BR112015022034B1

BR112015022034B1 - Método de fabricar um camundongo, e, para fabricar um anticorpo

Info

Publication number: BR112015022034B1
Application number: BR112015022034-7A
Authority: BR
Inventors: Lynn MacDonald; Andrew J. Murphy; David R. Buckler; John McWhirter; Karolina A. Meagher; Robert Babb; Sean Stevens; Samuel Davis
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc
Priority date: 2013-03-13
Filing date: 2014-03-13
Publication date: 2023-02-28
Also published as: EP2967013B1; JP6529957B2; LT3501272T; ES2942413T3; MX357308B; HRP20190706T1; CN105188357B; FI3501272T3; AU2020203238B2; ZA201505835B; CN108611369B; JP7010902B2; ZA201805369B; EP4218409A3; JP2019076109A; AU2014244020A1; IL240563B; JP2019213549A; IL240563A0; RS58669B1

Abstract

MÉTODO DE FABRICAR UM CAMUNDONGO E PARA FABRICAR UM ANTICORPO, CÉLULA B ISOLADA, E, HIBRIDOMA. Um camundongo geneticamente modificado é fornecido, em que o camundongo expressa um repertório da cadeia leve da imunoglobulina distinguida por um número limitado de domínios variáveis de cadeia leve. Camundongos são fornecidos que apresentam uma escolha de dois segmentos de gene variáveis da cadeia leve humana tal que as cadeias leves da imunoglobulina expressadas pelo camundongo compreendam um dos dois segmentos de gene variáveis da cadeia leve humana. Métodos para fabricar anticorpos biespecí-ficos tendo cadeias leves universais usando camundongos como aqui descritos, incluindo as regiões variáveis de cadeia leve humana, são fornecidos. Métodos para fabricar regiões variáveis humanas adequadas para o uso em proteínas aglutinantes multiespecí-ficas, por exemplo, anticorpos biespecí-ficos, e células hospedeiras são fornecidos.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica benefício sob 35 U.S.C. § 119(e) do Pedido de Patente U.S. Serial No. 13/798.455, depositado em 13 de março de 2013, pedido este que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

[0002] O presente pedido faz referência a uma listagem de sequência submetida na forma eletrônica como um arquivo ascii .txt nomeado “2010794-0550_ST25” em 13 de março de 2014. O arquivo .txt foi gerado em 11 de março de 2014 e tem 33 kb no tamanho.

CAMPO

[0003] Um camundongo geneticamente modificado é fornecido que expressa anticorpos tendo uma cadeia variável leve humana/constante de camundongo associados com diversas cadeias variáveis pesadas humanas/constantes de camundongo. Um método para fabricar um anticorpo humano biespecífico a partir de sequências de gene da região variável humana de células B do camundongo é fornecido.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[0004] Os anticorpos tipicamente compreendem um componente de cadeia pesada homodimérico, em que cada monômero de cadeia pesada está associado com uma cadeia leve idêntica. Anticorpos tendo um componente de cadeia pesada heterodimérico (por exemplo, anticorpos biespecíficos) são desejáveis como anticorpos terapêuticos. Mas a fabricação de anticorpos biespecíficos tendo um componente de cadeia leve adequado que possa se associar satisfatoriamente com cada uma das cadeias pesadas de um anticorpo biespecífico tem se mostrado problemática.

[0005] Em uma abordagem, uma cadeia leve seria selecionada pelas estatísticas de uso de inspeção para todos os domínios variáveis de cadeia leve, identificando a cadeia leve mais frequentemente utilizada em anticorpos humanos, e emparelhando esta cadeia leve in vitro com as duas cadeias pesadas de especificidade diferente.

[006] Em uma outra abordagem, uma cadeia leve seria selecionada observando-se as sequências de cadeia leve em uma biblioteca de demonstração de fago (por exemplo, uma biblioteca de demonstração de fago compreendendo sequências da região variável de cadeia leve humana, por exemplo, uma biblioteca de scFv humana) e selecionando-se a região variável de cadeia leve mais habitualmente usada da biblioteca. A cadeia leve pode ser depois testada nas duas cadeias pesadas diferentes de interesse.

[007] Em uma outra abordagem, uma cadeia leve seria selecionada ensaiando-se uma biblioteca de demonstração de fago das sequências variáveis de cadeia leve usando as sequências variáveis de cadeia pesada de ambas as cadeias pesadas de interesse como sondas. Uma cadeia leve que se associa com ambas as sequências de cadeia pesada variável seria selecionada como uma cadeia leve para as cadeias pesadas.

[008] Em uma outra abordagem, uma cadeia leve candidata seria alinhada com as cadeias leves cognatas das cadeias pesadas, e modificações são fabricadas na cadeia leve para se igualar mais intimamente com as características de sequência comuns para as cadeias leves cognatas de ambas as cadeias pesadas. Se as chances de imunogenicidade precisam ser minimizadas, as modificações preferivelmente resultam em sequências que estão presentes nas sequências de cadeia leve humanas conhecidas, tal que seja improvável que o processamento proteolítico gere um epítopo de célula T com base nos parâmetros e métodos conhecidos na técnica para avaliar a probabilidade de imunogenicidade (isto é, em ambiente virtual assim como ensaios úmidos).

[009] Todas as abordagens acima contam com métodos in vitro que incorporam a priori várias restrições, por exemplo, identidade de sequência, capacidade para associar com cadeias pesadas específicas pré-selecionadas, etc. Existe uma necessidade na técnica quanto a composições e métodos que não dependam da manipulação das condições in vitro, mas que ao invés utilizem abordagens mais biologicamente sensíveis para fabricar proteínas humanas de aglutinação de epítopo que incluam uma cadeia leve comum.

SUMÁRIO

[0010] Camundongos geneticamente modificados que expressam domínios variáveis de cadeia pesada e leve da imunoglobulina humana, em que os camundongos têm um repertório limitado de cadeia leve variável, são fornecidos. Um sistema biológico para gerar um domínio variável de cadeia leve humano que se associa e expressa com um repertório diverso de domínios variáveis de cadeia pesada humanos maturados com afinidade é fornecido. Métodos para fabricar proteínas de aglutinação compreendendo domínios variáveis de imunoglobulina são fornecidos, compreendendo imunizar camundongos que têm um repertório limitado de cadeia leve da imunoglobulina com um antígeno de interesse, e utilizando uma sequência de gene da região variável da imunoglobulina do camundongo em uma proteína de aglutinação que especificamente aglutina o antígeno de interesse. Os métodos incluem métodos para fabricar domínios variáveis de cadeia pesada da imunoglobulina humana adequados para o uso na fabricação de proteínas de aglutinação de antígeno multiespecíficas.

[0011] Camundongos geneticamente engendrados são fornecidos que selecionam domínios variáveis de cadeia pesada da imunoglobulina humana maturados por afinidade adequados derivados de um repertório de segmentos de gene da região variável de cadeia pesada humana não rearranjada, em que os domínios variáveis de cadeia pesada humanos maturados com afinidade associam e expressam com um domínio variável de cadeia leve humano único derivado de um segmento de gene de região variável de cadeia leve humana. Camundongos geneticamente engendrados que apresentam uma escolha de dois segmentos de gene da região variável de cadeia leve humana também são fornecidos. Em vários aspectos, o um ou dois segmentos de gene incluem XK3-5; jwocpq glqw XK5-20 humano.

[0012] Camundongos geneticamente engendrados são fornecidos que expressam um repertório limitado de domínios variáveis de cadeia leve humanos, ou um domínio variável de cadeia leve humano único, de um repertório limitado de segmentos de gene da região variável de cadeia leve humana. Em algumas modalidades, os camundongos fornecidos são geneticamente engendrados para incluir um segmento de gene de região variável de cadeia leve humana único não rearranjado (ou dois segmentos de gene da região variável de cadeia leve humana) que rearranja para formar um gene da região variável de cadeia leve humana rearranjado (ou dois genes da região variável de cadeia leve rearranjados) que expressa uma única cadeia leve (ou que expressam cada uma ou ambas de duas cadeias leves). Os domínios variáveis de cadeia leve humanos rearranjados são capazes de emparelhar com uma pluralidade de cadeias pesadas humanas maturadas por afinidade selecionadas pelos camundongos, em que as regiões de cadeia pesada especificamente aglutinam epítopos diferentes.

[0013] Camundongos geneticamente engendrados são fornecidos que expressam um repertório limitado de domínios variáveis de cadeia leve humanos, ou um domínio variável de cadeia leve humano único, a partir de um repertório limitado de sequências da região variável de cadeia leve humana. Em uma modalidade, os camundongos fornecidos são geneticamente engendrados para incluir uma única sequência de cadeia leve V/J humana (ou duas sequências V/J) que expressam uma região variável de uma única cadeia leve (ou que expressam cada uma ou ambas de duas regiões variáveis). Uma cadeia leve compreendendo a sequência variável é capaz de emparelhar com uma pluralidade de cadeias pesadas humanas maturadas por afinidade de maneira clonada selecionadas pelos camundongos, em que as regiões de cadeia pesada especificamente aglutinam epítopos diferentes.

[0014] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que compreende um único segmento de gene de região variável de cadeia leve (VL) da imunoglobulina humana que é capaz de rearranjar com um segmento de gene de J humano (selecionado de um ou uma pluralidade de segmentos JL) e codificar um domínio da VL humana de uma cadeia leve da imunoglobulina. Em um outro aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que compreende não mais do que dois segmentos de gene de VL humanas, cada um dos quais é capaz de rearranjar com um segmento de gene de J humano (selecionado de um ou uma pluralidade de segmentos JL) e codificando um domínio da VL humana de uma cadeia leve da imunoglobulina. Em algumas modalidades, os dois segmentos de gene da VL humana são justapostos no genoma do camundongo. Em algumas modalidades, os dois segmentos de gene da VL humana estão em locais diferentes (por exemplo, um heterozigoto, compreendendo um primeiro segmento da VL humana em um primeiro alelo de cadeia leve, e um segundo segmento da VL humana em um segundo alelo de cadeia leve, em que o primeiro e o segundo segmentos da VL humana não são idênticos) no genoma do camundongo. Em algumas modalidades, os dois segmentos de gene da VL humana são um segmento de gene fc XK3-39 humana e um segmento de gene fc XK5-20 humana. Em uma modalidade, o segmento de gene JL humana é ugngekqpcfq fq itwrq eqpukuVkpfq fg LK3. LK4. LK5. LK6. LK7. g eqoipc>õgu cqu pares dos mesmos. Em várias modalidades, um camundongo geneticamente engendrado fornecido é incapaz de expressar uma cadeia leve da imunoglobulina que contém um segmento de gene da VL endógeno. Por exemplo, em algumas modalidades, um camundongo geneticamente engendrado fornecido contém uma modificação genética que inativa e/ou remove parte ou todo de um segmento de gene da VL endógeno.

[0015] Em uma modalidade, o segmento de gene de VL humana único está operavelmente ligado a um segmento de gene de JL humano selecionado fg LK3. LK4. LK5. LK6. g LK7. go swg q ugiogpVq fg igpg fg XL humana único é capaz de rearranjar para formar uma sequência codificando uma região variável de cadeia leve gene com qualquer um do um ou mais segmentos de gene de JL humanos.

[0016] Em uma modalidade, um camundongo geneticamente modificado fornecido compreende um local da cadeia leve da imunoglobulina que não compreende um segmento de gene de VL de camundongo endógeno que é capaz de rearranjar para formar um gene da cadeia leve da imunoglobulina, em que o local da VL contém um único segmento de gene de VL humana que é capaz de rearranjar para codificar uma região da VL de um gene da cadeia leve. Em modalidades específicas, o segmento de gene de VL humana é um segmepvq fg igpg fg Xk3-5;Lk7 jwocpq qw wo ugiogpvq fg igpg fg Xk5-42Lk3 jwocpq0 Go cniwocu modalidades, um camundongo geneticamente modificado fornecido compreende um local da VL que não compreende um segmento de gene de VL de camundongo endógeno que é capaz de rearranjar para formar um gene da cadeia leve da imunoglobulina, em que o local da VL compreende não mais do que dois segmentos de gene de VL humanas que são capazes de rearranjar para codificar uma região da VL de um gene da cadeia leve. Em algumas de certas modalidades, os não mais do que dois segmentos de gene da VL humana são selecionados do grupo consistindo de um segmento de gene fg Xk3-39 humano, um segmento de igpg fg Xk5-20 humano, e uma combinação dos mesmos. Em algumas de certas modalidades, os não mais do que dois segmentos de gene da VL jwocpc u«q wo ugiogpvq fg igpg fg Xk3 -5;Lk7 jwocpq g wo ugiogpvq fg igpg fg Xk5-42Lk3 jwmano.

[0017] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que compreende uma região de cadeia leve variável (VL) da imunoglobulina humana rearranjada única (V/J) (isto é, uma região da VL/JL) que codifica um domínio da VL humana de uma cadeia leve da imunoglobulina. Em um outro aspecto, o camundongo compreende não mais do que duas regiões VL humanas rearranjadas que são capazes de codificar um domínio da VL humana de uma cadeia leve da imunoglobulina.

[0018] Em uma modalidade, a região da VL é uma seswêpekc fc XK3- 39/J jwocpc tgcttcpjcfc qw ugswêpekc fc XK5-20/J humana rearranjada. Em uma modalidade, o segmento de JL humano da sequência da VL/JL rearranjada fi ugngekqpcfq fg Lk3. Lk4. Lk5. Lk6. g Lk70 Go woc modalidade específica, a região da VL é uma ugswêpekc fq Xk3-5;Lk7 jwocpq qw ugswêpekc fq Xk5- 42Lk3 jwocpq0 Go woc modalidade específica, o camundongo tem tanto uma ugswêpekc fq Xk3-5;Lk7 jwocpq g ugswêpekc fq Xk5-42Lk3 jwocpq0

[0019] Em uma modalidade, o segmento de gene de VL humana está operavelmente ligado a uma sequência líder humana ou de camundongo. Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência líder de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência líder de camundongo é uma ugswêpekc nífgt fg XK5-7 de camundongo. Em uma modalidade específica, a sequência líder está operavelmente ligada a um segmento de gene de VL humana não rearranjado. Em uma modalidade específica, a sequência líder está operavelmente ligada a uma sequência da VL/JL humana rearranjada.

[0020] Em uma modalidade, o segmento de gene de VL está operavelmente ligado a uma sequência promotora da imunoglobulina. Em uma modalidade, a sequência promotora é uma sequência promotora humana. Em uma modalidade específica, o promotor da imunoglobulina humana é um rtqoqvqt fg Xk5-15 humano. Em uma modalidade específica, o promotor está operavelmente ligado a um segmento de gene de VL humana não rearranjado. Em uma modalidade específica, o promotor está operavelmente ligado a uma sequência da VL/JL humana rearranjada.

[0021] Em uma modalidade, o local da cadeia leve compreende uma ugswêpekc nífgt flcnswgcfc 5’ *com relação à direção transcricional de um segmento de gene de VL) com um promotor da imunoglobulina humana e flcnswgcfq" 5Ó" eqo" wo" ugiognvq" fg" igng" fg" XL humana que rearranja com um segmento de J humano e codifica um domínio da VL de uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo uma região constante de cadeia leve endógena de camundongo (CL). Em uma modalidade específica, o segmento de gene de VL guVá nq lqecl fc XK fg ecownfqniq, g q ecownfqniq EL é um ecownfqpiq EKO

[0022] Em uma modalidade, o local da cadeia leve compreende uma ugswênekc lífgt hlcnswgcfq 7Ó *com relação à direção transcricional de um segmento de gene de VL) com um promotor da imunoglobulina humana e hlcnswgcfq 5Ó eqo woc tgik«q fc XL humana rearranjada (sequência da VL/JL) e codifica um domínio da VL de uma cadeia leve quimérica reversa compreendendo uma região constante de cadeia leve endógena de camundongo (CL). Em uma modalidade específica, a sequência da VL/JL jwocnc tgcttcnlcfc guvá nq lqecl ecrc *K+ fg ecownfqniq. g q ecownfqniq CL fi wo ecownfqniq EK0

[0023] Em uma modalidade, o local da VL do camundongo oqfkhkecfc fi wo lqecl fc ecfgkc lgxg K. g q lqecl fc ecfgkc lgxg K eqortggnfg um camundongo intensificador intrônkeq K. wo intensificador 5Ó K fg camundongo, ou tanto um intensificador intrônico quanto um intensificador 5Ó0

[0024] Em uma modalidade, o camundongo compreende um local de cadeia leve de imunoglobulina lambda (n) não funcional. Em uma modalidade específica, o local de cadeia leve n compreende uma deleção de uma ou mais sequências do local, em que a uma ou mais deleções torna o local da cadeia leve n incapaz de rearranjar para formar um gene da cadeia leve. Em uma outra modalidade, todos ou substancialmente todos dos segmentos de gene de VL do local de cadeia leve n são deletados.

[0025] Em uma modalidade, o camundongo fabrica uma cadeia leve que compreende um domínio da VL somaticamente mutado derivado de um segmento de gene de VL humana. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende um domínio da VL somaticamente mutado derivado de um segmento de gene de VL jwocpc. g woc tgik«q EK fg ecowpfqpiqo Go woc modalidade, o camundongo não expressa uma cadeia leve n.

[0026] Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado é capaz de hipermutar somaticamente a sequência da VL da região humana. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma célula que compreende um gene da cadeia leve da imunoglobulina rearranjada derivado de um segmento de gene de VL humana que é capaz de rearranjar e codificar um domínio da VL, e o gene da cadeia leve da imunoglobulina rearranjada compreende um domínio da VL somaticamente mutado.

[0027] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma célula que expressa uma cadeia leve compreendendo um domínio da VL humana somaticamente mutado ligafq c wo ecowpfqpiq Ek. go swg c ecfgkc ngxg associa-se com uma cadeia pesada compreendendo um domínio da VH somaticamente mutado derivado de um segmento de gene de VH humana e em que a cadeia pesada compreende uma região constante da cadeia pesada de camundongo (CH). Em uma modalidade específica, a cadeia pesada compreende uma CH1 de camundongo, uma dobradiça de camundongo, uma CH2 de camundongo, e uma CH3 de camundongo. Em uma modalidade específica, a cadeia pesada compreende uma CH1 humana, uma dobradiça, uma CH2 de camundongo, e uma CH3 de camundongo.

[0028] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de segmentos de gene de VH de camundongo endógenos com um ou mais segmentos de gene de VH humana, em que os segmentos de gene de VH humana são operavelmente ligados a um gene da região CH de camundongo, tal que o camundongo rearranja os segmentos de gene de VH humana e expressa uma cadeia pesada da imunoglobulina quimérica reversa que compreende um domínio da VH humana e um CH de camundongo. Em uma modalidade, 90 a 100 % dos segmentos de gene de VH de camundongo não rearranjados são substituídos com pelo menos um segmento de gene de VH humana não rearranjado. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos dos segmentos de gene de VH de camundongo endógenos são substituídos com pelo menos um segmento de gene de VH humana não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 19, pelo menos 39, ou pelo menos 80 ou 81 segmentos de gene de VH humana não rearranjados. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 12 segmentos de gene de VH humana não rearranjados funcionais, pelo menos 25 segmentos de gene de VH humana não rearranjados funcionais, ou pelo menos 43 segmentos de gene de VH humana não rearranjados funcionais. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição de todos os segmentos DH e JH de camundongo com pelo menos um segmento da DH humano não rearranjado e pelo menos um segmento da JH humano não rearranjado. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento da DH humano não rearranjado é selecionado de 1-1, D1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, 7-27, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o pelo menos um segmento da JH humano não rearranjado é selecionado de 1, 2, 3, 4, 5, 6, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade específica, o um ou mais segmentos de gene de VH humana são selecionados de um segmento de gene de VH humana 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 25, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 459, 5-51, um 6-1, e uma combinação dos mesmos.

[0029] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma célula B que expressa uma proteína de aglutinação que especificamente aglutina um antígeno de interesse, em que a proteína de aglutinação compreende uma ecfgkc ngxg fgtkxcfc fg wo tgcttcpjq XK3-5;1LK7 jwocpq qw wo tgcttcpjq XK5-421LK3 jwocpq. g go swg c efinwnc eqortggpfg wo igpg fc ecfgkc pesada da imunoglobulina rearranjado derivado de um rearranjo de segmentos de gene de VH humana selecionados de um segmento de gene 1-69, 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, 4-59, e 5-51. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de VH humana são rearranjados com um segmento de gene de JH da cadeia pesada humano selecionado de 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de VH e JH humanas são rearranjados com um segmento de gene DH humano selecionado de 1-1, 1-7, 1-26, 2-8, 2-15, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, e 7-27. Em uma modalidade específica, o gene da cadeia leve tem 1, 2, 3, 4, ou 5 ou mais hipermutações somáticas.

[0030] Em uma modalidade, o camundongo compreende uma célula B que compreende uma sequência de gene rearranjada da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina compreendendo uma região da VH/DH/JH selecionada de 2-5/6-6/1, 2-5/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/7-27/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/3, 330/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 330/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 3-30/7-27/5, 3-30/7-27/6, 333/1-7/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 551/3-16/6, 5-51/5-5/3, 5-51/6-13/5, 3-53/1-1/4, 1-69/6-6/5, e 1-69/6-13/4. Em uma modalidade específica, a célula B expressa uma proteína de aglutinação compreendendo uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana fundida com uma região constante da cadeia pesada de camundongo, e uma região variável de cadeia leve da imunoglobulina humana fundida com uma região constante de cadeia leve de camundongo.

[0031] Em uma modalidade, a região da VL humana rearranjada é woc ugswêpekc fq XK3-5;LK7 jwocpq, g q ecowpfqpiq gzrtguuc woc ecfgkc leve quimérica reversa compreendendo (i) um domínio da VL derivado da sequência da VL/JL humana e (ii) uma CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) uma CH de camundongo e (ii) um domínio da VH humana somaticamente mutado derivado de um segmento de gene de VH humana selecionado de um dos segmentos de gene de VH humana 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 311, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, um 6-1, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade a CL fi woc EK fg ecowpfqpiqo Go woc modalidade específica, os segmentos de gene de VH humana são selecionados de um segmento de gene 2-5, 3-13, 3-23, 3-30, 4-59, 5-51, e 1-69. Em uma modalidade específica, o domínio da VH humana somaticamente mutado compreende uma sequência derivada de um segmento da DH selecionado de 1-1, 1-7, 2-8, 3-3, 3-10, 3-16, 3-22, 5-5, 5-12, 6-6, 6-13, e 7-27. Em uma modalidade específica, o domínio da VH humana somaticamente mutado compreende uma sequência derivada de um segmento da JH selecionado de 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Em uma modalidade específica, o domínio da VH humana somaticamente mutado é codificado por uma sequência da VH/DH/JH humana rearranjada selecionada de 2-5/6-6/1, 25/3-22/1, 3-13/6-6/5, 3-23/2-8/4, 3-23/3-3/4, 3-23/3-10/4, 3-23/6-6/4, 3-23/727/4, 3-30/1-1/4, 3-30/1-7/4, 3-30/3-3/4, 3-30/3-22/5, 3-30/5-5/2, 3-30/5-12/4, 3-30/6-6/1, 3-30/6-6/3, 3-30/6-6/4, 3-30/6-6/5, 3-30/6-13/4, 3-30/7-27/4, 330/7-27/5, 3-30/7-27/6, 4-59/3-16/3, 4-59/3-16/4, 4-59/3-22/3, 5-51/5-5/3, 169/6-6/5, e 1-69/6-13/4.

[0032] Em uma modalidade, a região da VL humana rearranjada é a ugswêpekc fq XK5-42LK3 jwocpq. g q ecowpfqpiq gzrtguuc woc ecfgkc ngxg quimérica reversa compreendendo (i) um domínio da VL derivado da sequência da VL/JL humana rearranjada, e (ii) uma CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) uma CH de camundongo, e (ii) uma VH humana somaticamente mutada derivada de um segmento de gene de VH humana selecionado de um dos segmentos de gene de VH humana 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, um 6-1, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade a CL fi woc EK fg ecowpfqpiqo Go woc modalidade específica, os segmentos de gene de VH humana são selecionados de um segmento de gene 3-30, 3-33, 3-53, 4-39, e 5-51. Em uma modalidade específica, o domínio da VH humana somaticamente mutado compreende uma sequência derivada de um segmento da DH selecionado de 1-1, 1-7, 1-26, 2-15, 3-3, 316, e 6-13. Em uma modalidade específica, o domínio da VH humana somaticamente mutado compreende uma sequência derivada de um segmento da JH selecionado de 3, 4, 5, e 6. Em uma modalidade específica, o domínio da VH humana somaticamente mutado é codificado por uma sequência da VH/DH/JH humana rearranjada selecionada de 3-30/1-1/4, 3-30/3-3/3, 3-33/17/4, 3-33/2-15/4, 4-39/1-26/3, 5-51/3-16/6, 5-51/6-13/5, e 3-53/1-1/4.

[0033] Em uma modalidade, o camundongo compreende tanto uma ugswêpekc fq XK3-5;LK7 jwocpq tgcttcpjcfc swanVq woc ugswêpekc fq XK5- 42Lk3 jwocpq tgcttcplcfc. g q ecowpfqpiq gzrtguuc woc ecfgkc ngxg quimérica reversa compreendendo (i) um domínio da VL derivado da sequência do Xk3-5;Lk7 jwocpq qw fc ugswêpekc fq Xk5-42Lk3 jwocpq. g (ii) uma CL de camundongo; em que a cadeia leve está associada com uma cadeia pesada quimérica reversa compreendendo (i) uma CH de camundongo, e (ii) um derivado da VH humana somaticamente mutado de um segmento de gene de VH humana selecionado de um dos segmentos de gene de VH humana 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, um 6-1, e uma combinação dos mesmos. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve que é somaticamente mutada. Em uma modalidade a CL fi woc Ek fg ecowpfqpiq0

[0034] Em uma modalidade, 90 a 100 % dos segmentos de gene de VH de camundongo endógenos não rearranjados são substituídos com pelo menos um segmento de gene de VH humana não rearranjado. Em uma modalidade específica, todos ou substancialmente todos dos segmentos de gene de VH de camundongo endógenos não rearranjados são substituídos com pelo menos um segmento de gene de VH humana não rearranjado. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 18, pelo menos 39, pelo menos 80, ou 81 segmentos de gene de VH humana não rearranjados. Em uma modalidade, a substituição é com pelo menos 12 segmentos de gene de VH humana não rearranjados funcionais, pelo menos 25 segmentos de gene de VH humana não rearranjados funcionais, ou pelo menos 43 segmentos de gene de VH humana não rearranjados.

[0035] Em uma modalidade, o camundongo geneticamente modificado é de uma cepa C57BL, em uma modalidade específica selecionado de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, e C57BL/Ola. Em uma modalidade específica, o camundongo geneticamente modificado é uma mistura de uma cepa 129 anteriormente mencionada e uma cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. Em uma outra modalidade específica, o camundongo é uma mistura das cepas 129 anteriormente mencionadas, ou uma mistura das cepas BL/6 anteriormente mencionadas. Em uma modalidade específica, a cepa 129 da mistura é uma cepa 129S6 (129/SvEvTac).

[0036] Em uma modalidade, o camundongo expressa um anticorpo quimérico reverso compreendendo uma cadeia leve que compreende um ecowpfqpiq EK g wo fqoipkq fc XL humana somaticamente mutado fgtkxcfq fg woc ugswêpekc fq XK3-5;LK7 jwocpq tgcttcpjcfq qw woc ugswêpekc fq XK5-42LK3 jwocpq tgcttanjcfq, g woc ecfgkc rgucfc swg compreende uma CH de camundongo e um domínio da VH humana somaticamente mutado derivado de um segmento de gene de VH humana selecionado de um dos segmentos de gene de VH humana 1-2, 1-8, 1-24, 1-69, 2-5, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 3-53, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, e um 6-1, em que o camundongo não expressa um anticorpo totalmente de camundongo e não expressa um anticorpo totalmente humano. Em uma modalidade o camundongo compreende um local da cadeia leve K Swg eqortggpfg woc uwduVkVwk>«q fg ugiogpVqu fg igpg fc ecfgkc ngxg K fg ecowpfqpiq gpf„igpqu eqo c ugswêpekc fq XK3-5;LK7 jwocpq tgcttanjcfq qw c ugswênekc fq XK5-42LK3 jwocnq tgcttanjcfq, g eqortggpfg woc substituição de todos ou substancialmente todos segmentos de gene de VH de camundongo endógenos com um repertório completo ou substancialmente completo de segmentos de gene de VH humana.

[0037] Em um aspecto, uma população de anticorpos específicos de antígeno derivados de um camundongo como aqui descritos é fornecida, em que os anticorpos compreendem um gene da cadeia leve derivado de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocnq qw wo tgcttcnlq fq Xk5-421Lk3 jwocnq, g em que os anticorpos compreendem um gene da cadeia pesada da imunoglobulina rearranjado derivado de um rearranjo de um segmento de gene de VH humana selecionado de um dos segmentos de gene 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 439, 4-59, 5-51, e um 6-1 da VH humana. Em uma modalidade, o um ou mais segmentos de gene de VH humana são rearranjados com um segmento de gene de JH da cadeia pesada humano selecionado de 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Em uma modalidade específica, a cadeia leve tem 1, 2, 3, 4, ou 5 ou mais hipermutações somáticas.

[0038] Em uma modalidade, a cadeia leve tem 1, 2, 3, ou 4 hipermutações somáticas. Em uma modalidade, o gene da cadeia leve tem 1 ou 2 mutações. Em várias modalidades, o gene da cadeia leve é capaz de incorrer mutações múltiplas ao longo da sua sequência.

[0039] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq XK3-5;1LK7 jwocpq g c ecfgkc ngxg Vgo rgnq ogpqu woc qw p«q ocku fq que quatro hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende pelo menos duas hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende pelo menos três hipermutações somáticas. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende pelo menos quatro hipermutações somáticas. Em uma modalidade específica, pelo menos uma tal mutação hipersomática está presente em uma ou mais regiões de estrutura (FWs) da cadeia leve. Em uma modalidade específica, pelo menos uma tal mutação hipersomática está presente em uma ou mais regiões determinadoras de complementaridade (CDRs) da cadeia leve. Em uma modalidade específica, pelo menos uma tal mutação hipersomática está presente em uma ou mais FWs e/ou uma ou mais CDRs da cadeia leve. Em várias modalidades, as regiões de estrutura são selecionadas da estrutura 1 (FW1), estrutura 2 (FW2), estrutura 3 (FW3), e/ou uma combinação das mesmas. Em várias modalidades, as CDRs são selecionadas de CDR1, CDR2, CDR3, e/ou uma combinação das mesmas.

[0040] Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende pelo menos uma mutação em uma ou mais FWs ou uma ou mais CDRs. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende pelo menos uma mutação em uma ou mais FWs e uma ou mais CDRs. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende pelo menos duas mutações em uma ou mais FWs e uma ou mais CDRs. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende pelo menos três mutações em uma ou mais FWs e uma ou mais CDRs. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende pelo menos quatro mutações em uma ou mais FWs e uma ou mais CDRs. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende pelo menos cinco ou mais do que cinco mutações em uma ou mais FWs e uma ou mais CDRs; em uma modalidade específica, a cadeia pesada compreende pelo menos cinco ou mais do que cinco mutações em duas FWs; em uma modalidade específica, a cadeia pesada compreende pelo menos cinco ou mais do que cinco mutações em uma FW e uma CDR.

[0041] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq XK3-5;1LK7 jwocpq g egtec fg 9 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK3- 5;1LK7 Vêo rgnq ogpqu woc owVc>«q rtgugpVg go HY3= go woc modalidade, pelo menos 9 % das cadeias leves compreendem uma mutação presente em FW1. Em uma modalidade, a cadeia leve é derivafc fg wo tgcttcplq fq Xk3- 5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 47 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk3 -5;1Lk7 têm pelo menos uma ou não mais do que duas mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 19 % das cadeias leves têm uma mutação presente na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 5 % das cadeias leves têm duas mutações presentes na CDR1.

[0042] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 42 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk3 - 5;1Lk7 vêo rgnq ogpqu woc qw p«q oais do que três mutações presentes em FW2; em uma modalidade, pelo menos 17 % das cadeias leves têm uma mutação presente em FW2; em uma modalidade, pelo menos 1 % das cadeias leves têm duas mutações presentes em FW2; em uma modalidade, pelo menos 1 % das cadeias leves têm três mutações presentes na FW2.

[0043] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 32 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk3 - 5;1LK7 Vêo rgnq ogpqu woc qw p«q ocku fq swg fwcu owVc>õgu rtgugpVgu pc CDR2; em uma modalidade, pelo menos 10 % das cadeias leves têm uma mutação presente na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 1 % das cadeias leves têm duas mutações presentes na CDR2.

[0044] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 4; ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk3 - 5;1Lk7 vêo pelo menos uma ou não mais do que quatro mutações presentes na FW3; em uma modalidade, pelo menos 21 % das cadeias leves têm uma mutação presente na FW3; em uma modalidade, pelo menos 5 % das cadeias leves têm duas mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 2 % das cadeias leves têm três mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 2 % das cadeias leves têm quatro mutações presentes em FW3.

[0045] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq XK3-5;1LK7 jwocpq g egtec fg 59 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK3- 5;1LK7 Vêo rgnq ogpqu woc qw p«q ocku fq swg swcVtq owVc>õgu rtgugpVgu pc CDR3; em uma modalidade, pelo menos 27 % das cadeias leves têm uma mutação presente na CDR3; em uma modalidade, pelo menos 8 % das cadeias leves têm duas mutações presentes na CDR3; em uma modalidade, pelo menos 1 % das cadeias leves têm três mutações presentes na CDR3; em uma modalidade, pelo menos 1 % das cadeias leves têm quatro mutações presentes na CDR3.

[0046] Em uma modalidade, uma população de anticorpos específicos de antígeno derivados de um camundongo como aqui descritos é fornecida, em que os anticorpos compreendem uma cadeia leve derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg ; ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk3 - 5;1LK7 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu go HY3. egtec fg 47 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK3-5;1LK7 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu na CDR1, cerca de 20 % das cadeias leves derkxcfcu fg Xk3-5;1Lk7 Vêo woc ou mais mutações presentes em FW2, cerca de 10 % das cadeias leves fgtkxcfcu fg XK3-5;1LK7 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu pc EFT2, egtec fg 4; ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk3-5;1Lk7 Vêo woc qw ocku mutações presentes em FW3, e cerca de 37 % das cadeias leves derivadas de XK3-5;1LK7 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu pc EFR5o

[0047] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 57 ' fcu ecfgkcu rgucfcu Vêo rgnq ogpqu uma mutação presente em FW1; em uma modalidade, pelo menos 25 % das cadeias pesadas têm uma mutação presente em FW1; em uma modalidade, pelo menos 9 % das cadeias pesadas têm duas mutações presentes em FW1; em uma modalidade, pelo menos 1 % das cadeias pesadas tem três mutações presentes em FW1; em uma modalidade, pelo menos 1 % das cadeias pesadas têm mais do que cinco mutações presentes em FW1.

[0048] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq XK3-5;1LK7 jwocpq g egtec fg 92 ' fcu ecfgkcu rgucfcu Vêo rgnq ogpqu uma ou não mais do que quatro mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 92 % das cadeias pesadas têm pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 26 % das cadeias pesadas têm uma mutação presente na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 44 % das cadeias pesadas têm duas mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 19 % das cadeias pesadas têm três mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 3 % das cadeias pesadas têm quatro mutações presentes na CDR1.

[0049] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 88 ' fcu ecfgkcu rgucfcu vêo rgnq ogpqu uma ou não mais do que três mutações presentes em FW2; em uma modalidade, pelo menos 66 % das cadeias pesadas têm pelo menos uma, pelo menos duas, ou pelo menos três mutações presentes em FW2; em uma modalidade, pelo menos 35 % das cadeias pesadas têm uma mutação presente em FW2; em uma modalidade, pelo menos 23 % das cadeias pesadas têm duas mutações presentes em FW2; em uma modalidade, pelo menos 8 % das cadeias pesadas têm três mutações presentes em FW2.

[0050] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 92 ' fcu ecfgkcu rgucfcu vêo rgnq ogpqu uma ou não mais do que quatro mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 70 % das cadeias pesadas têm pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 34 % têm uma mutação presente na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 20 % das cadeias pesadas têm duas mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 12 % das cadeias pesadas têm três mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 5 % das cadeias pesadas têm quatro mutações presentes na CDR2.

[0051] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq XK3-5;1LK7 jwocpq g egtec fg ;3 ' fcu ecfgkcu rgucfcu Vêo rgnq ogpqu uma ou até cinco ou mais mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 91 % das cadeias pesadas têm pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro, ou pelo menos cinco ou mais mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 19 % das cadeias pesadas têm uma mutação presente em FW3; em uma modalidade, pelo menos 33 % das cadeias pesadas têm duas mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 22 % das cadeias pesadas têm três mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 11 % das cadeias pesadas têm quatro mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 7 % das cadeias pesadas têm cinco ou mais mutações presentes em FW3.

[0052] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fq Xk3-5;1Lk7 jwocpq g egtec fg 85 ' fcu ecfgkcu rgucfcu vêo rgnq ogpqu uma ou não mais do que duas mutações presentes na CDR3; em uma modalidade, pelo menos 63 % das cadeias pesadas têm pelo menos uma mutação presente na CDR3; em uma modalidade, pelo menos 54 % das cadeias pesadas têm uma mutação presente na CDR3; em uma modalidade, pelo menos 9 % das cadeias pesadas têm duas mutações presentes na CDR3.

[0053] Em uma modalidade, uma população de anticorpos específicos de antígeno derivados de um camundongo como aqui descrito é fornecida, em que os anticorpos compreendem uma cadeia leve derivada de um rearranjo do Xk3-5;1Lk7 jwocpq g rgnq ogpqu 57 ' fcu ecfgkcu rgucfcu vêo woc qw ocku mutações presentes em FW1, cerca de 92 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes na CDR1, cerca de 66 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes em FW2, cerca de 70 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes na CDR2, cerca de 91 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes em FW3, e cerca de 63 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes na CDR3.

[0054] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg XK5-421LK3 jwocpq g q igpg fc ecfgkc ngxg Vgo rgnq ogpqu wo qw p«q mais do que duas hipermutações somáticas; em uma modalidade, o gene da cadeia leve tem pelo menos duas, pelo menos três, pelo menos quatro ou mais hipermutações somáticas. Em uma modalidade específica, as mutações estão presentes em uma ou mais regiões de estrutura da cadeia leve. Em uma modalidade específica, as mutações estão presentes em uma ou mais regiões de cadeia leve da CDR. Em uma modalidade específica, as mutações estão presentes em uma ou mais regiões de estrutura e/ou uma ou mais regiões de cadeia leve da CDR. Em várias modalidades, as regiões de estrutura são selecionadas da estrutura 1 (FW1), estrutura 2 (FW2), estrutura 3 (FW3), e/ou uma combinação dos mesmos.

[0055] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 32 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5- 421LK3 Vêo rgnq ogpqu woc owVc>«q rtgugpVg go HY3= go woc modalidade, pelo menos 10 % das cadeias leves têm uma mutação em FW1.

[0056] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 75 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5- 421LK3 Vêo rgnq ogpqu woc qw p«q ocku fq swg fwcu owVc>õgu rtgugpVgu pc CDR1; em uma modalidade, pelo menos 27 % das cadeias leves têm uma ou mais mutações na CDR1; em uma modalidade, cerca de 54 % das cadeias leves têm uma ou duas mutações presentes na CDR1.

[0057] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg XK5-421LK3 jwocpq g egtec fg 8 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK5- 421LK3 Vêo rgnq ogpqu woc qw p«q ocku fq swg fwcu owVc>õgu rtgugpVgu go FW2; em uma modalidade, pelo menos 6 % das cadeias leves têm pelo menos uma mutação presente em FW2; em uma modalidade, pelo menos 3 % das cadeias leves têm uma mutação presente em FW2; em uma modalidade, pelo menos 3 % das cadeias leves têm duas mutações presentes em FW2.

[0058] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g rgnq ogpqu egtec fg 5 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5-421Lk3 Vêo rgnq ogpqs uma mutação presente na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 3 % das cadeias leves têm uma mutação na CDR2.

[0059] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 39 ' qw ocku fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5-421Lk3 têm pelo menos uma ou não mais do que duas mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 20 % da cadeia leve têm uma mutação presente em FW3; em uma modalidade, pelo menos 17 % das cadeias leves têm duas mutações presentes em FW3.

[0060] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g rgnq ogpqu 65 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK5-421LK3 Vêo rgnq ogpqu woc owVc>«q rtgugpVg pc EFT5= go woc modalidade, pelo menos 43 % das cadeias leves têm uma mutação na CDR3.

[0061] Em uma modalidade, uma população de anticorpos específicos de antígeno derivados de um camundongo como aqui descritos é fornecida, em que os anticorpos compreendem uma cadeia leve derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 32 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5- 421LK3 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu go rgnq ogpqu, egtec fg 75 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK5-421LK3 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu pc EFT3, egtec fg 8 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5-421Lk3 têm uma ou mais mutações presentes em FW2, cerca de 3 % das cadeias leves fgtkxcfcu fg XK5-421LK3 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu pc EFT4. egtec fg 59 ' fcu ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK5-421LK3 Vêo woc qw ocku mutações presentes em FW3, e cerca de 43 % das cadeias leves derivadas de XK5-421LK3 Vêo woc qw ocku owVc>õgu rtgugpVgu pc EFR5o

[0062] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 65 ' fcu ecfgkcu rgucfcu Vêo rgnq ogpqu uma ou não mais do que duas mutações presentes em FW1; em uma modalidade, pelo menos 41 % das cadeias pesadas têm pelo menos uma mutação presente em FW1; em uma modalidade, cerca de 41 % das cadeias pesadas têm uma mutação presente em FW1; em uma modalidade, cerca de 2 % das cadeias pesadas têm duas mutações presentes em FW1.

[0063] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg ;4 ' fcu ecfgkcu rgucfcu Vêo rgnq ogpqu uma ou não mais do que quatro mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 43 % das cadeias pesadas têm pelo menos uma mutação presente na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 25 % das cadeias pesadas têm pelo menos duas mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 15 % das cadeias pesadas têm pelo menos 3 mutações presentes na CDR1; em uma modalidade, pelo menos 10 % das cadeias pesadas têm 4 ou mais mutações presentes na CDR1.

[0064] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 68 ' fcu ecfgkcu rgucfcu Vêo rgnq ogpqu uma ou não mais do que três mutações presentes em FW2; em uma modalidade, pelo menos 34 % das cadeias pesadas têm pelo menos uma mutação presente em FW2; em uma modalidade, pelo menos 10 % das cadeias pesadas têm duas ou mais mutações presentes em FW2; em uma modalidade, pelo menos 2 % das cadeias pesadas têm três ou mais mutações presentes em FW2.

[0065] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg XK5-421LK3 jwocpq g egtec de 84 % das cadeias pesadas têm pelo menos uma ou até cinco ou mais do que cinco mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 39 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 18 % das cadeias pesadas têm duas ou mais mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 21 % das cadeias pesadas têm três ou mais mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 3 % das cadeias pesadas têm quatro ou mais mutações presentes na CDR2; em uma modalidade, pelo menos 2 % das cadeias pesadas têm cinco ou mais mutações presentes na CDR2.

[0066] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg XK5-421LK3 jwocpq g egtec fg 92 ' fcu ecfgkcu rgucfcu Vêo rgnq ogpqu uma ou até cinco ou mais do que cinco mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 21 % das cadeias leves têm pelo menos uma mutação presente em FW3; em uma modalidade, pelo menos 20 % das cadeias pesadas têm pelo menos duas mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 13 % das cadeias pesadas têm pelo menos três mutações presentes em FW3; em uma modalidade, pelo menos 20 % das cadeias pesadas têm pelo menos quatro mutações em FW3; em uma modalidade, pelo menos 18 % das cadeias pesadas têm pelo menos 5 mutações em FW3.

[0067] Em uma modalidade, a cadeia leve é derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 9 ' fcu ecfgkcu rgucfcu vêo rgnq ogpqu uma mutação presente na CDR3; em uma modalidade, cerca de 7 % das cadeias pesadas têm uma mutação na CDR3.

[0068] Em uma modalidade, uma população de anticorpos específicos de antígeno derivados de um camundongo como aqui descritos é fornecida, em que os anticorpos compreendem uma cadeia leve derivada de um rearranjo fg Xk5-421Lk3 jwocpq g egtec fg 65 ' fcu ecfgkcu rgucfcs têm uma ou mais mutações presentes em FW1, cerca de 92 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes na CDR1, cerca de 46 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes em FW2, cerca de 84 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes na CDR2, cerca de 92 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes em FW3, e cerca de 7 % das cadeias pesadas têm uma ou mais mutações presentes na CDR3.

[0069] Em um aspecto, um camundongo que expressa uma cadeia leve da imunoglobulina de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina é fornecido, em que a sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina está presente na linha germinativa do camundongo, em que a cadeia leve da imunoglobulina compreende uma sequência humana variável. Em uma modalidade, a linha germinativa do camundongo compreende uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina que é derivada do mesmo segmento V e do mesmo segmento de J como todas as sequências de cadeia leve não substitutas presentes em cada célula B do camundongo que compreende uma sequência de cadeia leve rearranjada.

[0070] Em uma modalidade, a linha germinativa do camundongo carece de um segmento de gene de cadeia leve V não rearranjada funcional da imunoglobulina. Em uma modalidade, a linha germinativa do camundongo carece de um segmento de gene de cadeia leve J não rearranjada funcional da imunoglobulina.

[0071] Em uma modalidade, a linha germinativa do camundongo compreende não mais do que uma, não mais do que duas, ou não mais do que três sequências de cadeia leve (V/J) rearranjadas.

[0072] Em uma modalidade, a sequência V/J rearranjada compreende woc ugswêpekc fg ecfgkc ngxg Ko Go woc modalidade específica, a sequência fg ecfgkc ngxg K fi woc ugswêpekc fg ecfgkc ngxg K jwoanco Go woc modalidade gurgeífíec, c ugswênekc fg ecfgkc ngxg K fi ugngekqncfc fg woc sequência XK3-5;1L jwocpc. woc ugswêpekc XK5-20/J humana, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade específica, a sequência de ecfgkc ngxg K fi woc ugswênekc XK3-5;1LK7 jwocnq0 Go woc modalidade gurgeíhkec. c ugswêpeic fg ecfgic ngxg K fi woc ugswêpeic fg XK5-20/LK3 humano.

[0073] Em uma modalidade, o camundongo compreende ainda na sua linha germinativa uma sequência selecionada de um intensificador ipvt»pieq k 7Ó fg ecowpfqpiq com relação à sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina, um intensificador k 5Ó fe camundongo, e uma combinação dos mesmos.

[0074] Em uma modalidade, o camundongo compreende um segmento de gene de VH humana não rearranjada, um segmento de gene de DH humana não rearranjada, e um segmento de gene de JH humana não rearranjada, em que os ditos segmentos de gene de VH, DH, e JH são capazes de rearranjar para formar uma sequência de gene de Variável da cadeia pesada da imunoglobulina operavelmente ligada a uma sequência de gene constante da cadeia pesada. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma pluralidade de segmentos de gene de VH, DH, e JH humanas. Em uma modalidade específica, os segmentos de gene de VH, DH, e JH humanas substituem os segmentos de gene de VH, DH, e JH de camundongo endógenos no local da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo endógeno. Em uma modalidade específica, o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene de VH, DH, e JH de camundongo funcionais com todos ou substancialmente todos os segmentos de gene de VH, DH, e JH humanas funcionais.

[0075] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve da imunoglobulina que compreende uma sequência constante de camundongo. Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia leve da imunoglobulina que compreende uma sequência constante humana.

[0076] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia pesada da imunoglobulina que compreende uma sequência de camundongo selecionada de uma sequência CH1, uma sequência de dobradiça, uma sequência CH2, uma sequência CH3, e uma combinação das mesmas.

[0077] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma cadeia pesada da imunoglobulina que compreende uma sequência humana selecionada de uma sequência CH1, uma sequência de dobradiça, uma sequência CH2, uma sequência CH3, e uma combinação das mesmas.

[0078] Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo está em um local da cadeia leve da imunoglobulina de camundongo endógeno. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo substitui todas ou substancialmente todas as sequências de cadeia leve V e J de camundongo no local da cadeia leve da imunoglobulina de camundongo endógeno.

[0079] Em um aspecto, um camundongo é fornecido que compreende uma população de célula B caracterizada por cada célula B que compreende uma sequência de cadeia leve não substituta, sequência esta que compreende um gene de cadeia leve rearranjado que é gerado de um único segmento de gene de V humano e um único segmento de gene de J humano, em que a única sequência de cadeia leve variável na linha germinativa do camundongo é uma sequência rearranjada gerada do único segmento V humano e o único segmento de J humano, e em que cada célula B que compreende o gene de cadeia leve rearranjado compreende ainda um gene codificando um domínio variável da cadeia pesada humana cognata, e em que o gene de cadeia leve rearranjado compreende pelo menos uma, pelo menos duas, pelo menos três, ou pelo menos quatro hipermutações somáticas.

[0080] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido cuja população de célula B madura é caracterizada em que cada célula B madura compreende uma sequência de cadeia leve não substituta na sua superfície, sequência esta que compreende um gene de cadeia leve rearranjado que é gerado através do rearranjo de um de dois segmentos de gene da VL humana e um de não mais do que cinco segmentos de gene de JL humana, em que a única sequência de cadeia leve variável (sequência VLJL) na linha germinativa do camundongo é uma sequência rearranjada que é gerada através do rearranjo de um dos dois segmentos de gene da VL humana e um dos não mais do que cinco segmentos de gene JL humana, e em que cada célula B que compreende o gene de cadeia leve rearranjado compreende ainda um gene codificando um domínio variável cognato da cadeia pesada humana, e em que o gene de cadeia leve rearranjado compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, ou cinco ou mais hipermutações somáticas. Em algumas modalidades, um gene de cadeia leve rearranjado compreende um, dois, três, quatro, ou cinco hipermutações somáticas. Em algumas modalidades, camundongos como aqui descritos foram imunizados com um antígeno de interesse, e, em algumas modalidades, uma população de célula B madura é enriquecida com células B que aglutinam o antígeno de interesse.

[0081] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido cuja população de célula B madura é caracterizada em que cada célula B madura compreende uma sequência de cadeia leve não substituta na sua superfície, sequência esta que compreende um gene de cadeia leve rearranjado que é gerado através do rearranjo de um de dois segmentos de gene da VL humana e um de dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) segmentos de gene JL humana, em que os segmentos de gene da VL consistem essencialmente de dois segmentos de gene da VL que não são idênticos e o local da VL compreende dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) segmentos de gene JL humana, e em que cada célula B que compreende o gene de cadeia leve rearranjado compreende ainda um gene codificando um domínio variável cognato da cadeia pesada humana, e em que o gene de cadeia leve rearranjado compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, ou cinco ou mais hipermutações somáticas. Em algumas modalidades, um gene de cadeia leve rearranjado compreende um, dois, três, quatro, ou cinco hipermutações somáticas. Em algumas modalidades, camundongos como aqui descritos foram imunizados com um antígeno de interesse, e em algumas modalidades, uma população de célula B madura é enriquecida com células B que aglutinam o antígeno de interesse.

[0082] Em um aspecto, um derivado de célula pluripotente, pluripotente induzida, ou totipotente de um camundongo como aqui descrito é fornecido. Em uma modalidade específica, a célula é uma célula tronco embrionária de camundongo (ES).

[0083] Em um aspecto, um derivado de tecido de um camundongo como aqui descrito é fornecido. Em uma modalidade, o tecido é derivado de baço, linfonodo ou medula óssea de um camundongo como aqui descrito.

[0084] Em um aspecto, um núcleo derivado de um camundongo como aqui descrito é fornecido. Em uma modalidade, o núcleo é de uma célula diploide que não é uma célula B.

[0085] Em um aspecto, uma célula de camundongo é fornecida que é isolada de um camundongo como aqui descrito. Em uma modalidade, a célula é uma célula ES. Em uma modalidade, a célula é um linfócito. Em uma modalidade, o linfócito é uma célula B. Em uma modalidade, a célula B expressa uma cadeia pesada quimérica compreendendo um domínio variável derivado de um segmento de gene humano; e uma cadeia leve derivada de woc ugswêpekc fc XK3-5;1L jwocpc tgcttcnjcfc, ugswêpekc XK5-20/J humana rearranjada, ou uma combinação das mesmas; em que o domínio variável da cadeia pesada é fundida a uma região constante de camundongo e o domínio variável de cadeia leve é fundido a uma região constante de camundongo ou ser humano.

[0086] Em um aspecto, um hibridoma é fornecido, em que o hibridoma é feito com uma célula B de um camundongo como aqui descrito. Em uma modalidade específica, a célula B é de um camundongo como aqui descrito que foi imunizado com um imunógeno compreendendo um epítopo de interesse, e a célula B expressa uma proteína de aglutinação que aglutina o epítopo de interesse, a proteína de aglutinação tem um domínio da VH humana somaticamente mutado e uma CH de camundongo, e tem um domínio da VL jwocpc fgtkxcfq fg woc XK3-5;LK7 jwocpc tgcttcpjcfc qw woc XK5-42LK3 humana rearranjada e uma CL de camundongo.

[0087] Em um aspecto, um embrião de camundongo é fornecido, em que o embrião compreende uma célula ES doadora que é derivada de um camundongo como aqui descrito.

[0088] Em um aspecto, um vetor de alvejamento é fornecido, eqortggpfgpfq. fg 5’ rctc 5’ pc fktg>«q Vtcpuetkekqpcl eqo tefetêpekc §u ugswêpekcu fqu tcoqu fe jqoqlqikc 5’ e 5’ fe ecowpfqpiq fq xeVqt. wo tcoq fg jqoqnqikc 7Ó fg ecowpfqpiq. wo rtqoqvqt fc imunoglobulina de ser humano ou camundongo, uma sequência líder de ser humano ou de camundongo, e uma região da VL jwocpc ueleekqpcfc fe woc Xk3-5;Lk7 jwocpc tecttcplcfc qw woc Xk5-42Lk3 jwocpc tecttcplcfc. e wo tcoq fe jqoqlqikc 5" fe ecowpfqpiq0 Go woc modalidade, os ramos de homologia 7" e 5" clxelco q xevqt c woc ueswêpekc 7" com relação a uma sequência intensificadorc swe euVá rteuepVe 5’ e rt„zkoc cq iepe EK fe ecowpfqpiq. Em uma modalidade, o promotor é um promotor de segmento de gene de região variável da imunoglobulina humana. Em uma modalidade específica, o rtqoqvqt fi wo rtqoqvqt fe Xk5-15 humano. Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência líder de camundongo. Em uma modalidade eureeífíec, c ueswêpekc lifet fe ecowpfqpiq fi woc ueswêpekc lifet fe XK5-7 de camundongo.

[0089] Em um aspecto, um vetor de alvejamento é fornecido como descrito acima, mas no lugar fq tcoq fe jqoqlqikc 5’ fe ecowpfqpiq q rtqoqvqt fe uet jwocpq qw ecowpfqpiq fi hlcpswecfq 5’ eqo wo uivkq fe reconhecimento da recombinase específica de sítio (SRRS), e no lugar do tcoq"fg"jqoqnqikc"5Ó"fg"ecowpfqpiq"c"tgik«q"fc"XL jwocpc"fi"hncpswgcfc"5Ó com um SRRS.

[0090] Em um aspecto, um anticorpo quimérico reverso feito por um camundongo como aqui descrito, em que o anticorpo quimérico reverso compreende uma cadeia leve compreendendo uma VL humana e uma CL de camundongo, e uma cadeia pesada compreendendo uma VH humana e uma CH de camundongo.

[0091] Em um aspecto, um método para fabricar um anticorpo é fornecido, compreendendo expressar em uma única célula (a) uma primeira sequência de gene de VH de um camundongo imunizado como aqui descrito fundida com uma sequência de gene da CH humana; (b) uma sequência de gene de VL de camundongo imunizado como aqui descrito fundida com uma sequência de gene da CL humana; e, (c) manter a célula sob condições suficientes para expressar um anticorpo totalmente humano, e isolar o anticorpo. Em uma modalidade, a célula compreende uma segunda sequência de gene de VH de um segundo camundongo imunizado como aqui descrito fundida com uma sequência de gene da CH humana, a primeira sequência de gene de VH codifica um domínio VH que reconhece um primeiro epítopo, e a segunda sequência de gene de VH codifica um domínio da VH que reconhece um segundo epítopo, em que o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos.

[0092] Em um aspecto, um método para fabricar uma proteína de aglutinação de epítopo é fornecida, compreendendo expor um camundongo como aqui descrito com um imunógeno que compreende um epítopo de interesse, mantendo o camundongo sob condições suficientes para o camundongo gerar uma molécula de imunoglobulina que especificamente aglutina o epítopo de interesse, e isolar a molécula de imunoglobulina que especificamente aglutina o epítopo de interesse; em que a proteína de aglutinação de epítopo compreende uma cadeia pesada que compreende uma VH humana somaticamente mutada e uma CH de camundongo, associada com uma cadeia leve compreendendo uma CL de camundongo e uma VL humana fgtkxcfc fg woc XK3-5;LK7 jwocpc tgcttcpjcfc qw woc XK5-42LK3 jwocpc rearranjada.

[0093] Em um aspecto, uma célula que expressa uma proteína de aglutinação de epítopo é fornecida, em que a célula compreende: (a) uma sequência de nucleotídeo humana codificando um domínio da VL humana que fi fgtkxcfc fg woc Xk3-5;Lk7 jwocpc tgcttcplcfc qw woc Xk5-42Lk3 humana rearranjada, em que a sequência de nucleotídeo humana é fundida (diretamente ou atr5avés de um ligador) a uma sequência de cDNA do domínio constante da cadeia leve da imunoglobulina humana (por exemplo, woc ugswêpekc fg FPC fq fqoipkq eqpuVcpVg K jwocpq+= g. *d+ woc rtkogktc sequência de nucleotídeo da VH humana codificando um domínio da VH humana derivado de uma primeira sequência de nucleotídeo da VH humana, em que a primeira sequência de nucleotídeo da VH humana é fundida (diretamente ou através de um ligador) a uma sequência de cDNA do domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana; em que a proteína de aglutinação de epítopo reconhece um primeiro epítopo. Em uma modalidade, a proteína de aglutinação de epítopo aglutina o primeiro epítopo com uma constante de dissociação de mais baixo do que 10-6 M, mais baixo do que 10-8 M, mais baixo do que 10-9 M, mais baixo do que 10-10 M, mais baixo do que 10-11 M, ou mais baixo do que 10-12 M.

[0094] Em uma modalidade, a célula compreende uma segunda sequência de nucleotídeo humana codificando um segundo domínio da VH humana, em que a segunda sequência humana é fundida (diretamente ou através de um ligador) a uma sequência de cDNA do domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana, e em que o segundo domínio da VH humana não reconhece especificamente o primeiro epítopo (por exemplo, demonstra uma constante de dissociação, por exemplo, de 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, ou mais alta), e em que a proteína de aglutinação de epítopo reconhece o primeiro epítopo e o segundo epítopo, e em que a primeira e a segunda cadeias pesadas de imunoglobulina cada uma associa-se com uma cadeia leve idêntica de (a).

[0095] Em uma modalidade, o segundo domínio da VH aglutina o segundo epítopo com uma constante de dissociação que é mais baixa do que 10-6 M, mais baixa do que 10-7 M, mais baixa do que 10-8 M, mais baixa do que 10-9 M, mais baixa do que 10-10 M, mais baixa do que 10-11 M, ou mais baixa do que 10-12 M.

[0096] Em uma modalidade, a proteína de aglutinação de epítopo compreende uma primeira cadeia pesada da imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada da imunoglobulina, cada uma associada com uma cadeia leve idêntica derivada de uma região da VL humana rearranjada selecionada de uma XK3-5;LK7 jwocpc qw woc XK5-42LK3 jwocpc. go swg c rtkogktc cadeia pesada da imunoglobulina aglutina um primeiro epítopo com uma constante de dissociação na faixa nanomolar à picomolar, a segunda cadeia pesada da imunoglobulina aglutina um segundo epítopo com uma constante de dissociação na faixa nanomolar à picomolar, o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos, a primeira cadeia pesada da imunoglobulina não aglutina o segundo epítopo ou aglutina o segundo epítopo com uma constante de dissociação mais fraca do que a faixa micromolar (por exemplo, na faixa milimolar), a segunda cadeia pesada da imunoglobulina não aglutina o primeiro epítopo ou aglutina o primeiro epítopo com uma constante de dissociação mais fraca do que a faixa micromolar (por exemplo, a faixa milimolar), e uma ou mais da VL, da VH da primeira cadeia pesada da imunoglobulina, e da VH da segunda cadeia pesada da imunoglobulina, são somaticamente mutadas.

[0097] Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada da imunoglobulina compreende um resíduo de aglutinação da proteína A, e a segunda cadeia pesada da imunoglobulina carece do resíduo de aglutinação da proteína A.

[0098] Em uma modalidade, a célula é selecionada de CHO, COS, 293, HeLa, e uma célula retinal que expressa uma sequência de ácido nucléico viral (por exemplo, uma célula PERC.6®).

[0099] Em um aspecto, um anticorpo quimérico reverso é fornecido, compreendendo uma VH humana e um domínio constante da cadeia pesada de camundongo, uma VL humana e um domínio constante da cadeia leve de camundongo, em que o anticorpo é feito por um processo que compreende imunizar um camundongo como aqui descrito com um imunógeno compreendendo um epítopo, e o anticorpo especificamente aglutina o epítopo do imunógeno com o qual o camundongo foi imunizado. Em uma modalidade, o domínio da VL é somaticamente mutado. Em uma modalidade o domínio da VH é somaticamente mutado. Em uma modalidade, tanto o domínio da VL quanto o domínio da VH são somaticamente mutados. Em uma modalidade, a VL é ligafc c wo fqoípkq fc EK fg ecowpdongo.

[00100] Em um aspecto, um camundongo é fornecido, compreendendo segmentos de gene de VH humana substituindo todos ou substancialmente todos os segmentos de gene de VH de camundongo no local da cadeia pesada endógeno do camundongo; não mais do que uma ou duas sequências da cadeia leve VL/JL jwocpc tgcttcplcfcu ugngekqpcfcu fg woc Xk3-39/J tgcttcplcfc g woc Xk5-20/J rearranjada ou uma combinação das mesmas, substituindo todos os segmentos de gene da cadeia leve de camundongo; em que os segmentos de gene da cadeia pesada variável humana são ligados a um gene constante de camundongo, e as sequências de cadeia leve humana rearranjadas são ligadas a um gene constante de ser humano ou camundongo.

[00101] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo segmentos de gene da VH da imunoglobulina humana substituindo todos ou substancialmente todos os segmentos de gene da VH da imunoglobulina de camundongo no local da cadeia peada da imunoglobulina endógena de camundongo; não mais do que dois segmentos de gene da VL da imunoglobulina humana não rearranjados e dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4 ou 5) segmentos de gene JL da imunoglobulina humana não rearranjados ou cinco segmentos de gene JL da imunoglobulina humana, substituindo todos os segmentos de gene da cadeia leve da imunoglobulina ; em que os segmentos de gene da VH da imunoglobulina humana são ligados a um gene constante da imunoglobulina de camundongo, e os segmentos de gene da VL e JL da imunoglobulina humana não rearranjados são ligados a um gene constante da imunoglobulina humana ou não humana. Em algumas modalidades, um gene constante não humano é um gene constante da imunoglobulina de camundongo. Em algumas modalidades, um gene constante da imunoglobulina não humana é um gene constante da imunoglobulina de rato.

[00102] Em um aspecto, uma célula ES de camundongo compreendendo uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene da cadeia pesada variável de camundongo com segmentos de gene da cadeia pesada variável humana, e não mais do que uma ou duas sequências da cadeia leve VL/JL humana rearranjadas, em que os segmentos de gene da cadeia pesada variável humana são ligados a um gene constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo, e as sequências da cadeia leve VL/JL humana rearranjadas são ligadas a um gene da cadeia leve constante da imunoglobulina de camundongo ou ser humano. Em uma modalidade específica, o gene da cadeia leve constante é um gene constante de camundongo.

[00103] Em algumas modalidades, uma célula ES de camundongo é fornecida, compreendendo uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene da VH da imunoglobulina de camundongo com segmentos de gene da VH da imunoglobulina humana e não mais do que dois segmentos de gene da VL da imunoglobulina humana não rearranjados e dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) segmentos de gene JL da imunoglobulina humana não rearranjados, em que os segmentos de gene da VH da imunoglobulina humana são ligados a um gene constante da cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo, e os segmentos de gene da VL e JL da imunoglobulina humana não rearranjados são ligados a um gene constante da cadeia leve da imunoglobulina não humana ou humana. Em algumas de certas modalidades, o gene constante da cadeia leve da imunoglobulina não humana é um gene constante da imunoglobulina de camundongo. Em algumas de certas modalidades, o camundongo compreende cinco segmentos de gene JL da imunoglobulina não rearranjados.

[00104] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que pelo menos um, e em algumas modalidades todos, os segmentos de gene da VL de camundongo são substituídos por um segmento de gene da VL humana ou não mais do que dois segmentos de gene da VL humana. Em algumas modalidades, os segmentos de gene da VL humana de um camundongo são capazes de rearranjar para um de dois ou mais segmentos de gene JL humana para codificar um domínio da VL da imunoglobulina de um anticorpo. Em algumas modalidades, o(s) segmento(s) de gene da VL humana de um local de cadeia leve de um camundongo como aqui descrito é/são operavelmente ligado(s) a dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro, ou cinco) segmentos de gene JL humana.

[00105] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo não contém uma sequência de nucleotídeo antes do rearranjo que codifica um segmento de gene da VL endógeno. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo não contém uma sequência de nucleotídeo antes do rearranjo que codifica um segmento de gene JL endógeno. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo não contém um nucleotídeo antes do rearranjo que codifica os segmentos de gene de VL e JL endógenos.

[00106] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo não contém uma sequência de nucleotídeo depois do rearranjo que codifica um segmento de gene da VL endógeno. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo não contém uma sequência de nucleotídeo depois do rearranjo que codifica um segmento de gene JL endógeno. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo não contém uma sequência de nucleotídeo depois do rearranjo que codifica os segmentos de gene de VL e JL endógenos.

[00107] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que a mesma contém não mais do que dois segmentos de gene da VL humana e dois ou mais (por exemplo, dois, três, quatro ou cinco) segmentos de gene JL humana antes do rearranjo. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo contém não mais do que dois segmentos de gene da VL humana e cinco segmentos de gene JL humana antes do rearranjo.

[00108] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo contém não mais do que dois segmentos de gene da VL humana e cinco ou menos (por exemplo, 5, 4, 3, 2, ou 1) segmentos de gene JL humana depois do rearranjo. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo contém não mais do que dois segmentos de gene da VL humana e um, dois, três, quatro, ou cinco segmentos de gene JL humana depois do rearranjo.

[00109] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo contém um segmento de gene da VL humana e cinco ou menos (por exemplo, 5, 4, 3, 2, ou 1) segmentos de gene JL humana depois do rearranjo. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo contém um segmento de gene da VL humana e um, dois, três, quatro, ou cinco segmentos de gene JL humana depois do rearranjo.

[00110] Em várias modalidades, os segmentos de gene da VL e JL jwocpcu u«q ugiogpVqu fg igpg fc XK g LK jwocpcUo Go xátkcu modalidades, qu ugiogpVqu fc XK jwocpc u«q ugngekqpcfqu fg wo ugiogpVq fg igpg XK3 - 5; jwocpq g wo ugiogpvq fg igpg Xk5-20 humano. Em algumas modalidades. qu ugiogpvqu fc Xk jwocpc u«q Xk3-39 humapqu g Xk5-20 humanos. Em algumas modalidades. qu ugiogpvqu fc Lk jwocpc u«q ugngekqpcfqu fg wo ugiogpvq fg igpg Lk3. Lk4. Lk5. Lk6. Lk7. g woc combinação dos mesmos. Em algumas modalidades. qu ugiogpvqu fg igpg Lk jwocpc u«q Lk3. Lk4. Lk5. Lk6. g Lk7 jwocpos.

[00111] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é diferente daquela da estrutura de referência da FIG. 19 em que o mesmo contém uma estrutura que é substancialmente a mesma como aquela da estrutura da FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3, ou FIG. 9 antes do rearranjo. Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido, compreendendo um local de cadeia leve cuja estrutura é idêntica à estrutura da FIG. 1, FIG. 2, FIG. 3 ou FIG. 9 antes do rearranjo.

[00112] Em um aspecto, uma proteína de aglutinação de antígeno fabricada por um camundongo como aqui descrito é fornecida. Em uma modalidade específica, a proteína de aglutinação de antígeno compreende uma região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana fundida com uma região constante de camundongo, e uma região variável de cadeia leve da kowpqinqdwnkpc jwocpc fgtkxcfc fg wo ugiogpVq fg igpg fg XK3-39 ou um ugiogpVq fg igpg fg XK5-20, em que a região constante de cadeia leve é uma região constante de camundongo.

[00113] Em um aspecto, uma proteína de aglutinação de antígeno totalmente humana fabricada a partir de uma sequência de gene da região variável da imunoglobulina de um camundongo como aqui descrito é fornecida, em que a proteína de aglutinação de antígeno compreende uma cadeia pesada totalmente humana compreendendo uma região variável humana derivada de uma sequência de um camundongo como aqui descrito, e uma cadeia leve totalmente humana compreendendo uma Xk3-39 ou uma Xk5-20. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve compreende de uma a cinco mutações somáticas. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve é uma região variável de cadeia leve cognata que é emparelhada em uma célula B do camundongo com a região variável da cadeia pesada.

[00114] Em uma modalidade, a proteína de aglutinação de antígeno totalmente humana compreende uma primeira cadeia pesada e uma segunda cadeia pesada, em que a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada compreendem regiões variáveis não idênticas independentemente derivadas de um camundongo como aqui descrito, e em que cada uma da primeira e segunda cadeias pesadas expressa a partir de uma célula hospedeira associada com uma cadeia leve humana derivada de um sgiogpVq fg igpg fg XK3-39 qw wo ugiogpVq fg igpg fg XK5-20. Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada compreende uma primeira região variável de cadeia pesada que especificamente aglutina um primeiro epítopo de um primeiro antígeno, e a segunda cadeia pesada compreende uma segunda região variável de cadeia pesada que especificamente aglutina um segundo epítopo de um segundo antígeno. Em uma modalidade específica, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são diferentes. Em uma modalidade específica, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são os mesmos, e o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos; em uma modalidade específica, a aglutinação do primeiro epítopo por uma primeira molécula da proteína de aglutinação não bloqueia a aglutinação do segundo epítopo por uma segunda molécula da proteína de aglutinação.

[00115] Em um aspecto, uma proteína de aglutinação totalmente humana derivada de uma sequência da imunoglobulina humana de um camundongo como aqui descrito compreende uma primeira cadeia pesada da imunoglobulina e uma segunda cadeia pesada da imunoglobulina, em que a primeira cadeia pesada da imunoglobulina compreende uma primeira região variável que não é idêntica a uma região variável da segunda cadeia pesada da imunoglobulina, e em que a primeira cadeia pesada da imunoglobulina compreende um determinante de aglutinação da proteína A do tipo selvagem, e a segunda cadeia pesada carece de um determinante de aglutinação da proteína A do tipo selvagem. Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada da imunoglobulina aglutina a proteína A sob condições de isolação, e a segunda cadeia pesada da imunoglobulina não aglutina a proteína A ou aglutina a proteína A pelo menos 10 vezes, cem vezes, ou mil vezes mais fraca do que a primeira cadeia pesada da imunoglobulina aglutina a proteína A sob condições de isolação. Em uma modalidade específica, a primeira e a segunda cadeias pesadas são isótipos IgG1, em que a segunda cadeia pesada compreende uma modificação selecionada de 95R (EU 435R), 96F (EU 436F), e uma combinação das mesmas, e em que a primeira cadeia pesada carece de tal modificação.

[00116] Em um aspecto, um método para fabricar uma proteína de aglutinação de antígeno biespecífica é fornecido, compreendendo expor um primeiro camundongo como aqui descrito a um primeiro antígeno de interesse que compreende um primeiro epítopo, expor um segundo camundongo como aqui descrito a um segundo antígeno de interesse que compreende um segundo epítopo, permitindo que o primeiro e o segundo camundongo cada um monte respostas imunes aos antígenos de interesse, identificando no primeiro camundongo uma primeira região variável da cadeia pesada humana que aglutina o primeiro epítopo do primeiro antígeno de interesse, identificando no segundo camundongo uma segunda região variável de cadeia pesada humana que aglutina o segundo epítopo do segundo antígeno de interesse, fabricando um gene da primeira cadeia pesada totalmente humana que codifica uma primeira cadeia pesada que aglutina o primeiro epítopo do primeiro antígeno de interesse, fabricando um gene da segunda cadeia pesada totalmente humana que codifica uma segunda cadeia pesada que aglutina o segundo epítopo do segundo antígeno de interesse, que expressa a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada em uma célula que expressa uma úpkec ecfgkc ngxg VqVclogpVg jwocpc fgtkxcfc fg woc XK3-39 humano ou um ugiogpVq fg igpg fg XK5-20 humano para formar uma proteína de aglutinação de antígeno biespecífica, e isolar a proteína de aglutinação de antígeno biespecífica.

[00117] Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundo antígeno não são idênticos.

[00118] Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são idênticos, e o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos. Em uma modalidade, a aglutinação da primeira região variável da cadeia pesada ao primeiro epítopo não bloqueia a aglutinação da segunda região variável da cadeia pesada ao segundo epítopo.

[00119] Em uma modalidade, a cadeia leve humana quando emparelhada com a primeira cadeia pesada especificamente aglutina o primeiro epítopo do primeiro antígeno e quando emparelhada com a segunda cadeia pesada especificamente aglutina o segundo epítopo do segundo antígeno.

[00120] Em uma modalidade, o primeiro antígeno é selecionado de um antígeno solúvel e um antígeno de superfície de célula (por exemplo, um antígeno de tumor), e o segundo antígeno compreende um receptor de superfície de célula. Em uma modalidade específica, o receptor de superfície de célula é um receptor da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o receptor da imunoglobulina é um receptor de Fc. Em uma modalidade, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são os mesmos receptores de superfície de célula, e aglutinação da primeira cadeia pesada ao primeiro epítopo não bloqueia a aglutinação da segunda cadeia pesada ao segundo epítopo.

[00121] Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia leve da cadeia leve compreende de 2 a 5 mutações somáticas. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia leve é uma cadeia leve somaticamente mutada cognata expressada em uma célula B do primeiro ou do segundo camundongo imunizado com o primeiro ou o segundo domínios variáveis da cadeia pesada. Em uma modalidade, a cadeia leve da célula compreende uma sequência da linha germinativa.

[00122] Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada totalmente humana carrega uma modificação de aminoácido que reduz a sua afinidade com a proteína A, e a segunda cadeia pesada totalmente humana não compreende uma modificação que reduza a sua afinidade com a proteína A.

[00123] Em um aspecto, um método de preparar um anticorpo biespecífico que especificamente aglutina a um primeiro e um segundo antígeno é fornecido, em que o método compreende (a) identificar uma primeira sequência de ácido nucléico que codifica um primeiro domínio da cadeia pesada variável humana (VH) que é específica para o primeiro antígeno; (b) identificar uma segunda sequência de ácido nucléico que codifica um segundo domínio da cadeia pesada variável (VH) humana que é específico para o segundo antígeno; (c) fornecer uma terceira sequência de ácido nucléico que codifica uma região da cadeia leve variável (VL) humana que, quando emparelhada com a região VH de (a) especificamente aglutina o primeiro antígeno, e quando emparelhada com a região VH de (b) especificamente aglutina o segundo antígeno; (d) cultivar uma célula hospedeira compreendendo a primeira, segunda, e terceira sequências de ácido nucléico para permitir a expressão da primeira e segunda regiões de VH humana e a região da VL humana para formar o anticorpo biespecífico; e (d) recuperar o dito anticorpo biespecífico. Em vários aspectos, o primeiro e segundo antígenos são diferentes um do outro. Em vários aspectos a primeira e segunda sequências de ácido nucléico são isoladas de um camundongo imunizado que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina, em que a sequência da imunoglobulina rearranjada está na linha germinativa do camundongo.

[00124] Em uma modalidade, a região da VL humana é derivada de uma sequência de cadeia leve humana rearranjada compreendendo um ugiogpVq fg igpg fg XK3-5; jwocpq qw wo ugiogpVq fg igpg fg XK5-20 humano. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve humana rearranjada é uma sequência da linha germinativa (isto é, não compreende uma hipermutação somática dentro da sequência de segmento de gene de V).

[00125] Em uma modalidade, a terceira sequência de ácido nucléico é isolada de um camundongo que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina compreende um segmento de gene de VK3-5; jwocpq qw fc XK5-20 humano. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve rearranjada da kowpqinqdwnkpc" eqortggpfg" wo" ugiogpvq"fg" igpg" fg" Xk3-39 humano. Em uma modalidade, a região da VL da imunoglobulina humana é expressada a partir de um local da cadeia leve modificada da imunoglobulina endógeno.

[00126] Em uma modalidade, o primeiro e segundo antígenos estão presentes em uma molécula. Em uma modalidade, o primeiro e segundo antígenos estão presentes em moléculas diferentes. Em várias modalidades, a primeira ou segunda sequências de ácido nucléico compreendem uma modificação que reduz a afinidade da cadeia pesada codificado para a proteína A.

[00127] Em uma modalidade, a primeira ou segunda sequências de ácido nucléico compreendem uma sequência da região variável da cadeia pesada humana rearranjada compreendendo um segmento de gene de cadeia pesada humana selecionada de VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1- 46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3- 13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5- 51, e VH6-1. Em uma modalidade específica, o segmento de gene de cadeia pesada é VH2-5, VH3-23 ou VH3-30.

[00128] Em um aspecto, um método de preparar um anticorpo biespecífico que especificamente se aglutina a um primeiro e um segundo antígenos é fornecido, em que o método compreende (a) identificar uma primeira sequência de ácido nucléico que codifica um primeiro domínio da cadeia pesada variável (VH) humana que é específica para o primeiro antígeno; (b) identificar uma segunda sequência de ácido nucléico que codifica um segundo domínio da cadeia pesada variável (VH) humana que é específica para o segundo antígeno; (c) fornecendo uma terceira sequência de ácido nucléico que codifica uma região da cadeia leve variável (VL) humana fgtkxcfc fg woc XK3-5; jwocpq qw ugiogpVq fg igpg fg XK5-20 humano que, quando emparelhados com a região da VH de (a) especificamente aglutina o primeiro antígeno, e quando emparelhada com a região da VH de (b) especificamente se aglutina ao segundo antígeno; (d) cultivar uma célula hospedeira compreendendo a primeira, segunda, e terceira sequências de ácido nucléico para permitir a expressão da primeira e segunda regiões da VH humana e a região da VL humana para formar o anticorpo biespecífico; e (d) recuperar o dito anticorpo biespecífico. Em vários aspectos, o primeiro e segundo antígenos são diferentes um do outro. Em vários aspectos, a primeira e segunda sequências de ácido nucléico são isoladas de um camundongo imunizado que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana a partir fg woc ugswêpekc fc kowpqinqdwnkpc tgartcpjcfc swg fi fgtkxcfc fg woc XK3 - 5; jwocpq qw ugiogpvq fg igpg fg Xk5-42 jwocpq. go swg c Xk3-39 humano reartcplcfq qw ugiogpvq fg igpg fg Xk5-30 está na linha germinativa do camundongo.

[00129] Em uma modalidade, a terceira sequência de ácido nucléico é uma sequência da linha germinativa (isto é, não compreende uma hipermutação somática dentro da sequência do segmento de gene de V). Em uma modalidade, a terceira sequência de ácido nucléico é isolada do camundongo que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana fgtkxcfc fg woc Xk3-5; jwocpq qw ugiogpvq fg igpg fg Xk5-20 humano de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade específica, a terceira sequência de ácido nucléico compreende de duas a cinco hipermutações somáticas em uma região determinadora de complementaridade (CDR) e/ou uma região de estrutura (FWR). Em uma modalidade, a região da VL da imunoglobulina humana é expressada a partir de um local da cadeia leve da imunoglobulina endógena modificada.

[00130] Em uma modalidade, o primeiro e segundo antígenos estão presentes em uma molécula. Em uma modalidade, o primeiro e segundo antígenos estão presentes em moléculas diferentes. Em uma modalidade, a primeira ou segunda sequências de ácido nucléico compreendem uma modificação que reduz a afinidade da cadeia pesada codificada para a proteína A.

[00131] Em uma modalidade, a primeira ou segunda sequências de ácido nucléico compreendem uma sequência da região variável da cadeia pesada humana rearranjada compreendendo um segmento de gene de cadeia pesada humana selecionado de VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1- 46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3- 13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5- 51, e VH6-1. Em uma modalidade específica, o segmento de gene de cadeia pesada é VH2-5, VH3-23 ou VH3-30.

[00132] Em um aspecto, um método para fabricar um anticorpo biespecífico é fornecido, compreendendo expor um camundongo como aqui descrito a um antígeno de interesse, permitindo que o camundongo monte uma resposta imune para o antígeno de interesse, identificando uma primeira região variável da cadeia pesada humana que aglutina um primeiro epítopo do antígeno de interesse, identificando uma segunda região variável da cadeia pesada humana que aglutina um segundo epítopo do antígeno de interesse, fabricando um primeiro gene da cadeia pesada totalmente humana que codifica a primeira cadeia pesada que aglutina o primeiro epítopo do antígeno de interesse, fabricando um gene da segunda cadeia pesada totalmente humana que codifica uma segunda cadeia pesada que aglutina o segundo epítopo do antígeno de interesse, que expressa a primeira cadeia pesada e a segunda cadeia pesada em uma célula que expressa uma única cadeia leve VqVcnogpVg jwocpc fgtkxcfc fg woc XK3-39 humano ou um segmento de igpg fg XK5-20 humano para formar um anticorpo biespecífico, e isolar a proteína de aglutinação de antígeno biespecífica.

[00133] Em uma modalidade, o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos. Em uma modalidade, a aglutinação da primeira região variável da cadeia pesada ao primeiro epítopo não bloqueia a aglutinação da segunda região variável da cadeia pesada ao segundo epítopo. Em uma modalidade, a primeira e segunda cadeias pesadas são capazes de aglutinar o primeiro e segundo epítopos simultaneamente.

[00134] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico aglutina o primeiro e segundo epítopos simultaneamente. Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico aglutina o primeiro epítopo e segundo epítopo independentemente.

[00135] Em uma modalidade, a resposta de aglutinação do anticorpo biespecífico ao antígeno é de cerca de 2 vezes mais alta do que a resposta de aglutinação da primeira região variável da cadeia pesada ao antígeno. Em uma modalidade, a resposta de aglutinação do anticorpo biespecífico ao antígeno é de cerca de 2 vezes mais alta do que a resposta de aglutinação da segunda região variável da cadeia pesada ao antígeno. Em uma modalidade, a resposta de aglutinação do anticorpo biespecífico ao antígeno é aproximadamente a mesma como, ou aproximadamente igual à resposta de aglutinação da primeira região variável da cadeia pesada e/ou da segunda região variável da cadeia pesada ao antígeno.

[00136] Em uma modalidade, o antígeno é selecionado de um antígeno solúvel, um antígeno de superfície de célula (por exemplo, um antígeno de tumor) e um dos receptores de superfície de célula. Em uma modalidade específica, o receptor de superfície de célula é um receptor da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, o receptor da imunoglobulina é um receptor Fc.

[00137] Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia leve da cadeia leve compreende 2 a 5 mutações somáticas. Em uma modalidade, o domínio variável de cadeia leve é uma cadeia leve somaticamente mutada cognata expressada em uma célula B do camundongo imunizado com o primeiro ou o segundo domínios variáveis da cadeia pesada.

[00138] Em uma modalidade, a primeira cadeia pesada totalmente humana carrega uma modificação de aminoácido que reduz a sua afinidade com a proteína A, e a segunda cadeia pesada totalmente humana não compreende uma modificação que reduz a sua afinidade com a proteína A.

[00139] Em várias modalidades, os métodos para fabricar anticorpos biespecíficos são realçados utilizando-se uma cadeia leve comum para emparelhar com cada uma das regiões de cadeia pesada dos anticorpos biespecíficos. Em várias modalidades, utilizar uma cadeia leve comum como aqui descrita reduz o número de espécies inadequadas de imunoglobulinas carecendo de biespecificidade quando comparadas com a utilização de cadeias leves cognatas originais. Em várias modalidades, as regiões de cadeia pesada dos anticorpos biespecíficos são identificadas de anticorpos monoespecíficos compreendendo uma cadeia leve comum. Em várias modalidades, as regiões de cadeia pesada dos anticorpos biespecíficos compreendem segmentos de gene da cadeia pesada variável humana que são rearranjados in vivo dentro das células B de camundongo que foram previamente engendradas para expressar um repertório limitado da cadeia leve humana, ou uma única cadeia leve humana, cognata com as cadeias pesadas humanas e, em resposta à exposição com um antígeno de interesse, geram um repertório de anticorpo quimérico contendo uma pluralidade de regiões variáveis de cadeia pesada humana que são cognatas com uma ou uma de duas regiões variáveis de cadeia leve humana possíveis, em que os anticorpos quiméricos são específicos para o antígeno de interesse.

[00140] Em vários aspectos, um método de preparar um anticorpo biespecífico é fornecido, o anticorpo biespecífico compreendendo 1) um primeiro polipeptídeo e um segundo polipeptídio, em que o primeiro e segundo polipeptídeos cada um incluem um domínio de multimerização (por exemplo, um domínio Fc da imunoglobulina) permitindo que o primeiro e segundo polipeptídeos formem um dímero, e os domínios de multimerização promovem a interação estável entre o primeiro e segundo polipeptídeos, e em que um dos domínios de multimerização carrega uma modificação de aminoácido que reduz a sua afinidade para a proteína A e o outro domínio de multimerização carece da modificação, 2) um domínio de aglutinação em cada um do primeiro e segundo polipeptídeos, cada domínio de aglutinação compreendendo uma cadeia pesada variável e uma cadeia leve variável, em que a cadeia leve variável do primeiro polipeptídeo e a cadeia leve variável do segundo polipeptídeo têm uma sequência de aminoácido comum, sequência comum esta que tem uma identidade de sequência de aminoácido com uma cadeia leve original de cada um dos polipeptídeos de pelo menos 80 %, de pelo menos 85 %, preferivelmente pelo menos 90 %, mais preferivelmente pelo menos 95 % e o mais preferivelmente 100 % de identidade de sequência. Em várias modalidades. c ecfgkc ngxg xctkáxgn fi fgtkxcfc fg woc XK3-39 jwocpq qw wo ugiogpVq fg igpg fg XK5-20 humano. Em várias modalidades, a cadeia leve variável é uma sequência de cadeia leve humana rearranjada. Em várias modalidades, a cadeia leve variável é isolada de um camundongo como aqui descrito.

[00141] Em várias modalidades, o método compreende as etapas de (i) cultivar uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucléico codificando o primeiro polipeptídeo, o segundo polipeptídeo, e a cadeia leve comum, em que o ácido nucléico é expressado; e (ii) recuperar o anticorpo biespecífico da cultura de célula hospedeira; em uma modalidade, o ácido nucléico codificando o primeiro polipeptídeo ou o ácido nucléico codificando o segundo polipeptídeo, carrega uma modificação de aminoácido que reduz a sua afinidade com a proteína A. Em uma modalidade, o ácido nucléico codificando o primeiro polipeptídeo, o segundo polipeptídeo, e a cadeia leve comum está presente em um único vector ou em vetores separados. Em uma modalidade, a célula hospedeira é usada para fabricar um anticorpo biespecífico de acordo com o parágrafo precedente.

[00142] Em um aspecto, um método de preparar um anticorpo biespecífico é fornecido, compreendendo (a) selecionar um primeiro ácido nucléico codificando uma primeira região variável da cadeia pesada humana isolada de um camundongo como aqui descrito; (b) selecionar um segundo ácido nucléico codificando uma segunda região variável da cadeia pesada humana isolada do mesmo ou camundongo separado como aqui descrito; (c) fornecer um terceiro ácido nucléico codificando uma região variável de cadeia leve humana isolada de um camundongo como aqui descrito ou derivado de uma região variável de cadeia leve humana rearranjada como aqui descrita; (c) introduzir dentro de uma célula hospedeira o primeiro, segundo e terceiro ácidos nucléicos e cultivar a célula hospedeira de modo que a expressão do primeiro, segundo e terceiro ácidos nucléicos ocorra; e (d) recuperar o anticorpo biespecífico formado a partir da cultura de célula.

[00143] Em uma modalidade, a primeira e a segunda regiões variáveis da cadeia pesada humana são somaticamente mutadas. Em uma modalidade específica, a primeira e a segunda regiões variáveis da cadeia pesada humana são independentemente derivadas de um dos segmentos de gene de VH humana rearranjados selecionados dos segmentos de gene de VH humana 1-2, 1-3, 1-8, 1-18, 1-24, 1-46, 1-58, 1-69, 2-5, 2-26, 2-70, 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-43, 3-48, 3-53, 3-64, 3-72, 3-73, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 5-51, e um 6-1. Em uma modalidade, a primeira e a segunda regiões variáveis da cadeia pesada humana são independentemente derivadas de um dos segmentos de gene de VH humana rearranjados selecionados de 2-5, 3-30 e 3-23. Em uma modalidade, a primeira região variável da cadeia pesada humana é derivada de um segmento de gene de VH2-5 humana e a segunda região variável da cadeia pesada humana é derivada de um segmento de gene de VH3-30 humana. Em uma modalidade, a primeira região variável da cadeia pesada humana é derivada de um segmento de gene de VH3-30 humana e a segunda região variável da cadeia pesada humana é derivada de um segmento de gene de VH3-23 humana. Em uma modalidade, a primeira região variável da cadeia pesada humana é derivada de um segmento de gene de VH3-23 humana e a segunda região variável da cadeia pesada humana é derivada de um segmento de gene de VH3-30 humana.

[00144] Em uma modalidade, o primeiro ou o segundo ácidos nucléicos são modificados antes da etapa (c), em que o primeiro ou o segundo ácidos nucléicos são modificados tal que tenham uma afinidade reduzida à proteína A.

[00145] Em uma modalidade, o terceiro ácido nucléico é isolado de um camundongo como aqui descrito. Em uma modalidade, o terceiro ácido nucléico compreende de 2 a 5 mutações somáticas. Em uma modalidade, o terceiro ácido nucléico codifica uma região variável de cadeia leve humana derivada dg wo ugiogpVq fg igpg fg XK3-39 humano. Em uma modalidade, o terceiro ácido nucléico codifica uma região variável de cadeia leve humana fgtkxcfc fg wo ugiogpvq fg igpg fg Xk5-20 humano.

[00146] Em uma modalidade, o terceiro ácido nucléico é derivado de uma região variável de cadeia leve humana rearranjada. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve humana rearranjada compreende uma ugswêpekc fgtkxcfc fg wo ugiogpVq fg igpg fg XK3-39 humano ou um ugiogpvq fg igpg fg Xk5-20 humano. Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve humana rearranjada compreende uma sequência da linha igtokpcVkxc fg Xk3-39 humano (isto é, não compreende uma hipermutação somática dentro da sequência do segmento de gene de V). Em uma modalidade, a região variável de cadeia leve humana rearranjada compreende woc ugswêpekc fc nknjc igtokpcVkxc fg XK5-20 humano.

[00147] Em várias modalidades, um método de preparar um anticorpo biespecífico que incorpore uma primeira cadeia pesada humana compreendendo um domínio variável derivado de um camundongo modificado que carece de uma sequência de cadeia leve humana rearranjada na sua linha germinativa é fornecido, em que a primeira cadeia pesada humana é emparelhada com uma cadeia leve humana cognata que compreende uma região variável de cadeia leve humana rearranjada derivada de um segmento de gene de Vk3-5; jwocpq qw wo Xk5-20 humano. Em várias modalidades, uma segunda cadeia pesada humana com uma especificidade diferente da primeira cadeia pesada humana é identificada de um camundongo imunizado como aqui descrito. Os ácidos nucléicos que codificam as duas cadeias pesadas e a cadeia leve comum são introduzidos em uma célula hospedeira como descrito nos parágrafos precedentes de modo que a expressão de todas as três cadeias ocorra e o anticorpo biespecífico seja recuperado da cultura de célula.

[00148] Em uma modalidade, o camundongo é imunizado com os mesmos antígenos usados para gerar o domínio variável da primeira cadeia pesada humana. Em uma modalidade, o camundongo é imunizado com um antígeno diferente usado para gerar o domínio variável da primeira cadeia pesada humana.

[00149] Em um aspecto, um método de selecionar as cadeias pesadas humanas que possam forma par com uma única cadeia leve humana para fabricar um anticorpo biespecífico é fornecido, incluindo ácidos nucléicos que codificam o anticorpo biespecífico e uma célula hospedeira compreendendo os ácidos nucléicos.

[00150] Em um aspecto, um método de aumentar a quantidade de um anticorpo biespecífico desejado em uma cultura de célula em relação aos produtos indesejados tais como anticorpos monoespecíficos é fornecido, em que uma das cadeias pesadas do anticorpo biespecífico é modificada para reduzir a sua afinidade com a proteína A.

[00151] Em um aspecto, uma célula hospedeira isolada é fornecida, em que a célula hospedeira compreende (a) uma primeira sequência de ácido nucléico que codifica uma primeira região variável da cadeia pesada humana que aglutina um primeiro antígeno, em que a primeira sequência de ácido nucléico é isolada de um camundongo imunizado com o primeiro antígeno que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo; (b) uma segunda sequência de ácido nucléico que codifica uma segunda região variável da cadeia pesada humana que aglutina um segundo antígeno, em que a segunda sequência de ácido nucléico é isolada de um camundongo imunizado com o segundo antígeno que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina na linha germinativa do camundongo; (c) uma terceira sequência de ácido nucléico que codifica uma região variável de cadeia leve humana que, quando emparelhada com a região variável da cadeia pesada de (a) especificamente aglutina o primeiro antígeno, e quando emparelhada com a região variável da cadeia pesada de (b) especificamente se aglutina ao segundo antígeno.

[00152] Em vários aspectos, o primeiro e segundo antígenos são diferentes um do outro. Em vários aspectos, a expressão da primeira, segunda e terceira sequências de ácido nucléico leva à formação de um anticorpo biespecífico que especificamente se aglutina ao primeiro e segundo antígenos.

[00153] Em uma modalidade, a região da VL humana é derivada de uma sequência de cadeia leve humana rearranjada compreendendo um ugiogpVq fg igpg fg XK3-39 humano ou wo ugiogpVq fg igpg fg XK5-20 humano. Em uma modalidade específica, a sequência de cadeia leve humana rearranjada é uma sequência da linha germinativa (isto é, não compreende uma hipermutação somática dentro do domínio variável). Em uma modalidade, a terceira sequência de ácido nucléico é isolada de um camundongo que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina, em que a sequência de cadeia leve humana rearranjada está presente na linha germinativa do camundongo. Em uma modalidade, a sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina compreende um segmento de gene de VK3-39 jwocpq qw wo ugiogpVq fg igpg fg XK5-20 humano. Em uma modalidade gurgeífíec, q ugiogpVq fg igpg fg XK3-39 humano ou o segmento de gene de Xk5-20 humano compreendem pelo menos uma hipermutação somática em uma região determinadora de complementaridade (CDR) ou região de estrutura (FWR). Em uma modalidade específica, a primeira, segunda e terceira sequências de ácido nucléico são isoladas de um camundongo que expressa uma região da VL da imunoglobulina humana derivada de um ugiogpVq fg igpg fg Xk3-39 huocpq qw Xk5-20 humano de uma sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina, em que a sequência de cadeia leve rearranjada da imunoglobulina está presente na linha germinativa do camundongo.

[00154] Em várias modalidades, o camundongo não contém um segmento de gene de região variável de cadeia leve endógeno que é capaz de rearranjar para formar uma cadeia leve da imunoglobulina.

[00155] Em uma modalidade, a região da VL da imunoglobulina humana é expressada a partir de um local da cadeia leve da imunoglobulina endógena modificada. Em uma modalidade, o primeiro e segundo antígenos estão presentes em uma molécula. Em uma modalidade, o primeiro e segundo antígenos estão presentes em moléculas diferentes. Em uma modalidade, a primeira ou a segunda sequências de ácido nucléico compreendem uma modificação que reduz a afinidade da cadeia pesada codificada com a proteína A.

[00156] Em uma modalidade, a primeira ou segunda sequências de ácido nucléico compreendem uma sequência da região variável da cadeia pesada humana rearranjada compreendendo um segmento de gene de cadeia pesada humana selecionado de VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1- 46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3- 13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3-64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5- 51, e VH6-1. Em uma modalidade específica, o segmento de gene de cadeia pesada é VH2-5, VH3-23 ou VH3-30.

[00157] Em um aspecto, um anticorpo ou um anticorpo biespecífico compreendendo um domínio variável da cadeia pesada humana fabricada de acordo com a invenção são fornecidos. Em um outro aspecto, o uso de um camundongo como aqui descrito para fabricar um anticorpo totalmente humano ou um anticorpo biespecífico totalmente humano é fornecido.

[00158] Em um aspecto, um camundongo, embrião, ou célula geneticamente modificados aqui descritos compreende um local de cadeia ngxg K swg tgVfio gngogpVqu tgiwncfqtgu qw fg eqpVtqng gpf„igpqu. rqt exemplo, um camundongo intensificador kpVt»pkeq K. wo intensificador 3’ K de camundongo, ou tanto um intensificador intrônico quanto um intensificador 5Ó. go swg qu gngogpvqu tgiwncfqtgu qw fg eqpvtqng hceknkvco c mutação somática e maturação por afinidade de uma sequência expressada do nqecn fc ecfgkc ngxg K0

[00159] Em um aspecto, um camundongo é fornecido que compreende uma população de célula B caracterizada por ter cadeias leves da imunoglobulina derivadas de não mais do que um, ou não mais do que dois, segmentos de gene de V e J da cadeia leve da imunoglobulina rearranjada ou não rearranjada, em que o ccowpfqpiq gzkdg woc taz«q fg ecfgkc ngxg K<n que é aproximadamente a mesma como um camundongo que compreende um complemento do tipo selvagem dos segmentos de gene de V e J da cadeia leve da imunoglobulina.

[00160] Em uma modalidade, as cadeias leves da imunoglobulina são derivadas de não mais do que um, ou não mais do que dois, segmentos de gene de V e J rearranjados da cadeia leve da imunoglobulina. Em uma modalidade específica, as cadeias leves são derivadas de não mais do que um dos segmentos de gene de V e J rearranjados da cadeia leve da imunoglobulina. Em uma modalidade, as cadeias leves da imunoglobulina são geradas a partir de um de dois segmentos de gene da VL da imunoglobulina não rearranjados e um de 1, 2, 3, 4, ou 5 segmentos de gene JL da imunoglobulina. Em uma modalidade, as cadeias leves da imunoglobulina são geradas a partir de um de dois segmentos de gene da VL da imunoglobulina não rearranjados e um segmento de gene JL da imunoglobulina.

[00161] Em um aspecto, um camundongo como aqui descrito é fornecido que expressa uma cadeia leve da imunoglobulina derivada de não mais do que uma, ou não mais do que duas, sequências XKILK jwocpcu. go que o camundongo compreende uma substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene endógenos da região variável da cadeia pesada de camundongo com uma ou mais segmentos de gene da região variável da cadeia pesada humana, e o camundongo exibe uma razão de (a) células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leven, para (b) células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma ecfgkc"ngxg"k."fg"egtec"fg"3"rctc"egtec"fg"420"

[00162] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma única ecfgkc ngxg K fgtkxcfc fg woc ugswêpekc fq XK3-5;LK7 jwocpq. g c taz«q fg células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve n para células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia ngxg k fi fg egrca de 1 a cerca de 20; em uma modalidade, a razão é de cerca de 1 a pelo menos cerca de 66; em uma modalidade específica, a razão é de cerca de 1 a 66.

[00163] Em uma modalidade, o camundongo expressa uma única ecfgkc ngxg K fgtkxcfc fg woc ugswêpekc XK5-42LK7 jwmana, e a razão de células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia leve n para células B CD19+ que expressam uma imunoglobulina tendo uma cadeia ngxg K fi fg egtec fg 3 c egtec fg 42= go woc modalidade, a razão é de cerca de 1 a cerca de 21. Em modalidades específica, a razão é de 1 para 20, ou de 1 para 21.

[00164] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um camundongo que expressa uma cadeia leve da imunoglobulina cuja sequência é idêntica àquela obtida pelo rearranjo de um de dois segmentos de gene da XK jwocpc eqo 3. 4. 5. 6. qw 7 ugiogpvqu fg igpg fc LK jwocpc0

[00165] Em algumas modalidades, um camundongo é fornecido que expressa uma cadeia leve da imunoglobulina gerada a partir de um rearranjo fg wo fg fqku ugiogpvqu fg igpg fc XK jwocpc g wo fg 3. 4. 5, 4, ou 5 ugiogpvqu fg igpg fc LK jwocpc. go swg q ecowpfqpiq eqortggpfg woc substituição de todos ou substancialmente todos os segmentos de gene da VH da imunoglobulina endógena com uma ou mais VH da imunoglobulina humana, uma ou mais segmentos de gene da DH, e um ou mais da JH, e o camundongo exibe uma razão de (a) células B na medula óssea que expressa woc kowpqinqdwnkpc Vgpfq woc ecfgkc ngxg X, rctc *d+ efinwncu D pc ogfwnc „uugc swg gzrtguuco woc kowpqinqdwnkpc vgpfq woc ecfgkc ngxg K. fg egtec de 1 a cerca de 15. Em algumas modalidades, o rearranjo inclui um segmento fg igpg XK3-39 humano. Em algumas modalidades, o rearranjo inclui um ugiogpvq fg igpg XK5-20 humano. Em algumas modalidades, a substituição dos segmentos de gene da VH da imunoglobulina endógenos é em um local da VH da imunoglobulina endógeno. Em algumas modalidades, os dois ugiogpvqu fg igpg fc XK jwocpc guv«q go wo nqecn XK fc kowpqinqdwnkpc endógeno, e, em algumas modalidades. qu fqku ugiogpVqu fg igpg fg XK humana substitui todos ou substancialmente todos os segmentos de gene da Xk fc kowpqinqdwnkpc fg ecowpfqpiq0 Go cniwocu modalidades, os dois ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc guv«q go wo nqecn Xk fc kowpqinqdwnkpc endógeno, e, em algumas modalidades. qu fqku ugiogpvqu fg igpg fc Xk humana substituem todos ou substancialmente todos os segmentos de gene ecowpfqpiq fc XK g LK fc inninqglqbiilinco Go xátkcu modalidades, os dois ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc u«q qrgtcxgnogpvg ligados ao dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5) segmentos de gene da Lk jiocpc0

[00166] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção expressa uma cadeia leve gerada através de um rearranjo de um ugiogpvq fg igpg Xk3-5; jiocpq qi io ugiogpvq fg igpg Xk5-20 humano e um de dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) segmepvqu fg igpg fc Lk humana, e a razão de células B imaturas na medula óssea que expressam uma imunqglqbulinc Vgnfq woc ecfgkc lgxg X rctc efilwlcu D kocVwtcu swg gzrtguuco ioc ioipqilqdilipc vgpfq ioc ecfgic lgxg k fi fg egtec fg 3 c cerca de 13.

[00167] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção expressa uma cadeia leve gerada através de um rearranjo de um ugiogpvq fg igpg Xk3-5; jwocpq qw wo ugiogpvq fg igpg Xk5-20 humano g wo fg fqiu qw ociu *rqt gzgorlq. 4. 5. 6. qw 7+ ugiogpvqu fg igpg Lk humano, e a razão de células B maduras na medula óssea que expressam uma iowpqilqdwlipc vgpfq woc ecfgic lgxg X rctc efilwlcu D iocvwtcu swg gzrtguuco woc iowpqilqdwlipc vgpfq woc ecfgic lgxg k fi fg egtec fg 3 c cerca de 7.

[00168] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção expressa uma cadeia leve gerada através de um rearranjo de um ugiogpvq fg igpg Xk3-5; jwocpq qw wo ugiogpvq fg igpg Xk5-20 humano g wo fg fqiu qw ociu *rqt gzgorlq. 4. 5. 6. qw 7+ ugiogpvqu fg igpg fc Lk humana, e tem uma população de pró célula B na medula óssea dentro da faixa de cerca de 2,5 x 104 a cerca de 1,5 x 105 células, inclusive, por exemplo 444444 cerca de 2,5 x 10 , 3,0 x 10 , 3,5 x 10 , 4,0 x 10 , 4,5 x 10 , 5,0 x 10 , 5,5 x 104 6 0 x 104 6 5 x 104 7 0 x 104 7 5 x 104 8 0 x 104 8 5 x 104 9 0 x 104 ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x , 9,5 x 104, 1,0 x 105, ou 1,5 x 105 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pró célula B na medula óssea de cerca de 2,88 x 104 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pró célula B na medula óssea de cerca de 6,42 x 104 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pró célula B na medula óssea de cerca de 9,16 x 104 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pró célula B na medula óssea de cerca de 1,19 x 105 células. As pró células B exemplares na medula óssea de camundongos geneticamente modificados como aqui descritos são distinguidas pela expressão de CD19, CD43, c-kit e/ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, CD19+, CD43+, c-kit+).

[00169] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção expressa uma cadeia leve gerada através de um rearranjo de um segmento de gene VK3-5; jwocpq qw wo ugiogpVq fg igpg XK5-20 humano g wo fg fqku qw ocku *rqt gzgornq, 4. 5. 6. qw 7+ ugiogpVqu fg igpg fg LK humano, e tem uma população de pré célula B na medula óssea dentro da faixa de cerca de 1 x 106 a cerca de 2 x 106 células, inclusive, por exemplo, de 666666 cerca de 1,0 x 10 , 1,1 x 10 , 1,2 x 10 , 1,3 x 10 , 1,4 x 10 , 1,5 x 10 , 1,6 x 106, 1,7 x 106, 1,8 x 106, 1,9 x 106, ou 2,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pré célula B na medula óssea de cerca de 1,25 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pré célula B na medula óssea de cerca de 1,46 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pré célula B na medula óssea de cerca de 1,64 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de pré célula B na medula óssea de cerca de 2,03 x 106 células. As pré células B exemplares na medula óssea de camundongos geneticamente modificados como aqui descritos são distinguidas pela expressão de CD19, CD43, c-kit e/ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, CD19+, CD43-, c-kit-).

[00170] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção expressa uma cadeia leve gerada através de um rearranjo de um ugiogpVq fg igpg XK3-5; jwocpq qw wo ugiogpVq fg igpg XK5-20 humano g wo fg fqku qw ocku *rqt gzgornq. 4. 5. 6. qw 7+ ugiogpVqu fg igpg LK humanos, e tem uma população de célula B imatura na medula óssea dentro da faixa de cerca de 5 x 105 a cerca de 7 x 105 células, inclusive, por exemplo, de cerca de 5,0 x 105, 5,1 x 105, 5,2 x 105, 5,3 x 105, 5,4 x 105, 5,5 x 105, 5,6 x 105, 5,7 x 105, 5,8 x 105, 5,9 x 105, 6,0 x 105, 6,1 x 105, 6,2 x 105, 6,3 x 105, 6,4 x 105, 6,5 x 105, 6,6 x 105, 6,7 x 105, 6,8 x 105, 6,9 x 105, ou 7,0 x 105 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B imatura na medula óssea de cerca de 5,33 x 105 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B imatura na medula óssea de cerca de 5,80 x 105 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B imatura na medula óssea de cerca de 5,92 x 105 células; em algumas modalidades, o camundongo compreende uma população de célula B imatura na medula óssea de cerca de 6,67 x 105 células. As células B imaturas exemplares na medula óssea de camundongos geneticamente modificados como aqui descritos são distinguidas pela expressão de IgM, B220 e/ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, IgM+, B220int).

[00171] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção expressa uma cadeia leve gerada através de um rearranjo de um ugiogpVq fg igpg XK3-5; jwocpq qw wo ugiogpVq fg igpg XK5-20 humano g wo fg fqku qw ocku *rqt gzgornq, 4. 5. 6. qw 7+ ugiogpVqu fg igpg LK humano, e tem uma população de célula B madura na medula óssea dentro da faixa de cerca de 3 x 104 a cerca de 1,5 x 105 células, inclusive, por exemplo 444444 de cerca de 3,0 x 10 , 3,5 x 10 , 4,0 x 10 , 4,5 x 10 , 5,0 x 10 , 5,5 x 10 , 6,0 x 104 6 5 x 104 7 0 x 104 7 5 x 104 8 0 x 104 8 5 x 104 9 0 x 104 9 5 x 104 ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x , 1,0 x 105, ou 1,5 x 105 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B madura na medula óssea de cerca de 3,11 x 104 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B madura na medula óssea de cerca de 1,09 x 105 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B madura na medula óssea de cerca de 1,16 x 105 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B madura na medula óssea de cerca de 1,44 x 105 células. As células B maduras exemplares na medula óssea de camundongos geneticamente modificados como aqui descritos são distinguidas pela expressão de IgM, B220 e/ou uma combinação dos mesmos (por exemplo, IgM+, B220hi).

[00172] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção expressa uma cadeia leve gerada através de um rearranjo de um ugiogpVq fg igpg Xk3-5; jwocpq qw wo ugiogpVq fg igpg Xk5-20 humano e um de dois ou mais (por exempnq. 4. 5. 6. qw 7+ ugiogpVqu fg igpg Lk humano, e tem uma população de célula B total na medula óssea dentro da faixa de cerca de 1 x 106 a cerca de 3 x 106 células, inclusive, por exemplo de 666666 cerca de 1,0 x 10 , 1,1 x 10 , 1,2 x 10 , 1,3 x 10 , 1,4 x 10 , 1,5 x 10 , 1,6 x 106 1 7 x 106 1 8 x 106 1 9 x 106 2 0 x 106 2 1 x 106 2 2 x 106 2 3 x 106 ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x , 2,4 x 106, 2,5 x 106, 2,6 x 106, 2,7 x 106, 2,8 x 106, 2,9 x 106 ou 2,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B total na medula óssea de cerca de 1,59 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B total na medula óssea de cerca de 1,75 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B total na medula óssea de cerca de 2,13 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B total na medula óssea de cerca de 2,55 x 106 células. As células B totais exemplares na medula óssea de camundongos geneticamente modificados como aqui descritos são distinguidas pela expressão de CD19, CD20 e/ou um combinação dos mesmos (por exemplo, CD19+).

[00173] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fomgekfq swg gzrtguuc woc úpkec ecfgkc ngxg K tgcttanjcfc, go swg q camundongo compreende um local de cadeia leve n funcional, e em que o camundongo expressa uma população de célula B que compreende células Kik+ que expressam um detkxcfq fg ecfgkc ngxg k fc oguoc ecfgkc ngxg k única rearranjada. Em uma modalidade. c rqtegnvcigo fg efinwncu D Kik+Ign+ no camundongo é de aproximadamente a mesma como em um camundongo do tipo selvagem. Em uma modalidade específica, a porcentagem de células B Kik+Ign+ no camundongo é de cerca de 2 a cerca de 6 por cento. Em uma modalidade gurgeífíec, c rqtegnVcigo fg efinwncu D KiK+Ign+ em um ecownfqniq go swg c únkec ecfgkc ngxg k tgcttcnlcfc fi fgtkxcfc fg woc ugswênekc XK3-5;LK7 fi fg egtec fg 4 c egtec fg 3; em uma modalidade específica, a porcentagem é de cerca de 2,6. Em uma modalidade específica, a rqtegnvcigo fg efinwncu D KiK+Ign+ em um camundongo em que a única ecfgkc ngxg K tgcttcnlcfc fi fgtkxcfc fg woc ugswênekc XK5-42LK3 fi fg egtec de 4 a cerca de 8; em uma modalidade específica, a porcentagem é de cerca de 6.

[00174] Em algumas modalidades, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que expressa uma cadeia leve da imunoglobulina eqortggpfgpfq woc ugswêpekc XKILK fc kiinipqglqbnlkiKi jwocpc rearranjadc. go swg q ecowpfqpiq eqortggpfg wo Iqecl fg ecfgkc lgxg X fc imunoglobulina funcional, e em que o camundongo compreende uma pqpulcçàq fg efilwlc D gurlêpkec swg eqortggpfg woc taz«q fg efilwlcu D IgA- rctc efilwlcu D Kik- swg fi fg egtec fg 3 c egtec fg := gm algumas modalidades, de cerca de 1 a cerca de 5. Em algumas modalidades, a ugswêpekc Xk1Lk fc kowpqilqdwlkpc jwocpc tgcttcplcfc fi igtcfc cvtcxfiu fg wo tgcttcplq fg wo fg fqku ugiogpvqu fg igpg fg Xk fc kowpqilqdwlkpc humana e um de 1, 2, 3, 4, ou 5 segmepvqu fg igpg Lk fc kowpqilqdwlkpc humana. Em algumas modalidades. c ugswêpekc Xk1Lk fc kowpqilqdwlkpc humana rearranjada é gerada através de um rearranjo de um segmento de gene Xk3-5; fc kowpqilqdwlkpc jwocpc g wo ugiogpvq fg igpg Lk fc imunoglobulina humapc uglgekqpcfq fg Lk3. Lk4. Lk5. Lk6. Lk7. g woc combinação dos mesmos. Em algumas modalidades. c ugswêpekc Xk1Lk fc imunoglobulina humana rearranjada é gerada através de um rearranjo de um ugiogpvq fg igpg Xk5-20 da imunoglobulina humana e um segmento de gene Lk fc kowpqilqdwlkpc jwocpc uglgekqpcfq fg Lk3. Lk4. Lk5. Lk6. Lk7. g woc combinação dos mesmos.

[00175] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+ dentro da faixa de cerca de 2 x 106 a cerca de 7 x 106 células, inclusive, por exemplo de 666666 cerca de 2,0 x 10 , 2,5 x 10 , 3,0 x 10 , 3,5 x 10 , 4,0 x 10 , 4,5 x 10 , 5,0 x 106, 5,5 x 106, 6,0 x 106, 6,5 x 106, ou 7,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+ de cerca de 2,74 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+ de cerca de 4,30 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+ de cerca de 5,53 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+ de cerca de 6,18 x 106 células.

[00176] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDhi, IgMlo dentro da faixa de cerca de 1 x 106 a cerca de 4 x 106 células, inclusive, por exemplo de cerca de 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106, 2,5 x 106, 3,0 x 106, 3,5 x 106, 4,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDhi, IgMlo de cerca de 1,30 x 106; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDhi, IgMlo de cerca de 2,13 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDhi, IgMlo de cerca de 3,15 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDhi, IgMlo de cerca de 3,93 x 106 células.

[00177] Em alguma modalidade, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDlo, IgMhi dentro da faixa de cerca de 9 x 105 a cerca de 2 x 106 células, inclusive, por exemplo de cerca de 9,0 x 105, 9,25 x 105, 9,5 x 105, 9,75 x 105, 1,0 x 106, 1,25 x 106, 1,50 x 106, 1,75 x 106, 2,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDlo, IgMhi de cerca de 9,52 x 105; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDlo, IgMhi de cerca de 1,23 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende Uma população de célula B esplênica CD19+, IgDlo, IgMhi de cerca de 1,40 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B esplênica CD19+, IgDlo, IgMhi de cerca de 1,42 x 106 células.

[00178] Em algumas modalidades, um camundongo geneticamente modificado é fornecido, em que o camundongo compreende um local de ecfgkc ngxg K fc kowpqinqdwnkpc swg eqortggpfg fqku ugiogpVqu fg igpg XK imunoglobulina humana não rearranjados e dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 6. qw 7+ ugiogpvqu fg igpg LK jwocpqu p«q tgcttcplcfqu. g go swg q camundongo compreende uma população de célula B esplênica periférica compreendendo populações de célula B transicionais (por exemplo, T1, T2 e T3) que são aproximadamente o mesmo como um camundongo que compreende um complemento do tipo selvagem dos segmentos de gene V e J fc ecfgkc ngxg K fc kowpqinqdwnkpCo Cu rqrwnc>õgu fg efinwnc D transicional exemplar (por exemplo, T1, T2 e T3) no baço de um camundongo geneticamente modificado como aqui descrito são distinguidas pela expressão de IgM, CD23, CD93, B220 e/ou uma combinação dos mesmos.

[00179] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T1 no baço (por exemplo, CD93+, B220+, IgMhi, CD23-) dentro da faixa de cerca de 2 x 106 a cerca de 7 x 106 células, inclusive, por exemplo de cerca de 2,0 x 106, 2,5 x 106, 3,0 x 106 3 5 x 106 4 0 x 106 4 5 x 106 5 0 x 106 5 5 x 106 6 0 x 106 6 5 x 106 ou , , x , , x , , x , , x , , x , , x , , x , ou 7,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T1 no baço de cerca de 2,16 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T1 no baço de cerca de 3,63 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T1 no baço de cerca de 3,91 x 106; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T1 no baço de cerca de 6,83 x 106 células.

[00180] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T2 no baço (por exemplo, CD93+, B220+, IgMhi, CD23+) dentro da faixa de cerca de 1 x 106 a cerca de 7 x 106 células, inclusive, por exemplo de cerca de 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106 2 5 x 106 3 0 x 106 3 5 x 106 4 0 x 106 4 5 x 106 5 0 x 106 5 5 x 106 ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x ,,x , 6,0 x 106, 6,5 x 106, ou 7,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T2 no baço de cerca de 1,30 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T2 no baço de cerca de 2,46 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T2 no baço de cerca de 3,24 x 106; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T2 no baço de cerca de 6,52 x 106 células.

[00181] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma População de célula B T3 no baço (por exemplo, CD93+, B220+, IgMlo, CD23+) dentro da faixa de cerca de 1 x 106 a cerca de 4 x 106 células, inclusive, por exemplo de cerca de 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106, 2,5 x 106, 3,0 x 106, 3,5 x 106, ou 4,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T3 no baço de cerca de 1,08 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T3 no baço de cerca de 1,35 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T3 no baço de cerca de 3,37 x 106; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B T1 no baço de cerca de 3,63 x 106 células.

[00182] Em algumas modalidades, um camundongo geneticamente modificado é fornecido, em que o camundongo compreende um local da ecfgkc ngxg K fc kowpqinqdwnkpc swg eqortggpfg fqku ugiogpVqu fg igpg XK da imunoglobulina humana não rearranjado e 1, 2, 3, 4, ou 5 segmentos de igpg LK fc kowpqinqdwnkpc jwocpc p«q tgcttcplcfq. g go swg q ecowpfqpiq compreende uma população de célula B esplênica periférica compreendendo zona marginal e populações de célula B precursoras da zona marginal que são de cerca do mesmo como um camundongo que compreende um complemento fq vkrq ugnxcigo fqu ugiogpvqu fg igpg XK g LK fc kowpqinqdwnkpc0 As populações de célula B da zona marginal exemplares no baço de um camundongo geneticamente modificado como aqui descrito são distinguidas pela expressão de IgM, CD21/35, CD23, CD93, B220 e/ou um combinação dos mesmos.

[00183] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende população de célula B de zona marginal no baço (por exemplo, CD93-, B220+, IgMhi, CD21/35hi, CD23-) dentro da faixa de cerca de 1 x 106 a cerca de 3 x 106 células, inclusive, por exemplo, de cerca de 1,0 x 106, 1,5 x 106, 2,0 x 106, 2,5 x 106, ou 3,0 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B de zona marginal no baço de cerca de 1,47 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B de zona marginal no baço de cerca de 1,49 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende um população de célula B de zona marginal no baço de cerca de 2,26 x 106 células; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B de zona marginal no baço de cerca de 2,33 x 106 células.

[00184] Em algumas modalidades, um camundongo geneticamente modificado é fornecido, em que o camundongo compreende um local de ecfgkc ngxg K fc kowpqinqdwnkpc swg eqortggpfg fqku ugiogpVqu fg igpg XK da imunoglobulina humana não rearranjados e 1, 2, 3, 4, ou 5 segmentos de igpg LK fc kowpqinqdwnkpc jwocpc p«q tgcttcplcfqu. g go swg q ecowpfqpiq compreende uma população de célula B esplênica periférica compreendendo população(ções) de célula B folicular (por exemplo, FO-I e FO-II) que são de cerca do mesmo como um camundongo que compreende um complemento do vkrq ugnxcigo fg ugiogpvqu fg igpg XK g LK fc kowpqinqdwnkpc0 Cu populações de célula B folicular exemplares (por exemplo, FO-I e FO-II) no baço de um camundongo geneticamente modificado como aqui descrito são distinguidas pela expressão de IgM, IgD, CD21/35, CD93, B220 e/ou uma combinação dos mesmos.

[00185] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 1 no baÁo (por exemplo, CD93-, B220+, CD21/35int, IgMlo, IgDhi) dentro da faixa de cerca de 3 x 106 a cerca de 1,5x107 cÈlulas, inclusive, por exemplo de cerca de 3,0 x 106, 3,5 x 106, 4,0 x 106, 4,5 x 106, 5,0 x 106, 5,5 x 106, 6,0 x 106, 6,5 x 106, 7,0 x 106, 7,5 x 106, 8,0 x 106, 8,5 x 106, 9,0 x 106, 9,5 x 106, 1,0 x 107, ou 1,5 x 107 cÈlulas; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 1 no baÁo de cerca de 3,57 x 106 cÈlulas; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 1 no baÁo de cerca de 6,31 x 106 cÈlulas; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 1 no baÁo de cerca de 9,42 x 106 cÈlulas; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 1 no baÁo de cerca de 1,14 x 107 cÈlulas.

[00186] Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção compreende uma população de célula B folicular tipo 2 no baço (por exemplo, CD93-, B220+, CD21/35int, IgMint, IgDhi) dentro da faixa de cerca de 1 x 106 a cerca de 2 x 106 cÈlulas, inclusive, por exemplo, 1,0 x 106, 1,25 x 106, 1,5 x 106, 1,75 x 106, ou 2,0 x 106 cÈlulas; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 2 no baÁo de cerca de 1,14 x 106 cÈlulas; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 2 no baÁo de cerca de 1,45 x 106 cÈlulas; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 2 no baÁo de cerca de 1,80 x 106; em algumas modalidades, um camundongo da presente invenÁ„o compreende uma populaÁ„o de cÈlula B folicular tipo 2 no baÁo de cerca de 2,06 x 106 cÈlulas.

[00187] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é forneekfq. go swg q ecowpfqpiq gzrtguuc woc úpkec ecfgkc ngxg K tgcttcpjcfc fgtkxcfc fg wo ugiogpVq fg igpg fg XK g LK jwocpq, go swg q camundongo expressa uma população de célula B que compreende uma única ecfgkc ngxg K fgtkxcfc fc úpkec ugswêpekc fg ecfgkc ngxg K tgcttcpjcfc, go que o camundongo geneticamente modificado não foi tornado resistente às hipermutações somáticas. Em uma modalidade, pelo menos 90 % das cadeias ngxgu k gzrtguucfcu go woc efinwnc D fq ecowpfqpiq gzkdgo rgnq ogpqu fg uma a cerca de cinco hipermutações somáticas.

[00188] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é hqtpgekfq swg fi oqfkhkecfq rctc gzrtguuct woc úpkec ecfgkc ngxg k fgtkxcfc de não mais do que uma, ou não mais do que duas, sequências de cadeia leve k tgcttcplcfcu, go swg q ecowpfqpiq gzkdg wo wuq fc ecfgkc ngxg k swg fi fg cerca de duas vezes ou mais, pelo menos cerca de três vezes ou mais, ou pelo ogpqu egtec fg swcVtq xgzgu ockqt fq swg q wuq fc ecfgkc ngxg K qw ocku exibido por um camundongo do tipo selvagem, ou maior do que o uso da ecfgkc ngxg k gzkdkfq rqt wo ecowpfqpiq fc oguoc egrc swg eqortggpfg wo tgrgtv„tkq fq vkrq ugnxcigo fg ugiogpvqu fg igpg fc ecfgkc ngxg k0 Go uma modalidade gurgeíhkec. q ecowpfqpiq gzrtguuc c úpiec ecfgic ngxg K fg não mais do que uma sequêncic fg ecfgic ngxg K tgcttcpjcfco Go woc modalidade ociu gurgeíhkec, c ugswêpeic fg ecfgic ngxg K tgcttcpjcfc fi ugngeiqpcfc fg woc ugswêpeic XK3-5;LK7 g XK5-42LK3O Go woc modalidade, c ugswêpeic fg ecfgic ngxg k tgcttcplcfc fi woc ugswêpeic Xk3 -5;Lk70 Go uma modalidade, c ugswêpeic fg ecfgic ngxg k tgcttcplcfc fi woc ugswêpeic Xk5-42Lk30

[00189] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é hqtpgeifq swg gzrtguuc woc úpiec ecfgic ngxg k fgtixcfc fg p«q ociu fq swg uma, ou não mais do que duas, sequências de ecfgic ngxg k tgcttcplcfcu, go swg q ecowpfqpiq gzidg wo wuq fc ecfgic ngxg K swg fi fg egtec fg 322 xgzgu ou mais, pelo menos cerca de 200 vezes ou mais, pelo menos cerca de 300 vezes ou mais, pelo menos cerca de 400 vezes ou mais, pelo menos cerca de 500 vezes ou mais, pelo menos cerca de 600 vezes ou mais, pelo menos cerca de 700 vezes ou mais, pelo menos cerca de 800 vezes ou mais, pelo menos cerca de 900 vezes ou mais, pelo menos cerca de 1000 vezes ou mais maior fq swg q oguoq wuq fc ecfgic ngxg k gzidido por um camundongo que ecttgic wo nqecn fg ecfgic ngxg k jwocpc eqorngvq qw uwduvcpeicnogpvg completo. Em uma modalidade específica, o camundongo que carrega um nqecn fg ecfgic ngxg k jwocpc eqorngvq qw uwduvcpeicnogpvg eqorngvq ectgeg de uma sequência fg ecfgic ngxg k fg ecowpfqpiq p«q tgcttcplcfc hwpeiqpcn Em uma modalidade gurgeíhiec, q ecowpfqpiq gzrtguuc c ecfgic ngxg k úpiec fg p«q ociu fq swg woc ugswêpeic fg ecfgic ngxg k tgcttcplcfc0 Go woc modalidade, o camundongo compreende uma cópia de uma sequência de ecfgic ngxg k tgcttcplcfc *rqt gzgornq, wo jgvgtqziiqvq+0 Go woc modalidade, o camundongo compreende duas cópias de uma sequência de ecfgic ngxg k tgcttcplcfc *rqt gzgornq, wo jqoqziiqvq+0 Go woc modalidade mais específica, a sequência de cadeic ngxg k tgcttcplcfc fi ugngeiqpcfc fg woc ugswêpeic Xk3-5;Lk7 g Xk5-42Lk30 Go woc modalidade, c ugswêpekc fg ecfgkc ngxg K tgcttcpjcfc fi woc ugswêpekc XK3-5;LK7O Go uma modalidade, c ugswêpekc fg ecfgkc ngxg K tgcttcpjcfc fi woc ugswêpekc Xk5-42Lk30

[00190] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que expressa uma cadeia leve única derivada de não mais do que uma, ou não mais do que duas, sequências de cadeia leve rearranjadas, em que a cadeia leve no camundongo geneticamente modificado exibe um nível de expressão que é pelo menos 10 vezes a cerca de 1.000 vezes, 100 vezes a cerca de 1.000 vezes, 200 vezes a cerca de 1.000 vezes, 300 vezes a cerca de 1.000 vezes, 400 vezes a cerca de 1.000 vezes, 500 vezes a cerca de 1.000 vezes, 600 vezes a cerca de 1.000 vezes, 700 vezes a cerca de 1.000 vezes, 800 vezes a cerca de 1.000 vezes, ou 900 vezes a cerca de 1.000 vezes mais alta do que a expressão da mesma cadeia leve rearranjada exibida por um camundongo que carrega um local de cadeia leve completo ou substancialmente completo. Em uma modalidade, a cadeia leve compreende uma sequência humana. Em uma modalidade específica, a sequência humana fi woc ugswêpekc k0 Go woc modalidade, a sequência humana é uma sequência n. Em uma modalidade, a cadeia leve é uma cadeia leve totalmente humana.

[00191] Em uma modalidade, o nível de expressão é caracterizado pela quantificação do mRNA da sequência de cadeia leve transcrita, e comparando a mesma com a sequência de cadeia leve transcrita de um camundongo que carrega um local de cadeia leve completo ou substancialmente completo.

[00192] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que expressa uma única cadeia levg k fgtkxcfc fg p«q ocku fq swg woc, qw p«q ocku fq swg fwcu, ugswêpekcu fg ecfgkc ngxg k tgcttcplcfc, go que o camundongo, na imunização com antígeno, exibe um título sérico que é comparável a um camundongo do tipo selvagem imunizado com o mesmo antígeno. Em uma modalidade específica, o camundongo expressa uma única ecfgkc ngxg K fg p«q ocku fq swg woc ugswêpekc fg ecfgkc ngxg K tgcttcpjcfc. Em uma modalidade, o título sérico é caracterizado como imunoglobulina total. Em uma modalidade específica, o título sérico é caracterizado como título específico de IgM. Em uma modalidade específica, o título sérico é caracterizado como título específico de IgG. Em uma modalidade mais gurgeífíec, c ugswêpekc fg ecfgkc ngxg K tgcttcpjcfc fi ugngekqpcfc fg woc sequência VK3-5;LK7 g XK5-42LK30 Go woc modalidade, a sequência de ecfgkc ngxg K tgcttcplcfc fi woc ugswêpekc XK3-5;LK70 Go woc modalidade, a ugswêpekc fg ecfgkc ngxg K tgcttcplcfc fi woc ugswêpekc XK5-42LK30

[00193] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que expressa uma população de anticorpos específicos de antígeno, em que todas as cadeias leves da imunoglobulina da população de anticorpos específicos de antígeno compreendem uma região da cadeia leve variável (VL) humana derivada do mesmo segmento de gene de VL humana única e as cadeias pesadas da imunoglobulina compreendem uma região de cadeia pesada variável humana (VH) derivada de um de uma pluralidade de segmentos de gene de VH humana.

[00194] Em várias modalidades, os segmentos de gene de VH humana são selecionados de VH1-2, VH1-3, VH1-8, VH1-18, VH1-24, VH1-46, VH1-58, VH1-69, VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-15, VH3-20, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-33, VH3-43, VH3-48, VH3-53, VH3- 64, VH3-72, VH3-73, VH4-31, VH4-34, VH4-39, VH4-59, VH5-51, e VH6-1.

[00195] Em várias modalidades, o mesmo segmento de gene de VL jwocpc úpkec fi ugngekqpcfq fg wo ugiogpVq fg igpg fg XK3-39 humano e wo ugiogpvq fg igpg fg XK5-20 humano. Em várias modalidades, todas as cadeias leves da imunoglobulina compreendem um segmento de gene de cadeia leve J humana (JL) selecionado de um segmepvq fg igpg fg LK g wo Ln. Em uma modalidade específica, o segmento de JL humano de gene é ugngekqpcfq fg wo ugiogpVq fg igpg fg LK3 g wo LK7 jwocpqo Go xátkcu modalidades, o camundongo carece de uma sequência selecionada de um segmento de gene de VL da imunoglobulina de camundongo, um segmento de gene de JL da imunoglobulina de camundongo, e uma combinação dos mesmos. Em várias modalidades, a região da VL humana está operavelmente ligada a uma região de cadeia leve constante (CL) da imunoglobulina de ser humano, camundongo ou rato. Em uma modalidade específica, a região da VL humana está operavelmente ligafc c woc tgik«q EK fg ecowpfqpiqo Go woc modalidade específica, a região da VL humana está operavelmente ligada a woc tgik«q Ek fg tcvq0

[00196] Em várias modalidades, a região da VL humana é expressada a partir de um local endógeno da cadeia leve das endógenos imunoglobulina. Em várias modalidades, a região da VH humana está operavelmente ligada a uma região constante da cadeia pesada (CH) imunoglobulina de ser humano, camundongo ou rato. Em várias modalidades a região (CH) compreende uma sequência humana selecionada de uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, uma CH4, e/ou uma combinação das mesmas. Em várias modalidades, a região da VH humana é expressada a partir de um local endógeno da cadeia pesada da imunoglobulina.

[00197] Em um aspecto, um camundongo geneticamente modificado é fornecido que expressa uma pluralidade de cadeias pesadas da imunoglobulina associadas com uma única cadeia leve. Em uma modalidade, a cadeia pesada compreende uma sequência humana. Em várias modalidades, a sequência humana é selecionada de uma sequência variável, uma CH1, uma dobradiça, uma CH2, uma CH3, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, a única cadeia leve compreende uma sequência humana. Em várias modalidades, a sequência humana é selecionada de uma sequência variável, uma sequência constante, e uma combinação das mesmas. Em uma modalidade, o camundongo compreende um local da imunoglobulina endógena deficiente e expressa a cadeia pesada e/ou a cadeia leve de um transgene ou epissoma extracromossômico. Em uma modalidade, o camundongo compreende uma substituição em um local de camundongo endógeno de alguns ou todos os segmentos de gene endógenos da cadeia pesada de camundongo (isto é, V, D, J), e/ou alguns ou todas as sequências endógenas de cadeia pesada constante de camundongo (por exemplo, CH1, dobradiça, CH2, CH3, ou uma combinação das mesmas), e/ou algumas ou todas as sequências endógenas de cadeia leve de camundongo (por exemplo, V, J, constante, ou uma combinação das mesmas), com uma ou mais sequências da imunoglobulina humana.

[00198] Em um aspecto, um camundongo adequado para fabricar anticorpos que têm a mesma cadeia leve é fornecido, em que todos ou substancialmente todos os anticorpos fabricados no camundongo são expressados com a mesma cadeia leve. Em uma modalidade, a cadeia leve é expressada a partir de um local endógeno de endógenos cadeia leve.

[00199] Em um aspecto, um método para fabricar uma cadeia leve para um anticorpo humano é fornecido, compreendendo obter de um camundongo como aqui descrito uma sequência de cadeia leve e uma sequência de cadeia pesada, e utilizando a sequência de cadeia leve e a sequência de cadeia pesada na fabricação de um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo humano é um anticorpo biespecífico.

[00200] Em um aspecto, um método para identificar um domínio variável da cadeia pesada humana que é capaz de aglutinar um antígeno de interesse com uma cadeia leve engendrada como aqui descrito é fornecido, em que o método compreende fornecer um domínio variável da cadeia pesada derivado de um primeiro anticorpo que é capaz de aglutinar o antígeno, reemparelhando o domínio variável da cadeia pesada com uma sequência da linha germinativa de cadeia leve e transfectar uma célula de modo que cada uma seja expressada para formar um segundo anticorpo, expor o segundo anticorpo ao antígeno, e medir a aglutinação do segundo anticorpo ao antígeno.

[00201] Em uma modalidade, a cadeia leve do primeiro anticorpo eqortggpfg woc ugswêpekc XK3-39 humano. Em uma modalidade, a cadeia ngxg fq rtkogktq cpVkeqtrq eqortggpfg woc ugswêpekc XK5-20 humano. Em uma modalidade, a sequência da linha germinativa de cadeia leve compreende woc ugswêpekc Xk3-5; qw Xk5-20 humanos. Em várias modalidades, a aglutinação do segundo anticorpo ao antígeno é determinada pela comparação da aglutinação do primeiro anticorpo ao antígeno.

[00202] Qualquer uma das modalidades e aspectos aqui descritos pode ser usado em conjunção um com o outro, a menos que outro modo indicado ou evidente a partir do contexto. Outras modalidades tornar-se-ão evidentes a aqueles de habilidade na técnica a partir de uma revisão da descrição subsequente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[00203] A FIG. 1 ilustra uma estratégia de alvejamento para substituir segmentos de gene endógenos região variável de cadeia leve da imunoglobulina de camundongo com um gene da tgik«q Xk3-5;Lk7 jwocpc0

[00204] A FIG. 2 ilustra uma estratégia de alvejamento para substituir segmentos de gene endógenos da região variável de cadeia leve da kowpqinqdwnkpc fg ecowpfqpiq eqo woc tgik«q fg igpg fg Xk5-42Lk3 humana.

[00205] A FIG. 3 ilustra uma estratégia de alvejamento para substituir segmentos de gene endógenos da região variável de cadeia leve da kowpqinqdwnkpc fg ecowpfqpiq eqo woc tgik«q fg igpg fg XrtgD1LX7 humano.

[00206] A FIG. 4 mostra a porcentagem de células B CD19+ (eixo y) do sangue periférico para camundongos do tipo selvagem (WT), ecowpfqpiqu jqoqzkiqVqu rctc woc tgik«q fg ecfgkc ngxg XK3-5;LK7 tgcttcplcfc jwocpc gpigpftcfc *Xk3-5;Lk7 JQ+ g ecowpfqpiqu jqoqzkiqVqu rctc woc tgik«q fg ecfgkc ngxg XK5-42LK3 tgcttcpjcfc jwocpc gpigpftcfc *XK5-42LK3 JQ+.

[00207] A FIG. 5A mostra a expressão de mRNA relativa (eixo y) de woc ecfgkc ngxg fgtkxcfc fg Xk3-39 em um ensaio de PCR quantitativa wuanfq uqpfcu gurgeífíecu rctc c jwp>«q fg woc tgik«q fg ecfgkc ngxg XK3- 5;LK7 tgcttcpjcfc jwocnc gnignftcfc (Uqnfc fg Lwn>«q XK1-5;LK7+ g q ugiogpvq fg igpg fg Xk3-5; jwocpq *Uqpfc Xk3-39) em um camundongo jqoqzkiqVq rctc woc uwduVkVwk>«q fqu ugiognVqu fg igng fg XK g LK gnf„ignqu eqo ugiognvqu fg igng fg Xk g Lk jwocnqu (Jk+. wo camundongo do tipo selvagem (WT), e um camundongo heterozigoto para woc tgik«q fg ecfgkc ngxg Xk3-5;Lk7 tgcttcnlcfc jwocnc gnignftcfc (Xk3- 5;Lk7 JGV+0 Qu ukncku u«q nqtocnkzcfqu rctc c gzrtguu«q fg ecownfqniq Ek0 P0F0< n«q fgvgevcfq0

[00208] A FIG. 5B mostra a expressão de mRNA relativa (eixo y) de uma cadeia leve fgtkxcfc fg Xk3-39 em um ensaio de PCR quantitativo wucnfq uqnfcu gurgeífíecu rctc c jwn>«q fg woc tgik«q fg ecfgkc ngxg XK3 - 5;LK7 tgcttcnjcfc jwocnc gnignftcfc (Uqnfc fg Lwn>«q XK3-5;LK7+ g q ugiognvq fg igng fg Xk3-5; jwocnq (Uqnfc Xk3-39) em um camundongo jqoqzkiqVq rctc woc uwduVkVwk>«q fqu ugiognVqu fg igng fg XK g LK gnf„ignqu eqo ugiognvqu fg igng fg Xk g Lk jwocnqu (Jk+. wo camundongo do tipo selvagem (WT), e um camundongo homozigoto para woc tgik«q fg ecfgkc ngxg Xk3-5;Lk7 tgcttcnlcfc jwocnc gnignftcfc (Xk3- 5;Lk7 JQ+0 Qu ukncku u«q nqtocnkzcfqu rctc c gzrtguu«q fg ecownfqniq Ek0

[00209] A FIG. 5C mostra a expressão de mRNA relativa (eixo y) de woc ecfgkc ngxg fgtkxcfc fg Xk5-20 em um ensaio de PCR quantitativa usando sondas específicas para a junção de umc tgik«q fg ecfgkc ngxg Xk5- 42LK3 tgcttcnjcfc jwocnc gnignftcfc (Uqnfc fg Lwn>«q XK5-42LK3+ g q ugiognVq fg igng fg Xk5-42 jwocnq (Fqnfc Xk5-20) em um camundongo jqoqzkiqVq rctc woc uwduVkVwk>«q fqu ugiognVqu fg igng gnf„ignqu XK g LK com segmentos de gene fg XK g LK jwocpqu *JK+. wo ecowpfqpiq fq Vkrq selvagem (WT), e um camundongo heterozigoto (HET) e homozigotos (HO) rctc woc tgik«q fg ecfgkc ngxg Xk5-42Lk3 tgcttcplcfc jwocpc gpigpftcfc Qu ukpcku u«q pqtocnkzcfqu rctc c gzrtguu«q fg EK fg ecowpfqpiqo

[00210] A FIG. 6A mostra títulos de IgM (esquerda) e IgG (direita) em camundongos do tipo selvagem (WT; N = 2) e homozigotos para uma região fg ecfgkc ngxg Xk3-5;Lk7 tgcttcplcfc jwocpc gpigpftcfc *Xk3-5;Lk7 JQ= P ? 4+ kowpkzcfq eqo β-galactosidase.

[00211] A FIG. 6B mostra o título de imunoglobulina total (IgM, IgG, IgA) em camundongos do tipo selvagem (WT; N = 5) e homozigotos para woc tgik«q fg ecfgkc ngxg Xk5-42Lk3 tgcttcplcfc jwocpc gpigpftcfc *Xk5- 42Lk3 JQ= P ? 7+ kowpkzcfqu eqo β-galatosidase.

[00212] A FIG. 7A mostra um esquemático de anticorpos monoespecíficos (Precursor-1 e Precursor-2) e um anticorpo biespecífico (Biespecífico) construído a partir de regiões variáveis de cadeia pesada de cada anticorpo monoespecífico precursor. Uma região variável de cadeia leve comum (escurecida) é indicada no anticorpo biespecífico.

[00213] A FIG. 7B mostra um esquemático para as características de aglutinação de dois anticorpos monoclonais precursores (Precursor-1 e Precursor-2) para um antígeno de interesse, assim como a característica de aglutinação de um anticorpo biespecífico construído a partir de regiões de cadeia pesada emparelhadas de cada anticorpo precursor monoespecífico com uma cadeia leve comum. A capacidade do anticorpo biespecífico para aglutinar a dois epítopos distintos do antígeno de interesse separadamente (esquerda fundo) ou simultaneamente (direita fundo) é indicada.

[00214] A FIG. 8 mostra um gráfico de barra da aglutinação de 300 nM de anticorpos biespecíficos (barras escurecidas) e monoespecíficos (barras listradas e cinzas) a uma superfície de Antígeno E monomérico capturado em unidades de BIACORE® (RU). O anticorpo monoclonal precursor-1 (P1 Ab), monoclonal precursor-2 (P2 Ab) e anticorpos biespecíficos (BsAb) são indicados.

[00215] A FIG. 9 mostra dois locais de cadeia leve da imunoglobulina igpgVkecogpVg oqfkfíecfqu gpf„igpqu *rqt gzgornq. ecfgkc ngxg K+O Q nqecn no topo (DLC-5J) contém um fragmento de DNA humano engendrado (linha nkuvtcfc+ eqpvgpfq fqku ugiogpvqu fg igpg Xk jwocpqu g ekpeq ugiogpvqu fg igpg Lk jwocpqu0 Q nqecn pq hwpdo (DLC-1J) contém um fragmento de DNA jwocpq gpigpftcfq *nkpjc nkuvtcfc+ eqpvgpfq fqku ugiogpvqu fg igpg Xk jwocpqu g wo ugiogpVq fg igpg LK jwocpqo Ecfc nqecn fi ecrcz fg tgcttcpjct rctc hqtoct woc tgik«q Xk jwocpc qrgtcxgnogpvg ligada a uma região constapvg fg ecfgkc ngxg gpf„igpc *rqt gzgornq. woc Ek+0 Qu rtqoqvqtgu fg imunoglobulina (local acima da seta), exons líderes (setas fechadas), e os dois ugiogpvqu fg igpg Xk jwocpqu *ugvcu cdgtvcu+. vqfqu hncpswgcfqu c oqpvcpvg *7Ó+ rqt wo ecuugvg fg pgqokekpc contendo sítios de recombinação Frt são mostrados. As sequências de sinal de recombinação engendradas com cada wo fqu ugiogpvqu fg igpg *Xk g Lk+ jwocpqu u«q kpfkecfqu rgnqu qxcku abertos justapostos com cada segmento de gene.

[00216] A FIG. 10A, no painel superior, mostra gráficos de contorno representativos da medula óssea tingida quanto às células B e T (CD19+ e CD3+, respectivamente) de um camundongo do tipo selvagem (WT) e um ecowpfqpiq jqoqzkiqvq rctc fqku ugiogpvqu fg igpg Xk jwocpqu g ekpeq Lk jwocpqu *FNE-5J). O painel de fundo mostra os gráficos de contorno representativos de medula óssea restrito em CD19+ e tingido para ckit+ e CD43+ de um camundongo do tipo selvagem (WT) e um camundongo jqoqzkiqvq rctc fqku ugiogpvqu fg igpg Xk jwocpqu g ekpeq Lk jwocpqs (DLC-5J). As células B Pro e Pre são indicadas nos gráficos de contorno do painel de fundo.

[00217] A FIG. 10B mostra o número de células B Pro (CD19+CD43+ckit+) e Pre (CD19+CD43-ckit-) na medula óssea colhida dos fêmures de camundongos tipo selvagem (WT) e camundongos homozigotos rctc fqku ugiogpVqu fg igpg XK jwocpqu g ekpeq LK jwocpqu *FNE-5J).

[00218] A FIG. 11A mostra gráficos de contorno representativos da medula óssea restritos em singletos tingidos para imunoglobulina M (IgM) e B220 de um camundongo tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto rctc fqku ugiogpvqu fg igpg Xk jwocpqu g ekpeq Lk jwocpqu *FNE-5J). As células B imaturas, maduras e pro/pre são indicadas em cada um dos gráficos de contorno.

[00219] A FIG. 11B mostra o número total de células B (CD19+), B imaturas (B220intIgM+) e B maduras (B220hiIgM+) na medula óssea isolada dos fêmures de camundongos do tipo selvagem (WT) e camundongos jqoqzkiqVq rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc g ekpeq fc LK humana (DLC-5J).

[00220] A FIG. 12A mostra gráficos de contorno representativos de medula óssea restringidas em singletos tingidos para a imunoglobulina M (IgM) e B220 de um camundongo do tipo selvagem (WT) e um camundongo jqoqzkiqVq rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq fc Lk humana (DLC-5J). As células B imaturas, maduras e pro/pre são indicadas em cada um dos gráficos de contorno.

[00221] A FIG. 12B mostra gráficos de contorno representativos de medula óssea restringida em células B imaturas (B220intIgM+) e maduras (B220hiIgM++ Vkpikfcu rctc c gzrrguu«q fg IgA g KÍK kuqncfcu fqu feowrgu fg um camundongo do tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para fqku ugiogpVqu fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq fc Lk jwocpc *FNE-5J).

[00222] A FIG. 13A, no painel superior, mostra gráficos de contorno representativos de esplenócitos restringidos em singletos e tingidos para células B e T (CD19+ e CD3+, respectivamente) de um camundongo do tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para dois segmentos de gene fc Xk jwocpc g ekpeq fc Lk jwocpc *FNE-5J). O painel de fundo mostra gráficos de contorno representativos de esplenócitos restringidos em CD19+ e tingidos para a imunoglobulina D (IgD) e imunoglobulina M (IgM) a partir de um camundongo do tipo selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para fqku ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc g ekpeq fc LK jwocpc *FNE-5J). As células B maduras (54 para WT, 56,9 para DLC-5J) e transicionais (23,6 para WT, 25,6 para DLC-5J) são indicadas em cada um dos gráficos de contorno.

[00223] A FIG. 13B mostra o número total de células B CD19+, células B transicionais (CD19+IgMhiIgDlo) e células B maduras (CD19+IgMloIgDhi) em baços colhidos de camundongos do tipo selvagem *YV+ g ecowpfqpiqu jqoqzkiqVqu rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc g ekpeq fc Lk jwocpc *FNE-5J).

[00224] A FIG. 14A mostra gráficos de contorno representativos de gurngp„ekVqu IgA- g KÍK- tguVtkpikfqu go EF3;- fg wo ecowpfqpiq fq Vkrq selvagem (WT) e um camundongo homozigoto para dois segmentos de gene fc Xk jwocpc g ekpeq fc Lk jwocpc *FNE-5J).

[00225] A FIG. 14B mostra o número total de células B (CD19+), célwncu D IgA- (EF3;-KgX-+ g efinwncu D KÍK- *EF3;-KÍK-+ go dc>qu colhidos de camundongos do tipo selvagem (WT) e homozigotos para dois ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq fc Lk jwocpc (FNE-5J).

[00226] A FIG. 15A mostra o desenvolvimento de célula B periférica em ecowpfqpiqu jqoqzkiqvq rctc fqku ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq fc LK jwocpco Q rtkogktq gtáfíeq fg eqpVqtpq (gzVtgoc guswgtfc+ mostra esplenócitos CD93+ e B220+ restringidos em CD19+ indicando células B imaturas (39,6) e maduras (57,8). O segundo gráfico de contorno (central superior) mostra a expressão de IgM+ e CD23+ em células B imaturas indicando as populações de célula B T1 (33,7; IgD- IgM+CD21loCD23-), T2 (21,2; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) e T3 (29,1). O terceiro gráfico de contorno (centro inferior) mostra a expressão CD21+ (CD35+) e IgM+ de células B maduras indicando uma pequena população (14,8) que dá origem às células B da zona marginal e uma segunda população (70,5) que dá origem às células B foliculares (FO). O quarto gráfico de contorno (direita superior) mostra a expressão de B220+ e CD23+ em células B maduras indicando populações de célula B na zona marginal (90,5; MZ) e precursora de zona marginal (7,3; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+). O quinto gráfico de contorno (direita inferior) mostra a expressão de IgD+ e IgM+ em células B maduras indicando populações de célula B FO-I (79,0; I DhiI MloCD21midCD23+) e FO II (15 1 I DhiI MhiCD21midCD23+) A g g e - ,; g g . porcentagem de células dentro de cada região restringida é mostrada.

[00227] A FIG. 15B mostra o desenvolvimento de célula B periférica em camundongos do tipo selvagem. O primeiro gráfico de contorno (extrema esquerda) mostra esplenócitos CD93+ e B220+ restringidos em CD19+ indicando células B imaturas (31,1) e maduras (64,4). O segundo gráfico de contorno (central superior) mostra a expressão de IgM+ e CD23+ em células B imaturas indicando as populações de célula B T1 (28,5; IgD- IgM+CD21loCD23-), T2 (28,7; IgDhiIgMhiCD21midCD23+) e T3 (30,7). O terceiro gráfico de contorno (centro inferior) mostra a expressão de CD21+ (CD35+) e IgM+ de células B maduras indicando uma população pequena (7,69) que dá origem às células B da zona marginal e uma segunda população (78,5) que dá origem às células B foliculares (FO). O quarto gráfico de contorno (direita superior) mostra a expressão de B220+ e CD23+ em células B maduras indicando as populações de célula B da zona marginal (79,9; MZ) e do precursor da zona marginal (19,4; IgMhiIgDhiCD21hiCD23+). O quinto gráfico de contorno (direita inferior) mostra a expressão de IgD+ e IgM+ em células B maduras indicando as populações de célula B FO-I (83,6; I DhiI MloCD21midCD23+) e FO II (13 1 I DhiI MhiCD21midCD23+) A g g e - ,; g g . porcentagem de células dentro de cada região restringida é mostrada.

[00228] A FIG. 16 mostra o número total das populações de célula B transicional, zona marginal e folicular nos baços colhidos de camundongos do tipo selvagem (WT) e homozigoto para dois ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc g ekpeq fc LK jwocpc *FNE-5J).

[00229] A FIG. 17 mostra a expressão de mRNA relativa na medula „uugc *gkzq {+ fg ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5-42 g fgtkxcfcu fg Xk3-39 em um ensaio de PCR quantitativa usando sondas específicas para segmentos fg igpg Xk5-42 qw Xk3-39 em camundongos homozigotos para uma uwduVkVwk>«q fqu ugiogpVqu fg igpg XK g LK gpf„igpqu eqo ugiogpVqu fg igpg Xk g Lk jwocpqu *Jk+. ecowpfqpiqu fq vkrq ugnxcigo *YV+. camundongos homozigotos para dois segmentos de gene fc Xk jwocpc g ekpeq ugiogpVqu fg igpg fc Lk jwocpc *FNE-5J) e camundongos jqoqzkiqVqu rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc g wo ugiogpVq fg igpg fc Lk jwocpc *FNE-1J). Os sinais são normalizados para a expressão de Ek fg ecowpfqpiq0 PF< p«q fgVgeVcfq0

[00230] A FIG. 18 mostra a expressão de mRNA relativa em baços kpVgitcku *gkzq {+ fg ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fc Xk5-42 g fgtkxcfcu fc Xk3-39 em um ensaio de PCR quantitativo usando sondas específicas para os ugiogpVqu fg igpg fg Xk5-42 qw Xk3-39 em camundongos homozigotos para woc uwduVkVwk>«q fqu ugiogpVqu fg igpg XK g LK gpf„igpqu eqo ugiogpVqu fg igpg fc Xk g Lk jwocpc *Jk+. ecowpfqpiqu fq Vkrq ugnxcigo *YV+. ecowpfqpiqu jqoqzkiqVqu rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq ugiogpVqu fg igpg fc Lk jwocpc (DLC-5J) e camundongos jqoqzkiqVqu rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc Xk jwocpc g wo ugiogpVq fg igpg fc Lk jwocpc *FNE-1J). Os sinais são normalizados para a expressão de ecowpfqpiq Ek0 PF< p«q fgVgeVcfq0

[00231] A FIG. 19 mostra uma ilustração geral de recombinação de wo ugiogpVq fg igpg X g wo L fg wo cngnq fg ecfgkc ngxg k fc imunoglobulina em um camundongo e a estrutura do local da cadeia leve antes do rearranjo (superior) e depois do rearranjo (inferior). Um tal rearranjo como mostrado é apenas um de vários eventos de rearranjo possíveis.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[00232] Esta invenção não é limitada aos métodos particulares, e condições experimentais descritas, visto que tais métodos e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é para o propósito de descrever apenas modalidades particulares, e não é intencionada a ser limitante, visto que o escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações.

[00233] A menos que de outro modo definido, todos os termos e frases aqui usados incluem os significados de que os termos e frases têm obtido na técnica, a menos que o contrário seja claramente indicado ou claramente evidente a partir do contexto no qual o termo ou frase são usados. Embora qualquer um dos métodos e materiais similares ou equivalentes a aqueles aqui descritos possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, métodos e materiais particulares são agora descritos. Todas as publicações mencionadas são por meio deste incorporadas por referência em sua totalidade.

[00234] Q Vgtoq “cpVkeqtrq”. como aqui usado, inclui moléculas de imunoglobulina compreendendo quatro cadeias de peptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas pelas ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região de cadeia pesada variável (VH) e uma região de cadeia pesada constante (CH). A região de cadeia pesada constante compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região de cadeia leve variável (VL) e uma região de cadeia leve constante (CL). As regiões VH e VL podem ser subdivididas ainda em regiões de hipervariabilidade, chamadas de regiões determinadoras de complementaridade (CDR), intercaladas com regiões que são mais conservadas, chamada de regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL compreende três CDRs e quatro FRs, dispostas a partir do terminal amino para terminal carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (as CDRs de cadeia pesada podem ser abreviadas como HCDR1, HCDR2 e HCDR3; as CDRs de cadeia leve podem ser abreviados como LCDR1. NEFT4 e NEFT5o Q Vgtoq cpVkeqtrq fg “alVc cfmkfcfe” tefete-se a um anticorpo que tem um KD com relação ao seu epítopo alvo de cerca de 109 M ou mais baixa (por exemplo, de cerca de 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, ou cerca de 1 x 10-12 M). Em uma modalidade, KD é medido pela ressonância de plásmon de superfície, por exemplo, BIACORE®; em uma outra modalidade, KD é medido pelo ELISA.

[00235] C ftcue “cpVkeqtrq dkeureeífíeq” tefete-se a um anticorpo capaz de aglutinar seletivamente dois ou mais epítopos. Anticorpos biespecíficos incluem fragmentos de dois anticorpos monoclonais diferentes (FIG. 7A) e geralmente compreendem duas cadeias pesadas não idênticas derivadas dos dois anticorpos monoclonais diferentes, com cada cadeia pesada especificamente aglutinando um epítopo diferente — cada uma em duas moléculas diferentes (por exemplo, epítopos diferentes em dois imunógenos diferentes; ver a FIG. 7B, esquerda fundo) ou na mesma molécula (por exemplo, epítopos diferentes no mesmo imunógeno; ver a FIG. 7B, direita fundo). Se um anticorpo biespecífico é capaz de aglutinar seletivamente dois epítopos diferentes (um primeiro epítopo e um segundo epítopo), a afinidade da primeira cadeia pesada para o primeiro epítopo geralmente será de pelo menos uma a duas ou três ou quatro ou mais ordens de magnitude mais baixa do que a afinidade da primeira cadeia pesada para o segundo epítopo, e vice e versa. Os epítopos especificamente ligados pelo anticorpo biespecífico podem estra no mesmo alvo ou um diferente (por exemplo, na mesma proteína ou uma diferente; ver a FIG. 7B). Os anticorpos biespecíficos exemplares incluem aqueles com uma primeira cadeia pesada específica para um antígeno de tumor e uma segunda cadeia pesada específica para um marcador citotóxico, por exemplo, um receptor de Fc (por exemplo, FcyTK, HeyTKI, HeyTKII, eVeo+ qw wo octecfqt fe efinwnc V *rqt ezeornq, EF5, CD28, etc.). Além disso, a segunda região variável da cadeia pesada pode ser substituída com uma região variável da cadeia pesada tendo uma especificidade desejada diferente. Por exemplo, um anticorpo biespecífico com uma primeira cadeia pesada específica para um antígeno de tumor e uma segunda cadeia pesada específica para uma toxina pode ser emparelhada de modo a liberar uma toxina (por exemplo, saporina, alcalóide vinca, etc.) a uma célula de tumor. Outros anticorpos biespecíficos exemplares incluem aqueles com uma primeira cadeia pesada específica para um receptor ativador (por exemplo, receptor de célula B, FcyTK, HeyTKIC, HeyTKIIC. HeyTK, receptor de célula T, etc.) e uma segunda cadeia pesada específica para um tgegrVqt kPkdkfqt *rqt gzgornq. HeyTKID, EF7. EF44. EF94. EF522c. gVeo+. Tais anticorpos biespecíficos podem ser construídos para condições terapêuticas associadas com a ativação de célula (por exemplo alergia e asma). Os anticorpos biespecíficos podem ser fabricados, por exemplo, pela combinação de cadeias pesadas que reconhecem epítopos diferentes do mesmo imunógeno ou diferente (FIG. 7B). Por exemplo, as sequências de ácido nucléico que codificam as sequências da cadeia pesada variável que reconhecem epítopos diferentes do mesmo imunógeno ou diferente podem ser fundidos com as sequências de ácido nucléico que codificam as mesmas regiões constantes de cadeia pesada ou diferentes, e tais sequências podem ser expressadas em uma célula que expressa uma cadeia leve da imunoglobulina. Um anticorpo biespecífico típico tem duas cadeias pesadas cada uma tendo três CDRs de cadeia pesada, seguidas por (do terminal N para o terminal C) um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3, e uma cadeia leve da imunoglobulina que não confere especificidade de aglutinação de epítopo mas que pode se associar com cada cadeia pesada, ou que pode se associar com cada cadeia pesada e que pode aglutinar um ou mais dos epítopos aglutinados pelas regiões de aglutinação de epítopo de cadeia pesada, ou que pode associar com cada cadeia pesada e permitir a aglutinação ou uma ou ambas das cadeias pesadas a um ou ambos os epítopos.

[00236] Q Vgtoq “efinwnc” kpenwk swcnswgt efinwnc swg ugjc cfgswcfc rctc expressar uma sequência de ácido nucléico recombinante. As células incluem aquelas de procariotas e eucariotas (célula única ou célula múltipla), células bacterianas (por exemplo, cepas da E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactérias, células fúngicas, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetais, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas com baculovírus, Trichoplusia ni, etc.), células de animal não humano, células humanas, ou fusões de célula tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, símio, hamster, rato ou camundongo. Em algumas modalidades, a célula é eucariótica e é selecionado das seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula retinal, Vero, CV1, renal (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula de tumor, e uma linhagem de célula derivada de uma célula anteriormente mencionada. Em algumas modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo, uma célula retinal que expressa um gene de Viral (por exemplo, uma célula PER.C6®).

[00237] C htcug “tgik«q fgVgtoipcfqtc fg eqorngogpVctkfcfg,” ou o Vgtoq “EFT,” kpenwk woc ugswêpekc fg coipqáekfq eqfkfíecfc rqt woc sequência de ácido nucléico de um dos genes da imunoglobulina do organismo que normalmente (isto é, em um animal do tipo selvagem) aparece entre duas regiões de estrutura em uma região variável de uma cadeia leve ou uma pesada de uma molécula de imunoglobulina (por exemplo, um anticorpo ou um receptor de célula T). Uma CDR pode ser codificada, por exemplo, por uma sequência da linha germinativa ou uma sequência rearranjada ou não rearranjada, e, por exemplo, por uma célula B ou uma célula T ingênua ou uma madura. Uma CDR pode ser somaticamente mutada (por exemplo, variar de uma sequência codificado em uma linha germinativa do animal), substituições, adições, ou deleções humanizadas, e/ou modificadas com aminoácido. Em algumas circunstâncias (por exemplo, para uma CDR3), as CDRs podem ser codificadas por duas ou mais sequências (por exemplo, sequências da linha germinativa) que não são contíguas (por exemplo, em uma sequência de ácido nucléico não rearranjada) mas são contíguos em uma sequência de ácido nucléico de célula B, por exemplo, como o resultado da junção ou conexão das sequências (por exemplo, recombinação V-D-J para formar uma cadeia pesada CDR3).

[00238] Q Vgtoq “eqnugtxcVkxq,” swcnfq wucfq rctc fguetgxgt woc substituição de aminoácido conservativa, inclui a substituição de um resíduo de aminoácido por um outro resíduo de aminoácido tendo um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). No geral, uma substituição de aminoácido conservativa não mudará substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína, por exemplo, a capacidade de uma região variável para aglutinar especificamente um epítopo alvo com uma afinidade desejada. Os exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades químicas similares incluem cadeias laterais alifáticas tais como glicina, alanina, valina, leucina, e isoleucina; cadeias laterais de hidroxila alifática tais como serina e treonina; cadeias laterais contendo amida tais como asparagina e glutamina; cadeias laterais aromáticas tais como fenilalanina, tirosina, e triptofano; cadeias laterais básicas tais como lisina, arginina, e histidina; cadeias laterais ácidas tais como ácido aspártico e ácido glutâmico; e, cadeias laterais contendo enxofre tais como cisteína e metionina. Os grupos de substituição de aminoácidos conservativas incluem, por exemplo, valina/leucina/isoleucina, fenilalanina/ tirosina, lisina/arginina, alanina/valina, glutamato/aspartato, e asparagina/ glutamina. Em algumas modalidades, uma substituição de aminoácido conservativa pode ser a substituição de qualquer resíduo nativo em uma proteína com alanina, como usado, por exemplo, na mutagênese de varredura de alanina. Em algumas modalidades, uma substituição conservativa é fabricada que tem um valor positivo na matriz de probabilidade log PAM250 divulgada em Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256: 1443-45, por meio deste incorporada por referência. Em algumas modalidades, a substituição é uma substituição moderadamente conservativa em que a substituição tem um valor não negativo na matriz de probabilidade log PAM250.

[00239] Em algumas modalidades, as posições de resíduo em uma cadeia leve da imunoglobulina ou cadeia pesada diferem por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas. Em algumas modalidades, as posições de resíduo em uma cadeia leve da imunoglobulina ou fragmento funcional do mesmo (por exemplo, um fragmento que permita a expressão e secreção, por exemplo, de uma célula B) não são idênticas a uma cadeia leve cuja sequência de aminoácido é aqui listada, mas difere por uma ou mais substituições de aminoácido conservativas.

[00240] C ftcug “proteína de aglutinação fg gpitopo” kpenwk woc proteína tendo pelo menos uma CDR e que é capaz de seletivamente reconhecer um epítopo, por exemplo, é capaz de aglutinar um epítopo com um KD que seja de aproximadamente um micromolar ou mais baixo (por exemplo, um KD que é de cerca de 1 x 10-6 M, 1 x 10-7 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-9 M, 1 x 10-10 M, 1 x 10-11 M, ou de cerca de 1 x 10-12 M). As proteínas terapêuticas de aglutinação de epítopo (por exemplo, anticorpos terapêuticos) frequentemente requerem um KD que está na faixa nanomolar ou na picomolar.

[00241] C frcue “frciogpVq Iwnekqncl” kpenwk frcioepVqu fg rtqVgipcu de aglutinação de epítopo que possam ser expressadas, secretadas, e especificamente aglutinam a um epítopo com um KD na faixa micromolar, nanomolar ou picomolar. O reconhecimento específico inclui ter um KD que esteja pelo menos na faixa micromolar, na faixa nanomolar, ou na faixa picomolar.

[00242] Q Vgtoq "Iknlic igtoipcVkxc” kpenwk tefetêpekc c woc uequência de ácido nucléico da imunoglobulina em uma célula não somaticamente mutada, por exemplo, uma célula B não somaticamente mutada ou pré célula B ou célula hematopoiética.

[00243] C htcue “ecfekc reucfc.” qw “ecfekc reucfc fc kowpqinqdwnkpc” kpenwk woc ugswência da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina de qualquer organismo. Os domínios variáveis de cadeia pesada incluem três CDRs da cadeia pesada e quatro regiões FR, a menos que de outro modo especificado. Os fragmentos das cadeias pesadas incluem CDRs, CDRs e FRs, e combinações dos mesmos. Uma cadeia pesada típica tem, a seguir do domínio variável (do terminal N para o terminal C), um domínio CH1, uma dobradiça, um domínio CH2, e um domínio CH3. Um fragmento funcional de uma cadeia pesada inclui um fragmento que é capaz de especificamente reconhecer um epítopo (por exemplo, reconhecer o epítopo com um KD nas faixas micromolar, nanomolar ou picomolar), que é capaz de expressar e secretar a partir de uma célula, e compreendendo pelo menos uma CDR.

[00244] Q Vetoq “kfepVkfcfe” swcpfq wucfq eo eqpez«q eqo c sequência inclui identidade como determinada por vários algoritmos diferentes conhecidos na técnica que possam ser usados para medir a identidade de sequência de nucleotídeo e/ou aminoácido. Em algumas modalidades aqui descritas, as identidades são determinadas usando um alinhamento ClustalW v. 1.83 (lento) utilizando uma penalidade de intervalo aberto de 10,0, uma penalidade de intervalo de extensão de 0,1, e usando uma matriz de similaridade de Gonnet (MACVECTOR® 10.0.2, MacVector Inc., 2008). O comprimento das sequências comparadas com relação à identidade de sequências dependerá das sequências particulares, mas no caso de um domínio constante de cadeia leve, o comprimento deve conter a sequência de comprimento suficiente para dobrar em uma domínio constante de cadeia leve que seja capaz de autoassociação para formar um domínio constante de cadeia leve canônica, por exemplo, capaz de formar duas folhas beta compreendendo filamentos beta e capaz de interagir com pelo menos um domínio CH1 de um ser humano ou um camundongo. No caso de um domínio CH1, o comprimento da sequência deve conter a sequência de comprimento suficiente para dobrar em um domínio CH1 que é capaz de formar duas folhas beta compreendendo filamentos beta e capaz de interagir com pelo menos um domínio constante da cadeia leve de um camundongo ou um ser humano.

[00245] C ftcug “oqnfiewnc fg kowpqinqdwnkpc” kpenwk fwcu ecfgkcu pesadas da imunoglobulina e duas cadeias leves da imunoglobulina. As cadeias pesadas podem ser idênticas ou diferentes, e as cadeias leves podem ser idênticas ou diferentes.

[00246] C ftcug “ecfgkc ngxg” kpenwk woc ugswêpekc fg ecfgkc ngxg fc imunoglobulina de qualquer organismo, e a menos que outro modo gurgekfkecfq kpenwk ecfgkcu ngxgu K e n humanas e um VpreB, assim como cadeias leves substitutas. Os domínios variáveis de cadeia leve (VL) tipicamente incluem três CDRs de cadeia leve e quatro regiões de estrutura (FR), a menos que de outro modo especificado. Geralmente, uma cadeia leve de tamanho natural inclui, do terminal amino para o terminal carboxila, um domínio VL que inclui FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, e um domínio constante da cadeia leve. As cadeias leves incluem aquelas, por exemplo, que não aglutinam seletivamente um primeiro ou um segundo epítopo seletivamente aglutinado pela proteína de aglutinação de epítopo na qual eles aparecem. As cadeias leves também incluem aquelas que aglutinam e reconhecem, ou auxiliam a cadeia pesada com a aglutinação e reconhecimento, um ou mais epítopos seletivamente aglutinados pela proteína de aglutinação de epítopo na qual eles aparecem. As cadeias leves comuns são cswgncu fgtkxcfcu fg woc ugswêpekc fq XK3-5;LK7 jwocpq tgcttcpjcfq qw woc ugswêpekc fq XK5-42LK3 jwocpq tgcttcpjcfq, g kpenwgo xgtuões somaticamente mutadas (por exemplo, maturada por afinidade).

[00247] C htcug “hckzc mietqoqnct” fi kpVgpekqpcfc c ukipkhkect 3 c 999 mietqoqnctgu= c htcug “fakzc pcpqoqnct” fi kpVgpekqpcfc c ukipkhkect 3 c 999 pcpqoqnctgu= c htcug “hckzc rkeqoqnct” fi kpVgpekqpcfa a significar 1 a 999 picomolares.

[00248] C htcug “uqocvkecogpvg owvcfq” kpenwk tghgtêpekc c woc sequência de ácido nucléico de uma célula B que sofreu a comutação de classe, em que a sequência de ácido nucléico de uma região variável da imunoglobulina (por exemplo, um domínio variável da cadeia pesada ou incluindo uma CDR da cadeia pesada ou sequência de FR) na célula B comutada em classe não é idêntica à sequência de ácido nucléico na célula B antes da comutação de classe, tal como, por exemplo, uma diferença em uma CDR ou sequência de ácido nucléico de estrutura entre uma célula B que não sofreu a comutação de classe e uma célula B que sofreu a comutação de encuugo “UqocVkecogpVg owVcfq” kpenwk tgfetêpekc §u ugswêpekcu fg áekfq nucléico das células B maturadas por afinidade que não são idênticas às sequências da região variável da imunoglobulina correspondentes nas células B que não são maturadas por afinidade (isto é, as sequências no genoma das efinwncu fc nkpjc igtokpcvkxc+0 C htcug “uqocvkecogpvg owvcfq” vcobém inclui referência a uma sequência de ácido nucléico da região variável da imunoglobulina de uma célula B depois da exposição da célula B a um epítopo de interesse, em que a sequência de ácido nucléico difere da sequência de ácido nucléico correspondente antes da exposição da célula B ao gpítopo fg kpVgtguugo C ftcug “uqoctkecogptg owVcfq” tgfetg-se às sequências de anticorpos que foram geradas em um animal, por exemplo, um camundongo tendo as sequências de ácido nucléico da região variável da imunoglobulina humana, em resposta a uma inoculação de imunógeno, e que resulta dos processos de seleção inerentemente operativo em um tal animal.

[00249] Q tgtoq “p«q tgattcpjcfq,” eqo tgfgtêpekc c woc ugswêpekc fg ácido nucléico, inclui sequências de ácido nucléico que existem na linha germinativa de uma célula de animal.

[00250] C ftcug “fqoípkq xctkáxgn” kpenwk woc ugswêpekc fg aminoácido de uma cadeia leve ou pesada da imunoglobulina (modificada como desejado) que compreende as seguintes regiões de aminoácido, na sequência do terminal N para o terminal C (a menos que outro modo indicado): FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Cadeia Leve Universal

[00251] Esforços anteriores para fabricar proteínas de aglutinação de epítopo multiespecíficas úteis, por exemplo, anticorpos biespecíficos, foram impedidos pela variedade de problemas que frequentemente compartilham um paradigma comum: a seleção ou manipulação in vitro de sequências para engendrar racionalmente, ou para engendrar através da tentativa-e-erro, um formato adequado para emparelhar uma imunoglobulina humana heterodimérica biespecífica. Infelizmente, a maioria se não todos dos métodos de engendramento in vitro fornecem amplamente atrativos ad hoc que são adequados, se algum, para moléculas individuais. Por outro lado, abordagens in vivo para utilizar organismos complexos para selecionar emparelhamento apropriado que são capazes de levar aos produtos terapêuticos humanos não foram realizados.

[00252] Camundongos contendo locais da imunoglobulina humana, regiões variáveis e constantes aleatoriamente inseridos no genoma de camundongo, são conhecidos na técnica. As cepas iniciais de tais camundongos contiveram um número limitado de segmentos de gene da imunoglobulina humana. Especificamente, um punhado de cepas contendo segmentos de gene da cadeia leve humana da imunoglobulina conteve um, três ou quatro segmentos de gene da VL da imunoglobulina humana e cinco segmentos de gene JL da imunoglobulina humana (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Research 20(23): 6287-6295; Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851; Lonberg et al. 1994, Nature 368: 856-859; Green et al. 1994, Nature Genetics 7: 13-21; Green e Jakobovits 1998, J. Exp. Med. 188(3): 483-495; Green 1999, J. Immunol. Methods 231: 11-23). Estes camundongos que contiveram apenas uns poucos segmentos de gene da VL da imunoglobulina humana como parte de transgenes totalmente humanos aleatoriamente inseridos no genoma do camundongo demonstraram números de célula B comprometidos, desenvolvimento de célula B prejudicado e outras deficiências imunes. A expressão dos genes VL da imunoglobulina jwocpc. eqoq fgVgeVcfqu rgnc gzrtguu«q uwrgthkeicn fg EK jwocpc pcu efinwncu D. hoi ociu dcizq fq swg c ecfgic ngxg K gpf„igpc swcpfq eqorctcfc com a do tipo selvagem. Surpreendentemente, a presente invenção fornece camundongos cujos números e desenvolvimento de célula B é quase do tipo selvagem em relação à quando os camundongos são engendrados nos locais fg ecfgic ngxg k fc iowpqinqdwnipc gpf„igpqu rctc eqpvgt wo qw fqiu ugiogpvqu fg igpg fc Xk fc iowpqinqdwnipc jwocpc *rqt gzgornq. qu Exemplos 2 e 14, Tabelas 3, 25 e 26, e FIGs. 4, 10A-18). Além disso, em algumas modalidades, os camundongos fornecidos pela presente invenção, são capazes de gerar vários anticorpos quiméricos reversos de alta afinidade contendo domínios VH e VL humanos em resposta ao antígeno, em que os domínios VL cada um contém um de dois segmentos de gene possíveis da VL humana e um de cinco segmentos de gene possíveis da JL humana (por exemplo, ver os Exemplos 5 a 10, 12, e 14). Assim, ao contrário das cepas preliminares de camundongos engendrados com minilocais da cadeia leve da imunoglobulina humana (isto é, um número limitado de segmentos de gene da imunoglobulina humana), os camundongos engendrados presentemente fornecidos que contêm um número limitado de segmentos de gene da VL da imunoglobulina humana (um ou dois) e, em algumas modalidades, dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) segmentos de gene JL da imunoglobulina humana, surpreendentemente exibem números de célula B normais, expressão de cadeia leve da imunoglobulina normal, e desenvolvimento de célula B normal. Além disso, tais camundongos fornecidos também não mostraram capacidade reduzida ou prejudicada para montar respostas imunes robustas aos antígenos múltiplos como um resultado de um repertório limitado de cadeia leve da imunoglobulina. Consequentemente, camundongos são fornecidos que compreendem um local humanizado da VL compreendendo não mais do que dois segmentos de gene da VL da imunoglobulina humana não rearranjados e dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5) segmentos de gene JL da imunoglobulina humana — ou não mais do que dois segmentos VLJL humanos rearranjados — e que exibem populações de célula B do tipo selvagem em número, e exibem desenvolvimento de célula B do tipo selvagem.

[00253] Geralmente, as sequências de camundongo nativas frequentemente não são uma boa fonte para as sequências terapêuticas humanas. Quanto a pelo menos esta razão, gerar regiões variáveis de cadeia pesada da imunoglobulina de camundongo que formam par com uma cadeia leve humana comum é de utilidade prática limitada. Mais esforços de engendramento in vitro seriam gastos em um processo de tentativa-e-erro para tentar humanizar as sequências variáveis da cadeia pesada de camundongo enquanto se espera reter a especificidade e afinidade de epítopo enquanto se mantém a capacidade para ligar com a cadeia leve humana comum, com resultado incerto. No final de um tal processo, o produto final pode manter um pouco da especificidade e afinidade, e associar-se com a cadeia leve comum, mas basicamente imunogenicidade em um ser humano provavelmente permaneceria um risco profundo.

[00254] Portanto, um camundongo adequado para fabricar produtos terapêuticos humanos incluiria um repertório adequadamente grande de segmentos de gene da região variável da cadeia pesada humana no lugar dos segmentos de gene endógenos da região variável da cadeia pesada de camundongo. A região variável dos segmentos de gene da cadeia pesada humana deve ser capaz de rearranjar e recombinar com um domínio constante endógeno da cadeia pesada de camundongo para formar uma cadeia pesada quimérica reversa (isto é, uma cadeia pesada compreendendo um domínio variável humano e uma região constante de camundongo). A cadeia pesada deve ser capaz de comutação de classe e hipermutação somática de modo que um repertório adequadamente grande dos domínios variáveis da cadeia pesada são disponíveis para o camundongo selecionar um que possa associar-se com o repertório limitado das regiões variáveis de cadeia leve humanas.

[00255] Um camundongo que seleciona uma cadeia leve comum para uma pluralidade de cadeias pesadas tem uma utilidade prática. Em várias modalidades, os anticorpos que expressam em um camundongo que possa expressar apenas uma cadeia leve comum terá cadeias pesadas que possam associar-se e expressar com uma cadeia leve idêntica ou substancialmente idêntica. Isto é particularmente útil na fabricação de anticorpos biespecíficos. Por exemplo, um tal camundongo pode ser imunizado com um primeiro imunógeno para gerar uma célula B que expressa um anticorpo que especificamente aglutina um primeiro epítopo. O camundongo (ou um camundongo geneticamente o mesmo) pode ser imunizado com um segundo imunógeno para gerar uma célula B que expressa um anticorpo que especificamente aglutina o segundo epítopo. As regiões de cadeia pesada variáveis podem ser clonadas a partir das células B e expressadas com a mesma região constante da cadeia pesada e a mesma região de cadeia leve variável (por exemplo, uma cadeia leve comum) em uma célula para fabricar um anticorpo biespecífico, em que o componente de cadeia pesada variável do anticorpo biespecífico foi selecionado por um camundongo para associar e expressar com o componente de cadeia leve variável (ou cadeia leve comum).

[00256] Os inventores engendraram um camundongo para gerar cadeias leves da imunoglobulina que adequadamente formarão par com uma família bastante diversa das cadeias pesadas, incluindo cadeias pesadas cujas regiões variáveis divergem das sequências da linha germinativa, por exemplo, regiões variáveis maturadas por afinidade ou somaticamente mutadas. Em várias modalidades, o camundongo é projetado para emparelhar domínios variáveis de cadeia leve humana com domínios variáveis de cadeia pesada humana que compreendem mutações somáticas, permitindo assim um caminho para as proteínas de aglutinação de alta afinidade adequadas para o uso como produtos terapêuticos humanos.

[00257] O camundongo geneticamente engendrado, através do processo longo e complexo de seleção de anticorpo dentro de um organismo, faz escolhas biologicamente apropriadas no emparelhando de uma coleção diversa de domínios variáveis de cadeia pesada humana com um número limitado de opções de cadeia leve humana. De modo a obter isto, o camundongo é engendrado para apresentar um número limitado de opções de domínio variável de cadeia leve humana em conjunção com uma ampla diversidade de opções de domínio variável da cadeia pesada humana. Na inoculação com um imunógeno, o camundongo maximiza o número de soluções no seu repertório para desenvolver um anticorpo para o imunógeno, amplamente ou isoladamente limitado pelo número ou opções de cadeia leve no seu repertório. Em várias modalidades, isto inclui permitir que o camundongo obtenha mutações somáticas adequadas e compatíveis do domínio variável de cadeia leve que, não obstante será compatível com uma variedade relativamente grande de domínios variáveis de cadeia pesada humana, incluindo em particular domínios variáveis da cadeia pesada humana somaticamente mutada.

[00258] Para se obter um repertório limitado de opções de cadeia leve, o camundongo é engendrado para tornar não funcional ou substancialmente não funcional a sua capacidade para fabricar, ou rearranjar, um domínio variável de cadeia leve nativo de camundongo. Isto pode ser obtido, por exemplo, deletando-se os segmentos de gene da região variável de cadeia leve do camundongo. O local de camundongo endógeno pode ser depois modificado por um segmento de gene de região variável de cadeia leve humana exógeno adequado de escolha, operavelmente ligado ao domínio constante da cadeia leve de camundongo endógeno, em uma maneira tal que os segmentos de gene da região variável humana exógenos pode combinar com o gene da região constante de cadeia leve endógena de camundongo e formar um gene da cadeia leve quimérica reversa rearranjado (variável de ser humano, constante de camundongo). Em várias modalidades, a região variável de cadeia leve é capaz de ser somaticamente mutada. Em várias modalidades, para maximizar a capacidade da região variável de cadeia leve para adquirir mutações somáticas, o(s) intensificador(es) apropriado(s) é/são retidos no camundongo. Por exemplo, na modificação de um local de cadeia ngxg K fg ecowpfqpiq rctc uwduVkVwkt ugiogpVqu fg igpg fc ecfgkc ngxg K fg camundongo endógenos com segmentos de gene fc ecfgkc ngxg K jwocpc, q camundongo intensificador kpvt»pkeq K g intensificador 5Ó K fg ecowpfqpiq são funcionalmente mantidos, ou não rompidos.

[00259] Um camundongo geneticamente engendrado é fornecido que expressa um repertório limitado de cadeias leves reversas quiméricas (variável de ser humano, constante de camundongo) associada com uma diversidade de cadeias pesadas reversas quiméricas (variável de ser humano, constante de camundongo). Em várias modalidades, os segmentos de gene da ecfgkc ngxg K fg ecowpfongo endógenos são deletados e substituídos com uma única (ou duas) região de cadeia leve humana rearranjada, operavelmente ligafq" cq" igpg" EK" gpf„igpq" fg" ecowpfqpiq0" Pcu" modalidades para maximizar a hipermutação somática da região de humana rearranjada cadeia leve, o intensificador kpvt»pkeq"K" fg" ecowpfqpiq" g" q" intensificador 5Ó"K" fg" camundongo são mantidos. Em várias modalidades, o camundongo também compreende um local de cadeia leve n não funcional, ou uma deleção do mesmo ou uma deleção que torna o local incapaz de fabricar uma cadeia leve n.

[00260] Um camundongo geneticamente engendrado é fornecido que, em várias modalidades, compreende um local da região variável de cadeia leve carecendo dos segmentos de gene endógenos das cadeias leves VL e JL de camundongo e compreendendo uma região variável de cadeia leve humana rearranjada, em uma modalidade uma sequência da VL/JL humana rearranjada, operavelmente ligada a um região constante de camundongo, em que o local é capaz de sofrer hipermutação somática, e em que o local expressa uma cadeia leve compreendendo a sequência VL/JL humana ligada a uma região constante de camundongo. Assim, em várias modalidades, o local compreende um intensificador 3’ K fg ecmwpfqpiq, swg guVá eqttgncekqpcfq eqo wo píxgn normal ou do tipo selvagem de hipermutação somática.

[00261] O camundongo geneticamente engendrado em várias modalidades quando imunizado com um antígeno de interesse gera células B que exibem uma diversidade de rearranjos de regiões variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina humana que expressam e funcionam com uma ou com duas cadeias leves rearranjadas, incluindo as modalidades onde a uma ou duas cadeias leves compreendem as regiões variáveis de cadeia leve humanas que compreendem, por exemplo, de 1 a 5 mutações somáticas. Em várias modalidades, as cadeias leves humanas assim expressadas são capazes de associar e expressar com qualquer região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana expressada no camundongo.

[00262] Além dos camundongos geneticamente engendrados compreendendo repertório de cadeia leve da imunoglobulina restrito (por exemplo, um único segmento de gene da VL humana ou não mais do que dois segmentos de gene da VL humana e, um segmento de gene da JL humana ou, opcionalmente, dois ou mais segmentos de gene da JL humana) como aqui descrito, também são aqui fornecidos outros animais não humanos geneticamente modificados que compreendem um único segmento de gene da VL humana ou não mais do que dois segmentos de gene da VL humana. Em algumas modalidades, tais animais não humanos compreendem uma única região VL humana rearranjada composta de uma sequência VLJL humana rearranjada. Em algumas modalidades, tais animais não humanos compreendem não mais do que dois segmentos de gene da VL humana e dois ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, ou 5 segmentos de gene da JL humana. Em várias modalidades, segmentos de gene humanos são operavelmente ligados a uma região constante de cadeia leve não humana, por exemplo, uma região constante de cadeia leve de camundongo ou rato.

[00263] Tais animais não humanos podem ser selecionados de um grupo consistindo de um camundongo, rato, coelho, porco, bovino (por exemplo, vaca, touro, búfalo), cervo, ovelha, cabra, galinha, gato, cão, furão, primata (por exemplo, sagui, macaco reso). Para os animais não humanos onde células ES geneticamente modificáveis adequados não são prontamente disponíveis, outros métodos são utilizados para fabricar um animal não humano compreendendo modificações genéticas como aqui descritas. Tais métodos incluem, por exemplo, modificar um genoma que não de célula ES (por exemplo, um fibroblasto ou uma célula pluripotente induzida) e utilizando a transferência nuclear para transferir o genoma modificado a uma célula adequada, por exemplo, um oócito, e gestar a célula modificada (por exemplo, o oócito modificado) em um animal não humano sob condições adequadas para formar um embrião.

[00264] Em algumas modalidades, um animal não humano da presente invenção é um mamífero. Em algumas modalidades, um animal não humano da presente invenção é um mamífero pequeno, por exemplo, da superfamília Dipodoidea ou Muroidea. Em algumas modalidades, um animal geneticamente modificado da presente invenção é um roedor. Em algumas modalidades, um roedor da presente invenção é selecionado de um camundongo, um rato, e um hamster. Em algumas modalidades, um roedor da presente invenção é selecionado da superfamília Muroidea. Em algumas modalidades, um animal geneticamente modificado da presente invenção é de uma família selecionada de Calomyscidae (por exemplo, hamsters semelhantes a camundongo), Cricetidae (por exemplo, hamster, ratos e camundongos New World, arganazes), Muridae (camundongos e ratos verdadeiros, gerbos, camundongos espinhosos, ratos encrespados), Nesomyidae (camundongos escaladores, camundongos das rochas, ratos com cauda, ratos e camundongos de Madagascar), Platacanthomyidae (por exemplo, ratos do campo espinhosos), e Spalacidae (por exemplo, ratos toupeiras, ratos do bambú, e zokors). Em algumas de certas modalidades, um roedor geneticamente modificado da presente invenção é selecionado de um camundongo ou rato verdadeiros (família Muridae), um gerbo, um camundongo espinhoso, e um rato encrespado. Em algumas de certas modalidades, um camundongo geneticamente modificado da presente invenção é de um membro da família Muridae. Em alguma modalidade, um animal não humano da presente invenção é um roedor. Em algumas de certas modalidades, um roedor da presente invenção é selecionado de um camundongo e um rato. Em algumas modalidades, um animal não humano da presente invenção é um camundongo.

[00265] Em algumas modalidades, um animal não humano da presente invenção é um roedor que é um camundongo de uma cepa C57BL selecionado de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, e C57BL/Ola. Em algumas de certas modalidades, um camundongo da presente invenção é um da cepa 129 selecionado do grupo consistindo de uma cepa que é 129P1, 129P2, 129P3,129X1, 129S1 (por exemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEVH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por exemplo, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). Em algumas de certas modalidades, um camundongo geneticamente modificado da presente invenção é uma mistura de uma cepa 129 anteriormente mencionada e uma cepa C57BL/6 anteriormente mencionada. Em algumas de certas modalidades, um camundongo da presente invenção é uma mistura das cepas 129 anteriormente mencionadas, ou uma mistura das cepas BL/6 anteriormente mencionadas. Em algumas de certas modalidades, uma cepa 129 da mistura como aqui descrita é uma cepa 129S6 (129/SvEvTac). Em alguma modalidade, um camundongo da presente invenção é de uma cepa BALB, por exemplo, a cepa BALB/c. Em algumas modalidades, um camundongo da presente invenção é uma mistura de uma cepa BALB e uma outra cepa anteriormente mencionada.

[00266] Em algumas modalidades, um animal não humano da presente invenção é um rato. Em algumas de certas modalidades, um rato da presente invenção é selecionado de um rato Wistar, uma cepa LEA, uma cepa Sprague Dawley, uma cepa Fischer, F344, F6, e Dark Agouti. Em algumas de certas modalidades, uma cepa de rato como aqui descrita é uma mistura de duas ou mais cepas selecionada do grupo consistindo de Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, e Dark Agouti.

Proteínas de aglutinação de Epítopo Que Aglutinam Mais Do Que Um Epítopo

[00267] As composições e métodos aqui descritos podem ser usados para fabricar proteínas de aglutinação que aglutinam mais do que um epítopo com alta afinidade, por exemplo, anticorpos biespecíficos. As vantagens da invenção incluem a capacidade para selecionar adequadamente cadeias pesadas da imunoglobulina de alta aglutinação (por exemplo, maturadas por afinidade) cada uma das quais associar-se-ão com uma única cadeia leve.

[00268] Várias técnicas para fabricar fragmentos anticorpo biespecífico a partir de cultura de célula recombinante foram relatadas. Entretanto, a síntese e expressão de proteínas de aglutinação biespecíficas foram problemáticas, em parte devido aos problemas associados com a identificação de uma cadeia leve adequada que possa associar e expressar com duas cadeias pesadas diferentes, e em parte devido aos problemas de isolação. Em várias modalidades, as composições e métodos aqui descritos fornecem a vantagem de anticorpos biespecíficos de tamanho natural que não requerem modificação(ões) especial(is) para manter estrutura de imunoglobulina tradicional pelo aumento da estabilidade/interação dos componentes (FIG. 7A). Em várias modalidades, tal(is) modificação(ões) tem se mostrado excessivamente trabalhosa(s) e serviu(ram) como um obstáculo para o desenvolvimento da tecnologia biespecífica de anticorpo e seu uso potencial no tratamento para doenças humanas. Assim, em várias modalidades, através do fornecimento de uma estrutura da imunoglobulina natural (isto é, de tamanho natural) tendo a propriedades adicionada de especificidades múltiplas, anticorpos biespecíficos de tamanho natural mantêm as suas funções efetoras críticas que os fragmentos biespecíficos anteriores carecem, e fornecem ainda produtos terapêuticos que demonstram os parâmetros farmacocinéticos importantes de uma meia-vida mais longa.

[00269] Os métodos e composições aqui descritas permitem que um camundongo geneticamente modificado selecione, através de processos de outro modo naturais, uma cadeia leve adequada que possa associar e expressar com mais do que uma cadeia pesada, incluindo cadeias pesadas que são somaticamente mutadas (por exemplo, maturadas por afinidade). As sequências de VL e VH humanas de células B adequada de camundongos imunizados como aqui descritos que expressam anticorpos maturados por afinidade tendo cadeias pesadas quiméricas reversas (isto é, variável de ser humano e constante de camundongo) podem ser identificadas e clonadas na estrutura em um vetor de expressão com uma sequência de gene da região constante humana adequada (por exemplo, uma IgG1 humana). Duas de tais construções podem ser preparadas, em que cada construção codifica um domínio variável da cadeia pesada humana que aglutina um epítopo diferente. Uma das VLU jwocpcu *rqt gzgornq. XK3-5;LK7 jwocpc qw XK5-42LK3 humana), na sequência da linha germinativa ou a partir de uma célula B em que a sequência foi somaticamente mutada, pode ser fundida na estrutura a um gene da região constante humana adequada (por exemplo, um gene eqpuVcpVg K jwocpq+o GuVcu Vtêu eqnutruçògu rgucfc g ngxg VqValogpVg humanas podem ser colocadas em uma célula adequada para a expressão. A célula expressará duas espécies principais: uma cadeia pesada homodimérica com a cadeia leve idêntica, e uma cadeia pesada heterodimérica com a cadeia leve idêntica. Para permitir uma separação fácil destas espécies principais, uma das cadeias pesadas é modificada para omitir um determinante de aglutinação da proteína A, resultando em uma afinidade diferencial de uma proteína de aglutinação homodimérica de uma proteína de aglutinação heterodimérica. As composições e métodos que tratam deste problema são descritos na USSN 12/832.838, depositado em 25 de junho de 2010, kntktwlafq “Tgafkl{ Kuqlatgf Diupgeil'ie Cntkdqfkgu yktj Patkxg Kmmwnqilqdwlkn HqtoaV,” rwdlkeafq eqoq WU 423212553749C3. aswk incorporada por referência.

[00270] Em um aspecto, uma proteína de aglutinação de epítopo como aqui descrita é fornecida, em que as sequências VL e VH humanas são derivadas de camundongos aqui descritos que foram imunizados com um antígeno compreendendo um epítopo de interesse.

[00271] Em uma modalidade, uma proteína de aglutinação de epítopo é fornecida que compreende um primeiro e um segundo polipeptídeo, o primeiro polipeptídeo compreendendo, do terminal N para o terminal C, uma primeira região de aglutinação de epítopo que seletivamente aglutina um primeiro epítopo, seguido por uma região constante que compreende uma primeira região CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1, IgG2, IgG4, e uma combinação das mesmas; e, um segundo polipeptídeo compreendendo, do terminal N para o terminal C, uma segunda região de aglutinação de epítopo que seletivamente aglutina um segundo epítopo, seguido por uma região constante que compreende uma segunda região CH3 de uma IgG humana selecionada de IgG1, IgG2, IgG4, e uma combinação das mesmas, em que a segunda região CH3 compreende uma modificação que reduz ou elimina a aglutinação do segundo domínio CH3 à proteína A.

[00272] Em uma modalidade, a segunda região CH3 compreende uma modificação de H95R (pela numeração do exon IMGT; H435R pela numeração EU). Em uma outra modalidade, a segunda região CH3 compreende ainda uma modificação Y96F (IMGT; Y436F pela EU).

[00273] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG1 humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada do grupo consistindo de D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I pela EU).

[00274] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG2 humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada do grupo consistindo de N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I pela EU).

[00275] Em uma modalidade, a segunda região CH3 é de uma IgG4 humana modificada, e compreende ainda uma modificação selecionada do grupo consistindo de Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I pela EU).

[00276] Um método para fabricar uma proteína de aglutinação de epítopo que aglutina mais do que um epítopo é imunizar um primeiro camundongo de acordo com a invenção com um antígeno que compreende um primeiro epítopo de interesse, em que o camundongo compreende um local endógeno da região variável de cadeia leve da imunoglobulina que não contém uma VL de camundongo endógena que é capaz de rearranjar e formar uma cadeia leve, em que no local endógeno da região variável de cadeia leve da imunoglobulina de camundongo é uma única região rearranjada humana da VL operavelmente ligada ao gene endógeno da região constante de cadeia leve de camundongo, e a região da VL humana rearranjada é selecionada de uma XK3-5;LK7 jwocpc g woc XK5-42LK3 jwocpc. g qu ugiogpVqu fg igpg de VH de camundongo endógenos foram substituídos no todo ou em parte com segmentos de gene de VH humana, tal que as cadeias pesadas da imunoglobulina fabricadas pelo camundongo são isolada ou substancialmente cadeias pesadas que compreendem domínios variáveis humanos e domínios constantes de camundongo. Quando imunizado, um tal camundongo fabricará um anticorpo quimérico reverso, compreendendo apenas um de dois domínios xctkáxgku fg ecfgkc ngxg jwocpqu *rqt gzgornq, wo fc XK3-5;LK7 jwocpc qw Xk5-42Lk3 jwocpa). Uma vez que uma célula B é identificada que codifica uma VH que aglutina o epítopo de interesse, a sequência de nucleotídeo da VH (e, opcionalmente, a VL) pode ser recuperada (por exemplo, pela PCR) e clonada em uma construção de expressão na estrutura com um domínio constante adequado da imunoglobulina humana. Este processo pode ser repetido para identificar um segundo domínio da VH que aglutina um segundo epítopo, e uma segunda sequência de gene de VH pode ser recuperada e clonada em um vetor de expressão na estrutura a um segundo domínio constante adequado da imunoglobulina. O primeiro e o segundo domínios constantes da imunoglobulina podem ser os mesmos ou diferentes isótipos, e um dos domínios constantes da imunoglobulina (mas não o outro) podem ser modificados como aqui descrito ou na US 2010/0331527A1, e a proteína de aglutinação de epítopo pode ser expressada em uma célula adequada e isolada com base na sua afinidade diferencial para a proteína A como comparado a uma proteína de aglutinação de epítopo homodimérica, por exemplo, como descrito na US 2010/0331527A1.

[00277] Em uma modalidade, um método para fabricar uma proteína de aglutinação de epítopo biespecífica é fornecido, compreendendo identificar uma primeira sequência de nucleotídeo VH humana (VH1) maturada por afinidade (por exemplo, compreendendo uma ou mais hipermutações somáticas) de um camundongo como aqui descrito, identificando uma segunda sequência de nucleotídeo VH humana (VH2) maturada por afinidade (por exemplo, compreendendo uma ou mais hipermutações somáticas) de um camundongo como aqui descrito, clonando VH1 na estrutura com uma cadeia pesada humana carecendo de uma modificação determinante da proteína A como descrito na US 2010/0331527A1 para formar a cadeia pesada 1 (HC1), clonando VH2 na estrutura com uma cadeia pesada humana compreendendo um determinante da proteína A como descrito na US 2010/0331527A1 para formar a cadeia pesada 2 (HC2), introduzindo um vetor de expressão compreendendo HC1 e o mesmo ou um vetor de expressão diferente compreendendo HC2 em uma célula, em que a célula também expressa uma cadeia leve da imunoglobulina humana que compreende wo XK3-5;1LK7 jwocpq qw wo XK5-421LK3 jwocpq Iwnclifqu c wo fqoípkq eqpuVcpVg fc cadeia leve humana, permitindo que a célula expresse uma proteína de aglutinação de epítopo biespecífica compreendendo um domínio da VH codificado pela VH1 e um domínio da VH codificado pela VH2, e isolando a proteína de aglutinação de epítopo biespecífica com base na sua capacidade diferencial para aglutinar a proteína A quando comparada com uma proteína de aglutinação de epítopo homodimérica monoespecífica. Em uma modalidade específica, HC1 é uma IgG1, e HC2 é uma IgG1 que compreende a modificação H95R (IMGT; H435R pela EU) e compreende ainda a modificação Y96F (IMGT; Y436F pela EU). Em uma modalidade, o domínio da VH codificado pela VH1, o domínio da VH codificado pela VH2, ou ambas, são somaticamente mutadas.

Genes VH Humanos Que Expressam com uma VL Humana Comum

[00278] Uma variedade de regiões variáveis humanas de anticorpos maturados por afinidade incitados contra quatro antígenos diferentes foi expressada com a sua cadeia leve cognata, ou pelo menos uma de uma cadeia leve humana selecionada de XK3-5;1LK7 jwocpq. XK5-421LK3 jwocpq. qw XrtgD1LX7 jwocpq *xgt q Gzgornq 3+o Rctc cpVkeqtrqu rctc ecfc wo fqu antígenos, cadeias pesadas de alta afinidade somaticamente mutadas de famílias de gene diferentes emparelhadas com êxito com as regiões da linha ggtokpcvkxc jwocpc tgcttcplcfcu Xk3-5;Lk7 g Xk5-42Lk3 g hqtco ugetgvcfcu c rctvkt fg efinwncu swg gzrtguuco cu ecfgkcu rgucfcu g ngxgu0 Rctc c Xk3 - 5;LK7 g XK5-42LK3. qu fqoípkqu fc XH derivados das seguintes famílias de gene de VH humanas expressadas favoravelmente: 1-2, 1-8, 1-24, 2-5, 3-7, 39, 3-11, 3-13, 3-15, 3-20, 3-23, 3-30, 3-33, 3-48, 4-31, 4-39, 4-59, 5-51, e 6-1. Assim, um camundongo que é engendrado para expressar um repertório limitado de domínios da VL jwocpc fg woc qw codcu fg Xk3-5;Lk7 g Xk5- 22LK3 igtct«q woc rqrwnc>«q fkxgtuc fg fqoípkqu fc XH humana somaticamente mutados de um local da VH modificado para substituir segmentos de gene de VH de camundongo com segmentos de gene de VH humana.

[00279] Camundongos geneticamente engendrados para expressar cadeias pesadas reversas quiméricas (variável de ser humano, constante de camundongo) da imunoglobulina associadas com uma única cadeia leve tgcttcplcfc *rqt gzgornq. woc Xk3-5;1L qw woc Xk5-20/J), quando imunizados com um antígeno de interesse, geraram células B que compreenderam uma diversidade de rearranjos VH humanos e expressaram uma diversidade de anticorpos específicos de antígeno de alta afinidade com propriedades diversas com relação à sua capacidade para bloquear a aglutinação do antígeno ao seu ligante, e com relação à sua capacidade para aglutinar variantes do antígeno (ver os Exemplos 5 até 10).

[00280] Assim, os camundongos e métodos aqui descritos são úteis na fabricação e seleção de domínios variáveis de cadeia pesada da imunoglobulina humana, incluindo domínios variáveis da cadeia pesada humana somaticamente mutados, que resultam de uma diversidade de rearranjos, que exibem uma ampla variedade de afinidades (incluindo exibir um KD de cerca de um nanomolar ou menos), uma ampla variedade de especificidades (incluindo aglutinação aos epítopos diferentes do mesmo antígeno), e que associam e expressam com a mesma ou substancialmente a mesma região variável de cadeia leve da imunoglobulina humana.

Anticorpos Biespecíficos Totalmente Humanos Tendo Uma Cadeia Leve Comum

[00281] Como uma primeira etapa em várias modalidades, a primeira e segunda sequências de ácido nucléico que cada uma codifica domínios variáveis da cadeia pesada humana (e qualquer uma das sequências de ácido nucléico adicionais que formam o anticorpo biespecífico) são selecionadas de anticorpos monoclonais precursores tendo características desejadas tais como, por exemplo, capazes de aglutinar epítopos diferentes (ver as FIGs. 7A e 7B), tendo afinidades diferentes, etc. Normalmente, as sequências de ácido nucléico que codificam os domínios variáveis da cadeia pesada humana são isoladas de camundongos imunizados, como aqui descritos, para permitir que a fusão com as regiões constantes da cadeia pesada humana seja adequada para a administração humana. Outras modificações para a(s) sequência(s) podem ser feitas introduzindo-se mutações que adicionam funcionalidade adicional ao anticorpo biespecífico possam ser obtidas, que incluem, por exemplo, aumentar a meia-vida sérica (por exemplo, ver a U.S. 7.217.797) e/ou aumentar a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (por exemplo, ver a U.S. 6.737.056). A introdução de mutações nas regiões constantes de anticorpos é conhecida na técnica. Adicionalmente, parte do anticorpo biespecífico pode ser fabricada recombinantemente em cultura de célula e outra(s) parte(s) da molécula pode(m) ser fabricada(s) por aquelas técnicas mencionadas acima.

[00282] Várias técnicas para a produção de anticorpos foram descritas. Por exemplo, em várias modalidades anticorpos quiméricos são produzidos em camundongos como aqui descritos. Os anticorpos podem ser isolados diretamente das células B de um camundongo imunizado (por exemplo, ver a U.S. 2007/0280945A1) e/ou as células B do camundongo imunizado podem ser usadas para fabricar hibridomas (Kohler e Milstein, 1975, Nature 256: 495-497). O DNA que codifica os anticorpos (cadeias pesadas e/ou leves humanas) de camundongos como aqui descritos é facilmente isolado e sequenciado usando técnicas convencionais. Hibridoma e/ou células B derivados de camundongos como aqui descritos servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser substituído em vetores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras que de outro modo não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, substituindo-se a sequência codificadora para os domínios constantes das cadeias pesada e leve humanas no lugar das sequências de murino.

[00283] Em várias modalidades, a seguir da isolação do DNA e seleção da primeira e segunda sequências de ácido nucléico que codificam o primeiro e segundo domínios variáveis da cadeia pesada humana tendo as especificidades/afinidades desejadas, e uma terceira sequência de ácido nucléico que codifica um domínio da cadeia leve humana (uma sequência da linha germinativa rearranjada ou uma sequência de cadeia leve isolada de um camundongo como aqui descrito), as três sequências de ácido nucléico que codificam as moléculas são expressadas para formar o anticorpo biespecífico usando técnicas recombinantes que são amplamente disponíveis na técnica. Frequentemente, o sistema de expressão de escolha envolverá um vetor de expressão de célula de mamífero e hospedeiro de modo que o anticorpo biespecífico seja apropriadamente glicosilado (por exemplo, no caso de anticorpos biespecíficos compreendendo domínios de anticorpo que são glicosilados). Entretanto, as moléculas também podem ser produzidas nos sistemas de expressão procarióticos. Normalmente, a célula hospedeira será transformada com o DNA que codifica tanto o primeiro domínio variável da cadeia pesada humana, quanto o segundo domínio variável da cadeia pesada humana, o domínio da cadeia leve humana em um único vetor ou vetores independentes. Entretanto, é possível expressar o primeiro domínio variável da cadeia pesada humana, o segundo domínio variável da cadeia pesada humana, e o domínio da cadeia leve humana (os componentes do anticorpo biespecífico) em sistemas de expressão independentes e ligar os polipeptídeos expressados in vitro. Em várias modalidades, o domínio da cadeia leve humana compreende uma sequência da linha germinativa. Em várias modalidades, o domínio da cadeia leve humana compreende não mais do que uma, não mais do que duas, não mais do que três, não mais do que quatro, ou não mais do que cinco hipermutações somáticas com a sequência de cadeia leve variável do domínio de cadeia leve.

[00284] Em várias modalidades, o(s) ácido(s) nucléico(s) (por exemplo, cDNA ou DNA genômico) que codifica(m) as duas cadeias pesadas e a cadeia leve única humana é inserida em um vetor replicável para clonar mais (amplificação do DNA) e/ou para a expressão. Muitos vetores são disponíveis, e geralmente incluem, mas não são limitados a, um ou mais dos seguintes: uma sequência de sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor, e uma sequência de terminação transicional. Cada componente pode ser selecionado individualmente ou com base em uma escolha de célula hospedeira ou outros critérios determinados experimentalmente. Vários exemplos de cada componente são conhecidos na técnica.

[00285] Os vetores de expressão e clonagem usualmente contêm um promotor que é reconhecido pelo organismo hospedeiro e estão operavelmente ligados às sequências de ácido nucléico que codificam cada um ou todos os componentes do anticorpo biespecífico. Um número grande de promotores reconhecidos por uma variedade de célula hospedeiras potenciais é bem conhecido. Estes promotores são operavelmente ligados ao DNA que codifica o anticorpo biespecífico pela remoção do promotor do DNA fonte pela digestão com enzima de restrição e inserção da sequência promotora isolada no vetor.

[00286] Os vetores de expressão usados em células hospedeiras eucarióticas (levedura, fungos, inseto, planta, animal, ser humano, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) também podem conter as sequências necessárias para a terminação de transcrição e para a estabilização do mRNA. Tais sequências são habitualmente disponíveis das regiões não Vtcfwzkfcu 70 g. qecukqpcnogpVg 5’, fg FPCu qw eFPCu gwectk„vkequ qw virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeo transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do mRNA que codifica os componentes do anticorpo biespecífico. Os vetores de expressão adequados para as várias modalidades incluem aqueles que fornecem a expressão transitória em células de mamífero de DNA que codificam o anticorpo biespecífico. No geral, a expressão transitória envolve o uso de um vetor de expressão que é capaz de replicar eficientemente em uma célula hospedeira, tal que a célula hospedeira acumule muitas cópias do vetor de expressão e, por sua vez, sintetize altos níveis de um polipeptídeo codificado desejado pelo vetor de expressão. Os sistemas de expressão transitórios, compreendendo um vetor de expressão adequado e uma célula hospedeira, permitem a identificação positiva conveniente de polipeptídeos codificados pelos DNAs clonados, assim como para a triagem rápida de anticorpos biespecíficos tendo as especificidades/ afinidades de aglutinação desejadas ou as características de migração de gel desejadas em relação aos anticorpos precursores tendo homodímeros do primeiro ou segundo domínios variáveis da cadeia pesada humana.

[00287] Em várias modalidades, uma vez que o DNA que codifica os componentes do anticorpo biespecífico são montados no(s) vetor(es) desejado(s) como descrito acima, eles são introduzidos em uma célula hospedeira adequada para a expressão e recuperação. A transfecção das células hospedeiras pode ser realizada usando técnicas padrão conhecidas na técnica apropriadas para a célula hospedeira selecionada (por exemplo, eletroporação, microinjeção nuclear, fusão de protoplasto bacteriano com células intactas, ou policátions, por exemplo, polibreno, poliornitina, etc.).

[00288] Uma célula hospedeira é escolhida, em várias modalidades, que melhor se adapte ao vetor de expressão contendo os componentes e permita a produção mais eficiente e favorável das espécies de anticorpo biespecífico. As células hospedeiras exemplares para a expressão incluem aquelas de procariotas e eucariotas (célula única ou célula múltipla), células bacterianas (por exemplo, cepas da E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactérias, células fúngicas, células de levedura (por exemplo, S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, etc.), células vegetais, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas com baculovírus, Trichoplusia ni, etc.), células de animal não humano, células humanas, ou fusões de célula tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas. Em várias modalidades, a célula é uma célula humana, de macaco, símio, hamster, rato ou camundongo. Em várias modalidades, a célula é célula eucariótica selecionada de CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula retinal, Vero, CV1, renal (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL- 60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula de tumor, e uma linhagem de célula derivada de uma célula anteriormente mencionada. Em várias modalidades, a célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo uma célula retinal que expressa um gene de Viral (por exemplo, uma célula PER.C6®).

[00289] As células hospedeiras de mamífero usadas para produzir o anticorpo biespecífico pode ser cultivado em uma variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Essencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Meio Eagle Modificado de Dulbecco ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedeiras. Os meios podem ser suplementados como necessário com hormônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nucleosídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como GENTAMICINA®), elementos traço (definidos como compostos inorgânicos usualmente presentes nas concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ou uma fonte de energia equivalente. Qualquer outro suplemento também pode ser incluído nas concentrações apropriadas como conhecido por aqueles habilitados na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e os semelhantes, são, em várias modalidades, aquelas anteriormente usado com a célula hospedeira selecionada para a expressão, e estará evidente para aqueles habilitados na técnica.

[00290] O anticorpo biespecífico em várias modalidades é recuperado do meio de cultura como um polipeptídeo secretado, embora o mesmo também possa ser recuperado do lisado de célula hospedeira quando diretamente produzido sem um sinal secretor. Se o anticorpo biespecífico é ligado à membrana, o mesmo pode ser liberado da membrana usando uma solução de detergente adequada (por exemplo, Triton-X 100). Preferivelmente, os anticorpos biespecíficos aqui descritos envolve o uso de um primeiro domínio CH3 da imunoglobulina e um segundo domínio CH3 da imunoglobulina, em que o primeiro e segundo domínios da CH3 da imunoglobulina diferem um do outro em pelo menos um aminoácido, e em que pelo menos uma diferença de aminoácido reduz a aglutinação do anticorpo biespecífico à proteína A quando comparado com um anticorpo bi- específico que carece da diferença de aminoácido (ver a U.S. 2010/0331527A1; aqui incorporada por referência). Em uma modalidade, o primeiro domínio CH3 da imunoglobulina aglutina a proteína A e o segundo domínio CH3 da imunoglobulina contém uma mutação que reduz ou abole a aglutinação da proteína A tal como uma modificação H95R (pela numeração do exon IMGT; H435R pela numeração da EU). O segundo CH3 pode compreender ainda uma modificação Y96F (pelo IMGT; Y436F pela EU). Outras modificações que podem ser encontradas dentro do segundo CH3 incluem: D16E, L18M, N44S, K52N, V57M, e V82I (pelo IMGT; D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG1; N44S, K52N, e V82I (IMGT; N384S, K392N, e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG2; e Q15R, N44S, K52N, V57M, R69K, E79Q, e V82I (pelo IMGT; Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, e V422I pela EU) no caso de anticorpos IgG4. As variações no formato de anticorpo biespecífico descritas acima são consideradas dentro do escopo da presente invenção.

[00291] Por causa da natureza dual dos anticorpos biespecíficos (isto é, podem ser específicos para os epítopos diferentes de um polipeptídeo ou podem conter domínios de aglutinação de antígeno específicos para mais do que um polipeptídeo alvo, ver a FIG. 7B; ver também, por exemplo, Tutt et al., 1991, J. Immunol. 147: 60-69; Kufer et al., 2004, Trends Biotechnol. 22: 238-244), eles oferecem muitas vantagens úteis para aplicação terapêutica. Por exemplo, os anticorpos biespecíficos podem ser usados para a citotoxicidade redirecionada (por exemplo, para matar as células de tumor), como um adjuvante de vacina, para a liberação de agentes trombóticos aos coágulos, para converter os pró medicamentos ativados por enzima em um sítio alvo (por exemplo, um tumor), para tratar doenças infecciosas, complexos imunes de alvejamento aos receptores de superfície de células, ou para a liberação de imunotoxinas às células de tumor.

[00292] Os anticorpos biespecíficos aqui descritos também podem ser usados em vários métodos de ensaios terapêuticos e não terapêuticos e/ou de diagnóstico, tais como, imunoensaios de enzima, imunoensaios de sítio duplo, imunodiagnóstico in vitro ou in vivo de várias doenças (por exemplo, câncer), ensaios de aglutinação competitivos, ensaios de intercalação diretos e indiretos, e ensaio de imunoprecipitação. Outros usos para os anticorpos biespecíficos estarão evidentes para aqueles habilitados na técnica.

[00293] Os seguintes exemplos são fornecidos de modo a descrever para aqueles de habilidade comum na técnica como fabricar e usar os métodos e composições da invenção, e não são intencionados a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. A menos que indicado de outro modo, as partes são partes em peso, o peso molecular é o peso molecular médio, a temperatura é indicada em Celsius, e a pressão está na atmosférica ou próxima a esta.

EXEMPLOS

[00294] Os seguintes exemplos são fornecidos de modo a descrever para aqueles de habilidade comum na técnica como fabricar e usar os métodos e composições da invenção, e não são intencionadas a limitar o escopo do que os inventores consideram como sua invenção. Esforços foram feitos para garantir a precisão com relação aos números usados (por exemplo, quantidades, temperatura, etc.) mas alguns erros experimentais e desvios devem ser considerados. A menos que de outro modo indicado, a temperatura é indicada em Celsius, a pressão está na atmosférica ou próximo da mesma, as partes são em partes em peso, e o peso molecular é o peso molecular médio.

Exemplo 1 Identificação das Regiões VH Humanas Que Associam com Regiões VL Humanas Selecionadas

[00295] Um sistema de expressão in vitro foi construído para determinar se uma única cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana seria coexpressada com cadeias pesadas humanas de anticorpos humanos específicos de antígeno.

[00296] Métodos para gerar anticorpos humanos em camundongos geneticamente modificados são conhecidos (ver por exemplo, a US 6.596.541, Regeneron Pharmaceuticals, VELOCIMMUNE®). A tecnologia VELOCIMMUNE® envolve a geração de um camundongo geneticamente modificado tendo um genoma compreendendo a região variável de cadeias pesada e leve humanas operavelmente ligada aos locais da região constante endógena de camundongo tal que o camundongo produza um anticorpo compreendendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo em resposta ao estímulo antigênico. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesada e leve dos anticorpos produzidos a partir de um camundongo VELOCIMMUNE® é totalmente humano. Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como descrito abaixo, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto às características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar um anticorpo totalmente humano contendo um isótipo não IgM, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificadas. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com o uso específico, as características de aglutinação de antígeno de alta afinidade e especificidade de alvo residem na região variável.

[00297] Um camundongo VELOCIMMUNE® foi imunizado com um fator de crescimento que promove a angiogênese (Antígeno C) e anticorpos específicos de antígenos humanos foram isolados e sequenciados para o uso de gene de V usando técnicas padrão reconhecidas na técnica. Os anticorpos selecionados foram clonados nas regiões constantes de cadeia pesada e leve humanas e 69 cadeias pesadas foram selecionadas para emparelhar com uma das três cadeias leves humanas: (1) a ecfgkc ngxg K eqiPcVc ligada a uma tgik«q eqpuVcpVg K jwocnc, *4+ woc XK3-5;LK7 fc nkpjc ggnninctivc jwocpc rearranjada ligafc c woc tgik«q eqpuvcpvg k jwocpc. qw *5+ woc Xk5-42Lk3 da linha germinativa humana rearranjada ligafc c woc tgii«q eqputcptg k humana. Cada par de cadeia pesada e cadeia leve foi cotransfectado em células CHO-K1 usando técnicas padrão. A presença de anticorpo no sobrenandante foi detectada pela IgG anti-ser humano em um ensaio de ELISA. O título do anticorpo (ng/ml) foi determinado para cada par de cadeia pesada/cadeia leve e os títulos com as cadeias leves da linha germinativa rearranjadas diferentes foram comparadas com os títulos obtidos com a molécula de anticorpo precursora (isto é, a cadeia pesada emparelhada com a cadeia leve cognata) e a porcentagem de título nativo foi calculado (Tabela 1). VH: Gene da cadeia pesada variável. ND: nenhuma expressão detectada sob as condições experimentais correntes. Tabela 1

[00298] Em um experimento similar, camundongos VELOCIMMUNE® foram imunizados com vários antígenos diferentes e as cadeias pesadas selecionadas de anticorpos específicos de antígeno humanos foram testados quanto à sua capacidade para emparelhar com cadeias leves da linha germinativa humana rearranjadas (como descrito acima). Os antígenos usados neste experimento incluíram uma enzima envolvida na homeostase do colesterol (Antígeno A), um hormônio sérico envolvido na regulagem da homeostase da glicose (Antígeno B), um fator de crescimento que promove angiogênese (Antígeno C) e um receptor de superfície de célula (Antígeno D). Os anticorpos específicos de antígeno foram isolados de camundongos de cada grupo de imunização e as regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia leves foram clonadas e sequenciadas. A partir da sequência das cadeias pesada e leve, o uso de gene de V foi determinado e as cadeias pesadas selecionadas foram emparelhadas com a sua cadeia leve cognata ou uma tgik«q XK3-5;LK7 fc nkpjc igtokncVkxc jwocnc tgcttcnjcfco Ecfc rar de cadeia pesada/leve foi cotransfectada em células CHO-K1 e a presença de anticorpo no sobrenadante foi detectada pela IgG anti-ser humano em um ensaio de ELISA. O título de anticorpo (μg/ml) foi determinado para cada cadeia pesada/leve emparelhada e os títulos com as cadeias leves da linha germinativa humana rearranjada diferentes foram comparados com os títulos obtidos com a molécula de anticorpo precursora (isto é, cadeia pesada emparelhada com cadeia leve cognata) e a porcentagem de título nativo foi calculada (Tabela 2). VH: gene da ccfgkc rgucfc xctkáxgL XK< igpg fc ecfgkc ngxg K xctkáxgL PF< pgpjwoc gzrtguu«q fgVgeVcfc uqd cu eqpfk>õgu experimentais correntes. Tabela 2

[00299] Os resultados obtidos a partir destes experimentos demonstram que as cadeias pesadas somaticamente mutadas, de alta afinidade de diferentes famílias de gene são capazes de emparelhar com cu tgikõgu fg XK3- 5;LK7 g XK5-42LK3 fc nkpjc igtoincVkxc tgcttcnjcfc hwocnc g ugtgo secretadas da célula como uma molécula de anticorpo normal. Como mostrado na Tabela 1, o título de anticorpo foi aumentado em cerca de 61 % (42 de 69) cadeias pesadas quandq gorctgnhcfcu eqo c ecfgkc ngxg fg Xk3 - 5;Lk7 hwocnc tgcttcnlcfc g egtec fg 4; ' *42 fg 8;+ ecfgkcu rgucfcu swcnfq gorctgnhcfcu eqo c ecfgkc ngxg fg Xk5-42Lk3 hwocnc tgcttcnlcfc swcnfq comparadas com a cadeia leve cognata do anticorpo precursor. Para cerca de 20 % (14 de 69) das cadeias pesadas, ambas as cadeias leves da linha germinativa humana rearranjada conferiram um aumento na expressão quando comparada com a cadeia leve cognata do anticorpo precursor. Como mostrado nc Vcdgnc 4. c tgik«q fg Xk3-5;Lk7 fa linha germinativa humana rearranjada conferiu um aumento na expressão de várias cadeias pesadas específicas para uma faixa de classes diferentes de antígenos quando comparadas com a cadeia leve cognata para os anticorpos precursores. O título de anticorpo foi aumentado em mais do que duas vezes para cerca de 35 % (15/43) das cadeias pesadas quando comparadas com a cadeia leve cognata dos anticorpos precursores. Para as duas cadeias pesadas (315 e 316), o aumento foi maior do que dez vezes quando comparadas com o anticorpo precursor. Dentro de todas as cadeias pesadas que apresentaram expressão aumentada em relação à cadeia leve cognata do anticorpo precursor, as cadeias pesadas da família três (VH3) são representadas em excesso em comparação com as outras famílias de gene da região variável da cadeia pesada. Isto demonstra uma relação favorável das cadeias pesadas VH3 humanas para emparelhar com as cadeias Igxgu XK3-5;LK7 g XK5-42LK3 fc nkpjc ggnnkiiéctkvéc jwocnc rgarranjafao

Exemplo 2 Geração de um Local de Cadeia Leve da Linha Germinativa Humana Rearranjada

[00300] Vários vetores de alvejamento da cadeia leve da linha germinativa humana rearranjada foram fabricados usando a tecnologia VELOCIGENE® (ver, por exemplo, a Pat. US No. 6.586.251 e Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6): 652-659) para modificar os clones do Cromossoma Artificial Bacteriano (BAC) genômico de camundongo 302g12 e 254m04 (Invitrogen). Usando estes dois clones BAC, as construções genômicas foram engendradas para conter uma única região da cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana e inserida em wo nqecn fg ecfgkc ngxg k gnf„ignq swg hqk rtgxkcogntg oqfkhkecfc rctc fgngtar qu ugiogntqu fg igpg fg Xctkáxgn K g fg jwn>«q gnf„ignqUo

[00301] Construção de Vetores que Alvejam a Cadeia Leve da Linha Germinativa Humana Rearranjada. Três regiões da cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana foram fabricadas usando técnicas da biologia molecular padrão reconhecida na técnica. Os segmentos de gene de Variável de ser humano usados para construir estas três regiões incluíram a sequência fq XK3-5;LK7 jwoanq rgarranjafq, woa ugswêneka fq XK5-42LK3 jwoanq rgarranjafq g woa ugswêneka XrrgDLX5 jwoana rgarranjafao

[00302] Um segmento de DNA contendo exon 1 (que codifica o rgrtifgq lífgr+ g kntrqn 3 fq igng fg XK5-7 de camundongo foi fabricada pela síntese de DNA de novo (Integrated DNA Technologies). A parte da região n«q trafwzkfa 5’ atfi wo uítkq fg gnzkoa fg rgutrk>«q DnrK swg qeqrrg natwralogntg fok knenwífao Qu gzqnu fqu igngu XK3-5; g XK5-20 humanos foram amplificados pela PCR das bibliotecas BAC genômicas humanas. Os knkekafqrgu axan>afqu tkxgrao woa gztgnu«q 5’ eqntgnfq q uítkq aegktafqr fg jwp>«q fg kpVtqp 3 fq igpg fg XK5-7 de camundongo. O iniciador reverso wucfq rctc c RET fc ugswêpekc XK3-39 humano incluiu uma extensão que eqfkhkec c Lk7 jwocpc. cq rcuuq swg q kpkekcfqt tgxgtuq wucfq rctc c RET fc ugswêpekc fc Xk5-42 jwocpc kpenwkw woc gzvgpu«q swg eqfkhkec c Lk3 jwocpCo C ugswêpekc XrtgDLX7 jwocpc fok hcdtkecfc rgnc uípVgug fg FPC de novo (Integrated DNA Technoloikgu+o Woc rqt>«q fq kpVtqp LK-EK jwocpq incluindo o sítio doador de junção foi amplificada pela PCR de pBS-296- HA18-PISceI plasmídico. O iniciador de PCR avançado incluiu uma extensão Swg eqfkfíec rcrtg fg ecfc woc fcu ugswêpekcu LK7, LK3, qw LX7 jwocpcUo O iniciador reverso incluiu um sítio PI-SceI, que foi previamente engendrado no intron.

[00303] Q gzqp 31kpvtqp 3 fc Xk5-7 de camundongo, exons de cadeia ngxg xctkáxgn fg ugt jwocpq, g htciogpVqu fg kpVtqp LK-EK jwocpq fotco costurados juntos pela PCR de extensão de sobreposição, digerido com BlpI e PI-SceI, e ligados no plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI, que conteve o rtqoqVqt fq ugiogpVq fg igpg fg Xk5-15 variável humana. Um cassete de higromicina loxed dentro do plasmídeo pBS-296-HA18-PISceI foi substituído com um cassete higromicina FRTed flanqueado pelos sítios NotI e AscI. O fragmento NotI/PI-SceI deste plasmídeo foi ligado no camundongo BAC 476o26 oqfkhkecfq, swg eqpVgxg rctVg fq kpVtqp Lk-Ek fg ecowpfqpiq, q gzqp Ek fg ecowpfqpiq, g egtec fg 97 md fg ugswêpekc genômica a jusante fq nqecn k fg ecowpfqpiq, swg hqtpgegw wo tcoq fg jqoqnqikc 5Ó rctc recombinação homóloga em células ES de camundongo. O fragmento NotI/AscI deste BAC foi depois ligado no camundongo BAC 302g12 modificado, que conteve um cassete da neomicina FRTed e cerca de 23 kb de ugswêpekc igp»okec § oqpVcpVg fq nqecn K gpf„igpq rctc c tgeqodkpc>«q homóloga nas células ES de camundongo.

[00304] XgVqt fg CnxglcogpVq fg Xk3-5;Lk7 fc Nkpjc IgtokpcVkxc Humana Rearranjada (FIG. 1). Os sítios de enzima de restrição foram kpttqfwzkfqu pcu gzVtgokfcfgu 5’ g 50 fg wo kpugttq fg ecfgkc ngxg engendrado para clonar em um vetor de alvejamento: um sítio AscI na gzttgmifcfg 70 g wo uítkq RK-UegK pc gzttgokfcfg 3’. Fgpttq fq uítkq CueK 5’ g o sítio PI-UegK 5’ fc eqputtu>«q fg cnxgjamgptq fg 5’ c 5’ kpenwkw wm tcmq fg jqmqnqikc 5’ eqptgpfq c ugswêpekc 5’ rctc q nqecn fg ecfgkc ngxg K fg camundongo endógeno obtido do clone BAC 302g12 de camundongo, um gene da resistência à neomicina FRTed, uma sequência genômica incluindo o promqtqt fg Xk5-15 humano, um segmento de gene de sequência líder do ecmwpfqpiq Xk5-7 variável, uma sequência de intron do segmento de gene fg Xk5-7 variável de camundongo, uma matriz de leitura aberta de uma tgik«q fc Xk3-5;Lk5 fc nkpjc igtmkpctkxc jwmcpc tgcrranjada, uma ugswêpekc igp»miec eqptgpfq wmc rqt>«q fq kpttqp LK-EK jwmcpq, g wm tcmq fg jqmqnqikc 5’ eqptgpfq c ugswêpekc 5’ fq ugimgptq fg igpg fg Lk5 endógeno de camundongo obtido do clone BAC 254m04 de camundongo (Figura 1, meio). Os genes e/ou sequências a montante do local de cadeia leve k gpf„igpq fg ecmwpfqpiq g c lwucptg fq ugimgptq fg igpg fg Lk mcku c 5’ (por exemplo, o intensificador 5’ gpf„igpq+ p«q hqtcm mqfkhkecfqu rgnc eqputrw>«q cnxgjcfqtc *xgt c Hkiwtc 3+o C ugswêpekc fq nqecn fc XK3-5;LK5 humano engendrado é mostrado na SEQ ID NO: 1.

[00305] C kpugt>«q cnxgjcfc fc tgik«q XK3-5;LK5 fc nknhc igtmkpctkxc rearranjada humana no DNA BAC foi confirmado pela reação da cadeia da polimerase (PCR) usando iniciadores localizados nas sequências dentro da região da cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana. Em resumo, a ugswêpekc fg kpttqp 5’ rctc c ugswêpekc nífgt fg Xk5-7 de camundongo foi confirmada com os iniciadores ULC-m1F (AGGTGAGGGT ACAGATAAGT GTTATGAG; SEQ ID NO: 2) e ULC-m1R (TGACAAATGC CCTAATTATA GTGATCA; SEQ ID NO: 3). A matriz de ngktwtc cdgttc fc tgik«q Xk3-5;Lk5 fc nkpjc igtmkpctkxc jwmcpc tgcttcplcfc foi confirmada com os iniciadores 1633-h2F (GGGCAAGTCA GAGCATTAGC A; SEQ ID NO: 4) e 1633-h2R (TGCAAACTGG ATGCAGCATA G; SEQ ID NO: 5). O cassete da neomicina foi confirmado com os iniciadores neoF (ggtggagagg ctattcggc; SEQ ID NO: 6) e neoR (gaacacggcg gcatcag; SEQ ID NO: 7). O DNA de BAC alvejado foi depois usado para eletroporar células ES de camundongo para as células ES modificadas criadas para gerar camundongos quiméricos que expressam uma tgik«q XK3-5;LK7 fc nkpjc igtokncVkxc jwocnc tgcttcnjcfco

[00306] Os clones de célula ES positivos foram confirmados pela triagem e cariotipagem Taqman® usando sondas específicas para a região de cadeia leve Vk3-5;Lk7 gnignftcfc knugtkfc nq nqecn gnf„ignq0 Go tguwoq. c sonda neoP (TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG; SEQ ID NO:8) que aglutina dentro do gene marcador da neomicina, sonda ULC-m1P (CCATTATGAT GCTCCATGCC TCTCTGTTC; SEQ ID NO: 9) que aglutina dentro da sequênckc fg knVtqn 3’ rctc c ugswênekc nifgt fg XK5-7 de camundongo, e a sonda 1633h2P (ATCAGCAGAA ACCAGGGAAA GCCCCT; SEQ ID NO: 10) que aglutina dentro da matriz de leitura aberta da Xk3-5;Lk7 fc nknjc igtokncvkxc jwocnc tgcttcnlcfc0 Qu enqngu fg efinwnc GU positivos foram depois usados para implantar camundongos fêmeas para dar origem a uma ninhada de filhotes que expressam a região da cadeia leve de Xk3-5;Lk7 fc nknjc igtokncvkxc0

[00307] Alternativamente, as células ES que carregam a região de ecfgkc ngxg Xk3-5;Lk7 fc linha germinativa humana rearranjada são transfectadas com uma construção que expressa FLP de modo a remover o cassete de neomicina FRTed introduzido pela construção de alvejamento. Opcionalmente, o cassete de neomicina é removido pelo cruzamento com camundongos que expressam a recombinase FLP (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é retido nos camundongos.

[00308] XgVqt fg Clxgjaogpto XK5-42LK3 fc Nkpjc IgtokpcVkxc Humana Rearranjada (FIG. 2). Em uma maneira similar, um local de ecfgkc ngxg gpigpftcfq swg gzrtguuc woc tgik«q XK5-42LK3 fc nknjc germinativa humana rearranjada foi fabricado usando uma construção de alvglcogpvq kpenwkpfq. fg 7Ó rctc 5Ó. wo tcoq fg jqoqnqikc 7Ó eqpvgpfq c ugswêpekc 7’ rctc q nqeal fg ecfgkc ngxg K gpf„igpq fg ecowpfqpiq qdvkfq c partir do clone BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina FRTed, uma sequência genômica inclwkpfq q rtqoqvqt fg Xk5-15 hwocpq, woc ugswêpekc lífgt fq ugiogpVq fg igpg fg XK5-7 variável de ecowpfqpiq. woc ugswêpekc fg kpvtqp fq ugiogpvq fg igpg fg Xk5-7 xctkáxgl fg ecowpfqpiq, woc ocVtkz fg IgkVwtc cdgtVc fg woc tgik«q XK5- 42Lk3 fc nkphc igtokpcvkva humana rearranjada, uma sequência genômica eqpVgpfq woc rqt>«q fq kpVtqp LK-EK hwocpq, g wo tcoq fg hqoqlqikc 3’ eqpvgpfq c ugswêpekc 5Ó fq ugiogpvq fg igpg fg Lk7 gpf„igpq fg camundongo obtido a partir do clone BAC 254m04 de camundongo (Figura 2, meio)0 C ugswêpekc fq lqecl fc Xk3-42Lk3 hwocpc gpigpftcfq fi oquvtcfq pc SEQ ID NO: 11.

[00309] C kpugt>«q clxgjcfc fc tgik«q XK3-42LK3 fc lknhc igtokpcVkxc humana rearranjada dentro do DNA BAC foi confirmada pela reação da cadeia da polimerase (PCR) usando iniciadores localizados nas sequências fgpvtq fc tgik«q fg ecfgkc lgxg fg Xk3-42Lk3 fc lkphc igtokpcvkxc hwocpc tgcttcplcfc0 Go tguwoq, c ugswêpekc fg kpvtqp 3’ rctc c ugswêpekc lífgt fg Xk3-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (SEQ ID NO: 2) e ULC-m1R (SEQ ID NO: 3). A matriz de leitura aberta da região Xk3-42Lk3 fc lkphc igtokpcvkxc hwocpc tgcttcplcfc hqk eqphktocfc eqo qu iniciadores 1635-h2F (TCCAGGCACC CTGTCTTTG; SEQ ID NO: 12) e 1635-h2R (AAGTAGCTGC TGCTAACACT CTGACT; SEQ ID NO: 13). O cassete da neomicina foi confirmado com os iniciadores neoF (SEQ ID NO: 6) e neoR (SEQ ID NO: 7). O DNA de BAC alvejado foi depois usado para eletroporar células ES de camundongo para criar células ES modificadas para gerar camundongos quiméricos que expressam a ccfgkc ngxg fg XK5-42LK3 fc linha germinativa humana rearranjada.

[00310] Os clones de célula ES positiva foram confirmados pela Vtkcigo g earkqVkrcigo eqo VCSMCP™ wucpfq uqpfcu gurgeífíecu rare c tgik«q fg ecfgkc ngxg fg Xk5-42Lk3 gpigpftcfc kpugtkfc pq nqecn fg eadeia ngxg k gpf„igpc0 Go rguwoq. c uqpfc pgqR *UGS KF PQ< :+ swg aglutina dentro do gene marcador da neomicina, sonda ULC-m1P (SEQ ID NO: 9) que aglutina fgpVrq fc ugswêpekc nífgr fg XK5-7 de camundongo, e a sonda 1635h2P (AAAGAGCCAC CCTCTCCTGC AGGG; SEQ ID NO: 14) que aglutina fgpVrq fc ocVrkz fg ngkVwrc cdgrtc fg XK5-42LK3 jwocpco Qu enqpgu de célula ES positivos foram depois usados para implantar camundongos fêmeas. Uma ninhada de filhotes que expressam a região da cadeia leve de Xk5-42Lk3 fc nkpjc igroinativa humana.

[00311] Alternativamente, as células ES que carregam a região de ecfgkc ngxg fg Xk5-42Lk3 fc nkpjc igrokpcvkxc jwocpc rqfg ugr vrcpuhgevcfc com uma construção que expressa FLP de modo a remover o cassete de neomicina FRTed introduzido pela construção alvejadora. Opcionalmente, o cassete de neomicina pode ser removido pelo cruzamento com camundongos que expressam a FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é retido nos camundongos.

[00312] XgVqt fg CnxglcogpVq XrrgD..LZ5 da Linha Germinativa Humana Rearranjada (FIG. 3). Em uma maneira similar, um local da ecfgkc ngxg gpigpfrcfq swg gzrrguuc woc rgik«q XrrgDLX7 fc nknhc germinativa humana rearranjada foi fabricado usando uma construção de cnxglcogpvq kpenwkpfq. fg 7Ó rcrc 5Ó. wo rcoq fg jqoqnqikc 7Ó eqpvgpfq c ugswêpekc 7Ó rcrc q nqecn fg ecfgkc ngxg k gpf„igpq fg ecowpfqpiq qdvkfq do clone BAC 302g12 de camundongo, um gene de resistência à neomicina FRTed. woc ugswêpekc igp»okec kpenwkpfq q rrqoqvqr fg Xk5-15 humano, um sgiogpvq fg igpg fg ugswêpekc nífgr Xk5-7 variável de camundongo, uma ugswêpekc fg kpVtqp fq ugiogpVq fg igpg fg XK5-7 variável de camundongo, woc ocVtkz fg ngkVwtc cdgtVc fg woc tgik«q VrtgDL/7 fc nkphc igtokpcVkxc humana rearranjada, uma sequência genômica contendo uma porção do intron Lk-Ek jwocpq. g wo tcoq fg jqoqnqikc 5Ó eqpVgpfq c ugswêpekc 5Ó fq ugiogpVq fg igpg fg Lk7 gpf„igpq fg ecowpfqpiq qdVkfq fq enqpg DCE 476o26 fg ecowpfqpiq *Hkiwtc 5. ogkq+o C ugswêpekc fq nqecn fc VprgB.I/5 humano engendrado é mostrada na SEQ ID NO: 15.

[00313] C kpugt>«q cnxgjcfc fc tgik«q VrtgDL/7 fc nkphc igtokpcVkxc humana rearranjada no DNA BAC foi confirmada pela reação da cadeia da polimerase (PCR) usando iniciadores localizados nas sequências dentro da região de cadeia leve da tgik«q VrtgDL/7 fc nkphc igtokpcVkxc hwocpc tgcttcpjcfco Go tguwoq, c ugswêpekc fg kpVtqp 3’ rctc c ugswêpekc hfgt fg Xk5-7 de camundongo foi confirmada com iniciadores ULC-m1F (SEQ ID NO: 2) e ULC-m1R (SEQ ID NO: 3). A matriz de leitura aberta da região VrtgDL/7 fc nkphc igtmipcVkxc hwocpc tgcttcpjcfc fok eqpfítocfc eqo iniciadores 1616-h1F (TGTCCTCGGC CCTTGGA; SEQ ID NO: 16) e 1616- h1R (CCGATGTCAT GGTCGTTCCT; SEQ ID NO: 17). O cassete de neomicina foi confirmado com iniciadores neoF (SEQ ID NO: 6) e neoR (SEQ ID NO: 7). O DNA de BAC alvejado foi depois usado para eletroporar células ES de camundongo para as células ES modificadas criadas para gerar ecowpfqpiqu swkofitkequ swg gzrtguuco c ecfgkc ngxg VrtgDL/7 fc nkphc germinativa humana rearranjada.

[00314] Os clones de célula ES positiva são confirmados pela triagem e cariotipagem Taqman® usando sondas específicas para a região de cadeia ngxg VprgB.I/5 gpigpftcfc kpugtkfc pq nqecn fg ecfgkc ngxg K gpf„igpqo Go resumo, a sonda neoP (SEQ ID NO: 8), que aglutina dentro do gene marcador da neomicina, sonda ULC-m1P (SEQ ID NO: 9), que aglutina dentro da ugswêpekc hfgt fg KÍVK3-7 de camundongo, e sonda 1616h1P (ACAATCCGCC TCACCTGCAC CCT; SEQ ID NO: 18) que aglutina fgpVtq fc maVtkz fg ngkVwtc cdgrtc fg XprgB.I/5 jwocpCo Qs clones de célula ES positiva são depois usados para implantar camundongos gêmeas para dar origem a uma ninhada filhotes que expressam uma região de cadeia leve da linha germinativa.

[00315] Alternativamente, as células ES que carregam a região de cadeia leve VprgDL/7 fc nkpjc igtokpcvkxc jwocpc tgcttcplcfc u«q transfectadas com uma construção que expressa FLP de modo a remover o cassete de neomicina FRTed introduzido pela construção de alvejamento. Opcionalmente, o cassete de neomicina é removido pelo cruzamento com camundongos que expressam a FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é retido nos camundongos.

Exemplo 3 Geração de Camundongos que Expressam uma Única Cadeia Leve Humana Rearranjada

[00316] As células ES alvejadas descritas acima foram usadas como células ES doadoras e introduzidas em um embrião de camundongo no estágio de 8 células pelo método VELOCIMOUSE® (ver, por exemplo, a Pat. US No. 7.294.754 e Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essencialmente fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate fenotypic analyses Nature Biotech. 25(1): 91-99. VELOCIMICE® kpfgrgpfgpVgogpVg ecttgicpfq woc tgik«q fg ecfgkc ngxg fg XK3-5;LK7 fc linha germinativa humana engendrada, uma região de ccfgkc ngxg fg XK5- 42Lk3 qw woc tgik«q fg ecfgkc ngxg fg XrtgDL/7 fi kfgpvkhkecfq rgnc genotipagem usando uma modificação do ensaio de alelo (Valenzuela et al., supra) que detecta a presença da região única da cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana.

[00317] Os filhotes são genotipados e um filhote heterozigoto ou homozigoto para a região única da cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana é selecionado para caracterizar a expressão da região da cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana.

[00318] Citometria de Fluxo. A expressão da região de cadeia leve humana rearranjada no repertório de anticorpo normal de camundongos de cadeia leve comuns foi validada pela análise da expressão da imunoglobulina K g X go gurngp„ekVqu g ucpiwg rgtkfétkeq fg ecowpfqpiqu fg ecfgkc ngxg comuns. As suspensões de célula dos baços e sangue periférico colhidos de ecowpfqpiqu fq Vkrq ugnxcigo *p ? 5), jgVgtqzkiqVqu go XK3-5;LK7 fg cadeia leve comum (n = 3), jqoqzkiqVqu go XK3-5;LK5 fg ecfgkc ngxg eqowo *p ? 5). jgvgtqzkiqvqu go XK5-42LK3 fg ecfgkc ngxg eqowo *p ? 4). g jqoqzkiqvqu go XK5-42LK3 fg ecfgkc ngxg eqowo *p ? 4) hqtco hcdtkecfqu usando métodos padrão e tingidas com CD19+, KiX+ g KiK+ usando anticorpos fluorescentemente rotulados (BD Pharmigen).

[00319] Em resumo, 1 x 106 células foram incubadas com CD16/CD32 anti-camundongo (clone 2,4G2, BD Pharmigen) em gelo por 10 minutos, seguido pela rotulação com o seguinte coquetel de anticorpo por 30 minutos em gelo: CD19 anti-camundongo conjugada a APC (clone 1D3, BD Pharmigen), CD3 anti-camundongo conjugada a PerCP-Cy5,5 (clone 17A2, DkqNgigpf), KiK cpvk-camundongo conjugada a FITC (clone 187,1, BD Rjctokigp), KiX cpvk-camundongo conjugada a PE (clone RML-42, BioLegend). A seguir do tingimento, as células foram lavadas e fixadas em 2 % de formaldeído. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro de fluxo LSRII e analisado com FlowJo. Comutação: células B totais (CD19+CD3-), efinwncu D KiK+ *KiK+KiX-CD19+CD3-), efinwncu D KiX+ *KiK- KiX+CD19+CD3-). Os dados obtidos a partir das amostras de sangue e esplenócito demonstraram resultados similares. A Tabela 3 apresenta a porcentagem de células B CD19+ positivas de sangue periférico de um ecowpfqpiq tgrtgugpvcvkxq fg ecfc itwrq swg u«q KiX+, KiK+, qw KiX+KiK+. A porcentagem de células B CD19+ no sangue periférico de camundongos do tipo selxcigo *YV+ g jqoqzkiqVqu rctc cu ecfgkcu ngxgu XK3-5;LK7 qw VK3- 42LK3 eqowpu fi oquVrcfc pc HKIo 60 Tabela 3

[00320] Expressão de Cadeia Leve Comum. A expressão de cada ecfgkc ngxg eqowo *Xk3-5;Lk7 g Xk5-42Lk3+ hqk cpcnkucfc go ecowpfqpiqu heterozigotos e homozigotos usando um ensaio de PCR quantitativa (por exemplo TAQMAN®).

[00321] Em resumo, as células B CD19+ foram purificadas a partir dos baços de camundongos do tipo selvagem, homozigotos para uma substituição fqu nqecku fcu rgikõgu xatkáxgku fg ecfgkc rgucfc g ecfgkc ngxg K fg camundongo com os locais das regiões variáveis de cadeia pesada e cadeia ngxg k fg ugr jwocpq *Jk+ eqrrgurqpfgpvgu. cuukm como camundongos homozigotos e heterozigotos para cada região de cadeia leve humana rgcrrcplcfc *Xk3-5;Lk7 qw Xk5-42Lk3+ wucpfq Okerqrfirqncu fg EF3; fg camundongo (Miltenyi Biotec) de acordo com as especificações do fabricante. O RNA total foi purificado a partir das células B CD19+ usando o kit RNeasy Mini (Qiagen) de acordo com as especificações do fabricante e o RNA genômico foi removido usando um tratamento na coluna de DNase isenta de RNase (Qiagen). 200 ng de mRNA foi transcrito de modo reverso no cDNA usando o kit de Síntese de cDNA do Primeiro Filamento (Invitrogen) e o cDNA resultante foi amplificado com a Mistura PCR Master Universal Taqman (Applied Biosystems). Todas as reações foram realizadas usando o Sistema de Detecção de Sequência ABI 7900 (Applied Biosystems) usando kpkekcfqrgu g uqpfcu Vcsocp OID swg Vrcpurõgo *3+ c jwp>«q XK-LK rcrc codcu cu ecfgkcu ngxgu eqowpu. *4+ q igpg fg Xk uqzkpjq *kuvq fi Xk3 -39 e Xk5-42+. g *5+ c rgik«q Ek fg ecowpfqpiq0 C Vcdgnc 6 crrgugpvc cu sequências dos iniciadores e sondas utilizadas para este ensaio. A expressão tgncVkxc hqk iiqπnclkzcfc rctc c gzrtguu«q fc tgik«q EK fg ecowpfqpiqo Qu resultados são mostrados nas FIGs. 5A, 5B e 5C. Tabela 4

[00322] Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos de Antígeno. Os camundongos de cadeia leve comuns que carregam uma cadeia lgxg eqiwi Xk3-5;Lk7 qw Xk5-42Lk3 pq lqecl fg ecfgkc lgxg k gpf„igpq fg ecowpfqpiq forco kowpkzcfqu eqo β-galactosidase e o título de anticorpo foi medido.

[00323] Go tguwoq. c β-galactosidase (Sigma) foi emulsificada em adjuvante titermax (Sigma), como pelas diretrizes do fabricante. Do tipo selvagem (n = 7), hqoqzkiqvqu fg ecfgkc lgxg eqowo Xk3-5;Lk7 *p ? 4+ g jqoqzkiqvqu fg ecfgkc lgxg eqowo Xk5-42Lk3 *p ? 7+ hqtco kowpkzcfqu rglc kpjg>«q uwdewVâpgc eqo 322 -i fg β-galactosidase/Titermax. Os camundongos foram reforçados pela injeção subcutânea duas vezes, 3 semana ugrctcfcogpvg. eqo 72 -i fg β-galactosidase/Titermax. Depois do segundo reforço, o sangue foi coletado de camundongos anestesiados usando uma sangria retro-orbital em tubos separadores de soro (BD Biosciences) como pelas diretrizes do fabricante. Para medir anticorpos IgM ou IgG anti-β- iclcevqukfcug. rlcecu fg GNKUC *Pwpe+ hqtco tgxguvkfcu eqo 3 -i1ol fg β- galactosidase durante a noite a 4° C. Antígeno em excesso foi retirado por lavagem antes de bloquear com PBS com 1 % de BSA por uma hora na temperatura ambiente. As diluições em série de soro foram adicionadas às placas e incubadas por uma hora na temperatura ambiente antes da lavagem. As placas foram depois incubadas com anti-IgM (Southern Biotech) ou anti- IgG (Southern Biotech) conjugados com HRP por uma hora na temperatura ambiente. A seguir de uma outra lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato TMB (BD Biosciences). As reações foram interrompidas com ácido sulfúrico 1 N e a OD450 foi lida usando uma Leitora de Placa Victor X5 (Perkin Elmer). Os dados foram analisados com GraphPad Prism e o sinal foi calculado como a diluição de soro que está duas vezes acima do fundo. Os resultados são mostrados nas FIGs. 6A e 6B.

[00324] Eqoq oquVtcfq pguVg Gzgornq. c tcz«q fg efinwncu D Kin tanto no compartimento esplênico quanto no periférico de camundongos de cadeia ngxg eqowo fg XK3-5;LK7 g XK5-42LK3 fgoqpuvtctco wo rcft«q swcug fq tipo selvagem (Tabela 3 e FIG. 4). Os camundongos de cadeia leve comum de VprgB.I/5. gnVtgVcnVq, fgoqpuVtctco ogpqu efinwncu D rgtkfericas, dos quais cerca de 1 a 2 % expressam a região da cadeia leve humana engendrada (dados não mostrados). Os níveis de expressão das regiões de cadeia leve VK3-5;LK7 g VK5-42LK3 jwocpcu tgcttcplcfcu fq nqecn fg ecfgkc ngxg K endógeno foram elevados em eqorctc>«q c wo nqecn fg ecfgkc ngxg K gpf„igpq eqpVgpfq woc uwduVkVwk>«q eqorngVc fg ugiogntqu fg igpg fg VK g LK fg ecowpfqpiq eqo ugiogpvqu fg igpg fg VK g LK jwocpqu *HKI0 7C. 7D g 7E+o Qu níxgku fg gzrtguu«q fc tgik«q fg ecfgkc ngxg fg VprgB.I/5 jwocnc tgcttcplcfc fgoqpuvtctco gzrtguu«q cnvc ukoknct fq nqecn fg ecfgkc ngxg K endógeno tanto nos camundongos heterozigotos quanto nos homozigotos (dados não mostrados). Isto demonstra que na competição direta com os nqecku fg ecfgkc ngxg /. K. qw codqu gnf„ignos de camundongo, uma única sequência da VL/JL humana rearranjada pode produzir melhor do que a gzrtguu«q fg níxgn fq vkrq ugnxcigo fq nqeal fg ecfgkc ngxg K gnf„igpq g fá origem à frequência de células B esplênicas e do sangue normais. Além disso, a presgp>c fg wo nqecn fg ecfgkc ngxg K gpigpftcfq Vgpfq woc ugswêpekc fq XK3-5;LK7 jwocpq qw XK5-42LK3 jwocpc fok dgo Vqngtcfc rgnqu camundongos e parece funcionar na maneira do tipo selvagem representandose uma porção substancial do repertório da cadeia leve no componente humoral da resposta imune (FIG 6A e 6B).

Exemplo 4 Procriação de camundongos que expressam uma única cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana

[00325] Este exemplo descreve várias outras cepas de camundongo geneticamente modificadas que podem ser procriados com qualquer um dos camundongos de cadeia leve comum aqui descritos para criar cepas múltiplas de camundongo geneticamente modificado que abriguem múltiplos locais da imunoglobulina geneticamente modificada.

[00326] Gene inativado *MQ+ go IiX Gpf„igpqo Para otimizar o uso do local da cadeia leve engendrado, camundongos que carregam uma das cadeias de regiões de leve da linha germinativa rearranjada humana são procriados com um outro camundongo contendo uma deleção no local da cadeic ngxg X gpf„igpqo FguVc ocpgktc, c rtqiêpkg qdvkfc gzrtguuctá, eqoq c sua única cadeia leve, a região de cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana como descrito no Exemplo 2. A procriação é realizada pelas técnicas padrão reconhecidas na técnica e, alternativamente, por um criador comercial (por exemplo, The Jackson Laboratory). As cepas de camundongo que carregam um local de cadeia leve engendrado e uma deleção do local de ecfgkc ngxg X gpf„igpq u«q Vtkcfqu swanVq c rtgugp>c fc tgik«q fg ecfgkc leve úpkec g cwuênekc fg ecfgkcu ngxgu fg X gpf„igncu fg ecownfqniqo

[00327] Local de Cadeia Pesada Endógena Humanizada. Camundongos que carregam um local de cadeia leve engendrado da linha germinativa humana são procriados com camundongos que contêm uma substituição do local do gene da cadeia pesada variável endógeno de camundongo com o local de gene da cadeia pesada variável humana (ver a US 6.596.541; the VELOCIMMUNE® mouse, Regeneron Pharmaceuticals, Inc.). O camundongo VELOCIMMUNE® compreende um genoma compreendendo regiões variáveis da cadeia pesada humana operavelmente ligadas aos locais da região constante endógenos de camundongo tal que o camundongo produza anticorpos compreendendo uma região variável da cadeia pesada humana e uma região constante da cadeia pesada de camundongo em resposta ao estímulo antigênico. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas dos anticorpos é isolada e operavelmente ligada ao DNA que codifica as regiões constantes da cadeia pesada. O DNA é depois expressado em uma célula capaz de expressar a cadeia pesada totalmente humana do anticorpo.

[00328] Os camundongos que carregam uma substituição do local da VH de camundongo endógeno com o local da VH humana e uma única região da VL da linha germinativa humana rearranjada no loecn fg ecfgkc Igxg K endógeno são obtidos. Anticorpos quiméricos reversos contendo cadeias pesadas somaticamente mutadas (VH humana e CH de camundongo) com uma única cadeia leve humana (VL humana e CL de camundongo) são obtidos na imunização com um antígeno de interesse. As sequências de nucleotídeo de VH e VL das células B que expressam os anticorpos são identificadas e os anticorpos totalmente humanos são fabricados pela fusão das sequências de nucleotídeo VH e VL às sequências de nucleotídeo CH e CL humanas em um sistema de expressão adequado.

Exemplo 5 Geração de Anticorpos a partir de Camundongos Que Expressam Cadeias Pesadas Humanas e uma Região da Cadeia Leve da Linha Germinativa Humana Rearranjada

[00329] Depois de procriar camundongos que contiveram a região da cadeia leve humana engendrada com várias cepas desejadas contendo modificações e deleções de outros locais de Ig endógenos (como descrito no Exemplo 4), camundongos selecionados podem ser imunizados com um antígeno de interesse.

[00330] Geralmente, um camundongo VELOCIMMUNE® contendo uma das regiões da cadeia leve única da linha germinativa rearranjada humana é inoculado com um antígeno, e células linfáticas (tais como células B) são recuperadas do soro dos animais. As células linfáticas são fundidas com uma linhagem de célula de mieloma para preparar linhagens de célula de hibridoma imortais, e tais linhagens de célula de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar as linhagens de célula de hibridoma que produzem anticorpos contendo cadeias pesadas variáveis humanas e uma das cadeias leves da linha germinativa humana rearranjadas que sejam específicas para o antígeno usado para a imunização. O DNA que codifica as regiões variáveis das cadeias pesadas e a cadeia leve é isolado e ligado às regiões constantes isotípicas desejáveis da cadeia pesada e cadeia leve. Devido à presença das sequências de camundongo endógenas e qualquer um dos elementos que atuam em cis adicionais presentes no local endógeno, a cadeia leve única de cada anticorpo pode ser somaticamente mutado. Isto adiciona diversidade adicional ao repertório específico de antígeno compreendendo uma única cadeia leve e diversas sequências de cadeia pesada. As sequências de anticorpo clonadas resultantes são subsequentemente expressadas em uma célula, tal como uma célula CHO. Alternativamente, o DNA que codifica os anticorpos quiméricos específicos de antígeno ou os domínios variáveis das cadeias leve e pesada é identificado diretamente dos linfócitos específicos de antígeno.

[00331] Inicialmente, anticorpos quiméricos de alta afinidade são isolados tendo uma região variável humana e uma região constante de camundongo. Como descrito acima, os anticorpos são caracterizados e selecionados quanto às características desejáveis, incluindo afinidade, seletividade, epítopo, etc. As regiões constantes de camundongo são substituídas com uma região constante humana desejada para gerar o anticorpo totalmente humano contendo uma cadeia pesada humana somaticamente mutada e uma única cadeia leve derivada de uma região da cadeia leve da linha germinativa rearranjada humana da invenção. As regiões constantes humanas adequadas incluem, por exemplo IgG1 ou IgG4 do tipo selvagem ou modificadas.

[00332] Grupos separados de camundongos VELOCIMMUNE® contendo uma substituição do local de cadeia pesada de camundongo endógena com segmentos de gene de VH, DH, e JH humanas e uma uwduVkVwk>«q fq nqecn fg ecfgkc ngxg K gpf„igpq fg ecowpfqpiq eqo c tgik«q fc ecfgkc ngxg fg XK3-5;LK7 fc nkphc igtokpcVkxc hwocpc gpigpftcfc qw c região de cadeia leve fc Xk5-42Lk3 fc nkpjc igtokpcvkxc jwocpc gpigpftcfc (descrita acima) foram imunizados com uma proteína do receptor da superfície de célula humano (Antígeno E). O antígeno E é administrado diretamente na almofada da pata traseira dos camundongos com seis injeções consecutivas a cada 3 a 4 dias. Dois a três microgramas de Antígeno E são misturados com 10 μg de oligonucleotídeo CpG (Cat # tlrl-modn - oligonucleotídeo ODN1826; InVivogen, San Diego, CA) e 25 μg de Adju- Phos (Adjuvante de gel de fosfato de alumínio, Cat# H-71639-250; Brenntag Biosector, Frederikssund, Dinamarca) antes da injeção. Um total de seis injeções é dado antes do retorno de antígeno final, que é dado 3a 5 dias antes do sacrifício. As sangrias depois da 4a e 6a injeções são coletadas e a resposta imune de anticorpo é monitorada por um imunoensaio específico de antígeno padrão.

[00333] Quando uma resposta imune desejada é obtida, os esplenócitos são colhidos e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar a sua viabilidade e formar linhagens de célula de hibridoma. As linhagens de célula de hibridoma são triadas e selecionadas para identificar linhagens de célula que produzem anticorpos de cadeia leve comum específicos do Antígeno E. Usando esta técnica vários anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E específicos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis da cadeia pesada humana, o mesmo domínio variável de cadeia leve humano, e domínios constantes de camundongo) são obtidos.

[00334] Alternativamente, os anticorpos de cadeia leve comum anti- Antígeno E são isolados diretamente das células B positivas em antígeno sem fusão às células de mieloma, como descrito na U.S. 2007/0280945A1, aqui especificamente incorporada por referência na sua totalidade. Usando este método, vários anticorpos de cadeia leve comum de anti-Antígeno E totalmente humanos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis da ecfgkc rgucfc jwocpc. woc ecfgkc ngxg jwocpc fg XK3-5;LK7 gpigpftcfc qw woc tgik«q fg ecfgkc ngxg fg XK5-42LK3 jwocpc gpigpftcfc, g fqmípkqu constantes humanos) foram obtidos.

[00335] As propriedades biológicas dos anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E exemplares gerados de acordo com os métodos deste Exemplo são descritas em detalhes nas seções apresentadas abaixo.

Exemplo 6 Uso do Segmento de Gene de Cadeia Pesada nos Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos de Antígeno

[00336] Para analisar a estrutura dos anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E humanos produzidos, ácidos nucléicos que codificam as regiões variáveis de cadeia pesada do anticorpo foram clonadas e sequenciadas. A partir das sequências de ácido nucléico e sequências de aminoácido prognosticadas dos anticorpos, o uso de gene foi identificado para a região variável da cadeia pesada (HCVR) de anticorpos de cadeia leve comum selecionados obtidos a partir de camundongos imunizados com VGNQEIOOUPE® eqpVgpfq c ecfgkc ngxg fg XK3-5;LK7 jwocpc gpigpftcfc qw c tgik«q fg ecfgkc ngxg fg Xk5-42Lk3 jwocpc gpigpftcfc0 Qu resultados são mostrados nas Tabelas 5 e 6, que demonstram que os camundongos de acordo com a invenção geram anticorpos de cadeia leve comum específicos de antígeno a partir de uma variedade de segmentos de gene da cadeia pesada humana, devido a uma variedade de rearranjos, quando da utilização de um camundongo que expressa uma cadeia leve apenas de woc ecfgkc ngxg fgtkxcfc fg XK3-5; jwocpq qw woc XK5-20 humano. Segmentos de gene de VH humana das famílias 2, 3, 4, e 5 rearranjadas com uma variedade de segmentos da DH humana e segmentos da JH humana para produzir anticorpos específicos de antígeno. Tabela 5

Tabela 6

Exemplo 7 Determinação da Capacidade de Bloqueio de Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos de Antígeno pelo ensaio LUMINEX®

[00337] Noventa e oito anticorpos de cadeia leve comum humanos incitados contra o Antígeno E foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a aglutinação do ligante natural do Antígeno E (Ligante Y) ao Antígeno E em um ensaio com base em pérola.

[00338] O domínio extracelular (ECD) de Antígeno E foi conjugado aos dois rótulos de epítopo myc e um rótulo de 6X histidina (Antígeno E- mmH) e acoplado pela amina às microesferas carboxiladas em uma concentração de 20 μg/ml em tampão MES. A mistura foi incubada por duas horas na temperatura ambiente seguida pela desativação de pérola com Tris 1 M pH 8,0 seguida pela lavagem em PBS com 0,05 % (v/v) de Tween-20. As pérolas foram depois bloqueadas com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 2 % (p/v) de BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Em uma placa de filtração de 96 reservatórios, os sobrenandantes contendo anticorpos de cadeia leve comum específicos de Antígeno E foram diluídos 1:15 em tampão. Um controle negativo contendo um sobrenadante simulado com os mesmos componentes do meio como para o sobrenadante de anticorpo foi preparado. As pérolas rotuladas com Antígeno E foram adicionadas aos sobrenadantes e incubadas durante a noite a 4 °C. A proteína de Ligante Y biotinilada foi adicionada a uma concentração final de 0,06 nM e incubada por duas horas na temperatura ambiente. A detecção de Ligante Y biotinilado aglutinado às pérolas rotuladas com Antígeno E-myc-myc-6His foi determinada com R-Ficoeritrina conjugada à Estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguida pela medição em um analisador com base na citometria de fluxo LUMINEX®. A Intensidade de Fluorescência Média de (MFI) fundo de uma amostra sem Ligante Y foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão da MFI subtraída do fundo de cada amostra pelo valor do controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[00339] Em um experimento similar, os mesmos 98 anticorpos de cadeia leve comum humanos incitados contra o Antígeno E foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a aglutinação de Antígeno E às pérolas rotuladas com Ligante Y.

[00340] Em resumo, o Ligante Y foi acoplado pela amina às microesferas carboxiladas em uma concentração de 20 μg/ml diluída em tampão de MES. A mistura e incubada duas horas na temperatura ambiente seguida pela desativação das pérolas com Tris 1 M pH 8 depois lavando em PBS com 0,05 % (v/v) de Tween-20. As pérolas foram depois bloqueadas com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 2 % (p/v) de BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO). Em uma placa de filtração de 96 reservatórios, os sobrenadantes contendo anticorpos de cadeia leve comum específicos do Antígeno E foram diluídos 1:15 em tampão. Um controle negativo contendo um sobrenadante simulado com os mesmos componentes do meio como para o sobrenadante de anticorpo foi preparado. Um Antígeno E-mmH biotinilado foi adicionado a uma concentração final de 0,42 nM e incubados durante a noite a 4 °C. As pérolas rotuladas com o Ligante Y foram depois adicionadas à mistura de anticorpo/Antígeno E incubadas por duas horas na temperatura ambiente. A detecção de Antígeno E-mmH biotinilado aglutinado às pérolas com o Ligante Y foi determinada com R-Ficoeritrina conjugada com estreptavidina (Moss Inc, Pasadena, MD) seguida pela medição em um analisador com base na citometria de fluxo LUMINEX®. A Intensidade de Fluorescência Média (MFI) de fundo de uma amostra sem Antígeno E foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão da MFI subtraída do fundo de cada amostra pelo valor de controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[00341] As Tabelas 7 e 8 mostram o bloqueio percentual para todos os 98 anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E testados em ambos os ensaios LUMINEX®. ND: não determinado sob condições experimentais correntes. Tabela 7

Tabela 8

[00342] No primeiro experimento LUMINEX® descrito acima, 80 anticorpos de cafgkc" ngxg" eqowo" eqpvgpfq" c" ecfgkc" ngxg" fg" Xk3-5;Lk7 engendrada foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a aglutinação do Ligante Y para as pérolas rotuladas com Antígeno E. Destes 80 anticorpos de cadeia leve comum, 68 demonstraram >50 % de bloqueio, enquanto que 12 demonstraram <50 % de bloqueio (6 de 25 a 50 % de bloqueio e 6 a <25 % de bloqueio). Para os 18 anticorpos de cadeia leve eqowo"eqpvgpfq"c"ecfgkc"ngxg"gpigpftcfc"fg"Xk5-42Lk3."34"fgoqpuvtctco >50 % de bloqueio, enquanto 6 demonstraram <50 % de bloqueio (3 de 25 a 50 % de bloqueio e 3 a <25 % de bloqueio) da aglutinação de Ligante Y às pérolas rotuladas com Antígeno E.

[00343] No segundo experimento LUMINEX® descrito acima, os mesmos 80 anticorpos de cadeia leve comum contendo a cadeia leve dg XK3- 5;LK7 gpigpftcfc forao VguVcfcu swanVq § uwc ecrcekfcfg rare dnqswgct a aglutinação de Antígeno E às pérolas rotuladas com Ligante Y. Destes 80 anticorpos de cadeia leve comum, 36 demonstraram >50 % de bloqueio, enquanto que 44 demonstraram <50 % de bloqueio (27 de 25 a 50 % de bloqueio e 17 a <25 % de bloqueio). Para os 18 anticorpos de cadeia leve eoowo eonvgnfo a eafgka ngxg fg Xk5-42Lk3 gnignfrafa. 3 fgoonuvrow @72 % de bloqueio, enquanto que 17 demonstraram <50 % de bloqueio (5 de 25 a 50 % de bloqueio e 12 a <25 % de bloqueio) da aglutinação de Antígeno E às pérolas rotuladas com Ligante Y.

[00344] Os dados das Tabelas 7 e 8 estabeleceram que os rearranjos descritos nas Tabelas 5 e 6 geraram anticorpos de cadeia leve comum específicos do anti-Antígeno E que bloquearam a aglutinação do Ligante Y ao seu receptor de Antígeno E cognato com graus variáveis de eficácia, que é compatível com os anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E das Tabelas 5 e 6 compreendendo anticorpos com sobreposição e não sobreposição da especificidade de epítopo com relação ao Antígeno E.

Exemplo 8 Determinação da Capacidade de Bloqueio dos Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos de Antígeno pelo ELISA

[00345] Os anticorpos de cadeia leve comum humana incitados contra Antígeno E foram testados quanto à sua capacidade para bloquear a aglutinação de Antígeno E a uma superfície revestida com Ligante Y em um ensaio de ELISA.

[00346] O Ligante Y foi revestido sobre placas de 96 reservatórios em uma concentração de 2 μg/ml diluídos em PBS e incubados durante a noite seguido pela lavagem quatro vezes em PBS com 0,05 % de Tween-20. A placa foi depois bloqueada com PBS (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) contendo 0,5 % (p/v) de BSA (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO) por uma hora na temperatura ambiente. Em uma placa separada, os sobrenadantes contendo anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E foram diluídos 1:10 em tampão. Um sobrenadante simulado com os mesmos componentes dos anticorpos foi usado como um controle negativo. Antígeno E-mmH (descrito acima) foi adicionado a uma concentração final de 0,150 nM e incubados por uma hora na temperatura ambiente. A mistura de anticorpo/Antígeno E-mmH foi depois adicionada à placa contendo Ligante Y e incubados por uma hora na temperatura ambiente. A detecção de Antígeno E-mmH aglutinado ao Ligante Y foi determinada com Peroxidase de Rábano (HRP) conjugada ao anticorpo anti-Penta-His (Qiagen, Valencia, CA) e desenvolvido pela resposta colorimétrica padrão usando substrato de tetrametilbenzidina (TMB) (BD Biosciences, San Jose, CA) neutralizado pelo ácido sulfúrico. A absorbância foi lida na OD450 por 0,1 segundo. A absorbância de fundo de uma amostra sem o Antígeno E foi subtraída de todas as amostras. O bloqueio percentual foi calculado pela divisão da MFI subtraído do fundo de cada amostra pelo valor do controle negativo ajustado, multiplicando por 100 e subtraindo o valor resultante de 100.

[00347] As Tabelas 9 e 10 mostram o bloqueio percentual para todos os 98 anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E testados no ensaio de ELISA. ND: não determinado sob as condições experimentais correntes. Tabela 9

Tabela 10

[00348] Como descrito neste Exemplo, dos 80 anticorpos de cadeia ngxg"eqowo"eqpvgpfq"c"ecfgkc"ngxg"fg"Xk3-5;Lk7"gpigpftcfc"vguvcfc"swcpvq à sua capacidade para bloquear a aglutinação de Antígeno E a uma superfície revestida com o Ligante Y, 22 demonstraram >50 % de bloqueio, enquanto que 58 demonstraram <50 % de bloqueio (20 de 25 a 50 % de bloqueio e 38 a <25 % de bloqueio). Para os 18 anticorpos de cadeia leve comum contendo a ecfgkc ngxg fg XK5-42LK3 gpigpftcfc. wo fgoqpuVtqw @72 ' fg dnqswgkq. enquanto que 17 demonstraram <50 % de bloqueio (5 de 25 a 50 % de bloqueio e 12 a <25 % de bloqueio) da aglutinação do Antígeno E a uma superfície revestida com o Ligante Y.

[00349] Estes resultados também são compatíveis com a reunião de anticorpo de cadeia leve comum específico de antígeno E compreendendo anticorpos com sobreposição e não sobreposição da especificidade de epítopo com relação ao Antígeno E.

Exemplo 9 Determinação da Afinidade em BIACORE® para os Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos de Antígeno

[00350] As constantes de dissociação (KD) no equilíbrio para os sobrenadantes de anticorpo selecionados foram determinadas pela SPR (Ressonância de plásmon de superfície) usando um instrumento BIACORE® T100 (GE Healthcare). Todos os dados foram obtidos usando HBS-EP (10 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 0,3 mM de EDTA, 0,05 % de Tensoativo P20, pH 7,4) tanto como tampões de condução quanto de amostra, a 25 °C. Os anticorpos foram capturados a partir das amostras de sobrenadante bruto em uma superfície de chip sensor CM5 previamente derivatizada com uma alta densidade de anticorpos Fc anti-ser humano usando a química da ligação de amina padrão. Durante a etapa de captura, os sobrenadantes foram injetados através da superfície de Fc anti-ser humano em uma taxa de fluxo de 3 μl/min, durante um total de 3 minutos. A etapa de captura foi seguida por uma injeção de tampão de condução ou análito em uma concentração de 100 nM por 2 minutos em uma taxa de fluxo de 35 μl/min. A dissociação de antígeno do anticorpo capturado foi monitorada durante 6 minutos. O anticorpo capturado foi removido por uma injeção breve de 10 mM de glicina, pH 1,5. Todos os sensorgramas foram de referência dupla subtraindo-se os sensorgramas das injeções de tampão dos sensorgramas de análito, removendo deste modo artefatos causados pela dissociação do anticorpo da superfície de captura. Os dados de aglutinação para cada anticorpo foram ajustados a um modelo de aglutinação 1:1 com transporte de massa usando o software BIAcore T100 Evaluation v2.1. Os resultados são mostrados nas Tabelas 11 e 12. Tabela 11

Tabela 12

[00351] As afinidades de aglutinação dos anticorpos de cadeia leve comum compreendendo os rearranjos mostrados nas Tabelas 5 e 6 variam, com quase todos exibindo um KD na faixa nanomolar. Os dados de afinidade são compatíveis com os anticorpos de cadeia leve comum que resultam da associação combinatória de domínios variáveis rearranjados descritos nas Tabelas 5 e 6 sendo de alta afinidade, de maneira clonada selecionados, e somaticamente mutados. Acoplados com os dados anteriormente mostrados, os anticorpos de cadeia leve comum descritos nas Tabelas 5 e 6 compreendem uma coleção de anticorpos diversos, de alta afinidade que exibem especificidade para um ou mais epítopos no Antígeno E.

Exemplo 10 Determinação das Especificidades de Aglutinação de Anticorpos de Cadeia Leve Comum Específicos de Antígeno pelo Ensaio LUMINEX®

[00352] Os anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E selecionados foram testados quanto à sua capacidade para aglutinar ao ECD de Antígeno E e variantes ECD de Antígeno E, incluindo o ortólogo de macaco cinomolgo (Mf Antígeno E), que difere da proteína humana em aproximadamente 10 % dos seus resíduos de aminoácido; um mutante de deleção de Antígeno E carecendo dos últimos 10 aminoácidos da extremidade de terminal C da ECD (Antígeno E-FCT); e dois mutantes contendo uma substituição de alanina nos locais suspeitos de interação com o Ligante Y (Antígeno E-Ala1 e AntígenoE-Ala2). As proteínas do antígeno E foram produzidas em células CHO e cada uma conteve um rótulo de terminal C myc-myc-His.

[00353] Para os estudos de aglutinação, a proteína ECD do Antígeno E ou proteína variante (descrita acima) a partir de 1 ml de meio de cultura foi capturada pela incubação durante 2 horas na temperatura ambiente com 1 x 106 pérolas de microesfera (LUMINEX®) covalentemente revestidas com um anticorpo monoclonal anti-myc (MAb 9E10, linhagem de célula de hibridoma CRL-1729®; ATCC, Manassas, VA). As pérolas foram depois lavadas com PBS antes do uso. Os sobrenadantes contendo anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E foram diluídos 1:4 em tampão e adicionados à placa de filtração de 96 reservatórios. Um sobrenadante simulado sem nenhum anticorpo foi usado como controle negativo. As pérolas contendo as proteínas de Antígeno E capturadas foram depois adicionadas às amostras de anticorpo (3000 pérolas por reservatório) e incubadas durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, as pérolas de amostra foram lavadas e o anticorpo de cadeia leve comum ligado foi detectado com um anticorpo de IgG anti-ser humano conjugado com R-ficoeritrina. A intensidade de fluorescência das pérolas (aproximadamente 100 pérolas contadas para cada aglutinação de amostra de anticorpo a cada proteína de Antígeno E) foi medida com um analisador com base na citometria de fluxo LUMINEX®, e a intensidade de fluorescência média (MFI) para pelo menos 100 pérolas contadas por interação de pérola/anticorpo foi registrada. Os resultados são mostrados nas Tabelas 13 e 14. Tabela 13

Tabela 14

[00354] Os sobrenadantes de anticorpo de cadeia leve comum anti- Antígeno E exibiram alta aglutinação específica às pérolas ligadas ao Antígeno E-ECD. Para estas pérolas, o sobrenadante simulado do controle negativo resultou em sinal negligenciável (<10 MFI) quando combinado com a amostra de pérola de antígeno E-ECD, ao passo que os sobrenadantes contendo anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E exibiram sinal de aglutinação forte (MFI média de 2627 para 98 sobrenadantes de anticorpo; MFI > 500 para 91/98 amostras de anticorpo).

[00355] Como uma medida da capacidade dos anticorpos de cadeia leve comum anti-Antígeno E selecionados para identificar epítopos diferentes no ECD de Antígeno E, a aglutinação relativa dos anticorpos às variantes foram determinadas. Todas as quatro variantes do Antígeno E foram capturadas pelas pérolas LUMINEX® anti-myc como descrito acima para os estudos de aglutinação de Antígeno E-ECD nativo, e as razões de aglutinação relativa (MFIVariante/MFIAntígeno E-ECD) foram determinadas. Para 98 sobrenadantes de anticorpo de cadeia leve comum testados mostrados nas Tabelas 12 e 13, as razões médias (MFIVariante/MFIAntígeno E-ECD) diferiram para cada variante, refletindo do mesmo modo quantidades de captura diferentes de proteínas nas pérolas (razões médias de 0,61, 2,9, 2,0, e 1,0 para Antígeno E-FCT, Antígeno E-Ala1, Antígeno E-Ala2, e Mf Antígeno E, respectivamente). Para cada variante de proteína, a aglutinação a um subconjunto dos 98 anticorpos de cadeia leve comum testados apresentou aglutinação enormemente reduzida, indicando sensibilidade à mutação que caracterizou uma dada variante. Por exemplo, 19 das amostras de anticorpo de cadeia leve comum se aglutinaram ao Mf Antígeno E com MFIVariante/MFIAntígeno E-ECD de <8 %. Visto que muitos neste grupo incluíram anticorpos de afinidade alta ou moderadamente alta (5 com KD < 5nM, 15 com KD < 50 nM), é provável que o sinal mais baixo para este grupo resulte da sensibilidade às diferenças de sequência (epítopo) entre Antígeno E-ECD nativo e uma dada variante ao invés de afinidades mais baixas.

[00356] Estes dados estabelecem que os anticorpos de cadeia leve comum descritos nas Tabelas 5 e 6 representam um grupo diverso de anticorpos de cadeia leve comum específicos de Antígeno-E que especificamente reconhecem mais do que um epítopo no Antígeno E.

Exemplo 11 Embaralhamento de Cadeia Leve em Anticorpos de Cadeia Leve Comum

[00357] As cadeias pesadas de anticorpos de cadeia leve comum específicos de antígeno selecionados foram testados quanto à aglutinação ao Antígeno E depois de reemparelhamento das cadeias pesadas com uma cadeia leve da nkpjc ggrmkπctkvc fg XK3-5;LK7 qw woc nknjc igtokpcVkxc fg XK5- 42LK3 gpignftcfcu *eqmq fguetktq nq Gzgmrnq 3+o

[00358] Em resumo, 247 cadeias pesadas de anticorpos de cadeia leve eqmwm gurgeífíequ fq Cntíignq G *XK3-5;LK7 g XK5-42LK3+ hotcm transfectadas com uma ccfgkc ngxg Xk3-5; fc nknjc igtoknctkxc qw woc Xk5- 20 da linha germinativa engendradas e retriadas quanto à aglutinação ao Antígeno E por um ensaio LUMINEX® (como descrito no Exemplo 7 e Exemplo 10). A aglutinação ao Antígeno E foi confirmada pelo BIACORE® (como descrito no Exemplo 9). Os resultados são mostrados na Tabela 15.

[00359] Como mostrado neste Exemplo, vinte e oito anticorpos de cadeia leve comum específicos para o Antígeno E foram capazes de aglutinação ao Antígeno E quando reemparelhados com uma forma da linha germinativa da cadeia leve. Tabela 15

Exemplo 12 Uso de Gene da Cadeia e Frequência de Hipermutação Somática em Anticorpos de Cadeia Leve Comum

[00360] As sequências de cadeia pesada e leve (>6000) de anticorpos incitados em camundongos VELCOIMMUNE® (por exemplo, US 6.596.541 e US 7.105.348) foram compilados com sequências de cadeia pesada e leve (>600) de anticorpos de cadeia leve comum obtidos por um esquema de imunização de antígeno múltiplo utilizando os camundongos de cadeia leve engendrados (descritos acima) para comparar o uso do segmento de gene de cadeia pesada e as frequências de hipermutação somática das cadeias de anticorpo.

[00361] Uso de Gene de Cadeia Pesada. As sequências de cadeia pesada e leve obtidas de camundongos VELOCIMMUNE® contendo uma substituição do local de cadeia pesada de camundongo endógeno com segmentos de gene de VH, DH, e JH humanas e uma substituição do local de ecfgkc ngxg K fg ecowpfqpiq gpf„igpq eqo c tgik«q fg ecfgkc ngxg fg XK3- 5;LK7 fc linha igtoipcVkxc hwocpc gpigpftcfc qw c tgik«q fg ecfgkc ngxg fg XK5-42LK3 fc nkpjc igtokpcvkxc jwocpc gpigpftcfc *eqoq fguetkvcu pq Exemplo 2) imunizados com um receptor de superfície de célula humano (Antígeno E), um heterodímero de duas glicoproteínas de superfície de célula humanas (Antígeno F), um receptor da citocina humana (Antígeno G) e um antígeno de diferenciação de tumor humano (Antígeno H) foram analisados quanto ao uso de segmento de gene de cadeia pesada e os segmento de gene de VH e JH foram registrados. Os resultados são mostrados nas Tabelas 16 a 18. As porcentagens nas Tabelas 16 a 18 representam valores arredondados e em alguns casos podem não ser iguais a 100 % quando somados juntos.

[00362] A Tabela 16 apresenta a porcentagem de uso da família da cadeia pesada para os anticorpos de camundongos VELCOIMMUNE® (VI), anticorpos de camundongos VELCOIMMUNE® tendo uma cadeia leve de XK3-39 cognata (VI - XK3-39), anticorpos de camundongos com a cadeia ngxg fg XK3-5; gpigpftcfqu *XK3-39), anticorpos de camundongos VGNEQIOMUPE® Vgpfq woc ecfgkc ngxg fg XK5-20 cognata (VI - XK5- 42+. g cpvkeqtrqu fg ecowpfqpiqu eqo ecfgkc ngxg Xk5-20 engendrados *Vk5-20). A Tabela 17 apresenta a porcentagem do uso de gene de VH e JH para os anticorpos de camundongos VELCOIMMUNE® (VI), anticorpos de ecowpfqpiqu VGNEQIOOUPE® Vgpfq woc ecfgkc ngxg fg VK3-39 cognatos (VI - Vk3-5;+. cpvkeqtrqu fg ecowpfqpiqu fg ecfgkc ngxg fg Vk3- 39 engendradqu *Vk3-39), anticorpos de camundongos VELCOIMMUNE® vgpfq woc ecfgkc ngxg Vk5-20 cognata (VI - Vk5-20), e anticorpos de ecowpfqpiqu fg ecfgkc ngxg fg Vk5-42 gpigpftcfqu *Vk5-20). A Tabela 18 apresenta a porcentagem do uso de gene de VH para anticorpos de ccowpfqpiqu fg ecfgkc ngxg fg Vk3-5; gpigpftcfqu *Ecowpfqpiqu Vk3 -39) de cada grupo de imunização (Antígenos E, F, G e H) e a porcentagem de uso de gene de VH rctc cpvkeqtrqu fg ecowpfqpiqu fg ecfgkc ngxg fg Vk5-20 gpigpftcfqu *Ecowpfqpiqu Vk5-20) de grupos de imunização selecionados (Antígenos E e G).

[00363] Como mostrado neste Exemplo, o uso do gene de cadeia rgucfc rctc qu cpViigpqu VguVcfqu go ecowpfqpiqu fg ecfgkc ngxg fg VK3- 5;LK7 gpigpftcfqu hqk ectceVgtkzcfq rqt woc rtgrqpfgtânekc fg uwditwrqu III da família de VH (VH3-7, VH3-9, VH3-11, VH3-13, VH3-20, VH3-23, VH3- 30, VH3-33 e VH3-48). O uso notável de outros subgrupos da família VH foi caracterizado pelo uso de VH1-18, VH1-69, VH2-5, VH4-59 e VH6-1. Para os antígenos testados nos camundongos da cadeia leve fg Vk5-42Lk3 engendrados, o uso de gene da cadeia pesada foi caracterizado por uma preponderância de subgrupos da família III de VH, família IV de VH e família V de VH (VH3-11, VH3-30, VH3-33, VH4-39, VH4-59 e VH5-51). O uso notável de outros subgrupos da família VH foi caracterizado pelo uso de VH1-18, VH1- 69, VH2-70 e VH6-1.

[00364] Frequência de Hipermutação Somática. As cadeias pesada e leve de anticorpos incitados em camundongos VELCOIMMUNE® e os camundongos de cadeia leve engendrados (descritos acima) foram alinhadas com as sequências da linha germinativa de acordo com o uso de gene da cadeia pesada e leve demonstrado para cada cadeia pesada e/ou leve. As mudanças de aminoácido para cada região de estrutura (FW) e região determinadora de complementaridade (CDR) tanto para a cadeia pesada quanto a leve de cada sequência foram calculadas. Os resultados são mostrados nas Tabelas 19 a 22. As porcentagens nas Tabelas 21 a 24 representa valores arredondados e em alguns casos pode não ser iguais a 100 % quando somados juntos.

[00365] A Tabela 19 apresenta o número de mudanças de aminoácido (AA) observado em cada região de FW e CDR de cadeias pesadas de anticorpos de camundongos VELCOIMMUNE®, cadeias pesadas de cpVkeqtrqu fg ecowpfqpiqu fg ecfgkc ngxg gpigpftcfc XK3-39 *Ecowpfqpiqu XK3-39) e cadeias pesadas de anticorpos de camundongos de ecfgkc ngxg gpigpftcfc Xk5-42 *Ecowpfqpiqu Xk5-20). A Tabela 20 apresenta o número de mudanças de aminoácido (AA) observado em cada região de FW e CDR das cadeias leves de anticorpos de camundongos VELCOIMMUNE®, a cadeia leve de anticorpos de camundongos gpigpftcfqu Xk3-5; *Ecowpfqpiqu Xk3-39) e a cadeia leve de anticorpos de camundongos gpigpftcfqu Xk5-42 *Ecowpfqpiqu Xk5-20). A Tabela 21 apresenta o número de mudanças de aminoácido (AA) observado em cada região FW e CDR das cadeias pesadas de anticorpos de camundongos de ecfgkc ngxg fg Xk3-5; gpigpftcfqu *Ecowpfqpiqu Xk3-39) para grupos de imunização selecionados (Antígenos E, F e H). A Tabela 22 apresenta o número de mudanças de aminoácido (AA) observado em cada região FW e CDR das cadeias pesadas de anticorpos de camundongos de cadeia leve de Xk5-42 gpigpftcfqu *Xk5-20 Camundongos) para grupos de imunização selecionados (Antígenos E e G).

Exemplo 13 Afinidade de Aglutinação de Anticorpos Biespecíficos Tendo Cadeias Leves Universais

[00366] Anticorpos totalmente humanos biespecíficos foram construídos a partir das regiões variáveis de cadeia pesada humana clonadas de anticorpos anti-Antígeno E de cadeia leve comum monoespecíficos selecionados (descritos no Exemplo 5) usando técnicas de DNA recombinantes padrão conhecidas na técnica. A Tabela 23 apresenta o emparelhando de cadeias pesadas humanas (HC-1 e HC-2) de anticorpos monoespecíficos precursores selecionados, cada par utilizado com uma cadeia ngxg XK3-5;1LK3 fc nkpjc igtokncVkxc jwocnc tecttanjcdc rctc c eqnuVtw>«q de cada anticorpo biespecífico.

[00367] A aglutinação de anticorpos anti-Antígeno E biespecíficos ou monoespecíficos precursores ao domínio extracelular (ECD) de Antígeno E foi determinada usando um ensaio de biossensor de ressonância de plásmon de superfície em tempo real em um instrumento BIACORE® 2000 (GE Healthcare). Uma superfície de sensor CM5 BIACORE® derivatizado com anticorpo monoclonal específico de anti-c-myc (Clone# 9E10) usando a química de EDC-NHS foi usado para capturar o ECD de terminal C rotulado com myc-myc-hexahistidina de Antígeno E (AntígenoE-mmh). Em torno de 190 RUs de AntígenoE-mmh foram capturados na superfície do sensor BIACORE®, seguida pela injeção nas concentrações de 300 nM e 50 nM de anticorpos anti-Antígeno E biespecíficos ou monoespecíficos precursores diferentes em uma taxa de fluxo de 50 μl/min. O experimento foi realizado a 25 °C em tampão de condução HBST (0,01 M de HEPES pH 7,4, 0,15 M de NaCl, 3 mM de EDTA, 0,05 % v/v de Tensoativo P20). A quantidade de aglutinação de anticorpo à superfície de AntígenoE-mmh na concentração de 300 nM foi registrada três segundos antes do final da injeção de anticorpo e plotada.

[00368] A Tabela 24 e FIG. 8 apresentam as respostas de aglutinação (unidades de BIACORE®; RU) observadas para cada anticorpo biespecífico (BsAb) e anticorpo precursor monoespecífico (PAb-1, PAb-2). Visto que cada anticorpo foi injetado sob condições de saturação em uma superfície de AntígenoE-mmh idêntica, a resposta de aglutinação reflete a estequiometria de aglutinação para cada aglutinação de anticorpo à superfície de captura de antígeno.

[00369] Como mostrado neste Exemplo, a resposta de aglutinação observada para cada anticorpo biespecífico foi aproximadamente 2 vezes maior do que a resposta de aglutinação para cada anticorpo monoespecífico precursor (Tabela 24 e FIG. 8), demonstrando a construção funcional de anticorpos biespecíficos usando cadeias pesadas de anticorpos monoclonais específicos de antígeno e uma cadeia leve comum onde cada ramo Fab na molécula de anticorpo biespecífico aglutina simultaneamente aos epítopos distintos no domínio extracelular de um dos receptores de superfície de célula (Antígeno E; ver a FIG. 7B, fundo esquerdo).

Exemplo 14. Geração e Análise de Camundongos Que Expressam Duas Cadeia Leves Humanas

[00370] Usando os métodos descritos acima no Exemplo 2, dois locais de cadeia leve engendrados adicionais contendo dois segmentos de gene da XK jwocpc *rqt gzgornq. wo ugiogpVq fg igpg XK3-5; jwocpq g wo XK5- 20 humano) foram construídos (FIG. 9). Um local de cadeia leve engendrado eqpvgxg fqku ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq ugiogpvqu fg igpg fc LK jwocpc pc eqpfíiwtc>«q p«q tgcttcpjcfc *FNE-5J). O segundo local de ecfgkc ngxg gpigpftcfq eqpvgxg fqku ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc g wo ugiogpvq fg igpg fc Lk humana na configuração não rearranjada (DLC-1J). Para cada um dos dois locais de cadeia leve adicionais engendrados, os ugiogpVqu fg igpg jwocpqu fotco flcpswgcfqu 3’ eqo ugswêpeicu fg uipcn fg recombinação para permitir rearranjo in vivo dos segmentos de gene humanos nas células B.

[00371] Os clones de BAC DNA modificados separadamente contiveram cada um dos locais de cadeia leve engendrados operavelmente ligados às sequências de camundongo (isto é, sequências a montante e a lwucpvg fq nqecn fg ecfgic ngxg k fc iowpqinqdwnipc gpf„igpq+ fqtco confirmados pela PCR usando iniciadores localizados nas sequências dentro de cada local de cadeia leve engendrado contendo os dois segmentos de gene fc XK jwocpc ugiwifc rgnc gngVtorotc>«o go efinwncu GU rctc etict ecowpfqpiqu swg gzrtguuco ecfc wo fqu fqiu ugiogpvqu fg igpg fc Xk humana (como descrito acima). Os clones de célula ES positivos que contêm cada um dos locais da cadeia leve engendrada descritos acima foram confirmados pela triagem em Taqman® e cariotipagem usando sondas específicas para os locais de cadeia leve engendrada (como descrito acima). Os clones de célula ES confirmados foram depois usados para implantar camundongos fêmeas para dar origem a uma ninhada de filhotes expressando wo fqoípkq xctkáxgn fg ecfgkc ngxg jwocpq hwpfkfq eqo wo fqoípkq EK fg camundongo, aqui aludido como camundongos de Cadeia Leve Dual (DLC).

[00372] Alternativamente, as células ES que carregam o local de cadeia leve engendrado podem ser transfectadas com uma construção que expressa FLP de modo a remover o cassete da neomicina FRTed introduzida pela construção de alvejamento. Opcionalmente, o cassete de neomicina é removido pela criação para camundongos que expressam a FLP recombinase (por exemplo, US 6.774.279). Opcionalmente, o cassete de neomicina é retido nos camundongos.

[00373] Citometria de Fluxo. As populações de célula B e o desenvolvimento de célula B em camundongos DLC foram validados pela análise de citometria de fluxo de esplenócito e preparações de medula óssea. As suspensões de célula de camundongos homozigotos para dois segmentos fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq ugiogpvqu fg igpg fc Lk jwocpc *p ? 6+. camundongos homozigotos para dois segmenvqu fg igpg fc Xk jwocpc g wo ugiogpvq fg igpg fc Lk jwocpc *p ? 6+. g ecowpfqpiqu fq vkrq ugnxcigo *p = 4) foram fabricados usando métodos padrão (descritos acima) e tingidos com anticorpos fluorescentemente rotulados (como descrito no Exemplo 3).

[00374] Em resumo, 1 x 106 células foram incubadas com CD16/CD32 anti-camundongo (clone 2,4G2, BD Pharmigen) em gelo por 10 minutos, seguido pela rotulação com o seguinte coquetel de anticorpo por 30 minutos em gelo: CD19 anti-camundongo conjugado a APC-H7 (clone 1D3, BD Pharmigen), CD3 anti-camundongo conjugado a Pacific Blue (clone 17A2, DkqNgigpf+. Kik cpvk-camundongo conjugado a FITC (clone 187,1, BD Pharmigen) ou CD43 anti-ecowpfqpiq *enqpg 3D3 3. DkqNgigpf+. lg/. cpVk- camundongo conjugado a PE (clone RML-42, BioLegend) ou kit C anti- camundongo (clone 2B8, BioLegend), IgD anti-camundongo conjugado a PerCP-Cy5,5 (BioLegend), IgM anti-camundongo conjugado a PE-Cy7 (clone II/41, eBioscience), B220 anti-camundongo conjugado a APC (clone RA3-6B2, eBioscience). A seguir do tingimento, as células foram lavadas e fixadas em formaldeído a 2 %. A aquisição de dados foi realizada em um citômetro de fluxo LSRII e analisado com FlowJo (Tree Star, Inc.). Comutação: células B totais (CD19+CD3-+. efinwncu D KÍK+ (IgK'Ig/.- CD19+CD3-), célwncu D IgX+ *KÍK-KÍX+CD19+CD3-). Os resultados para o compartimento de medula óssea são mostrados na FIG. 10A a FIG. 12B. Os resultados para o compartimento esplênico são mostrados na FIG. 13A a FIG. 16.

[00375] Como mostrado neste Exemplo, camundongos DLC-5J demonstram populações de célula B normais dentro dos compartimentos esplênicos e de medula óssea (FIG. 10A a 16). Os camundongos DLC-5J demonstram populações de célula B imatura, madura e pre/pro dentro do compartimento da medula óssea que são substancialmente as mesmas como observadas nas ninhadas do tipo selvagem. De fato, o local DLC-5J foi capaz fg eqorgVkt eqo q nqecn fc ecfgkc ngxg X gpf„igpq rctc rtqfwzkt woc taz«q K<X swg fi uwduVcpekcnogpVg c oguoc eqoq cswgnc qdugtvcfc go camundongos do tipo selvagem (FIG. 14B). Também, os camundongos DLC- 5J demonstram um desenvolvimento de célula B periférica normal conforme a progressão das células B através dos vários estágios no compartimento esplênico (por exemplo, imaturo, maduro, T1, T2 T3, precursor de zona marginal, zona marginal, folicular-I, folicular-II, etc.) ocorre em uma maneira substancialmente a mesma como observado em camundongos do tipo selvagem (FIG. 15A a 16). Ao contrário, os camundongos DLC-1J demonstraram um número global mais baixo de células B e um uso da cadeia ngxg X cwogpvcfq swcpfq eqorctcfq eqo c ecfgkc ngxg k gpigpftcfc *fcfqu não mostrados).

[00376] Expressão de Cadeia Leve Dual. A expressão de ambos os ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc hqk cpcnkucfc go ecowpfqpiqu homozigotos usando um ensaio de PCR quantitativa de acordo com o Exemplo 3. Em resumo, células B CD19+ foram purificadas da medula óssea e baços integrais de camundongos do tipo selvagem, camundongos homozigotos para uma substituição da cadeia pesada de camundongo e local fg ecfgkc ngxg K xctkáxgn eqo c ecfgkc rgucfc jumana e locais de região xctkáxgn fg ecfgkc ngxg K *JK+. cuuko eqoq ecowpfqpiqu jqoqzkiqVqu rctc wo fqu nqecku fg ecfgkc ngxg k gpigpftcfqu eqpvgpfq fqku ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc g ekpeq ugiogpvqu fg igpg fc Lk jwocpc *FNE-5J) ou um segmento de gene fc Lk jwocpc *FNE-1J). A expressão relativa foi pqtocnkzcfc rctc c gzrtguu«q fc tgik«q Ek fg ecowpfqpiq *p ? 5 c 7 camundongos por grupo). Os resultados são mostrados na FIG. 17 e FIG. 18.

[00377] A expressão das cadeias leves contendo um segmento de gene Xk5-20 jwocpq qw Xk3-39 humano rearranjados foram detectados tanto na medula óssea quanto no baço de camundongos DLC-5J e DLC-1J (FIG. 17 e FIG. 18). No compartimento de medula óssea, a expressão tanto da cadeia ngxg fgtkxcfc fg Xk5-20 humano quanto a derivada de Xk3-39 humano em ambas as cepas de camundongos DLC foi significantemente mais alta quando comparada com camundongos compreendendo uma substituição dos ugiogpvqu fg igpg fc Xk g Lk fg ecowpfqpiq eqo ugiogpvqu fg igpg fc Xk g Lk jwocpcu eqttgurqpfgpvgu *Jk= FIG. 17). A expressão da cadeia leve fgtkxcfc fg Xk5-20 humano foi observada em cerca de seis vezes (DLC-5J) a quinze vezes (DLC-3L+ ocku cnvc fq swg pqu ecowpfqpiqu Jk0 Qu camundongos DLC-1J demonstraram expressão de cerca de duas vezes mais alta de cadekcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5-20 humano em relação aos camundongos DLC-5J no compartimento da medula óssea. A expressão de ecfgkc ngxg fgtkxcfc fg Xk3-39 humano foi observada em cerca de seis vezes (DLC-5J) a treze vezes (DLC-1J) mais altas do que em camundoniqu Jk0 Qu camundongos DLC-1J demonstraram expressão de cerca de duas vezes mais cnvc fg ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg XK3-39 humano em relação aos camundongos DLC-5J no compartimento da medula óssea.

[00378] No compartimento esplênico, a expressão tanto da cadeia leve fgtkxcfc fg Xk5-42 jwocpq swcpfq fc fgtkxcfc fg Xk3-39 humano em ambas as cepas de camundongos DLC foi significantemente mais alta quando eqorctcfc eqo qu ecowpfqpiqu Jk *HKI0 3:+0 C gzrtguu«q fg ecfgkc ngxg fgtkxcfc fg Xk5-20 humano foi observada em cerca de quatro vezes (DLC- 5J) e oito vezes (DLC-3L+ ocku cnvc fq swg pqu ecowpfqpiqu Jk0 Qu camundongos DLC-1J demonstraram expressão de cerca de duas vezes mais cnvc fg ecfgkcu ngxgu fgtkxcfcu fg Xk5-20 humano em relação aos camundongos DLC-5J no compartimento esplênico. A expressão de cadeia ngxg fgtkxcfc fg Xk3-39 humano foi observada em cerca de quatro vezes (DLC-5J) a cinco vezes (DLC-3L+ ocku cnvc pqu ecowpfqpiqu Jk0 Qu camundongos DLC-1J demonstraram expressão similar de cadeias leves fgtkxcfcu fg Xk1-39 humano quando comparados com camundongos DLC-5J no compartimento esplênico.

[00379] Uso de VL/JL humana em camundongos DLC-5J. Ecowpfqpiqu jqoqzkiqVqu rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc p«q tgcttcplcfqu g ekpeq ugiogpvqu fg igpg fc Lk jwocpc p«q tgcttcnjado (DLC- 7L+ hqtco cpcnkucfqu swcpvq q wuq fq ugiogpvq fg igpg Xk1Lk jwocpq go células B esplênicas pela reação da cadeia da polimerase com transcriptase reversa (RT-PCR).

[00380] Em resumo, os baços de camundongos DLC-5J homozigoto (n = 3) e tipo selvagem (n = 2) foram colhidos e combinados em 10 ml de RPMI 1640 (Sigma) contendo 10 % de soro bovino fetal inativado por calor usando lâminas de vidro congeladas para triar suspensões de célula única. Os esplenócitos foram peletizados com uma centrífuga (1200 rpm durante cinco minutos) e as células sanguíneas vermelhas foram lisadas em 5 ml de tampão de lise ACK (GIBCO) durante três minutos. Os esplenócitos foram diluídos eqo RDU *Ktxkpg UekgpVkfie+. finvtcfqu eqo wo eqcfqt fg efinwnc fg 2.9 μo g centrifugados mais uma vez para peletizar as células, que foi seguido pela recolocação em suspensão em 1 ml de PBS.

[00381] O RNA foi isolado de esplenócitos peletizados usando o kit AllPrep DNA/RNA mini (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A RT-PCR foi realizada em RNC fg gurngp„ekvq wucpfq q Ukuvgoc 7Ó TCEG (Amplificação Rápida de Extremidades de cDNA) com iniciadores gurgeífíequ rctc q igpg EK fg ecowpfqpiq fg ceqtfq eqo cu gurgekfkec>õgu fq fcdtkecpVg *KpvkVtqigp+o Qu kpkekcfqtgu gurgeífíequ rctc q igpg EK fg camundqpiq fqtco 5Ó oKikE TCEG3 *CCICCIECEC EICEVICIIE CE= UGS KF PQ< 56+ g oKikE5Ó-1 (CTCACTGGAT GGTGGGAAGA TGGA; SEQ ID NO: 35). Os produtos da PCR foram purificados em gel e clonados em vetor pCR®2,1-TOPO® (TOPO® TA Cloning® Kit, Invitrogen) e sequenciados com os iniciadores M13 Avançado (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ ID NO: 36) e M13 Reverso (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO: 37) localizados dentro do vetor nos locais que flanqueiam o sítio de clonagem. Dez clones de cada amostra de baço foram sequenciados. As sequências foram comparadas ao camundongo e conjuntos da imunoglobulina humana dos conjuntos diretórios de referência da IMGT/V-SWGUV rctc fgvgtokpct q wuq fg Xk1Lk0 C Vcdgnc 47 crtgugpvc cu eqodkpc>õgu XKILK rctc qu enqpgu ugngekqpcfqu qdugtvcfqu pqu enqpgu fc RT-PCR de cada amostra de esplenócito. A Tabela 26 apresenta a sequência fg cokpqáekfq fcu jwp>õgu fg XK jwocpa/LK jwocpc g LK jwocpa/EK fg camundongo de clones de RT-PCR selecionados de camundongos DLC-5J homozigotos. As letras em minúsculo indicam mutações na sequência de aminoácido da região variável ou adições não padrão que resultam das adições N e/ou P durante a recombinação.

[00382] Como mostrado neste Exemplo, camundongos homozigotos rctc fqku ugiogpVqu fg igpg fc XK jwocpc p«q tgcttcpjcfqu g ekpeq segmentos fg igpg fc LK jwocpc p«q tgcttcpjcfq *FNE-5J) operavelmente ligafqu cq igpg EK fg ecowpfqpiq u«q ecrczgu fg tgeqodkpct rtqfwvkxcogpvg codqu qu ugiogpvqu fg igpg fc Xk jwocpc eqo qu ugiogpVqu fg igpg fc LK jwocpc oúnvkrnqu rctc rtqfwzkt wo tgrgtV„tkq limitado de cadeia leve da imunoglobulina. Entre os rearranjos nos camundongos homozigotos DLC-7L oquvtcfqu pc Vcdgnc 47. tgcttcplqu Xk1Lk jwocpqu úpkequ hqtco qdugtxcfqu rctc Xk3-5;1Lk4 *3+. Xk3-5;1Lk5 *3+. Xk5-421Lk3 *9+. Xk5-421Lk4 *6+ g Xk5-421Lk5 *3+0 Cnfio disso, tais rearranjos únicos demonstraram diversidade juncional através da presença de aminoácidos únicos dentro da região da cadeia leve da CDR3 (Tabela 26) resultando de cada mutação e/ou da recombinação dos segmentos de gene da Xk g Lk jwocpcu fwtcpvg o desenvolvimento. Todos os rearranjos crtgugpvctco ngkvwtc hwpekqpcn fktgvc pq ecowpfqpiq Ek *Vcdgnc 48+0 [00383] Quando juntos, estes dados demonstram que os camundongos engendrados para apresentar uma escolha de não mais do que dois segmentos de gene da VL humana, ambos dos quais são capazes de rearranjar (por exemplo, com um ou mais e, em algumas modalidades, até cinco segmentos de gene da JL humana) e codificando um domínio VL humano de uma cadeia leve da imunoglobulina têm os números e desenvolvimento de célula B que são quase do tipo selvagem em todos os aspectos. Tais camundongos produzem uma coleção de anticorpos tendo cadeias leves da imunoglobulina que têm um de dois segmentos de gene possíveis da VL humana presentes na coleção. Esta coleção de anticorpos é produzida pelo camundongo em resposta à inoculação do antígeno e são associados com uma diversidade de cadeias pesadas quiméricas reversas (variável humana/constante de camundongo).

Claims

1. Método de fabricar um camundongo, caracterizado pelo fato de que compreende modificar geneticamente o genoma da linha germinativa do camundongo de forma que este inclua: (a) dois segmentos de gene VK imunoglobulina humana não rearranjados e cinco segmentos de gene JK imunoglobulina humana não rearranjados operavelmente ligados a uma região constante de cadeia leve de imunoglobulina, em que os dois segmentos de gene Vk imunoglobulina humana não rearranjados são um segmento de gene Vk1-39 humano, um segmento de gene Vk3-20 humano, e os cinco segmentos de gene Jk imunoglobulina humana não rearranjados são JK1 humano, JK2 humano, JK3 humano, JK4 humano e JK5 humano; e (b) um ou mais segmentos de gene VH imunoglobulina humana, um ou mais segmentos de gene DH imunoglobulina humana, e um ou mais segmentos de gene JH imunoglobulina humana operavelmente ligados a uma sequência da região constante de imunoglobulina não humana; em que os segmentos de gene da cadeia leve k da imunoglobulina humana são capazes de rearranjar e codificar domínios variáveis da cadeia leve da imunoglobulina humana, e ainda em que o camundongo não compreende um segmento de gene VK de imunoglobulina endógena que é capaz de rearranjar para formar uma sequência da região variável de cadeia leve da imunoglobulina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que os dois segmentos de gene Vk imunoglobulina humana não rearranjados e os cinco segmentos de gene Jk imunoglobulina humana não rearranjados são operavelmente ligados a uma sequência da região constante de cadeia leve da imunoglobulina de camundongo ou rato, em que a sequência da região constante de cadeia leve da imunoglobulina é: (i) uma região Ck de rato; ou (ii) uma região CK de camundongo.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que os dois segmentos de gene Vk imunoglobulina humana não rearranjados e os cinco segmentos de gene Jk imunoglobulina humana não rearranjados estão presentes em um local de cadeia leve da imunoglobulina K endógena.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos de gene VH imunoglobulina humana, um ou mais segmentos de gene DH imunoglobulina humana, e um ou mais segmentos de gene JH imunoglobulina humana são operavelmente ligados a uma sequência da região constante de camundongo.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que os segmentos de gene da cadeia pesada da imunoglobulina humana são capazes de rearranjar e codificar domínios variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina humana.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende um local de cadeia leve da imunoglobulina X funcional.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende um local de cadeia leve da imunoglobulina X não funcional.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 7, caracterizado pelo fato de que os dois segmentos de gene VK imunoglobulina humana não rearranjados e os cinco segmentos de gene Jk imunoglobulina humana não rearranjados operavelmente ligados a uma sequência da região constante da cadeia leve de camundongo ou rato estão presentes no local da região variável da cadeia leve da imunoglobulina k endógena do camundongo e compreende em ordem: dois segmentos Vk humana que são o segmento de gene Vk1-39 humano e o segmento de gene VK3-20 humano, um JK1 humano, um JK2 humano, um JK3 humano, um JK4 humano e um JK5 humano.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o camundongo compreende um local DLC- 5J, em que o local DLC-5J compreende uma sequência de junção hVK/hJK/mCK selecionada de SEQ ID Nos: 38-49.

10. Método para fabricar um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: expressar em uma única célula: (a) uma primeira sequência de ácido nucleico compreendendo uma primeira sequência da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina humana a partir de um primeiro camundongo que foi fabricado de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que foi imunizado com um primeiro antígeno de interesse incluindo um primeiro epítopo, em que a sequência da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana é fundida com uma sequência da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana; e (b) uma segunda sequência de ácido nucleico compreendendo a sequência da região variável da cadeia leve K da imunoglobulina humana fundida com uma sequência da região constante da cadeia leve da imunoglobulina humana, em que a sequência da região variável da cadeia leve k da imunoglobulina humana compreende um Vk1-39 humano, um Vk3-20 humano, ou uma versão somaticamente hipermutada do mesmo; mantendo a célula sob condições suficientes para expressar um anticorpo totalmente humano; e isolando o anticorpo da célula.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a célula compreende um terceira sequência de ácido nucleico compreendendo uma segunda sequência da região variável de cadeia pesada da imunoglobulina humana a partir de um segundo camundongo fabricado de acordo com o método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 que foi imunizado com um segundo antígeno de interesse incluindo um segundo epítopo, em que a sequência da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana é fundida com uma sequência da região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana, em que a primeira sequência da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana codifica um domínio variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana que reconhece um primeiro epítopo, e uma segunda sequência da região variável da cadeia pesada da imunoglobulina humana codifica um domínio variável da cadeia peasada da imunoglobulina humana que reconhece um segundo epítopo, em que o primeiro epítopo e o segundo epítopo não são idênticos, e em que o primeiro e o segundo domínios variáveis da cadeia pesada da imunoglobulina humana interagem com o domínio variável da cadeia leve da imunoglobulina humana codificado pela sequência da região variável da cadeia leve da imunoglobulina humana.

12. Método de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro antígeno de interesse e o segundo antígeno de interesse são o mesmo antígeno de interesse, e o primeiro e o segundo epítopo são diferentes epítopos no mesmo antígeno.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que o primeiro camundongo e o segundo camundongo são o mesmo camundongo.