用于心脏疾病机制研究、药物筛选及临床细胞治疗。
Claims (7)
1.一种诱导多能干细胞分化培养心脏成纤维细胞的方法,其特征在于包括如下步骤:
步骤S1,用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养得到心脏中胚层祖细胞;具体为,于35~39℃、3~7%CO2条件下,用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养1~3天,移除未贴壁的细胞,定向分化得到心脏中胚层祖细胞;
所述促心脏中胚层祖细胞培养液的成分包括:RPMI 1640基础培养基,人血清白蛋白,L-抗坏血酸2磷酸,聚乙烯醇,Wnt激活剂,BMP拮抗剂和FGF激活剂;所述人血清白蛋白浓度为1~5mg/mL,所述L-抗坏血酸2磷酸浓度为50~100μg/mL;所述聚乙烯醇质量浓度为0.1%~10%;所述Wnt激活剂浓度为4~8μmol/L;所述BMP拮抗剂浓度为1~10ng/mL;所述FGF激活剂浓度为1~10ng/mL;
步骤S2,心脏中胚层祖细胞用促第二心场祖细胞培养液继续分化培养得到第二心场祖细胞;具体为,心脏中胚层祖细胞于35~39℃、3~7%CO2条件下用促第二心场祖细胞培养液继续培养3~5天得到第二心场祖细胞,继续培养期间每1-2天更换一次培养液;所述促第二心场祖细胞培养液包括心脏成纤维培养液、β-巯基乙醇和FGF激活剂;所述β-巯基乙醇在所述心脏成纤维培养液中的浓度为0.1~10mmol/L;所述FGF激活剂在所述心脏成纤维培养液中的浓度为25~100ng/mL;
步骤S3,第二心场祖细胞经消化后再用心脏成纤维细胞培养液培养得到纯化的成熟心脏成纤维细胞;具体为,步骤S2得到的促第二心场祖细胞用TryplE消化,按3000-5000cells/cm2密度接种,于35-39℃、3-7%CO2条件下,用心脏成纤维细胞培养液培养5~7天得到纯化的成熟心脏成纤维细胞,并进行传代培养5~10次;所述心脏成纤维细胞培养液包括:DMEM高糖培养基DMEM high glucose with GlutaMAX supplement,KnockOutTM SRXenoFree CTSTM和MEM Non-Essential Amino Acids Solution;所述KnockOutTM SRXenoFree CTSTM浓度为5%-15%;所述MEM Non-Essential Amino Acids Solution浓度为0.5%-2%。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于:
步骤S1,具体为,于37℃、5%CO2条件下,用促心脏中胚层祖细胞培养液对诱导多能干细胞进行定向分化培养2天,移除未贴壁的细胞,定向分化得到心脏中胚层祖细胞;
步骤S2,具体为,心脏中胚层祖细胞于37℃、5%CO2条件下用促第二心场祖细胞培养液继续培养4天得到第二心场祖细胞,继续培养期间每2天更换一次培养液;
步骤S3,具体为,步骤S2得到的促第二心场祖细胞用TryplE消化,按3000-5000cells/cm2密度接种,于37℃、5%CO2条件下,用心脏成纤维细胞培养液培养5~7天得到纯化的成熟心脏成纤维细胞,并进行传代培养5~10次。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述诱导多能干细胞用外周血单核细胞电转质粒法获得。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述Wnt激活剂为CHIR99021,所述BMP拮抗剂为BMP4,所述FGF激活剂为FGF2。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述人血清白蛋白浓度为2.5mg/mL,所述L-抗坏血酸2磷酸浓度为75μg/mL;所述聚乙烯醇质量浓度为2.5%;所述Wnt激活剂浓度为6μmol/L;所述BMP拮抗剂浓度为5ng/mL;所述FGF激活剂浓度为5ng/mL。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述KnockOutTM SR XenoFree CTSTM浓度为10%;所述MEM Non-Essential Amino Acids Solution浓度为1%。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述β-巯基乙醇在所述心脏成纤维培养液中的浓度为1mmol/L;所述FGF激活剂为FGF2,所述FGF激活剂在所述心脏成纤维培养液中的浓度为50ng/mL。
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PB01 | Publication | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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