BR112014014268B1

BR112014014268B1 - Métodos para modular a condutância de estomas e estruturas de expressão de planta para execução da mesma

Info

Publication number: BR112014014268B1
Application number: BR112014014268-8A
Authority: BR
Inventors: David Granot; Gilor Kelly; Menachem Moshelion
Original assignee: The State Of Israel, Miniistry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization, (A.R.O.) (Volcani Center); Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd
Priority date: 2011-12-11
Filing date: 2012-12-11
Publication date: 2022-05-31
Also published as: UA116097C2; MX2014006966A; AU2012354054B2; CN104379749B; US10975385B2; EP2788492A4; RU2014128294A; EP2788492A1; EP2788492B1; CA2860011C; BR112014014268A2; AU2012354054A1; BR112014014268B8; CN104379749A; US20140345000A1; ES2651244T3; US20190284569A1; RU2664461C2; CA2860011A1; WO2013088438A1

Abstract

MÉTODOS PARA MODULAR A CONDUTÂNCIA DE ESTOMAS E ESTRUTURAS DE EXPRES-SÃO DE PLANTA PARA EXECUÇÃO DA MESMA, fornece uma estrutura de expressão de plan-tas; de acordo com uma aplicação, a estrutura de expressão de planta compreende uma sequên-cia de ácido nucleico que codifica uma hexoquinase sob um controle transcricional de um ele-mento regulador de ação cis especifico de células-guardas; também são fornecidos métodos para uso das estruturas e plantas transgênicas, células de plantas e partes de plantas que expressam as mesmas.

Description

[0001] O presente pedido de patente de invenção reivindica o benefício de prioridade nos termos do 35 USC 119(e) do Pedido Provisório de Patente Norte-Americana N° 61/569,251, depositado em 11 de dezembro de 2011, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua totalidade. CAMPO DE APLICAÇÃO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

[0002] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, refere-se a métodos para modular a condutância de estomas e estruturas de expressão de planta para execução da mesma.

[0003] Estomas são poros dinâmicos na cutícula protetora impermeável que reveste as partes aéreas de plantas terrestres, que evoluíram principalmente para economizar água. Os estomas, que são compreendidos por duas células-guarda e o poro que elas circunscrevem, se abrem ao amanhecer para permitir a entrada de dióxido de carbono (CO2) da atmosfera para fazer fotossíntese, às custas de uma extensa perda de água na transpiração. Os estomas se fecham quando a fixação e o uso de carbono são menos eficientes, no intuito de reduzir a perda de água por transpiração. No nível mecanicista, os estomas se abrem em resposta ao aumento da osmolaridade das células-guarda. Esses aumentos de osmolaridade são seguidos pelo movimento da água nas células-guarda, que aumentam seu volume e abrem o estoma. O fechamento dos estomas ocorre de maneira oposta; à medida que a osmolaridade das células-guarda é reduzida, seu volume diminui.

[0004] A escassez de água é um grave problema que será exacerbado pelas alterações climáticas globais. Estresses abióticos, principalmente secas e aumento de salinidade, são as causas primárias da perda de colheita em todo o mundo. Além disso, a agricultura atualmente usa aproximadamente 70% (86% nos países em desenvolvimento) da água doce disponível. Uma das abordagens que pode ser adotada para economizar água na agricultura é o desenvolvimento de plantas que usam menos água, mas ainda mantêm altos níveis de produção em condições de escassez de água. À medida que as plantas perdem mais de 95% da sua água através da transpiração pelos estomas, a engenharia da atividade dos estomas é uma abordagem promissora para reduzir a necessidade de água das colheitas e aumentar a produtividade sob condições de estresse.

[0005] Cominelli et al. Transcription. 2010 Jul-Aug; 1(1): 41-45 analisou desenvolvimentos recentes na identificação de reguladores de transcrição que controlam os movimentos dos estomas e estão envolvidos no fechamento dos estomas.

[0006] O histórico adicional da técnica inclui: Pedido de Patente Norte Americana 7,423,203 que apresenta um método para aumentar a produção da planta ao expressar hexoquinase fúngica sob um promotor específico de sementes. Pedido de Patente Norte Americana 20090265812 que apresenta um método para aumentar a tolerância da planta a estresses de alta temperatura ao expressar hexoquinase sob um promotor específico de pólen.

SUMÁRIO

[0007] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma estrutura de expressão de plantas, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica uma hexoquinase sob um controle transcricional de um elemento regulador de ação cis específico de células-guarda.

[0008] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma estrutura de expressão de plantas, compreendendo uma sequência de ácido nucleico que codifica um agente de ácido nucleico para silenciar a expressão de uma hexoquinase, caracterizado pela expressão do agente de ácido nucleico estar sob o controle transcricional de um elemento regulador de ação cis específico de células- guarda.

[0009] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o elemento regulador de ação cis específico de células- guarda é induzível.

[0010] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o elemento regulador de ação cis específico de células- guarda é constitutivo.

[0011] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção o elemento regulador de ação cis específico de células- guarda é um promotor específico de células-guarda.

[0012] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o promotor específico de células-guarda é um promotor KST1.

[0013] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para regular a condutância de estomas de uma planta, o método compreendendo modular na planta o nível e/ou atividade de uma hexoquinase em uma maneira específica na célula-guarda, regulando, dessa forma, a condutância da planta.

[0014] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a modulação é de regulação ascendente.

[0015] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a regulação ascendente é efetuada pela introdução da estrutura de ácido nucleico da reivindicação 1 na planta.

[0016] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a modulação é de regulação descendente.

[0017] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a regulação descendente é efetuada pela introdução na planta de um agente silenciador de ácido nucleico sob um controle transcricional de um elemento regulador de ação cis específico de células- guarda.

[0018] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para diminuir a condutância dos estomas da planta, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico, aumentando, dessa maneira, a condutância dos estomas da planta.

[0019] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência do uso de água de uma planta, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico, aumentando, dessa maneira, a eficiência do uso de água da planta.

[0020] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de aumentar a tolerância de uma planta à seca, salinidade ou estresse de temperatura, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico, aumentando, dessa maneira, a tolerância da planta à seca, salinidade ou estresse de temperatura.

[0021] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método para aumentar a biomassa, vigor ou produção de uma planta, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico, aumentando, dessa maneira, a biomassa, vigor ou produção da planta.

[0022] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de aumentar a tolerância de uma planta ao estresse biótico, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico, aumentando, dessa maneira, a tolerância da planta ao estresse biótico.

[0023] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma planta transgênica ou uma parte respectiva compreendendo a estrutura de expressão de plantas.

[0024] De acordo com um aspecto de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, é fornecida uma célula de planta isolada ou uma cultura de célula de planta compreendendo a estrutura de expressão de plantas.

[0025] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a parte da planta transgênica é uma semente.

[0026] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a parte da planta transgênica é uma folha.

[0027] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a semente é uma semente híbrida.

[0028] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, cultivar a planta sob condições deficientes de água.

[0029] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, cultivar a planta sob salinidade.

[0030] A não ser que seja definido de outra maneira, todos os termos técnicos e/ou científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado que seria normalmente compreendido por alguém de habilidade ordinária na técnica da do presente pedido de patente de invenção pertence. Embora os métodos e materiais similares ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou teste das aplicações do presente pedido de patente de invenção, métodos e/ou materiais exemplares são descritos abaixo. Em caso de conflitos, a especificação da patente, incluindo as definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não devem ser necessariamente limitadores.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0031] Algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção são aqui descritas, apenas a título de exemplo, com referência às figuras que as acompanham. Com referência específica agora às figuras em detalhe, é salientado que os particulares exibidos são a título de exemplo e para fins de discussão ilustrativa das aplicações do presente pedido de patente de invenção. A este respeito, a descrição tomada com as figuras se torna aparente àqueles habilitados na técnica como as aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser praticadas.

[0032] Nas figuras:

[0033] As Figuras de 1A a 1C são gráficos exibindo que a sacarose estimula o fechamento dos estomas através da hexoquinase. A Figura 1A - Imagens de microscópio de luz representativas de estomas tomadas de marcas impressas epidérmicas 3h após o tratamento com 100 mM de sorbitol ou 100 mM de sacarose (barra branca = 20 μm). B, Resposta do estoma à sacarose em tipo selvagem (WT | wild- type) e plantas que expressam AtHXK1 (HK4) foram ensaiadas com folhas imersas por 3h em seiva apoplástica artificial contendo 100 mM de sorbitol (como um controle osmótico), 100 mM de Suc ou 100 mM de sacarose juntos com 20 mM de N- acetil-glucosamina (NAG | N-acetyl-glucoseamine) inibidor de hexoquinase. Impressões epidérmicas foram então tomadas e a abertura dos estomas foi medida. C, As respostas dos estomas às plantas WT às combinações diferentes de açúcar foram ensaiadas assim como descrito na (Figura 1B), com 200 mM de manitol servindo como um controle osmótico adicional. Os dados exibidos nas Figuras 1B, 1C são meios de 300 estomas de seis repetições biológicas independentes ± SE. As letras diferentes indicam uma diferença significativa (teste t, P < 0,05).

[0034] As Figuras 2A a 2D demonstram que a expressão elevada de hexoquinase aumenta o fechamento do estoma e diminui a transpiração. A abertura dos estomas (Figura 2A) e a condutância dos estomas (Figura 2B) foi determinada para controle (WT) e plantas transgênicas expressando níveis diferentes de AtHXK1 (HK38 > HK4 > HK37). Os dados de abertura são meios de 200 estomas de quatro repetições independentes ± SE. Os dados de condutância do estoma são meios de seis repetições independentes ± SE. As letras diferentes indicam uma diferença significativa (teste t, P < 0,05). A Figura 2C - A taxa de transpiração normalizada à área total da folha foi monitorada simultaneamente e de maneira contínua no decorrer do dia e os dados são fornecidos como os meios ± SE para cada 10° ponto de amostragem (n = 6). A Figura 2D - Uma correlação negativa foi observada entre a transpiração diária relativa da planta inteira e a atividade relativa de hexoquinase- fosforilação. Os dados de transpiração foram normalizados para a área total da folha e a quantidade de água foi retirada pelo medidor adjacente submerso de tamanho fixo diariamente, o que foi ajustado a 100%. A atividade de hexoquinase WT foi ajustada a 100%.

[0035] As Figuras 3A a 3E demonstram que AtHXK1 reduz a transpiração especialmente quando expressa em folhas. O enxerto recíproco (Figura 3A) e o enxerto triplo (Figura 3D) foram executados na fase de plântula e as plantas foram fotografadas e utilizadas para medidas de transpiração aproximadamente 4 semanas após o enxerto. As setas amarelas e colchetes indicam a localização dos enxertos. A Figura 3B - Transpiração diária relativa da planta inteira de plantas com enxerto recíproco. Os dados foram normalizados à área da folha total e à quantidade de água tirada do morrão contíguo submerso de tamanho fixo a cada dia, o que foi ajustado a 100%. Os dados são fornecidos como meios de quatro repetições independentes ± SE. As letras diferentes indicam uma diferença significativa (teste t, P < 0,05). A Figura 3C - A taxa de transpiração normalizada à área da folha total das plantas com enxerto recíproco foi monitorada simultaneamente e de maneira contínua durante o dia. Os dados são fornecidos como os meios ± SE para cada 10° ponto de amostragem (n = 4). A Figura 3E - A transpiração diária relativa das plantas com enxerto triplo inteiras calculadas como na (Figura 3B).

[0036] As Figuras 4A a 4B são gráficos demonstrando que a supressão de HXK inibe o fechamento dos estomas em resposta a Suc. A Figura 4A - Medidas quantitativas da expressão em tempo real dos genes de tomate LeHXK1-3 em tomate do tipo selvagem (WT) e em duas linhas independentes de tomate com supressão anti-sentido de HXK, αHK1 e αHK2. Os dados são meios de três repetições biológicas independentes ± SE. Os asteriscos denotam diferenças significativas relativas ao WT (teste t, P < 0,05). A Figura 4B - Resposta dos estomas WT à Suc, duas linhas anti-sentido (αHK1 e αHK2) e que expressam AtHXK1(HK4) foram ensaiadas em folhas intactas que foram imersas em seiva apoplástica artificial contendo 100 mM de Suc por 3h. Os dados são fornecidos como meios de 400 estomas a partir de oito repetições biológicas independentes ± SE. As letras diferentes indicam uma diferença significativa (teste t, P < 0,05).

[0037] A Figura 5 é um gráfico demonstrando que a glucose (Glc) e os açúcares que podem ser fosforilados, mas não metabolizados, estimulam o fechamento dos estomas. As respostas dos estomas aos diferentes açúcares foram ensaiadas em folhas intactas de plantas do tipo selvagem. As folhas foram imersas por 3h em seiva apoplástica artificial contendo manitol (como um controle osmótico), Glc, 2-deoxiglicose (2-dG) ou manose. Impressões epidérmicas foram então tomadas e a abertura dos estomas foi medida. Os dados são fornecidos como meios de 400 estomas de seis repetições biológicas independentes ± SE. As letras diferentes indicam uma diferença significativa (teste t, P < 0,05).

[0038] As Figuras 6A a 6F demonstram que a Suc estimula a produção NO dependente de ABA em células-guarda que são mediadas pelo HXK. As Figuras 6A a 6B - Níveis de óxido nítrico (NO) foram monitorados em células- guarda de cascas epidérmicas do tipo selvagem (WT) e em plantas que expressam AtHXK1 (HK4) utilizando o indicador de NO fluorescente com corante DAF-2DA. Níveis de fluorescência relativos de células-guarda (barras brancas) e aberturas do estoma (barras pretas) foram determinados após 30 minutos de tratamento com tampão de MES (controle) ou MES contendo ou 100 mM de Suc ou 100 mM de sorbitol como um controle osmótico. As imagens de fluorescência representativas são exibidas acima das colunas de fluorescência (barra = 10 μm). Os dados são fornecidos como meios ± SE de 90 estomas (Figura 6A) ou 60 estomas (Figura 6B) para cada tratamento com três a quatro repetições biológicas independentes de cada tratamento. A Figura 6C - Níveis de fluorescência relativos das células-guarda WT foram determinados após 30 min de tratamento com tampão de MES (controle), MES contendo 20 mM de N-acetil-glucosamina (NAG) inibidor de hexoquinase, ou 100 mM de Suc com ou sem 20 mM de NAG. As imagens de fluorescência representativas são exibidas acima das colunas de fluorescência (barra = 10 μm). Os dados são fornecidos como meios de 60 estomas de três repetições biológicas independentes por tratamento ± SE. A Figura 6D - Imagens confocais da produção de NO nas células-guarda das cascas epidérmicas tratadas apenas com 20 mM de NAG (à esquerda), 30 minutos após a adição de 100 mM de Suc (meio) e 30 minutos após o NAG ser lavado com 100 mM de Suc (à direita). O ensaio foi conduzido à medida que a mesma faixa epidérmica foi fotografada (barra = 20 μm). A Figura 6E - Níveis de fluorescência relativos de células- guardas de uma faixa epidérmica tratada como na (Figura 6D). Os dados são fornecidos como meios de 40 a 60 estomas ± SE. A Figura 6F - Imagens confocais da produção de NO nas células-guarda de cascas epidérmicas de Sitiens (mutantes com deficiência de ABA) após 30 minutos de tratamento com tampão de MES contendo ou 100 mM de Suc (à esquerda) ou 100 μM ABA (à direita); barra = 10 μm. Letras minúsculas diferentes nas (Figuras 6A a 6C, 6E) indicam uma diferença significativa entre os tratamentos no que diz respeito aos dados fluorescentes e as letras maiúsculas diferentes na (Figura 6A) indicam uma diferença significativa entre os tratamentos no que diz respeito aos dados de abertura dos estomas (teste t, P < 0,05).

[0039] As Figuras 7A a 7E demonstram que a expressão GFP sobre o controle do promotor KST1 é específico às células-guarda. A Figura 7A- Imagens confocais de folhas de tomate do tipo selvagem (WT) (painéis 1 a 4) e transgênicas (painéis 5 a 8) de plantas com expressão específica de GFP de células-guarda (designadas GCGFP) sob o controle do promotor KST1. Os painéis 1 e 5 são imagens da fluorescência GFP (marcados em verde), os painéis 2 e 6 são a autofluorescência de clorofila (marcada em magenta), os painéis 3 e 7 são imagens de luz branca e os painéis 4 e 8 são imagens diluídas. B a E, Imagens confocais de plantas GCGFP Arabidopsis transgênicas (à direita) e WT (à esquerda). As imagens foram tiradas de folhas (Figuras 7B e 7C, barras = 50 μm e 5 μm, respectivamente), hipocótilos (Figura 7D, barra = 100 μm) e raízes (Figura 7E, barra = 50 μm). Todos os painéis são imagens diluídas de luz branca, autofluorescência de clorofila (magenta) e fluorescência GFP (verde).

[0040] As Figuras 8A a F, demonstram que a expressão de AtHXK1 específica às células-guarda induz o fechamento dos estomas e reduz a transpiração das plantas de tomate e Arabidopsis. A Figura 8A - Imagens representativas de duas linhas de tomate transgênicos independentes e do tipo selvagem (WT) expressando AtHXK1 especificamente nas células-guarda (GCHXK7 e 12). As Figuras 8B e 8C - Condutância dos estomas (gs,) e transpiração diária relativa da planta inteira de duas linhas de tomate transgênicas independentes (GCHXK7 e 12) e WT. Os dados de condutância dos estomas são fornecidos como meios de quatro repetições independentes ± SE. Os dados de transpiração foram normalizados à área da folha total e à quantidade de água tirada do morrão contíguo submerso de tamanho fixo a cada dia, o que foi ajustado a 100%. São apresentados os dados de três dias consecutivos. Os dados para cada dia são fornecidos como meios de quatro repetições independentes ± SE. A Figura 8D - Imagens representativas de Arabidopsis WT (ecótipo Col.) e duas linhas transgênicas independentes expressando AtHXK1 especificamente em células- guardas (GCHXK1 e 2). As Figuras 8E e 8F - Medidas de transpiração e condutância de estomas de WT, duas linhas de Arabidopsis transgênicas independentes, GCHXK1 e GCHXK2 (ecótipo Col.), e o gin 2-1 (AtHXK1 mutante nulo, ecótipo Ler.). As setas indicam condutância aumentada ou diminuída e a transpiração relativa ao WT. Os dados são fornecidos como meios (± SE) de 8 e 12 repetições independentes para as linhas GCHXK e gin2-1, respectivamente. Os asteriscos denotam diferenças significativas relativa ao WT (teste t, P < 0,05).

[0041] A Figura 9 demonstra que a expressão GFP sob o controle do promotor FBPase é específico às células de mesofilo. Imagens confocais de tomate transgênico e folhas de Arabidopsis de plantas com expressão específica de mesofilo de GFP (designado MCGFP) sob o controle do promotor FBPase. As imagens são uma mescla de fluorescência de GFP (marcado em verde) e imagens em luz branca (barra = 100 μm). A fluorescência é específica às células de mesofilo.

[0042] As Figuras 10A a D são gráficos demonstrando que a expressão elevada de hexoquinase nas células-guarda reduz a transpiração enquanto a fotossíntese se mantém inalterada, melhorando assim instantaneamente a eficiência do uso de água. A análise de troca de gás de plantas GCHXK e WT foi ensaiada utilizando um sistema de troca de gás portátil Li-6400 (LI-COR), a condutância dos estomas (Figura 10A), transpiração (Figura 10B), fotossíntese (Figura 10C) e eficiência do uso de água instantânea (IWUE, Figura 10D) foram medidas e calculadas sob condições favoráveis de cultivo. Os dados são meios ± SE (n = 10 para WT e n = 20 para 10 linhas transgênicas diferentes, duas medições cada). A estrela denota a diferença significativa (teste t, P < 0,05).

[0043] As Figuras 11A a 11C demonstram que a expressão elevada de hexoquinase em células-guarda reduz a transpiração das plantas inteiras e aumenta a eficiência do uso da água. As Figuras 11A a 11B - A transpiração diária relativa (RDT | relative daily transpiration) da planta inteira foi analisada utilizando o sistema do lisímetro em grande escala assim como descrito no Exemplo 1. As duas linhas transgênicas GCHXK (GCHXK7, GCHXK12) e WT foram colocadas em balanças. A transpiração e o peso da planta total foram documentados a cada 3 minutos durante o experimento, em que as plantas foram cultivadas sob condições normais por 10 dias, e então sujeitas a estresse de seca por 3 dias, seguido pelo processo de irrigação recuperativa por mais 7 dias. Os dados foram normalizados ao peso da planta total e a quantidade foi tomada pelo morrão contíguo submerso de tamanho fixo a cada dia, que foi ajustado a 100% e utilizado como referência para as variações temporais na transpiração potencial. A Figura 11A - Transpiração relativa diária, dia após dia, durante todo o experimento. Os dados são meios de quatro repetições independentes ± SEM. A Figura 11B - Transpiração diária relativa dos dias selecionados em cada tratamento. Os dados são meios de quatro repetições independentes ± SEM; A estrela denota a diferença significativa (teste t, P < 0,05). A Figura 11C - A eficiência do uso de água foi calculada pela proporção entre o acúmulo de peso da planta e a perda de água da planta, a cada dia, por cada planta. Os dados são meios de quatro repetições independentes ± SEM; A estrela denota a diferença significativa (teste t, P < 0,05). (A-ampliada) O RDT das plantas WT e GCHXK durante a troca de irrigação normal (dia 10) às condições de seca (dia 11). As setas vermelha e verde indicam o declínio de RDT (representado pelo declive) de WT e GCHXK respectivamente, após as plantas serem expostas à seca.

[0044] As Figuras 12A a 12F demonstram que a expressão elevada de hexoquinase nas células-guarda reduzem a taxa de transpiração e condutância dos estomas no decorrer do dia, enquanto exibem um crescimento normal. A taxa de transpiração relativa da planta inteira (Figura 12A) e a condutância dos estomas (gs, Figura 12B) foram analisadas utilizando-se o sistema do lisímetro em grande escala assim como descrito nos métodos. As duas linhas transgênicas GCHXK e WT foram colocadas em balanças. A taxa de transpiração, gs, intensidade de luz 10 (Figura 12E), déficit de pressão de vapor (VPD | vapor pressure deficit, Figura 12F) foram documentados simultaneamente a cada 3 minutos durante o experimento no qual as plantas foram cultivadas sob condições normais. Os dados para as Figuras 12A e 12B foram normalizados à área da folha total e a quantidade foi tomada pelo morrão contíguo submerso de tamanho fixo a cada dia, que foi ajustado a 100% e utilizado como referência para as variações temporais na transpiração potencial. A Figura 12C - Área da folha da planta total, Figura 12D - Peso da planta total.

[0045] A Figura 13 demonstra a taxa de transpiração das plantas WT e GCHXK sob condições de seca. A taxa de transpiração da planta inteira foi analisada utilizando-se o sistema do lisímetro em grande escala assim como descrito no Exemplo 1. As linhas transgênicas GCHXK (em verde) e WT (em azul) foram colocadas em balanças. As taxas de transpiração foram documentadas por 9 dias após a exposição das plantas ser gradualmente aumentada - condições de seca, parando a irrigação por completo. A taxa de transpiração normalizada à área da folha total foi monitorada simultaneamente e de maneira contínua no decorrer do dia e os dados são fornecidos como os meios ± SE para cada ponto de amostragem. Os dados foram normalizados à área da folha total e à quantidade tomada pelo morrão contíguo submerso de tamanho fixo a cada dia, que foi ajustado a 100% e utilizado como referência para as variações temporais na transpiração potencial. A estrela denota o dia no qual a transição de transpiração entre WT e GCHXK ocorreu.

[0046] As Figuras 14A a 14B demonstram a produção de plantas transgênicas expressando hexoquinase, especificamente nas células-guarda. A Figura 14A - Número de frutas coletadas de plantas WT e GCHXK (4 linhas independentes). A Figura 14B - Imagens representativas de planta de tomate transgênica e do tipo selvagem (WT) expressando AtHXK1 especificamente nas células-guarda (GCHXK7).

[0047] As Figuras 15A a 15C demonstram a produção de plantas transgênicas expressando hexoquinase, especificamente nas células-guarda, sob condições limitadas de fornecimento de água. A Figura 15A - As plantas foram cultivadas sob condições controladas em estufas comerciais, seguindo instruções de especialistas no que diz respeito aos procedimentos do cultivo (sistema do solo, irrigação, fertilização etc.). As plântulas foram plantadas em uma ordem misturada por toda a fileira de plantio e a mesma ordem foi mantida a cada fileira. Cada fileira foi irrigada de maneira diferente; ou por completo (100%) ou parcialmente (regimes de irrigação de 75%, 50% e 25%). Desde a fase de rompimento da fruta inicial, as frutas foram coletadas, contadas e pesadas para cada planta individual por 4 semanas. O peso da fruta cumulativo (Figura 15B) e o número da fruta (Figura 15C) das plantas WT (em azul) e GCHXK (em verde) tiveram sua média calculada para cada regime de irrigação. As setas em azul e em verde indicam o peso da fruta diminuído das plantas WT e GCHXK respectivamente ao trocar a irrigação de 75% a 50%.

[0048] As Figuras 16A a 16F demonstram que a expressão específica às células-guarda de AtHXK1 induzem o fechamento dos estomas, reduzem a transpiração e aumentam a temperatura da folha sem baixar a fotossíntese ou condutância dos mesofilos por CO2, aumentando assim a eficiência do uso de água das plantas Arabidopsis. As medidas de condutância (Figura 16A), transpiração (Figura 16B), fotossíntese (Figura 16C) dos estomas e condutância dos mesofilos por CO2 (gm, Figura 16D) de plantas Arabidopsis transgênicas e WT expressando AtHXK1 especificamente em células-guarda (GCHXK). A Figura 16E - A eficiência do uso de água instantânea (IWUE | instantaneous water use efficiency) de plantas WT e GCHXK. A Figura 16F - As temperaturas das folhas (folhas mais aquecidas - fechamento dos estomas) de plantas WT e GCHXK foram determinadas utilizando-se o software ThermaCam researcher pro 2.10. Os pontos de dados são os meios ± SE de 6 repetições biológicas nas Figuras 16A a 16E e de 12 repetições biológicas na Figura 16F. Um asterisco denota uma relativa diferença significativa ao tipo selvagem (teste t, P < 0,05).

[0049] As Figuras 17A a 17B são mapas esquemáticos do vetor binário pGreen0029 contendo o promotor KST1, AtHXK1 cDNA (Figura 17A) ou GFP (Figura 17B) e um finalizador: O vetor também contém genes nos-Kan e neomicina-fosfotransferase II (NptII | neomycin phosphotransferase II) como marcadores selecionáveis para a transformação das bactérias e da planta. DESCRIÇÃO DAS APLICAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO

[0050] O presente pedido de patente de invenção, em algumas aplicações respectivas, se refere aos métodos de modular a condutância de estomas e estruturas de expressão de plantas para execução do mesmo.

[0051] Antes de explicar ao menos uma aplicação do presente pedido de patente de invenção com detalhes, deve ser entendido que o presente pedido de patente de invenção não é necessariamente limitado em sua aplicação pelos detalhes estabelecidos na descrição a seguir ou exemplificado pelos Exemplos. O presente pedido de patente de invenção é capaz de outras aplicações ou de ser praticado ou executado de diversas maneiras.

[0052] A água é o fator principal, limitando o cultivo e desenvolvimento de muitas plantas terrestres. Os estomas, compostos de duas células- guarda, são os portões principais de controle de perda de água da planta. Muitos estímulos ambientais e fisiológicos controlam a abertura dos estomas, mas todos funcionam através da regulação de osmolaridade das células- guarda. O aumento das células-guarda leva à abertura dos estomas e a diminuição de osmolaridade faz com que os estomas se fechem. O paradigma predominante é que a sacarose age como um osmótico nas células-guarda, contribuindo assim com a abertura dos estomas.

[0053] Ao conceber o presente pedido de patente de invenção, os presentes inventores descobriram que, ao contrário do paradigma predominante, a sacarose fecha os estomas através de um mecanismo não osmótico (consulte o Exemplo 2). Além disso, a resposta das células-guarda à sacarose é dependente da hexoquinase de enzimas detectoras de açúcar (HXK | hexokinase), o que ativa o caminho de sinalização do ácido abscísico dentro das células-guarda, levando ao fechamento dos estomas.

[0054] Assim, enquanto reduziam o presente pedido de patente de invenção à prática, os presentes inventores descobriram que a modulação da atividade ou expressão da hexoquinase se correlaciona com a abertura dos estomas.

[0055] Assim como aqui ilustrado abaixo e na seção de Exemplos a seguir, os presentes inventores superexpressaram o HXK nos estomas das plantas de tomate (de uma maneira específica às células- guardas). Surpreendentemente, enquanto a fotossíntese se manteve inalterada (Figura 10C), a condutância dos estomas (indicando a abertura dos estomas, Figura 10B) e a transpiração (Figura 10A) foram reduzidos. Resultados similares foram obtidos ao monitorar os mesmos parâmetros por todo o dia (Figuras 12A a 12D). Acima de tudo, ao medir o peso e a área da folha da planta total (Figuras 12C e 12D, respectivamente), os presentes inventores descobriram que mesmo com as plantas consumindo menos água (Figura 12A), o cultivo não foi prejudicado, e foi até mesmo melhorado. Economizar água sem afetar o cultivo da planta melhora toda a eficiência de uso de água da planta inteira. A expressão elevada de hexoquinase nas células-guarda melhora a produção (Figuras 14A a 14B) até mesmo sob fornecimento limitado de água (Figuras 15A a 15C). Resultados similares foram observados nas Arabidopsis. Esses resultados demonstram que a mesma inserção transgênica de hexoquinase sob o promotor específico às células-guarda utilizado no caso do Tomate (família Solanaceae) é aplicada universalmente enquanto afeta os estomas e aumenta também a eficiência do uso de água no caso das Arabidopsis (família Brassicaceae), e que essa técnica pode ser implementada também em outras espécies.

[0056] Diferente dos estudos anteriores, que dependeram de correlações entre o teor da sacarose e abertura dos estomas, esse estudo teve uma abordagem funcional à examinação dos efeitos da sacarose e seus produtos de clivagem no comportamento dos estomas. Foi agora provado que a sacarose estimula uma resposta específica às células-guarda que é mediada pelo HXK e ABA e leva ao fechamento dos estomas. Sem estar vinculado à teoria, é sugerido que essa resposta apresenta um mecanismo de retroalimentação natural visando a reduzir a transpiração e conservando água sob excesso de fotossíntese, coordenando assim entre fotossíntese e transpiração.

[0057] Assim, de acordo com um aspecto do presente pedido de patente de invenção, é fornecido um método de regular a condutância de estomas da planta, o método compreendendo a modulação na planta no nível e/ou atividade de uma hexoquinase em uma célula-guarda de maneira específica, regulando dessa maneira a condutância dos estomas e a transpiração da planta.

[0058] Como aqui utilizado, a frase “condutância dos estomas” se refere à troca gasosa pelo complexo de poros dos estomas. A condutância dos estomas é regulada pela abertura dos estomas. A condutância dos estomas afeta a transpiração da planta e, portanto, a presente metodologia de acordo com esse aspecto d o presente pedido de patente de invenção, também com a transpiração da planta regulada.

[0059] Como aqui utilizado, a frase “regulação da condutância dos estomas das plantas” se refere ao aumento ou diminuição na condutância dos estomas. O aumento ou diminuição pode ser de pelo menos 2%, 5% , 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais a dizer 90% ou 100% (por exemplo, 20% a 40%).

[0060] Como aqui utilizado, o termo “hexoquinase”, abreviado como HXK, e aqui referido como “o transgene” ou “o polipeptídeo”, se refere à enzima que normalmente fosforila as hexoses (açúcares de seis carbonos), formando o fosfato de hexose e tendo a E.C. número 2.7.1.1. A HXK, como aqui utilizado, se refere também à proteína do tipo hexoquinase ( HKL | hexokinase-like) que se vincula com a hexose e transmite um sinal independente da sua atividade de quinase (fosforilação de hexose).

[0061] As hexoquinases, de acordo com as presentes instruções, podem ser de aproximadamente 100 kD em tamanho como a maioria dos organismos multicelulares (por exemplo, mamíferos e plantas). Elas consistem de duas metades (terminais N e C), que compartilham muita homologia de sequência. Isso sugere uma origem evolucionária pela duplicação e fusão de um ancestral similar de hexoquinase50kD.

[0062] A hexoquinase pode ocorrer naturalmente ou pode compreender/consistir de uma sequência sintética (por exemplo, artificial) enquanto retém uma atividade de hexoquinase.

[0063] Devido ao seu alto nível de conservação, a hexoquinase Do presente pedido de patente de invenção pode ser de uma origem animal ou de planta. De acordo com uma aplicação específica, a hexoquinase é uma hexoquinase de planta.

[0064] As hexoquinases podem ser categorizadas de acordo com sua localização celular. Assim, as HXKs podem estar associadas com as mitocôndrias, associadas com ou dentro dos plastídios ou presentes no citosol. Até o momento, descobriu-se que todas as HXKs examinadas nas eudicotiledôneas possuem ou um peptídeo de sinal plastídio (tipo A) ou um domínio de âncora de membrana de terminal N (tipo B), porém, as hexoquinases citosólicas são também contempladas para o uso de acordo com as presentes instruções. De acordo com uma aplicação específica, a hexoquinase é uma HXK do tipo B (associada às mitocôndrias).

[0065] Como aqui utilizado, “uma atividade de hexoquinase” se refere à capacidade da enzima de regular a condutância dos estomas. A enzima pode vincular a hexose e estimular o caminho do ácido abscísico (ABA | abscisic acid) que controla a condutância dos estomas. A atividade pode ser independente da quinase.

[0066] Exemplos não limitantes das hexoquinases que são contempladas de acordo com as presentes instruções são fornecidas aqui, na Tabela 1, abaixo. Tabela 1. Genes de hexoquinase e suas funções fisiológicas

Tipo A - localizado em estromas plastídios. Tipo B - associado com as mitocôndrias. Tipo C - localizado no citosol e no núcleo. Tipo D - associado com as mitocôndrias, diferente do tipo B na sequência. M - associado às mitocôndrias. P - plastídio. N - núcleo. C - citosol. ND - não determinado. PCD - morte celular programada. Glc - glIcose. *Joint Genome Institute- Selaginella moellendorffii v1.0.

[0067] Assim como mencionado, a sequência HXK pode ocorrer naturalmente ou ser gerada artificialmente (por exemplo, otimizada por códon) de acordo com o uso pretendido.

[0068] De acordo com uma aplicação específica, modular a atividade ou expressão da HXK se refere a regular de forma ascendente a atividade ou expressão, o que resulta na redução da condutância dos estomas. A regulação ascendente pode ser de pelo menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou mais por dizer, 90% ou até mesmo 100%, quando comparado à expressão ou atividade de hexoquinase em uma célula similar da mesma espécie de planta, condições de cultivo e estágio de desenvolvimento (por exemplo, planta do tipo selvagem (WT)).

[0069] Como mencionado, a regulação ascendente da atividade ou expressão de hexoquinase de uma maneira específica às células-guarda possui um número de vantagens na agricultura de vegetais e colheita de plantas.

[0070] Assim, os presentes inventores demonstraram que a regulação ascendente de HXK, de uma maneira específica às células-guarda, diminui a abertura e a condutância dos estomas (sem afetar a fotossíntese), melhora a eficiência do uso da água da planta, aumentando assim a tolerância da planta à seca, e aumenta o vigor, a biomassa ou a produção (sob condições de cultivo ideais ou estresse) gerais. Da mesma maneira, as plantas expressando HXK de uma maneira específica às células-guarda são tolerantes ao estresse de salinidade. É apreciado que a água seja tomada (imersa) pelas plantas como resultado da diferença entre o potencial de água no ar e dentro das plantas. Essa diferença é denominada déficit de pressão de vapor (VPD). A força motriz da água imersa do solo é o VPD. Quanto maior o VPD, maior é a força. Contudo, quando o estoma está parcialmente fechado, o efeito do VPD é diminuído e uma quantidade menor de água é absorvida pela planta. Nesse caso, a planta absorverá menos sal do solo e será menos afetada. As presentes instruções possuem também um impacto sem precedentes na tolerância das plantas ao estresse biótico. Muitos patógenos humanos e de plantas, como bactérias e fungos, invadem as plantas através dos estomas (consulte, por exemplo, Kroupitski et al. Applied and Environmental Microbiology 2009, 6076-6086 instruindo que a Salmonella entérica se internaliza nas folhas através dos estomas abertos). Os estomas não apenas permitem uma fácil entrada, mas também servem como um bom ambiente para atrair os patógenos pelo acúmulo de açúcares próximo às células- guarda quando os estomas estão abertos. De fato, os presentes inventores observaram um número reduzido de infecções por fungos e bactérias em plantas com uma alta expressão de HXK (não exibido).

[0071] De maneira alternativa ou adicional, as presentes instruções também podem ser empregadas para conferir a planta com uma tolerância ao estresse de temperatura (calor ou frio). Por exemplo, espera-se que as plantas que expressam altos níveis de HXK de uma maneira específica às células- guarda exibam um calor extenso e uma resistência ao frio no que diz respeito à frutificação. O desenvolvimento e germinação de pólen são sensíveis ao calor e frio, provavelmente devido à perturbação do metabolismo do açúcar. Sugere-se que durante o estresse de calor, sejam carregados menos açúcares na direção dos grãos de pólen (e outros tecidos coletores também), visto que a maioria da água é transpirada através dos estomas. De acordo com as presentes instruções, quando uma menor quantidade de água for transpirada pelos estomas, então, mais água estará disponível para transporte de açúcar no floema. Isso pode conferir resistência ao estresse de temperatura (por exemplo, calor) permitindo assim a produção de grãos de pólen viáveis.

[0072] De maneira alternativa ou adicional, as presentes instruções podem ser empregadas para a prevenção de podridão no final da florescência (BER | blossom end rot). A BER é um dano fisiológico visível que afeta muitas colheitas como tomate, berinjela, pimenta, melão e muito mais. A BER acontece principalmente sob estresse de calor e água. Sugere-se agora que sob tais condições, a maior parte da água é transpirada e uma menor quantidade de água é disponível para transportar açúcares, minerais e íons na direção das frutas. Consequentemente, reduzir a transpiração pode alocar mais água transportando mais açúcares, minerais e íons na direção das frutas e outros tecidos coletores (Nikinma et al. 2012 Plant, Cell and Environment 2012, 1-15). A BER é determinada pela porcentagem de frutas que exibem podridão visível ou detectável (dano físico) na fruta. A prevenção de BER significa reduzir a porcentagem das frutas com BER.

[0073] Assim, de acordo com uma aplicação exemplar, as presentes instruções podem ser utilizadas para aumentar a biomassa, o vigor ou produção de uma planta.

[0074] Como aqui utilizado, a frase "produção de planta" se refere ao montante (por exemplo, como determinado pelo peso ou tamanho) ou quantidade (números) de tecidos ou órgãos produzidos por planta ou por estação de crescimento. Portanto a produção aumentada pode afetar o benefício econômico que se pode obter da planta em uma área de cultivo e/ou tempo de cultivo específicos.

[0075] Deve ser notado que uma produção de planta pode ser afetada por diversos parâmetros incluindo, mas não limitado, a biomassa de planta; vigor de planta; taxa de crescimento; produção de semente; quantidade de sementes ou grãos; qualidade de sementes ou grãos; produção de óleo; teor de óleo, amido e/ou proteína em órgãos colhidos (por exemplo, sementes, frutas ou partes vegetativas da planta); número de flores (floretes) por panícula (expressa como a razão entre o número de sementes preenchidas sobre o número das panículas primárias); índice de colheita; número de plantas cultivadas por área; número e tamanho de órgãos cultivados por planta e por área; número de plantas por área de cultivo (densidade); número de órgãos colhidos no campo; área da folha total; assimilação de carbono e compartimentação de carbono (a distribuição/alocação de carbono dentro da planta); resistência à sombra; número de órgãos cultiváveis (por exemplo sementes), sementes por vagem, peso por semente; e arquitetura modificada [tal como aumento de diâmetro, espessura ou melhoria das propriedades físicas do caule (por exemplo elasticidade)].

[0076] Como aqui utilizado, a frase “produção de sementes” se refere à quantidade ou peso de sementes por planta, sementes por vagem, ou por área de cultivo ou ao peso de uma única semente, ou ao óleo extraído por semente. Portanto, a produção de sementes pode ser afetada pelas dimensões de sementes (por exemplo comprimento, largura, perímetro, área e/ou volume), número de sementes (preenchidas) e taxa de preenchimento de sementes e por teor de óleo de sementes. Portanto o aumento de produção de sementes por planta pode afetar o benefício econômico que se pode obter da planta em uma área de cultivo e/ou tempo de cultivo específicos; e o aumento de produção de sementes por área de cultivo pode ser alcançado ao aumentar a produção de sementes por planta, e/ou ao aumentar a quantidade de plantas cultivadas na mesma área considerada.

[0077] O termo "semente" (às vezes referido como "grão" ou "drupa") assim como aqui utilizado se refere a uma pequena planta embriônica encapsulada em uma cobertura chamada revestimento da semente (geralmente com alguns alimentos armazenados), o produto do óvulo maduro das plantas gimnospermas e angiospermas que ocorre após a fertilização e algum cultivo dentro da planta mãe. A semente pode ser uma semente híbrida ou uma linha homozigótica.

[0078] A frase “teor de óleo” assim como aqui utilizada se refere à quantidade de lipídios em um órgão de planta específico, ou as sementes (teor de óleo de semente) ou a porção vegetal da planta (teor de óleo vegetal) e é normalmente expressa como porcentagem de peso seco (10% de umidade das sementes) ou peso molhado (para a porção vegetal).

[0079] Deve ser notado que o teor de óleo é afetado pela produção intrínseca de óleo de um tecido (por exemplo semente, fruto, porção vegetal), assim como a massa ou tamanho do tecido produtor de óleo por planta ou por período de cultivo.

[0080] Em uma aplicação, o aumento do teor de óleo da planta pode ser alcançado ao aumentar o tamanho/massa de um tecido de uma planta, o que compreende o óleo por período de cultivo. Assim, o aumento do teor de óleo de uma planta pode ser alcançado ao aumentar a produção, taxa de crescimento, biomassa e vigor da planta.

[0081] Como aqui utilizado, a frase "biomassa da planta" se refere à quantidade (por exemplo, medida em gramas de tecido de ar seco) de um tecido produzido da planta em uma estação de crescimento, o que poderia também determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por área de cultivo. Um aumento na biomassa da planta pode ser na planta inteira ou em partes respectivas, tal como as partes acima do solo (cultiváveis), biomassa do fruto, biomassa vegetativa, raízes e sementes.

[0082] Como aqui utilizado, a frase “taxa de crescimento” se refere ao aumento no tamanho do tecido/órgão da planta por tempo (pode ser medido em cm2 por dia).

[0083] Como aqui utilizado, a frase "vigor da planta" se refere à quantidade (medida pelo peso) de tecido produzido pela planta em um determinado tempo. Portanto o vigor aumentado pode determinar ou afetar a produção da planta ou a produção por tempo de cultivo ou área de cultivo. Além disso, vigor precoce (na semente e/ou plântula) resulta num melhor suporte de campo.

[0084] Deve ser notado que uma produção de planta pode ser determinada sob condições de estresse (por exemplo, estresse abiótico) e/ou não estresse (normais). Contempla-se aqui que a produção, vigor ou biomassa da planta expressando o HXK de uma maneira específica às células-guarda é aumentada em comparação àquela planta do tipo selvagem (não expressando tal HXK) sob condições de estresse ou não estresse.

[0085] Como aqui utilizado, a frase “condições de não estresse” (ou normais ou ideais assim como aqui referido) se referem às condições de cultivo (por exemplo, água, temperatura, ciclos de luz e escuridão, umidade, concentração de sal, concentração de fertilizante no solo, fornecimento de nutrientes como nitrogênio, fósforo e/ou potássio), que não ultrapassam, de maneira significativa, as condições climáticas ou abióticas do dia- a-dia que as plantas podem encontrar, e que permitem um crescimento, metabolismo, reprodução e/ou viabilidade ideais de uma planta em qualquer fase de seu ciclo de vida (por exemplo, em uma colheita de plantas, da semente à planta madura e novamente à semente). Os especialistas na técnica estão cientes das condições de solo normais e condições climáticas para uma determinada planta em uma determinada localização geográfica. Deve ser notado que enquanto as condições de não estresse podem incluir algumas variações brandas das condições ideais (que podem variar de um tipo/espécie de uma planta para outra), tais variações não fazem com que a planta pare de crescer sem a capacidade de retomar o crescimento.

[0086] Como mencionado, a produção aumentada pode estar sob condições de não estresse ou condições de estresse abiótico/biótico.

[0087] A frase “estresse abiótico” como aqui utilizada se refere a qualquer efeito adverso no metabolismo, cultivo, reprodução e/ou viabilidade de uma planta. Consequentemente, o estresse abiótico pode ser induzido pelas condições abaixo do ideal de cultivo ambiental tal como, por exemplo, salinidade, privação de água, inundação, congelamento, temperatura alta ou baixa (por exemplo, frio ou calor), toxicidade a metais pesados, anaerobiose, deficiência de nutrientes, poluição atmosférica ou irradiação UV.

[0088] A frase “tolerância ao estresse abiótico” como aqui utilizada se refere à capacidade de uma planta de suportar um estresse abiótico sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, cultivo, produtividade e/ou viabilidade.

[0089] Como aqui utilizado, a frase “eficiência do uso de água (WUE | water use efficiency)” se refere ao nível de matéria orgânica produzida por unidade de água consumida pela planta, ou seja, o peso molhado de uma planta em relação ao uso de água da planta, por exemplo, a transpiração de biomassa produzida por unidade.

[0090] De maneira similar, “estresse biótico” se refere ao estresse que ocorre como resultado de danos causados a plantas por outros organismos vivos, tais como bactérias, vírus, fungos, parasitas.

[0091] A regulação ascendente da HXK de uma maneira específica às células-guarda pode ser utilizada para remediar qualquer uma das condições acima mencionadas e para melhorar o desempenho geral das plantas. Assim, a regulação ascendente da HXK pode ser eficiente ao expressar um polinucleotídeo exógeno codificando HXK na planta de uma maneira específica às células-guarda.

[0092] A frase “expressando dentro da planta um polinucleotídeo exógeno codificando HXK” como aqui utilizada se refere a regular de maneira ascendente o nível de expressão de um polinucleotídeo exógeno codificando um polipeptídeo HXK dentro da planta ao introduzir o polinucleotídeo exógeno em uma célula da planta ou planta e expressar por meios recombinantes, como melhor descrito aqui abaixo.

[0093] Como aqui utilizado, "expressar" se refere à expressão no mRNA e no nível de polipeptídeo. Será apreciado que para silenciar a expressão deve ficar apenas ao nível de mRNA (mecanismos de silenciamento de HXK são abaixo descritos com mais detalhes).

[0094] Como aqui utilizada, a frase "polinucleotídeo exógeno" se refere a uma sequência de ácido nucleico heteróloga que pode não ser naturalmente expressa dentro da planta ou em que a superexpressão na planta seja desejada. O polinucleotídeo exógeno pode ser introduzido na planta de uma maneira estável ou transitória, de modo a produzir uma molécula de ácido ribonucleico (RNA | ribonucleic acid) e/ou uma molécula polipeptídea. Deve ser notado que o polinucleotídeo exógeno pode compreender uma sequência de ácido nucleico que é idêntica ou parcialmente homóloga a uma sequência de ácido nucleico endógena da planta.

[0095] O termo “endógeno” como aqui utilizado se refere a qualquer polinucleotídeo ou polipeptídeo que esteja presente e/ou naturalmente expresso dentro de uma planta ou uma célula respectiva.

[0096] De acordo com o presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção compreende uma sequência de ácido nucleico codificando um polipeptídeo com uma sequência de aminoácidos de uma hexoquinase.

[0097] De acordo com uma aplicação específica, a sequência de aminoácidos do polipeptídeo de HXK (codificado do polinucleotídeo exógeno) é de, aproximadamente, pelo menos, 30%, 40% ou 50%, ou pelo menos aproximadamente 55%, pelo menos aproximadamente 60%, pelo menos aproximadamente 65%, pelo menos aproximadamente 70%, pelo menos aproximadamente 75%, pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou mais a dizer 100% homóloga à sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste dos SEQ ID Nos: 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 e 94, desde que sua atividade de hexoquinase seja mantida assim como acima descrito.

[0098] A homologia (por exemplo, homologia percentual, identidade + similaridade) pode ser determinada utilizando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP ou TBLASTN software do Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI | National Center of Biotechnology Information) tal como ao usar parâmetros padrão, ao iniciar de uma sequência de polipeptídeos; ou o algoritmo tBLASTX (disponibilizado pelo NCBI) tal como usar os parâmetros padrão, que se comparam os produtos de tradução conceituais em seis quadros de uma sequência de consulta nucleotídica (em ambos os filamentos) contra uma base de dados de sequência de proteínas.

[0099] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o termo “homologia” ou “homólogo” se refere à identidade de duas ou mais sequências de ácido nucleico; ou à identidade de duas ou mais sequências de aminoácidos.

[00100] As sequências homólogas incluem ambas as sequências ortólogas e parálogas. O termo “paráloga” se refere às duplicações de gene dentro de um genoma de uma espécie, levando aos genes parálogos. O termo “ortóloga” se refere aos genes homólogos nos diferentes organismos devido ao relacionamento antigo.

[00101] Uma opção para identificar ortólogos em espécies de plantas monocotiledôneas é executar uma pesquisa BLAST recíproca. Isso pode ser executado por um primeiro BLAST envolvendo executar BLAST na sequência desejada contra qualquer base de dados de sequência, tal como a base de dados publicamente disponível da NCBI que pode ser encontrada em: Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ncbi (ponto) nlm (ponto) nih (ponto) gov. Caso fossem procurados os ortólogos no arroz, a sequência desejada executaria BLAST contra, por exemplo, os 28.469 clones longos de cDNA da Oryza sativa Nipponbare disponível na NCBI. Os resultados BLAST seriam filtrados. As sequências longas de ambos os resultados filtrados ou os resultados não filtrados sofrem então novo cálculo BLAST (segundo BLAST) contra as sequências do organismo do qual a sequência desejada é derivada. Os resultados do primeiro e do segundo BLAST são então comparados. Um ortólogo é identificado quando a sequência resultante no maior placar (melhor chance) no primeiro BLAST identifica no segundo BLAST a sequência de consulta (a sequência desejada original) como a melhor chance. Utilizando o mesmo racional, um parálogo (homólogo a um gene no mesmo organismo) é encontrado. No caso de famílias de sequências extensas, o programa ClustalW pode ser utilizado [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) ebi (ponto) ac (ponto) uk/Tools/clustalw2/index (ponto) html], seguido por uma árvore de neighbor-joining (Hypertext Transfer Protocol://en (ponto) wikipedia (ponto) org/wiki/Neighbor-joining) que ajuda a visualizar o agrupamento.

[00102] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção codifica um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácidos de pelo menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 60%, 70% ou pelo menos aproximadamente 80%, pelo menos aproximadamente 81%, pelo menos aproximadamente 82%, pelo menos aproximadamente 83%, pelo menos aproximadamente 84%, pelo menos aproximadamente 85%, pelo menos aproximadamente 86%, pelo menos aproximadamente 87%, pelo menos aproximadamente 88%, pelo menos aproximadamente 89%, pelo menos aproximadamente 90%, pelo menos aproximadamente 91%, pelo menos aproximadamente 92%, pelo menos aproximadamente 93%, pelo menos aproximadamente 94%, pelo menos aproximadamente 95%, pelo menos aproximadamente 96%, pelo menos aproximadamente 97%, pelo menos aproximadamente 98%, pelo menos aproximadamente 99%, ou mais dizer 100% idêntica à sequência de aminoácidos selecionada do grupo consistindo de 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92 e 94 desde que a atividade de hexoquinase da proteína (assim como descrito acima) seja mantida.

[00103] Como aqui utilizado, o termo “polinucleotídeo” se refere a uma sequência de ácido nucleico de filamentos únicos ou duplos que é isolada e fornecida no formato de uma sequência RNA, uma sequência complementar de polinucleotídeos (cDNA), uma sequência genômica de polinucleotídeos e/ou uma sequência de compostos de polinucleotídeos (por exemplo, uma combinação dos acima mencionados).

[00104] O termo “isolado” se refere a pelo menos parcialmente separado do ambiente natural, por exemplo, de uma célula de planta.

[00105] Como aqui utilizada, a frase “sequência de polinucleotídeo complementar” se refere a uma sequência, que resulta da transcrição reversa do mensageiro RNA utilizando uma transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Tal sequência pode ser posteriormente ampliada in vivo ou in vitro utilizando-se uma polimerase de DNA dependente de RNA.

[00106] Como aqui utilizado, a frase "sequência de polinucleotídeos genômica" se refere a uma sequência derivada (isolada) de um cromossomo e representa, assim, uma porção contígua de um cromossomo.

[00107] Como aqui utilizado, a frase "sequência de compostos de polinucleotídeos" se refere a uma sequência, que é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma sequência de compostos pode incluir algumas sequências exonais exigidas para codificar o polipeptídeo do presente pedido de patente de invenção, tal como algumas sequências de íntrons se interpondo entre os mesmos. As sequências de íntrons podem ser de qualquer fonte, incluindo de outros genes, e tipicamente incluirá sequências de sinal dividido conservadas. Tais sequências de íntrons podem posteriormente incluir elementos reguladores de expressão de ação cis.

[00108] As sequências de ácido nucleico codificando os polipeptídeos HXK presente pedido de patente de invenção podem ser otimizados para expressão. Exemplos de tais modificações na sequência incluem, mas não são limitados a, um teor alterado de G/C a uma abordagem mais próxima do que é encontrado normalmente nas espécies de interesse das plantas, e a remoção de códons encontrados de maneira atípica na espécie de planta normalmente referidos como otimização de códon.

[00109] A frase "otimização de códons" se refere à seleção dos nucleotídeos de DNA apropriados para uso dentro de um gene ou fragmento estrutural respectivo que aborda o uso de códons dentro da planta de interesse. Portanto, um gene ou sequência de ácido nucleico otimizados se referem a um gene no qual a sequência de nucleotídeos de um gene nativo ou que ocorre naturalmente foi modificado no intuito de se utilizar códons preferidos por estatística ou favorecidos por estatística dentro da planta. A sequência de nucleotídeos é normalmente examinada no nível de DNA e a região de codificação é otimizada para a expressão na espécie de planta determinada utilizando qualquer procedimento adequado, por exemplo, assim como descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677-681). Nesse método, o desvio padrão do uso do códon, uma medição de viés do uso de códon, pode ser calculado ao encontrar primeiramente o desvio proporcional ao quadrado de uso de cada códon do gene nativo relativo a aquele dos genes de planta expressos altamente, seguidos por um cálculo do desvio quadrado médio. A fórmula utilizada é: 1 SDCU = n = 1 N [ (Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, onde Xn se refere à frequência de uso do códon n em genes de planta expressos altamente, onde Yn à frequência de uso do códon n no gene de interesse e N se refere ao número total de códons no gene de interesse. Uma tabela de uso de códon de genes expressos altamente de plantas dicotiledôneas é compilada utilizando os dados de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498).

[00110] Um método de otimizar a sequência de ácido nucleico de acordo com o uso preferido do códon para um tipo de célula de planta específico é baseado no uso direto, sem executar quaisquer cálculos de estatística adicionais, de Tabelas de otimização de códon como as fornecidas online na Base de Dados de Uso de Códons através do banco de DNA do NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences | Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) no Japão (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (ponto) kazusa (ponto) or (ponto) jp/codon/). A Base de Dados de Uso de Códons contém tabelas para uso de códons para uma variedade de diferentes espécies, com cada Tabela de uso de códons sendo estatisticamente determinada com base nos dados presentes no Genbank.

[00111] Ao usar as Tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie específica (por exemplo, arroz), uma sequência de nucleotídeos que ocorre naturalmente codificando uma proteína de interesse pode ser otimizada por códon para aquela espécie específica de planta. Isso é efetuado ao substituir os códons que possam ter uma baixa incidência estatística no genoma específico da espécie com códons correspondentes, a respeito de um aminoácido, que é estatisticamente mais favorecido. Porém, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para deletar os locais de restrição existentes, para criar novos em junções potencialmente úteis (extremidades de 5' e 3' para adicionar peptídeos de sinal ou cassetes de terminação, locais internos que podem ser utilizados para cortar e dividir segmentos para produzir uma sequência longa correta), ou para eliminar sequências de nucleotídeos que possam efetuar de maneira negativa a estabilidade ou expressão de mRNA.

[00112] A sequência de nucleotídeos de codificação que ocorre naturalmente já pode, além de qualquer modificação, conter um número de códons que corresponde a um códon favorecido estatisticamente em uma espécie específica de planta. Portanto, a otimização de códons de uma sequência de nucleotídeos nativa pode compreender a determinação de quais códons, dentro da sequência de nucleotídeos nativa, não são favorecidos estatisticamente com respeito a uma planta específica, e a modificação desses códons de acordo com uma tabela de uso de códons da planta específica para produzir uma derivativa otimizada de códon. Uma sequência de nucleotídeos modificada pode ser completa ou parcialmente otimizada para o uso de códons de planta fornecida de maneira que a proteína codificada pela sequência de nucleotídeos modificada seja produzida a um nível maior que a proteína codificada pelo gene correspondente que ocorre naturalmente ou pelo gene nativo. A construção de genes sintéticos pela alteração do uso de códon é descrita, por exemplo, no Pedido de Patente PCT 93/07278.

[00113] O termo '"planta" como aqui utilizado abrange plantas inteiras, ancestrais e progênie das plantas e partes da planta (aquelas que compreendem os estomas, mas não necessariamente), incluindo sementes, brotos, caules, raízes (incluindo tubérculos), e células de plantas, tecidos e órgãos. A planta pode estar em qualquer forma, incluindo culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecidos calosos, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e micrósporos.

[00114] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta é uma planta dicotiledônea.

[00115] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta é uma planta monocotiledônea.

[00116] As plantas que são especificamente úteis nos métodos do presente pedido de patente de invenção incluem todas as plantas que pertencem à superfamília Viridiplantae, especialmente as plantas monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo uma leguminosa forrageira, planta ornamental, cultivo de alimentos, árvore ou arbusto selecionado da lista compreendendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargos, brócolis, couve de Bruxelas, couve, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve-galega, linho, couve-de- folhas, lentilha, colza, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, tomate, polpa de chá, milho, trigo, cevada, centeio, aveia, amendoim, ervilha, lentilha e alfafa, algodão, colza, canola, pimenta, girassol, tabaco, berinjela, eucalipto, uma árvore, uma planta ornamental, uma gramínea perene e uma colheita de forragem. De maneira alternativa, as algas e outras não Viridiplantae podem ser utilizadas para os métodos do presente pedido de patente de invenção.

[00117] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta utilizada pelo método do presente pedido de patente de invenção é uma planta de colheita tal como arroz, milho, trigo, cevada, amendoim, batata, gergelim, oliveira, óleo de palma, banana, soja, girassol, canola, cana de açúcar, alfafa, milhete, leguminosas (feijão, ervilha), linho, tremoço, colza, tabaco, choupo e algodão.

[00118] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a planta é um tomate ou uma banana.

[00119] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a expressão do polinucleotídeo exógeno do presente pedido de patente de invenção dentro da planta é efetuada ao introduzir em uma célula de uma planta (por exemplo, transformar uma ou mais células da planta) um polinucleotídeo exógeno codificando o HXK sob um elemento regulador de ação cis para conduzir a expressão do HXK de uma maneira específica às células-guarda, após gerar uma planta madura das células transformadas e cultivar a planta madura sob condições adequadas para a expressão do polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura.

[00120] Assim, é fornecida uma estrutura de expressão de planta compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando uma hexoquinase sob um controle transcricional de um elemento regulador de ação cis específico às células-guarda e métodos que fazem uso do mesmo.

[00121] Também é fornecido um método de diminuir a condutância dos estomas da planta, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico acima descrita, diminuindo dessa maneira a condutância dos estomas da planta.

[00122] De maneira alternativa ou adicional, é fornecido um método para aumentar a eficiência do uso de água de uma planta, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico acima descrita, aumentando dessa maneira a eficiência do uso de água da planta.

[00123] De maneira alternativa ou adicional, é fornecido um método de aumentar a tolerância de uma planta à seca, salinidade ou estresse de temperatura, o método compreendendo introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de ácido nucleico acima descrita, aumentando dessa maneira a tolerância da planta à seca, salinidade ou estresse de temperatura.

[00124] De maneira alternativa ou adicional, é forneciso um método para aumentar a tolerância a estresse biótico de uma planta, o método compreendendo introduzir em uma célula da planta a estrutura de ácido nucleico acima descrita, aumentando dessa maneira a tolerância a estresse biótico da planta.

[00125] De maneira alternativa ou adicional, é fornecido um método para aumentar a biomassa, vigor ou produção de uma planta, o método compreendendo introduzir em uma célula da planta a estrutura de ácido nucleico, aumentando dessa maneira a biomassa, vigor ou produção da planta.

[00126] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a transformação é efetuada ao introduzir uma estrutura de ácido nucleico à célula da planta, o que inclui o polinucleotídeo exógeno de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção codificando o HXK (assim como descrito acima) e um elemento regulador de ação cis específico às células-guarda. Mais detalhes da abordagem de transformação adequada são fornecidos, aqui abaixo.

[00127] Como aqui utilizado, “elemento regulador de ação cis específico às células- guardas” se refere à capacidade de um elemento transcricional de conduzir a expressão da sequência de ácido nucleico sob sua regulação (por exemplo, HXK) apenas em células-guarda, mantendo sem modificação o resto dos tecidos na planta pela expressão de transgene (por exemplo, mais de 90% do mRNA é expresso no tecido de interesse, como detectado pelo RT-PCR). Os elementos reguladores de ação cis específicos aos tecidos podem ser induzidos por fatores endógenos ou exógenos, para que possam também ser classificados como promotores induzíveis. Em outros casos, são expressos constitutivamente.

[00128] Uma sequência de codificação de ácido nucleico (por exemplo, HXK) é “operacionalmente conectada” a uma sequência reguladora (por exemplo, promotor específico às células-guarda) se a sequência reguladora for capaz de exercer um efeito regulador na sequência de codificação aqui conectada.

[00129] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o elemento regulador de ação cis é um promotor.

[00130] Como aqui utilizado, o termo “promotor” se refere a uma região do DNA que fica ao montante do local de iniciação transcricional de um gene para o qual a polimerase de RNA se vincula para iniciar a transcrição do RNA. O promotor controla onde (por exemplo, em qual porção da planta) e/ou quando (por exemplo, a qual fase ou condição no período de vida de um organismo) o gene é expresso.

[00131] Exemplos de promotores específicos às células-guarda incluem, mas não são limitados aos promotores listados na Tabela 2 abaixo e o promotor KST1 utilizado na seção de Exemplos (SEQ ID N°: 108). Tabela 2

GC (guard cell) - célula-guarda. GFP (green fluorescence protein) - proteína de fluorescência verde. GUS (β-glucoronidase reporter gene ) - gene relator de β-glucoronidase.

[00132] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode incluir, ainda, um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a estrutura de ácido nucleico utilizada é um vetor transportador, que pode se propagar tanto em E. coli (caracterizado pela estrutura compreender um marcador selecionável apropriado e uma origem de replicação) e ser compatível com a propagação em células. A estrutura, de acordo com do presente pedido de patente de invenção, pode ser, por exemplo, um plasmídeo, um bacmídeo, um fagomídeo, um cosmídeo, um fago, um vírus ou um cromossomo artificial.

[00133] A estrutura de ácido nucleico de algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção pode ser utilizada para transformar de maneira estável ou transitória as células da planta. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno é integrado no genoma da planta e dessa maneira representa uma peculiaridade estável e herdada. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, mas não é integrada no genoma e dessa maneira representa uma peculiaridade transitória.

[00134] Existem diversos métodos de introduzir genes externos tanto em plantas monocotiledôneas quanto em plantas dicotiledôneas (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338:274-276).

[00135] Os métodos de princípio de causar a integração estável do DNA exógeno no DNA genômico da planta inclui duas abordagens principais: (i) Transferência de gene mediado por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) págs. 2 a 25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) págs. 93 a 112. (ii) Captação direta de DNA: Paszkowski et al., em Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) págs. 52 a 68; incluindo métodos para captação direta de DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captação de DNA induzida por breve choque elétrico das células de plantas: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791- 793. Injeção de DNA em células ou tecidos de plantas por bombardeamento de partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923- 926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso de sistemas de micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de fibras de vidro ou vibrissas de carboneto de silício de cultura de células, embriões ou tecidos calosos, Patente Norte-Americana N° 5.464.765 ou pela incubação direta de DNA com pólen germinador, DeWet et al. em Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) págs. 197 a 209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA (1986) 83:715-719.

[00136] O sistema Agrobacterium inclui o uso de vetores de plasmídeos que contém segmentos definidos de DNA que se integram dentro do DNA genômico da planta. Métodos de inoculação do tecido da planta podem variar dependendo da espécie da planta e do sistema de distribuição do Agrobacterium. Uma abordagem amplamente utilizada é o procedimento do disco de folha, que pode ser executado com qualquer explante do tecido que forneça uma boa fonte para iniciação da diferenciação da planta inteira. Consulte, por exemplo, Horsch et al. em Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) págs. 1 a 9. Uma abordagem complementar emprega o sistema de distribuição do Agrobacterium em combinação com a infiltração de vácuo. O sistema Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas transgênicas dicotiledôneas.

[00137] Existem diversos métodos de direcionar a transferência de DNA para as células de planta. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na microinjeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células utilizando micropipetas bem pequenas. No bombardeamento de micropartículas, o DNA é absorvido em microprojéteis como cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungstênio, e os microprojéteis são fisicamente acelerados em tecidos de plantas ou células.

[00138] A seguir, a transformação estável da propagação da planta é exercida. O método mais comum de propagação da planta é pela semente. A regeneração pela propagação de sementes, porém, possui a deficiência que, devido à heterozigosidade, há uma falta de uniformidade na colheita, visto que as sementes são produzidas por plantas de acordo com as variações genéticas governadas pelas regras mendelianas. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada uma irá crescer com suas próprias peculiaridades específicas. Portanto, é preferível que a planta transformada seja produzida de maneira que a planta regenerada possua as peculiaridades idênticas e características da planta transgênica controladora. Portanto, é preferível que a planta transformada seja regenerada pela micropropagação que fornece uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

[00139] A micropropagação é um processo de cultivar plantas de nova geração a partir de uma parte única do tecido que tenha sido excisada de uma planta parental selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa das plantas tendo o tecido preferível expressando a proteína da fusão. As plantas de nova geração que são produzidas são geneticamente idênticas à, e possuem todas as características da, planta original. A micropropagação permite a produção em massa de material de qualidade da planta em um curto período de tempo e oferece uma rápida multiplicação dos cultivares selecionados na preservação das características da planta transgênica original ou transformada. As vantagens de se clonar as plantas são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.

[00140] A micropropagação é um procedimento multifásico que requer a alteração do meio de cultura ou condições de cultivo entre as fases. Assim sendo, o processo de micropropagação envolve quatro fases básicas:

[00141] Fase um, cultura inicial de tecidos; fase dois, multiplicação da cultura de tecidos; fase três, diferenciação e formação da planta; e fase quatro, cultivo e endurecimento em estufa. Durante a fase um, cultura de tecido inicial, a cultura de tecido é estabelecida e certificada como livre de contaminadores. Durante a fase dois, a cultura inicial de tecidos é multiplicada até que seja produzido um número suficiente de amostras de tecido, para atender às metas de produção. Durante a fase três, as amostras de tecido cultivadas no estágio dois são divididas e cultivadas em plântulas individuais. Na fase quatro, as plântulas transformadas são transferidas para uma estufa para endurecer, onde a tolerância das plantas à luz é gradualmente aumentada de maneira que possa ser cultivada em um ambiente natural.

[00142] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, as plantas transgênicas são geradas pela transformação transitória das células de folhas, células meristemáticas ou a planta inteira.

[00143] A transformação transitória pode ser efetuada por qualquer um dos métodos diretos de transferência de DNA acima descritos ou por uma infecção viral utilizando-se vírus multiplicados de planta.

[00144] Os vírus que têm se demonstrado úteis para a transformação dos hospedeiros da planta incluem CaMV, vírus do mosaico do tabaco (TMV | Tobacco mosaic virus), vírus do mosaico do bromo (BMV | brome mosaic virus) e vírus do mosaico comum do feijão (BV ou BCMV | Bean Common Mosaic Virus). A transformação das plantas utilizando vírus das plantas é descrita na Patente Norte-Americana N° 4.855.237 (vírus do mosaico dourado do feijão [BGV | bean golden mosaic virus]), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Publicado Japonês N° 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV), EPA 278.667 (BV); e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nova York, págs. 172 a 189 (1988). As partículas de pseudovírus para uso na expressão de DNA externo em diversos hospedeiros, incluindo plantas, são descritas na WO 87/06261.

[00145] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, os vírus utilizados para transformações transitórios são avirulentos e, portanto, incapazes de causar sintomas graves como taxa reduzida de crescimento, mosaicos, manchas anelares, enrolamento das folhas, amarelamento, espalhamento, formação de varíolas, formação de tumores e corrosão. Um vírus avirulento adequado pode ser um vírus avirulento que ocorre naturalmente ou um vírus atenuado artificialmente. A atenuação dos vírus pode ser efetuada ao usar métodos bem conhecidos na técnica incluindo, mas não limitando a, aquecimento subletal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese direcionadas tal como descrito, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et al. (1994).

[00146] Cepas de vírus adequadas podem ser obtidas de fontes disponíveis tal como, por exemplo, a Coleção de Cultura do Tipo Americano (ATCC | American Type Culture Collection) ou por isolamento de plantas infectadas. O isolamento de vírus de tecidos infectados de plantas pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica, tal como descritas, por exemplo, por Foster e Tatlor, Eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998. Brevemente, os tecidos de uma planta infectada de onde se acredita conter uma alta concentração de vírus adequados, preferencialmente folhas jovens e pétalas de flores, são moídos em uma solução amortecedora (por exemplo, solução de tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada por vírus que pode ser utilizada em inoculações posteriores.

[00147] A construção dos vírus do RNA da planta para a introdução e expressão de sequências não virais de polinucleotídeo exógeno em plantas é demonstrada pelas referências acima, tal como por Dawson, W. O. et al., Virology (1989) 172:285 a 292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6:307 a 311; French et al. Science (1986) 231:1294 a 1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73 a 76; e a Patente Norte-Americana N° 5.316.931.

[00148] Quando o vírus é um vírus de DNA, podem-se fazer modificações adequadas ao próprio vírus. De maneira alternativa, o vírus pode ser primeiramente clonado em um plasmídeo bacteriano para facilitar a construção do vetor viral desejado com o DNA externo. O vírus pode então ser excisado do plasmídeo. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem de replicação bacteriana pode ser anexada ao DNA viral, que é então replicado pela bactéria. A transcrição e tradução desse DNA produzirá a proteína de revestimento que irá encapsidar o DNA viral. Se o vírus for um vírus de RNA, o vírus será geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídeo. O plasmídeo é então utilizado para executar todas as estruturas. O vírus RNA é então produzido pela transcrição da sequência viral do plasmídeo e pela tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína(s) de revestimento que encapsidarão o RNA viral.

[00149] Em uma aplicação, um polinucleotídeo viral da planta é fornecido no qual a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa foi deletada de um polinucleotídeo viral, uma sequência de codificação da proteína de revestimento viral da planta não nativa e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor subgenômico da sequência de codificação da proteína de revestimento não nativa, capaz de expressar no hospedeiro da planta, acondicionamento do polinucleotídeo viral da planta recombinante, e garantido uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotídeo viral da planta recombinante, foi inserido. De maneira alternativa, o gene da proteína de revestimento pode ser desativado com a inserção de uma sequência de polinucleotídeos não nativa dentro dele, de maneira que uma proteína seja produzida. O polinucleotídeo viral da planta recombinante pode conter um ou mais promotores subgenômicos não nativos adicionais. Cada promotor subgenômico não nativo é capaz de transcrever ou expressar os genes adjacentes ou as sequências de polinucleotídeo no hospedeiro da planta e incapaz de se recombinar um com o outro e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeos não nativas (externas) podem ser inseridas adjacentes aos promotores subgenômicos virais da planta nativa ou aos promotores subgenômicos virais da planta nativos e não ativos se for incluída mais que uma sequência de polinucleotídeos. As sequências de polinucleotídeo não nativas são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle do promotor subgenômico para produzir os produtos desejados.

[00150] Em uma segunda aplicação, um polinucleotídeo viral da planta recombinante é fornecido assim como na primeira aplicação, exceto que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa é posicionada adjacente a um dos promotores subgenômicos da proteína de revestimento não nativos ao invés de uma sequência de codificação de proteína de revestimento não ativa.

[00151] Em uma terceira aplicação, um polinucleotídeo viral da planta recombinante é fornecido no qual o gene da proteína de revestimento nativo é adjacente ao seu promotor subgenômico e um ou mais promotores subgenômicos não nativos tenham sido inseridos no polinucleotídeo viral. Os promotores subgenômicos não nativos inseridos são capazes de transcrever ou expressar os genes adjacentes em um hospedeiro da planta e são incapazes de se recombinar uns com os outros e com promotores subgenômicos nativos. As sequências de polinucleotídeos não nativas podem ser inseridas adjacentes aos promotores virais da planta subgenômicos não nativos de maneira que as sequências sejam transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle dos promotores subgenômicos para produzir o produto desejado.

[00152] Em uma quarta aplicação, um polinucleotídeo viral da planta recombinante é fornecido como na terceira aplicação, exceto que a sequência de codificação da proteína de revestimento nativa é substituída por uma sequência de codificação da proteína de revestimento não ativa.

[00153] Os vetores virais são encapsidados pelas proteínas de revestimento codificadas pelos polinucleotídeos virais da planta recombinante para produzir um vírus da planta recombinante. Os polinucleotídeos virais da planta recombinante ou vírus da planta recombinante são utilizados para infectar as plantas hospedeiras apropriadas. O polinucleotídeo viral da planta recombinante é capaz de replicar-se no hospedeiro, se espalhar de maneira sistêmica no hospedeiro, e transcrever ou expressar o(s) gene(s) externo(s) (polinucleotídeos exógenos) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

[00154] Técnicas para inoculação de vírus nas plantas pode ser encontradas em Foster and Taylor, eds. “Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)”, Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. “Methods in Virology” 7 vols, Academic Press, Nova York 1967-1984; Hill, S.A. “Methods in Plant Virology”, Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. “Applied Plant Virology”, Wiley, Nova York, 1985; e Kado e Agrawa, eds. “Principles and Techniques in Plant Virology”, Van Nostrand-Reinhold, Nova York.

[00155] Além do acima informado, o polinucleotídeo do presente pedido de patente de invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto, habilitando, assim, a expressão de cloroplasto.

[00156] Uma técnica para introduzir sequências de polinucleotídeos exógenos ao genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os procedimentos a seguir. A princípio, as células de planta são tratadas quimicamente para que reduzam o número de cloroplastos por célula a aproximadamente um. Então, o polinucleotídeo exógeno é introduzido através de um bombardeamento de partículas nas células com o intuito de introduzir pelo menos uma molécula de polinucleotídeo exógeno nos cloroplastos. Os polinucleotídeos exógenos são selecionados de maneira que possam ser integráveis no genoma do cloroplasto através de recombinação homóloga, o que é prontamente efetuado pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos um trecho de polinucleotídeo que é derivado do genoma do cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que serve pelos procedimentos de seleção sequencial para determinar que todas ou substancialmente todas as cópias dos genomas dos cloroplastos seguindo tais seleções incluirão o polinucleotídeo exógeno. Mais detalhes referentes a essa técnica são encontrados nas Patentes Norte- Americanas Nos 4.945.050; e 5.693.507 que são aqui incorporadas por referência. Um polipeptídeo pode assim ser produzido pelo sistema de expressão da proteína do cloroplasto e se tornar integrado à membrana interna do cloroplasto.

[00157] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, o método compreende, ainda, cultivar a planta expressando o polinucleotídeo exógeno sob estresse biótico ou abiótico (por exemplo, seca, privação de água ou estresse de temperatura).

[00158] Assim, a invenção abrange plantas (transgênicas), partes respectivas ou células de planta, expressando de maneira exógena o(s) polinucleotídeo(s) ou as estruturas de ácido nucleico do presente pedido de patente de invenção.

[00159] Uma vez expresso dentro da célula da planta ou da planta inteira, o nível do polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo exógeno pode ser determinado por métodos bem conhecidos na técnica, tais como ensaios de atividade, Western blots utilizando anticorpos capazes de vincularem especificamente o polipeptídeo, Ensaios Imunoadsorventes Vinculado às Enzimas (ELISA | Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay), radioimunensaios (RIA | radio-immuno-assays), imuno- histoquímica, imunocitoquímica, imunofluorescência e similares.

[00160] Métodos para determinar o nível na planta de RNA transcrito do polinucleotídeo exógeno são bem conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, análises Northern blot, análise da reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa ( RT- PCR | reverse transcription polymerase chain reaction) (incluindo RT-PCRs quantitativas, semiquantitativas ou em tempo real) e hibridização de RNA-in situ.

[00161] O efeito do HXK expresso na condutância dos estomas da planta (por exemplo, manifestado pela abertura), eficiência do uso de água, a eficiência do uso de água e/ou fotossíntese podem ser qualificados utilizando- se métodos que são bem conhecidos na técnica. Os ensaios de funcionalidade dos estomas são descritos de maneira profunda na seção Exemplos, que segue abaixo.

[00162] O efeito do polinucleotídeo exógeno codificando o HXK em tolerância de estresse abiótico pode ser determinado utilizando-se métodos conhecidos assim como detalhados na seção Exemplos, que segue abaixo.

[00163] Tolerância ao estresse abiótico - Plantas transformadas (ou seja, expressando o HXK) e não transformadas (tipo selvagem) são expostas às condições de estresse biótico ou abiótico, tal como privação de água ou temperatura abaixo do ideal (baixa temperatura, alta temperatura).

[00164] Tolerância ao estresse do frio - Para analisar o estresse do frio, as plantas maduras (com 25 dias de vida) são transferidas a câmaras a 4°C por 1 ou 2 semanas, com luz constitutiva. Posteriormente, as plantas voltam à estufa. Duas semanas após, os danos do período de resfriamento, resultando no retardo do crescimento e outros fenótipos, são comparados tanto entre plantas controle quanto transgênicas, ao medir o peso da planta (molhada e seca), e ao comparar as taxas de crescimento medidas como tempo até florescerem, tamanho da planta, produção, e similares.

[00165] Tolerância ao estresse do calor - A tolerância ao estresse do calor é obtida ao expor as plantas às temperaturas acima dos 34 °C por um período específico. A tolerância das plantas é examinada após transferir as plantas novamente para os 22 °C para recuperação e avaliação após 5 dias em relação aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas que não foram expostas nem ao estresse do frio ou do calor.

[00166] Eficiência do uso de água - pode ser determinada como a biomassa produzida por unidade de transpiração. Para analisar o WUE, o teor de água relativa na folha pode ser medido em plantas controladas e transgênicas. O peso fresco (FW | fresh weight) é imediatamente registrado; então, as folhas são imersas por 8 horas em água destilada à temperatura ambiente no escuro, e o peso inchado (TW | turgid weight|) é registrado. O peso seco (DW | dry weight) total é registrado após secar as as folhas a 60 °C a um peso constante. O teor de água relativo (RWC | relative water content) é calculado.

[00167] Ensaio de tolerância à salinidade - Espera-se que as plantas transgênicas com tolerância a altas concentrações de sal exibam melhor germinação, vigor de plântula ou crescimento com muito sal. O estresse do sal pode ser efetuado de diversas maneiras, como por exemplo, ao irrigar as plantas com uma solução hiperosmótica, ao cultivar as plantas de maneira hidropônica em uma solução de cultivo hiperosmótico (por exemplo, solução Hoagland), ou ao se cultivar as plantas em um meio de cultivo hiperosmótico [por exemplo meio Murashige-Skoog a 50% (meio MS)]. Visto que diferentes plantas variam consideravelmente na tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, solução de cultivo, ou meio de cultivo pode ser ajustada de acordo com as características da planta cultivar ou variedade específicas, para que inflija um efeito brando ou moderado na fisiologia e/ou morfologia das plantas (para diretrizes como concentração propriada, consultar Bernstein e Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half, 3a ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., Nova York, 2002, e as referências lá inclusas).

[00168] Por exemplo, um teste de tolerância de salinidade pode ser executado ao irrigar plantas em diferentes fases de desenvolvimento com concentrações crescentes de cloreto de sódio (por exemplo, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM de NaCl) aplicados a partir de baixo e a partir de cima para garantir uma distribuição uniforme do sal. Após a exposição à condição de estresse, as plantas são frequentemente monitoradas até que os efeitos substanciais fisiológicos e/ou morfológicos apareçam em plantas do tipo selvagem. Assim, a aparência externa fenotípica, grau de murchamento e sucesso geral em alcançar a maturidade e progênie de produção são comparados entre as plantas controladas e transgênicas.

[00169] Os parâmetros quantitativos medidos de tolerância incluem, mas não são limitados a, o peso médio molhado e seco, taxa de crescimento, tamanho da folha, cobertura da folha, (área da folha total), o peso das sementes produzidas, a média de tamanho das sementes e o número de sementes produzidas por planta. As plantas transformadas que não exibem efeitos fisiológicos e/ou morfológicos substanciais, ou exibem uma biomassa maior do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

[00170] Teste de tolerância osmótica - São conduzidos ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios de cloreto de sódio e manitol) para determinar se um fenótipo de estresse osmótico era específico ao cloreto de sódio ou se era um fenótipo geral relacionado ao estresse osmótico. As plantas que são tolerantes ao estresse osmótico podem ter mais tolerância à seca e/ou ao congelamento. Para experimentos de germinação de estresse osmótico e de sal, o meio é complementado, por exemplo, com 50 mM, 100 mM, 200 mM de NaCl ou 100 mM, 200 mM NaCl, 400 mM de manitol.

[00171] O efeito do transgene no vigor, taxa de crescimento, biomassa, produção e/ou teor de óleo da planta pode ser determinado utilizando-se os métodos conhecidos.

[00172] Vigor da planta - O vigor da planta pode ser calculado pelo aumento nos parâmetros de crescimento como área da folha, comprimento da fibra, diâmetro da roseta, peso fresco da planta e similares por tempo.

[00173] Taxa de crescimento - A taxa de crescimento pode ser medida utilizando-se análises digitais das plantas cultivadas. Por exemplo, imagens das plantas sendo cultivadas na estufa em lotes podem ser capturadas a cada 3 dias e a área da roseta pode ser calculada por análise digital. O crescimento da área de rosetas é calculado utilizando-se a diferença da área de roseta entre os dias de amostragem dividida pela diferença em dias entre amostras.

[00174] Como mencionado, as presentes instruções são também direcionadas para atividades ou expressões de HXK de regulação descendente de uma maneira específica às células-guarda. Isso é efetuado para aumentar a desidratação das plantas quando necessário. Por exemplo, quando houver necessidade de acelerar o desfolhamento antes ou depois da colheita, como o que ocorre com o algodão ou outras colheitas, ou para desidratação de folhas e caules para palha.

[00175] A regulação descendente (silenciamento do gene) do produto de transcrição ou tradução de um HXK endógeno em uma maneira específica à célula-guarda pode ser obtida pela co- supressão, supressão anti-sentidos, interferência de RNA e moléculas ribozimas sob o elemento regulador de ação cis acima mencionado, ativo especificamente em uma célula- guarda.

[00176] Assim, é fornecida uma estrutura de expressão de plantas compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um agente de ácido nucleico para silenciar a expressão de uma hexoquinase, caracterizado pela expressão do referido agente de ácido nucleico estar sob o controle transcricional de um elemento regulador de ação cis específico às células- guarda (assim como descrito acima).

[00177] Co-supressão (supressão de sentidos) - A inibição do gene endógeno pode ser alcançada pela co-supressão, utilizando uma molécula de RNA (ou um vetor de expressão codificando a mesma) que está na orientação de sentido no que diz respeito à direção de transcrição do gene endógeno. O polinucleotídeo utilizado para co-supressão pode corresponder a toda ou apenas parte da sequência codificando o polipeptídeo endógeno e/ou toda ou parte da região não traduzida de 5' e/ou 3' da transcrição endógena; pode também ser um RNA não poliadenilado; um RNA que carece de uma estrutura de cobertura de 5'; ou um RNA que contenha um íntron impossível de ser emendado. Em algumas aplicações, o polinucleotídeo utilizado para co- supressão é projetado para eliminar o códon inicial do polinucleotídeo exógeno de maneira que nenhum produto da proteína seja traduzido. Os métodos para co-supressão utilizando uma sequência cDNA longa assim como uma sequência cDNA parcial são conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, a Patente Norte-americana N° 5.231.020).

[00178] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a regulação descendente do gene endógeno é executada utilizando-se um vetor de expressão de amplicons que compreenda uma sequência derivada de um vírus da planta que contenha todo ou parte do gene alvo, mas geralmente não todos os genes dos vírus nativos. As sequências virais presentes no produto de transcrição do vetor de expressão permitem que o produto de transcrição direcione sua própria replicação. As transcrições produzidas pelos amplicons podem ser ou de sentido ou de anti-sentido relativo à sequência desejada [consulte, por exemplo, Angell e Baulcombe, (1997) EMBO J. 16:3675-3684; Angell e Baulcombe, (1999) Plant J. 20:357-362, e a Patente Norte-americana N° 6.646.805, cada qual aqui incorporado por referência].

[00179] Supressão anti-sentido - A supressão anti-sentido pode ser executada utilizando um polinucleotídeo anti-sentido ou um vetor de expressão que é projetado para expressar uma molécula de RNA complementar a todo ou parte do RNA mensageiro (mRNA | messenger RNA) codificando o polipeptídeo endógeno e/ou a toda ou parte da região não traduzida de 5‘ e/ou 3‘ do gene endógeno. A superexpressão da molécula anti-sentido de RNA pode resultar na expressão reduzida do gene nativo (endógeno). O polinucleotídeo anti-sentido pode ser completamente complementar à sequência desejada (ou seja, 100% idêntica ao complemento da sequência desejada) ou parcialmente complementar à sequência desejada (ou seja, menos do que 100% idêntica, por exemplo, menos do que 90%, menos do que 80% idêntica ao complemento da sequência desejada). A supressão anti-sentido pode ser utilizada para inibir a expressão das múltiplas proteínas na mesma planta (consulte por exemplo, a Patente Norte-americana n° 5.942.657). Além disso, as porções dos nucleotídeos anti-sentido podem ser utilizadas para interromper a expressão no gene desejado. Geralmente, sequências de no mínimo aproximadamente 50 nucleotídeos, no mínimo aproximadamente 100 nucleotídeos, no mínimo aproximadamente 200 nucleotídeos, no mínimo aproximadamente 400, no mínimo aproximadamente 450, no mínimo aproximadamente 500, no mínimo aproximadamente 550, ou superior, podem ser utilizadas. Os métodos para uso da supressão anti-sentido para inibir a expressão dos genes endógenos nas plantas são descritos, por exemplo, em Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1732-1743 e nas Patentes Norte- americanas nos 5.759.829 e 5.942.657, cada qual aqui incorporada por referência. A eficiência da supressão anti- sentido pode ser aumentada ao incluir uma região poli-dT no cassete de expressão a uma posição 3‘ à sequência anti- sentido e 5‘ do sinal de poliadenilação [Consulte a Publicação de Patente Norte-americana n° 20020048814, aqui incorporada por referência].

[00180] Interferência de RNA - A interferência de RNA pode ser obtida utilizando um polinucleotídeo, que pode recozer em si mesmo e formar um RNA com dois filamentos, tendo uma estrutura de forquilha (também chamada de estrutura em grampo), ou utilizando dois polinucleotídeos, que formam um RNA com filamento duplo.

[00181] Para interferência de RNA em em grampo (hpRNA), o vetor de expressão é projetado para expressar uma molécula de RNA que se hibridize para formar uma estrutura em grampo que compreenda uma região de alça com filamentos únicos e uma haste com base pareada.

[00182] Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a região da haste com base pareada das moléculas de hpRNA determinam a especificidade da interferência de RNA. Nessa configuração, a sequência de sentido da região da haste com base pareada pode corresponder a todo ou parte do mRNA endógeno para ser regulado de maneira descendente, ou a uma porção de uma sequência promotora controlando a expressão do gene endógeno a ser inibido; e a sequência anti-sentido da região da haste com base pareada é completa ou parcialmente complementar à sequência de detecção. Tais moléculas de hpRNA são altamente eficientes ao inibir a expressão de genes endógenos, de uma maneira que é herdada pelas gerações posteriores das plantas [Consulte, por exemplo, Chuang e Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; e Waterhouse e Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4:29-38; Chuang e Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 97:4985-4990; Pandolfini et al., BMC Biotechnology 3:7; Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30:135-140; e a Publicação de Patente Norte-americana n° 2003/0175965; cada qual aqui incorporada por referência].

[00183] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência de sentido da haste com base pareada é de aproximadamente 10 nucleotídeos a aproximadamente 2.500 nucleotídeos em comprimento, por exemplo de aproximadamente 10 nucleotídeos a aproximadamente 500 nucleotídeos, por exemplo de aproximadamente 15 nucleotídeos a aproximadamente 300 nucleotídeos, por exemplo de aproximadamente 20 nucleotídeos a aproximadamente 100 nucleotídeos, por exemplo ou de aproximadamente 25 nucleotídeos a aproximadamente 100 nucleotídeos.

[00184] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a sequência anti-sentido da haste com base pareada pode ter um comprimento menor, igual ou maior do que o comprimento da sequência de sentido correspondente.

[00185] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a porção de alça do hpRNA pode ser de aproximadamente 10 nucleotídeos a aproximadamente 500 nucleotídeos em comprimento, por exemplo, de aparentemente 15 nucleotídeos a aproximadamente 100 nucleotídeos, de aproximadamente 20 nucleotídeos a aproximadamente 300 nucleotídeos ou de aproximadamente 25 nucleotídeos a aproximadamente 400 nucleotídeos em comprimento.

[00186] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a porção de alça do hpRNA pode incluir um íntron (ihpRNA), que é capaz de ser emendado na célula hospedeira. O uso de um íntron minimiza o tamanho da alça na molécula de RNA em grampo após a emenda e aumenta, assim, a eficiência da interferência [Consultar, por exemplo, Smith, et al., (2000) Nature 407:319-320; Wesley, et al., (2001) Plant J. 27:581- 590; Wang e Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5:146-150; Helliwell e Waterhouse, (2003) Métodos 30:289-295; Brummell, et al. (2003) Plant J. 33:793-800; e a Publicação de Patente Norte-americana n° 2003/0180945; WO 98/53083; WO 99/32619; WO 98/36083; WO 99/53050; US 20040214330; US 20030180945; Patente Norte-americana n° 5.034.323; Patente Norte-americana n° 6.452.067; PatenteNorte-americana n° 6.777.588; Patente Norte-americana n° 6.573.099 e Patente Norte-americana n° 6.326.527, cada qual aqui incorporada por referência].

[00187] Em algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a região de alça do RNA em grampo determina a especificidade da interferência de RNA ao seu RNA endógeno objetivo. Nessa configuração, a sequência de alça corresponde a toda ou parte do RNA mensageiro endógeno do gene referido. Consulte, por exemplo, WO 02/00904; Mette, et al., (2000) EMBO J 19:5194-5201; Matzke, et al., (2001) Curr. Opin. Genet. Devel. 11:221-227; Scheid, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99:1365913662; Aufsaftz, et al., (2002) Proc. Nat'l. Acad. Sci. 99(4):16499-16506; Sijen, et al., Curr. Biol. (2001) 11:436- 440), cada qual aqui incorporada por referência.

[00188] Para interferência de RNA de filamento duplo, as moléculas de RNA de sentido e anti-sentido podem ser expressas na mesma célula de um vetor de expressão único (o que compreende sequências de ambos os filamentos) ou de dois vetores de expressão (cada um compreendendo a sequência de um dos filamentos). Os métodos para usar a interferência de dsRNA para inibir a expressão dos genes endógenos da planta são descritos em Waterhouse, et al, (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964; e WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, e WO 00/49035; cada qual aqui incorporado por referência.

[00189] De acordo com algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção, a interferência de RNA é efetuada utilizando um vetor de expressão projetado para expressar uma molécula de RNA que seja modelada em um gene endógeno de microRNAs (miRNA). Os microRNAs (miRNAs) são agentes reguladores que consistem de aproximadamente 22 ribonucleotídeos e são altamente eficientes na inibição de expressão de genes endógenos [Javier, et al., (2003) Nature 425:257-263]. O gene miRNA codifica um RNA que forma uma estrutura em grampo contendo uma sequência de 22 nucleotídeos que é suplementar ao gene endógeno alvo.

[00190] Assim, a presente instrução fornece para uma planta transgênica ou uma parte respectiva compreendendo a estrutura de expressão da planta como aqui descrita tal como uma célula de planta isolada ou uma cultura de célula de planta compreendendo a estrutura de expressão da planta assim como aqui descrito.

[00191] As presentes instruções também se referem aos produtos processados produzidos das plantas, partes das plantas ou células de plantas do presente pedido de patente de invenção. Tais produtos processados se referem à comida, ração animal, bebidas, materiais de construção, biocombustível, biodiesel, óleos, molhos, massa, pastéis, refeições, e similares.

[00192] Espera-se que durante a vida de uma patente maturando dessa aplicação, muitas hexoquinases relevantes e elementos reguladores de ação cis específico às células-guarda sejam desenvolvidas e que o escopo dos termos aqui utilizados inclua, a priori, todas as novas tecnologias.

[00193] Como aqui utilizado, o termo “aproximadamente” se refere a ± 10%.

[00194] Os termos "compreendem", "compreendendo", "inclui", "incluindo", “tendo” e seus conjugados significam “incluindo, mas não limitados a”.

[00195] O termo “consiste de” significa “inclui e limitado a”.

[00196] O termo "consistindo essencialmente de" significa que a composição, método ou estrutura pode incluir ingredientes adicionais, etapas e/ou partes, mas apenas se os ingredientes adicionais, etapas e/ou partes não alterarem materialmente as características básicas e inovadoras da composição, método ou estrutura reivindicada.

[00197] Como aqui utilizado, a forma singular "um/umas" e "o/a" inclui referências no plural a não ser que o contexto claramente dite o contrário. Por exemplo, o termo "um composto" ou "pelo menos um composto" pode incluir uma pluralidade de compostos, incluindo misturas respectivas.

[00198] Através dessa aplicação, diversas aplicações do presente pedido de patente de invenção podem ser apresentadas em um formato extenso. Deve ser entendido que a descrição em formato extenso é para mera conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo do presente pedido de patente de invenção. Consequentemente, a descrição de uma extensão deve ser considerada ter divulgada especificamente todas as sub-extensões possíveis tal como os valores numéricos individuais dentro dessa extensão. Por exemplo, a descrição de uma extensão como de 1 a 6 deve ser considerada ter divulgada especificamente as sub-extensões como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6 etc., assim como números individuais dentro dessa extensão, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, e 6. Isso se aplica independentemente da largura da extensão.

[00199] Sempre que uma extensão numérica for aqui indicada, significa incluir qualquer numeral citado (fração ou integral) dentro da extensão indicada. As frases “se estendendo/extensões entre” um primeiro número indicado e um segundo número indicado e “se estendendo/extensões de” um primeiro número indicado “para” um segundo número indicado são aqui utilizadas de maneira intercambiável e pretendem incluir o primeiro e o segundo número indicado e todos os numerais fracionais e integrais entre os mesmos.

[00200] Como aqui utilizado, o termo "método" se refere às maneiras, meios, técnicas e procedimentos para concluir uma dada tarefa incluindo, mas não limitado a, essas maneiras, meios, técnicas e procedimentos ou conhecidos, ou prontamente desenvolvidos de maneiras, meios, técnicas e procedimentos conhecidos aos praticantes das técnicas químicas, farmacológicas, biológicas, bioquímicas e médicas.

[00201] É apreciado que determinadas características do presente pedido de patente de invenção, que são, para esclarecimento, descritas no contexto de aplicações separadas, possam também ser fornecidas em combinação em uma simples aplicação. Reciprocamente, várias características do presente pedido de patente de invenção, que são, para brevidade, descritas no contexto de uma simples aplicação, podem também ser fornecidas de maneira separada ou em qualquer sub-combinação adequada ou tão adequada em qualquer outra aplicação descrita do presente pedido de patente de invenção. Certas características descritas no contexto de diversas aplicações não devem ser consideradas características essenciais dessas aplicações, a não ser que a aplicação seja inoperante sem esses elementos.

[00202] Várias aplicações e aspectos do presente pedido de patente de invenção acima delineado e abaixo reivindicado na seção de reivindicações encontram suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

[00203] Referências são agora feitas aos seguintes exemplos, que juntos com as descrições acima, ilustram algumas aplicações do presente pedido de patente de invenção de uma maneira não restringente.

[00204] Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos de laboratório utilizados do presente pedido de patente de invenção incluem técnicas de DNA molecular, bioquímico, celular e recombinante. Tais técnicas são minuciosamente explicadas na literatura. Consulte, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes de I a III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nova York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nova York; Birren et al. (eds); metodologia assim como anunciada na Patente Norte-americana. Nos 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5,272,057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I a III Cellis, J. E., ed. (1994); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Volumes de 1 a 317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); todos os quais aqui incorporados em sua totalidade por referência. Outras referências em geral são fornecidas através desse documento. Crê-se que os processos ali dispostos sejam bem conhecidos na técnica e sejam fornecidos para conveniência do leitor. Toda a informação ali contida é aqui incorporada por referência.

EXEMPLO 1 MATERIAIS E MÉTODOS Material da planta e condições de cultivo

[00205] Os experimentos foram conduzidos utilizando um tomate WT (Solanum lycopersicum cv. MP-1), linhas de tomate homozigóticas transgênicas independentes isogênicas expressando diferentes níveis da Arabidopsis AtHXK1 (35S::AtHXK1) [assim como descrito anteriormente por ], linhas homozigóticas transgênicas isogênicas com supressão anti-sentido do tomate LeHXK1, genes 2&3, linhas homozigóticas transgênicas isogênicas expressando GFP ou AtHXK1 sob o controle do promotor KST1, e o mutante com deficiência de ABA Sitiens (S. Lycopersicum cv. Ailsa Craig).

[00206] Linhas de tomate HXK anti-sentido independentes, αHK1 e αHK2, foram geradas após a transformação do MP-1 com uma estrutura anti- sentido de StHXK1 (X94302) expressa sob o promotor 35S. A batata StHXK1 compartilha mais de 80% da identidade de sequência com LeHXK1,2&3 e supressão conferida de LeHXK1,2&3 (Figura 4A). As linhas de Arabidopsis (Col.) e tomate (MP-1) que expressam GFP ou AtHXK1 especificamente em células-guarda (linhas GCGFP e GCHXK, respectivamente) foram geradas após a transformação com GFP ou AtHXK1 expressa sob o promotor KST1. Linhas homozigóticas transgênicas independentes para cada estrutura foram então identificadas. As plantas de tomate foram cultivadas em uma estufa com temperatura controlada sob condições naturais de cultivo e as plantas Arabidopsis foram cultivadas em uma câmara de crescimento mantida a 22°C, com um fotoperíodo de 8h com luz / 16h de escuridão.

Medições dos estomas

[00207] A abertura e a densidade dos estomas são determinadas utilizando a técnica de rápida impressão descrita por Geisler e Sack. Essa abordagem permite marcar de maneira confiável centenas de estomas de cada experimento, cada qual é amostrada ao mesmo tempo. Resinas dentais de vinil polissiloxano finas (Heraeus-Kulzer, Hanau, Alemanha) são anexadas ao lado abaxial da folha e então removidas assim que secarem (1 min). As impressões epidérmicas de resina são então cobertas com esmalte, que é removido assim que tiver secado e serve de espelho para a impressão de resina. As impressões de esmalte são colocadas em tiras revestidas de vidro e são fotografadas através de um microscópio com campo brilhante. As imagens dos estomas são então analisadas para determinar o tamanho da abertura utilizando a ferramenta fit-ellipse do software ImageJ (www.rsb.info.nih.gov/ij/) ou qualquer outro software que possa processar e analisar imagens. Uma régua microscópica é utilizada para a calibração de tamanho. As informações adicionais podem ser obtidas do software, tais como largura, comprimento, área, perímetro etc. de um estoma.

[00208] Para avaliar as respostas dos estomas, pequenas folhas foram cortadas e imediatamente imersas em uma solução artificial de seiva de xilema (AXS | artificial xylem sap) contendo 100 mM de sacarose (Duchefa Biochemie) com ou sem 20 mM de N-acetil glucosamina (NAG, Sigma-Aldrich), 100 mM ou 200 mM de glucose (Duchefa Biochemie), 100 mM ou 200 mM de frutose (Sigma-Aldrich), 100 mM de 2-deoxiglicose (Sigma-Aldrich), 10 mM ou100 mM de manose (Sigma-Aldrich), 100 mM de sorbitol (Sigma-Aldrich) ou 100 mM ou 200 mM de manitol (Duchefa Biochemie). Os tratamentos de sorbitol e manitol servem como controles osmóticos não metabólicos. Impressões são tomadas 3h após a análise da imersão e da abertura do estoma. Diferentes espécies de plantas podem também ser utilizadas, como, soluções AXS, soluções de tratamento e sensos diferentes para nossa decisão. Análise da troca de gás

[00209] As medições de troca de gás são avaliadas utilizando um sistema portátil Li-6400 de troca de gás (LI-COR). As plantas são cultivadas sob condições favoráveis ou de estresse, e as medições são conduzidas em folhas totalmente expandidas, da 5a à 6a do topo no caso do tomate. Todas as medições foram conduzidas entre 10h e 02h. Estamos induzindo fotossíntese através de uma luz saturada (de 1000 a 1200 μmol m-2 sec-1) com 370 μmol mol-1 de CO2 ao redor da folha (Ca). A quantidade de luz azul é configurada em 15% de densidade de fluxo de fótons fotossinteticamente ativos para otimizar a abertura dos estomas. O VPD (Déficit de pressão de vapor) da folha pro ar é mantido a aproximadamente 1 a 2,5 kPa e a temperatura da folha é mantida em aproximadamente 25°C, durante todas as medições. Assim que se alcança um estado estável, são feitas as medições. É possível ajustar cada um dos parâmetros acima mencionados. Cada medição contém dados de fotossíntese (μmol CO2 m-2 s-1), transpiração (mmol H2O m-2 s-1), condutância dos estomas (mol H2O m-2 s-1), e é calculada instantaneamente a eficiência do uso de água (μmol CO2 mmol-1 H2O). Dados adicionais obtidos de cada medição são a condutância de mesofilos por CO2 (mol CO2 m-2 s-1 bar-1), taxa de transporte de elétrons, calculada das concentrações internas de CO2 (Ci) e produção de quantum do PS (photosystem) II.

[00210] Para a condutância dos estomas (gs), as medições de condutância da folha em estado estável pelo porômetro LI-1600 (LI-COR, Lincoln, NE) é utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Medições de transpiração da planta inteira

[00211] As taxas de transpiração e transpiração diária relativa (RDT | relative daily transpiration) da planta inteira são determinadas utilizando um sistema de pesagem de lisímetros em tela cheia, o que permite a medição de até 160 plantas instantaneamente. As plantas são plantadas em potes de 3,9L e cultivadas sob condições controladas. Cada pote é posicionado em uma célula de carga de compensação de temperatura com saída digital e é selado para evitar a evaporação da superfície do meio de cultivo. Um morrão vertical molhado de 0,15 m2 de fibras de algodão parcialmente submerge em um tanque de água de 1L que é posicionado em uma célula de carga similar e o usa como uma referência para as variações temporais na taxa de transpiração em potencial. A saída das células de carga é monitorada a cada 10 s e a média de leituras acima de 3 min é registrada em um registro de dados para análises posteriores. Os dados de saída incluem a transpiração da planta inteira, o peso da planta, intensidade de luz, déficit de pressão de vapor (VPD), temperatura, condutância dos estomas, eficiência do uso de água e parâmetros ambientais e fisiológicos adicionais. A taxa de transpiração da planta inteira é calculada por uma derivada numérica da saída da célula de carga seguindo um processo de suavização de dados. A taxa de transpiração diária da planta é normalizada ao peso da planta total e os dados para o morrão contíguo submerso e essas figuras têm sua média calculada para uma linha específica sobre todas as plantas (quantidade recolhida pelo morrão diário = 100%). A eficiência do uso de água é calculada do peso diário adicionado pela perda de água diária por cada planta. O RDT das plantas é monitorado sob diferentes condições de cultivo à nossa decisão: Irrigação normal, seca, tratamento com sal e mais. É possível trocar as condições de cultivo em uma base diária e para monitorar respostas da planta. Extração de RNA, geração de cDNA e análise quantitativa em tempo real de expressão de PCR (Com base em Goren 2011, Kandel-Kfir 2006)

[00212] Amostras de tecidos são congeladas e homogenizadas em nitrogênio líquido. O RNA é extraído utilizando o kit EZ-RNA (Biological Industries, Kibbutz Bet Haemek, Israel), com até 500 μl de tecido homogenizado congelado por tubo de extração. Pelo menos quatro extrações independentes são executadas para cada conjunto de tecidos. As extrações são executadas de acordo com o protocolo do fabricante, incluindo duas lavagens opcionais em 2 M LiCl. Os sedimentos de RNA são então suspensos em 25 μl de H2O tratado em DEPC e tratado com DNase (Ambion, Austin, Texas, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A presença de RNA é confirmada por eletroforese em gel e a degradação do DNA é confirmada pelo PCR. O RNA (<1μg) de cada amostra é então transcrito reversamente para cDNA utilizando MMLV RT (ProMega, Madison, WI, EUA) em uma reação de 25-μl, com primers aleatórios de 2 μl e primers misturados com poli-dT de 1μl (de 18 a 23 nt). Todas as amostras de cDNA são diluídas 1:8 em água tratada em DEPC.

[00213] As reações em tempo real são preparadas utilizando SYBR Green Mix (Eurogentec S.A., Seraing, Bélgica) em volumes de 10 μl com cDNA diluído em 4 μl por reação, duas replicações por amostra de cDNA. As reações são executadas em um RotorGene 6000 Cycler (Corbett, Mortlake, New South Wales, Australia), 40 ciclos por execução, com amostragem após cada ciclo. Após uma etapa inicial de pré-aquecimento a 95 °C por 15 min, existem 40 ciclos de amplificação consistindo de 10 s aos 95 °C, 15 s aos 55 °C, 10 s aos 60 °C e 20 s aos 72 °C. Os resultados são então interpretados utilizando- se o software RotorGene, duas duplicatas por amostra. Os dados são normalizados utilizando-se SlCyP como um gene de referência (ciclofilina - n° de adesão M55019). Cápsulas utilizadas para amplificação: SlCyP - CGTCGTGTTTGGACAAGTTG (SEQ ID N°: 1) e CCGCAGTCAGCAATAACCA (SEQ ID N°: 2). As cápsulas para SlHXKs (LeHXKs) são as seguintes: para SlHXK1- GACTTGCTGGGAGAGGAGT (SEQ ID N°: 3) e AAGGTACATTGAATGAGAGGCA (SEQ ID N°: 4); para SlHXK2- GTCCTCCCATCTTCCCTTG (SEQ ID N°: 5) e CCCAAGTACATACCAGAACAT (SEQ ID N°: 6); para SlHXK3- GCGATATTATCACCTCTCGTG (SEQ ID N°: 7) e CTGCTTCTCTCCGTCTTTAAA (SEQ ID N°: 8); e para SlHXK4- GCTGAGGACACCTGATATATG (SEQ ID N° : 9) e GATCGGATTTTACCCCAGCTA (SEQ ID N°: 10). Extração de Proteínas e análise da atividade de Hexoquinase

[00214] A extração de proteína das folhas de planta é executada com 1 a 2 g de tecido de planta homogenizada em 4 volumes de tampão de extração (50 mM de Hepes, pH 7,6, 1 mM de EDTA, 15 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 3 mM de ácido dietilditiocabâmico e, 0,2% de PVP). A mistura é centrifugada por 25 minutos a 16.000g aos 48 C, e o sobrenadante é trazido a 80% de saturação de sulfato de amônio. Após a centrifugação, os sedimentos são ressuspensos em 0,5 mL de tampão de lavagem (50 mM de Hepes, pH 7,5, 1 mM de EDTA, e 1 mM de DTT), dessalinizados em uma coluna G-25 Sephadex (55 x 11 mm), e utilizados como extrato de enzima crua para futuras análises enzimáticas.

[00215] A atividade de hexoquinase é medida pelos ensaios conectados às enzimas de acordo com Schaffer e Petreikov (1997). Os ensaios possuem um volume total de 1 mL de 30 mM de Hepes-NaOH, pH 7,5, 2 mM de MgCl2, 0,6 mM de EDTA, 9 mM de KCl, 1 mM de NAD, 1 mM de ATP, e 1 unidade de glucose-6-fosfato desidrogenase dependente de NAD (G6PDH do Leuconostoc mesenteroides; Sigma). Para ensaiar a fosforilação da glucose, a reação é iniciada com 2 mM de glucose. As reações são conduzidas a 37°C, e a absorção a 340 nm é monitorada de maneira contínua. (Para mais informações, consulte Dai et al. 1999, Schaffer e Petreikov, 1997). Monitoramento da produção de óxido nítrico nas células- guardas

[00216] A detecção de níveis de óxido nítrixo (NO) nos estomas é executado da seguinte maneira: As cascas epidérmicas são preparadas e incubadas em tampões de MES [25 mM de MES-KOH, pH = 6,15 e 10 mM de KCl (MES, ácido sulfônico 2-(N-morfolino)-etano; Sigma-Aldrich] com ou sem 20 mM de NAG, por 2,5 h sob luz estável, e então carregada com 60 μM de corante indicador em NO, DAF-2DA (4, diacetato de 5-diaminofluoresceína; Sigma-Aldrich), diluído em tampão MES com ou sem 20 mM de N-acetil glucosamina (NAG, Sigma-Aldrich) e mantidas por mais 50 min. Então, as cascas são lavadas com MES por 3 vezes e são reincubadas por 30 minutos no tampão (controle, configurado como 100% de fluorescência) ou em 100 mM sorbitol, 100 mM de sacarose e 20 mM de NAG. As cascas são então fotografadas sob um microscópio (consulte Materiais e Métodos, “Criação de imagens microscópicas confocais”). Três a quatro repetições biológicas contendo de 20 a 30 estomas cada são incluídas em cada experimento e cada experimento é repetido por diversas vezes. As imagens são analisadas utilizando a ferramenta histogram do software ImageJ para avaliar a intensidade de fluorescência e a ferramenta fit-ellipse para determinar a abertura dos estomas. É possível usar faixas epidérmicas de diferentes espécies, usar diferentes soluções de tratamento e diferentes sensos, tudo para nossa decisão. Criação de imagens microscópicas confocais

[00217] As imagens são obtidas utilizando o microscópio confocal invertido de escaneamento a laser OLYMPUS IX 81 (Japão) (FLUOVIEW 500) equipado com um laser de íons de argão de 488-nm e um 60X1,0 NA PlanApo objetivo de imersão em água. A fluorescência do óxido nítrico- DAF-2DA (4, diacetato de 5-diaminofluoresceína; Sigma-Aldrich) é agitada por uma luz de 488-nm e a emissão é coletada utilizando um filtro BA 505-525. O GFP é agitado por uma luz de 488-nm e a emissão é coletada utilizando um filtro BA 505-525. Um filtro de emissão BA 660 IF é utilizado para observar a autofluorescência de clorofila. As seções óticas confocais são obtidas de incrementos de 0,5-μm. As imagens são codificadas em cor verde para GFP e magenta para a autofluorescência de clorofila. Imagem térmica

[00218] A temperatura da folha é uma ferramenta confiável para determinar a variação de transpiração entre diferentes condições e diferentes espécies de plantas. As altas temperaturas são associadas com estomas fechados e baixa transpiração, enquanto as baixas temperaturas apontam para estomas abertos e alta transpiração. Para imagens térmicas, as folhas são captadas utilizando uma câmera térmica (ThermaCAM modelo SC655; FLIR Systems). As fotos são posteriormente analisadas utilizando o software ThermaCAM researcher pro 2.10. Os experimentos são repetidos por diversas vezes. Os dados são meios ± SE de cinco repetições biológicas por linha; quatro folhas são analisadas por planta. Uso do KST1 como um promotor específico às células-guarda

[00219] O canal de potássio KST1 nas batatas (Solanum tuberosum L.) têm sido exibidos para ser expressado especificamente nas células-guarda. Posteriormente, foi demonstrado pela atividade GUS e ensaio de coloração, que o segmento promotor KST1 pode ser utilizado para expressar genes exclusivamente em células- guardas.. Sabendo disso, as plantas de Arabidopsis e tomate transgênico foram geradas superexpressando a hexoquinase1 (KST::AtHXK1) ou GFP (proteína de fluorescência verde) (como um controle para expressão exclusiva) especificamente em células-guarda nos seguintes procedimentos: 1. Criação de vetor binário contendo uma inserção de cDNA AtHXK1 cDNA sob promotor KST1 após o finalizador. 2. Criação de vetor binário contendo uma inserção de gene GFP sob promotor KST1 após o finalizador. 3. Transformação da planta 4. Identificação das plantas contendo a peculiaridade KST1:AtHXK1. Criação de um vetor binário contendo uma inserção do AtHXK1 cDNA ou GFP sob o promotor KST1 seguido pelo finalizador.

[00220] O vetor binário pGreen0029 foi utilizado para transformação em plantas de tomate e Arabidopsis. O promotor KST1 estava ligado à montante da sequência de codificação AtHXK1 (isolada por ou GFP seguido por finalizador (Consulte as Figuras de 17A a 17B).

EXEMPLO 2 SACAROSE ESTIMULA O FECHAMENTO DOS ESTOMA

[00221] Para examinar o efeito de Suc nos estomas, pequenas folhas intactas de tomate do tipo selvagem (WT) foram imersas em soluções apoplásticas artificiais contendo ou 100 mM de Suc ou 100 mM de sorbitol, um açúcar não metabólico utilizado como um controle osmótico, e mediu-se a abertura dos estomas. A Suc diminuiu o tamanho da abertura dos estomas em 29% em comparação com o sorbitol (Figuras 1A, B). A sacarose é um dissacarídeo que deve ser clivado. Deve ser clivado por invertases da parede celular (apoplástica), glucose de produção (Glc) e frutose (Fru) em proporções iguais e resultando em osmolaridades extracelulares adicionais abordando 200 mOsm/L, quando comparado aos 100 mOsm/L da Suc original adicionada. Nós, portanto, comparamos os efeitos de 100 mM de sacarose, 100 mM de Glc + 100 mM de Fru e 200 mM de Glc ou Fru com o efeito de 200 mM de manitol, que foi utilizado como um controle osmótico adicional. Todas as combinações de açúcar diminuíram o tamanho das aberturas dos estomas, quando comparadas com o efeito de 200 mM de manitol (Figura 1C), apoiando uma função osmoticamente independente para açúcares na regulagem do fechamento dos estomas. EXEMPLO 3 SACAROSE ESTIMULA O FECHAMENTO DOS ESTOMAS VIA HEXOQUINASE [000229] A sacarose pode ser clivada ou por invertase apoplástica (extracelular) ou pode entrar nas células através de transportadores de sacarose e então ser clivada por enzimas intracelulares clivadoras de sacarose para produzir as hexoses Glc e o Fru. As hexoses Glc e Fru devem ser fosforiladas por enzimas fosforiladoras de hexose. Nas plantas, as hexoquinases (HXK) são as únicas enzimas que podem fosforilar Glc e podem também fosforilar Fru. As HXKs são as enzimas intracelulares conhecidas por cumprir ambos os papéis cinéticos e de sinalização de açúcar. Para examinar se a Suc estimula o fechamento dos estomas pelo HXK, o efeito da Suc foi testado na presença do N-acetil glucosamina (NAG), um inibidor eficiente da atividade do HXK. O NAG quase aboliu por completo o efeito da Suc e evitou o fechamento dos estomas, cumprindo uma função para o HXK na regulação do fechamento dos estomas (Figura 1B).

EXEMPLO 4 EXPRESSÃO AUMENTADA DE HXK MELHORA O FECHAMENTO DOS ESTOMAS

[00222] Para melhor explorar se o HXK media o fechamento dos estomas, o efeito da Suc foi examinado em plantas de tomate transgênico bem- caracterizadas expressando o Arabidopsis HXK1 (AtHXK1) sob o controle do promotor global não específico 35S. A abertura dos estomas das plantas que expressam AtHXK1 (a linha HK4, que já possui um nível de atividade que é 5 vezes maior do que o das plantas WT) foi reduzida em 21% em relação às plantas de controle mesmo em condições de controle (100 mM de sorbitol) (Figura 1B), indicando que a expressão aumentada de HXK induz o fechamento dos estomas. A adição de Suc fez com que o estoma se feche ainda mais (Figura 1B) e o inibidor de HXK, NAG, venha a abolir o efeito de fechamento de Suc, suportando ainda uma função para HXK na regulagem do fechamento do estoma (Figura 1B).

EXEMPLO 5 CORRELAÇÃO DIRETA ENTRE A ATIVIDADE HXK, FECHAMENTO DE ESTOMAS E TRANSPIRAÇÃO REDUZIDA

[00223] Para examinar o efeito de HXK nos estomas de tomate, as aberturas dos estomas e a condutância das linhas de tomate expressando níveis crescentes de AtHXK1 foram medidos. (As linhas HK37, HK4 e HK38 possuem níveis de atividade HXK que são 2, 5 e 6 vezes maiores que o das plantas WT, respectivamente) . As densidades dos estomas das linhas expressando AtHXK1são similares aos das plantas WT (Tabela S1), ainda que tanto a abertura como a condutância dos estomas foram significativamente reduzidas, em correlação direta com o nível de expressão de AtHXK1 (Figuras 2A, 2B). Além disso, a medição contínua da transpiração no decorrer do dia revelou que o AtHXK1 baixou a taxa de transpiração por unidade de área da folha nas linhas expressando AtHXK1, em correlação com o nível de expressão AtHXK1 (Figura 2C), de maneira que a transpiração cumulativa diária relativa da planta inteira por unidade da área da folha (RDT) foi claramente uma correlação negativa com a atividade HXK (Figura 2D).

[00224] Para descartar a possibilidade de que a diminuição observada na transpiração foi o resultado dos efeitos inibitórios do AtHXK1 na captação de água da raiz ou transporte de água do caule, experimentos recíprocos com enxertos foram executados. Brotos de HK4 foram enxertados nas raízes WT e os brotos WT foram enxertados em raízes de HK4 (Figura 3A). As medições contínuas das taxas de transpiração e transpiração cumulativa diária relativa da planta inteira por unidade da área da folha das plantas enxertadas indicaram que a diminuição na transpiração foi geralmente associada aos brotos de HK4, com as raízes tendo menor influência (Figuras 3B, 3C). Para melhor examinar o efeito dos caules de HK4 na transpiração, as plantas triplamente enxertadas foram geradas nas quais o enxerto intermediário HK4 substituiu uma porção do caule das plantas WT (Figura 3D). O enxerto intermediário HK4 não fez efeito na RDT (Figura 3E), indicando que a transpiração diminuída das plantas expressando AtHXK1 foi o resultado da transpiração reduzida pelas folhas e não redução de captação de água pelas raízes ou transporte atenuado pelo caule. O efeito do AtHXK1 na transpiração das folhas indica, ainda, que a HXK controla o comportamento dos estomas que afetam a transpiração de plantas inteiras intactas.

EXEMPLO 6 SUPRESSÃO DA HXK INIBE O FECHAMENTO DOS ESTOMAS

[00225] A função da HXK no fechamento dos estomas foi examinada utilizando, ainda, plantas de tomate e Arabidopsis com supressão antissentido e mutantes inativos de HXK, respectivamente. Quatro HXKs são conhecidas em plantas de tomate, três das quais (LeHXK1, 2 e 3) são associadas a mitocôndrias HXKs similares ao sensor de açúcar AtHXK1. Diferentemente do fechamento dos estomas observado em plantas de tomate expressando um alto nível de AtHXK1 (Figuras 2A, B), o fechamento de estomas em linhas de tomate (αHK1 e αHK2) com supressão antissentido de LeHXK1, 2 e 3 (Figura 4A) foi reduzido em resposta aos tratamentos da Suc (Figura 4B). De maneira similar, o mutante inativo de Arabidopsis AtHXK1- gin2-1 teve maior condutância nos estomas e uma maior taxa de transpiração, quando comparado com plantas controladas e de tipo selvagem (Figuras 8E, F), apoiando a hipótese que o HXK executa uma função importante na regulagem do fechamento dos estomas.

EXEMPLO 7 HXK media o fechamento dos estomas independentemente do metabolismo à jusante dos açúcares fosforilados

[00226] Para examinar se o metabolismo à jusante dos açúcares fosforilados é requerido para o fechamento dos estomas, os efeitos da manose (um epímero de glucose no segundo átomo de carbono) e 2- deoxiglicose (2- dG - um análogo de glucose) foram testados. Ambos os açúcares são fosforilados pela HXK, mas 2-dG não é posteriormente metabolizado e a manose é insuficientemente metabolizada. Tanto a manose quanto 2-dG reduziram a abertura dos estomas (Figura 5). Uma menor concentração de manose (10 mM) também reduziu a abertura dos estomas em mais de 100 mM glucose (Figura 5), em linha com as observações anteriores que a manose é mais potente do que a glucose no que diz respeito aos efeitos do açúcar mediados pelo HXK. Além disso, o efeito de fechamento de 10 mM de manose futuramente apoiará uma função osmótica independente dos açúcares na simulação do fechamento dos estomas. Os resultados com a manose e com 2-dG sugerem que a HKX estimula o fechamento dos estomas independente do metabolismo à jusante dos açúcares fosforilados.

EXEMPLO 8 SACAROSE ESTIMULA UM CAMINHO SINALIZADO PELA ABA NAS CÉLULAS-GUARDA

[00227] Já foi demonstrado anteriormente que os efeitos de sinalização de açúcar da HXK, tal como a inibição da fotossíntese e do crescimento, são mediados pelo ácido abscísico (ABA) [para uma revisão atualizada, consulte ], um fitohormônio bem conhecido que também induz o fechamento dos estomas. Portanto, foi especulado que a Suc possa modular a abertura das células- guardas através do HXK e ABA dentro das células-guarda. A sinalização de ABA nas células-guarda é mediada pela produção rápida de óxido nítrico (NO), que é exigido para o fechamento dos estomas induzidos por ABA e serve como indicador dos estímulos para fechamento dos estomas. Para examinar o efeito da Suc no caminho sinalizado pela ABA nas células- guarda, os níveis de NO foram monitorados dentro das células-guarda em resposta às aplicações da Suc. As cascas epidérmicas foram incubadas com Suc e monitoradas utilizando o corante indicador fluorescente de NO diacetato de diaminofluoresceína (DAF-2DA). As aplicações de 100 mM de sorbitol não fizeram efeitos nos níveis de NO nas células- guardas (Figura 6A). Porém, a aplicação de 100 mM de Suc resultou em um aumento de 3,5 vezes na fluorescência das células-guarda, indicando um aumento rápido nos níveis de NO, que foi correlacionado ao fechamento dos estomas (Figura 6a). As células-guarda de cascas epidérmicas de HK4 não tratadas (linha expressando AtHXK1) exibiram altos níveis de NO, similar àqueles das cascas epidérmicas WT tratadas a Suc (Figura 6B), e a adição de Suc nas epidermes descascadas de HK4 levam a uma fluorescência ainda mais intensa (Figura 6B).

[00228] Para melhor examinar o envolvimento do HXK na produção de NO em células-guarda, o inibidor de HXK, NAG, foi utilizado com cascas epidérmicas. O NAG não apenas inibiu o efeito da Suc e bloqueou o fechamento dos estomas (Figura 1B), mas também preveniu a produção de NO (Figura 6C). Lavar o NAG com 100 mM de Suc levou ao recomeço da produção de NO dentro de menos de 30 min (Figuras 6D, E). Esses resultados sugerem que a Suc extrai uma resposta de NO específica às células-guarda através do HXK.

[00229] Para verificar se o ABA é realmente requerido para a resposta dos estomas de NO para Suc, os mesmos experimentos foram conduzidos com um tomate mutante deficiente de ABA chamado Sitiens, onde os estomas estão sempre abertos. Diferente do que foi observado para as plantas WT, tratar as cascas epidérmicas de Sitiens com 100 mM de Suc não resultou em nenhum aumento de fluorescência ou fechamento de estomas, indicando que não houve produção de NO (Figura 6F). Porém, tratar as cascas de Sitiens com ABA fornecido externamente disparou a produção de NO (Figura 6F) e o fechamento dos estomas. Essas descobertas indicam que as células-guarda de Sitiens retêm sua capacidade de responder ao ABA fornecido externamente ao produzir NO e que apenas a ausência da produção de ABA no mutante Sitiens evita a produção de NO iniciada pela Suc e o fechamento dos estomas. Essa observação confirma que os estomas de Sitiens não respondem à Suc devido à deficiência de ABA desse mutante e que o ABA é um mediador vital na responsa de estomas à Suc.

EXEMPLO 9 EXPRESSÃO ESPECÍFICA ÀS CÉLULAS-GUARDA DE ATHXK1 INDUZ O FECHAMENTO DOS ESTOMAS E REDUZ A TRANSPIRAÇÃO DO TOMATE E PLANTAS ARABIDOPSIS.

[00230] Para examinar a função da HXK especificamente nas células- guarda, as plantas de tomate e Arabidopsis foram geradas que expressam AtHXK1 sob o promotor específico às células-guarda KST1. A expressão específica do promotor KST1 nas células-guarda de tomate e Arabidopsis foi verificada pela expressão da GFP sob o promotor KST1 (linhas GCGFP, Figuras 7A a E). A expressão do promotor KST1 foi específica às células- guarda em todos os órgãos examinados da planta e não foi detectado nos órgãos que não possuem estomas, tal como as raízes (Figura 7E). A expressão específica às células-guarda foi registrada de desenvolvimentos precoces das plântulas, assim como observado nos hipocótilos das plântulas (Figura 7D), através das fases nas quais as folhas são completamente expandidas (Figuras 7A a 7C).

[00231] Diferente da expressão de AtHXK1 sob o promotor 35S , a expressão de AtHXK1 sob o promotor KST1 específico às células-guarda (linhas GCHXK) quase não teve nenhum efeito de crescimento negativo (Figuras 8A, D). Ainda assim, a expressão de AtHXK1 sob o promotor KST1 reduziu tanto a condutância quanto a transpiração dos estomas no tomate e nas plantas Arabidopsis (Figuras 8B, C, E, F). Esses resultados suportam seguramente a função hipotética específica da HXK nas células-guarda, regulando o fechamento dos estomas.

EXEMPLO 10 EXPRESSÃO GFP SOB O CONTROLE DO PROMOTOR FBPASE É ESPECÍFICO ÀS CÉLULAS DE MESOFILOS

[00232] Para discriminar entre os efeitos da HXK nas células-guarda versus as células de mesofilos, os presentes inventores criaram plantas transgênicas de tomate e Arabidopsis expressando HXK sob um promotor de mesofilos FBPase (Peleg et al., 2007). A expressão específica do promotor FBPase foi demonstrada com plantas transgênicas de tomate e Arabidopsis expressando GFP sob controle desse promotor (designado MCGFP, Figura 9). Diversas linhas de Arabidopsis e tomate homozigotas independentes com alta expressão de FBPase: AtHXK1 (denominadas plantas MCHXK) foram identificadas.

EXEMPLO 11 EXPRESSÃO ELEVADA DE HEXOQUINASE EM CÉLULAS-GUARDA REDUZ A TRANSPIRAÇÃO DA PLANTA INTEIRA E AUMENTA A EFICIÊNCIA DO USO DA ÁGUA, COMO DETERMINADO UTILIZANDO SISTEMA DE ANÁLISE DE TROCA DE GÁS

[00233] Utilizando o sistema de troca de gás LI-COR, os presentes inventores analisaram 10 linhas independentes GCHXK e descobriram um impressionante aumento na eficiência do uso da água naquelas plantas (Figuras 10A a D). Nossos dados exibem claramente que enquanto a fotossíntese se manteve inalterada (Figura 10C), a condutância (indicando a abertura dos estomas, Figura 10B) e a transpiração (Figura 10A) dos estomas foi reduzida em 20% e 15% respectivamente, melhorando assim a eficiência do uso de água de 1,36 WT para 1,78 em linhas GCHXK (Figura 10D).

EXEMPLO 12 EXPRESSÃO ELEVADA DE HEXOQUINASE EM CÉLULAS-GUARDA REDUZ A TRANSPIRAÇÃO DA PLANTA INTEIRA E AUMENTA A EFICIÊNCIA DO USO DA ÁGUA, COMO DETERMINADO UTILIZANDO SISTEMA DE BALANÇAS DO LISÍMETRO

[00234] Para avaliar a eficiência do uso de água nas plantas GCHXK os presentes inventores utilizaram o preciso e sensível sistema de balanças do lisímetro, que mede o acúmulo de peso da planta e a perda de água da planta total durante os experimentos duradouros, e pode monitorar mais que 160 plantas simultaneamente sob variados tratamentos de irrigação (Figuras 11A a C). Duas linhas transgênicas GCHXK independentes (que exibiram uma alta WUE quando medidas pelo LI-COR (Figuras A a D 10)) foram analisadas. Os presentes inventores descobriram que a transpiração relativa diária daquelas linhas foi inferior a WT durante todo o experimento (20 dias) (Figuras 11 A a C). O acúmulo de peso e crescimento da planta não foi afetado. Como resultado, houve um aumento de aproximadamente 20% a 30% na WUE das linhas GCHXK em comparação com as plantas WT.

EXEMPLO 13 EXPRESSÃO ELEVADA DE HEXOQUINASE EM CÉLULAS-GUARDA REDUZ A TAXA DE TRANSPIRAÇÃO E CONDUTÂNCIA DE ESTOMAS DA PLANTA INTEIRA, SEM NENHUM EFEITO NEGATIVO NO CULTIVO, MELHORANDO ASSIM A EFICIÊNCIA DO USO DE ÁGUA.

[00235] Utilizando o sistema de balanças do lisímetro pudemos analisar, ainda, que a economia de água e WUE nas plantas GCHXK, que exibiram uma alta WUE quando medidas pelo LI-COR (Figuras 10A a D) e pelo lisímetro (Figuras 11A a C). Diversos parâmetros foram monitorados. Parâmetros para perda d'água: taxa de transpiração, condutância dos estomas (gs); parâmetros para crescimento: peso da planta total, área de folha da planta total e parâmetros ambientais: intensidade da luz, déficit de pressão de vapor (VPD). Descobriu-se que, durante o dia, as taxas de transpiração que se normalizaram à área de folha total foram correlacionadas com as mudanças ambientais (intensidade de luz e VPD, Figuras 12E e 12F, respectivamente). As taxas de transpiração das plantas GCHXK foram significativamente inferiores quando comparadas àquelas WT no decorrer do dia (Figura 12A). Consequentemente, a condutância dos estomas foi descoberta estar reduzida também (Figura 12B) provando que nas plantas GCHXK, a água é economizada e os estomas são mais fechados. Além disso, ao medir a área total e o peso da folha da planta (Figuras 12C e 12D, respectivamente), os presentes inventores descobriram que mesmo com as plantas consumindo menos água (Figura 12A), o crescimento não foi prejudicado, e foi até mesmo melhorado como no caso da linha GCHXK 12. Economizar água sem afetar o crescimento da planta melhora toda a eficiência de uso de água da planta inteira.

EXEMPLO 14 EXPRESSÃO ELEVADA DE HEXOQUINASE EM CÉLULAS-GUARDA MELHORA A TOLERÂNCIA À SECA

[00236] Para monitorar o comportamento das plantas sob condições de estresse, o sistema de balanças do lisímetro foi utilizado. Após a interrupção completa da irrigação, as plantas foram expostas a estresse de seca, o que gradualmente aumentou a cada dia durante o experimento. As taxas de transpiração das plantas WT e GCHXK foram analisadas por nove dias consecutivos (Figura 13). Durante os 3 primeiros dias, as plantas GCHXK transpiraram menos que as WT, alinhadas com o comportamento em condições normais (Figuras 11A a C; 12A a F), indicando que o estresse foi apenas moderado naquele momento. Porém, nos dias que seguiram (4 e 5), uma transição entre as taxas de transpiração de WT e GCHXK foi observada (Figura 13, *) e a transpiração das WTs caiu abruptamente em comparação com as GCHXKs, indicando que as plantas WT são mais sensíveis à seca. Como visto em estresse moderado (dias 5 e 6) assim como em condições de estresse grave (dias 7 e 8), a transpiração das GCHXK é menos sensível à limitação de água quando comparadas com as WT, exibindo menos declínio em transpiração no decorrer do experimento. Esses resultados indicam que as plantas GCHXK possuem melhor tolerância à escassez de água e que sob condições de estresse brandas, essas plantas podem ainda funcionar normalmente. A tolerância à seca foi também detectada durante a monitoração da transpiração diária relativa (RDT) das plantas WT e GCHXK sob condições de seca (Figura 11A). Durante a alteração de condições de irrigadas para seca (Figura 11A, dias 10 e 11, ampliada), uma redução abrupta na transpiração foi observada nas plantas WT (seta vermelha). Porém, a transpiração das GCHXK foi afetada apenas moderadamente quando expostas à seca (seta verde), indicando que essas plantas possuem melhor tolerância à seca.

EXEMPLO 15 EXPRESSÃO ELEVADA DE HEXOQUINASE EM CÉLULAS-GUARDA MELHORA A PRODUÇÃO

[00237] Para examinar o efeito da GCHXK em produção, a quantidade de frutos das plantas GCHXK foi monitorada. Nenhuma das linhas exibidas reduziu a produção, mesmo com a descoberta que a transpiração dessas linhas foi menor (Figuras 10 a 12). Ao contrário, nas poucas linhas o número da fruta foi ainda maior do que o controle (Figuras 14 A a B).

EXEMPLO 16 EXPRESSÃO ELEVADA DE HEXOQUINASE EM CÉLULAS-GUARDA MELHORA A PRODUÇÃO SOB CONDIÇÕES LIMITADAS DE FORNECIMENTO D'ÁGUA

[00238] Para um ensaio de produção mais amplo, as plantas foram cultivadas em uma estufa semicomercial controlada sob quatro diferentes regimes de estresse de irrigação de água. As plantas foram irrigadas ou em 25% acima da quantidade recomendada de irrigação (125%), na irrigação recomendada (100%) e com irrigação deficiente (regimes de 75% e 50% de irrigação, Figura 15A). Os frutos foram coletados e os números cumulativos dos frutos e o peso total dos frutos de cada planta foram documentados (Figuras 15 B a C). Como claramente visto, GCHXK na produção foi dramático. Em comparação com WT, as plantas GCHXK tiveram uma produção significativamente superior (em número de frutos e peso total dos frutos sob todos os regimes de irrigação. Ainda assim, a irrigação deficiente não alterou o número de frutos por planta, mas reduziu o peso dos frutos. Curiosamente, o peso do fruto GCHXK sob condições extremamente estressantes (50% de irrigação) foi maior do que as plantas controladas com 100% de irrigação. As plantas GCHXK possuem também uma melhor tolerância à limitação da água. Ao baixar a irrigação de 100% para 75%, o peso dos frutos das plantas GCHXK foi reduzido em apenas 16% enquanto o das plantas controladas WT foi reduzido em 39%. Portanto, além de uma melhor produção sob condições de irrigação normais (100%) (Figuras 14A a B e Figura 15B), as plantas GCHXK também possuem melhor tolerância (maior produção) a um fornecimento limitado de água. Junto com os resultados de transpiração (Figura 13), esses resultados indicam que uma expressão específica de HXK nas células-guarda economiza água, aumenta a eficiência do uso de água e melhora a produção, não apenas sob condições normais, mas também sob condições de seca.

EXEMPLO 17 EXPRESSÃO ELEVADA DE HEXOQUINASE EM CÉLULAS-GUARDA REDUZ A TRANSPIRAÇÃO NA PLANTA INTEIRA, INDUZ O FECHAMENTO DOS ESTOMAS E AUMENTA A EFICIÊNCIA DO USO DA ÁGUA NAS ARABIDOPSIS

[00239] As imagens térmicas e análises de troca de gases foram utilizadas para determinar a abertura dos estomas, a transpiração e a WUE em plantas Arabidopsis expressando HXK específico às células-guarda (GCHXK, Figuras 16 A a F). Os presentes inventores descobriram que nas plantas GCHXK, a condutância e transpiração dos estomas (Figuras 16 A e B respectivamente, Figura 8E a F) são significativamente reduzidos quando comparados com as WT. Adicionalmente, ao utilizar a técnica de imagens térmicas, foi descoberto que a temperatura da folha das plantas GCHXK é maior que as WT, o que indica que os estomas ficam mais fechados (Figura 16F). Além disso, enquanto a transpiração é reduzida, as taxas de fotossíntese (Figuras 16C), assim como a condutância de mesofilos ao CO2 (gm, Figura 16D) não foi afetada. Além disso, o crescimento também não foi afetado (Figura 8D). No geral, as plantas GCHXK possuem maior eficiência do uso de água (Figura 16E). Esses resultados demonstram que a mesma inserção transgênica de hexoquinase sob o promotor específico às células- guarda utilizado no caso do Tomate (família Solanaceae) é aplicada universalmente enquanto afeta os estomas e aumenta também a eficiência do uso de água no caso das Arabidopsis (família Brassicaceae), e que essa técnica pode ser implementada também em outras espécies.

[00240] Apesar de o pedido de patente de invenção ser descrito em conjunto com aplicações específicas respectivas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações podem ser aparentes àqueles especialistas na técnica. Consequentemente, é projetado para que atenda todas as tais alternativas, modificações e variações que caiam dentro do espírito e amplo escopo das reivindicações anexas.

[00241] Todas as publicações, patentes e pedidos de patentes mencionadas nessa especificação são aqui incorporadas em sua integridade por referência na especificação, à mesma extensão como se cada publicação individual, patente ou pedidos de patente fossem especifica e individualmente indicados para serem aqui incorporados por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência nesse pedido não deve ser interpretada com uma admissão de que tal referência está disponível como técnica prévia ao presente pedido de patente de invenção. Na medida em que os cabeçalhos das seções forem utilizados, eles não devem ser interpretados necessariamente como limitação.

Claims

1. Estrutura de expressão de planta, caracterizada pelo fato de compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica uma hexoquinase tipo B, em que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 39, 41, 43 e 45 ou uma sequência degenerada das mesmas codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 40, 42, 44 e 46 e em que a referida sequência de ácido nucleico está sob um controle transcricional de um elemento regulador de ação cis específico de células-guarda selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 e 108.

2. Estrutura de expressão de planta, caracterizado pelo fato de compreender uma sequência de ácido nucleico que codifica um agente de ácido nucleico para silenciar a expressão de uma hexoquinase tipo B codificado por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 39, 41, 43 e 45 ou uma sequência degenerada das mesmas codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 40, 42, 44 e 46, em que a expressão do referido agente de ácido nucleico está sob o controle transcricional de um elemento regulador de ação cis específico de células-guarda selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 e 108.

3. Estrutura de expressão de planta de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de o referido promotor específico de células- guarda ser um promotor KST1 estabelecido na SEQ ID NO: 108.

4. Método para regular a condutância de estomas de planta, o método caracterizado pelo fato de compreender modular na planta o nível e/ou atividade de uma hexoquinase em uma maneira específica na célula-guarda, em que a referida hexoquinase é uma hexoquinase tipo B capaz de regular condutância de estomas, regulando, dessa forma, a condutância da planta, em que a referida hexoquinase tipo B é codificada por uma sequência de ácido nucleico selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 11, 13, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 39, 41, 43 e 45 ou uma sequência degenerada das mesmas codificando um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO: 12, 14, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 40, 42, 44 e 46.

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de a referida modulação ser regulada de forma ascendente.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de a referida regulação ascendente ser efetuada ao introduzir a estrutura de expressão de planta conforme definida na reivindicação 1 na planta.

7. Método para diminuir a condutância dos estomas da planta, o método caracterizado pelo fato de compreender introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de expressão de planta conforme definida na reivindicação 1, em que a referida hexoquinase é uma hexoquinase tipo B capaz de regular condutância de estomas, diminuindo, dessa forma, a condutância dos estomas da planta.

8. Método para aumentar a eficiência no uso de água de uma planta, o método caracterizado pelo fato de compreender introduzir em uma célula da planta a estrutura de expressão de planta conforme definida na reivindicação 1, em que a referida hexoquinase é uma hexoquinase tipo B capaz de regular condutância de estomas, aumentando, dessa forma, a eficiência no uso de água da planta.

9. Método para aumentar a tolerância de uma planta à seca, salinidade ou estresse à temperatura, o método caracterizado pelo fato de compreender introduzir em uma célula de uma planta a estrutura de expressão de planta conforme deinida na reivindicação 1, em que a referida hexoquinase é uma hexoquinase tipo B capaz de regular condutância de estomas, aumentando, dessa forma, a tolerância da planta à seca, salinidade ou estresse à temperatura.

10. Método para aumentar a biomassa, vigor ou produção de uma planta, o método caracterizado pelo fato de compreender introduzir em uma célula da planta a estrutura de expressão de planta conforme definida na reivindicação 1, aumentando, dessa forma, a biomassa, vigor ou produção da planta.