ES2674256T3 - Polinucleótidos y polipéptidos aislados y métodos de uso de los mismos para aumentar el rendimiento de la planta - Google Patents

Polinucleótidos y polipéptidos aislados y métodos de uso de los mismos para aumentar el rendimiento de la planta Download PDF

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Abstract

Un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento de semillas, el ritmo de crecimiento y/o la biomasa de una planta en comparación con una planta nativa, que comprende expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:68, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento de semillas, el ritmo de crecimiento y/o la biomasa de la planta en comparación con la planta nativa.

Description

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DESCRIPCION
Polinucleótidos y polipéptidos aislados y métodos de uso de los mismos para aumentar el rendimiento de la planta Campo y antecedentes de la invención
La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a polipéptidos, polinucleótidos que los codifican, plantas transgénicas que expresan lo mismo y métodos de producción y uso de los mismos y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos para aumentar el rendimiento de la planta, el rendimiento de aceite, el rendimiento de semillas, la biomasa, el ritmo de crecimiento, el vigor, el contenido de aceite, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno.
Las condiciones de estrés abiótico tales como salinidad, sequía, inundaciones, temperatura subóptima y contaminación química tóxica, causan daños sustanciales a las plantas agrícolas. La mayoría de las plantas han desarrollado estrategias para protegerse contra estas condiciones. Sin embargo, si la gravedad y la duración de las condiciones de estrés son demasiado grandes, los efectos sobre el desarrollo, el crecimiento y el rendimiento de la planta de la mayoría de las plantas de cultivo son profundos. Además, la mayoría de las plantas de cultivo son altamente susceptibles al estrés abiótico (ABS) y, por lo tanto, necesitan condiciones de crecimiento óptimas para los rendimientos de cultivos comerciales. La exposición continua al estrés causa alteraciones importantes en el metabolismo de la planta, lo que finalmente causa la muerte celular y en consecuencia pérdidas de rendimiento.
La escasez mundial de suministro de agua es uno de los problemas agrícolas más graves que afectan el crecimiento de las plantas y al rendimiento de los cultivos, y se realizan esfuerzos para mitigar los efectos nocivos de la desertización y la salinización de las tierras cultivables del mundo. Por lo tanto, las compañías de Agbiotech intentan crear nuevas variedades de cultivos que sean tolerantes a diferentes estreses abióticos, centrándose principalmente en el desarrollo de nuevas variedades que puedan tolerar la escasez de agua durante períodos más largos.
Los nutrientes subóptimos (macro y micronutrientes) afectan al crecimiento y al desarrollo de la planta a lo largo de todo el ciclo de vida de la planta. Uno de los macronutrientes esenciales para la planta es el nitrógeno. El nitrógeno es responsable de la biosíntesis de aminoácidos y ácidos nucleicos, grupos prostéticos, hormonas vegetales, defensas químicas de las plantas y similares. El nitrógeno es a menudo el elemento limitante del ritmo del crecimiento de las plantas y todos los cultivos de campo tienen una dependencia fundamental del fertilizante nitrogenado inorgánico. Dado que los fertilizantes se agotan rápidamente en la mayoría de los tipos de suelo, se deben suministrar a cultivos en crecimiento dos o tres veces durante la temporada de crecimiento. Macronutrientes importantes adicionales son fósforo (P) y potasio (K), que tienen una correlación directa con el rendimiento y la tolerancia general de la planta.
Los aceites vegetales o de semillas son la principal fuente de energía y nutrición en la dieta humana y animal. También se usan para la producción de productos industriales, tales como pinturas, tintas y lubricantes. Además, los aceites vegetales representan fuentes renovables de hidrocarburos de cadena larga que pueden usarse como combustible. Dado que los combustibles fósiles usados actualmente son recursos finitos y se están agotando gradualmente, los cultivos de biomasa de crecimiento rápido pueden usarse como combustibles alternativos o como materias primas energéticas y pueden reducir la dependencia de los suministros de energía fósil. Sin embargo, el principal obstáculo para aumentar el consumo de aceites vegetales como biocombustible es el precio del aceite, que sigue siendo más alto que el del combustible fósil [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) eia (.) doe (.) gov/oiaf/analysispaper/biodiesel/; Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) njbiz (.)com/weekly_article.asp?aID=19755147 (.) 6122555 (.) 957931 (.) 7393254 (.) 4337383 (.) 561&aID2=73678]. Además, la tasa de producción de aceite vegetal está limitada por la disponibilidad de tierras agrícolas y agua. Por lo tanto, aumentar los rendimientos de aceite vegetal de la misma área de cultivo puede superar eficazmente la escasez en el espacio de producción y puede disminuir los precios del aceite vegetal al mismo tiempo.
Los estudios que apuntan a aumentar los rendimientos de aceite vegetal se centran en la identificación de genes implicados en el metabolismo del aceite, así como en genes capaces de aumentar los rendimientos de plantas y de semillas en plantas transgénicas.
Los genes que se sabe que están implicados en el aumento del rendimiento de aceite vegetal incluyen aquellos que participan en la síntesis de ácidos grasos o secuestrantes tales como desaturasa [p. ej., DELTA6, DELTA12 o acil- ACP (Ssi2; Arabidopsis Information Resource (TAIR; Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) arabidopsis (.) org/), TAIR No. AT2G43710)], OleosinA (TAIR No. AT3G01570) o FAD3 (TAIR No. AT2G29980), y diversos factores de transcripción y activadores tales como Lec1 [TAIR No. AT1G21970,Lotan et al. 1998. Cell. 26; 93(7): 1195-205], Lec2 [TAIR No. AT1G28300, Santos Mendoza et al. 2005, FEBS Lett. 579(21): 4666-70], Fus3 (TAIR No. AT3G26790), ABI3 [TAIR No. AT3G24650, Lara et al. 2003. J Biol Chem. 278(23): 21003-11] y Wri1 [TAIR No. AT3G54320, Cernac y Benning, 2004. Plant J. 40(4): 575-85].
Zabrouskov V., et al., 2002 (Physiol Plant. 116: 172-185) describen un aumento en la fracción lipídica total mediante la regulación positiva de las desaturasas de ácidos grasos del retículo endoplásmico (FAD3) y plastídicos (FAD7) en la patata.
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Wang HW et al., 2007 (Plant J. 52: 716-29. publicación on line 2007 septiembre 18) describen un aumento en el contenido de ácidos grasos y lípidos totales en semillas de plantas al sobreexpresar los factores de transcripción GmDof4 y GmDof11.
Vigeolas H, et al. [Plant Biotechnol J. 2007, 5(3): 431-41] ysolicitud de patente de Estados Unidos No. 20060168684describe un aumento en el contenido de aceite de semilla en colza de semilla oleaginosa (Brassica napus L.) mediante la sobreexpresión de una glicerol-3-fosfato deshidrogenasa de levadura bajo el control de un promotor específico de semilla.
Katavic V, et al., 2000 (Biochem Soc Trans. 28:935-7) describen el uso de los genes FAE1 de Arabidopsis y SLC1-1 de levadura para mejoras en el contenido de ácido erúcico y aceite en colza.
La solicitud de patente de Estados Unidos No. 20080076179describe un ácido nucleico de musgo aislado que codifica una proteína del metabolismo de lípidos (LMP) y plantas transgénicas que lo expresan con niveles de lípidos aumentados.
La solicitud de patente de Estados Unidos No. 20060206961describe un método de aumento del contenido de aceite en plantas (p. ej., en semillas de plantas), expresando en la planta el polipéptido Ypr140w.
La solicitud de patente de Estados Unidos No. 20060174373describe un método de aumento del contenido de aceite en plantas, expresando un ácido nucleico que codifica una proteína potenciadora (TEP) de la síntesis de triacilgliceroles (TAG) en la planta.
Las solicitudes de patente de Estados Unidos No. 20070169219,20070006345,20070006346y20060195943, describen plantas transgénicas con una eficiencia de uso de nitrógeno mejorada que puede usarse para la conversión en combustible o materias primas químicas.
El documento WO2004/104162enseña secuencias de polinucleótidos y métodos de utilización de las mismas para aumentar la tolerancia de una planta a estreses abióticos y/o aumentar la biomasa de una planta.
El documento WO2007/020638enseña secuencias de polinucleótidos y métodos de utilización de las mismas para aumentar la tolerancia de una planta a estreses abióticos y/o aumentar la biomasa, el vigor y/o el rendimiento de una planta.
El documento WO2008/122890enseña secuencias de polinucleótidos y métodos de utilización de las mismas para aumentar el contenido de aceite, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el rendimiento y/o el vigor de una planta.
El documento US2007214517describe moléculas de ADN que constituyen fragmentos del genoma de una planta, y polipéptidos codificados por ellas. Las moléculas de ADN son útiles para especificar un producto génico en células, ya sea como un promotor o como una secuencia codificante de proteínas o como una UTR o como una secuencia de terminación 3', y también son útiles para controlar el comportamiento de un gen en el cromosoma, para controlar la expresión de un gen o como herramientas para el mapeo genético, el reconocimiento o aislamiento de fragmentos de ADN idénticos o relacionados, o la identificación de un organismo individual en particular, o para la agrupación de un grupo de organismos con un rasgo común. Este documento describe 81.981 secuencias de proteínas y 30.066 secuencias de ácidos nucleicos en el listado de secuencias, y una lista de genes y proteínas depositados sin orientación con respecto al uso de cada una de las secuencias,
Es contra los antecedentes, y las limitaciones y problemas asociados con ellos, que se ha desarrollado la presente invención.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a una serie de mejoras en polipéptidos, polinucleótidos que los codifican, plantas transgénicas que expresan lo mismo y métodos para aumentar el rendimiento de la planta, el rendimiento de aceite, el rendimiento de semillas, la biomasa, el ritmo de crecimiento, el vigor, el contenido de aceite, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno.
Para conseguir esto, el método de la invención comprende las características reivindicadas en la reivindicación 1. Según la presente invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento de semillas, el ritmo de crecimiento y/o la biomasa de una planta en comparación con una planta nativa, que comprende expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:68, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento de semillas, el ritmo de crecimiento y/o la biomasa de la planta en comparación con la planta nativa.
En las reivindicaciones dependientes se reivindican realizaciones ventajosas de la invención.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la
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eficiencia de uso de nitrógeno de una planta, que comprende expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80 % idéntica a las SEQ ID nO:18, 1-16, 19-50, 101378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea la expuesta mediante la SEQ ID NO:756 o 762, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de la planta.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta, que comprende expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno que comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las sEq ID NO:18, 1-16, 1950, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 y 763, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de la planta.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta, que comprende transformar la planta con un polinucleótido exógeno capaz de regular negativamente el nivel de expresión de una secuencia de ácido nucleico al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO:17 o 673, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de la planta.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia del uso del nitrógeno de una planta, que comprende transformar la planta con un polinucleótido exógeno capaz de regular negativamente el nivel de expresión de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID nO:17 o 673, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de la planta.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de producción de aceite, que comprende: (a) proporcionar la planta según el método de la invención; y (b) extraer el aceite de la planta; produciendo de este modo el aceite.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80 % idéntica a las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea tal como se expone mediante la SEQ ID NO:756 o 762.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 y 763.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de regular negativamente el nivel de expresión de una secuencia de ácido nucleico al menos un 80 % idéntica a la SEQ ID NO:17 o 673.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de regular negativamente el nivel de expresión de la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO:17 o 673.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID NO:68, 51-66, 69100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 y 764-772 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea tal como se expone mediante la SEQ ID NO: 765 o 771.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 y 772.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de regular negativamente el nivel de expresión o la actividad de un polipéptido al menos un 80 % homólogo al polipéptido expuesto mediante la SEQ ID NO:67.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico capaz de regular negativamente el nivel de expresión o la actividad del polipéptido expuesto mediante la SEQ ID NO:67.
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Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado de la invención, y un promotor para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a las SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 o 772 con la condición de que la secuencia de aminoácidos no sea tal como se expone mediante la SEQ ID NO:765 o 771.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 y 772.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 779-792 y una secuencia de polinucleótido heterólogo, en donde la secuencia de ácido nucleico es capaz de regular la expresión del polinucleótido heterólogo en una célula huésped.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido heterólogo es un gen indicador.
Según algunas realizaciones de la invención, la regulación de la expresión del polinucleótido heterólogo es de una manera específica de tejido.
Según algunas realizaciones de la invención, la regulación de la expresión del polinucleótido heterólogo es de una manera específica de la fase del desarrollo.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80 % idéntica a la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea tal como se expone mediante la SEQ ID NO:756 o 762.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido heterólogo codifica una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a las SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 y 764-772 con la condición de que la secuencia de aminoácidos no sea tal como se expone mediante la SEQ ID NO: 765 o 771.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la
eficiencia de uso de nitrógeno de una planta, que comprende expresar dentro de la planta la construcción de ácido
nucleico de la reivindicación 17, en donde el polinucleótido heterólogo comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80 % idéntica a las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea la expuesta mediante la SEQ ID NO:756 o 762, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de la planta.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la
eficiencia de uso de nitrógeno de una planta, que comprende expresar dentro de la planta la construcción de ácido
nucleico de la reivindicación 17, en donde el polinucleótido heterólogo codifica una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a las SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 y 764-772 con la condición de que la secuencia de aminoácidos no sea tal como se expone mediante la SEQ ID NO: 765 o 771, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de la planta.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una célula vegetal que expresa de forma exógena el polinucleótido de la invención, o la construcción de ácido nucleico de la invención.
Según un aspecto de algunas realizaciones de la presente invención, se proporciona una célula vegetal que expresa de forma exógena el polipéptido de la invención.
Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia de ácido nucleico es tal como se expone en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 o 763.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido consiste en la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724741, 755, 757-761 y 763.
Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a la SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 o 772 con la condición de que la secuencia de aminoácidos no sea tal como se expone mediante la SEQ ID NO: 765 o
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Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 y 772.
Según algunas realizaciones de la invención, la célula vegetal forma parte de una planta.
Según algunas realizaciones de la invención, el método comprende además cultivar la planta que expresa el polinucleótido exógeno bajo estrés abiótico.
Según algunas realizaciones de la invención, el estrés abiótico se selecciona del grupo que consiste en salinidad, sequía, privación de agua, baja temperatura, alta temperatura, toxicidad por metales pesados, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, exceso de nutrientes, contaminación atmosférica e irradiación con UV.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido es un polinucleótido de co-supresión, un polinucleótido antisentido, un polinucleótido de interferencia de ARN o un polinucleótido de ribozima.
Breve descripción de los dibujos
Algunas realizaciones de la invención se describen en la presente memoria, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos. Con referencia específica ahora a los dibujos en detalle, se destaca que los detalles mostrados son a modo de ejemplo y para los fines de una descripción ilustrativa de las realizaciones de la invención. A este respecto, la descripción tomada con los dibujos hace evidente para los expertos en la técnica cómo pueden llevarse a la práctica las realizaciones de la invención.
En los dibujos:
Las figuras 1A-D son imágenes digitales de hojas que representan los parámetros de las hojas. Figura 1A - longitud de la hoja (la longitud de la hoja está representada por la flecha); Figura 1B - longitud laminar (la longitud laminar está representada por la flecha); Figura 1C - área laminar (el área laminar está representada por la elipse blanca); Figura 1D - anchura laminar (la anchura laminar está representada por la flecha). La circularidad del cuerpo de la hoja se calculó como la anchura laminar dividida por la longitud laminar.
Las figuras 2A-B son imágenes que representan la visualización del desarrollo de raíces de plantas cultivadas en placas de agar transparentes. Los diferentes transgenes se cultivaron en placas de agar transparente durante 17 días y las placas se fotografiaron cada 2 días comenzando el día 7. Figura 2A - una imagen de una fotografía de plantas tomada después de 12 días en placas de agar. Figura 2B - una imagen de análisis de raíz en la que la longitud de la raíz medida se representa mediante una flecha roja.
La figura 3 es una ilustración esquemática del plásmido binario pGI usado para expresar las secuencias de polinucleótidos aisladas de la invención. RB - Borde derecho de ADN-T; LB - Borde izquierdo de ADN-T; H-Enzima de restricción HindIII; X - Enzima de restricción XbaI; B - enzima de restricción BamHI; S - Enzima de restricción SalI; Sm - enzima de restricción SmaI; R-I - enzima de restricción EcoRI; Sc - SacIlSstIlEcl136II; (números) - Longitud en pares de bases; NOS pro = promotor de nopalina sintasa; NPT-II = gen de neomicina fosfotransferasa; Terminador NOS ter = nopalina sintasa; Señal de Poli-A (señal de poliadenilación); GUSintron - el gen indicador GUS (secuencia codificante e intrón). Las secuencias de polinucleótidos aisladas de algunas realizaciones de la invención se clonaron en el vector mientras se reemplazaba el gen indicador GUSintron.
Descripción de realizaciones específicas de la invención
La presente invención, en algunas realizaciones de la misma, se refiere a polipéptidos aislados y polinucleótidos que los codifican y, más particularmente, pero no exclusivamente, a métodos de uso de los mismos para aumentar el contenido de aceite, el ritmo de crecimiento, el rendimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta.
Antes de explicar en detalle al menos una realización de la invención, debe entenderse que la invención no está necesariamente limitada en su aplicación a los detalles expuestos en la siguiente descripción o ejemplificados mediante los ejemplos. La invención es capaz de otras realizaciones o de ser puesta en práctica o llevada a cabo de diversas maneras.
Mientras reducían la presente invención a la práctica, los inventores de la presente invención han identificado nuevos polipéptidos y polinucleótidos que pueden usarse para aumentar el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el contenido de aceite, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta.
De este modo, tal como se muestra en la sección de ejemplos que sigue, los inventores de la presente invención han utilizado herramientas bioinformáticas para identificar polinucleótidos que mejoran el rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas, rendimiento de aceite y contenido de aceite), el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la
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tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta. Los genes que afectan al rasgo de interés se identificaron basándose en los perfiles de expresión de genes de varios ecotipos y tejidos de Arabidopsis, la homología con genes que se sabe que afectan al rasgo de interés y el uso del perfil de expresión digital en tejidos y condiciones específicos (tablas 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 y 11, ejemplos 1 y 3). También se identificaron polipéptidos y polinucleótidos homólogos que tienen la misma función (tabla 2, ejemplo 2). Las plantas transgénicas que sobreexpresan los polinucleótidos identificados exhiben un mayor rendimiento de semillas (p. ej., peso de 1000 semillas), rendimiento de aceite (por ejemplo, porcentaje de aceite en la semilla), biomasa (p. ej., materia seca), índice de cosecha, ritmo de crecimiento, área de roseta, tolerancia al estrés abiótico (p. ej., a condiciones de sequía) y eficiencia de uso de nitrógeno (tablas 22, 23, 24, 25, 26 y 27, ejemplos 5 y 7, tablas 28-30, ejemplo 8). Además, los inventores de la presente invención han descubierto que los polinucleótidos que reducen el nivel de expresión y/o la actividad de ciertos productos génicos (p. ej., el gen BDL127, SEQ ID NO:17 o 673) pueden aumentar el rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas), biomasa y/o ritmo de crecimiento en plantas (tablas 31-36, ejemplo 9). Tal como se muestra adicionalmente en la sección de ejemplos que sigue, los inventores de la presente invención han descubierto secuencias promotoras novedosas que pueden usarse para expresar el gen de interés de una manera específica de tejido y/o específica de la fase de desarrollo (tablas 16, 17, 18, 19, 20 y 21, ejemplo 6). En conjunto, estos resultados sugieren el uso de los polinucleótidos o polipéptidos de la invención para aumentar el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta
De este modo, según un aspecto de algunas realizaciones de la invención, se proporciona un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta, que comprende expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 80% idéntica a las SEQ ID NO:18, 1-16, 1950, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea la expuesta mediante la SEQ ID NO:756 o 762, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de la planta.
La frase "contenido de aceite" como se emplea en esta memoria se refiere a la cantidad de lípidos en un órgano vegetal dado, ya sea las semillas (contenido de aceite de la semilla) o la parte vegetativa de la planta (contenido de aceite vegetativo) y se expresa típicamente como porcentaje de peso seco (10 % de humedad de las semillas) o peso húmedo (por parte vegetativa).
Debe observarse que el contenido de aceite se ve afectado por la producción de aceite intrínseca de un tejido (p. ej., semilla, parte vegetativa), así como la masa o el tamaño del tejido productor de aceite por planta o por período de crecimiento.
En una realización, el aumento en el contenido de aceite de la planta se puede conseguir aumentando el tamaño/la masa de uno o varios tejidos de una planta que comprenden aceite por período de crecimiento. Por lo tanto, el aumento del contenido de aceite de una planta se puede conseguir aumentando el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa y el vigor de la planta.
Como se emplea en esta memoria, la frase "rendimiento de la planta" se refiere a la cuantía (según se determina por peso o tamaño) o cantidad (números) de tejido producido por planta o por temporada de cultivo. Por lo tanto, un mayor rendimiento podría afectar el beneficio económico que se puede obtener de la planta en una determinada área de cultivo y/o tiempo de cultivo.
Debe observarse que el rendimiento de una planta puede verse afectado por diversos parámetros que incluyen, pero no se limitan a, biomasa de la planta; vigor de la planta; ritmo de crecimiento; rendimiento de semillas; rendimiento de aceite; contenido de aceite, almidón y/o proteína en órganos cosechados (p. ej., semillas o partes vegetativas de la planta); número de flores (flósculos) por panícula (expresado como una proporción del número de semillas llenas respecto al número de panículas primarias); índice de cosecha; número de plantas cultivadas por área; número y tamaño de los órganos cosechados por planta y por área; número de plantas por área de cultivo (densidad); número de órganos cosechados en el campo; área foliar total; asimilación de carbono y partición de carbono (la distribución/asignación de carbono dentro de la planta); resistencia a la oscuridad; número de órganos recolectables (p. ej., semillas), semillas por vaina, peso por semilla; y arquitectura modificada [tal como aumento del diámetro del tallo, el grosor o la mejora de las propiedades físicas (p. ej., elasticidad)].
Como se emplea en esta memoria, la frase "biomasa vegetal" se refiere a la cantidad (medida en gramos de tejido secado al aire) de un tejido producido a partir de la planta en una temporada de cultivo, que también podría determinar o afectar al rendimiento de la planta o al rendimiento por área de cultivo. Un aumento en la biomasa de la planta puede ser en la planta completa o en partes de la misma, tales como partes aéreas (cosechables), biomasa vegetativa, raíces y semillas.
Como se emplea en esta memoria, la frase "ritmo de crecimiento" se refiere al aumento de tamaño del órgano de la planta por tiempo (puede medirse en cm2 por día).
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Como se emplea en esta memoria, la frase "vigor de la planta" se refiere a la cantidad (medida en peso) de tejido producido por la planta en un tiempo dado. Por lo tanto, un mayor vigor podría determinar o afectar al rendimiento de la planta o al rendimiento por tiempo de cultivo o área de cultivo. Además, el vigor temprano (semilla y/o plántula) da como resultado una plantación mejorada.
Como se emplea en esta memoria, la frase "rendimiento de semillas" se refiere al número o peso de las semillas por planta, semillas por vaina, o por área de cultivo o al peso de una única semilla, o al aceite extraído por semilla. Por lo tanto, el rendimiento de semillas puede verse afectado por las dimensiones de la semilla (p. ej., longitud, anchura, perímetro, área y/o volumen), el número de semillas (llenas) y la tasa de llenado de semillas y por el contenido de aceite de la semilla. Por lo tanto, el aumento del rendimiento de semillas por planta podría afectar al beneficio económico que uno puede obtener de la planta en un área de cultivo y/o tiempo de cultivo determinados; y el aumento del rendimiento de semillas por área de cultivo podría conseguirse aumentando el rendimiento de semillas por planta, y/o aumentando el número de plantas cultivadas en la misma área dada.
El término "semilla" (también denominado "grano" o "pepita") como se emplea en esta memoria se refiere a una planta embrionaria pequeña encerrada en una cubierta llamada testa (generalmente con algo de alimento almacenado), el producto del óvulo madurado de plantas gimnospermas y angiospermas que se produce después de la fertilización y algo de crecimiento dentro de la planta madre.
Debe observarse que el rendimiento de una planta puede determinarse bajo estrés (p. ej., estrés abiótico, condiciones limitantes de nitrógeno) o condiciones sin estrés (normales).
Como se emplea en esta memoria, la frase "condiciones sin estrés" se refiere a las condiciones de cultivo (p. ej., agua, temperatura, ciclos de luz-oscuridad, humedad, concentración de sal, concentración de fertilizante en el suelo, suministro de nutrientes tales como nitrógeno, fósforo y/o potasio), que permiten el metabolismo, el crecimiento, la reproducción y/o la viabilidad de una planta normales en cualquier fase de su ciclo de vida (desde la semilla hasta la planta madura y de vuelta a la semilla de nuevo). Debe observarse que, aunque las condiciones sin estrés pueden incluir algunas variaciones leves de las condiciones óptimas (que varían de un tipo/especie de una planta a otra), dichas variaciones no hacen que la planta deje de crecer sin la capacidad de reanudar el crecimiento.
La frase "estrés abiótico" como se emplea en esta memoria se refiere a cualquier efecto adverso sobre el metabolismo, el crecimiento, la reproducción y/o la viabilidad de una planta. Por consiguiente, el estrés abiótico puede ser inducido por condiciones de cultivo ambientales subóptimas tales como, por ejemplo, salinidad, privación de agua, inundación, congelación, baja o alta temperatura, toxicidad por metales pesados, anaerobiosis, deficiencia de nutrientes, contaminación atmosférica o irradiación con UV. Las implicaciones del estrés abiótico se describen en la sección de Antecedentes.
La frase "tolerancia al estrés abiótico" como se emplea en esta memoria se refiere a la capacidad de una planta para soportar un estrés abiótico sin sufrir una alteración sustancial en el metabolismo, el crecimiento, la productividad y/o la viabilidad.
Como se emplea en esta memoria, la frase "eficiencia de uso de nitrógeno (EUN)" se refiere al o los procesos metabólicos que causan un aumento en el rendimiento, la biomasa, el vigor, el ritmo de crecimiento y la tolerancia al estrés abiótico de la planta por unidad de nitrógeno aplicada. El proceso metabólico puede ser la captación, diseminación, absorción, acumulación, reubicación (dentro de la planta) y el uso de nitrógeno absorbido por la planta.
Como se emplea en esta memoria, la frase "condiciones limitantes de nitrógeno" se refiere a condiciones de cultivo que incluyen un nivel (p. ej., concentración) de nitrógeno (p. ej., amonio o nitrato) aplicado que es inferior al nivel necesario para el metabolismo, el crecimiento, la reproducción y/o viabilidad normales de la planta.
Como se emplea en esta memoria, el término "aumentar" se refiere a al menos aproximadamente el 2 %, al menos
aproximadamente el 3 %, al menos aproximadamente el 4 %, al menos aproximadamente el 5 %, al menos
aproximadamente el 10 %, al menos aproximadamente el 15 %, al menos aproximadamente el 20 %, al menos
aproximadamente el 30 %, al menos aproximadamente el 40 %, al menos aproximadamente el 50 %, al menos
aproximadamente el 60 %, al menos aproximadamente el 70 %, al menos aproximadamente el 80 %, de aumento en el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, la vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta en comparación con una planta nativa [es decir, una planta no modificada con las biomoléculas (polinucleótidos o polipéptidos) de la invención, p. ej., una planta no transformada de la misma especie que se cultiva en las mismas condiciones de cultivo).
Como se emplea en esta memoria, la frase "polinucleótido exógeno" se refiere a una secuencia de ácido nucleico heteróloga que puede no expresarse de forma natural dentro de la planta o cuya sobreexpresión en la planta se desea. El polinucleótido exógeno se puede introducir en la planta de una manera estable o transitoria, para producir una molécula de ácido ribonucleico (ARN) y/o una molécula de polipéptido. Debe observarse que el polinucleótido exógeno puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es idéntica o parcialmente homóloga a una secuencia de ácido nucleico endógena de la planta.
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Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al

menos aproximadamente el 89 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al

menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al

menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al
menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, p. ej., el 100% idéntica a la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 1950, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO:756 o 762.
La identidad (por ejemplo, porcentaje de homología) puede determinarse usando cualquier software de comparación de homología, incluyendo, por ejemplo, el software BlastN del National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como usando los parámetros por defecto.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido es al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 86 %, al menos
aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al menos aproximadamente el 89 %, al menos
aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos
aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos
aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos
aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, p. ej., el 100% idéntico al polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724741 y 755-763 con la condición de que el polinucleótido exógeno no sea como se expone en la SEQ ID NO:756 o 762.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno se expone mediante las SEQ ID NO:18, 116, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 o 763.
En realizaciones ejemplares, el polinucleótido exógeno no es el polinucleótido expuesto mediante la SEQ ID NO:807 u 808.
Como se emplea en esta memoria, el término "polinucleótido" se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que se aísla y se proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o secuencias de polinucleótidos compuestas (p. ej., una combinación de las anteriores).
El término "aislado" se refiere a al menos parcialmente separado del entorno natural, por ejemplo, de una célula vegetal.
Como se emplea en esta memoria, la frase "secuencia de polinucleótidos complementaria" se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa de ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. Dicha secuencia puede amplificarse posteriormente in vivo o in vitro usando una ADN polimerasa dependiente de ADN.
Como se emplea en esta memoria, la frase "secuencia de polinucleótidos genómica" se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y, por lo tanto, representa una parte contigua de un cromosoma.
Como se emplea en esta memoria, la frase "secuencia de polinucleótidos compuesta" se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. Una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exónicas requeridas para codificar el polipéptido de la presente invención, así como algunas secuencias intrónicas que se interponen entre ellas. Las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluyendo otros genes, y típicamente incluirán secuencias señal de corte y empalme conservadas. Dichas secuencias intrónicas pueden incluir además elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno de la invención codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81 %, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al

menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 87 %, al

menos aproximadamente el 88 %, al menos aproximadamente el 89 %, al menos aproximadamente el 90 %, al

menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al

menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al
menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o más, digamos el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 y 764-772 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO: 765 o 771.
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La homología (p. ej., porcentaje de homología) puede determinarse usando cualquier software de comparación de homología, incluyendo, por ejemplo, el software BlastP o TBLASTN del National Center of Biotechnology Information (NCBI) tal como usando parámetros por defecto, cuando se parte de una secuencia de polipéptidos; o el algoritmo tBLASTX (disponible a través del NCBI) tal como mediante usando parámetros por defecto, que compara los productos de traducción conceptual de seis marcos de una secuencia de búsqueda de nucleótidos (ambas cadenas) frente a una base de datos de secuencias de proteínas.
Las secuencias homólogas incluyen secuencias tanto ortólogas como parálogas. El término "parálogo" se refiere a la duplicación de genes dentro del genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término "ortólogo" se refiere a genes homólogos en diferentes organismos debido a una relación ancestral.
Una opción para identificar ortólogos en especies de plantas monocotiledóneas es realizar una búsqueda recíproca en Blast. Esto se puede hacer mediante una primera búsqueda en Blast que complica comparar con Blast la secuencia de interés frente a cualquier base de datos de secuencias, tal como la base de datos del NCBI disponible públicamente que se puede encontrar en: Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov. Si se buscaran ortólogos en el arroz, la secuencia de interés se compararía mediante blast contra, por ejemplo, los 28.469 clones de ADNc de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare disponibles en NCBI. Los resultados de la comparación en Blast pueden ser filtrados. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o los resultados no filtrados se comparan (segunda comparación con Blast) frente a las secuencias del organismo del que se deriva la secuencia de interés. Los resultados de la primera y segunda comparaciones con Blast se comparan a continuación. Se identifica un ortólogo cuando la secuencia que da como resultado la puntuación más alta (mejor resultado) en la primera comparación con Blast identifica en la segunda comparación con Blast la secuencia de consulta (la secuencia de interés original) como el mejor resultado. Usando la misma lógica, se descubre un parálogo (homólogo de un gen en el mismo organismo). En el caso de familias de secuencias grandes, se puede usar el programa ClustalW [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) ebi (.) ac (.) uk/Tools/clustalw2/index (.) html], seguido de un método de unión de pares por árbol Neighbor-joining (Hypertext Transfer Protocol://en (.) wikipedia (.) org/wiki/Neighbor-joining) que ayuda a visualizar el agrupamiento.
En una realización ejemplar, el polinucleótido exógeno no codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 809-852.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno codifica un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos expuesta mediante la SEQ ID NO: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742754, 764, 766-770 o 772.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de la presente invención pueden optimizarse para la expresión. Ejemplos no limitantes de secuencias de ácido nucleico optimizadas se proporcionan en las SEQ ID NO:663 (BDL-113), 675 (BDL-129), 676 (BDL-130), 680 (BDL-134), 683 (BDL-137), 684 (BDL-139) y 685 (BDL-141) que codifican un polipéptido optimizado que comprende las secuencias de aminoácidos expuestas mediante las SEQ ID NO:57, 69, 712, 74, 77, 78 y 79. Ejemplos de dichas modificaciones de secuencia incluyen, pero no se limitan a, un contenido de G/C alterado para acercarse más al que se encuentra típicamente en las especies vegetales de interés, y la eliminación de codones que se encuentran de forma atípica en las especies de plantas comúnmente denominada optimización de codones.
La frase "optimización de codones" se refiere a la selección de nucleótidos de ADN apropiados para uso dentro de un gen estructural o fragmento del mismo que se aproxima al uso de codones dentro de la planta de interés. Por lo tanto, un gen o una secuencia de ácido nucleico optimizado se refiere a un gen en el que la secuencia de nucleótidos de un gen nativo o de origen natural se ha modificado con el fin de utilizar codones preferidos estadísticamente o estadísticamente favorecidos dentro de la planta. La secuencia de nucleótidos típicamente se examina a nivel de ADN y la región codificante optimizada para la expresión en la especie vegetal se determina usando cualquier procedimiento adecuado, por ejemplo, como se describe en Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15: 677-681). En este método, la desviación estándar del uso de codones, una medida del sesgo en el uso de codones, se puede calcular descubriendo en primer lugar la desviación proporcional al cuadrado del uso de cada codón del gen nativo con respecto a la de genes de plantas altamente expresados, seguido de un cálculo de la desviación cuadrada promedio. La fórmula usada es: 1 SDCU = n = 1 N [(Xn - Yn) / Yn] 2 / N, donde Xn se refiere a la frecuencia de uso del codón n en genes vegetales altamente expresados, donde Yn se refiere a la frecuencia de uso de codón n en el gen de interés y N se refiere al número total de codones en el gen de interés. Se compila una tabla de uso de codones de genes altamente expresados de plantas dicotiledóneas usando los datos deMurray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17: 477-498).
Un método de optimización de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo con el uso de codón preferido para un tipo de célula vegetal particular se basa en el uso directo, sin realizar cálculos estadísticos adicionales, de tablas de optimización de codones tales como las proporcionadas en línea en la base de datos Codon Usage Database a través del banco de ADN del NIAS (National Institute of Agrobiological Sciences) en Japón (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) kazusa (.) or (.) jp/codon/). La Codon Usage Database (base de datos de uso de codones) contiene tablas de uso de codones para varias especies diferentes, con cada tabla de uso de codones habiéndose determinado estadísticamente en función de los datos presentes en el Genbank.
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Usando las tablas anteriores para determinar los codones más preferidos o más favorecidos para cada aminoácido en una especie particular (por ejemplo, arroz), se pueden optimizar los codones de una secuencia de nucleótidos de origen natural que codifica una proteína de interés para esa especie vegetal particular. Esto se efectúa reemplazando codones que pueden tener una baja incidencia estadística en el genoma de la especie particular con los codones correspondientes, con respecto a un aminoácido, que son estadísticamente más favorecidos. Sin embargo, se pueden seleccionar uno o más codones menos favorecidos para delecionar sitios de restricción existentes, para crear otros nuevos en uniones potencialmente útiles (extremos 5 'y 3' para añadir casetes de péptido señal o de terminación, sitios internos que podrían usarse para cortar y empalmar conjuntamente segmentos para producir una secuencia correcta de longitud completa), o para eliminar secuencias de nucleótidos que pueden afectar negativamente a la estabilidad o expresión del ARNm.
La secuencia de nucleótidos codificante de origen natural puede ya, antes de cualquier modificación, contener un número de codones que corresponden a un codón estadísticamente favorecido en una especie vegetal particular. Por lo tanto, la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos nativa puede comprender determinar qué codones, dentro de la secuencia de nucleótidos nativa, no están estadísticamente favorecidos con respecto a una planta particular, y modificar estos codones según una tabla de uso de codones de la planta particular para producir un derivado con optimización de codones. Una secuencia de nucleótidos modificada puede optimizarse total o parcialmente para el uso de codones de plantas siempre que la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos modificada se produzca a un nivel superior a la proteína codificada por el gen de origen natural o nativo correspondiente. La construcción de genes sintéticos alterando el uso de codones se describe, por ejemplo, en la solicitud de patente PCT 93/07278.
Por lo tanto, la invención abarca las secuencias de ácido nucleico descritas anteriormente; fragmentos de las mismas, secuencias hibridables con las mismas, secuencias homólogas a las mismas, secuencias que codifican polipéptidos similares con uso de codones diferente, secuencias alteradas caracterizadas por mutaciones, tales como deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, ya sean de origen natural o inducidos por el hombre, aleatoriamente o de manera dirigida.
La invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos
aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al menos
aproximadamente el 89 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos
aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos
aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos
aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, p. ej., el 100% idéntico al polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO:756 o 762.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido aislado comprende la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724741, 755, 757-761 y 763.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido aislado se expone mediante las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741, 755, 757-761 o 763.
En realizaciones ejemplares, el polinucleótido aislado no es el polinucleótido expuesto mediante la SEQ ID NO:807 u 808.
La invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81 %, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al menos
aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 86 %, al menos
aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al menos aproximadamente el 89 %, al menos
aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos
aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos
aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos
aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o más, digamos el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720723, 742-754 y 764-772 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO: 765 o 771.
La invención proporciona un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 y 772.
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La invención proporciona un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81 %, al menos aproximadamente el 82 %, al menos
aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos
aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al menos
aproximadamente el 89 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos
aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos
aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos
aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o más, digamos el 100% homóloga a la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754 y 764-772 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO: 765 o 771.
En una realización ejemplar, el polipéptido no es el polipéptido expuesto mediante la SEQ ID NO: 809-851 u 852.
Según algunas realizaciones de la invención, el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID nO:68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 y 772.
Según algunas realizaciones de la invención, el polipéptido se expone mediante la SEQ ID NO: 68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764, 766-770 o 772.
La invención también abarca fragmentos de los polipéptidos descritos anteriormente, y polipéptidos que tienen mutaciones, tales como deleciones, inserciones o sustituciones de uno o más aminoácidos, ya sean de origen natural o inducidas por el hombre, ya sea aleatoriamente o de forma dirigida.
El término "planta" como se emplea en esta memoria abarca plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y partes de plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, raíces (incluyendo tubérculos), y células, tejidos y órganos vegetales. La planta puede estar en cualquier forma, incluyendo cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas incluyendo un forraje o leguminosa forrajera, planta ornamental, cultivo alimenticio, árbol o arbusto seleccionado de la lista que comprende Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chacoomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Dibeteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehraffia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalypfus spp., Euclea schimperi, Eulalia vi/losa, Pagopyrum spp., Feijoa sellowlana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksli, Geranium thunbergii, GinAgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemaffhia altissima, Heteropogon contoffus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hypeffhelia dissolute, Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesli, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago saliva, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativam, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonaffhria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys vefficillata, Sequoia sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofa, espárragos, brócoli, coles de Bruselas, col, canola, zanahoria, coliflor, apio, acelga, lino, berza, lentejas, colza, okra, cebolla, patata, arroz, soja, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, té de calabaza, maíz, trigo, cebada, centeno, avena, cacahuete, arveja, lenteja y alfalfa, algodón, colza, canola, pimienta, girasol, tabaco, berenjena, eucalipto, un árbol, una planta ornamental, un hierba perenne y un cultivo forrajero. Como alternativa, pueden usarse algas y otras sustancias distintas de Viridiplantae para los métodos de la presente invención.
Según algunas realizaciones de la invención, la planta usada por el método de la invención es una planta de cultivo tal como arroz, maíz, trigo, cebada, cacahuete, patata, sésamo, olivo, aceite de palma, plátano, soja, girasol, canola, caña de azúcar, alfalfa, mijo, leguminosas (judía, guisante), lino, lupino, colza, tabaco, álamo y algodón.
La expresión del polinucleótido exógeno de la invención dentro de la planta puede efectuarse transformando una o
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más células de la planta con el polinucleótido exógeno, seguido de la generación de una planta madura a partir de las células transformadas y cultivando la planta madura en condiciones adecuadas para expresar el polinucleótido exógeno dentro de la planta madura.
Según algunas realizaciones de la invención, la transformación se efectúa introduciendo en la célula vegetal una construcción de ácido nucleico que incluye el polinucleótido exógeno de algunas realizaciones de la invención y al menos un promotor para dirigir la transcripción del polinucleótido exógeno en una célula huésped (una célula vegetal). A continuación, se proporcionan más detalles de los enfoques de transformación adecuados.
Según algunas realizaciones de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado de la invención, y un promotor para dirigir la transcripción de la secuencia de ácido nucleico en una célula huésped.
Como se emplea en esta memoria, el término "promotor" se refiere a una región de ADN que se encuentra cadena arriba del sitio de inicio transcripcional de un gen al que se une una ARN polimerasa para iniciar la transcripción de ARN. El promotor controla dónde (p. ej., qué parte de una planta) y/o cuándo (por ejemplo, en qué fase o condición en la vida de un organismo) se expresa el gen.
Cualquier secuencia promotora adecuada puede ser usada por la construcción de ácido nucleico de la presente invención. Preferiblemente, el promotor es un promotor constitutivo, un promotor específico de tejido o inducible por estrés abiótico.
Los promotores constitutivos adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor 35S de CaMV (SEQ ID NO:777; Odell et al., Nature 313: 810-812, 1985); el promotor At6669 de Arabidopsis (SEQ ID NO:775; véasePublicación PCT No. WO04081173A2); Ubi 1 de maíz (Christensen et al., Plant Sol. Biol. 18: 675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171, 1990); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81: 581-588, 1991); 19S de CaMV (Nilsson et al., Physiol. Plant 100: 456-462, 1997); GOS2 (de Pater et al, Plant J Nov; 2(6): 837-44, 1992); ubiquitina (Christensen et al, Plant Mol. Biol. 18: 675-689, 1992); ciclofilina de arroz (Bucholz et al, Plant Mol Biol. 25(5): 83743, 1994); histona H3 de maíz (Lepetit et al, Mol. Gen. Genet. 231: 276-285, 1992); Actina 2 (An et al, Plant J. 10(1); 107-121, 1996) y Súper MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995). Otros promotores constitutivos incluyen los de las patentes de Estados Unidos No. 5.659.026; 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597; 5.466.785; 5.399.680; 5.268.463; y 5.608.142.
Los promotores específicos de tejido adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores específicos de la hoja [tales como los descritos, por ejemplo, por Yamamoto et al., Plant J. 12: 255-265, 1997; Kwon et al., Plant Physiol. 105: 357-67, 1994; Yamamoto et al., Plant Cell Physiol. 35: 773-778, 1994; Gotor et al., Plant J. 3: 509-18, 1993; Orozco et al., Plant Mol. Biol. 23: 1129-1138, 1993; yMatsuoka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 9586-9590, 1993], promotores preferidos de semillas [p. ej., de genes específicos de semillas (Simon, et al., Plant Mol. Biol. 5. 191, 1985; Scofield, et al., J. Biol. Chem. 262: 12202, 1987; Baszczynski, et al., Plant Mol. Biol. 14: 633, 1990), albúmina de nuez de Brasil (Pearson' et al., Plant Mol. Biol. 18: 235- 245, 1992), legumina (Ellis, et al. Plant Mol. Biol. 10: 203-214, 1988), Glutelina (arroz) (Takaiwa, et al., Mol. Gen. Genet. 208: 15-22, 1986; Takaiwa, et al., FEBS Letts. 221: 43-47, 1987), Zeína (Matzke et al Plant Mol Biol, 143). 323-32 1990), napA (Stalberg, et al, Planta 199: 515-519, 1996), SPA de trigo (Albanietal, Plant Cell, 9: 171- 184, 1997), oleosina de girasol (Cummins, etal., Plant Mol. Biol. 19: 873-876, 1992)], promotores específicos de endosperma [p. ej., LMW y HMW de trigo, glutenina-1 (Mol Gen Genet 216: 81-90, 1989;NAR 17: 461-2), gliadinas a, b y g de trigo (EMBO3: 1409-15, 1984), promotor ltrl de cebada, hordeína B1, C, D de cebada (Theor Appl Gen 98: 1253-62, 1999;Plant J 4: 343-55, 1993;Mol Gen Genet 250: 750- 60, 1996), DOF de cebada (Mena et al, The Plant Journal, 116(1): 53- 62, 1998), Biz2 (EP99106056.7), promotor sintético (Vicente-Carbajosa et al., Plant J. 13: 629-640, 1998), prolamina NRP33 de arroz, globulina Glb-1 de arroz (Wu et al, Plant Cell Physiology 39(8) 885- 889, 1998), alfa-globulina REB/OHP-1 de arroz (Nakase et al. Plant Mol. Biol. 33: 513-S22, 1997), ADP-glucosa PP de arroz (Trans Res 6: 157-68, 1997), familia del gen ESR de maíz (Plant J 12: 235-46, 1997), gamma- kafirina de sorgo (PMB 32: 1029-35, 1996)], promotores específicos de embriones [p. ej., OSH1 de arroz (Sato et al, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 93: 8117-8122), KNOX (Postma-Haarsma et al, Plant Mol. Biol. 39:257-71, 1999), oleosina de arroz (Wu et at, J. Biochem., 123: 386, 1998)], y promotores específicos de flores [p. ej., AtPRP4, caleno sintasa (chsA) (Van der Meer, et al., Plant Mol. Biol. 15, 95-109, 1990), LAT52 (Twell et al Mol. Gen Genet. 217:240-245; 1989), apétala-3].
Los promotores inducibles por estrés abiótico adecuados incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles por sales tales como RD29A (Yamaguchi-Shinozalei et al., Mol. Gen. Genet. 236:331-340, 1993); promotores inducibles por sequía tales como el promotor del gen rab17 de maíz (Pla et. al., Plant Mol. Biol. 21: 259-266, 1993), el promotor del gen rab28 de maíz (Busk et. al., Plant J. 11: 1285-1295, 1997) y el promotor del gen Ivr2 de maíz (Pelleschi et. al., Plant Mol. Biol. 39: 373-380, 1999); promotores inducibles por calor tales como el promotor hsp80 inducible por calor de tomate (patente de Estados Unidos No. 5.187.267).
Como se ha mencionado anteriormente, y se describe adicionalmente en el ejemplo 6 de la sección de ejemplos que sigue, los inventores de la presente invención han descubierto nuevas secuencias promotoras (secuencias de ácido nucleico reguladoras) que pueden usarse para expresar un polinucleótido de interés en una planta.
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Por lo tanto, según un aspecto de algunas realizaciones de la invención, se proporciona una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 779-792 y una secuencia de polinucleótido heterólogo, en donde la secuencia de ácido nucleico es capaz de regular la expresión del polinucleótido heterólogo en una célula huésped.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido heterólogo está unido operativamente a la secuencia de ácido nucleico reguladora seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 779-792.
Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia de ácido nucleico reguladora de la invención varía en longitud de aproximadamente 500 nucleótidos a aproximadamente 4000 nucleótidos e incluye una o más regiones de secuencia que son capaces de reconocer y unirse a la ARN polimerasa II y a otras proteínas (factores de transcripción que actúan en trans) implicadas en la transcripción.
Una secuencia de ácido nucleico codificante está "unida operativamente" a una secuencia reguladora si la secuencia reguladora es capaz de ejercer un efecto regulador sobre la secuencia codificante unida a la misma. Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia reguladora está situada 1-500 pb cadena arriba del codón ATG de la secuencia de ácido nucleico codificante, aunque se apreciará que las secuencias reguladoras también pueden ejercer su efecto cuando están situadas en otra parte con respecto a la secuencia de ácido nucleico codificante (p. ej., dentro de un intrón).
Como se ilustra claramente en la sección de ejemplos que sigue, las novedosas secuencias de ácido nucleico reguladoras de la invención son capaces de regular la expresión de una secuencia de ácido nucleico codificante (p. ej., un gen indicador tal como GUS, luciferasa) unida operativamente a la misma (véase el ejemplo 6 de la sección de ejemplos que sigue).
Según algunas realizaciones de la invención, las secuencias de ácido nucleico reguladoras de la invención regulan la expresión del polinucleótido heterólogo de una manera específica de tejido.
Según algunas realizaciones de la invención, las secuencias de ácido nucleico reguladoras de la invención regulan la expresión del polinucleótido heterólogo de una manera específica de la fase del desarrollo.
Según algunas realizaciones de la invención, las secuencias de ácido nucleico reguladoras de la invención se modifican para crear variaciones en las secuencias de la molécula tales como para potenciar sus actividades de promoción, usando métodos conocidos en la técnica, tales como modificación de ADN basada en PCR o técnicas de mutagénesis de ADN estándar o sintetizando químicamente los polinucleótidos modificados.
Por consiguiente, las secuencias de ácido nucleico reguladoras expuestas en las SEQ ID NO:779-792 pueden truncarse o delecionarse y aún conservar la capacidad de dirigir la transcripción de una secuencia de ADN heteróloga unida operativamente. La longitud mínima de una región promotora puede determinarse eliminando sistemáticamente secuencias de los extremos 5' y 3' del polinucleótido aislado mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, la eliminación de fragmentos de enzimas de restricción o la digestión con nucleasas. En consecuencia, cualesquier fragmentos, partes o regiones de secuencia de las secuencias de polinucleótidos promotoras de la invención descritas pueden usarse como secuencias reguladoras. Se apreciará que las secuencias modificadas (mutadas, truncadas y similares) pueden adquirir diferentes propiedades transcripcionales tales como la dirección de diferentes patrones de expresión génica en comparación con el elemento sin modificar.
Opcionalmente, las secuencias expuestas en las SEQ ID NO:779-792 pueden modificarse, por ejemplo, para la expresión en una gama de sistemas de plantas. En otro enfoque, los promotores híbridos novedosos pueden diseñarse o concebirse mediante diversos métodos. Muchos promotores contienen secuencias cadena arriba que activan, potencian o definen la resistencia y/o la especificidad del promotor, tal como se describe, por ejemplo, porAtchison [Ann. Rev. Cell Biol. 4: 127 (1988)]. Los genes de ADN-T, por ejemplo, contienen cajas "TATA" que definen el sitio de inicio de la transcripción y otros elementos situados aguas arriba del sitio de inicio de la transcripción modulan los niveles de transcripción [Gelvin In: Transgenic Plants (Kung, S.-D. and Us, R., Eds, San Diego: Academic Press, págs.49-87, (1988)]. Otro promotor quimérico combinó un trímero del activador de la octopina sintasa (OCS) con el activador más promotor de la mannopina sintasa (mas) y notificó un aumento en la expresión de un gen indicador [Min Ni et al. The Plant Journal 7: 661 (1995)]. Las secuencias reguladoras cadena arriba de las secuencias de polinucleótidos promotores de la invención pueden usarse para la construcción de dichos promotores quiméricos o híbridos. Los métodos para la construcción de promotores variantes incluyen, pero no se limitan a, combinar elementos de control de diferentes promotores o duplicar partes o regiones de un promotor (véanse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos No. 5.110.732y5.097.025). Los expertos en la técnica están familiarizados con las condiciones y procedimientos específicos para la construcción, manipulación y aislamiento de macromoléculas (p. ej., moléculas de ADN, plásmidos, etc.), la generación de organismos recombinantes y el cribado y aislamiento de genes [véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, (1989);Mailga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, (1995);Birren et al., Genome Analysis: volumen 1, Analyzing DNA, (1997);volumen 2, Detecting Genes, (1998);volumen 3, Cloning Systems, (1999); yvolumen 4, Mapping Genomes, (1999), Cold Spring Harbor, N.Y].
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Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido heterólogo que está regulado por la secuencia de ácido nucleico reguladora de la invención (p. ej., SEQ ID NO:779-791 o 792) comprende una secuencia de ácido nucleico que es al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos
aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 87 %, al menos
aproximadamente el 88 %, al menos aproximadamente el 89 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos
aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos
aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos
aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos
aproximadamente el 99 %, p. ej., el 100% idéntica a la secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO:756 o 762.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido heterólogo codifica una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81 %, al menos aproximadamente el 82 %, al

menos aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al

menos aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al

menos aproximadamente el 89 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al

menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al

menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al
menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o más, digamos el 100 % homóloga a las SEQ ID NO::68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 o 772 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO: 765 o 771.
Según algunas realizaciones, el polinucleótido heterólogo no codifica la secuencia de aminoácidos expuesta mediante la SEQ ID NO: 809-851 u 852.
Según algunas realizaciones, el polinucleótido heterólogo no comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta mediante la SEQ ID NO:807 u 808.
Por lo tanto, según algunas realizaciones de la invención, el método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta se efectúa expresando dentro de la planta una construcción de ácido nucleico de la invención que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:779-792 y una secuencia de polinucleótidos heteróloga que comprende una secuencia de ácido nucleico al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81%, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al

menos aproximadamente el 86 %, al menos aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al

menos aproximadamente el 89 %, al menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al

menos aproximadamente el 92 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al

menos aproximadamente el 94 %, al menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al
menos aproximadamente el 97 %, al menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, p. ej., el 100% idéntica a las SEQ ID NO:18, 1-16, 19-50, 101-378, 657-672, 674-706, 716-719, 724-741 y 755-763 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea la expuesta mediante la SEQ ID NO:756 o 762, en donde la secuencia de ácido nucleico es capaz de regular la expresión del polinucleótido heterólogo en una célula huésped.
Según algunas realizaciones de la invención, el método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta se efectúa expresando dentro de la planta una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO:779-792 y una secuencia de polinucleótidos heteróloga que codifica una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente el 80 %, al menos aproximadamente el 81 %, al menos aproximadamente el 82 %, al menos aproximadamente el 83 %, al

menos aproximadamente el 84 %, al menos aproximadamente el 85 %, al menos aproximadamente el 86 %, al

menos aproximadamente el 87 %, al menos aproximadamente el 88 %, al menos aproximadamente el 89 %, al

menos aproximadamente el 90 %, al menos aproximadamente el 91 %, al menos aproximadamente el 92 %, al

menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 93 %, al menos aproximadamente el 94 %, al

menos aproximadamente el 95 %, al menos aproximadamente el 96 %, al menos aproximadamente el 97 %, al
menos aproximadamente el 98 %, al menos aproximadamente el 99 %, o más, digamos el 100 % homóloga a las SEQ ID NO::68, 51-66, 69-100, 379-656, 707-715, 720-723, 742-754, 764-771 o 772 con la condición de que la secuencia de ácido nucleico no sea como se expone en la SEQ ID NO: 765 o 771, en donde la secuencia de ácido nucleico es capaz de regular la expresión del polinucleótido heterólogo en una célula huésped.
La construcción de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención puede incluir además un marcador seleccionable y/o un origen de replicación apropiados. Según algunas realizaciones de la invención, la construcción de ácido nucleico utilizada es un vector lanzadera, que puede propagarse tanto en E. coli (en donde la construcción comprende un marcador seleccionable y un origen de replicación apropiados) y ser compatible con la propagación en las células. La construcción según la presente invención puede ser, por ejemplo, un plásmido, un bacémido, un
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fagémido, un cósmido, un fago, un virus o un cromosoma artificial.
La construcción de ácido nucleico de algunas realizaciones de la invención puede utilizarse para transformar las células vegetales de manera estable o transitoria. En la transformación estable, el polinucleótido exógeno se integra en el genoma de la planta y, por tanto, representa un rasgo hereditario y estable. En la transformación transitoria, el polinucleótido exógeno es expresado por la célula transformada pero no se integra en el genoma y, por tanto, representa un rasgo transitorio.
Existen diversos métodos de introducción de genes extraños en plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas (Potrykus, I. Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42: 205-225; Shimamoto et al., Nature (1989) 338: 274-276).
Los métodos principales para causar la integración estable de ADN exógeno en ADN genómico de plantas incluyen dos enfoques principales:
(i) transferencia de genes mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee y Rogers en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, en Plant Biotechnology, eds. Kung, S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112.
(ii) captación directa de ADN: Paszkowski et al., en Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluyendo métodos de captación directa de ADN en protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6: 1072-1074. Captación de ADN inducida por electrochoque breve de células vegetales: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384.Fromm et al. Nature (1986) 319: 791-793. Inyección de ADN en células o tejidos vegetales mediante bombardeo con partículas, Klein et al. Bio/Technology (1988) 6: 559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6: 923-926; Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; mediante el uso de sistemas con micropipeta: Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus y Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformación con filamentos de carburo de silicio o fibra de vidrio de cultivos de células, de tejidos de embriones o de callos, patente de Estados Unidos No. 5.464.765o mediante incubación directa de ADN con polen en germinación, DeWet et al. en Experimental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. and Mantell, S. H. and Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; yOhta, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 715-719.
El sistema de Agrobacterium incluye el uso de vectores plasmídicos que contienen segmentos de ADN definidos que están integrados en el ADN genómico de la planta. Los métodos de inoculación del tejido vegetal varían dependiendo de la especie de la planta y del sistema de suministro de Agrobacterium. Un enfoque muy usado es el procedimiento con disco foliar que puede realizarse con cualquier explante tisular que proporcione una buena fuente para iniciar la diferenciación de toda la planta. Véase, p. ej., Horsch et al. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Un enfoque complementario emplea el sistema de suministro de Agrobacterium en combinación con infiltración al vacío. El sistema de Agrobacterium es especialmente viable en la creación de planta dicotiledóneas transgénicas.
Existen diversos métodos de transferencia directa de ADN en las células vegetales. En la electroporación, los protoplastos se exponen brevemente a un campo eléctrico intenso. En la microinyección, el ADN se inyecta mecánicamente directamente al interior de las células usando micropipetas muy pequeñas. En el bombardeo con micropartículas, el ADN se adsorbe en microproyectiles, tales como cristales de sulfato de manganeso o partículas de tungsteno, y los microproyectiles se aceleran físicamente en el interior de las células o tejidos vegetales.
Después de la transformación estable se realiza la propagación de la planta. El método más habitual para realizar la propagación de la planta es por semillas. Sin embargo, la regeneración mediante propagación por semillas, tiene el defecto de que, debido a la heterocigosidad, hay una falta de uniformidad en el cultivo, dado que las semillas se producen por plantas según variaciones genéticas regidas por las leyes de Mendel. Básicamente, cada semilla es genéticamente diferente y cada una de ellas crecerá con sus propios rasgos específicos. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se produzca de modo que la planta regenerada tenga los mismos rasgos y características que los de la planta transgénica parental. Por lo tanto, se prefiere que la planta transformada se regenere mediante micropropagación, lo que proporciona una reproducción uniforme y rápida de las plantas transformadas.
La micropropagación es un proceso de cultivo de nuevas generaciones de plantas a partir de un solo trozo de tejido que se ha extraído de una planta o variedad de cultivo parental seleccionada. Este proceso permite la reproducción masiva de las plantas que tienen el tejido preferido que expresa la proteína de fusión. Las plantas de nueva generación que se producen son genéticamente idénticas a, y tienen todas las características de, la planta original. La micropropagación permite la producción masiva de material vegetal de calidad en un corto periodo de tiempo y ofrece una rápida multiplicación de las variedades de cultivo seleccionadas en la conservación de las características de la planta transformada o transgénica original. Las ventajas de la clonación de plantas son la velocidad de la multiplicación de la planta y la calidad y uniformidad de las plantas producidas.
La micropropagación es un procedimiento de fases múltiples que requiere la alteración del medio de cultivo o de las
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condiciones de cultivo entre las fases. Por lo tanto, el proceso de micropropagación implica cuatro fases básicas: fase uno, cultivo tisular inicial; fase dos, multiplicación del cultivo tisular; fase tres, diferenciación y formación de la planta; y fase cuatro, cultivo y fortalecimiento en invernadero. Durante la fase uno de cultivo tisular inicial, el cultivo tisular se establece y se verifica que está libre de contaminantes. Durante la fase dos, el cultivo tisular inicial se multiplica hasta producir un número suficiente de muestras tisulares para alcanzar los objetivos de producción. Durante la fase tres, las muestras tisulares cultivadas en la fase dos se dividen y se desarrollan en plántulas individuales. En la fase cuatro, las plántulas transformadas se transfieren a un invernadero para fortalecerse, donde la tolerancia de las plantas a la luz se aumenta gradualmente de tal manera que puedan crecer en un entorno natural.
Según algunas realizaciones de la invención, las plantas transgénicas se generan por transformación transitoria de células foliares, células meristemáticas o de toda la planta.
La transformación transitoria puede efectuarse mediante cualquiera de los métodos de transferencia directa de ADN descritos anteriormente o mediante infección vírica usando virus de plantas modificados.
Los virus que se ha demostrado que son útiles para la transformación de huéspedes vegetales incluyen CaMV, virus del mosaico del Tabaco (TMV), virus del mosaico del bromo (BMV) y Virus del Mosaico Común de la Judía (BV o BCMV). La transformación de plantas usando virus de plantas se describe enla Patente de Estados Unidos No. 4.855.237(virus del mosaico amarillo de la judía; BGV), EP-A 67.553(TMV), Solicitud Publicada Japonesa No.63- 14693(TMV), EPA 194.809(BV), EPA 278.667(BV); yGluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, págs. 172-189 (1988). En el documentoWO 87/06261se describen partículas de Pseudovirus para su uso en la expresión de ADN exógeno en muchos hospedadores, incluyendo plantas.
Según algunas realizaciones de la invención, el virus usado para las transformaciones transitorias es un virus avirulento y por lo tanto incapaz de causar graves síntomas tales como ritmo de crecimiento reducido, mosaico, manchas anulares, enrollamiento foliar, amarillamiento, formación de vetas, formación de pústulas, formación de tumores y picaduras. Un virus avirulento adecuado puede ser un virus avirulento de origen natural o un virus artificialmente atenuado. La atenuación de virus puede efectuarse usando métodos bien conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, calentamiento subletal, tratamiento químico o mediante técnicas de mutagénesis dirigida, tales como las descritas, por ejemplo, por Kurihara y Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Galon et al. (1992), Atreya et al. (1992) y Huet et al. (1994).
Pueden obtenerse cepas de virus adecuadas procedentes de fuentes disponibles tales como, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) o por aislamiento de plantas infectadas. El aislamiento de virus a partir de tejidos vegetales infectados puede efectuarse por técnicas bien conocidas en la técnica, tales como las descritas, por ejemplo, porFoster y Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. En resumen, los tejidos de una planta infectada, que se piensa que contienen una alta concentración de un virus adecuado, preferiblemente hojas y pétalos de flores jóvenes, se cultivan en una solución tampón (p. ej., solución de tampón fosfato) para producir una savia infectada con virus que puede usarse en inoculaciones posteriores.
La construcción de virus de ARN de plantas para la introducción y expresión de secuencias de polinucleótidos exógenos no virales en plantas, se demuestra mediante las referencias anteriores, así como medianteDawson, W. O. et al., Virology (1989) 172: 285-292; Takamatsu et al. EMBO J. (1987) 6: 307-311; French et al. Science (1986) 231: 1294-1297; Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76; y patente de Estados Unidos No. 5.316.931.
Cuando el virus es un virus de ADN, pueden realizarse modificaciones adecuadas en el propio virus. Como alternativa, el virus puede clonarse primero en un plásmido bacteriano para facilitar la construcción del vector viral deseado con el ADN exógeno. A continuación, el virus puede extraerse del plásmido. Si el virus es un virus de ADN, al ADN viral se le puede unir un origen de replicación bacteriano, que, a continuación, es replicado por las bacterias. La transcripción y traducción de este ADN producirá la proteína de recubrimiento que encapsidará el ADN viral. Si el virus es un virus de ARN, el virus se clona generalmente como un ADNc y se inserta en un plásmido. A continuación, el plásmido se usa para fabricar todas las construcciones. El virus de ARN se produce a continuación transcribiendo la secuencia viral del plásmido y traduciendo los genes virales para producir una o más proteínas de recubrimiento que encapsidan el ARN viral.
En una realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta en el que se ha insertado la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento nativa que se ha delecionado de un polinucleótido viral, una secuencia codificante de la proteína de recubrimiento viral de una planta no nativa y un promotor no nativo, preferiblemente el promotor subgenómico de la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento no nativa, capaz de expresión en la planta huésped, empaquetar el polinucleótido viral de la planta recombinante y garantizar una infección sistémica del huésped mediante el polinucleótido viral de la planta recombinante. Como alternativa, el gen de la proteína de recubrimiento puede inactivarse por inserción de la secuencia de polinucleótidos no nativa en su interior, de modo que se produce una proteína. El polinucleótido viral de la planta recombinante puede contener uno o más promotores subgenómicos no nativos adicionales. Cada promotor subgenómico no nativo es capaz de transcribir o
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expresar genes adyacentes o secuencias de polinucleótidos en la planta huésped e incapaz de recombinarse entre sí ni con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de polinucleótidos (exógenas) no nativas pueden insertarse adyacentes al promotor subgenómico viral de la planta nativa o a los promotores subgenómicos virales de la planta nativa y no nativa si se incluye más de una secuencia de polinucleótidos. Las secuencias de polinucleótidos no nativas se transcriben o expresan en la planta huésped bajo el control del promotor subgenómico para producir los productos deseados.
En una segunda realización, al igual que en la primera realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante, salvo que la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento nativa se coloca adyacente a uno de los promotores sugbenómicos de la proteína de recubrimiento no nativa en lugar de a una secuencia codificante de la proteína de recubrimiento no nativa.
En una tercera realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante en el que el gen de la proteína de recubrimiento nativa es adyacente a su promotor subgenómico y uno o más promotores subgenómicos no nativos se han insertado en el polinucleótido viral. Los promotores subgenómicos no nativos insertados son capaces de transcribir o expresar genes adyacentes en una planta huésped e incapaces de recombinarse entre sí ni con promotores subgenómicos nativos. Las secuencias de polinucleótidos no nativas pueden insertarse adyacentes a los promotores virales de plantas subgenómicos no nativos de tal manera que las secuencias se transcriben o expresan en la planta huésped bajo el control de los promotores subgenómicos para producir el producto deseado.
En una cuarta realización, al igual que en la tercera realización, se proporciona un polinucleótido viral de planta recombinante, salvo que la secuencia codificante de la proteína de recubrimiento nativa se sustituye por una secuencia codificante de la proteína de recubrimiento no nativa.
Los vectores virales están encapsidados por las proteínas de recubrimiento codificadas por el polinucleótido viral de planta recombinante para producir un virus de planta recombinante. El polinucleótido viral de planta recombinante o virus de planta recombinante se usa para infectar plantas huésped apropiadas. El polinucleótido viral de planta recombinante puede replicarse en el huésped, propagarse sistémicamente en el huésped y transcribir o expresar uno o más genes ajenos (polinucleótido exógeno) en el huésped para producir la proteína deseada.
Técnicas para la inoculación de virus en plantas pueden encontrarse enFoster and Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998;Maramorosh and Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, Nueva York 1967-1984;Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984;Walkey, D.G.A. "Applied Plant Virology", Wiley, Nueva York, 1985; yKado and Agrawa, eds. "Principles and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand- Reinhold, Nueva York.
Además de lo anterior, el polinucleótido de la presente invención también puede introducirse en un genoma de cloroplasto mediante lo cual se posibilita la expresión en el cloroplasto.
Se conoce una técnica para introducir secuencias de polinucleótidos exógenas en el genoma de los cloroplastos. Esta técnica implica los siguientes procedimientos. En primer lugar, las células vegetales se tratan químicamente para reducir el número de cloroplastos por célula a aproximadamente uno. A continuación, se introduce el polinucleótido exógeno mediante bombardeo de partículas en las células con el objetivo de introducir al menos una molécula de polinucleótido exógeno en el cloroplasto. El polinucleótido exógeno se selecciona de modo que sea integrable en el genoma del cloroplasto mediante recombinación homóloga que es fácilmente efectuada por enzimas intrínsecas al cloroplasto. Con este fin, el polinucleótido exógeno incluye, además de un gen de interés, al menos un tramo polinucleotídico que se deriva del genoma del cloroplasto. Además, el polinucleótido exógeno incluye un marcador seleccionable, que desempeña procedimientos de selección secuenciales para confirmar que todas, o sustancialmente todas, las copias de los genomas del cloroplasto, después de dicha selección, incluirán el polinucleótido exógeno. Detalles adicionales con respecto a esta técnica se encuentran enlas Patentes de Estados Unidos No. 4.945.050; y5.693.507que se incorporan en la presente memoria como referencia. Un polipéptido puede, por lo tanto, producirse mediante el sistema de expresión de proteínas del cloroplasto y llegar a integrarse en la membrana interna del cloroplasto.
Dado que los procesos que aumentan el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta pueden implicar múltiples genes que actúan aditivamente o en sinergia (véase, por ejemplo, enQuesda et al., Plant Physiol. 130: 951-063, 2002), la presente invención también prevé expresar una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una sola planta huésped para conseguir, de este modo, un efecto superior sobre el contenido de aceite, el rendimiento, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno.
La expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una sola planta huésped puede efectuarse cointroduciendo múltiples construcciones de ácido nucleico, incluyendo cada una de ellas, un polinucleótido exógeno diferente, en una sola célula vegetal. La célula transformada puede regenerarse a continuación en una planta madura usando los métodos descritos anteriormente en la presente memoria.
Como alternativa, la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una sola planta huésped puede
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efectuarse cointroduciendo en una sola célula vegetal una sola construcción de ácido nucleico que incluya una pluralidad de polinucleótidos exógenos diferentes. Dicha construcción puede diseñarse con una única secuencia promotora que puede transcribir un ARN mensajero policistrónico que incluyen todas las diferentes secuencias de polinucleótidos exógenas. Para permitir la cotraducción de los diferentes polipéptidos codificados por el ARN mensajero policistrónico, las secuencias de polinucleótidos pueden están interconectadas mediante una secuencia de sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) que facilita la traducción de las secuencias de polinucleótidos situadas aguas abajo de la secuencia IRES. En este caso, una molécula de ARN policistrónico transcrita que codifica los diferentes polipéptidos descritos anteriormente se traducirá desde tanto el extremo 5' protegido y como las dos secuencias IRES internas de la molécula de ARN policistrónico para producir de este modo en la célula todos los polipéptidos diferentes. Como alternativa, la construcción puede incluir varias secuencias promotoras, cada una de ellas unida a una secuencia de polinucleótidos exógena diferente.
La célula vegetal transformada con la construcción que incluyen una pluralidad de polinucleótidos exógenos diferentes puede regenerarse a una planta madura, usando los métodos descritos anteriormente en la presente memoria.
Como alternativa, la expresión de una pluralidad de polinucleótidos exógenos en una sola planta huésped puede efectuarse introduciendo diferentes construcciones de ácido nucleico, que incluyen diferentes polinucleótidos exógenos, en una pluralidad de células vegetales. A continuación, las plantas transformadas regeneradas pueden cruzarse y la progenie resultante puede seleccionarse con respecto a rasgos superiores de tolerancia al estrés abiótico, crecimiento, biomasa, rendimiento, vigor y/o eficiencia de uso de nitrógeno, usando técnicas convencionales de cultivo de plantas.
Como se ha mencionado anteriormente, y se describe adicionalmente en el ejemplo 9 de la sección de ejemplos que sigue, los inventores de la presente invención han descubierto que la regulación negativa del nivel de expresión del producto del gen BDL127 (p. ej., los polinucleótidos expuestos mediante la SEQ ID NO:17 o 673; o el polipéptido expuesto mediante la SEQ ID NO:67) y/o de homólogos de los mismos se puede usar para aumentar el rendimiento (p. ej., rendimiento de semillas), el contenido de aceite, la biomasa, el ritmo de crecimiento, el vigor, la TEAB y/o la EUN en una planta.
En algunos casos, la sobreexpresión del polinucleótido exógeno dentro de la planta puede dar como resultado el silenciamiento del polinucleótido endógeno (que es homólogo del polinucleótido exógeno), probablemente a través de mecanismos de interferencia o de cosupresión de ARN. Para ensayar el efecto de la regulación negativa del o los polinucleótidos de la invención sobre el rasgo deseado de la planta (p. ej., rendimiento de planta, contenido de aceite, biomasa, vigor, TEAB o EUN), se pueden usar diversos métodos y agentes de regulación negativa.
La regulación negativa (silenciamiento génico) del producto de transcripción o de traducción de un gen endógeno tal como BDL127 puede conseguirse mediante métodos que son bien conocidos en la técnica, p. ej., cosupresión, supresión antisentido, interferencia de ARN y moléculas de polinucleótido de ribozima, cambiando la estructura del promotor, eliminación o creación de sitios de unión del factor de transcripción o expresión bajo diferentes promotores. Las directrices para efectuarlos se proporcionan a continuación.
Cosupresión (supresión sentido) - La inhibición del gen endógeno se puede conseguir por cosupresión, usando una molécula de ARN (o un vector de expresión que codifica la misma) que está en la orientación sentido con respecto a la dirección de transcripción del gen endógeno. El polinucleótido usado para la cosupresión puede corresponder a toda o a parte de la secuencia codificante del polipéptido endógeno y/o a toda o parte de la región no traducida 5' y/o 3' del transcrito endógeno; también puede ser un ARN no poliadenilado; un ARN que carece de una estructura protectora en 5'; o un ARN que contiene un intrón que no puede someterse a corte y empalme. En algunas realizaciones, el polinucleótido usado para la cosupresión está diseñado para eliminar el codón de inicio del polinucleótido endógeno de modo que no se traducirá ningún producto de proteína. Sin embargo, como con la supresión antisentido, la eficacia supresora mejora a medida que aumenta la especificidad de la hibridación, p. ej., a medida que se alarga la secuencia introducida, y/o aumenta la similitud de secuencia entre la secuencia introducida y el gen endógeno. Para más detalles, véase las patentes de Estados Unidos No. 20050172364y No.5.231.020que se incorporan en la presente memoria como referencia en su totalidad.
Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico intraducible, p. ej., una secuencia que comprende uno o más codones de terminación pre-maduros, o mutaciones sin sentido, tal como se describe enla patente de Estados Unidos 5.583.021.
Según algunas realizaciones de la invención, la regulación negativa del gen endógeno se realiza usando un vector de expresión de amplicón que comprende una secuencia derivada de virus de planta que contiene todo o parte del gen diana pero generalmente no todos los genes del virus nativo. Las secuencias virales presentes en el producto de transcripción del vector de expresión permiten que el producto de transcripción dirija su propia replicación. Los transcritos producidos por el amplicón pueden ser sentido o antisentido con respecto a la secuencia diana [véase, por ejemplo, Angell y Baulcombe, (1997) EMBO J. 16: 3675-3684; Angell y Baulcombe, (1999) Plant J. 20: 357-362, yla patente de Estados Unidos No. 6.646.805, cada una de las cuales se incorpora en la presente memoria como referencia].
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Según algunas realizaciones de la invención, el polinucleótido exógeno comprende una secuencia de ácido nucleico intraducible, p. ej., una secuencia que comprende uno o más codones de terminación pre-maduros, o mutaciones sin sentido, tal como se describe enla patente de Estados Unidos 5.583.021.
Supresión antisentido - La supresión antisentido puede realizarse usando un polinucleótido antisentido o un vector de expresión que está diseñado para expresar una molécula de ARN complementaria a todo o parte del ARN mensajero (ARNm) que codifica el polipéptido endógeno y/o a toda o parte de la región no traducida 5' y/o 3' del gen endógeno. La sobreexpresión de la molécula de ARN antisentido puede dar como resultado una expresión reducida del gen nativo (endógeno). El polinucleótido antisentido puede ser completamente complementario a la secuencia diana (es decir, 100 % idéntico al complemento de la secuencia diana) o parcialmente complementario a la secuencia diana (es decir, menos del 100 % idéntico, p. ej., menos del 90 %, menos que 80 % idéntico al complemento de la secuencia diana). La supresión antisentido puede usarse para inhibir la expresión de proteínas múltiples en la misma planta (véase, p.ej., la patente de Estados Unidos No. 5.942.657). Además, pueden usarse partes de los nucleótidos antisentido para interrumpir la expresión del gen diana. Generalmente, pueden usarse secuencias de al menos aproximadamente 50 nucleótidos, al menos aproximadamente 100 nucleótidos, al menos aproximadamente 200 nucleótidos, al menos aproximadamente 300, al menos aproximadamente 400, al menos aproximadamente 450, al menos aproximadamente 500, al menos aproximadamente 550 o más. Los métodos de uso de la supresión antisentido para inhibir la expresión de genes endógenos en plantas se describen, por ejemplo, en Liu, et al., (2002) Plant Physiol. 129: 1732-1743ylas patente de Estados Unidos No. 5.759.829y5.942.657, cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia. La eficacia de la supresión antisentido puede aumentarse incluyendo una región poli-dT en el casete de expresión en una posición 3' con respecto a la secuencia antisentido y 5' respecto a la señal de poliadenilación [véase, la publicación de patente de Estados Unidos No. 20020048814, incorporada en la presente memoria como referencia].
Interferencia de ARN - La interferencia de ARN puede conseguirse usando un polinucleótido que puede hibridar consigo mismo y formar un ARN bicatenario que tiene una estructura de tallo-bucle (también denominada estructura en horquilla) o usando dos polinucleótidos que forman un ARN bicatenario.
Para la interferencia de ARN en horquilla (ARNh), el vector de expresión está diseñado para expresar una molécula de ARN que hibrida consigo misma para formar una estructura en horquilla que comprende una región de bucle monocatenaria y un tallo con bases emparejadas.
En algunas realizaciones de la invención, la región del tallo con bases emparejadas de la molécula de ARNh determina la especificidad de la interferencia de ARN. En esta configuración, la secuencia sentido de la región del tallo con bases emparejadas puede corresponder a todo o parte del ARNm endógeno a regular negativamente, o a una parte de una secuencia promotora que controla la expresión del gen endógeno a inhibir; y la secuencia antisentido de la región del tallo con bases emparejadas es total o parcialmente complementaria a la secuencia sentido. Dichas moléculas de ARNh son altamente eficaces para inhibir la expresión de genes endógenos, de una manera que es heredada por generaciones posteriores de plantas [Véase, p. ej., Chuang y Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4985-4990; Stoutjesdijk, et al., (2002) Plant Physiol. 129: 1723-1731; yWaterhouse y Helliwell, (2003) Nat. Rev. Genet. 4: 29-38; Chuang y Meyerowitz, (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 4985-4990; Pandolfini et al., BMC Biotechnology 3: 7; Panstruga, et al., (2003) Mol. Biol. Rep. 30: 135-140; ypublicación de patente de Estados Unidos No. 2003/0175965; cada uno de los cuales se incorpora como referencia].
Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia sentido del tallo con bases emparejadas es de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 2.500 nucleótidos de longitud, p. ej., de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos, p. ej., de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos, p. ej., de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, p. ej., o de aproximadamente 25 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos.
Según algunas realizaciones de la invención, la secuencia antisentido del tallo con bases emparejadas puede tener una longitud que es más corta, igual o mayor que la longitud de la secuencia sentido correspondiente.
Según algunas realizaciones de la invención, la parte de bucle del ARNh puede ser de aproximadamente 10 nucleótidos a aproximadamente 500 nucleótidos de longitud, por ejemplo, de aproximadamente 15 nucleótidos a aproximadamente 100 nucleótidos, de aproximadamente 20 nucleótidos a aproximadamente 300 nucleótidos o de aproximadamente 25 nucleótidos a aproximadamente 400 nucleótidos de longitud.
Según algunas realizaciones de la invención, la parte de bucle del ARNh puede incluir un intrón (iARNh), que es capaz de someterse a corte y empalme en la célula huésped. El uso de un intrón minimiza el tamaño del bucle en la molécula de ARN en horquilla después del corte y empalme y, por lo tanto, aumenta la eficacia de la interferencia [Véase, por ejemplo, Smith, et al., (2000) Nature 407: 319-320; Wesley, et al., (2001) Plant J. 27: 581-590; Wang y Waterhouse, (2001) Curr. Opin. Plant Biol. 5: 146-150; Helliwell y Waterhouse, (2003) Methods 30: 289-295; Brummell, et al. (2003) Plant J. 33: 793-800; ypublicación de patente de Estados Unidos No. 2003/0180945; WO 98/53083;WO 99/32619;WO 98/36083; WO 99/53050;US 20040214330;US 20030180945;patente de Estados Unidos No. 5.034.323; patente de Estados Unidos No. 6.452.067;patente de Estados Unidos No. 6.777.588; patente de Estados Unidos No. 6.573.099 y patente de Estados Unidos No. 6.326.527; cada uno de los cuales se incorpora
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en la presente memoria como referencia].
En algunas realizaciones de la invención, la región de bucle del ARN en horquilla determina la especificidad de la interferencia de ARN respecto a su ARN endógeno diana. En esta configuración, la secuencia de bucle corresponde a todo o parte del ARN mensajero endógeno del gen diana. Véase, por ejemplo, WO 02/00904; Mette, et al., (2000) EMBO J 19: 5194-5201; Matzke, et al., (2001) Curr. Opin. Genet. Devel. 11: 221-227; Scheid, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci., USA 99: 13659-13662; Aufsaftz, et al., (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99(4): 16499-16506; Sijen, et al., Curr. Biol. (2001) 11: 436-440), cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia.
Para la interferencia de ARN bicatenario (ARNbc), las moléculas de ARN sentido y antisentido se pueden expresar en la misma célula a partir de un único vector de expresión (que comprende secuencias de ambas cadenas) o a partir de dos vectores de expresión (comprendiendo cada uno la secuencia de una de las cadenas). Los métodos para usar la interferencia de ARNbc para inhibir la expresión de genes vegetales endógenos se describen enWaterhouse, et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959-13964; y WO 99/49029, WO 99/53050, WO 99/61631, y WO 00/49035; cada uno de los cuales se incorpora en la presente memoria como referencia.
Según algunas realizaciones de la invención, la interferencia de ARN se efectúa usando un vector de expresión diseñado para expresar una molécula de ARN que se modela en un gen de micro ARN endógeno (miARN). Los microARN (miARN) son agentes reguladores que consisten en aproximadamente 22 ribonucleótidos y altamente eficientes para inhibir la expresión de genes endógenos [Javier, et al., (2003) Nature 425: 257-263]. El gen de miARN codifica un ARN que forma una estructura en horquilla que contiene una secuencia de 22 nucleótidos que es complementaria al gen diana endógeno.
Ribozima - las moléculas de ARN catalíticas, ribozimas, están diseñadas para escindir transcritos de ARNm particulares, evitando de este modo la expresión de sus polipéptidos codificados. Las ribozimas escinden ARNm en secuencias de reconocimiento específicas de sitio. Por ejemplo, las "ribozimas de cabeza de martillo" (véase, por ejemplo, la patente de Estados Unidos No. 5.254.678) escinden ARNm en ubicaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarios con el ARNm diana. El único requisito es que el ARN diana contenga una secuencia de nucleótidos 5'-UG-3'. Las secuencias de ribozimas de cabeza de martillo se pueden incrustar en un ARN estable tal como un ARN de transferencia (ARNt) para aumentar la eficacia de escisión in vivo [Perriman et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92(13): 6175-6179; de Feyter y Gaudron Methods in Molecular Biology, Vol. 74, Capítulo 43, "Expressing Ribozymes in Plants", Editado por Turner, P. C, Humana Press Inc., Totowa, N.J.; patente de Estados Unidos No. 6.423.885]. Las endorribonucleasas de ARN tales como las encontradas en Tetrahymena thermophila son también ribozimas útiles (patente de Estados Unidos No. 4.987.071).
Las líneas de plantas transformadas con cualquiera de las moléculas reguladoras negativamente descritas anteriormente se criban para identificar las que muestran la mayor inhibición del polinucleótido o polipéptido de interés endógeno y, de este modo, el aumento del rasgo de las plantas deseado (p. ej., rendimiento, contenido de aceite, ritmo de crecimiento, biomasa, vigor, EUN y/o TEAB).
Por lo tanto, la invención abarca plantas que expresan de forma exógena el o los polinucleótidos, las construcciones de ácido nucleico y/o el o los polipéptidos de la invención. Una vez expresado dentro de la célula vegetal o la planta completa, el nivel del polipéptido codificado por el polinucleótido exógeno puede determinarse mediante métodos bien conocidos en la técnica tales como ensayos de actividad, transferencias de Western usando anticuerpos capaces de unirse específicamente al polipéptido, ensayo inmunoadsorbente ligado a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, inmunofluorescencia y similares.
El nivel de una molécula de ARN de interés en la planta [p. ej., el ARN transcrito a partir del polinucleótido exógeno de la invención o el ARN endógeno que está dirigido por la molécula reguladora negativamente de la invención] puede determinarse usando métodos bien conocidos en la técnica tal como análisis de transferencia de Northern, análisis de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) (incluyendo RT-PCR cuantitativa, semicuantitativa o en tiempo real) e hibridación in situ de aRn.
El homólogo endógeno del polinucleótido o polipéptido exógeno de la invención, o un fragmento del homólogo endógeno (p. ej., intrones o regiones sin traducir) en la planta puede usarse como un marcador para selección asistida por marcador (MAS), en la que se usa un marcador para la selección indirecta de un determinante o determinantes genéticos de un rasgo de interés (p. ej., biomasa, ritmo de crecimiento, contenido de aceite, rendimiento, tolerancia al estrés abiótico y/o eficiencia de uso de nitrógeno). Estos genes (secuencia de ADN o ARN) pueden contener o estar ligados a sitios polimórficos o marcadores genéticos en el genoma, tales como polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP), microsatélites y polimorfismo de nucleótido único (SNP), huella genética de ADN (DFP), polimorfismo de longitud de fragmento amplificada (AFLP), polimorfismo de nivel de expresión, polimorfismo del polipéptido codificado y cualquier otro polimorfismo en la secuencia de ADN o ARN.
Los ejemplos de selecciones asistidas por marcador incluyen, pero no se limitan a, seleccionar un rasgo morfológico (p. ej., un gen que afecta a la forma, coloración, esterilidad masculina o resistencia tal como la presencia o ausencia de arista, coloración de la vaina foliar, altura, color del grano, aroma de arroz); selección para un rasgo bioquímico (p. ej., un gen que codifica una proteína que se puede extraer y observar, por ejemplo, isozimas y proteínas de
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almacenamiento); selección para un rasgo biológico (p. ej., razas de patógenos o biotipos de insectos basados en el patógeno del huésped, o la interacción del parásito con el huésped se puede usar como un marcador, dado que la constitución genética de un organismo puede afectar a su susceptibilidad a patógenos o parásitos).
Los polinucleótidos y polipéptidos descritos anteriormente en la presente memoria pueden usarse en una amplia gama de plantas económicas, de manera segura y rentable.
Las líneas de plantas que expresan de forma exógena el polinucleótido o el polipéptido de la invención se criban para identificar aquellas que muestran el mayor aumento del rasgo de la planta deseado.
El efecto del transgén (el polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido de la invención) o la molécula de regulación negativa (p.ej., molécula de interferencia de ARN) sobre la tolerancia al estrés abiótico se puede determinar usando métodos conocidos.
Tolerancia al estrés abiótico - Plantas transformadas (es decir, que expresan el transgén) y no transformadas (de tipo silvestre) se exponen a una condición de estrés abiótico, tal como privación de agua, temperatura subóptima (baja temperatura, alta temperatura), déficit de nutrientes, exceso de nutrientes, una condición de estrés salino, estrés osmótico, toxicidad por metales pesados, anaerobiosis, contaminación atmosférica e irradiación por UV.
Ensayo de tolerancia a la salinidad - Se espera que las plantas transgénicas con tolerancia a altas concentraciones de sal presenten mejor germinación, vigor o crecimiento de las semillas en condiciones con alto contenido en sal. El estrés salino puede efectuarse de muchas maneras, tales como, por ejemplo, regando las plantas con una solución híperosmótica, cultivando las plantas hidropónicamente en una solución de cultivo híperosmótica (p. ej., solución de Hoagland) o cultivando las plantas en un medio de cultivo híperosmótico [p. ej., medio Murashige-Skoog (medio MS) al 50 %]. Dado que las diferentes plantas varían considerablemente en cuanto a su tolerancia con respecto a la salinidad, la concentración salina en el agua de riego, en la solución de cultivo o en el medio de cultivo, pueden ajustarse según las características específicas de la variedad de cultivo o variedad específica de una planta, para causar un efecto leve o moderado sobre la fisiología y/o morfología de las plantas (para una orientación sobre la concentración apropiada véase,Bernstein y Kafkafi, Root Growth Under Salinity Stress In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A and Kafkafi U. (editores) Marcel Dekker Inc., Nueva York, 2002, y referencias en su interior).
Por ejemplo, puede realizarse un ensayo de tolerancia a la salinidad regando plantas en diferentes fases de desarrollo con concentraciones en aumento de cloruro de sodio (por ejemplo, NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM) aplicadas desde abajo y desde arriba para garantizar la dispersión homogénea de la sal. Después de la exposición a la condición de estrés, las plantas se monitorizan frecuentemente hasta que aparecen efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales en las plantas de tipo silvestre. Por lo tanto, el aspecto fenotípico externo, el grado de marchitamiento y el éxito global en alcanzar la madurez y producir descendencia se comparan entre las plantas de control y las transgénicas. Los parámetros cuantitativos de tolerancia medidos incluyen, pero no se limitan a, humedad promedio y peso seco, el peso de las semillas producidas, el tamaño promedio de la semilla y el número de semillas producidas por planta. Las plantas transformadas que no exhiben efectos fisiológicos y/o morfológicos sustanciales, o que exhiben mayor biomasa en comparación con las plantas de tipo silvestre, se identifican como plantas tolerantes al estrés abiótico.
Ensayo de tolerancia osmótica - Se realizan ensayos de estrés osmótico (que incluyen análisis de cloruro de sodio y manitol) para determinar si un fenotipo de estrés osmótico era específico del cloruro de sodio o si era un fenotipo relacionado con el estrés osmótico general. Las plantas que son tolerantes al estrés osmótico pueden tener más tolerancia a la sequía y/o la congelación. Para experimentos de germinación con estrés salino y osmótico, el medio se suplementa, por ejemplo, con NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM o NaCl 100 mM, 200 mM, manitol 400 mM.
Ensayo de tolerancia a la sequía/ensayo osmótico - La tolerancia a la sequía se realiza para identificar los genes que confieren una mejor supervivencia de la planta después de la privación aguda de agua. Para analizar si las plantas transgénicas son más tolerantes a la sequía, se realiza un estrés osmótico producido por la presencia de sorbitol o polietilenglicol (PEG 8000) en el medio. Las plantas de control y transgénicas se hacen germinar y se cultivan en placas de agar para plantas durante 10 días, después de lo cual se transfieren a placas que contienen 1,5 % de PEG8000 o 500 mM de sorbitol. Las plantas se cultivan durante aproximadamente 10 días adicionales. El tratamiento causa un retraso en el crecimiento, a continuación, se comparan tanto las plantas de control como las transgénicas, midiendo el peso de la planta (fresco y seco), el rendimiento y los ritmos de crecimiento.
Por el contrario, se realizan exploraciones de sequía basadas en suelo con plantas que sobreexpresan los polinucleótidos detallados anteriormente. Las semillas de plantas de control de Arabidopsis, o de otras plantas transgénicas que sobreexpresan el polipéptido de la invención germinan y se transfieren a macetas. El estrés por sequía se obtiene después de parar de regar, acompañado por la colocación de las macetas sobre papel absorbente para potenciar la tasa de secado del suelo. Las plantas transgénicas y de control se comparan entre sí cuando la mayoría de las plantas de control desarrollan marchitamiento severo. Las plantas vuelven a regarse después de obtener una fracción significativa de plantas de control que presentan un marchitamiento severo. Las plantas se clasifican comparando los controles para cada uno de dos criterios: tolerancia a las condiciones de sequía y
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recuperación (supervivencia) después de volver a regar.
Tolerancia al estrés por frío - Para analizar el estrés por frío, plantas maduras (25 días de edad) se transfirieren a cámaras a 4 °C durante 1 o 2 semanas, con luz constitutiva. Después las plantas se vuelven a llevar al invernadero. Dos semanas después, se comparan los daños del periodo de enfriamiento, resultantes del retraso del crecimiento y otros fenotipos, entre las plantas de control y las transgénicas, midiendo el peso de la planta (húmedo y seco), y comparando los ritmos de crecimiento medidos como tiempo de floración, tamaño de la planta, rendimiento y similares.
Tolerancia al estrés por calor - La tolerancia al estrés por calor se consigue exponiendo las plantas a temperaturas por encima de 34 °C durante un periodo de tiempo determinado. La tolerancia de la planta se examina después de transferir las plantas de nuevo a 22 °C para su recuperación y evaluación después de 5 días con respecto a controles internos (plantas no transgénicas) o plantas no expuestas ni a estrés por frío ni a estrés por calor.
Ensayos de germinación -Los ensayos de germinación comparan el porcentaje de semillas de plantas transgénicas que podrían completar el proceso de germinación con el porcentaje de semillas de plantas de control que se tratan de la misma manera. Se consideran condiciones normales, por ejemplo, incubaciones a 22 °C en ciclos diarios de 22 horas de luz, 2 horas de oscuridad. La evaluación de la germinación y el vigor de las plántulas se lleva a cabo entre 4 y 14 días después de la siembra. El medio basal es medio MS al 50 % (Murashige y Skoog, 1962 Plant Physiology 15, 473-497).
La germinación se verifica también en condiciones desfavorables, tales como frío (incubando a temperaturas inferiores a 10 °C en lugar de 22 °C) o usando soluciones de inhibición de semillas que contienen altas concentraciones de un osmolito tal como sorbitol (a concentraciones de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM y hasta 1000 mM) o aplicando concentraciones crecientes de sal (NaCl 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM).
El efecto del transgén (el polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido de la invención) o la molécula de regulación negativa (p.ej., molécula de interferencia de ARN) sobre la eficiencia de uso de nitrógeno se puede determinar usando métodos conocidos.
Ensayo de eficiencia de uso de nitrógeno usando plántulas - En resumen, las plantas transgénicas que se cultivan durante 7-10 días en 0,5 x MS [Murashige-Skoog] suplementado con un agente de selección se transfieren a dos condiciones de fertilización con nitrógeno: medio MS en el que la concentración de nitrógeno combinada (NH4NO3 y KNO3) fue 0,75 mM (deficiencia de nitrógeno). Habitualmente, 20 plantas seleccionadas al azar de cada evento de un gen se transfieren a los medios. Las plantas se dejan crecer por 10 días adicionales. Al final de los 10 días, las plantas se retiran de la placa y se pesan inmediatamente (peso fresco) y a continuación se secan durante 24 y se vuelven a pesar (peso seco para análisis estadísticos posteriores). Las plantas transgénicas se comparan con plantas de control cultivadas en paralelo en las mismas condiciones. Las plantas transgénicas simuladas usadas como control pueden ser aquellas plantas transgénicas que expresan el gen indicador uidA (GUS) bajo el mismo promotor o plantas transgénicas que albergan sólo el mismo promotor pero que carecen de cualquier gen indicador.
Concentración de proteína en el grano - El contenido de proteína en el grano (g de proteína en el grano m-2) se estima como el producto de la masa de grano N (g de grano N m-2) multiplicado por la relación de conversión N/proteína de k-5,13 (Mosse 1990, anteriormente). La concentración de proteína en el grano se estima como la proporción de contenido de proteína en el grano por unidad de masa del grano (g proteína en el grano kg-1 grano).
El efecto del transgén (el polinucleótido exógeno que codifica el polipéptido de la invención) o la molécula de regulación negativa (p.ej., molécula de interferencia de ARN) sobre el vigor de la planta, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el rendimiento y/o el contenido de aceite se puede determinar usando métodos conocidos.
Vigor de la planta - El vigor de la planta puede calcularse mediante el aumento de los parámetros de crecimiento tales como el área foliar, la longitud de la fibra, el diámetro de la roseta, el peso fresco de la planta y similares, por tiempo.
Ritmo de crecimiento - el ritmo de crecimiento puede medirse usando el análisis digital de plantas en crecimiento. Por ejemplo, las imágenes de plantas que crecen en invernadero sobre la base de la parcela se pueden capturar cada 3 días y el área de la roseta se puede calcular mediante análisis digital. El crecimiento del área de la roseta se calcula usando la diferencia del área de la roseta entre los días de muestreo dividida por la diferencia en días entre las muestras.
La evaluación del ritmo de crecimiento puede realizarse midiendo la biomasa producida, el área de la roseta, el tamaño de la hoja o la longitud de la raíz por tiempo (puede medirse en cm2 por día de área foliar).
El área de crecimiento relativo puede calcularse usando la fórmula I.
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Fórmula I:
Ritmo de crecimiento relativo del área = (A Área / At) x (1/ Área tO)
At es el actual día de imagen analizado al que se le resta el día inicial (t-t0).
Por lo tanto, el ritmo de crecimiento relativo del área está en unidades de 1/día y el ritmo de crecimiento en longitud está en unidades de 1/día.
Rendimiento de semillas- la evaluación del rendimiento de semillas por planta se puede realizar midiendo la cuantía (peso o tamaño) o la cantidad (es decir, número) de semillas secas producidas y cosechadas a partir de 8-16 plantas y divididas por el número de plantas.
Por ejemplo, las semillas totales de 8-16 plantas se pueden recoger, pesar usando, p. ej., una balanza analítica y el peso total se puede dividir por el número de plantas. El rendimiento de semillas por área de cultivo puede calcularse de la misma manera, teniendo en cuenta el área de cultivo otorgada a una sola planta. Se podría conseguir aumentar el rendimiento de semillas por área de cultivo aumentando el rendimiento de semillas por planta, y/o aumentando el número de plantas capaces de crecer en un área determinada.
Además, el rendimiento de semillas se puede determinar mediante el peso de 1000 semillas. El peso de 1000 semillas se puede determinar de la siguiente manera: las semillas se dispersan en una bandeja de vidrio y se toma una fotografía. Cada muestra se pesa y, a continuación, usando el análisis digital, se calcula el número de semillas en cada muestra.
El peso de 1000 semillas se puede calcular usando la fórmula II:
Fórmula II:
Peso de 1000 semillas = número de semillas en la muestra/peso de la muestra x 1000 El índice de cosecha se puede calcular usando la fórmula III Fórmula III:
índice de cosecha = rendimiento de semillas promedio por planta/peso seco promedio
Longitud de la fibra - la longitud de la fibra se puede medir con fibrografía. El sistema de fibrografía se usó para calcular la longitud en términos de la longitud "media de la mitad superior". La media de la mitad superior (UHM) es la longitud promedio de la mitad más larga de la distribución de la fibra. El fibrograma mide la longitud en longitudes de tramo en un punto porcentual dado (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) cottoninc (.) com/ClassificationofCotton/?Pg=4#Length).
Contenido de aceite - El contenido de aceite de una planta se puede determinar mediante la extracción del aceite de la semilla o la parte vegetativa de la planta. En resumen, los lípidos (aceite) se pueden eliminar de la planta (p. ej., semilla) moliendo el tejido vegetal en presencia de disolventes específicos (p. ej., hexano o éter de petróleo) y extrayendo el aceite en un extractor continuo. El análisis del contenido de aceite indirecto se puede llevar a cabo usando diversos métodos conocidos tales como Espectroscopía de Resonancia Magnética Nuclear (RMN), que mide la energía de resonancia absorbida por átomos de hidrógeno en el estado líquido de la muestra [Véase, por ejemplo,Conway TF. y Earle FR., 1963, Journal of the American Oil Chemists' Society; Springer Berlín / Heidelberg, iSsN: 0003-021X (Imprimir) 1558-9331 (En línea)]; la Espectroscopía de Infrarrojo Cercano (IC), que utiliza la absorción de energía infrarroja cercana (1100-2500 nm) por la muestra; y un método descrito en el documentoWO/2001/023884, que se basa en extraer un disolvente de aceite, evaporar el disolvente en una corriente de gas que forma partículas de aceite y dirigir una luz a la corriente de gas y partículas de aceite que forman una luz reflejada detectable.
Por lo tanto, la presente invención es de alto valor agrícola para promover el rendimiento de cultivos comercialmente deseados (p. ej., biomasa de órgano vegetativo tal como madera de álamo u órgano reproductivo tal como número de semillas o biomasa de semillas).
Cualquiera de las plantas transgénicas descritas anteriormente en la presente memoria o partes de las mismas se pueden procesar para producir una preparación de pienso, harina, proteínas o aceite, tal como para animales rumiantes.
Las plantas transgénicas descritas anteriormente en la presente memoria, que exhiben un contenido de aceite aumentado, pueden usarse para producir aceite vegetal (extrayendo el aceite de la planta).
El aceite vegetal (que incluye el aceite de la semilla y/o el aceite de la parte vegetativa) producido según el método de la invención se puede combinar con una variedad de otros ingredientes. Los ingredientes específicos incluidos en un producto se determinan según el uso previsto. Los productos ejemplares incluyen pienso para animales, materia
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prima para modificación química, plástico biodegradable, producto alimenticio mezclado, aceite comestible, biocombustible, aceite de cocina, lubricante, biodiesel, aperitivo, cosméticos y materia prima del proceso de fermentación. Los productos ejemplares que se incorporarán al aceite vegetal incluyen alimentos para animales, productos alimenticios humanos como aperitivos extruidos, panes, como agente aglutinante de alimentos, alimentos acuícolas, mezclas fermentables, suplementos alimenticios, bebidas deportivas, barritas alimenticias nutricionales, suplementos multivitamínicos, bebidas dietéticas y cereales.
Según algunas realizaciones de la invención, el aceite comprende un aceite de semilla.
Según algunas realizaciones de la invención, el aceite comprende un aceite de parte vegetativa.
Según algunas realizaciones de la invención, la célula vegetal forma una parte de una planta.
Como se usa en esta memoria, el término "aproximadamente" se refiere a ± 10 %.
Los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "que tiene" y sus conjugados significan "que incluyen pero no se limitan a".
El término "que consiste en" significa "que incluye y se limita a".
El término "consiste esencialmente en" significa que la composición, el método o la estructura pueden incluir ingredientes, etapas y/o partes adicionales, pero sólo si los ingredientes, etapas y/o partes adicionales no alteran materialmente las características básicas y novedosas de la composición, método o estructura reivindicada.
Como se usa en esta memoria, las formas singulares "un", "una" y "el/la" incluyen referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, la expresión "un compuesto" o "al menos un compuesto" puede incluir una pluralidad de compuestos, incluyendo mezclas de los mismos.
En toda esta solicitud, se pueden presentar diversas realizaciones de esta invención en un formato de intervalo. Debe entenderse que la descripción en formato de intervalo es simplemente por conveniencia y brevedad y no debe interpretarse como una limitación inflexible del alcance de la invención. Por consiguiente, debe considerarse que la descripción de un intervalo ha descrito específicamente todos los posibles subintervalos así como los valores numéricos individuales dentro de ese intervalo. Por ejemplo, debe considerarse que la descripción de un intervalo como de 1 a 6 ha descrito específicamente subintervalos tales como de 1 a 3, de 1 a 4, de 1 a 5, de 2 a 4, de 2 a 6, de 3 a 6, etc., así como números individuales dentro de ese intervalo, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5 y 6. Esto se aplica independientemente de la amplitud del intervalo.
Siempre que se indique un intervalo numérico en esta memoria, se pretende que incluya cualquier número citado (fraccional o número entero) dentro del intervalo indicado. Las frases "que varía/varía entre" un primer número indicado y un segundo número indicado y "que varía/varía entre" un primer número indicado "y" un segundo número indicado se usan indistintamente y pretenden incluir los primer y segundo números indicados y todos los números fraccionarios y enteros entre ellos.
Como se usa en esta memoria, el término "método" se refiere a maneras, medios, técnicas y procedimientos para llevar a cabo una tarea determinada incluyendo, pero sin limitase a, maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos, o fácilmente desarrollados a partir de maneras, medios, técnicas y procedimientos conocidos por parte de profesionales de las artes química, farmacológica, biológica, bioquímica y médica.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que, por claridad, se describen en el contexto de realizaciones independientes, también pueden proporcionarse en combinación en una única realización. Por el contrario, varias características de la invención, que, por brevedad, se describen en el contexto de una sola realización, también se pueden proporcionar por separado o en cualquier subcombinación adecuada o como es adecuado en cualquier otra realización descrita de la invención. Ciertas características descritas en el contexto de diversas realizaciones no deben considerarse características esenciales de esas realizaciones, a menos que la realización sea inoperante sin esos elementos.
Diversas realizaciones y aspectos de la presente invención tal como se perfilaron anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación encuentran apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y/o científicos usados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece la invención. Aunque los métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en este documento pueden usarse en la puesta en práctica o el ensayo de las realizaciones de la invención, métodos y/o materiales ejemplares se describen a continuación. En caso de conflicto, la memoria descriptiva de patente, incluidas las definiciones, regirá. Además, los materiales, métodos y ejemplos son solo ilustrativos y no pretenden ser necesariamente limitantes.
Ejemplos
Ahora, se hace referencia a los siguientes ejemplos, que junto con las descripciones anteriores ilustran algunas realizaciones de la invención de un modo no limitante.
Generalmente, la nomenclatura usada en la presente memoria y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención, incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994);Ausubel 5 et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989);Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, Nueva York (1988);Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, Nueva York;Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se exponen enlas patentes de Estados Unidos No. 4.666.828;4.683.202;4.801.531;5.192.659y5.272.057; "Cell Biology: A Laboratory Handbook", 10 Volúmenes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volúmenes I-III Coligan J. E., ed.
(1994);Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology" (8a edición), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994);Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., Nueva York (1980); inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la bibliografía de patentes y científica, véase, por ejemplo,las patentes de Estados Unidos No.
15 3.791.932;3.839.153;3.850.752;3.850.578;3.853.987;3.867.517;3.879.262;3.901.654;3.935.074;3.984.533;3.996.345
;4.034.074;4.098.876;4.879.219;5.011.771and5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., and Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., and Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984) y "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, 20 Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990);Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996); todos los cuales se incorporan por referencia como si estuvieran completamente expuestos en la presente memoria. Otras referencias generales se proporcionan a lo largo de este documento. Se cree que los procedimientos en el mismo son bien conocidos en la técnica y se proporcionan para la comodidad del lector. Toda 25 la información contenida en este documento se incorpora en la presente memoria como referencia.
Ejemplo 1
Identificación de genes y predicción del papel de los genes usando herramientas bioinformáticas
Los inventores de la presente invención han identificado polinucleótidos que pueden aumentar el rendimiento de la planta, el rendimiento de semillas, el rendimiento de aceite, el contenido de aceite, la biomasa, el ritmo de 30 crecimiento, la tolerancia al estrés abiótico, la eficiencia de uso de nitrógeno y/o el vigor de una planta, de la siguiente manera.
Los conjuntos de datos de secuencias de nucleótidos usados aquí fueron de bases de datos disponibles públicamente o de secuencias obtenidas usando la tecnología Solexa (p. ej., cebada y sorgo). Se introdujeron datos de secuencias de 100 especies de plantas diferentes en una única base de datos integral. También se incorporó otra 35 información sobre expresión génica, anotación de proteínas, enzimas y rutas. Las principales bases de datos usadas incluyen:
Genomas
Genoma de Arabidopsis [genotipo TAIR, versión 6 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) arabidopsis (.) org/)];
40 Genoma de arroz [IRGSP versión 4.0 (Hypertext Transfer Protocol://rgp (.) dna (.) affrc (.) go (.) jp/IRGSP/)];
Álamo [Populus trichocarpa versión 1.1 de JGI (versión de ensamblaje v1.0) (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) genome (.) jgi-psf (.) org/)];
Brachypodium [JGI 4x ensamblaje, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) brachpodium (.) org)];
Soja [DOE-JGI SCP, versión Glyma0 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) phytozome (.) net/)];
45 Uva [Consorcio público franco-italiano para la caracterización del genoma de la vid Genoma de la vid (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (.) genoscope (.) cns (.)fr/)];
Semilla de ricino [TIGR/J Craig Venter Institute 4x ensamblaje [(Hypertext Transfer Protocol:// msc (.) jcvi (.) org/r_communis];
Sorgo [DOE-JGI SCP, versión Sbi1 [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) phytozome (.) net/)];
50 Genoma de Maíz parcialmente ensamblado [Hypertext Transfer Protocol://maizesequence (.) org/];
Las secuencias expresadas de EST y ARNm se extrajeron de las siguientes bases de datos:
Versiones de GenBank 154, 157, 160, 161, 164, 165, 166 y 168 (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov/dbEST/);
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RefSeq (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov/RefSeq/);
TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) arabidopsis (.) org/);
Bases de datos de proteínas y rutas
Uniprot [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) uniprot (.) org/].
AraCyc [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) arabidopsis (.) org/biocyc/index (.) jsp].
ENZYME [Hypertext Transfer Protocol://expasy (.) org/enzyme/].
Los conjuntos de datos de micromatrices se descargaron de:
GEO (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) TAIR (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web.arabidopsis.org/).
Datos de micromatrices patentados de Evogene (véase el documento WO2008/122980 de Evogeney el ejemplo 3 a continuación.
Información de QTL y SNP
Gramene [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) gramene (.) org/qtl/].
Panzea [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) panzea (.) org/index (.) html].
Ensamblaje de bases de datos- se realizó para construir una base de datos amplia, rica, fiable, anotada y fácil de analizar que comprendía datos de dominio público de secuencias de ARNm genómico, EST y ADN, de diversos cultivos así como datos de expresión de genes, anotación de proteínas y rutas, QTL, y otra información relevante.
El ensamblaje de bases de datos comprendía una aplicación de herramientas de refinamiento de genes, estructuración, anotación y análisis que permitía construir una base de datos a medida para cada proyecto de descubrimiento génico. Las herramientas del refinamiento y estructuración de genes permiten detectar, de manera fiable, variantes de corte y empalme y transcritos antisentido, generando el entendimiento de los posibles diversos resultados fenotípicos de un solo gen. Las capacidades de la plataforma “LEADS” de Compugen LTD para analizar el genoma humano han sido confirmadas y aceptadas por la comunidad científica [véase p. ej., "Widespread Antisense Transcription", Yelin, et al. (2003) Nature Biotechnology 21, 379-85; "Splicing of Alu Sequences", Lev- Maor, et al. (2003) Science 300 (5623), 1288-91; "Computational analysis of alternative splicing using EST tissue information", Xie H et al. Genomics 2002], y también han demostrado se las más eficientes en genómica de plantas.
Agrupamiento de EST y ensamblaje de genes- Para agrupar y ensamblar genes de organismos con datos disponibles de secuencia del genoma (arabidopsis, arroz, ricino, uva, brachypodium, álamo, soja, sorgo), se empleó la versión genómica LEADS (GANG). Esta herramienta permite la agrupación más precisa de secuencias de eSt y de ARNm en el genoma, y predice la estructura del gen, así como los eventos de corte y empalme alternativos y la transcripción antisentido.
Para los organismos que no tienen datos completos disponibles sobre la secuencia del genoma, se aplicó el software de agrupamiento "LEADS expresado".
Anotación de genes- los genes y las proteínas previstos se anotaron de la siguiente manera:
Se realizó una búsqueda con Blast [Hypertext Transfer Protocol://blast (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov /Blast (.) cgi] contra todas las secuencias UniProt de plantas [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) uniprot (.) org/]. Se analizaron los marcos de lectura abiertos de cada transcripción supuesta y se seleccionó el ORF más largo con un número mayor de homólogos como la proteína predicha del transcrito. Las proteínas predichas fueron analizadas por InterPro [Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (.) ebi (.) ac (.) uk/interpro/].
Se usó Blast contra las proteínas de las bases de datos AraCyc y ENZYME para mapear los transcritos predichos para las rutas AraCyc.
Las proteínas predichas de diferentes especies se compararon usando el algoritmo blast [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) ncbi (.) nlm (.) nih (.) gov /Blast (.) cgi] para validar la precisión de la secuencia proteica predicha, y para la detección eficiente de ortólogos.
Perfiles de expresión génica- Se aprovecharon varias fuentes de datos para el perfil de expresión génica, que combinó los datos de micromatrices y el perfil de expresión digital (véase a continuación). Según el perfil de expresión génica, se realizó un análisis de correlación para identificar genes que están co-regulados en diferentes fases del desarrollo y condiciones ambientales y que están asociados con diferentes fenotipos.
Los conjuntos de datos de micromatrices disponibles públicamente se descargaron de los sitios TAIR y NCBI GEO, se renormalizaron y se integraron en la base de datos. El perfil de expresión es uno de los datos de recursos más
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importantes para identificar genes importantes para el rendimiento.
Se recopiló un resumen de perfil de expresión digital para cada grupo según todas las palabras clave incluidas en los registros de secuencias que comprendían el grupo. La expresión digital, también conocida como transferencia de Northern electrónica, es una herramienta que muestra un perfil de expresión virtual basado en las secuencias EST que forman el grupo génico. La herramienta puede proporcionar el perfil de expresión de un grupo en cuanto a la anatomía de la planta (p. Ej., el tejido/órganos en los que se expresa el gen), fase de desarrollo (las fases de desarrollo en las que puede encontrarse un gen) y perfil de tratamiento (que proporciona las condiciones fisiológicas en las que se expresa un gen, tales como sequía, frío, infección por patógenos, etc.). Dada una distribución al azar de las EST en los diferentes grupos, la expresión digital proporciona un valor de probabilidad que describe la probabilidad de que un grupo que tiene un total de N EST contenga X EST de una determinada colección de bibliotecas. Para efectuar los cálculos de probabilidad se tiene en cuenta: a) el número de EST en el grupo, b) el número de un EST de las bibliotecas implicadas y relacionadas, c) el número total de EST disponibles que representan las especies. Por lo tanto, los grupos con valores de baja probabilidad están enormemente enriquecidos con EST del grupo de bibliotecas de interés indicando una expresión especializada.
Recientemente, la precisión de este sistema fue demostrada por Portnoy et al., 2009 (Analysis Of The Melon Fruit Transcriptome Based On 454 Pyrosequencing) en: Plant & Animal Genomes XVII Conference, San Diego, CA. El análisis transcriptómico, basado en la abundancia relativa de EST en los datos, se realizó mediante pirosecuenciación 454 de ADNc que representa el ARNm del fruto de melón. Se secuenciaron catorce muestras de ADNc bicatenario obtenidas a partir de dos genotipos, dos tejidos de fruto (carne y corteza) y cuatro fases del desarrollo. La pirosecuenciación GS FLX (Roche/454 Life Sciences) de muestras de ADNc no normalizadas y purificadas produjo 1.150.657 marcas de secuencia expresada que se ensamblaron en 67.477 unigenes (32.357 elementos aislados y 35.120 cóntigos.). El análisis de los datos obtenidos contra la base de datos de Cucurbit Genomics [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) icugi (.) org/] confirmó la precisión de la secuencia y el ensamblaje. Los patrones de expresión de genes seleccionados encajaban bien con sus datos de qRT-PCR.
Los conceptos de ortología y paralogía se han aplicado recientemente a las caracterizaciones y clasificaciones funcionales en la escala de las comparaciones del genoma completo. Los ortólogos y parálogos constituyen dos tipos principales de homólogos: los primeros evolucionaron desde un ancestro común por especialización, y los últimos se relacionaron mediante eventos de duplicación. Se supone que es probable que los parálogos que surgen de los antiguos eventos de duplicación hayan divergido en su función, mientras que es más probable que los verdaderos ortólogos conserven una función idéntica durante el tiempo evolutivo.
Para identificar supuestos ortólogos de los genes que afectan al rendimiento de la planta, el rendimiento de aceite, el contenido de aceite, el rendimiento de semillas, el ritmo de crecimiento, el vigor, la biomasa, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno, todas las secuencias se alinearon usando BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, herramienta básica de búsqueda de alineamiento local). Las secuencias suficientemente similares fueron agrupadas provisionalmente. Estos supuestos ortólogos se organizaron adicionalmente bajo un filograma - un diagrama de ramificación (árbol) que se supone que es una representación de las relaciones evolutivas entre los taxones biológicos. Los supuestos grupos ortólogos fueron analizados en cuanto a su acuerdo con el filograma y en los casos de desacuerdos estos grupos ortólogos se rompieron en consecuencia. Los datos de expresión se analizaron y las bibliotecas EST se clasificaron usando un vocabulario fijo de términos personalizados tales como fases del desarrollo (p. ej., genes que muestran un perfil de expresión similar a lo largo del desarrollo con regulación positiva en una fase específica, tal como en la fase de llenado de semillas) y/u órgano de la planta (p. ej., genes que muestran un perfil de expresión similar en sus órganos con regulación positiva en órganos específicos, tales como la semilla). Las anotaciones de todas las EST agrupadas en un gen se analizaron estadísticamente comparando su frecuencia en el grupo frente a su abundancia en la base de datos, permitiendo la construcción de un perfil de expresión numérico y gráfico de ese gen, que se denomina "expresión digital". La razón de usar estos dos métodos complementarios con los métodos de estudios de asociación fenotípica de QTL, SNP y la correlación de expresión fenotípica se basa en la suposición de que es probable que los ortólogos verdaderos conserven una función idéntica a lo largo del tiempo evolutivo. Estos métodos proporcionan diferentes conjuntos de indicaciones sobre las similitudes de funciones entre dos genes homólogos, similitudes en el nivel de la secuencia, aminoácidos idénticos en los dominios de proteínas y similitud en los perfiles de expresión.
En general, se identificaron 50 genes que tenían un gran impacto en el rendimiento de la planta, el rendimiento de semillas, el rendimiento de aceite, el contenido de aceite, la biomasa, el ritmo de crecimiento, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico (TEAB) y/o eficiencia de uso de nitrógeno (EUN) cuando se expresan en una planta. Los genes identificados, sus secuencias de polinucleótidos y de polipéptidos seleccionadas, así como sus secuencias actualizadas de acuerdo con la base de datos de Genbank se proporcionan en la tabla 1, a continuación, en esta memoria.
Tabla 1
Polinucleótidos identificados que afectan al rendimiento de la planta, el rendimiento de semillas, el rendimiento de aceite, el contenido de aceite, la biomasa, el ritmo de crecimiento, el vigor, la tolerancia al estrés abiótico y/o la eficiencia de uso de nitrógeno de una planta
Nombre del gen
Nombre del grupo Organismo SEQ ID NO del polinucleótido: SEQ ID NO del polipéptido:
BDL100
rice|p;b157.2|BI812936 arroz 1 51
BDL100
1 723
BDL106
canola|gb161|DY020650 canola 2 52
BDL106
724 52
BDL108
canola|gb161|CD818601 canola 3 53
BDL108
725 742
BDL108
726 743
BDL110
canola|gb161|CD814521 canola 4 54
BDL110
727 744
BDL110
728 745
BDL111
canola|gb161|CN829852 canola 5 55
BDL111
729 746
BDL111
730 747
BDL112
arabidopsis|gb165|AT3G23510 arabidopsis 6 56
BDL113
arabidopsis|gb165|AT2G45310 arabidopsis 7 57
BDL114
arabidopsis|gb165|AT5G27820 arabidopsis 8 58
BDL115
arabidopsis|gb165|AT4G11090 arabidopsis 9 59
BDL116
arabidopsis|gb165|AT4G24175 arabidopsis 10 60
BDL119
arabidopsis|gb165|AT3G47965 arabidopsis 11 61
BDL119
731 748
BDL120
arabidopsis|gb165|AT3G03230 arabidopsis 12 62
BDL120
732 749
BDL122
arabidopsis|gb165|AT3G49000 arabidopsis 13 63
BDL123
arabidopsis|gb165|AT2G21860 arabidopsis 14 64
BDL124
arabidopsis|gb165|AT5G51590 arabidopsis 15 65
BDL124
733 750
BDL125
arabidopsis|gb165|AT3G16180 arabidopsis 16 66
BDL125
734 751
BDL127
arabidopsis|gb165|AT3G44940 arabidopsis 17 67
BDL128
arabidopsis|gb165|AT1G60770 arabidopsis 18 68
BDL129
arabidopsis|gb165|AT4G08690 arabidopsis 19 69
BDL129
735 69
BDL130
arabidopsis|gb165|AT3G03870 arabidopsis 20 70
BDL130
736 752
BDL131
arabidopsis|gb165|AT4G27450 arabidopsis 21 71
BDL131
737 71
BDL132
arabidopsis|gb165|AT4G23730 arabidopsis 22 72
BDL133
arabidopsis|gb165|AT3G06150 arabidopsis 23 73
BDL134
arabidopsis|gb165|AT3G28420 arabidopsis 24 74
BDL134
738 753
BDL135
arabidopsis|gb165|AT3G18600 arabidopsis 25 75
BDL136
arabidopsis|gb165|AT3G22990 arabidopsis 26 76
BDL137
arabidopsis|gb165|AT5 G14530 arabidopsis 27 77
BDL139
arabidopsis|gb165|AT1G29800 arabidopsis 28 78
BDL141
arabidopsis|gb165|AT1G29980 arabidopsis 29 79
BDL142
arabidopsis|gb165|AT2G39110 arabidopsis 30 80
BDL142
30 754
BDL143
arabidopsis|gb165|AT1G62810 arabidopsis 31 81
BDL143
739 81
BDL144
arabidopsis|gb165|AT3G14890 arabidopsis 32 82
BDL145
arabidopsis|gb165|AT1G24470 arabidopsis 33 83
BDL145
740 83
BDL146
arabidopsis|pb165|AT3G09310 arabidopsis 34 84
BDL146
741 84
BDL148
arabidopsis|gb165|AT4G35785 arabidopsis 35 85
BDL42
arabidopsis|gb165|AT5G13170 arabidopsis 36 86
BDL46
arabidopsis|gb165|AT2G13690 arabidopsis 37 87
BDL46
719 87
BDL51
arabidopsis|gb165|AT5G64260 arabidopsis 38 88
BDL52
tomato|gb164|BG127438 tomate 39 89
BDL52
716 89
BDL54
arabidopsis|gb165|AT2G41090 arabidopsis 40 90
BDL56
arabidopsis|gb165|AT2G32990 arabidopsis 41 91
BDL59
arabidopsis|gb165|AT5G07110 arabidopsis 42 92
BDL59
717 92
BDL60
arabidopsis|gb165|AT2G45200 arabidopsis 43 93
5
10
15
20
25
30
35
BDL65
arabidopsis|gb165|AT4G20360 arabidopsis 44 94
BDL67
arabidopsis|gb165|AT1G73600 arabidopsis 45 95
BDL68
arabidopsis|gb165|AT2G17280 arabidopsis 46 96
BDL78
arabidopsis|gb165|AT3G26520 arabidopsis 47 97
BDL78
718 720
BDL82
arabidopsis|gb165|AT1G21790 arabidopsis 48 98
BDL89
rice|gb157.2|AA749665 arroz 49 99
BDL89
49 721
BDL95
rice|gb157.2|AU062876 arroz 50 100
BDL95
50 722
Tabla 1: Se proporcionan los genes identificados, sus anotaciones, organismos y los identificadores de secuencia de polinucleótidos y polipéptidos. Obsérvese que las SEQ ID NO:716-719 y 724-741 son variantes de los polinucleótidos identificados y las SEQ ID NO:720-723 y 742-754 son variantes de los polipéptidos identificados.
Ejemplo 2
Identificación de secuencias homólogas que aumentan el rendimiento de semillas, el rendimiento de aceite, el ritmo de crecimiento, el contenido de aceite, la biomasa, el vigor, la teab y/o la uen de una planta
La búsqueda e identificación de genes homólogos implica el cribado de información de secuencia disponible, por ejemplo, en bases de datos públicas como la Base de Datos de ADN de Japón (DDBJ), Genbank y la Base de Datos de Secuencias de Ácidos Nucleicos (EMBL) del Laboratorio Europeo de Biología Molecular o sus versiones o la base de datos MIPS. Se han desarrollado varios algoritmos de búsqueda diferentes, que incluyen, entre otros, el conjunto de programas denominados programas BLAST. Hay cinco implementaciones de BLAST, tres diseñadas para búsquedas de secuencias de nucleótidos (BLASTN, BLASTX y TBLASTX) y dos diseñadas para búsquedas de secuencias de proteínas (BLASTP y TBLAsTn) (Coulson, Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et al., Genome Analysis, I: 543, 1997). Dichos métodos implican alineamiento y comparación de secuencias. El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para realizar el análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional de Información Biotecnológica. Otros softwares o algoritmos de este tipo son GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA. GAP usa el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar el alineamiento de dos secuencias completas que maximiza el número de coincidencias y minimiza el número de huecos.
Los genes homólogos pueden pertenecer a la misma familia de genes. El análisis de una familia de genes se puede llevar a cabo usando un análisis de similitud de secuencia. Para realizar este análisis, se pueden usar programas estándar para alineamientos múltiples, p. ej. Clustal W. Se puede usar un árbol de "unión al vecino" de las proteínas homólogas a los genes en esta invención para proporcionar una visión general de las relaciones estructurales y ancestrales. La identidad de secuencia se puede calcular usando un programa de alineamiento tal como se ha descrito anteriormente. Se espera que otras plantas porten un gen funcional similar (ortólogo) o una familia de genes similares y esos genes proporcionarán el mismo fenotipo preferido que los genes presentados aquí. Ventajosamente, estos miembros de la familia pueden ser útiles en los métodos de la invención. Se incluyen ejemplos de otras plantas aquí, pero sin estar limitados a, cebada (Hordeum vulgare), arabidopsis (Arabidopsis thaliana), maíz (Zea mays), algodón (Gossypium), colza (Brassica napus), arroz (Oryza sativa), caña de azúcar (Saccharum officinarum), sorgo (Sorghum bicolor), soja (Glycine max), girasol (Helianthus annuus), tomate (Lycopersicon esculentum) y trigo (Triticum aestivum).
Los análisis mencionados anteriormente para la homología de secuencia pueden llevarse a cabo en una secuencia de longitud completa, pero también pueden basarse en una comparación de ciertas regiones tales como dominios conservados. La identificación de dichos dominios también estaría dentro del ámbito del experto en la técnica e implicaría, por ejemplo, un formato legible por ordenador de los ácidos nucleicos de la presente invención, el uso de programas informáticos de alineamiento y el uso de información de dominio público sobre dominios de proteínas, motivos conservados y cajas. Esta información está disponible en la base de datos PRODOM (Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) biochem (.) ucl (.) ac (.) uk/bsm/dbbrowser/protocol/prodomqry (.) html), PIR (Hypertext Transfer Protocol:// pir (.) Georgetown (.) edu/) o Pfam (Hypertext Transfer Protocol:// World Wide Web (.) sanger (.) ac (.) uk/Software/Pfam/). Los programas de análisis de secuencia diseñados para la búsqueda de motivos pueden usarse para la identificación de fragmentos, regiones y dominios conservados como se ha mencionado
anteriormente. Los programas informáticos preferidos incluyen, pero no se limitan a, MEME, SIGNALSCAN y GENESCAN.
Un experto en la técnica puede usar las secuencias homólogas proporcionadas en la presente memoria para encontrar secuencias similares en otras especies y otros organismos. Los homólogos de una proteína abarcan 5 péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos con respecto a la proteína no modificada en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada de la que se derivan. Para producir dichos homólogos, los aminoácidos de la proteína pueden sustituirse por otros aminoácidos que tengan propiedades similares (cambios conservativos, tales como hidrofobia, hidrofilia, antigenicidad, propensión a formar o romper estructuras a-helicoidales o estructuras de lámina 10 beta). Las tablas de sustitución conservativa son bien conocidas en la técnica (véase, por ejemplo
Creighton (1984) Proteins. W.H. Freeman and Company). Los homólogos de un ácido nucleico abarcan ácidos nucleicos que tienen sustituciones, deleciones y/o inserciones de nucleótidos con respecto al ácido nucleico no modificado en cuestión y que tienen actividad biológica y funcional similar a la del ácido nucleico no modificado del que se derivan.
15 Los genes identificados en las bases de datos de secuencias de dominio público como que comparten una alta homología de secuencia con los genes de arabidopsis identificados en la presente memoria se resumen en la tabla 2 a continuación. Se espera que esos genes aumenten el rendimiento de la planta, el rendimiento de semillas, el rendimiento de aceite, el contenido de aceite, el ritmo de crecimiento, la biomasa, el vigor, la TEAB y/o la EUN de una planta de las bases de datos usando el software BLAST (BLASTP y TBLASTN) y se proporcionan en la tabla 2, 20 a continuación en esta memoria.
Tabla 2
Polinucleótidos y polipéptidos homólogos
SEQ ID NO del polinuc.:
Nombre del grupo Organismo SEQ ID NO del polipép.: Homología con la SEQ ID NO: % de identidad Algoritmo
101
brachypodium|gb169|BE4156 18 brachypodium 379 51 88,81 blastp
102
maize|gb169.2|AI600710 maíz 380 51 90,11 blastp
103
maize|gb169.2|AI615263 maíz 381 51 91,09 blastp
104
sorghum|gb161.crp|AI987481 sorgo 382 51 81,43 blastp
105
sugarcane|gb157.3|CA081111 caña de azúcar 383 51 86,03 blastp
106
switchgrass|gb167|FE601953 pasto varilla 384 51 90,99 blastp
107
wheat|gb164|BE490052 trigo 385 51 89,72 blastp
108
b_rapa|gb162|EX108797 b rapa 386 52 80 tblastn
109
b_rapa|gb162|EX138742 b rapa 387 52 92,86 blastp
110
canola|gb161|CD8214 78 canola 388 52 80 tblastn
111
radish|gb164|EV569061 rábano 389 52 83,1 tblastn
112
antirrhinum|gpb166|AJ558675 antirrhinum 390 53 80,77 blastp
113
apple|gb157.3|CN580529 manzana 391 53 80,22 blastp
114
arabidopsis|gb165|AT5G15750 arabidopsis 392 53 88,46 blastp
115
b_ rapa|gb162|CX270798 b rapa 393 53 93,41 blastp
116
b_rapa|gb162|DY009670 b rapa 394 53 99,45 blastp
117
bean|gb167|CA897445 alubia 395 53 84,07 blastp
118
cacao|gb167|CU485233 cacao 396 53 84,07 blastp
119
canola|gb161|EE456125 canola 397 53 91,21 blastp
Q_
Q_
Q_
Q_
Q_
CI Q_ Q_ Q_ Q_ CI Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ CI Q_ Q_ Q_ Q_ CI Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ CI
Q_
Q_
Q_
Q_
Q_
Q_
(J,)
C/5 (J) (J,) (J,) (J,) (J,) c/5 C/5 (J) (J,) (J,> (J,) C/5 (J) (j,> C/5 C/5 Ct) C/5 C/5 C/5 C/5 C/5 C/5 C/5 C/5 C/5 C/5 C/5
CB
CB
(C CC CC CC CC cc CC CC CC CC CC CC CC cc CC CB CB CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC CC
JO
JO
JO
JO
JO
£ JO JO JO JO £ JO JO JO JO JO £ JO JO JO JO JO JO JO JO JO JO JO £
JO
JO
JO
JO
JO
JO
CM
r-- CO r»- CM r-- r»- CO CM r-- CM CO CO CM CM r-- r-- 00 05 CO CO CO 05 CO r-- 05 LO_ r»- CM LO 00 00 05
CM
05 CM 05 CO 00 o O r-- CM CO CO LO LO 05 CM 00 CO CO O o O CO CO 05 00 CO o CO 05 r-- CO
O
CM CO CM T— T— CO CM o O LO LO CO CO CM T— T— CM 05 CO o O 05 O o CO CM 00 CO CM CM CO o T—
00
00
00
00
CO 00 00 00 00 00 00 05 05 00 00 00 05 00 05 05 00 00 00 05 00 00 05
00
00
00
00
00
00
00
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO
CO r»- r»- r-- r-- r»- r»- r-- r»-
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
LO
00
05 O CM CO LO CO r»- 00 05 O CM CO LO CO r»- 00 05 O CM CO LO CO r»- 00 05 o CM
CO CO CO
CO
CO
alubia carilla c CB TD CC
centaurea
cítrico algodón alcachofa diente de leó uva O E _CT3 'E cc Q_ E cc o i lechuga melón rábano rábano soja soja girasol thellunglella triphysaria arabidopsis b_oleracea b_rapa algodón cacahuete rábano soja soja arabidopsis arabidopsis arabidopsis arabidopsis b_rapa cañóla cítrico soja soja
O b_oleracea|gb161|AM059122 O O LO O
centaurea|gb166|EH737065
citrus|gb166|CB304606 cotton |gb164|BQ409188 cowpea|gb166|FF400239 cynara|gb167|GE592319 dandelion|gb161 |DY824742 grape|gb160|CA813426 ipomoea|gb157.2|C J749317 kiwi|gb166|FG473358 Iettuce|gb157.2|DW152666 melón |gb165|EB714755 radish|gb164|EV526240 radish|gb164|EV537766 soybean|gb168|BE202985 soybean|gb168|BM 139685 sunflower|gb162|CD851096 thellungiella|gb167|BY81024 triphvsaria|gb164|BM356672 rabidopsis|gb165 |AT1 G2176 b_rapa|gb162|DN965363 cotton|gb164|C0083170 peanut|gb167|ES716655 radish|gb164|EV546747 soybean|gb168|AI967832 sovbean|gh168|AW395758 rabidopsis|gb165|AT3G2353 rabidopsis|gb165|AT 1G0200 rabidopsis|gb165|AT2G4531 rabidopsis|gb165|AT4G0011 b_ rapa|gb162|CV544806 canola|gb161 |CD830303 citrus|gb166|CK740093 soybean|gb168|AW704756 soybean|gb168|CB540306
CC CC CC CC CC
O
CM CO LO CO r»- 00 05 O CM CO LO CO r-- 00 05 O CM CO LO CO r»- 00 05 O CM CO
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CM
CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO LO LO LO LO LO
155
tomato|gb164|BG126144 tomate 433 57 81,01 tblastn
156
b_rapa|gb162|CV432750 b_rapa 434 58 95,61 blastp
157
b_rapa|gb162|ES933357 b_rapa 435 58 93,86 blastp
158
canola|gb161|CN730767 canola 436 58 94,74 blastp
159
canola|gb161|CX193104 canola 437 58 92,98 blastp
160
canola|gb161|EE472289 canola 438 58 94,74 blastp
161
canola|gb161|EV217368 canola 439 58 94,74 blastp
162
cassava|gb164|DV446328 mandioca 440 58 82,61 blastp
163
citrus|gb166|CX667844 cítrico 441 58 81,58 blastp
164
papava|gb165|EX265359 papaya 442 58 81,58 blastp
165
radish|gpb164|EW733783 rábano 443 58 95,61 blastp
166
radish|gb164|FD535333 rábano 444 58 94,74 blastp
167
canola|gb161|CD820476 canola 445 59 83,1 blastp
168
arabidopsis|gb165|AT1G3125 8 arabidopsis 446 61 97,73 blastp
169
arabidopsis|gb165|AT3G0324 0 arabidopsis 447 62 81,44 blastp
170
canola|gb161|CD818131 canola 448 62 81,68 blastp
171
radish|gb164|EX894603 rábano 449 66 89,23 blastp
172
canola|gb161|CD814119 canola 450 68 86,35 blastp
173
canola|gb161|CD816209 canola 451 68 85,19 blastp
174
b_rapa|gb162|ES934568 b_rapa 452 69 87,04 tblastn
175
radish|gb164|EV538975 rábano 453 69 84,39 blastp
176
apple|gb157.3|AU223507 manzana 454 71 81,18 blastp
177
apple|gb157.3|CN579496 manzana 455 71 82,35 blastp
178
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179
b_oleracea|gb161|AM386119 b_oleracea 457 71 83,6 blastp
180
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181
b_ rapa|gp162| EX022604 b_rapa 459 71 96 blastp
182
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183
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184
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185
canola|gb161|CX192269 canola 463 71 97,2 blastp
186
canola|gb161|H74607 canola 464 71 95,6 blastp
187
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188
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189
cotton|gb164|AI054775 algodón 467 71 82,75 blastp
Q_
CI Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ CI Q_ Q_ CI Q_ Q_ Q_ Q_ Q_ CI Q_ CI CI Q_ C Q_ CI Q_ Q_ Q_ CI CI
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CO CO LO 05 LO CO 00 00 r-- co o CO CM 00 CM 00 LO CM 05 00 CM
O CO CM CO CM co 00 00 00 o
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05 o CM co LO co r-- 00 05 o CM co LO co r-- 00 05 o CM CO LO co r-- 00 05 o CM
co
co
r-- r-- r-- r-- r»- r»- r-- r-- r-- r-- 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 o o O
LO LO LO
lubia carilla
alcachofa c *o _0> <D TD Q) "o uva lechuga lechuga lechuga lechuga _o 2 melón papaya melocotón cacahuete álamo prunus rábano rábano rábano cártamo soja soja soja fresa girasol girasol nueces nueces b_ rapa cañóla rábano cañóla cañóla ricino algodón uva
"O
cowpea|gb166|FC457888
cvnara|gb167 |GE589236 dandellon|gb161 |DY816357 grape|gb160|BM436371 Iettuce|gb157.2|DW046017 lettuce|gb157.2|DW076019 lettuce|gb157.2|DW110290 lettuce|gb157.2|DW153964 lotus|gb157.2|CN825209 melón |gb165|AM715906 papava|gb165|EX227683 peach |gb 157.2 |BU039450 peanut|gb167|CX127963 poplar|gb157.2|BI068247 prunus|gb167|BU039450 radish|gb164|EV567811 radish|gb164|EV568452 radish|gb164|EV572670 safflower|gb162|EL387585 soybean |gb168 |AF272360 sovbean |gb168|AL370910 soybean|gb168|BE661209 strawberry|gb164|C0817556 sunflower|gb162|DY915187 sunflower|gb162|DY939330 walnuts|gb166|CB303475 walnuts|gb166|CB303477 b_rapa|gb162|EX017049 canola|gb161 |CD831601 radish|gb164|EV547036 canola|gb161 |CX189942 canola|gb161|H74865 castorbean|gb160|EG664225 cotton |gb164|BG442642 grape|gb160|CB916567
O
CM CO LO CO r-- 00 05 O CM CO LO CO r-- 00 05 O CM CO LO CO r»- 00 05 O CM CO
05
05
05
05
05
05
05
05
05
05
O O O o O O O o O O CM CM CM CM CM
CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM CM
LO
co
tblastn
blastp blastp tblastn blastp blastp tblastn blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp blastp tblastn blastp blastp blastp blastp blastp tblastn blastp blastp blastp blastp
tblastn
80,61
86,61 80,29 94,26 88,75 90,95 89,73 86,58 ■'ñT o" 00 80,54 90,82 87,87 88,2 87,87 89,86 90,65 87,1 80,08 88,28 CO CO oo“ 00 82,85 82,85 92,08 86,67 05_ 00 89,96 92,92 94,56 92,92 82,01 89,54 85,77 82,57 85,77 81,17
77
r-- r-- r-- r»- r»- r»~ 05 r-- 05 r»- 05 r»- CO 00 LO 00 CO 00 00 00 00 00 00 00 00 00 05 00 05 00 CM 05 93 CO 05 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93
503
504 sos 90S 507 00 o LO 60S 510 ¡O 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 524 525 526 527 00 CM LO 529 530 531 532 CO CO LO 534 535 536 537
álamo
rábano soja thellunglella bjuncea b_rapa rábano rábano b_rapa cañóla b_oleracea b_rapa cañóla cañóla patata patata rábano antirrhinum manzana albaricoque aquilegia b_oleracea b_rapa basilicum alubia cacao canda canda canda E O .C O o cítrico algodón algodón alubia carilla diente de león
poplar|gb157.2|BU816880
radish|gb164|EV537923 soybean|gb168|AW776674 thellungiella|gb167|DN77378 0 bJuncea|gb164|EVGN00166 916743135 b_ rapa|gb162|CX268133 radish|gb164|EV573167 radish|gb164|EW724071 b_rapa|gb162|EE517848 canola|gb161|CD824985 b_oleracea|gb161 |AM057266 b_rapa|gb162|BG543561 canola|gb161 |CD820232 canola|gb161|W999252 potato|gb157,2|BG351102 potato|gb 157.2 |B I435634 radish|gb164|EY917873 antirrhinum|gb166|AJ797267 apple|gb157.3|CN489681 apricot|gb157.2|CV051536 aquilegia|gb157.3|DT735665 b_oleracea|gb161|ES939061 b_rapa|gb162|EX075010 basilicum|gb157.3|DY334833 bean |gb167 |CV530444 cacao|gb167|CU490565 canola|gb161 |CD813794 canola|gb161 |CD826913 canola|gb161 |CN737313 cichorium|gb166|EH687081 citrus|gb166|CF506133 cotton|gb164|AI730510 cotton|gb164|BF268340 cowpea|gb166|FF384748 dandelion|gb161 |DY819170
225
226 227 00 CM CM 229 O CO CM 231 232 CO CO CM 234 235 236 237 00 CO CM 239 240 241 242 243 244 245 246 247 00 CM 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258 259
(O
CO
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
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blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
blastp
87,08
88,28 82,85 83,68 85,89 87,65 85,89 CO CO co" co 92,92 92,08 82,01 87,45 86,72 88,7 80,83 97,07 r-~ 00 86,31 83,4 83,95 83,78 83,64 83,06 83,27 87,18 CO a> co 83,44 co ■'ñT CO 80,82 83,12 83,74 80,29 81,17 81,82 81,82
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
93
94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94 94
00 co LO
539 540 541 542 543 544 545 546 547 548 549 OSS 551 552 553 554 SSS 9SS 557 8SS 6SS 09S 561 562 563 564 S9S 99S 567 00 CO LO 69S 570 571 572
eucalipto
uva lechuga melón álamo álamo patata prunus rábano rábano cártamo soja soja euforbio girasol thellungiella tabaco tomate triphysaria manzana manzana aquilegia alubia alubia cañóla cañóla cítrico clavo algodón alubia carilla alubia carilla uva uva lechuga lechuga
eucalyptus|gb166|CT983920
grape|gb160|CD798978 Iettuce|gb157.2|DW062039 melón |gb165|AM742165 poplar|gb1572 |C F234347 poplar|gb157.2|CV241881 potato|gb157,2|BG595485 prunus|gb167|AJ631796 radish|gb164|EV567266 radish|gb164|EY912132 safflower|gb162|EL405854 soybean|gb168|BQ157726 soybean|gb168|CD399194 spurge|gb161 |DV128393 sunflower|gb162|DY918314 thellungiea|gb167|BY82093 5 tobacco|gb162|EB445856 tomato|gb164|BG128536 triphysaria|gb164|EY139231 apple|gb157.3|CN489235 apple|gb157.3|CN490414 aquilegia|gb157.3|DR925212 bean|gb1 67|CA905538 bean|gb167|CB542107 canola|gb161 |CD816386 canola|gb161 |CX187647 citrus|gb166|BE213456 dover|gb162|BB936594 cotton |gb164|BG440364 cowpea|gb166|FC460131 cowpea|gb166|FF541811 grape|gb160|BG273758 grape|gb160|BQ792941 lettuce|gb157.2|DW051431 lettuce|gb157.2|DW112484
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261 262 263 264 265 266 267 00 CO CM 269 270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 O CO CM CO CM CM CO CM CO 00 CM 00 CM LO 00 CM CO 00 CM 287 CO 00 CM 289 290 291 292 293 294
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sunflower|gb162|CX944572 girasol 583 94 81,57 blastp
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tomato|gb164|BG125985 tomate 586 94 81,99 blastp
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310
canola|gb161|CX188753 canola 588 95 92,69 blastp
311
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312
canola|gb161|CD813792 canola 590 96 88,93 blastp
313
radish|gb164|EV526073 rábano 591 96 88,19 blastp
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315
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317
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b_juncea|gb164|EVGN00256 308610946 b_juncea 597 97 92,09 tblastn
320
b_juncea|gb164|EVGN00465 908341698 b_juncea 598 97 84,58 blastp
321
b_juncea|gb164|EVGN01252 008670772 b_juncea 599 97 83,79 blastp
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b_ oleracea|gb161|AM385528 b_oleracea 600 97 91,3 blastp
323
b_oleracea|gb161|BOU92651 b_oleracea 601 97 84,19 blastp
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b_rapa|gb162|BQ791222 b_rapa 603 97 86,17 blastp
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thellungieMa|gb167|EE683447 thellungiella 615 97 91,7 blastp
338
canola|gb161|H74506 canola 616 98 88,54 blastp
339
radish|gb164|EW716884 rábano 617 98 88,19 blastp
340
barley|gb157.3|AL450752 cebada 618 99 82,46 blastp
341
brachypodium|gb169|BE3990 53 brachypodium 619 99 85,96 blastp
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cenchrus|gb166|EB653861 cenchrus 620 99 86,84 blastp
343
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leymus|gb166|CD809085 leymus 622 99 84,21 blastp
345
lovegrass|gb167|DN480336 pasto llorón 623 99 86,84 blastp
346
lovegrass|gb167|DN480721 pasto llorón 624 99 83,33 tblastn
347
lovegrass|gb167|EH184046 pasto llorón 625 99 85,96 blastp
348
maize|gb169.2|AI586696 maíz 626 99 84,21 blastp
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maize|gb 169.2|AI619158 maíz 627 99 85,22 blastp
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maize|gb 169.2|AI619355 maíz 628 99 84,21 blastp
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maize|gb169.2|AI783324 maíz 629 99 85,96 blastp
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maize|gb169.2|DQ244850 maíz 630 99 84,21 blastp
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maize|gb169.2|FK957562 maíz 631 99 83,33 tblastn
354
maize|gb169.2|X86553 maíz 632 99 85,96 blastp
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millet|gb161|CD725537 mijo 633 99 85,96 blastp
356
pseudoroegneria|gb167|FF35 9011 pseudoroegneria 634 99 84,21 blastp
357
rice|gb157.3|C26798 arroz 635 99 83,33 blastp
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sorghum|bg161.crp|AI621929 sorgo 636 99 87,72 blastp
359
sorghum|gb161.crp|AI666179 sorgo 637 99 85,96 blastp
360
sorghum|gb161.crp|CD22229 3 sorgo 638 99 81,58 blastp
361
sugarcane|gb157.3|BQ478960 caña de azúcar 639 99 86,84 blastp
362
sugarcane|gb157.3|BQ537227 caña de azúcar 640 99 85,96 blastp
363
sugarcane|gb157.3|CA074008 caña de azúcar 641 99 85,96 blastp
364
sugarcane|gb157.3|CA112912 caña de azúcar 642 99 81,74 blastp
365
switchgrass|gb167|DN150202 pasto varilla 643 99 86,84 blastp
366
switchgrass|gb167|FE615220 pasto varilla 644 99 86,84 blastp
367
switchgrass|gb167|FL725679 pasto varilla 645 99 85,96 blastp
368
switchgrass|gb167|FL732781 pasto varilla 646 99 86,84 blastp
369
switchgrass|gb1671|FL846775 pasto varilla 647 99 85,34 blastp
370
switchgrass|gb167|FL899116 pasto varilla 648 99 85,96 blastp
371
switchgrass|gb167|FL979422 pasto varilla 649 99 85,96 blastp
372
wheat|gb1 64|BE398366 trigo 650 99 84,21 blastp
373
wheat|gb1 64|BE399053 trigo 651 99 84,21 blastp
374
barley|gb157.3|BF623452 cebada 652 100 85,25 tblastn
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maize|gb169.2|AW267619 maíz 653 100 80,58 tblastn
376
pseudoroegneria|gb167|FF35 2828 pseudoroegneria 654 100 84,89 blastp
377
sorghum|gb161.crp|AW43824 sorgo 655 100 86,43 blastp
378
wheat|gb164|BQ905354 trigo 656 100 85,97 tblastn
755
amborella|gb166|CD482678 amborella 764 97 81,03 blastp
756
castorbean|gb160|AJ605571 ricino 765 97 80,24 blastp
757
cotton|gb164|AI055329 algodón 766 97 83,79 blastp
758
cotton|gb164|AI731742 algodón 767 97 83,79 blastp
759
liriodendron|gb166|CK74443 0 tulípero 768 97 81,42 blastp
760
papaya|gb165|EX246150 papaya 769 97 81,82 blastp
761
periwinkle|gb164|EG554262 vincapervinca 770 97 80,24 blastp
762
spurge|gb161|AW990927 euforbio 771 97 80,63 blastp
763
tobacco|gb162|CV018899 tabaco 772 97 80,24 blastp
773
canola|gb161|DW999739 canola 774 747 82,78 blastp
Tabla 2: Se proporcionan polinucleótidos y polipéptidos que son homólogos a los polinucleótidos o polipéptidos identificados de la tabla 1. Obsérvese que las siguientes secuencias polipeptídicas son 100 % idénticas: la SEQ ID NO:201 es idéntica a la SEQ ID NO:204; La SEQ ID NO:409 es idéntica a la SEQ ID NO:410; la SEQ ID NO:411 es idéntica a la SEQ ID NO:412; la SEQ ID NO:456 es idéntica a la SEQ ID NO:463; la SEQ ID NO:458 es idéntica a la SEQ ID NO:462; la SEQ ID NO:472 es idéntica a la SEQ ID NO:474; la SEQ ID NO:479 es idéntica a la SEQ ID NO:482; la SEQ ID NO:514 es idéntica a la SEQ ID NO:516; la SEQ ID NO:522 es idéntica a la SEQ ID NO:545; la SEQ ID NO:600 es idéntica a la SEQ ID NO:604, 606 y 608; la SEQ ID NO:602 es idéntica a la SEQ ID NO:607 y 609; la SEQ ID NO:610 es idéntica a la SEQ ID NO:611; la SEQ ID NO:620 es idéntica a la SEQ ID NO:643; la SEQ ID NO:622 es idéntica a la SEQ ID NO:630, 634, 650 y 65; la SEQ ID NO:629 es idéntica a la SEQ ID NO:632; la SEQ ID NO:637 es idéntica a la SEQ ID NO:640 y 641; la SEQ ID NO: 644 es idéntica a la SEQ ID NO:646; la SEQ ID NO:648 es idéntica a la SEQ ID NO:649; la SEQ ID NO:650 es idéntica a SEQ ID NO:651; la SEQ ID NO:624 es idéntica a la SEQ ID NO:625.
5
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25
30
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40
Ejemplo 3
Producción de transcriptoma de arabidopsis y análisis de correlación de alto rendimiento usando micromatriz de oligoucleótidos del genoma completo de arabidopsis de 44k
Para producir un análisis de correlación de alto rendimiento, los inventores de la presente invención utilizaron una micromatriz de oligonucleótidos de Arabidopsis thaliana, producida por Agilent Technologies [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) chem. (.) agilent (.) com/Scripts/PDS (.) asp?lPage=50879]. La matriz de oligonucleótidos representa aproximadamente 40.000 genes y transcripciones de A. thaliana diseñados basándose en datos de la base de datos TIGR ATH1 v.5 y bases de datos de Arabidopsis MPSS (Universidad de Delaware). Para definir las correlaciones entre los niveles de expresión de ARN y los componentes del rendimiento o los parámetros relacionados con el vigor, se analizaron diversas características de la planta de 15 ecotipos diferentes de Arabidopsis. Entre ellos, nueve ecotipos que abarcan la varianza observada se seleccionaron para el análisis de expresión de ARN. La correlación entre los niveles de ARN y los parámetros caracterizados se analizó mediante la prueba de correlación de Pearson [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) davidmlane (.) com/hyperstat/A34739 (.) html].
Procedimientos experimentales
Extracción de ARN- se tomaron muestras de cinco tejidos en diferentes fases del desarrollo, incluyendo raíz, hoja, flor en antesis, semilla a los 5 días después de la floración (DAF) y semilla a 12 DAF, que representaban diferentes características de la planta, y se extrajo el ARN usando reactivo TRIzol de Invitrogen [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) invitrogen (.) com/content (.) cfm? Pageid=469]. Por conveniencia, cada tipo de tejido de información de expresión de micromatriz ha recibido una ID de conjunto tal como se resume en la tabla 3 a continuación.
Tabla 3
Conjuntos experimentales de transcripción de Arabidopsis
Conjunto de expresión
ID del conjunto
Raíz
A
Hoja
B
Flor
C
Semilla 5 DAF
D
Semilla 12 DAF
E
Tabla 3. Se proporcionan los conjuntos experimentales de transcripción de Arabidopsis (A-E). DAF = días después de la floración.
Se tomaron aproximadamente 30-50 mg de tejido de las muestras. Los tejidos pesados se trituraron utilizando mazo y mortero en nitrógeno líquido y se resuspendieron en 500 pl de Reactivo TRIzol. Al lisado homogeneizado, se le añadieron 100 pl de cloroformo seguido de precipitación usando isopropanol y dos lavados con etanol al 75 %. El ARN se eluyó en 30 pl de agua libre de ARNasa. Las muestras de ARN se limpiaron usando el protocolo de limpieza del minikit RNeasy de Qiagen según el protocolo del fabricante.
Evaluación de los componentes de rendimiento y los parámetros relacionados con el vigor- se usaron ocho de los nueve ecotipos de Arabidopsis en cada uno de los 5 bloques repetitivos (denominados A, B, C, D y E), conteniendo cada uno 20 plantas por parcela cultivadas en condiciones de invernadero de control 22 °C, se añadió fertilizante 20:20:20 (relaciones en peso) N:P:K [nitrógeno (N), fósforo (P) y potasio (K)]. Durante este tiempo, los datos fueron recopilados, documentados y analizados. Se recopilaron datos adicionales a través de la fase de plántulas de plantas cultivadas en cultivo tisular en placas de agar transparentes de cultivo vertical. La mayoría de los parámetros elegidos se analizaron mediante imágenes digitales.
Imagenología digital en cultivo tisular- Se usó un sistema de adquisición de imágenes en laboratorio, que consiste en una cámara réflex digital (Canon EOS 300D) conectada con una lente de 55 mm de distancia focal (serie Canon EF-S), montada en un dispositivo de reproducción (Kaiser RS), que incluía 4 unidades de iluminación (4 bombillas de iluminación de 150 vatios) y ubicado en un cuarto oscuro, para capturar imágenes de plántulas sembradas en placas cuadradas de agar.
Imagenología digital en invernadero- El proceso de captura de imágenes se repitió cada 3-4 días desde el día 7 hasta el día 30. La misma cámara conectada con una lente de 24 mm de distancia focal (serie Canon EF), colocada
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
en un soporte de hierro hecho a medida, se usó para capturar imágenes de plantas más grandes sembradas en cubas blancas en un invernadero de entorno controlado. Las cubas blancas eran de forma cuadrada con medidas de 36 x 26,2 cm y 7,5 cm de profundidad. Durante el proceso de captura, las cubas se colocaron debajo del soporte de hierro, evitando la luz solar directa y la proyección de sombras. Este proceso se repitió cada 3-4 días durante hasta 30 días.
Se usó un sistema de análisis de imágenes, que consiste en una computadora de escritorio personal (procesador Intel P4 a 3,0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.37, programa de procesamiento de imágenes basado en Java, desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., disponible gratuitamente en Internet en Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (.) nih (.) gov/. Las imágenes se capturaron con una resolución de 6 megapíxeles (3072 x 2048 píxeles) y se almacenaron en un formato de compresión baja JPEG (estandar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (instituto SAS).
Análisis foliar- Usando el análisis digital, se calcularon los datos de las hojas, incluidos el número de hojas, el área, el perímetro, la longitud y la anchura. El día 30, se seleccionaron 3-4 plantas representativas de cada parcela de bloques A, B y C. Las plantas se disecaron, cada hoja se separó y se introdujo entre dos bandejas de vidrio, se tomó una foto de cada planta y los diversos parámetros (tales como el área total de la hoja, la longitud laminar, etc.) se calcularon a partir de las imágenes (figuras 1a-d). La circularidad del cuerpo de la hoja se calculó como la anchura laminar dividida por la longitud laminar.
Análisis radicular- Durante 17 días, los diferentes ecotipos se cultivaron en placas de agar transparentes. Las placas se fotografiaron cada 2 días a partir del día 7 en la sala de fotografía y se documentó el desarrollo de las raíces (figuras 2a-b). El ritmo de crecimiento se calculó de acuerdo con la fórmula I como se ha descrito anteriormente [Ritmo de crecimiento relativo del área = (A Área / At) * (1 / Área t0)].
Análisis del ritmo de crecimiento vegetativo- El ritmo de crecimiento se calculó dividiendo el área añadida (A Área) por el número de días para cada intervalo (At). El análisis finalizó con la aparición de plantas solapantes. El ritmo de crecimiento se calculó según la fórmula IV.
Fórmula IV:
Ritmo de crecimiento = AÁrea/At
Para la comparación entre ecotipos, el ritmo calculado se normalizó usando la fase de desarrollo de la planta, representada por el número de hojas verdaderas. En los casos en que las plantas con 8 hojas se habían muestreado dos veces (por ejemplo, el día 10 y el día 13), solo se eligió la muestra más grande y se añadió a la comparación por Anova.
Análisis de semillas en silicuas- El día 70, se recogieron 15-17 silicuas de cada parcela en los bloques D y E. Las silicuas elegidas eran de color marrón claro, pero aún intactas. Las silicuas se abrieron en la sala de fotografía y las semillas se dispersaron en una bandeja de vidrio, se tomó una imagen digital de alta resolución para cada parcela. Usando las imágenes, se determinó el número de semillas por silicua.
Peso promedio de las semillas-Al final del experimento, se recogieron todas las semillas de las parcelas de los bloques A-C. Se midió un peso promedio de 0,02 gramos de cada muestra, las semillas se dispersaron en una bandeja de vidrio y se tomó una fotografía. Usando el análisis digital, se calculó el número de semillas en cada muestra.
Porcentaje de aceite en las semillas-Al final del experimento, se recogieron todas las semillas de las parcelas de los bloques A-C. Las semillas Columbia de 3 parcelas se mezclaron trituradas y se montaron a continuación en la cámara de extracción. Se usaron 210 ml de n-Hexano (No. de cat. 080951 Biolab Ltd.) como disolvente. La extracción se realizó durante 30 horas a una temperatura media de 50 °C. Una vez que la extracción ha terminado, el n-Hexano se evaporó usando el evaporador a 35 °C y condiciones de vacío. El proceso se repitió dos veces. La información obtenida del extractor Soxhlet (Soxhlet, F. Die gewichtsanalytische Bestimmung des Milchfettes, Polytechnisches J. (Dingler's) 1879, 232, 461) se usó para crear una curva de calibración para la RMN de baja resonancia. El contenido de aceite de todas las muestras de semillas se determinó usando la RMN de baja resonancia (MARAN Ultra de Oxford Instruments) y su paquete de software MultiQuant.
Análisis de longitud de las silicuas- El día 50 desde la siembra, se tomaron muestras de 30 silicuas de diferentes plantas en cada parcela en el bloque A. Las silicuas seleccionadas eran de color amarillo verdoso y se recogieron de las partes inferiores del tallo de una planta cultivada. Se tomó una fotografía digital para determinar la longitud de la silicua.
Peso seco y rendimiento de semillas- El día 80 desde la siembra, las plantas de los bloques A-C se cosecharon y se dejaron secar a 30 °C en una cámara de secado. La biomasa y el peso de la semilla de cada parcela se separaron, se midieron y se dividieron por el número de plantas. Peso seco = peso total de la parte vegetativa por encima del suelo (excluidas las raíces) después de secar a 30 °C en una cámara de secado; Rendimiento de
5
10
Parámetro correlacionado con
ID de correlación
Longitud de la raíz el día 13 (cm)
1
Longitud de la raíz el día 7 (cm)
2
Crecimiento relativo de la raíz (cm/día) día 13
3
Peso fresco por planta (g) en la fase de subida a flor
4
Materia seca por planta (g)
5
Ritmo de crecimiento vegetativo (cm2/ día) hasta 8 hojas verdaderas
6
Circularidad del cuerpo de la hoja
7
Anchura de la lámina (cm)
8
Longitud de la lámina (cm)
9
Área foliar total por planta (cm)
10
Peso de 1000 semillas (g)
11
% de aceite por semilla
12
Semillas por silicua
13
Longitud de la silicua (cm)
14
Rendimiento de semillas por planta (g)
15
Rendimiento de aceite por planta (mg)
16
Índice de cosecha
17
Anchura/longitud de la hoja
18
Tabla 4. Se proporcionan los parámetros correlacionados de Arabidopsis (ID de correlación No. 1-18).
semillas por planta = peso total de semillas por planta (g).
Rendimiento de aceite- El rendimiento de aceite se calculó usando la fórmula V.
Fórmula V;
Rendimiento de aceite de semillas = rendimiento de semillas por planta (g) x % de aceite en la semilla
Índice de cosecha- El índice de cosecha se calculó usando la fórmula III como se ha descrito anteriormente [Índice de cosecha = Rendimiento de semilla promedio por planta/Peso seco promedio].
Resultados experimentales
Nueve ecotipos diferentes de Arabidopsis se cultivaron y caracterizaron para 18 parámetros (nombrados como vectores). Los parámetros de los datos se resumen en la tabla 4 a continuación.
Tabla 4
Parámetros correlacionados de Arabidopsis (vectores)
Los valores caracterizados se resumen en las tablas 5 y 6 a continuación.
Tabla 5
Parámetros medidos de ecotipos de Arabidopsis
Ecotipo
Rendimiento de semillas por planta (g) Rendimiento de aceite por planta (mg) % de aceite por semilla Peso de 1000 semillas (g) Materia seca por planta (g) Índice de cosecha Área foliar total por planta (cm) Semillas por silicua Longitud de la silicua (cm)
An-1
0,34 118,63 34,42 0,0203 0,64 0,53 46,86 45,44 1,06
Col-0
0,44 138,73 31,19 0,0230 1,27 0,35 109,89 53,47 1,26
Ct-1
0,59 224,06 38,05 0,0252 1,05 0,56 58,36 58,47 1,31
Cvi (N8580)
0,42 116,26 27,76 0,0344 1,28 0,33 56,80 35,27 1,47
Gr-6
0,61 218,27 35,49 0,0202 1,69 0,37 114,66 48,56 1,24
Kondara
0,43 142,11 32,91 0,0263 1,34 0,32 110,82 37,00 1,09
Ler-1
0,36 114,15 31,56 0,0205 0,81 0,45 88,49 39,38 1,18
Mt-0
0,62 190,06 30,79 0,0226 1,21 0,51 121,79 40,53 1,18
Shakdara
0,55 187,62 34,02 0,0235 1,35 0,41 93,04 25,53 1,00
Tabla 5. Se proporcionan los parámetros medidos en ecotipos de Arabidopsis: Rendimiento de semillas por planta (cm); rendimiento de aceite por planta (mg); % de aceite por semilla; peso de 1000 semillas (g); materia seca por planta (g); índice de cosecha; área foliar total por planta (cm); semillas por silicua; longitud de la silicua (cm).
Tabla 6
5 Parámetros medidos adicionales de ecotipos de Arabidopsis
Ecotipo
Crec. veg. Crecimiento relativo de la raíz Longitud de la raíz el día 7 Longitud de la raíz el día 13 Peso fresco por planta Longitud de la lámina Anchura de la lámina Anchura/longitud de la hoja Circularidad del cuerpo de la hoja
An-1
0,313 0,631 0,937 4,419 1,510 2,767 1,385 0,353 0,509
Col-0
0,378 0,664 1,759 8,530 3,607 3,544 1,697 0,288 0,481
Ct-1
0,484 1,176 0,701 5,621 1,935 3,274 1,460 0,316 0,450
Cvi (N858 0)
0,474 1,089 0,728 4,834 2,082 3,785 1,374 0,258 0,370
Gr-6
0,425 0,907 0,991 5,957 3,556 3,690 1,828 0,356 0,501
Kondara
0,645 0,774 1,163 6,372 4,338 4,597 1,650 0,273 0,376
Ler-1
0,430 0,606 1,284 5,649 3,467 3,877 1,510 0,305 0,394
Mt-0
0,384 0,701 1,414 7,060 3,479 3,717 1,817 0,335 0,491
Shakdara
0,471 0,782 1,251 7,041 3,710 4,149 1,668 0,307 0,409
Tabla 6. Se proporcionan los parámetros medidos en ecotipos de Arabidopsis: Crec. Veg. = Ritmo de crecimiento vegetativo (cm2/día) hasta 8 hojas verdaderas; crecimiento relativo de la raíz = crecimiento relativo de la raíz (cm/ía; longitud de la raíz el día 7 (cm); longitud de la raíz el día 13 (cm); peso fresco por planta (g) en la fase de subida a flor; longitud de la lámina = longitud de la lámina (cm); anchura de la lámina = anchura de la lámina (cm); anchura/longitud de la hoja; circularidad del cuerpo de la hoja.
Las tablas 7-9, a continuación, proporcionan los genes seleccionados, los parámetros caracterizados (que se usan como eje x para la correlación) y el transcriptoma tisular correlacionado junto con el valor de correlación (R, calculado usando la correlación de Pearson).
Tabla 7
5 Genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas,
rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor
entre diferentes conjuntos de transcriptomas
Nombre del gen
Nombre del grupo Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R
BDL112
AT3G23 510 B 7 0,84 D 17 0,90 D 8 -0,88 D 10 -0,94
BDL113
AT2G45 310 B 8 0,85 D 13 0,91 D 14 0,91 B 10 0,83
BDL114
AT5G27 820 B 16 0,92 D 6 0,88 B 15 0,94
BDL115
AT4G11 090 C 8 0,85 A 8 0,81 C 10 0,90 B 10 0,92
BDL116
AT4G24 175 B 16 0,92 B 15 0,91
BDL119
AT3G47 965 D 16 0,93 D 15 0,93
BDL120
AT3G03 230 D 16 0,95 D 3 0,89 D 15 0,96
BDL122
AT3G49 000 D 17 0,96 D 8 -0,92 D 10 -0,96 E 6 0,83
BDL123
AT2G21 860 A 16 0,82 D 13 0,92 D 14 0,94 A 15 0,86
BDL124
AT5G51 590 D 12 0,93 C 16 0,93 A 1 -0,85 D 2 -0,91
BDL125
AT3G16 180 D 16 -0,91 D 15 -0,93
BDL128
AT1G60 770 D 5 -0,86 D 17 0,82 D 8 -0,91 E 14 0,88
BDL130
AT3G03 870 C 9 -0,82 D 13 0,85 D 14 0,94 C 6 0,85
BDL131
AT4G27 450 A 1 0,92 A 2 0,91
BDL132
AT4G23 730 D 13 0,90 C 14 0,94 D 14 0,91 C 3 0,81
BDL133
AT3G06 150 D 13 0,86 C 14 0,90 D 14 0,92
BDL134
AT3G28 420 D 13 0,92 D 14 0,91 E 3 0,81 E 11 0,80
BDL135
AT3G18 600 D 12 0,96 D 16 0,87 D 3 0,93 D 2 -0,81
BDL136
AT3G22 990 D 12 0,90 C 16 0,83 D 16 0,81 D 3 0,89
BDL137
AT5G14 530 B 12 0,83 D 12 0,83 B 16 0,83 D 16 0,81
BDL139
AT1G29 800 C 13 0,87 B 13 0,85
BDL141
AT1G29 980 D 18 0,90 C 16 0,81 B 16 0,81 A 3 0,83
BDL142
AT2G39 110 C 16 0,82 D 16 0,83 B 3 0,86 D 3 0,90
BDL143
AT1G62 810 A 13 0,94 D 13 0,82
BDL144
AT3G14 890 C 16 0,81
BDL145
AT1G24 470 C 13 0,89 B 13 0,82 D 14 0,80
BDL146
AT3G09 310 C 14 0,85 C 3 0,81 B 3 0,92 A 3 0,91
BDL148
AT4G35 785 D 17 0,91 D 10 -0,93 D 4 -0,89 B 3 0,82
BDL42
AT5G13 170 B 11 0,88
BDL51
AT5G64 260 E 9 -0,81 A 8 -0,82 D 13 -0,83 B 14 0,82
BDL54
AT2G41 090 A 6 0,82 B 3 -0,86
BDL60
AT2G45 200 C 7 -0,88
BDL65
AT4G20 360 B 7 -0,81 B 18 -0,88 B 12 -0,82 D 11 0,89
BDL78
AT3G26 520 D 13 0,84
BDL149
AT5G15 750 B 14 0,83
BDL149
AT5G15 750 A 14 0,95 B 3 0,89
Tabla 7. Se proporcionan genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptomas. Vec. de corr. = vector de correlación; Conj. exp. = conjunto experimental.
Tabla 8
Genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor
entre diferentes conjuntos de transcriptomas
Nombre del gen
Nombre del grupo Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R
BDL112
AT3G23 510 D 4 -0,84
BDL113
AT2G45 310
BDL114
AT5G27 820
BDL115
AT4G11 090 A 10 0,82 D 10 0,80 C 4 0,93 B 4 0,96
BDL116
AT4G24 175
BDL119
AT3G47 965
BDL120
AT3G03 230
BDL122
AT3G49 000 D 4 -0,84 A 11 0,88
BDL123
AT2G21 860
BDL124
AT5G51 590 C 15 0,91
BDL125
AT3G16 180
BDL128
AT1G60 770 D 10 -0,84 A 1 -0,94 D 1 -0,86 A 2 -0,83
BDL130
AT3G03 870
BDL131
AT4G27 450
BDL132
AT4G23 730
BDL133
AT3G06 150
BDL134
AT3G28 420
BDL135
AT3G18 600
BDL136
AT3G22 990
BDL137
ATSG14 530 C 3 0,89 D 3 0,89
BDL139
AT1G29 800
BDL141
AT1G29 980 C 15 0,84 B 15 0,85
BDL142
AT2G39 110
BDL143
AT1G62 810
BDL144
AT3G14 890
BDL145
AT1G24 470
BDL146
AT3G09 310 A 2 -0,81 C 11 0,83 D 11 0,81
BDL148
AT4G35 785 E 1 0,88
BDL42
AT5G13 170
BDL51
AT5G64 260 D 14 -0,88 E 6 -0,82 B 11 0,87
BDL54
AT2G41 090
BDL60
AT2G45 200
BDL65
AT4G20 360
BDL78
AT3G26 520
BDL149
AT5G15 750
BDL149
AT5G15 750 D 4 -0,84
Tabla 8. Se proporcionan genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptomas. Vec. de corr. = vector de correlación; Conj. exp. = conjunto experimental.
Tabla 9
Genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor 5 entre diferentes conjuntos de transcriptomas
Nombre del gen
Nombre del grupo Conj. exp. Vec. de corr. R
BDL112
AT3G23510
BDL113
AT2G45310
BDL114
AT5G27820
BDL115
AT4G11090 A 4 0,86
BDL116
AT4G24175
BDL119
AT3G47965
BDL120
AT3G03230
BDL122
AT3G49000
BDL123
AT2G21860
BDL124
AT5G51590
BDL125
AT3G16180
BDL128
AT1G60770
BDL130
AT3G03870
BDL131
AT4G27450
BDL132
AT4G23730
BDL133
AT3G06150
BDL134
AT3G28420
BDL135
AT3G18600
BDL136
AT3G22990
BDL137
AT5G14530
BDL139
AT1G29800
BDL141
AT1G29980
BDL142
AT2G39110
BDL143
AT1G62810
BDL144
AT3G14890
BDL145
AT1G24470
BDL146
AT3G09310
BDL148
AT4G35785
BDL42
AT5G13170
BDL51
AT5G64260
BDL54
AT2G41090
BDL60
AT2G45200
BDL65
AT4G20360
BDL78
AT3G26520
BDL149
AT5G15750
BDL149
AT5G15750
Tabla 9. Se proporcionan genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptomas. Vec. de corr. = vector de correlación; Conj. exp. = conjunto experimental.
Las tablas 10 y 11, a continuación, proporcionan datos sobre los homólogos de genes seleccionados, los parámetros caracterizados (que se usan como eje x para la correlación) y el transcriptoma tisular correlacionado junto con el valor de correlación (R, calculado usando la correlación de Pearson).
5 Tabla 10
Homólogos de genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes
de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptomas
Nombre del gen
Nombre del grupo Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R
1 CD X O ° ÜZ o
AT1G217 60 D 17 0,97 D 8 -0,81 B 16 0,82 D 10 -0,91
BDL113 _ H0
AT1G020 00 B 13 -0,81
BDL113 _ H1
AT2G453 15 E 1 0,92
BDL113 _ H2
AT4G001 10 B 18 -0,84 E 14 0,87 E 11 0,87
BDL120 _ H0
AT3G032 40 D 16 0,89 C 4 -0,84 D 15 0,88
5
10
15
20
25
BDL78
AT2G368 B 12 -0,92 C 2 -0,87
H0
30
Tabla 10. Se proporcionan homólogos de genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptomas. Vec. de corr. = vector de correlación; Conj. exp. = conjunto experimental.
Tabla 11
Homólogos de genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes
de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptomas
Nombre del gen
Nombre del grupo Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R Conj. exp. Vec. de corr. R
BDL110_H0
AT1G217 60 D 4 -0,85 B 3 0,81 A 3 0,92 B 15 0,87
BDL113_H0
AT1G020 00
BDL113_ H1
AT2G453 15
BDL113_ H2
AT4G001 10
BDL120_ H0
AT3G032 40
BDL78_H 0
AT2G368 30
Tabla 11. Se proporcionan homólogos de genes seleccionados de Arabidopsis y su correlación con el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento de aceite, contenido de aceite), la biomasa, el ritmo de crecimiento y/o componentes de vigor entre diferentes conjuntos de transcriptomas. Vec. de corr. = vector de correlación; Conj. exp. = conjunto experimental.
Ejemplo 4
Clonación de genes y generación de vectores binarios para la expresión en plantas
Para validar su papel en la mejora del contenido de aceite, el rendimiento de la planta, el rendimiento de semillas, la biomasa, el ritmo de crecimiento, la TEAB, la EUN y/o el vigor, los genes seleccionados se sobreexpresaron en plantas, de la siguiente manera.
Estrategia de clonación
Los genes enumerados en el ejemplo 1 anteriormente en esta memoria se clonaron en vectores binarios para la generación de plantas transgénicas. Para la clonación, se identificó por primera vez el marco de lectura abierta (ORF) de longitud completa. En el caso de los grupos de ORF-EST y en algunos casos ya publicados, se analizaron las secuencias de ARNm para identificar el marco de lectura abierto completo comparando los resultados de varios algoritmos de traducción con proteínas conocidas de otras especies vegetales. Para clonar los ADNc de longitud completa, se realizó la transcripción inversa (RT) seguida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; RT-PCR) en el ARN total extraído de hojas, flores, silicuas u otros tejidos vegetales, cultivados en condiciones normales. El ARN total se extrajo como se describe en el ejemplo 2 anterior. La producción de ADNc y la amplificación por PCR se realizó usando protocolos estándar descritos en otra parte (Sambrook J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2a Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York.) que son bien conocidos por los expertos en la técnica. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR (Qiagen). En caso de que no se haya encontrado la secuencia codificante completa, se usó el kit RACE de Ambion (RACE = _R_apid_A_ccess to _c_DNA_E_nds) para acceder al transcrito completo de ADNc del gen a partir de las muestras de ARN descritas anteriormente. El procedimiento RACE se realizó para los genes BDL-108 (SEQ ID NO:726), BDL-110 (SEQ ID NO:728) y BDL-111 (SEQ ID NO:730) usando las secuencias de cebadores enumeradas
en la tabla 12, a continuación. Los productos de RACE se clonaron en vectores de número de copias elevados, seguido por secuenciación. La información del procedimiento RACE se usó para la clonación del oRf de longitud completa de los genes correspondientes.
Tabla 12
5 Cebadores de RACE usados para secuenciación de los genes de la invención identificados
Nombre del gen
Cebadores usados para amplificación Plásmido de número de copias elevado usados para la clonación de productos de RACE
BDL108_Race
Dir: BDL108 Externo Race (SEQ ID NO:853): GCTATACAACATGGGAGTTATACC Topo TA
BDL108_Race
Dir: BDL108 Interno Race (SEQ ID NO:854): CTATCGACAGTGCTGGTACA
BDL108_Race
Inv:3' Cebador Externo Race (SEQ ID NO:855): GCGAGCACAGAATTAATACGACT
BDL108_Race
Inv:3' Cebador interno Race (SEQ ID NO:856): CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG
BDL110_Race
Dir: BDL110 Externo Race (SEQ ID NO:857): TGCAGTCTAAATACGATGGATCA Topo TA
BDL110_Race
Dir: BDL110 Interno Race (SEQ ID NO:858): GAGTAGGAACACTTACATTCGA
BDL110_Race
Inv:3' Cebador Externo Race (SEQ ID NO:859): GCGAGCACAGAATTAATACGACT
BDL110_Race
Inv:3' Cebador interno Race (SEQ ID NO:860): CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG
BDL111_Race
Dir: BDL111 Externo Race (SEQ ID NO:861): TCTCAAGAAGCTCTTCGTGGA Topo TA
BDL111_Race
Dir: BDL111 Interno Race (SEQ ID NO:862): GAGGAAGAATCTGAGCCGAT
BDL111_Race
Inv:3' Cebador Externo Race (SEQ ID NO:863): GCGAGCACAGAATTAATACGACT
BDL111_Race
Inv:3' Cebador interno Race (SEQ ID NO:864): CGCGGATCCGAATTAATACGACTCACTATAGG
Tabla 12. Se proporcionan los cebadores de PCR usados para secuenciación RACE. Dir = cebador directo; Inv = cebador inverso;
Cuando se clonó ADN genómico, como en el caso del gen BDL119, el gen se amplificó por PCR directa en ADN genómico extraído de tejido foliar usando el kit DNAeasy (Qiagen No. de cat. 69104).
Habitualmente, se sintetizaron 2 conjuntos de cebadores para la amplificación de cada gen de un ADNc o una 10 secuencia genómica; un conjunto externo de cebadores y un conjunto interno (cebadores de PCR anidados). Cuando fue necesario (p. ej., cuando la primera reacción de PCR no dio como resultado un producto satisfactorio para la secuenciación), se usó un cebador adicional (o dos) de los cebadores de PCR anidados. La tabla 13 a continuación proporciona los cebadores usados para la clonación de genes seleccionados.
Tabla 13
Los cebadores de PCR usados para clonar los genes de la invención
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
BDL42
SalI, Xbal Dir Anidado: BDL42_NF_SalI (SEQ ID NO:865)
AATGTCGACAGAAAATGGGAGTCATGATCAA
Dir Externo: BDL42_EF_SalI (SEQ ID NO:866)
AATGTCGACTGCTATAGAAAATGGGAGTCATG
Inv Anidado: BDL42_NR_XbaI (SEQ ID NO:867)
TATCTAGATCATCAAACGGTTTCAGGACGAG
Inv Externo: BDL42_ER_XbaI (SEQ ID NO:868)
TATCTAGATGACACTTCAAACGGTTTCAG
BDL46
SalI, Smal Dir Anidado: BDL46_NF_SalI (SEQ ID NO:869)
ACGGTCGACACTTGATGACAATGGGCGAC
Inv Anidado: BDL46_NR_SmaI (SEQ ID NO:870)
TCCCGGGTTATTACCTACAAGTAGATGATTCTACACC
BDL51
Xbal, SacI Dir: BDL51_F_XbaI (SEQ ID NO:871)
AATCTAGATCTCAATGGCTTCTAATTACCG
Inv Anidado: BDL51_NR_SacI (SEQ ID NO:872)
AGAGCTCGTGTCTTACTCACATCCCTTGG
Inv Externo: BDL51_ER_SacI (SEQ ID NO:873)
TGAGCTCTGCCACGTGTCTTACTCACATC
BDL52
SalI, Xbal Dir: BDL52_F_SalI (SEQ ID NO:874)
AATGTCGACCTATAATGGCTGGAATGTGTTG
Inv Anidado: BDL52_NR_XbaI (SEQ ID NO:875)
TATCTAGATTACCCATACTGTTATAGATTTTTTCTC
Inv Externo: BDL52_ER_XbaI (SEQ ID NO:876)
TATCTAGACATCAACAAAGGCAGCTAAATC
BDL54
SalI, Xbal Dir Anidado: BDL54_NF_SalI (SEQ ID NO:877)
AATGTCGACAAACAATGGCGAATAAGTTCAC
Inv Anidado: BDL54_NR_XbaI (SEQ ID NO:878)
TATCTAGATCATCAAGAAAACAACGCTTCG
BDL56
SalI, XbaI Dir Anidado: BDL56_NF_SalI (SEQ ID NO:879)
AGCGTCGACCAAATATGACTGTGATGAATCACC
Dir Externo: BDL56_EF_SalI (SEQ ID NO:880)
ATAGTCGACAAAGAGATCTTCACAAATATGACTG
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
Inv Anidado: BDL56_NR_XbaI (SEQ ID NO: 881)
TATCTAGACTACTATCTCTTATAAGTTGCAACCAAG
Inv Externo: BDL56_ER_XbaI (SEQ ID NO:882)
TATCTAGAATAGAAATGGCAAAATGGGTG
BDL59
SalI, Xbal Dir Anidado: BDL59_NF_SalI (SEQ ID NO:883)
AATGTCGACCTGCAATGGCTTCTCCTCTT
Dir Externo: BDL59_EF_SalI (SEQ ID NO:884)
TAAGTCGACGATCTCTCTCTGCACTCTCTGAC
Inv Anidado: BDL59_NR_XbaI (SEQ ID NO:885)
TATCTAGATCAATCTCAGACTCGAACGCGTG
Inv Externo: BDL59_ER_ XbaI (SEQ ID NO:886)
TATCTAGACTTCAACAATCTCAGACTCGAAC
BDL60
SalI, SacI Dir Anidado: BDL60_NF_SalI (SEQ ID NO:887)
AGAGCTCAGGAAAATGACAGAATCGAGTC
Dir Externo: BDL60_EF_SalI (SEQ ID NO:888)
AATGTCGACGGAGAGGTTACTGATCTGAATTG
Inv Anidado: BDL60_NR_SacI (SEQ ID NO:889)
AGAGCTCAGGAAAATGACAGAATCGAGTC
Inv Externo: BDL60_ER_SacI (SEQ ID NO:890)
TGAGCTCAGCTTAGGTGTATGAACATTCTG
BDL65
SalI, Smal Dir Anidado: BDL65_NF_SalI (SEQ ID NO:891)
AATGTCGACTCCAATTCCATCTTCCCATG
Dir Externo: BDL65_EF_SalI (SEQ ID NO:892)
AATGTCGACCTCTCCTCTGCTCTCCAATTC
Inv Anidado: BDL65_NR_SmaI (SEQ ID NO:893)
TCCCGGGTCATCATTCGAGGATCGTCCCA
Inv Externo: BDL65_ER_SmaI (SEQ ID NO:894)
TCCCGGGCTTATAATCATTCGAGGATCGT
BDL67
SalI, Smal Dir Anidado: BDL67_NF_SalI (SEQ ID NO:895)
AATGTCGACGGATAATGGCTTCGTATGGC
Inv Anidado: BDL67_NR_SmaI (SEQ ID NO:896)
TCCCGGGTTATCAGTTTCTCITGGCGATGA
BDL68
SalI, XbaI Dir Anidado: BDL68_NF_SalI (SEQ ID NO:897)
TAGGTCGACTAGCCATGGACAACGAAGG
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
Inv Anidado: BDL68_NR_XbaI (SEQ ID NO:898)
TATCTAGATTATTAGCCACTAGGATTATCAAGTC
BDL78
Xbal, SacI Dir: BDL78_F_XbaI (SEQ ID NO:899)
AATCTAGATCCGATCATGCCGACCAG
Inv Anidado: BDL78_NR_SacI_new (SEQ ID NO:900)
TGAGCTCTTATCAGTAATCGGTGGTAGGCA
Inv Externo: BDL78_ER_SacI (SEQ ID NO:901)
TGAGCTCCAGATTAACAACGTTGAATTTGAC
BDL82
SalI, Xbal Dir Anidado: BDL82_NF_SalI (SEQ ID NO:902)
AAGGTCGACCGAGAGAGACAGAGAGGTTTCG
Dir Externo: BDL82_EF_SalI (SEQ ID NO:903)
ATAGTCGACCGAAGTTTGAGCTAAGAATCC
Inv Anidado: BDL82_NR_XbaI (SEQ ID NO:904)
TATCTAGATTATTATTCTCCATGGTCGTGAAG
Inv Externo: BDL82_ER_XbaI (SEQ ID NO:905)
TATCTAGATAGCTATTATTCTCCATGGTCG
BDL89
Sall, Xbal Dir Anidado: BDL89_NF_SalI (SEQ ID NO:906)
AATGTCGACCCAGGATGAAGTTCATTTCTG
Dir Externo: BDL89_EF_SalI (SEQ ID NO:907)
AATGTCGACTCTCTCCATCTCCCATCCAG
Inv Anidado: BDL89_NR_XbaI (SEQ ID NO:908)
TATCTAGATCATCGCATCACTCAGTCAAACAAAC
Inv Externo: BDL89_ER_XbaI (SEQ ID NO:909)
TATCTAGAGATGATAGAAGAGGTGACCGC
BDL95short
SalI, SacI Dir: BDL95_Short_F (SEQ ID NO:910)
AATGTCGACGGCGAATGGCTGGATTTC
Inv Anidado: BDL95_NR_SacI (SEQ ID NO:911)
TGAGCTCTTATCAGTCCTGATGTGTCTGCTG
BDL100
Sall, SacI Dir Anidado: BDL100_NF_SalI (SEQ ID NO:912)
AATGTCGACAACAATGGAGAGCGAGATGGCG
Dir Externo: BDL100_EF_SalI (SEQ ID NO:913)
AATGTCGACGAGGAGGAACAAACAACTCATC
Inv Anidado: BDL100_NR_SacI (SEQ ID NO:914)
TGAGCTCTCATCATTGAATCATCGGATCACC
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
Inv Externo: BDL100_ER_sacI (SEQ ID NO:915)
TGAGCTCGCAGGTCATTGAATCATCGG
BDL106
Xbal, SacI Dir Anidado:BDL106_NF_XbaI (SEQ ID NO:916)
ATTCTAGAAAACCATGACCGTCGTCTC
Dir Externo: BDL106_EF_XbaI (SEQ ID NO:917)
CTTCTAGAGGTCTCITCTCAGATACTCATTCAC
Inv Anidado: BDL106_NR_SacI (SEQ ID NO:918)
TGAGCTCTTATTAGAATCTGCAGAAAGCTAG
Inv Externo: BDL106_ER_SacI (SEQ ID NO:919)
TGAGCTCAGATGTCAAAGAGGGCTTACTC
BDL108
SalI, Xbal Dir Anidado: BDL108_NF_SalI (SEQ ID NO:920)
AATGTCGACCAGTGATGAGGAAGCTCAAGA
Dir Externo: BDL108_EF_SalI (SEQ ID NO:921)
ATAGTCGACCGTTGTTTGCACCACCTTG
Inv Anidado: BDL108_NR_XbaI (SEQ ID NO:922)
TATCTAGATTATTAAGCAAGCATGTCGTAGTCA
Inv Externo: BDL108_ER_XbaI (SEQ ID NO:923)
TCTCTAGATTAGATCTTTTAAGCAAGCATGTCG
BDL110
Sall, Xbal Dir Anidado: BDL110_NF_SalI (SEQ ID NO:924)
ACGGTCGACTCCACATGACTTCAGATGCTC
Dir Externo: BDL110_EF_SalI (SEQ ID NO:925)
ACTGTCGACGAACATCACCCAATTCTCTAGC
Inv Anidado: BDL110_NR_xbaI (SEQ ID NO:926)
TATCTAGACTACTAGCCGGTGACAAAGTAATC
Inv Externo: BDL110_ER_XbaI (SEQ ID NO:927)
TATCTAGACTAATCGTTGGTTGATGTGTCACTCTAG
BDL111
EcoRV Dir Anidado: BDL111_NF_EcoRV(SEQ ID NO:928)
TAGATATCAAAAGATGCAAGTTGTTTCTCC
Dir Externo: BDL111_EF_EcoRV (SEQ ID NO:929)
TAGATATCCTGTGTGTTTGTATTTATTTGGATC
Inv Anidado: BDL111_NR_EcoRV(SEQ ID NO:930)
TAGATATCTCATGATGATCAGTAAGGATGAACATTC
Inv Externo: BDL111_ER_EcoRV (SEQ ID NO:931)
TAGATATCTCAGCAAGAAGGTGATGATCAGTAAGG
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
BDL112
SalI, Xbal Dir Anidado: BDL112_NF_Sl (SEQ ID NO:932)
TTGGTCGACCGTAGACACGTATTTTGAAGGG
Dir Externo: BDL112_EF_Sl (SEQ ID NO:933)
TATGTCGACTTAATGGTAGACCGTAGACACG
Inv Anidado: BDL112_NR_Xb (SEQ ID NO:934)
CAATCTAGATTAATGCTCTCAAGAGACACAATAAGC
Inv Externo: BDL112_ER_Xb (SEQ ID NO:935)
CTTCTAGATTAGGTCATCAAATATTGTATAGATCG
BDL113 GA
SacI, Xbal Producto sintético
BDL114
SalI, Xbal Dir: BDL114_NF_Sl (SEQ ID NO:936)
TTTGTCGACTCAGCTTCAGATGGTGATTCC
Inv: BDL114 NR_Xb (SEQ ID NO:937)
TTTCTAGATCATCAGAGCAACTTGACACCAGC
BDL115
Smal, SacI Dir Anidado: BDL115_NF_SmaI (SEQ ID NO:938)
ACCCGGGAGAAGATGAAGCTAAAATGGGAA
Dir Externo: BDL115_EF_SmaI (SEQ ID NO:939)
ACCCGGGGTATATCTCTCAGCGCGAGG
Inv Anidado: BDL115_NR_SacI (SEQ ID NO:940)
TGAGCTCTTATTATTTACCGGTTCGACCATT
Inv Externo: BDL115_ER_SacI (SEQ ID NO:941)
TGAGCTCTTAGCCATTGACTACATACAAGCAA
BDL116
EcoRV Dir Anidado:BDL116_NF_EeRV (SEQ ID NO:942)
TAGATATCACCTTGGAACGATTTTGCC
Dir Externo: BDL116_EF_EcRV (SEQ ID NO:943)
GAGATATCAAAGCTCTGACCTTGGAACG
Inv Anidado: BDL116_NR_EcRV (SEQ ID NO:944)
CAGATATCTTATCATAAGTACAAATCAGTCTGCTCAC
Inv Externo: BDL116_ER_EcRV(SEQ ID NO:945)
TAGATATCTCACATTCATAAGTACAAATCAGTCTGC
BDL119
EcoRV Dir: BDL119_NF_EcRV (SEQ ID NO:946)
TTGATATCAGTTTCTCCGTCGACGATACC
Inv: BDL119_NR_EcRV (SEQ ID NO:947)
AAGATATCGGTCAAGTACATAAGCTAATAGATG
BDL120
SacI, SalI Dir: BDL120_F_SalI (SEQ ID NO:948)
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
AATGTCGACAACAATGGTGCTTCTACTTGTGATTG
Inv: BDL120_R_SacI (SEQ ID NO:949)
TGAGCTCTCACTTCCACTAGTCACTACAAGCG
BDL122
SalI, Xbal Dir:BDL122_NF_Sl (SEQ ID NO:950)
CTGGTCGACACAGTATTGAGAGACTTCCTGGTG
Inv: BDL122_NR_Xba (SEQ ID NO:951)
GCTTCTAGACAATGTGAACTAAATCGACC
BDL123
SacI Dir:BDL123_F_Sac (SEQ ID NO:952)
AGAGCTCGTTTTCTTCGCCATGGC
Inv: BDL123_R_Sac (SEQ ID NO:953)
TGAGCTCITAAACAGTGACTACCACAGTGCA
BDL124
EcoRV Dir Anidado: BDL124_NF_EcRV (SEQ ID NO:954)
TCGATATCGGAATCAGAATCTTTTCAGATGG
Dir Externo: BDL124_EF_EcRV (SEQ ID NO:955)
CTGATATCGAGTTTCTCTTCCTTAATTGTCG
Inv Anidado: BDL124_NR_EcRV (SEQ ID NO:956)
TTGATATCATCATCAGCTTGGAACCTCG
Inv Externo: BDL124_ER_EcRV (SEQ ID NO:957)
TAGATATCTCTTTCCATCGATCATCAGC
BDL125
SalI, Xbal Dir: BDL125_NF_Sl (SEQ ID NO:958)
CTAGTCGACTAACAACAATGGAGAACCCTC
Inv: BDL125_NR_Xb (SEQ ID NO:959)
ACTCTAGATTAATGATCAACCAATTGGTCTTAG
BDL127 GA
SacI, Xbal Producto sintético
BDL128
Xbal Dir: BDL128_NF_XbaI (SEQ ID NO:960)
TATCTAGAAGAAAATGGCGATGCGAC
Inv: BDL128_NR_XbaI (SEQ ID NO:961)
TATCTAGATCATCACACATCCTGAGATACTTCATC
BDL129 GA
SacI, Xbal Producto sintético
BDL130 GA
SacI, Xbal Producto sintético
BDL131
SalI, XbaI Dir: BDL131_NF_SalI (SEQ ID NO:962)
AATGTCGACAGAGAAATGTTGGCTATCTTCC
Inv: BDL131_NR_XbaI (SEQ ID NO:963)
TATCTAGATCATCAGAGAGACCAATTGGCTTC
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
BDL132
SalI, Xbal Dir Anidado: BDL132_NF_SalI (SEQ ID NO:964)
AATGTCGACTTTGAATGGAACCATCATCTG
Dir Externo: BDL132_EF_SalI (SEQ ID NO:965)
TTAGTCGACCTGAATCTGTTTTTGAATGGAAC
Inv Anidado: BDL132_NR_XbaI (SEQ ID NO:966)
TATCTAGATTATTAGGTGGAAAGAACAAGCG
Inv Externo: BDL132_ER_ XbaI (SEQ ID NO:967)
TATCTAGATCAACAAGACAAGATAATGAAAGACACAG
BDL133
EcoRV Dir: BDL133_NF_EcoRV(SEQ ID NO:968)
TAGATATCTTAAAATGCCGGAGAAAGG
Inv: BDL133_NR_EcoRV (SEQ ID NO:969)
ATGATATCCTACTATCTTACACACAATGCATTCAG
BDL134 GA
SacI, Xbal Producto sintético
BDL135
SalI, Xbal Dir: BDL135_NF_SalI (SEQ ID NO:970)
ATAGTCGACGAAACATGGTTGAATCGGAC
Inv: BDL135_NR_XbaI (SEQ ID NO:971)
TATCTAGATTAGACACTTTATGCCTCCTTTGTAG
BDL136
SalI, SacI Dir: BDL136_NF_Sl (SEQ ID NO:972)
AGCGTCGACTTAGAGAGAGATGCAGAAACGG
Inv: BDL136_NR_Sc (SEQ ID NO:973)
CGAGCTCCTAATCTAGAGAAGACTTTTACATGCC
BDL137 GA
SacI, XbaI Producto sintético
BDL139 GA
SacI, XbaI Producto sintético
BDL141 GA
SacI, XbaI Producto sintético
BDL142
SalI, XbaI Dir Anidado: BDL142_NF_SalI (SEQ ID NO:974)
AATGTCGACCATCCTCATGAATAATTCTACATC
Dir Externo: BDL142_EF_Sal1 (SEQ ID NO:975)
ACTGTCGACGCATTCCATTCATCCTCATGA
Inv Anidado: BDL142_NR_Xba (SEQ ID NO:976)
ATTCTAGAGTGTGATTATCAGTTTGTTCTCTC
Inv Externo: BDL142_ER_Xba1 (SEQ ID NO:977)
ATTCTAGAGAAACGACAAGTGATTATAATGG
BDL143
SalI, BamHI Dir: BDL143_F_Sal1 (SEQ ID NO:978)
ACTGTCGACAACATGTTGTTTAACTGGACTAAG
Nombre del gen
Enzimas de restricción usadas para la clonación Cebadores usados para amplificación
Inv Anidado: BDL143_NR_BamHI (SEQ ID NO:979)
ATGGATCCTTACAGAACCGGTCAAGATGAAG
Inv Externo: BDL143_ER_BamHI (SEQ ID NO:980)
ATGGATCCCAATAACTCGAACACGAACAAC
BDL144
EcoRV Dir: BDL144_F_EcoRV (SEQ ID NO:981)
TAGATATCAACAATGATTACAGTAGCCCCCTTC
Inv Anidado: BDL144_NR_EcoRV (SEQ ID NO:982)
ATGATATCCTAACAAGCACAAGACTGATACAGC
Inv Externo: BDL144_ER_EcoRV (SEQ ID NO:983)
ATGATATCCAAAAGCTAGCTACTAGTTTCATCAC
BDL145
Salí, Xbal Dir: BDL145_F_Sal (SEQ ID NO:984)
ATAGTCGACGAAAGAAAGAGAAAGCAGAACATG
Inv: BDL145_NR_Xba1 (SEQ ID NO:985)
ATTCTAGATGGAGGAGCAAATACAAACTTG
BDL146
Salí, Xbaí Dir: BDL146_F_Sall (SEQ ID NO:986)
AATGTCGACGAAACTTGGTTTTGAGCTTAAC
Inv Anidado: BDL146_NR_Xba1 (SEQ ID NO:987)
ATTCTAGATCATCCCATTGCTTTCTCTAGTATTAG
Inv Externo: BDL146_ER_Xba1 (SEQ ID NO:988)
ATTCTAGATTAAATGTATCGCTCCAAAAGAC
BDL148
Salí, Sací Dir Anidado: BDL148_NF_Sal1 (SEQ ID NO:989)
ACTGTCGACCTAATTCTCTCCGTCTCGATCG
Dir Externo: BDL148_EF_Sal1 (SEQ ID NO:990)
ACTGTCGACGACTGATTTTACGCTTTATTGCTC
Inv Anidado: BDL148_NR_NEW_Sac1 (SEQ ID NO:991)
GTGAGCTCTTAAACAGGTCATCTCGAGCCAC
Inv Externo: BDL148_ER_NEW_Sac1 (SEQ ID NO:992)
GAGAGCTCCGTTGCCTGACAGAATCTTTG
Tabla 13. Se proporcionan los cebadores de PCR usados para clonar los genes descritos en la tabla 12 anterior. Dir = cebador directo; Inv = cebador inverso; Anidado = cebador anidado para PCR (cebador interno); Externo = cebador externo para PCR.
Se realizó la secuenciación de los productos de PCR amplificados, usando el secuenciador ABI 377 (Amersham Biosciences Inc). Para facilitar la clonación de los ADNc/las secuencias genómicas, se añadió una prolongación de 8-12 pb al extremo 5' de cada cebador. La prolongación del cebador incluye un sitio de restricción de endonucleasa. 5 Los sitios de restricción se seleccionaron usando dos parámetros: (a). El sitio no existía en la secuencia de ADNc; y (b). Los sitios de restricción en los cebadores directo e inverso se diseñaron de manera que el ADNc digerido se
inserte en la formación sentido en el vector binario utilizado para la transformación. Los productos de PCR se digirieron con las endonucleasas de restricción (New England BioLabs Inc) según el diseño de los sitios en los cebadores (tabla 13, anterior) y se clonaron en vectores binarios según la tabla 14, a continuación. Los productos de RACE se secuenciaron como se describe a continuación en esta memoria para BDL108, BDL 110 y BDL111.
5 Tabla 14
Sitios de enzimas de restricción usados para clonar los genes identificados en el vector binario
Nombre del gen
Vector binario Enzimas de restricción usadas para la clonación en el vector binario-DIRECTA Enzimas de restricción usadas para la clonación en el vector binario- INVERSA Enzimas de restricción usadas para digerir el vector binario
BDL42
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL46
pBXYN SalI SmaI SalI, Ecl136
BDL51
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL52
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL54
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL56
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL59
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL60
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL65
pBXYN SalI SmaI SalI, Ecl136
BDL67
pBXYN SalI Smal SalI, Ecl136
BDL68
pBXYN SalI SmaI SalI, Ecl136
BDL78
pBXYN SalI, EcoRI SalI, EcoRI
BDL82
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL89
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL95
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL100
pBXYN SalI SacI SalI, SacI
BDL106
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL108
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL110
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL111
pBXYN EcoRV EcoRV SmaI, Ecl136
BDL112
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL114
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL115
pBXYN SmaI SacI Smal, SacI
BDL116
pBXYN EcoRV EcoRV SmaI, Ecl136
BDL119
pBXYN EcoRV EcoRV SmaI, Ecl136
BDL120
pBXYN SalI SacI SaIl, SacI
BDL122
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL123
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL124
pBXYN EcoRV EcoRV SmaI, Ecl136
BDL125
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL128
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL131
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL132
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL133
pBXYN EcoRV EcoRV SmaI, Ecl136 II
BDL135
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL136
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL142
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL143
pBXYN BamHI Sal I SalI, Ecl 136 II
BDL144
pBXYN EcoRV EcoRV Smal, Ecl 136 II
BDL145
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL146
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL148
pBXYN SalI EcoRI SalI, EcoRI
BDL113_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
BDL127_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
BDL129_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
BDL130_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
BDL134_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
BDL137_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
BDL139_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
BDL141_GA
pBXYN SacI Xba I SacI, Xba I
Tabla 14.
Cada producto de PCR digerido se insertó en un vector de número de copias elevado, vector plasmídico pBlue-script KS [vector plasmídico pBlue-script KS, Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) stratagene (.) com/manuals/212205 (.) pdf] o en plásmidos que se originan a partir de estos vectores. En los casos en que se usó 5 el vector pGXN de número de copias elevado (originado de pBlue-script KS), el producto de PCR se insertó cadena arriba del terminador NOS (SEQ ID NO:776) originado a partir del vector binario pBI 101.3 (No. de acceso del GenBank U12640, nucleótidos 4356 a 4693, SEQ ID NO:776) y cadena abajo del promotor 35S. En otros casos (pKSJ_6669a), el promotor At6669 (SEQ ID NO:775) ya se clonó en el pBlue-script KS, por lo que el gen se introdujo cadena abajo del promotor (tabla 15 a continuación). En todos los casos, después de la confirmación de la 10 secuencia de los genes clonados, el ADNc clonado acompañado o no con el terminador NOS se introdujo en el vector binario pGI [pBXYN que contenía el promotor 35S de CaMV] según la tabla 14, anterior, por digestión con unas endonucleasas de restricción apropiadas. En cualquier caso, el inserto fue seguido por una copia única del terminador NOS (SEQ ID NO:776).
Tabla 15
Genes clonados a partir de bibliotecas de ADNc o ADN genómico en un plásmido de número de copias
elevado
Nombre del gen
Plásmido de número de copias elevado Amplificado a partir de SEQ ID NO del polinucleótido: SEQ ID NO del polipéptido:
Organismo
Origen
BDL42
pGXN Arabidopsis ARNm 692 86
BDL46
pKS Arabidopsis ARNm 693 87
BDL51
pGXN Arabidopsis ARNm 694 88
BDL52
pGXN Tomate ARNm 695 713
BDL54
pGXN Arabidopsis ARNm 696 90
BDL56
pGXN Arabidopsis ARNm 697 91
BDL59
pGXN Arabidopsis ARNm 698 92
BDL60
pGXN Arabidopsis ARNm 699 93
BDL65
pKS Arabidopsis ARNm 700 94
BDL67
pKS Arabidopsis ARNm 701 714
BDL68
pKS Arabidopsis ARNm 702 96
BDL78
pGXN Arabidopsis ARNm 703 97
BDL82
pGXN Arabidopsis ARNm 704 98
BDL89
pGXN Arroz ARNm 705 99
BDL95
pGXN Arroz ARNm 706 715
BDL100
pGXN Arroz ARNm 657 707
BDL106
pGXN Canola ARNm 658 52
BDL108
pGXN Canola ARNm 659 708
BDL110
pGXN Canola ARNm 660 709
BDL111
pKSJ_6669a Canola ARNm 661 710
BDL112
pGXN Arabidopsis ARNm 662 56
BDL114
pGXN Arabidopsis ARNm 664 58
BDL115
pKSJ Arabidopsis ARNm 665 59
BDL116
pKSJ_6669a Arabidopsis ARNm 666 60
BDL119
pKSJ_6669a Arabidopsis ADN genómico 667 711
BDL120
pGXN Arabidopsis ARNm 668 62
BDL122
pGXN Arabidopsis ARNm 669 63
BDL123
pGXN Arabidopsis ARNm 670 64
BDL124
pKSJ_6669a Arabidopsis ARNm 671 65
BDL125
pGXN Arabidopsis ARNm 672 66
Nombre del gen
Plásmido de número de copias elevado Amplificado a partir de SEQ ID NO del polinucleótido: SEQ ID NO del polipéptido:
Organismo
Origen
BDL128
pGXN Arabidopsis ARNm 674 68
BDL131
pGXN Arabidopsis ARNm 677 71
BDL132
pGXN Arabidopsis ARNm 678 72
BDL133
pKSJ_6669a Arabidopsis ARNm 679 73
BDL135
pGXN Arabidopsis ARNm 681 75
BDL136
pGXN Arabidopsis ARNm 682 76
BDL142
pGXN Arabidopsis ARNm 686 80
BDL143
pKSJ Arabidopsis ARNm 687 81
BDL144
pKSJ_6669a Arabidopsis ARNm 688 82
BDL145
pGXN Arabidopsis ARNm 689 83
BDL146
pGXN Arabidopsis ARNm 690 84
BDL148
pGXN Arabidopsis ARNm 691 85
BDL113 GA
pGA4 Sintético GeneArt 663 57
BDL127_GA
pCR4Blunt- TOPO Sintético GeneArt 673 67
BDL129 GA
pGA4 Sintético GeneArt 675 69
BDL130 GA
pGA14 Sintético GeneArt 676 712
BDL134 GA
pGA4 Sintético GeneArt 680 74
BDL137 GA
pGA18 Sintético GeneArt 683 77
BDL139 GA
pGA15 Sintético GeneArt 684 78
BDL141 GA
pGA4 Sintético GeneArt 685 79
Tabla 15: Los genes clonados y sintéticos se proporcionan junto con los identificadores de secuencia de sus polinucleótidos y polipéptidos. También se proporcionan el organismo fuente, el tejido y los vectores de clonación.
Los productos digeridos y el vector plasmídico linealizado se ligaron usando la enzima T4 ADN ligasa (Roche, Suiza). El plásmido pPI se construyó insertando una secuencia señal de poli-(A) sintética, que se origina a partir del vector plasmídico básico pGL3 (Promega, Acc No U47295; pb 4658-4811) en el sitio de restricción de HindIII del 5 vector binario pBI101.3 (Clontech, No. de Acc. U12640). pGI (figura 3) es similar a pPI, pero el gen original en la cadena principal, el gen GUS, fue sustituido por el gen GUS-Intron seguido por el terminador NOS (SEQ ID NO:776) (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). Se usó pGI para clonar las secuencias de polinucleótidos, inicialmente bajo el control del promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810 - 812 (28 de febrero de 1985); SEQ ID NO:777.
10 Las secuencias de ADN seleccionadas fueron sintetizadas por un proveedor comercial GeneArt, GmbH [Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) geneart (.) com/)]. El ADN sintético está diseñado in silico. Se añadieron sitios de enzimas de restricción adecuadas a las secuencias clonadas en el extremo 5' y en el extremo 3' para permitir la clonación posterior en el binario pBXYN cadena abajo del promotor 35S de CaMV (SEQ ID NO: 777).
Optimización de genes para expresión en plantas dicotiledóneas- Para optimizar la secuencia codificante
15 (diseño in silico), se usaron tablas de uso de codones calculadas a partir de transcriptomas de plantas [ejemplos de dichas tablas se pueden encontrar en la base de datos de uso de codones disponible en línea en Hypertext Transfer Protocol://World Wide Web (.) kazusa (.) or (.) jp/codon/]. Las secuencias codificantes optimizadas se diseñaron de manera que no se introduzcan cambios en la secuencia de aminoácidos codificada (de polipéptidos seleccionados
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30
35
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50
55
de la tabla 1, ejemplo 1) mientras se usan codones preferidos para la expresión en plantas dicotiledóneas, principalmente Arabidopsis, tomate, canola y soja, evitando codones raros para Arabidopsis; y plantas monocotiledóneas tales como el maíz. Dichas secuencias optimizadas promueven una mejor velocidad de traducción y, por lo tanto, niveles de expresión de proteína más elevados. Los genes para los que se prepararon secuencias sintéticas (artificiales) optimizadas con codones son: BDL-113 (SEQ ID NO:663 polinucleótido, SEQ ID NO:57 polipéptido), BDL-127 (SEQ ID NO:673 polinucleótido, SEQ ID NO:67 polipéptido), BDL-129 (SEQ ID NO:675 polinucleótido, SEQ ID NO:69 polipéptido), BDL-130 (SEQ ID NO:676 polinucleótido, SEQ ID NO:712 polipéptido), BDL-134 (SEQ ID NO:680 polinucleótido, SEQ ID NO:74 polipéptido), BDL-137 (SEQ ID NO:683 polinucleótido, SEQ ID NO:77 polipéptido), BDL-139 (SEQ ID NO:684 polinucleótido, SEQ ID NO:78 polipéptido), BDL-141 (SEQ ID NO:685 polinucleótido, SEQ ID nO:79 polipéptido).
Varias secuencias de polinucleótidos de los genes seleccionados se clonaron cadena abajo del promotor 35S de CaMV (SEQ ID NO:777), el promotor At6669 de Arabidopsis (SEQ ID NO:775) o el promotor específico de la semilla Napin (SEQ ID NO:778).
El promotor Napin (SEQ ID NO:778), que se origina a partir de Brassica napus, se caracteriza por una actividad promotora específica de la semilla [Stuitje A. R. et. al. Plant Biotechnology Journal 1 (4): 301-309]. El promotor Napin se amplificó por PCR directa en ADN genómico extraído de tejido de hoja [usando el kit DNAeasy (Qiagen No. de Cat. 69104)] usando los siguientes cebadores de PCR: Napin F HindIII 5'-
ATAAGCTTATTGATTCCTTTAAAGACTTATGTT (SEQ ID NO:993) y Napin R SalI 5'- TCGTCGACGGGTGTATGTTTTTAATCTTGTTT (SeQ ID NO:994). Un ejemplo de un gen clonado cadena abajo de la secuencia del promotor Napin es BDL65 (SEQ ID NO:700).
Para 9 genes, concretamente BDL52, BDL67, BDL95, BDL100, BDL108, BDL110, BDL111, BDL119 y BDL130, la traducción de la proteína de la secuencia de ADNc amplificada no coincidía con la predicción bioinformática inicial de las secuencias de proteínas. Las secuencias de polipéptidos codificadas por la clonada y sus identificadores de secuencia son las siguientes: BDL52 (SEQ ID NO:713), BDL67 (SEQ ID NO:714), BDL95 (SEQ ID NO:715), BDL100 (SEQ ID NO:707) , BDL108 (SEQ ID NO:708), BDL110 (SEQ ID NO:709), BDL111 (SEQ ID NO:710), BDL119 (SEQ ID NO:711) y BDL130 (SEQ ID NO:712). Obsérvese que se predice que el gen BDL119 es un ARN no codificante (p. ej., un ARN regulador). El polinucleótido BDL119 se clonó a partir de un ADN genómico y el ADNc de BDL119 se proporciona en la SEQ ID NO:667.
Ejemplo 5
Producción de plantas transgénicas de arabidopsis que expresan los polinucleótidos identificados de la invención
Materiales y métodos experimentales
Transformación de plantas- Se transformó Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas T0) según el procedimiento Floral Dip [Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735-43; yDesfeux C, Clough SJ, Bent AF. (2000) Female reproductive tissues are the primary targets of Agrobacterium-mediated transformation by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123(3): 895-904] con modificaciones menores. En resumen, se sembraron plantas de Arabidopsis thaliana Columbia (Col0) T0 en macetas de 250 ml llenas de una mezcla de crecimiento basada en turba húmeda. Las macetas se cubrieron con papel de aluminio y una cúpula de plástico, se mantuvieron a 4 °C durante 3-4 días, a continuación se descubrieron y se incubaron en una cámara de crecimiento a 18-24 °C bajo ciclos de 16/8 horas de luz/oscuridad. Las plantas T0 estaban listas para la transformación seis días antes de la antesis.
Se cultivaron colonias individuales de Agrobacterium que portan los vectores binarios que albergan los genes de aceite de semilla en medio LB suplementado con kanamicina (50 mg/l) y gentamicina (50 mg/l). Los cultivos se incubaron a 28 °C durante 48 horas con agitación vigorosa y se centrifugaron a 4000 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos que comprendían células de Agrobacterium se resuspendieron en un medio de transformación que contenía la mitad de la concentración (2,15 g/l) de Murashige-Skoog (Duchefa); bencilamino purina 0,044 pM (Sigma); 112 pg/L de vitaminas de Gambourg B5 (Sigma); sacarosa al 5%; y 0,2 ml/l de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) en agua bidestilada, a un pH de 5,7.
La transformación de las plantas T0 se realizó invirtiendo cada planta en una suspensión de Agrobacterium, de modo que el tejido vegetal molido se sumergió durante 3-5 segundos. Cada planta T0 inoculada se colocó inmediatamente en una bandeja de plástico, a continuación se cubrió con una cúpula de plástico transparente para mantener la humedad y se mantuvo en la oscuridad a temperatura ambiente durante 18 horas para facilitar la infección y la transformación. Las plantas transformadas (transgénicas) se descubrieron y se transfirieron a un invernadero para recuperación y maduración. Las plantas T0 transgénicas se cultivaron en el invernadero durante 3-5 semanas hasta que las silicuas estuvieron marrones y secas, a continuación, las semillas se recogieron de las plantas y se mantuvieron a temperatura ambiente hasta la siembra.
Para generar plantas transgénicas T1 y T2 que albergan los genes, las semillas recogidas de plantas T0 transgénicas se esterilizaron superficialmente sumergiéndolas en etanol al 70% durante 1 minuto, seguido de remojo en
5
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25
30
hipoclorito de sodio al 5% y tritón al 0,05% durante 5 minutos. Las semillas esterilizadas en la superficie se lavaron exhaustivamente en agua destilada estéril y a continuación se colocaron sobre placas de cultivo que contenían Murashig-Skoog a la mitad de concentración(Duchefa); sacarosa al 2%; agar de planta al 0,8%; Kanamicina 50 mM; y carbenicilina 200 mM (Duchefa). Las placas de cultivo se incubaron a 4 °C durante 48 horas y a continuación se transfirieron a una sala de crecimiento a 25 °C durante una semana adicional de incubación. Las plantas Vital T1 de Arabidopsis se transfirieron a placas de cultivo nuevas durante otra semana de incubación. Después de la incubación, las plantas T1 se retiraron de las placas de cultivo y se sembraron en una mezcla de crecimiento contenida en macetas de 250 ml. Las plantas transgénicas se dejaron crecer en un invernadero hasta la madurez. Las semillas cosechadas de las plantas T1 se cultivaron y se dejaron crecer hasta la madurez como plantas T2 en las mismas condiciones que las utilizadas para cultivar y dejar crecer las plantas T1.
Ejemplo 6
Identificación de promotores novedosos
Los promotores constitutivos permiten la expresión continua de genes regulados de este modo, en toda la planta. Un ejemplo ampliamente usado para un promotor constitutivo es el promotor CaMV35S del virus del mosaico de la coliflor (SEQ ID NO:777).
Uno de los requisitos importantes para una planta modificada por ingeniería genética es activar el gen de interés en el tejido u órgano adecuado, y/o en el momento apropiado (p. ej., una fase del desarrollo determinada, en ciertas condiciones ambientales). Por ejemplo, para influir en un tejido único tal como la semilla, el gen de interés puede inducirse para la expresión (activada) en una determinada fase del desarrollo tal como fertilización preembrionaria, post-fertilización, embriogénesis temprana o tardía. Por ejemplo, para mejorar el rendimiento y/o el contenido de aceite de una planta, la expresión del gen de interés puede regularse mediante un promotor que tenga un patrón de expresión apropiado para el desarrollo de la semilla. Por lo tanto, la combinación de un gen diana con promotores específicos tales como un promotor específico del desarrollo (tal como semilla, carpelo, tallo, plántula) puede aumentar el efecto deseado del gen (p. ej., mejorar el rendimiento y/o el contenido de aceite) y evitar la influencia indeseada del gen sobre otros procesos biológicos en otros tejidos, por ejemplo, estructura celular, arquitectura de la planta.
Los inventores de la presente invención han aislado y validado nuevos promotores específicos del desarrollo de diferentes fases del desarrollo vegetal y/o tejidos vegetales, que tienen diferentes niveles de expresión génica. La siguiente descripción resume el proceso de selección y clonación de los novedosos promotores de Arabidopsis.
Clonación y análisis de promotores- Los novedosos promotores de Arabidopsis de la invención se seleccionaron basándose en el perfil de expresión de los genes nativos situados cadena abajo (3') en las secuencias promotoras (véase la tabla 16, a continuación).
Tabla 16
Perfil de expresión basado en el análisis de micromatrices
Gen 3' respecto al promotor
AT1G30860 AT2G31160 AT2G39640 AT3G21380 AT3G24510 AT3G61040 AT4G15975
Descripción del producto génico
proteína expresada Proteína de función desconocida (DUF640) Proteína 17 de la glucosil 1 hidrolasa similar a la proteína de la familia de la lectina jacalina [Arabidopsis thaliana] (TAIR:At1g52 040.1) Codifica una proteína de la familia similar a defensina (DEFL) Proteína de la familia del citocromo P450 Dedo de Zinc, tipo C3HC4 (dedo RING)
Especificidad/ nivel de expresión normalizado
Semilla Tallo Semilla Semilla Carpelo Semilla Plántula
carpelos
28,89 6,89 35,03 50,33 462,3 23,75 16,29
tallo
58,82 26,06 18,62 8,48 4 40,36 4
cotiledones
27,56 35,91 30,1 4 4,59 36,86 39,32
flor
21,59 97,92 35,48 32,46 23,73 26,94 18,92
hipocotilo
48,59 782,8 30,62 31,39 6,32 27,57 31,21
inflorescencia
23,93 643,83 24,23 39,18 4 32,95 4
hoja
9,61 41,3 25 7,73 5,95 42,8 23,3
pedicelos
4 12,22 22,78 13,35 4,12 39,68 20,16
pétalos
4 16 41,7 14 4,48 36,9 17,2
peciolo
4 174,5 15,23 20,1 4 55,57 28,04
polen
56,49 16,3 36,44 19,85 4 16,31 20,17
raíz
20 91,6 39 38,2 6,91 35,8 19,3
roseta
8,19 37,84 26,28 17,49 4,78 33,78 27,05
semilla
1172,9 52,49 30,41 1702,9 10,89 1186,5 24,34
plántula
16,78 65,72 30,6 19,9 6,92 37,95 81,98
sépalos
77,8 19,3 30 9,09 4 53,9 13,2
brote
19,22 631,3 26,5 34,29 4,84 26,34 21,36
silicuas
61,36 60,56 132,9 16,83 698,8 39,27 22,16
estambre
66,15 17,04 32,04 62,88 4 20,98 21,67
tallo
24,18 449,5 18,17 15,99 6,77 38,93 5,62
Tabla 16. Se proporcionan los resultados de un perfil de expresión de micromatrices de genes (No de acceso al GenBank Accession) situados en 3' de los promotores identificados. Se muestran la especificidad tisular de los promotores y los niveles de expresión normalizados de cada gen en el tejido específico.
La tabla 17, a continuación, proporciona los identificadores de secuencia de los promotores novedosos de la invención, junto con los identificadores de secuencia de los genes y los polipéptidos codificados de ese modo situados cadena abajo de los promotores novedosos de la invención.
5 Tabla 17
Identificación de promotores novedosos
Designación del promotor (SEQ ID NO:)
Los polinucleótidos (No. de acceso al GenBank y SEQ ID NO:) situados cadena abajo de los promotores identificados Los polipéptidos (No. de acceso al GenBank y SEQ ID NO:) codificados por los polinucleótidos situados cadena abajo de los promotores identificados Longitud del promotor (pb)
PrBDL40 L (SEQ ID NO:779)
AT1G30860 (SEQ ID NO:793) AT1G30860_P1 SEQ ID NO:800 2970
PrBDL40 S (SEQ ID NO:780)
AT1G30860 (SEQ ID NO:793) AT1G30860_P1 SEQ ID NO:800 2238
PrBDL34 L (SEQ ID NO:781)
AT2G31160 (SEQ ID NO:794) AT2G31160_P1 SEQ ID NO:801 3097
PrBDL34 S (SEQ ID NO:782)
AT2G31160 (SEQ ID NO:794) AT2G31160_P1 SEQ ID NO:801 3000
PrBDL36 L (SEQ ID NO:783)
AT2G39640 (SEQ ID NO:795) AT2G39640_P1 SEQ ID NO:802 2889
PrBDL36 S (SEQ ID NO:784)
AT2G39640 (SEQ ID NO:795) AT2G39640_P1 SEQ ID NO:802 831
5
10
15
20
25
30
PrBDL38 L (SEQ ID NO:785)
AT3G21380 (SEQ ID NO:796) AT3G21380_P1 SEQ ID NO:803 3000
PrBDL38 S (SEQ ID NO:786)
AT3G21380 (SEQ ID NO:796) AT3G21380_P1 SEQ ID NO:803 880
PrBDL37 L (SEQ ID NO:787)
AT3G24510 (SEQ ID NO:797) AT3G24510_P1 SEQ ID NO:804 3000
PrBDL37 S (SEQ ID NO:788)
AT3G24510 (SEQ ID NO:797) AT3G24510_P1 SEQ ID NO:804 1423
PrBDL39 L (SEQ ID NO:789)
AT3G61040 (SEQ ID NO:798) AT3G61040_P1 SEQ ID NO:805 3000
PrBDL39 S (SEQ ID NO:790)
AT3G61040 (SEQ ID NO:798) AT3G61040_P1 SEQ ID NO:805 1159
PrBDL35 L (SEQ ID NO:791)
AT4G15975 (SEQ ID NO:799) AT4G15975_P1 SEQ ID NO:806 2881
PrBDL35 S (SEQ ID NO:792)
AT4G15975 (SEQ ID NO:799) AT4G15975_P1 SEQ ID NO:806 942
Tabla 17. Se proporcionan los promotores identificados, su longitud y los identificadores de secuencia junto con los genes que se encuentran cadena abajo de los promotores.
Construcción del promotor: construcción de ácido nucleico de fusión GUS para el análisis del patrón de expresión de los promotores identificados- Para la clonación de cada una de las secuencias promotoras, se diseñaron dos conjuntos de cebadores que abarcan la secuencia promotora predicha. La secuencia corta del promotor se amplificó usando una secuencia de cebador 3' seleccionada cerca del codón de inicio de la secuencia codificante del gen cadena abajo (que se localiza cadena abajo de las secuencias promotoras) y una secuencia de cebador 5' seleccionada de la secuencia que está cadena abajo respecto al gen cadena arriba adyacente. La secuencia larga del promotor estaba usando una secuencia de cebador 3' seleccionada desde el inicio de la región no traducida (5'UTR) del gen cadena abajo del promotor y una secuencia de cebador 5' ubicada 3 kb cadena arriba del cebador 3' (véase la tabla 18, a continuación). Cada secuencia promotora se fusionó por traducción a la secuencia codificante de GUS (un gen indicador).
Todas las secuencias se amplificaron por PCR. Los productos de PCR se purificaron usando el kit de purificación de PCR Mini Elute (Qiagen) y se realizó la secuenciación de los productos de PCR amplificados, usando el secuenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Para facilitar la clonación de las secuencias promotoras, se añadió una prolongación de 8-12 pb al extremo 5' de cada cebador. La prolongación del cebador incluye un sitio de restricción de endonucleasa. Los sitios de restricción se seleccionan usando dos parámetros: a.) El sitio no existe en la secuencia promotora. b.) Los sitios de restricción en los cebadores directo e inverso están diseñados para que el ADN genómico digerido se inserte en la formación sentido en el vector binario utilizado para la transformación. Por ejemplo, el vector plasmídico pGI se construyó insertando una secuencia señal de poli-(A) sintética, que se origina a partir del vector plasmídico básico pGL3 (Promega, No. de Acc. U47295; pb 4658-4811) en el sitio de restricción de HindIII del vector binario pBI101.3 (Clontech, No. de Acc. U12640) y gen GUS-Intron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990). Otro vector plasmídico usado para la clonación fue el pMBLArt (Gleave AP. Plant Mol Biol. diciembre de 1992; 20 (6): 1203-7).
Los productos de PCR digeridos se subclonaron en primer lugar en pBlue-script KS [(originado del vector plasmídico pBlue-script KS
www.stratagene.com/manuals/212205.pdf)] seguido de clonación en vector binario pGI con el gen GUS-Intron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990) y el terminador NOS originado a partir del vector binario pBI 101.3 (No. de acceso al GenBank U12640; GI:529333 nucleótidos 4356 a 4693, SEQ ID NO: 776). Algunos de los productos de PCR se subclonaron en primer lugar en pBlue-script KS [(originado a partir del vector plasmídico pBlue-script KS
www.stratagene.com/manuals/212205.pdf)] con el gen GUS-Intron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 1990) y el terminador NOS se originó a partir del vector binario pBI 101.3 seguido de la clonación del casete completo en el vector binario pMBLArt (según la tabla 19). El producto de PCR digerido y el vector plasmídico linealizado se ligaron usando la enzima T4 ADN ligasa (Roche, Suiza). Los cebadores usados para la clonación se proporcionan en la tabla 18.
A 19eiaaJd
A
i t^eiaaJd
A
i ot^iaaJd
^ViaiAld U0 opsuoio
I9d U0 opsuoio JOJOWOJd
saiuajaj.jp soijeuiq sajojoaA ua sopeuo/o sajojouiojd 61 e¡qe±
sopeoi/puspi g
ssjojoiuojd so| ep oun epeo jeuop bjbcI sopBsn uopeuop sp ssjopsasoi Buopjodojd 'uopenuquoo b 'q\, e|qe} e~|
m eiqBi
800 HON ai D3S/ VWIVOWOOWVOWOOIWOOVOOIOIIV - 1- lies d OV laaJd :au|
lies 'IIIPUIH 1 otoaaJd
ZOOHON ai D3S/ OIOOIVIVOIIOVOOOIOIVOIIOOWIVI - inpuiH d ov naaJd :jio
900 HON ai D3S/ OIOOIIOOOVOOIVIIVIWIOOOOOOOI - IBUJS d 68 lOBJd :au|
IBUJS 'IIIPUIH 16eiaaJd
SOOHON ai 03S/ OlVllVlllVOlWOWOOlOOllOOWllV - inpuiH d 68 iaaJd :jio
V001 :ON ai 03S / OOOOVIIOIVIVOIVOIOIVIOIOVOOIOIIV - ||BS d Jjoqs 88iaaJd :au|
MBS 'HSd s_8eiaaJd
eOOldON ai D3S/ OOlllllOlOlOVOOVOlOOVOVOOlOW - psd H poqs 88iaaJd :j|a
ZOOIZON ai D3S/OV0001WOV11111VW01110V0010101 - lies d poqs zeiaaJd :au|
lies 'IIIPUIH s_zeiaaJd
l-OOON ai 03S/ OlVWOOVOOWlOVIVOllOVOllOOWlOV - inpuiH d jjoqs zeiaaJd uia
000 HON ai 03S/ OllllOllllOllllOlllOOlVOVIOlVl
- |eqx_d_98_iaaJd :au|
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66601X1 ai D3S/ OIWOIIIOWIOOVIWOIWOOOVOOIOIW - lies d 98 naaJd :Jia
86:ON ai D3S/ OOVllllVOWOlWOlOWOVOVOVOOlOllV - lies d se laaJd :au|
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Z66ON ai D3S/ OlVOllOVOllVOVOllOVOllVOllOOVWlV - inpuiH d se naaJd uia
9660N ai D3S/011101V011011V0110110V11VOOV001011V - lies d3 t^eiaaJd :au|
lies 'lisd ■fKnaaJd
S66ON ai D3S/ OWlllOOOWWOOllVWOOVOOlOlV - nsd d3 t^eiaaJd uia
■ON OI 03Sluojoeojjjiduie ejed sopesn sajopeqaQ
ugfoeuojo e¡ ejed sepesn uoioouisej ep seiuizu3 jojouiojd 1ap ajquiofj
sosopaAou sajojouiojd so/ ap uojoeuojo e¡ ejed sopesn sajopeqaQ
81. ejqe±
PrBDL38 S
V
PrBDL37 S
V
PrBDL39 L
V
PrBDL35 L
V
Tabla 19: Se proporcionan las designaciones del promotor (los identificadores de secuencia se dan en la tabla 17, anterior) y los vectores usados para su clonación. "V" indica que el promotor se clonó en el vector indicado.
Las construcciones se transformaron en plantas de Arabidopsis como se describe en el ejemplo 5 anterior y se realizó un análisis de expresión basado en la monitorización del nivel de expresión del gen GUS (tinción de GUS) esencialmente como se describe en Jefferson RA. et. al. 1987 EMBO J 6 (13), 3901-3907; y Meissner et. al. 2000 5 Plant Journal 22 (3), 265-274.
El nivel de tinción de GUS se determinó según la intensidad del color azul. La tabla 20, a continuación, proporciona el nivel de coloración de la tinción de GUS.
Tabla 20
Nivel de coloración
sin color
0
medio -
2
medio oscuro
3
medio +
4
el más oscuro
5
Tabla 20: El índice de intensidad del color azul.
10
La tabla 21, a continuación, describe el patrón de expresión de los promotores clonados.
Tabla 21
Patrón de expresión de promotores de la fase del desarrollo
Promotor
Promotor de SEQ ID NO: Evento Flores pequeñas Flores grandes Hojas Tallo Silicuas
pMBL_GI
777 5681.1 4-5 2 3 2-5 2-5
pMBL_GI
777 5681.2 4-5 2 2-3 2-5 3-5
pMBL_GI
777 5681.3 4-5 2 3 2-5 2-5
MBL_ GI
777 5681.4 4-5 2 3 3-5 3-5
pMBL_GI
777 5681.5 4-5 2 3 2-5 2-5
pM PrBDL 40_YN
779 6552.1 0 0 1 1-3 1
pM PrBDL 40_YN
779 6552.2 0 0 1 0-2 0
pM PrBDL 40_YN
779 6552.3 3 3 3 3 3
pM PrBDL 40_YN
779 6552.4 0 5 1 5 0
O Z
0
0
0
0
0
Y1199 161 NA se iaaJd lAid
z-i
0 0 0 0 9'1199 161 NA_se iaaJd lAid
s-e
0 0 0 0 2' l U99 161 NA_se nagjd lAid
0
0
0
0
0
11199 161 NA_se nagjd lAid
0
0
0
0
0
9Z199 161 NA_se nagjd lAid
0
0
0
0
0
YZ199 161 NA_se nagjd lAid
e
0 0 0 0 9'Z199 161 NA_se nagjd lAid
0
0
0
0
0
Z'Z199 161 NA_se nagjd lAid
0
0
0
0
0
1. "21-99 161 NA_se nagjd lAid
0
0
0
0
0
S'20S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
Y 20S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
9'20S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
2'20S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
I/20S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
SI-0S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
YI-0S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
9I-0S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
l 2' U0S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
0
0
0
L-' L-0S9 68Z NA_6e nagjd lAid
0
0
2-0 2-1. 0 YV999 6ZZ NA_0t? nagjd lAid
0
s s-o V 0 9>SS9 6ZZ NA_0t? nagjd lAid
0
e s-o V l 2>SS9 6ZZ NA_0t? nagjd lAid
0
1.-0 0 0 0 l->SS9 6ZZ NA_0t? nagjd lAid
5
10
15
20
25
pM PrBDL 35_YN
791 6511.5 0 0 0 0 0
WT
0 0 0 0 0
Tabla 21. "pM" o "pMBL" se refieren al vector binario pMBLArt que incluye el promotor CaMV35S (SEQ ID NO:777). "Y" o "GI" se refieren al intrón GUS. "N" se refiere al terminador NOS. pMBL GI sirve como un control positivo. PrBDL40 = SEQ ID NO:779 (L); PrBDL39 = SEQ ID NO:789 (L)); PrBDL35 = SEQ ID NO:791 (L)
Estos resultados demuestran que los promotores novedosos de la invención son capaces de dirigir la expresión de un polinucleótido heterólogo en una célula huésped en de una manera específica del tejido y/o de la fase del desarrollo.
Ejemplo 7
Rendimiento mejorado de la planta transgénica
Para analizar el efecto de la expresión de los polinucleótidos aislados en plantas, las plantas se cultivaron en macetas con una cantidad adecuada de nutrientes y agua. Las plantas se analizaron para su tamaño general, ritmo de crecimiento, tiempo hasta aparición de la inflorescencia (subida a flor) y floración, rendimiento de semillas, peso de 1.000 semillas, materia seca e índice de cosecha [(HI) rendimiento de semillas/materia seca]. El rendimiento de las plantas transgénicas se comparó con plantas de control cultivadas en paralelo en las mismas condiciones. Las plantas transgénicas simuladas con un vector vacío o que expresan el gen indicador uidA (GUS-Intron) bajo el mismo promotor se usaron como control.
Los parámetros se midieron como se describe en el ejemplo 3 anterior.
Análisis estadísticos- El ritmo de crecimiento de la planta, el área de la planta, el tiempo hasta subida a la flor, el tiempo hasta florecer, el peso de 1.000 semillas, el rendimiento de semillas, el rendimiento de aceite, la materia seca y los datos del área de índice de cosecha se analizaron usando la prueba de la t. Para identificar genes y construcciones con rendimiento extraordinario, se analizaron los resultados de la combinación de eventos de transformación o eventos independientes. Para el análisis de gen frente a control, se aplicó la prueba de la t, usando significación de p < 0,1. Se usó el paquete de software de estadística de JMP (Versión 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.).
Resultados experimentales
Las plantas que expresan los polinucleótidos de la invención se ensayaron para una serie de rasgos comercialmente deseados. La tabla 22 proporciona los parámetros medidos en un ensayo de cultivo tisular (los resultados se presentan en la tabla 23).
Tabla 22
Símbolo de parámetro usado en la tabla de resultados 23
Nombre del parámetro
1
Área de la hoja, punto temporal 1
2
Área de la hoja, punto temporal 2
3
Área de la hoja, punto temporal 3
4
Longitud de las raíces, punto temporal 1
5
Longitud de las raíces, punto temporal 2
6
Longitud de las raíces, punto temporal 3
7
Cobertura de las raíces, punto temporal 1
8
Cobertura de las raíces, punto temporal 2
9
Cobertura de las raíces, punto temporal 3
10
RCR del área de la hoja, punto temporal 2
11
RCR del área de la hoja, punto temporal 3
12
RCR de la cobertura de las raíces, punto temporal 2
13
RCR de la cobertura de las raíces, punto temporal 3
14
RCR de la longitud de las raíces, punto temporal 2
15
RCR de la longitud de las raíces, punto temporal 3
16
Peso fresco
17
Peso seco
Tabla 22. RCR = ritmo de crecimiento relativo.
Análisis de plantas en ensayo de cultivo tisular- La tabla 23, a continuación, representa análisis de rendimiento de semillas en plantas que sobreexpresan los polinucleótidos de la invención bajo la regulación de los promotores constitutivos 35S (SEQ ID NO:777) o At6669 (SEQ ID NO:775). En los casos en que un determinado evento aparece 5 más de una vez, el evento se ensayó en varios experimentos independientes.
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 100
7872.2 P 0,10 0,07 0,34 0,17
BDL 100
7872.2 Pr 1,15 1,77 1,24 1,40
BDL 100
7872.3 P 0,22 0,19 0,01
BDL 100
7872.3 Pr 1,10 1,46 1,63
BDL 100
7873.2 P 0,16 0,75 0,02 0,51 0,01
BDL 100
7873.2 Pr 1,12 1,13 1,94 1,17 1,75
BDL 100
7873.3 P 0,24 0,09 0,01
BDL 100
7873.3 Pr 1,16 1,47 1,76
BDL 100
7873.4 P 0,20 0,06 0,16 0,01 0,06
BDL 100
7873.4 Pr 1,12 1,25 1,22 1,17 1,12
BDL 108
8122.1 P 0,20 0,24 0,50 0,11
BDL 108
8122.1 Pr 1,38 1,35 1,32 1,58
BDL 108
8122.2 P 0,09 0,09 0,12
BDL 108
8122.2 Pr 1,83 1,47 1,27
BDL 108
8123.5 P 0,77 0,32
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 108
8123.5 Pr 1,13 1,31
BDL 108
8123.6 P
BDL 108
8123.6 Pr
BDL 110
8092.1 P 0,05 0,41 0,13 0,42 0,31 0,31
BDL 110
8092.1 Pr 1,23 1,13 1,39 1,16 1,15 1,33
BDL 110
8092.2 P 0,35 0,22 0,13 0,18 0,04
BDL 110
8092.2 Pr 1,22 3,01 1,25 2,69 1,33
BDL 110
8092.5 P 0,00 0,01 0,00 0,01 0,18 0,16 0,11 0,33 0,01
BDL 110
8092.5 Pr 1,86 1,30 1,53 1,40 2,04 1,58 2,58 1,11 2,24
BDL 110
8095.2 P 0,00 0,05 0,22 0,00 0,03 0,10
BDL 110
8095.2 Pr 1,53 1,47 1,23 1,62 1,40 1,56
BDL 110
8722.3 P 0,07 0,01 0,22 0,05 0,06 0,16
BDL 110
8722.3 Pr 1,36 2,31 1,14 2,47 1,28 1,47
BDL 114
7741.3 P 0,07 0,66 0,01 0,01 0,02 0,15
BDL 114
7741.3 Pr 1,51 1,17 1,84 1,51 1,75 1,37
BDL 114
7741.6 P 0,24 0,34 0,64 0,00 0,25
BDL 114
7741.6 Pr 1,14 1,22 1,13 1,40 1,23
BDL 114
7742.1 P 0,36 0,26 0,19 0,62 0,14 0,06 0,51
BDL 114
7742.1 Pr 1,12 1,15 1,32 1,14 1,29 1,49 1,16
BDL 114
7742.3 P 0,17 0,69 0,08 0,09 0,08 0,01
BDL 114
7742.3 Pr 1,28 1,24 2,68 2,00 2,89 1,80
BDL 114
7742.5 P 0,24 0,37 0,31 0,06 0,59 0,06
CD
CO CO CO CO CO CO CO CO C0 CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO CO O
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BDL 131
8633.2 Pr 1,12 1,21 1,22 2,07 1,20 1,38 1,74
BDL 131
8634.2 P 0,00 0,13 0,08 0,13 0,22 0,03 0,00 0,00 0,01 0,00 0,00
BDL 131
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BDL 131
8635.4 P 0,00 0,15 0,23 0,08 0,12 0,18 0,12 0,09 0,11 0,49 0,30 0,27 0,51 0,05 0,03
BDL 131
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BDL 133
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BDL 133
8542.2 Pr 1,10 1,11 1,20
BDL 133
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BDL 133
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BDL 133
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BDL 133
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BDL 133
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BDL 133
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BDL 133
8545.3 Pr 1,51 1,68 1,63 1,10 1,18 1,44 1,81 1,32 2,76 1,55 2,12 1,26 2,51 3,55
BDL 134
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BDL 134
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BDL 134
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BDL 134
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BDL 134
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BDL 134
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BDL 134
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r»-
0,02
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CM 05 o o 00 co 00 r-. 00 co LO co 05
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Gen
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BDL 139
8581.5 Pr 1,14 1,16 1,20 1,58 1,54 1,35 1,37 1,57 1,68
BDL 139
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BDL 139
8581.5 Pr 1,21
BDL 139
8581.6 P 0,01 0,01 0,07 0,28 0,19 0,56 0,36 0,12 0,31 0,00 0,00
BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 139
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BDL 141
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Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 141
8641.3 Pr 1,10 1,43 1,10 1,69 1,13 1,12 1,51 1,83
BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 142
8283.2 P
BDL 142
8283.2 Pr
BDL 142
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BDL 142
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BDL 142
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Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 142
8285.1 Pr 1,51 1,22 1,35 1,36 2,43 2,18 1,75 2,62 1,22
BDL 142
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BDL 142
8285.3 Pr 1,22 1,65 1,13 1,89 1,24
BDL 142
8285.5 P 0,48 0,38 0,15 0,42 0,33 0,60
BDL 142
8285.5 Pr 1,11 1,11 1,29 1,15 1,22 1,11
BDL 143
8411.1 P 0,22 0,31 0,02 0,02
BDL 143
8411.1 Pr 1,51 1,22 2,08 1,50
BDL 143
8412.2 P 0,28 0,08
BDL 143
8412.2 Pr 1,59 2,30
BDL 143
8413.3 P 0,04 0,49 0,14 0,43 0,23
BDL 143
8413.3 Pr 1,49 1,22 1,39 1,31 1,30
BDL 143
8414.4 P 0,69 0,17 0,59 0,01
BDL 143
8414.4 Pr 1,27 1,42 1,25 1,84
BDL 143
8414.5 P 0,17 0,31 0,42 0,12
BDL 143
8414.5 Pr 1,28 1,21 1,10 1,40
BDL 144
8381.3 P 0,53 0,03 0,11
BDL 144
8381.3 Pr 1,15 1,85 1,39
BDL 144
8382.2 P 0,22 0,24 0,40 0,45 0,36 0,16 0,32 0,08 0,01 0,20
BDL 144
8382.2 Pr 1,36 1,61 1,34 1,37 1,31 2,95 1,30 1,73 1,55 1,20
BDL 144
8384.4 P 0,04 0,33 0,01 0,01
BDL 144
8384.4 Pr 1,42 2,46 2,51 1,97
BDL 144
8385.1 P 0,13 0,06 0,02 0,27 0,03
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 144
8385.1 Pr 1,59 1,51 2,26 1,36 1,60
BDL 145
8233.2 P 0,08 0,11 0,00
BDL 145
8233.2 Pr 1,39 1,61 1,42
BDL 145
8233.3 P 0,57 0,24 0,21 0,04 0,00
BDL 145
8233.3 Pr 1,12 1,71 1,43 2,15 1,51
BDL 145
8235.3 P 0,40 0,31 0,01
BDL 145
8235.3 Pr 1,18 1,34 1,55
BDL 145
8731.3 P 0,81 0,41 0,47 0,12 0,21
BDL 145
8731.3 Pr 1,12 1,45 1,36 1,60 1,52
BDL 145
8734.2 P 0,09 0,32 0,02 0,00
BDL 145
8734.2 Pr 2,95 1,16 2,57 1,38
BDL 146
8241.1 P 0,11 0,03 0,07 0,67 0,06 0,01 0,08 0,00 0,08 3,64
BDL 146
8241.1 Pr 1,18 1,28 1,20 1,12 1,85 1,52 1,50 1,52 1,37 1,11
BDL 146
8241.3 P 0,06 0,17 0,25 0,01 0,00
BDL 146
8241.3 Pr 1,45 1,23 1,18 4,78 3,57
BDL 146
8244.4 P 0,00 0,01 0,04 0,03 0,53 0,09 0,06 0,02
BDL 146
8244.4 Pr 1,76 1,74 1,66 1,45 1,45 1,43 1,52 1,78
BDL 146
8244.7 P 0,12 0,31 0,00 0,05 0,01 0,02
BDL 146
8244.7 Pr 1,57 1,15 2,44 2,61 2,07 2,32
BDL 146
8245.5 P 0,02 0,01 0,01 0,22 0,40 0,00 0,13
BDL 146
8245.5 Pr 1,23 1,43 1,32 1,26 1,12 1,33 1,32
BDL 42
7771.3 P 0,20 0,01 0,29 0,06 0,41 0,04 0,17 0,01 0,17 0,18 0,02 0,04 0,09
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 42
7771.3 Pr 1,14 1,50 1,15 1,25 1,27 1,67 1,34 1,55 2,06 1,37 1,80 1,30 1,36
BDL 42
7771.5 P 0,43 0,05 0,12 0,00
BDL 42
7771.5 Pr 1,51 1,15 3,36 1,69
BDL 42
7772.6 P 0,00 0,00 0,01 0,10
BDL 42
7772.6 Pr 1,85 3,31 1,43 1,34
BDL 42
7774.1 P 0,01 0,01 0,02
BDL 42
7774.1 Pr 1,57 4,16 2,03
BDL 42
7774.5 P 0,55 0,63 0,02 0,20 0,24 0,06 0,44
BDL 42
7774.5 Pr 1,11 1,14 1,56 2,36 1,66 2,21 1,23
BDL 51
8021.1 P 0,25 0,01 0,01
BDL 51
8021.1 Pr 1,14 1,92 1,50
BDL 51
8022.4 P 0,06 0,02 0,01
BDL 51
8022.4 Pr 1,15 1,80 1,59
BDL 51
8022.5 P 0,24 0,00 0,06 0,00
BDL 51
8022.5 Pr 1,11 1,27 2,05 1,84
BDL 51
8022.7 P 0,08 0,00 0,18 0,25 0,00 0,02 0,03 0,34 0,16
BDL 51
8022.7 Pr 1,22 1,80 1,18 1,14 3,36 1,71 1,53 1,30 1,34
BDL 51
8024.4 P 0,02 0,46 0,04
BDL 51
8024.4 Pr 1,20 1,25 1,38
BDL 51
8024.7 P 0,02 0,05 0,02
BDL 51
8024.7 Pr 1,34 1,45 1,39
BDL 52
7861.1 P 0,05 0,44 0,08 0,10 0,12 0,02 0,04 0,38
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 52
7861.1 Pr 1,26 1,20 1,73 3,22 1,90 2,82 1,37 1,19
BDL 52
7863.2 P 0,00 0,55 0,52 0,16 0,29 0,08
BDL 52
7863.2 Pr 1,42 1,14 1,17 1,31 1,32 1,47
BDL 52
7864.2 P 0,10 0,26 0,57 0,22
BDL 52
7864.2 Pr 1,22 3,45 1,10 2,55
BDL 52
7864.3 P 0,00 0,27 0,01 0,41 0,46
BDL 52
7864.3 Pr 1,28 1,11 1,76 1,16 1,12
BDL 52
7864.5 P 0,27 0,47 0,10
BDL 52
7864.5 Pr 1,19 1,10 1,12
BDL 59
7792.1 P
BDL 59
7792.1 Pr
BDL 59
7792.2 P 0,20
BDL 59
7792.2 Pr 1,27
BDL 59
7792.3 P
BDL 59
7792.3 Pr
BDL 59
7793.3 P 0,01 0,00 0,04
BDL 59
7793.3 Pr 1,76 1,65 1,45
BDL 59
7794.1 P 0,12
BDL 59
7794.1 Pr 1,15
BDL 65
7824.1 P 0,08 0,11
BDL 65
7824.1 Pr 1,79 1,37
BDL 65
7825.2 P 0,18 0,48
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 65
7825.2 Pr 1,12 1,16
BDL 65
8761.1 P 0,16 0,07 0,04 0,66
BDL 65
8761.1 Pr 2,09 1,51 1,39 1,11
BDL 65
8762.3 P 0,10 0,15 0,70
BDL 65
8762.3 Pr 1,14 1,27 1,15
BDL 65
8764.1 P 0,08 0,03 0,39 0,00 0,39
BDL 65
8764.1 Pr 1,42 1,81 1,10 1,98 1,46
BDL 67
7901.5 P 0,18 0,16
BDL 67
7901.5 Pr 1,71 1,58
BDL 67
7902.3 P 0,07 0,10 0,00
BDL 67
7902.3 Pr 1,20 1,22 1,49
BDL 67
7902.7 P 0,06 0,03 0,50 0,08 0,35 0,27
BDL 67
7902.7 Pr 1,42 5,05 1,16 4,84 1,19 1,23
BDL 67
7903.3 P 0,00 0,19
BDL 67
7903.3 Pr 1,40 1,21
BDL 67
7903.5 P 0,01 0,01 0,29 0,02
BDL 67
7903.5 Pr 1,26 1,34 1,35 2,25
BDL 68
7761.3 P 0,11 0,24
BDL 68
7761.3 Pr 1,16 1,13
BDL 68
7761.5 P 0,02 0,01 0,68
BDL 68
7761.5 Pr 1,79 1,42 1,16
BDL 68
7761.9 P
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 68
7761.9 Pr
BDL 68
7764.1 P 0,49
BDL 68
7764.1 Pr 1,16
BDL 68
7765.2 P 0,11 0,10 0,03 0,26 0,25 0,22
BDL 68
7765.2 Pr 1,23 1,51 1,84 1,40 1,43 1,37
BDL 78
7911.11 P 0,47 0,27 0,07 0,18 0,01 0,24 0,04 0,01
BDL 78
7911.11 Pr 1,10 1,16 1,16 1,19 1,58 1,16 1,24 1,36
BDL 78
7911.8 P 0,53 0,04 0,05 0,22 0,05 0,08 0,09
BDL 78
7911.8 Pr 1,12 1,31 2,55 1,36 1,87 1,47 1,63
BDL 78
7912.6 P 0,00 0,03 0,44 0,29 0,22 0,04 0,00 0,00 0,53
BDL 78
7912.6 Pr 1,16 1,25 1,13 1,23 2,15 1,85 1,30 1,82 1,16
BDL 78
7913.6 P 0,61 0,27 0,20 0,20 0,47
BDL 78
7913.6 Pr 1,16 1,83 1,50 1,35 1,16
BDL 78
7913.8 P 0,34 0,43 0,01 0,11 0,02 0,39
BDL 78
7913.8 Pr 1,14 1,13 1,57 1,28 1,39 4,27
BDL 78
7913.9 P 0,00 0,05 0,08 0,22
BDL 78
7913.9 Pr 2,56 1,75 1,56 1,40
BDL 82
7801.1 P 0,05 0,00
BDL 82
7801.1 Pr 1,97 1,57
BDL 82
7801.2 P 0,11 0,21 0,83 0,33
BDL 82
7801.2 Pr 1,13 1,14 1,12 1,33
BDL 82
7801.3 P 0,00 0,20 0,01
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 82
7801.3 Pr 1,32 1,78 1,69
BDL 82
7801.3 P 0,09 0,00 0,02
BDL 82
7801.3 Pr 2,47 5,03 2,49
BDL 82
7802.2 P 0,00 0,02 0,00
BDL 82
7802.2 Pr 1,62 3,16 2,56
BDL 82
7802.2 P 0,58
BDL 82
7802.2 Pr 1,11
BDL 82
7802.3 P 0,22 0,07 0,02
BDL 82
7802.3 Pr 1,33 1,67 1,46
BDL 82
7803.4 P 0,11 0,28 0,03
BDL 82
7803.4 Pr 1,51 1,28 1,36
BDL 82
7803.8 P 0,11 0,12 0,03 0,41 0,40
BDL 82
7803.8 Pr 1,55 1,90 2,13 1,37 1,15
BDL 82
7803.9 P 0,00 0,06 0,33 0,35 0,37 0,41 0,01
BDL 82
7803.9 Pr 1,27 1,27 1,15 1,33 1,34 1,16 1,17
BDL 82
7803.9 P 0,31 0,12 0,16 0,05 0,43
BDL 82
7803.9 Pr 1,12 2,57 1,28 2,36 1,13
BDL 82
7808.6 P 0,00 0,02 0,05 0,04 0,10 0,14 0,17 0,08 0,08
BDL 82
7808.6 Pr 1,50 1,18 1,22 1,29 1,42 2,35 1,48 2,32 1,26
BDL 89
7812.2 P 0,07 0,00 0,00 0,01 0,00
BDL 89
7812.2 Pr 1,16 1,75 1,41 1,50 1,35
BDL 89
7812.5 P 0,16 0,04 0,01
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 89
7812.5 Pr 1,43 3,01 2,30
BDL 89
7814.1 P 0,05 0,64 0,07 0,07
BDL 89
7814.1 Pr 1,17 1,13 1,60 1,57
BDL 89
7814.4 P 0,19 0,12 0,12
BDL 89
7814.4 Pr 1,40 1,39 1,39
BDL 89
7814.5 P 0,11 0,28 0,41 0,02 0,37 0,05
BDL 89
7814.5 Pr 1,30 1,16 2,04 2,01 1,21 1,68
BDL 95
7841.2 P 0,03 0,55 0,16 0,70 0,08
BDL 95
7841.2 Pr 1,21 1,23 1,40 1,10 1,37
BDL 95
7842.12 P 0,41 0,02 0,10 0,31 0,17 0,36 0,02
BDL 95
7842.12 Pr 1,12 1,26 1,26 1,28 1,27 1,17 1,46
BDL 95
7842.2 P 0,11 0,34 0,00
BDL 95
7842.2 Pr 1,30 1,19 1,34
BDL 95
7842.8 P 0,18 0,14 0,00 0,33 0,06
BDL 95
7842.8 Pr 1,22 1,22 1,63 1,19 1,49
BDL 95
7843.4 P 0,02 0,04 0,01
BDL 95
7843.4 Pr 1,58 2,93 2,20
Tabla 23, “P” = valor P; “Pr” = cociente entre los promedios de evento y control. Hay que señalar que cuando el cociente de los promedios es mayor que “1” el efecto de la expresión exógena del gen es un incremento del rasgo deseado, “Par” = Parámetro de acuerdo con los parámetros enumerados en la Tabla 22 anterior; “Ev” = evento.
Ensayos en invernadero- Las tablas 25, 26 y 27 representan experimentos que se realizaron usando ensayos en invernadero. La tabla 24 especifica los parámetros que se midieron en los ensayos en invernadero y que se presentan en las tablas 25, 26 y 27. En los casos en que un determinado evento aparece más de una vez, el evento 5 se ensayó en varios experimentos independientes.
Tabla 24
Símbolo de parámetro en las tablas de resultados 25, 26 y 27
Nombre del parámetro Símbolo de parámetro en las tablas de resultados 25, 26 y 27 Nombre del parámetro
1
Diámetro de roseta, punto temporal 1 31 Área relativa del peciolo, punto temporal 3
2
Diámetro de roseta, punto temporal 2 32 Área relativa del peciolo, punto temporal 4
3
Diámetro de roseta, punto temporal 3 33 RCR del área del cuerpo de la hoja, punto temporal 2
4
Diámetro de roseta, punto temporal 4 34 RCR del área del cuerpo de la hoja, punto temporal 3
5
Área de roseta, punto temporal 1 35 RCR del área del cuerpo de la hoja, punto temporal 4
6
Área de roseta, punto temporal 2 36 RCR del número de hojas, punto temporal 2
7
Área de roseta, punto temporal 3 37 RCR del número de hojas, punto temporal 3
8
Área de roseta, punto temporal 4 38 RCR del número de hojas, punto temporal 4
9
Cobertura de la parcela, punto temporal 1 39 RCR del área de roseta, punto temporal 2
10
Cobertura de la parcela, punto temporal 2 40 RCR del área de roseta, punto temporal 3
11
Cobertura de la parcela, punto temporal 3 41 RCR del área de roseta, punto temporal 4
12
Cobertura de la parcela, punto temporal 4 42 RCR del diámetro de roseta, punto temporal 2
13
Número de hojas, punto temporal 1 43 RCR del diámetro de roseta, punto temporal 3
14
Número de hojas, punto temporal 2 44 RCR del diámetro de roseta, punto temporal 4
15
Número de hojas, punto temporal 3 45 RCR de la cobertura de la parcela, punto temporal 2
16
Número de hojas, punto temporal 4 46 RCR de la cobertura de la parcela, punto temporal 3
17
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 1 47 RCR de la cobertura de la parcela, punto temporal 4
18
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 2 48 Subida a flor
19
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 3 49 Floración
20
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 4 50 Peso seco
21
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 1 51 Rendimiento de semillas
22
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 2 52 Indice de cosecha
23
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 3 53 Peso de 1000 semillas
24
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 4 54 contenido de aceite
25
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 1 55 Peso fresco
26
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 2
27
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 3
28
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 4
29
Área relativa del peciolo, punto temporal 1
30
Área relativa del peciolo, punto temporal 2
Tabla 24
Tabla 25
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 95
7841,5 P
BDL 95
7841,5 Pr.
BDL 95
7842,12 P
BDL 95
7842,12 Pr.
BDL 95
7842,2 P 0,35
BDL 95
7842,2 Pr. 1,12
BDL 95
7842,8 P
BDL 95
7842,8 Pr.
BDL 95
7843,4 P
BDL 95
7843,4 Pr.
BDL 100
7871,2 P
BDL 100
7871,2 Pr.
BDL 100
7872,2 P
BDL 100
7872,2 Pr.
BDL 100
7872,3 P 0,35 0,31 0,53 0,33 0,10 0,31 0,53 0,33 0,10 0,23 0,02 0,23
BDL 100
7872,3 Pr. 1,11 1,38 1,21 1,19 1,20 1,38 1,21 1,19 1,20 1,13 1,08 1,38
BDL
7873,3 P
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
100
BDL 100
7873,3 Pr.
BDL 100
7873,4 P 0,43 0,23 0,57 0,53 0,23 0,57 0,53 0,39
BDL 100
7873,4 Pr. 1,11 1,23 1,12 1,14 1,23 1,12 1,14 1,15
BDL 106
7881,1 P 0,24 0,24
BDL 106
7881,1 Pr. 1,13 1,13
BDL 106
7881,4 P
BDL 106
7881,4 Pr.
BDL 106
7882,6 P
BDL 106
7882,6 Pr.
BDL 106
7884,1 P
BDL 106
7884,1 Pr.
BDL 106
7884,9 P
BDL 106
7884,9 Pr.
BDL 106
7881,1 P
BDL 106
7881,1 Pr.
BDL 106
7881,2 P
BDL 106
7881,2 Pr.
BDL 106
7882,2 P 0,79 0,79 0,04
BDL 106
7882,2 Pr. 1,13 1,13 1,17
BDL 106
7882,4 P
BDL 106
7882,4 Pr.
BDL 106
7882,5 P
BDL 106
7882,5 Pr.
BDL 108
8122,2 P
BDL 108
8122,2 Pr.
BDL 108
8122,3 P 0,02 0,42
BDL 108
8122,3 Pr. 1,10 1,11
BDL 108
8123,1 P
BDL 108
8123,1 Pr.
BDL 108
8123,2 P
BDL 108
8123,2 Pr.
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 108
8123,5 P
BDL 108
8123,5 Pr.
BDL 108
8121,1 P
BDL 108
8121,1 Pr.
BDL 108
8121,3 P
BDL 108
8121,3 Pr.
BDL 108
8121,4 P
BDL 108
8121,4 Pr.
BDL 108
8122,7 P
BDL 108
8122,7 Pr.
BDL 108
8123,7 P
BDL 108
8123,7 Pr.
BDL 110
8092,1 P 0,46 0,01 0,56 0,56 0,46
BDL 110
8092,1 Pr. 1,13 1,43 1,17 1,17 1,27
BDL 110
8092,2 P 0,15
BDL 110
8092,2 Pr. 1,21
BDL 110
8092,5 P 0,10 0,01 0,28 0,00 0,30 0,11 0,53 0,05 0,10
BDL 110
8092,5 Pr. 1,27 1,52 1,26 1,17 1,11 1,19 1,19 1,11 1,35
BDL 110
8095,2 P 0,01 0,21 0,21 0,05
BDL 110
8095,2 Pr. 1,44 1,23 1,23 1,45
BDL 111
8102,7 P
BDL 111
8102,7 Pr.
BDL 111
8103,1 P
BDL 111
8103,1 Pr.
BDL 111
8103,2 P
BDL 111
8103,2 Pr.
BDL 111
8103,4 P
BDL 111
8103,4 Pr.
BDL 111
8103,5 P 0,04
BDL 111
8103,5 Pr. 1,04
BDL 111
8102,7 P
BDL
8102,7 Pr.
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
111
BDL 111
8103,1 P 0,41 0,56 0,39 0,67 0,55 0,67 0,55
BDL 111
8103,1 Pr. 1,11 1,13 1,10 1,12 1,15 1,12 1,15
BDL 111
8103,2 P
BDL 111
8103,2 Pr.
BDL 111
8103,4 P
BDL 111
8103,4 Pr.
BDL 111
8103,5 P
BDL 111
8103,5 Pr.
BDL 112
7502,1 P
BDL 112
7502,1 Pr.
BDL 112
7502,14 P
BDL 112
7502,14 Pr.
BDL 112
7502,4 P
BDL 112
7502,4 Pr.
BDL 112
7502,7 P
BDL 112
7502,7 Pr.
BDL 112
7502,9 P
BDL 112
7502,9 Pr.
BDL 112
7502,1 P 0,01
BDL 112
7502,1 Pr. 1,36
BDL 112
7502,4 P
BDL 112
7502,4 Pr.
BDL 112
7502,7 P
BDL 112
7502,7 Pr.
BDL 112
7502,8 P
BDL 112
7502,8 Pr.
BDL 112
7502,9 P
BDL 112
7502,9 Pr.
BDL 113
7683,4 P
BDL 113
7683,4 Pr.
BDL 113
7683,6 P
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 113
7683,6 Pr.
BDL 113
7684,3 P
BDL 113
7684,3 Pr.
BDL 113
7684,6 P
BDL 113
7684,6 Pr.
BDL 113
7684,7 P
BDL 113
7684,7 Pr.
BDL 113
7683,1 P
BDL 113
7683,1 Pr.
BDL 113
7683,11 P
BDL 113
7683,11 Pr.
BDL 113
7683,4 P
BDL 113
7683,4 Pr.
BDL 113
7684,1 P
BDL 113
7684,1 Pr.
BDL 113
7684,5 P
BDL 113
7684,5 Pr.
BDL 114
7741,3 P
BDL 114
7741,3 Pr.
BDL 114
7741,6 P 0,44
BDL 114
7741,6 Pr. 1,10
BDL 114
7742,1 P
BDL 114
7742,1 Pr.
BDL 114
7742,3 P
BDL 114
7742,3 Pr.
BDL 114
7742,5 P
BDL 114
7742,5 Pr.
BDL 115
8152,3 P 0,09
BDL 115
8152,3 Pr. 1,13
BDL 115
8152,4 P 0,18 0,24 0,06
BDL 115
8152,4 Pr. 1,13 1,12 1,13
BDL
8154,1 P
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
115
BDL 115
8154,1 Pr.
BDL 115
8155,2 P 0,46
BDL 115
8155,2 Pr. 1,11
BDL 115
8155,4 P
BDL 115
8155,4 Pr.
BDL 115
8152,3 P
BDL 115
8152,3 Pr.
BDL 115
8152,4 P
BDL 115
8152,4 Pr.
BDL 115
8154,1 P
BDL 115
8154,1 Pr.
BDL 115
8155,2 P
BDL 115
8155,2 Pr.
BDL 115
8155,4 P 0,06
BDL 115
8155,4 Pr. 1,15
BDL 116
7481,2 P
BDL 116
7481,2 Pr.
BDL 116
7481,7 P
BDL 116
7481,7 Pr.
BDL 116
7481,8 P
BDL 116
7481,8 Pr.
BDL 116
7482,2 P
BDL 116
7482,2 Pr.
BDL 116
7485,1 P
BDL 116
7485,1 Pr.
BDL 119
7732,2 P 0,41
BDL 119
7732,2 Pr. 1,16
BDL 119
7733,2 P 0,18
BDL 119
7733,2 Pr. 1,20
BDL 119
7734,1 P
BDL 119
7734,1 Pr.
r--
0,35 CO 0,33 CM
<o
0,00 O
LO
0,26 0,07 1,09
co
0,53 1,27 0,01 1,25 0,02 r»-
CM
0,39 05 0,43 r-- 0,07 LO 0,23 CM
-
0,64 CO 0,34 05 0,07 r-- 0,23 CM
o
0,12 1,28 0,07 1,20 0,19 CM
CT5
0,52 CO 0,20 r-- 0,03 1,25
00
0,39 05 0,43 r-- 0,28 1,34 0,23 CM
r--
0,64 CO 0,34 05 0,27 1,36 0,23 CM
co
0,12 1,28 0,07 1,20 0,19 CM
LO
0,52 CO o" 1,35 0,03 1,25
0,08 1,09 0,47
co
0,08 1,26 0,00 1,57 0,51 00 0,08 CO
CM
0,06 CO
-
0,07 1,33 0,14 00 0,25 1,29 0,02 00 0,28
fe ü_
Q_ ül Q_ CL Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
7734,5 7734,5 7734,7 7734,7 7891,3 7891,3 7892,4 7892,4 7892,6 7892,6 7893,2 7893,2 7893,5 7893,5 7513,1 7513,1 7513,1 7513,1 7513,14 7513,14 7513,9 7513,9 7514,3 7514,3* 7513,1 7513,1 7513,14 7513,14 7513,9 7513,9 7514,3 7514,3 |
| Gen
BDL 119 BDL 119 BDL 119 BDL 119 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 _1 O GQ
r»-
0,26 1,20 0,00 00 0,00 1,46 0,00 1,28 0,23 CN 0,01 LO
co
O CN o“ CN O o_ o" CN CO o" CN CO o_ o" 00 o_
LO
O co o" CO CO o" CN
05 CN o“ O
co
o_ o" co CN CO o_ o" O co o" 00
CM
LO CM_ o" CN LO o_ o" CO CN 00 o" O CN 00 CN o"
-
O CN o" r-- CN o_ o" LO CN O o_ o"
o
O o_ o" CO CO_ o" CO CN
CT5
CM CO_ o" CN O o_ o" CN co CN o" O o_ o" CO_ 00 o_ o" 05 CN 00 LO o" CO LO CN o" CO
00
LO CN o" CN LO o_ o" CO CN 00 o" O CN 00 CN o"
r--
O CN o" r-- CN o_ o" LO CN O o_ o"
co
o o_ o" CO co_ o" CO CN CO CN o"
LO
CN CO_ o" CN O o_ o" CN CO CN o" o o_ o" CO- 00 co o" 05 CN 00 IO_ o" CO CN o_ o" CN
r-- o_ o" O
co
CN o_ o" 00 CO o" CN
CM
o o_ o" 05 LO o_ o" O
-
CN o" LO O o_ o" CO CN CO o" CO o o_ o" CO CO o o_ o" CN CO CN o" O o_ o" CN
fe ü_
Q_ ül ü_ CL ü_ CL CL CL CL ül CL CL CL ül CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL ül CL CL CL
iS
CN 00 O 00 CN 00 o 00 co_ CN 00 O 00 CO_ CN 00 O 00 co_ CN 00 O 00 co_ CN 00 O 00 CN co" 00 O 00 CN co" 00 O 00 co co" 00 o 00 co co" 00 o 00 CN 00 00 CN 00 00 05 r»- 05 r-- 7491,5 7491,5 7492,5 7492,5 ■'ñT" 05 ■'Ñl- r-~ 05 r-~ 7495,5 LO lo" 05 r-~ 7711,3 7711,3 8361,5 LO_ CO CO 00 CN CN CO CO 00 CN CN CO CO 00 CN co" CO CO 00 CN co" CO CO 00 CN lo" CO CO 00
| Gen
CM CM BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 124 BDL 124 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128
r»-
0,41 LO 0,08 1,53 0,02 1,38 0,33 1,40 0,21 CM
<o
0,00 CM 0,06 1,08 0,06 1,04 0,05 1,06 0,02
LO
0,02 1,09 0,09 CM
0,01 CM 0,25 r»- 0,43 1,23 I 80'0
co
0,53 LO 0,26 1,37 0,38 1,40 0,47 CM 0,36 05 o"
CM
0,05 1,26 0,58 0,00 co 0,15 LO 0,22 1,23 I ¿O'o
-
0,01 1,34 0,41 CM o" 1,39 0,13 CO o" 1,33 I 60 0
o
0,13 CO 0,24 0,03 1,50 0,30 1,50 00 CM_ o"
05
0,66 1,22 0,00 0,22 1,33 0,35 CO ■'Ñf I 9S'0
00
0,05 1,26 0,17 00 0,00 co 0,15 LO 0,22 1,23 I ¿o'o
r--
0,01 1,34 0,05 05 o" 1,39 0,13 CO o" 1,33 I 60 0
co
0,13 CO 0,05 00 0,03 1,50 0,30 1,50 00 CM_ o"
LO
0,73 CM 0,52 1,28 0,00 0,01 1,42 0,35 CO I 9S'0
0,05 0,35 CM
co
0,03 1,33 0,00 1,49 0,02 ¡O 0,20 CO 0,08 LO 0,06 1,20 ■'Ñl- o~
CM
0,04 CM_ 0,28 1,22 co o"
-
0,14 0,31 r»- 0,00 CM_ 0,01 1,27 0,00 1,37 0,01 CO 0,00 1,27 I ¿O'o
fe ü_
CL Q_ ül Q_ ül Q_ ül Q_ ül Q_ CL Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
8365,2 7691,4 7691,4 7691,6 7691,6 7692,2 7692,2 7692,6 7692,6 7693,1 7693,1 7663,1 7663,1 7663,3 7663,3 7663,6 7663,6 7664,5 7664,5 7461,2 7461,2 7461,4 7461,4 7462,2 7462,2 7463,4 7463,4 7464,5 7464,5 7471,1 7471,1 7471,4 |
| Gen
BDL 128 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 132 BDL 132 _1 O GQ
r»-
0,46 CM
co
LO
00
co
0,02 1,58 0,31 CN 0,17 1,45
CM
05 0,13 LO 0,32 CO 0,01 1,22
-
CN 0,03 CO 0,02 r»-
o
1,27
CT5
LO 0,05 1,39 0,24 1,27
00
05 0,13 LO 0,28 CO 0,32 CO 0,01 1,22
r»-
CN 0,03 CO 0,02
r»-
co
1,27 0,01 CO
LO
LO 0,03 00 ■'Ñf 0,24 1,27
co
CM 0,06 1,09 0,27 1,34 0,00 1,52 0,06 1,47 0,15 1,32 0,07 1,26 0,03 1,34 0,00 1,53
CM
-
1,08 0,02 CM 0,07 1,29 0,30 LO
fe ü_
ül Q_ ül Q_ ül Q_ ül 0_ CL Q_ CL Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
7471,4 7472,4 7472,4 7473,1 7473,1 7474,4 7474,4 7471,1 7471,1 7471,4 7471,4 7472,4 7472,4 7473,1 7473,1 7475,4 7475,4 8161,1 8161,1 8161,2 8161,2 8161,3 8161,3 8161,4 8161,4 8162,1 8162,1 8162,3 8162,3 8162,5 8162,5
| Gen
CM CO BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133
100
r»-
0,06
co
LO
0,36 CO
co
0,59 1,29 0,55 CM 0,24 1,54 0,55 CM 0,24 1,24 0,10 1,36
CM
0,01 r»- 0,20 1,33 0,29 CO
-
0,03 LO 0,17 1,28 0,30 CO
o
0,37 r»- 0,06 1,33
05
0,36 00 o" 1,25
00
0,01 r»- 0,20 1,33 0,29 co
r--
0,03 LO 0,17 1,28 0,30 co
co
0,37 r»- 0,06 1,33
LO
0,36 00 o" 1,25
0,33 CO
co
0,27 1,33 0,21 05 0,03 1,35 0,01 1,40 0,27 r»- o" CO 0,00 1,57 0,01 1,39 0,25 CO 0,01 1,65 0,01 1,44 0,00 LO 0,09 co_
CM
-
0,35 00 0,36 r»- 0,06 CO
fe ü_
Q_ CL ü_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
8163,2 8163,2 7671,2 7671,2 7672,1 7672,1 7673,1 7673,1 7673,2 7673,2 7722,1 7722,1 7723,1 7723,1 7723,3 7723,3 7723,8 7723,8 7723,9 7723,9 7751,4 7751,4 7751,5 7751,5 7751,8 7751,8 7752,6 7752,6 7701,2 7701,2 7701,5 7701,5 |
| Gen
BDL 133 BDL 133 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 137 BDL 137 BDL 137 __1 O GQ
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
137
BDL 137
7701,6 P 0,06 0,67
BDL 137
7701,6 Pr. 1,44 1,21
BDL 137
7702,1 P
BDL 137
7702,1 Pr.
BDL 137
7703,2 P 0,06
BDL 137
7703,2 Pr. 1,38
BDL 137
7703,3 P 0,16
BDL 137
7703,3 Pr. 1,20
BDL 137
7703,7 P 0,13 0,46
BDL 137
7703,7 Pr. 1,36 1,27
BDL 139
8131,1 P
BDL 139
8131,1 Pr.
BDL 139
8131,2 P
BDL 139
8131,2 Pr.
BDL 139
8132,7 P
BDL 139
8132,7 Pr.
BDL 139
8133,2 P
BDL 139
8133,2 Pr.
BDL 141
8141,2 P 0,06 0,30
BDL 141
8141,2 Pr. 1,39 1,21
BDL 141
8142,2 P
BDL 141
8142,2 Pr.
BDL 142
8282,1 P 0,18
BDL 142
8282,1 Pr. 1,34
BDL 142
8283,1 P 0,11
BDL 142
8283,1 Pr. 1,24
BDL 142
8283,2 P 0,01 0,47 0,47 0,06
BDL 142
8283,2 Pr. 1,45 1,18 1,18 1,42
BDL 142
8284,1 P 0,02
BDL 142
8284,1 Pr. 1,36
BDL 142
8285,3 P 0,13
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 142
8285,3 Pr. 1,23
BDL 142
8285,5 P 0,49 0,06 0,51 0,57 0,51 0,57 0,24
BDL 142
8285,5 Pr. 1,10 1,53 1,12 1,11 1,12 1,11 1,24
BDL 143
8411,1 P 0,33 0,00 0,28 0,03 0,00 0,06 0,28 0,03 0,00 0,06 0,30 0,08 0,03
BDL 143
8411,1 Pr. 1,18 1,73 1,47 1,36 1,28 1,32 1,47 1,36 1,28 1,32 1,51 1,12 1,17
BDL 143
8411,5 P 0,37 0,04 0,64
BDL 143
8411,5 Pr. 1,13 1,37 1,12
BDL 143
8412,2 P 0,24
BDL 143
8412,2 Pr. 1,20
BDL 143
8412,4 P
BDL 143
8412,4 Pr.
BDL 143
8413,3 P 0,21
BDL 143
8413,3 Pr. 1,18
BDL 143
8414,4 P 0,35
BDL 143
8414,4 Pr. 1,35
BDL 143
8414,5 P 0,19
BDL 143
8414,5 Pr. 1,19
BDL 144
8384,1 P 0,05
BDL 144
8384,1 Pr. 1,30
BDL 144
8384,5 P 0,06
BDL 144
8384,5 Pr. 1,29
BDL 144
8385,1 P
BDL 144
8385,1 Pr.
BDL 145
8233,2 P 0,10
BDL 145
8233,2 Pr. 1,26
BDL 145
8233,3 P
BDL 145
8233,3 Pr.
BDL 145
8235,1 P 0,13
BDL 145
8235,1 Pr. 1,24
BDL 145
8235,3 P
BDL 145
8235,3 Pr.
BDL
8235,4 P
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
145
BDL 145
8235,4 Pr.
BDL 146
8241,1 P 0,42 0,13 0,32 0,60 0,32 0,60 0,15
BDL 146
8241,1 Pr. 1,12 1,46 1,18 1,13 1,18 1,13 1,30
BDL 146
8241,3 P 0,08
BDL 146
8241,3 Pr. 1,28
BDL 146
8243,2 P 0,06 0,55
BDL 146
8243,2 Pr. 1,37 1,12
BDL 146
8243,5 P 0,45
BDL 146
8243,5 Pr. 1,21
BDL 146
8244,4 P 0,07 0,33 0,27 0,42 0,33 0,27 0,42 0,21
BDL 146
8244,4 Pr. 1,57 1,16 1,26 1,22 1,16 1,26 1,22 1,11
BDL 146
8244,7 P 0,47
BDL 146
8244,7 Pr. 1,10
BDL 146
8245,2 P 0,02
BDL 146
8245,2 Pr. 1,35
BDL 146
8245,5 P 0,32 0,00 0,23 0,21 0,47 0,23 0,21 0,47 0,05
BDL 146
8245,5 Pr. 1,16 1,51 1,21 1,13 1,11 1,21 1,13 1,11 1,45
BDL 42
7771,1 P
BDL 42
7771,1 Pr.
BDL 42
7772,1 P
BDL 42
7772,1 Pr.
BDL 42
7772,7 P
BDL 42
7772,7 Pr.
BDL 42
7774,1 P
BDL 42
7774,1 Pr.
BDL 42
7774,2 P
BDL 42
7774,2 Pr.
BDL 42
7774,4 P 0,56
BDL 42
7774,4 Pr. 1,11
BDL 46
7833,3 P
BDL 46
7833,3 Pr.
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 46
7833,4 P 0,27 0,10
BDL 46
7833,4 Pr. 1,10 1,08
BDL 46
7833,5 P
BDL 46
7833,5 Pr.
BDL 46
7833,6 P
BDL 46
7833,6 Pr.
BDL 46
7834,1 P
BDL 46
7834,1 Pr.
BDL 46
7833,1 P
BDL 46
7833,1 Pr.
BDL 46
7833,3 P
BDL 46
7833,3 Pr.
BDL 46
7833,4 P
BDL 46
7833,4 Pr.
BDL 46
7833,5 P
BDL 46
7833,5 Pr.
BDL 46
7834,4 P 0,19
BDL 46
7834,4 Pr. 1,25
BDL 51
7291,1 P
BDL 51
7291,1 Pr.
BDL 51
8021,1 P
BDL 51
8021,1 Pr.
BDL 51
8022,4 P
BDL 51
8022,4 Pr.
BDL 51
8022,5 P
BDL 51
8022,5 Pr.
BDL 51
8024,4 P
BDL 51
8024,4 Pr.
BDL 51
8024,7 P
BDL 51
8024,7 Pr.
BDL 52
7861,1 P 0,02
BDL
7861,1 Pr. 1,08
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
52
BDL 52
7861,5 P
BDL 52
7861,5 Pr.
BDL 52
7863,2 P 0,17
BDL 52
7863,2 Pr. 1,12
BDL 52
7864,5 P 0,14 0,14 0,14 0,14
BDL 52
7864,5 Pr. 1,16 1,12 1,16 1,12
BDL 54
7781,1 P
BDL 54
7781,1 Pr.
BDL 54
7781,4 P
BDL 54
7781,4 Pr.
BDL 54
7784,3 P
BDL 54
7784,3 Pr.
BDL 54
7784,5 P
BDL 54
7784,5 Pr.
BDL 54
7785,4 P
BDL 54
7785,4 Pr.
BDL 54
7781,1 P
BDL 54
7781,1 Pr.
BDL 54
7781,4 P
BDL 54
7781,4 Pr.
BDL 54
7784,3 P
BDL 54
7784,3 Pr.
BDL 54
7785,4 P
BDL 54
7785,4 Pr.
BDL 54
7785,8 P
BDL 54
7785,8 Pr.
BDL 56
7181,2 P
BDL 56
7181,2 Pr.
BDL 56
8301,1 P 0,00 0,05 0,04 0,04 0,31 0,00 0,02 0,02 0,31 0,00 0,02 0,02 0,38 0,07 0,02 0,28
BDL 56
8301,1 Pr. 1,26 1,18 1,21 1,12 1,36 1,33 1,33 1,33 1,36 1,33 1,33 1,33 1,16 1,09 1,09 1,32
BDL 56
8301,3 P
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 56
8301,3 Pr.
BDL 56
8304,1 P 0,14 0,04 0,45 0,09 0,06 0,45 0,09 0,06 0,58 0,06 0,17 0,39
BDL 56
8304,1 Pr. 1,19 1,11 1,28 1,17 1,16 1,28 1,17 1,16 1,14 1,09 1,12 1,23
BDL 56
8305,1 P
BDL 56
8305,1 Pr.
BDL 56
8301,1 P
BDL 56
8301,1 Pr.
BDL 56
8301,2 P 0,39
BDL 56
8301,2 Pr. 1,24
BDL 56
8301,3 P
BDL 56
8301,3 Pr.
BDL 56
8303,1 P 0,43
BDL 56
8303,1 Pr. 1,11
BDL 56
8303,2 P
BDL 56
O O Pr.
BDL 59
7792,1 P 0,00 0,05 0,14 0,23 0,06 0,04 0,23 0,06 0,04 0,08 0,00 0,06 0,09
BDL 59
7792,1 Pr. 1,21 1,15 1,10 1,25 1,24 1,24 1,25 1,24 1,24 1,16 1,17 1,13 1,16
BDL 59
7792,2 P 0,05 0,20
BDL 59
7792,2 Pr. 1,09 1,12
BDL 59
7792,3 P 0,21 0,16 0,03 0,05 0,57 0,03 0,12 0,10 0,57 0,03 0,12 0,10 0,58 0,07 0,09 0,00 0,62
BDL 59
7792,3 Pr. 1,12 1,13 1,17 1,11 1,22 1,23 1,18 1,13 1,22 1,23 1,18 1,13 1,14 1,09 1,12 1,20 1,13
BDL 59
7793,3 P 0,07 0,09
BDL 59
7793,3 Pr. 1,05 1,07
BDL 59
7794,1 P
BDL 59
7794,1 Pr.
BDL 60
8011,4 P 0,47 0,40 0,42 0,47 0,40 0,42 0,27 0,00
BDL 60
8011,4 Pr. 1,18 1,21 1,19 1,18 1,21 1,19 1,11 1,11
BDL 60
8011,7 P
BDL 60
8011,7 Pr.
BDL 60
8013,4 P
BDL 60
8013,4 Pr.
BDL
8013,6 P
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
60
BDL 60
8013,6 Pr.
BDL 60
8014,5 P
BDL 60
8014,5 Pr.
BDL 60
8013,6 P
BDL 60
8013,6 Pr.
BDL 60
8014,2 P 0,00
BDL 60
8014,2 Pr. 1,20
BDL 60
8014,7 P 0,48
BDL 60
8014,7 Pr. 1,27
BDL 60
8014,8 P
BDL 60
8014,8 Pr.
BDL 65
7824,1 P
BDL 65
7824,1 Pr.
BDL 65
7825,2 P 0,36
BDL 65
7825,2 Pr. 1,27
BDL 65
8473,2 P
BDL 65
8473,2 Pr.
BDL 65
8474,1 P 0,03 0,50 0,50 0,30
BDL 65
8474,1 Pr. 1,32 1,14 1,14 1,36
BDL 67
7901,5 P
BDL 67
7901,5 Pr.
BDL 67
7902,3 P
BDL 67
7902,3 Pr.
BDL 67
7902,7 P
BDL 67
7902,7 Pr.
BDL 67
7903,3 P
BDL 67
7903,3 Pr.
BDL 67
7903,5 P
BDL 67
7903,5 Pr.
BDL 68
7761,3 P
BDL 68
7761,3 Pr.
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 68
7761,8 P
BDL 68
7761,8 Pr.
BDL 68
7761,9 P
BDL 68
7761,9 Pr.
BDL 68
7763,2 P
BDL 68
7763,2 Pr.
BDL 68
7764,1 P
BDL 68
7764,1 Pr.
BDL 78
7911,11 P 0,03 0,55
BDL 78
7911,11 Pr. 1,34 1,12
BDL 78
7911,8 P 0,31
BDL 78
7911,8 Pr. 1,20
BDL 78
7911,9 P
BDL 78
7911,9 Pr.
BDL 78
7912,6 P 0,11
BDL 78
7912,6 Pr. 1,23
BDL 78
7913,11 P 0,48
BDL 78
7913,11 Pr. 1,11
BDL 78
7913,3 P 0,00 0,47 0,47 0,19
BDL 78
7913,3 Pr. 1,46 1,13 1,13 1,33
BDL 78
7913,6 P
BDL 78
7913,6 Pr.
BDL 78
7913,8 P 0,39
BDL 78
7913,8 Pr. 1,12
BDL 78
7913,9 P 0,01
BDL 78
7913,9 Pr. 1,38
BDL 82
7801,1 P
BDL 82
7801,1 Pr.
BDL 82
7801,3 P
BDL 82
7801,3 Pr.
BDL 82
7802,2 P
BDL
7802,2 Pr.
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
82
BDL 82
7802,3 P
BDL 82
7802,3 Pr.
BDL 82
7803,9 P 0,14 0,02 0,01 0,02 0,00 0,13 0,01 0,08 0,00 0,13 0,01 0,08 0,01 0,02 0,00 0,12 0,00
BDL 82
7803,9 Pr. 1,29 1,13 1,16 1,14 1,48 1,25 1,38 1,30 1,48 1,25 1,38 1,30 1,26 1,14 1,11 1,12 1,34
BDL 89
7812,2 P 0,07
BDL 89
7812,2 Pr. 1,05
BDL 89
7812,5 P
BDL 89
7812,5 Pr.
BDL 89
7814,1 P 0,19
BDL 89
7814,1 Pr. 1,20
BDL 89
7814,4 P
BDL 89
7814,4 Pr.
BDL 89
7814,5 P
BDL 89
7814,5 Pr.
Tabla 25, “P” = valor P; “Pr” = cociente entre los promedios de evento y control. Hay que señalar que cuando el cociente de los promedios es mayor que “1” el efecto de la expresión exógena del gen es un incremento del rasgo deseado, “Par” = Parámetro de acuerdo con los parámetros enumerados en la Tabla 24 anterior; “Ev” = evento.
Tabla 26
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 95
7841,5 P 0,71 0,78 0,70 0,66
BDL 95
7841,5 Pr. 1,23 1,18 1,19 1,31
BDL 95
7842,12 P 0,67 0,75 0,19 0,70 0,32
BDL 95
7842,12 Pr. 1,11 1,18 2,66 1,28 2,84
BDL 95
7842,2 P 0,78 0,47 0,41
BDL 95
7842,2 Pr. 1,11 55,83 28,99
BDL 95
7842,8 P 0,56 0,56 0,46 0,35 0,41 0,46
BDL 95
7842,8 Pr. 1,36 1,29 3,76 1,56 1,57 4,32
BDL 95
7843,4 P 0,03 0,56 0,54 0,00 0,53 0,16 0,48 0,54
BDL 95
7843,4 Pr. 2,00 2,47 1,84 1,84 2,94 1,23 2,18 2,06
BDL 100
7871,2 P 0,72 0,47
3
0,36 ^Z 0,59 CO 0,31 2,02 0,34 1,20 0,06 1,49 0,60 1,56 0,44 CO
B
1,28 0,00 1,32 0,58 2,85 0,15 1,68 0,84
CO
0,57 1,35 0,76 2,04 0,15 5,93 0,57 2,78 0,60 1,34 0,01 3,39 0,27 00 05_ 0,05 2,59 0,38 1,69 0,22 1,42 0,66 1,64 0,46 r-~ 0,21
co
0,75 00 0,22 r»- 0,21 00 0,00 1,34 0,57 1,56 0,23 1,32 0,54 1,82 0,66 1,42 0,75
R
0,13 00 0,55 2,06 0,27 1,63 0,70 0,47 3,05 0,38 1,47 0,61 1,29 0,67 CO
05 CM
r-- 0,00 1,53 0,03 CM_ 0,27 2,42 0,61 1,35 0,31 1,67 00 ■'Ñf o" 1,86 0,58 4,38 0,17 6,35 0,65 1,55
00 CM
r-- CM
co CM
0,03 1,05
LO CM
0,24 O
Si
0,82 CO 0,76 2,13 0,19 6,24 0,55 2,80 0,57 1,33 0,35 1,74 0,31 CO 0,22 1,76 0,47 1,56 0,30 1,38 0,59 1,58 0,60 1,49 0,21
CO CM
0,24 CO 0,63 1,25 0,65 ^z 0,67 1,20 0,46 1,84 0,77 1,23
CM CM
0,54 1,87 0,46 2,65 0,41 LO 0,66 1,25
CM
0,00 1,63 0,03 CM_ 0,44 5,50 00 ■'Ñf o" 1,37 0,22 1,87 0,50 2,57 0,59 4,09 0,01 5,82 0,57 1,75
O CM
0,39 ^Z
05
0,33 r»-
00
0,47 1,26 0,22 CO 0,10 1,32
Par
CL Q_ ül Q_ ül Q_ ül Q_ CL Q_ ül Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
7871,2 7872,2 7872,2 7872,3 7872,3 7873,3 7873,3 7873,4 7873,4 7881,1 7881,1 7881,4 7881,4 7882,6 7882,6 7884,1 7884,1 7884,9 7884,9 7881,1 7881,1 7881,2 7881,2 7882,2 7882,2 7882,4 7882,4 7882,5
Gen
BDL 100 BDL 100 BDL 100 BDL 100 BDL 100 BDL 100 BDL 100 BDL 100 BDL 100 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106
3
0,45 2,73 0,09 00 0,53 2,81
8
05 0,41 1,59 0,64 1,28 0,85 1,56 0,00 1,28 0,27 1,22 0,09 1,32 0,00
CO
1,58 0,14 4,42 00 o" 2,15 0,50 1,34 0,74 0,05 2,58 0,08 1,67 0,45 1,92
co
05 00 ■'ñT o" 1,38 0,04 1,50 0,22 CM_ 0,62 1,26 0,31 1,68 0,00 2,33 0,35 CO 0,14 1,32 0,30 1,64 0,00 CO 0,26 1,96
8
0,30 3,00 0,08 1,20 0,38 4,07 0,35 1,38 0,51 1,59 0,62 CM 0,13 1,46 0,84 1,22 0,23 1,77 0,37 CO
CT5 CM
0,17 cnT 0,50 1,58 0,00 05_ 0,20 2,36 0,36 1,86 0,10 6,16 0,68 1,88 0,44 3,66 0,63 5,66 0,72 cnT 0,22
00 CM
r»- CM
co CM
LO CM
Si
1,53 0,04 3,68 0,73 05 0,28 1,52 0,32 1,32 0,44 1,62 0,37 1,28
CO CM
0,00 1,46 0,27 1,42 0,26 1,54 0,44 1,36 0,06 CO 0,24 1,76
CM CM
0,39 1,94 0,42 3,64 0,31 CM 0,63 1,33 0,35 1,24 CO ■'Ñf o" r»- 0,38 1,54 0,52 1,35
CM
0,08 2,85 0,46 2,61 0,20 1,96 0,30 3,17 0,42 2,96 0,12 4,75 0,65 cnT 0,44 2,83 0,67 4,00 0,71 2,15
O CM
0,01 r»-
05
0,01 LO
00
0,23 co
Par
CL Q_ ül Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
7882,5 8122,2 8122,2 8122,3 8122,3 8123,1 8123,1 8123,2 8123,2 8123,5 8123,5 CM CO CM CO 8121,3 8121,3 CM CO CM CO 8122,7 8122,7 8123,7 8123,7 8092,1 8092,1 8092,2 8092,2 8092,5 8092,5 8095,2
Gen
BDL 106 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 110 BDL 110 BDL 110 BDL 110 BDL 110 BDL 110 BDL 110
112
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 110
8095,2 Pr. 1,24
BDL 111
8102,7 P 0,00 0,25 0,01 0,02 0,30 0,25
BDL 111
8102,7 Pr. 1,62 1,11 1,57 1,42 1,12 1,26
BDL 111
8103,1 P 0,41 0,06 0,08 0,32 0,36 0,29 0,30 0,12 0,32
BDL 111
8103,1 Pr. 2,15 1,27 1,11 2,44 1,85 1,76 1,40 3,38 1,37
BDL 111
8103,2 P 0,00 0,00 0,13
BDL 111
8103,2 Pr. 1,79 1,66 1,20
BDL 111
8103,4 P 0,41 0,12 0,00 0,50 0,28 0,22 0,00 0,40
BDL 111
8103,4 Pr. 1,87 1,44 1,52 2,06 1,58 1,72 1,87 2,83
BDL 111
8103,5 P 0,06 0,71 0,34 0,00 0,12 0,35 0,18 0,00 0,73
BDL 111
8103,5 Pr. 1,77 1,11 1,21 4,29 1,66 1,25 1,37 5,17 1,14
BDL 111
8102,7 P 0,46 0,20 0,63 0,13 0,44 0,28 0,34 0,06
BDL 111
8102,7 Pr. 2,95 1,35 1,15 1,51 3,43 1,57 1,37 1,68
BDL 111
8103,1 P 0,57 0,65 0,26 0,27 0,24 0,32
BDL 111
8103,1 Pr. 1,12 1,11 1,13 2,19 2,28 1,58
BDL 111
8103,2 P 0,96 0,51 0,20 0,88 0,68 0,34 0,33
BDL 111
8103,2 Pr. 1,35 1,16 1,53 2,21 1,21 1,47 2,07
BDL 111
8103,4 P 0,90 0,79 0,83
BDL 111
8103,4 Pr. 1,51 2,47 1,42
BDL 111
8103,5 P 0,88 0,58 0,82 0,53 0,69
BDL 111
8103,5 Pr. 2,94 1,19 4,21 1,46 1,37
BDL 112
7502,1 P 0,69 0,43 0,44 0,37 0,32
BDL 112
7502,1 Pr. 1,20 2,10 1,46 2,26 1,63
BDL 112
7502,14 P 0,52 0,50 0,57 0,50 0,48 0,47 0,46
BDL 112
7502,14 Pr. 1,67 3,18 1,34 1,44 3,42 1,55 2,15
BDL 112
7502,4 P 0,19 0,75 0,11 0,29 0,02 0,44 0,65 0,51
BDL 112
7502,4 Pr. 2,17 1,18 2,04 1,46 1,24 1,48 1,24 1,36
BDL 112
7502,7 P 0,19 0,19 0,07 0,18 0,00 0,84 0,25
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 112
7502,7 Pr. 1,88 1,36 1,70 1,36 1,44 1,13 1,52
BDL 112
7502,9 P 0,30 0,62 0,62 0,26 0,16 0,50
BDL 112
7502,9 Pr. 2,12 1,23 1,22 1,20 2,29 1,30
BDL 112
7502,1 P 0,42 0,41 0,41 0,61
BDL 112
7502,1 Pr. 1,29 1,15 1,27 1,40
BDL 112
7502,4 P 0,58 0,55 0,48 0,18
BDL 112
7502,4 Pr. 1,19 1,84 2,27 2,78
BDL 112
7502,7 P 0,64 0,82 0,61 0,71 0,72
BDL 112
7502,7 Pr. 3,88 1,14 4,86 1,19 1,36
BDL 112
7502,8 P 0,54 0,67 0,57 0,51 0,54 0,60
BDL 112
7502,8 Pr. 2,50 1,20 1,40 2,33 1,41 1,52
BDL 112
7502,9 P 0,07 0,79 0,07 0,48 0,62 0,56
BDL 112
7502,9 Pr. 4,27 1,11 4,93 1,12 1,23 1,22
BDL 113
7683,4 P 0,13 0,00 0,69 0,18 0,35 0,10 0,58 0,24
BDL 113
7683,4 Pr. 1,51 1,24 1,63 1,76 1,13 1,53 2,03 1,60
BDL 113
7683,6 P 0,06 0,10 0,09 0,20 0,01 0,04 0,00 0,02 0,00
BDL 113
7683,6 Pr. 2,09 1,38 1,25 1,80 1,93 2,10 1,67 2,80 1,59
BDL 113
7684,3 P 0,24 0,56 0,38 0,62 0,05 0,53 0,35 0,52
BDL 113
7684,3 Pr. 1,45 1,34 1,50 1,69 1,42 1,61 1,90 2,95
BDL 113
7684,6 P 0,12 0,04 0,54 0,17 0,00 0,51
BDL 113
7684,6 Pr. 1,81 1,29 3,37 1,68 1,63 4,60
BDL 113
7684,7 P 0,57 0,90 0,31 0,70
BDL 113
7684,7 Pr. 1,15 1,19 1,59 1,88
BDL 113
7683,1 P 0,18 0,41 0,63 0,16 0,23 0,33 0,06 0,11 0,61
BDL 113
7683,1 Pr. 4,92 1,37 1,11 1,68 6,15 1,83 1,32 2,01 2,09
BDL 113
7683,11 P 0,00 0,00
BDL 113
7683,11 Pr. 3,76 4,28
BDL 113
7683,4 P 0,29 0,47 0,94 0,36 0,47 0,78
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 113
7683,4 Pr. 1,28 1,32 1,72 1,56 1,62 1,47
BDL 113
7684,1 P
BDL 113
7684,1 Pr.
BDL 113
7684,5 P 0,00 0,00
BDL 113
7684,5 Pr. 3,01 4,03
BDL 114
7741,3 P 0,41 0,12 0,30 0,40 0,00 0,23 0,53
BDL 114
7741,3 Pr. 3,87 1,92 3,64 4,33 2,51 4,94 2,47
BDL 114
7741,6 P 0,36 0,50 0,01 0,58 0,49 0,06 0,43
BDL 114
7741,6 Pr. 1,37 12,18 2,96 1,16 4,68 2,99 3,15
BDL 114
7742,1 P 0,36 0,30 0,30 0,50
BDL 114
7742,1 Pr. 1,56 1,35 1,21 1,29
BDL 114
7742,3 P 0,39 0,23 0,59 0,29 0,00 0,02 0,10
BDL 114
7742,3 Pr. 4,22 1,73 1,24 2,30 2,68 1,73 1,70
BDL 114
7742,5 P 0,16 0,25 0,18 0,63 0,00 0,25 0,13 0,27 0,53
BDL 114
7742,5 Pr. 3,66 1,85 1,38 1,33 2,39 2,81 2,01 2,23 1,62
BDL 115
8152,3 P 0,05 0,34
BDL 115
8152,3 Pr. 1,28 1,14
BDL 115
8152,4 P 0,13 0,71 0,08 0,79 0,08 0,39
BDL 115
8152,4 Pr. 1,16 1,15 2,16 1,11 2,20 1,39
BDL 115
8154,1 P 0,40 0,36 0,60
BDL 115
8154,1 Pr. 2,40 2,88 1,11
BDL 115
8155,2 P 0,51 0,26 0,52 0,26 0,54
BDL 115
8155,2 Pr. 2,70 2,22 3,09 2,28 2,66
BDL 115
8155,4 P 0,36 0,48 0,25 0,47 0,53
BDL 115
8155,4 Pr. 2,31 1,84 1,88 2,66 2,33
BDL 115
8152,3 P 0,43 0,35 0,01 0,36 0,37 0,20 0,24 0,09
BDL 115
8152,3 Pr. 1,84 1,26 1,22 1,88 1,96 1,41 1,51 2,04
BDL 115
8152,4 P 0,25 0,59 0,25 0,05 0,15 0,41
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 115
8152,4 Pr. 2,58 1,13 2,87 1,61 1,42 1,30
BDL 115
8154,1 P 0,02 0,27 0,16 0,12
BDL 115
8154,1 Pr. 5,48 1,16 5,83 1,36
BDL 115
8155,2 P 0,05 0,24 0,20 0,13 0,80 0,85
BDL 115
8155,2 Pr. 3,97 1,36 3,99 1,33 1,13 1,25
BDL 115
8155,4 P 0,52 0,01 0,43 0,09 0,28 0,02 0,27 0,23 0,02
BDL 115
8155,4 Pr. 1,11 4,85 1,20 1,64 1,42 5,32 1,71 1,86 2,24
BDL 116
7481,2 P 0,10 0,07 0,54 0,52 0,49
BDL 116
7481,2 Pr. 1,59 1,64 1,46 1,16 1,14
BDL 116
7481,7 P 0,06 0,51 0,14 0,23 0,41 0,64
BDL 116
7481,7 Pr. 1,17 1,40 1,19 1,13 1,52 1,22
BDL 116
7481,8 P 0,75 0,51 0,32 0,68 0,50 0,18 0,54
BDL 116
7481,8 Pr. 1,15 5,20 1,78 1,17 3,75 2,05 1,87
BDL 116
7482,2 P 0,19 0,22 0,03 0,16 0,35
BDL 116
7482,2 Pr. 1,14 2,69 1,25 2,82 1,46
BDL 116
7485,1 P 0,00 0,52 0,40 0,02 0,29 0,07 0,37 0,59
BDL 116
7485,1 Pr. 2,16 1,17 2,56 1,92 1,62 1,27 3,36 1,26
BDL 119
7732,2 P 0,05 0,61 0,00 0,74 0,00 0,39 0,00 0,62 0,34
BDL 119
7732,2 Pr. 2,07 1,16 1,63 1,36 1,83 1,47 2,00 1,76 1,30
BDL 119
7733,2 P 0,42 0,46 0,11 0,15 0,07 0,01 0,73 0,32 0,10
BDL 119
7733,2 Pr. 1,27 1,15 1,19 1,37 1,38 1,39 1,19 1,10 1,13
BDL 119
7734,1 P 0,23 0,07 0,01 0,01 0,00
BDL 119
7734,1 Pr. 1,50 1,66 1,42 1,56 1,30
BDL 119
7734,5 P 0,37 0,26 0,62 0,69 0,00 0,15 0,42 0,41 0,15
BDL 119
7734,5 Pr. 1,12 1,37 1,16 1,16 1,30 1,58 1,39 1,34 1,21
BDL 119
7734,7 P 0,62 0,60 0,25 0,58 0,54 0,75 0,62 0,56 0,52
BDL 119
7734,7 Pr. 1,11 1,12 1,15 1,41 2,92 1,16 1,18 2,29 1,90
BDL 120
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3
00 ■'ñT o" 0,13 3,99 0,59 1,27 0,45 3,28 0,55 2,58 0,17
8
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CO
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co
1,30 0,69 1,22
8
0,31 1,36 0,59 CO 0,14 5,34 0,53 1,26 0,44 3,19 0,61 CM~
05 CM
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00 CM
r»- CM
0,04 1,03
co CM
0,08 1,04
LO CM
0,01 CM
Si
2,89 0,62 1,55 0,60 2,56 0,91 0,60 2,19 0,47 2,77 0,80 1,40 0,19 1,82 0,52 4,29 0,57 2,10 0,86 1,34 0,06
CO CM
0,74 1,20
CM CM
0,39 1,20 0,30 00 r-~ 0,46 2,20 0,58 1,68
CM
3,31 0,23 1,53 0,38 00 0,49 1,56 0,17 1,87 0,01 1,79 0,01 4,25 0,88 1,32 0,35 4,01 0,32 2,36
O CM
0,15 1,23 0,09
05
0,46 O 0,22 1,29 0,09 0,31
00
0,02 00 0,17 00 0,50 CO 0,31 05
Par
CL Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
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Gen
BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 120 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 123
117
3
1,37 0,62 1,69 0,59 2,09 0,29
o O LO 00 co
8
o_ CN co_ co CN LO_
o ■*” o ■*” o ■*”
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CM
CM
CM
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CM
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00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 05 05 05 05 05 05 05 05 05 05 CO CO CO CO CO
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00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 00 r-. r-. r-. r-. r»- r-. r-. r-- r»- r-. r-- r-- co co co 00 00
C
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118
3
1,30 00 ■'ñT o" 3,78 0,23 1,38 0,53 3,01 0,52 3,58 0,06 1,37 0,01 1,28
8
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CO
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co
0,00 <o 0,52 1,37 0,00 1,44 0,24 2,32 00 o" 1,30 0,76 1,20
8
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05 CM
1,84 0,42 1,27 0,04 1,92 0,27 CO 0,13 2,34
00 CM
0,06 1,02
r»- CM
0,03 1,02 0,00 1,04 0,08 1,05 0,02
co CM
0,00 1,05 0,04 1,07
LO CM
0,06 O 0,09 1,08 0,30 CM
Si
3,77 0,39 1,53 0,64 00 ■'ñT 0,26 2,87 0,21 3,15 00 o" 2,15 0,54 1,74 0,66 3,42 0,85
CO CM
0,00 1,22 0,33 1,44 0,36 1,30 0,76 r»-
CM CM
0,47 2,55 0,50 3,65 0,23 CM 0,47 4,24 0,39 LO
CM
1,88 0,41 1,22 0,20 05_ 0,35 1,50 0,39 4,91
O CM
0,14 1,22 0,24 0,01 1,25 0,19
05
0,01 1,33 0,06 0,08 CO
00
0,02 00 0,14 CM 0,00 1,38
Par.
CL Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
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Gen
BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131
119
3
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£3
T— r»- T— 00 T— co T— r»- co co co
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CM
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CM
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Si
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C
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120
3
0,34 ^Z 00 ■'ñT o" CO 0,02 r»- 0,46 1,27 0,10 ^Z 0,24 1,22 0,26 CO
B
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CO
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co
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R
0,04 1,28 0,10 1,37 0,57 1,69 0,08 CO r-~ 0,00 1,49 0,09 2,03 o" 1,62 0,45 r»-
05 CM
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00 CM
0,05 1,02
r-- CM
0,02 1,02
co CM
0,04
LO CM
0,17
Si
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0,00 1,46 0,01 0,14 1,20 0,40 1,26 0,26 1,42 0,34 ^z 0,43 CO
CM CM
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CM
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O CM
1,20 0,19 05 0,05
05
0,08 CM 0,12
00
0,03
Par
CL Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
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Gen
BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135
3
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8
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CO
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co
00 ■'ñT o" 05 0,44 0,00 1,49 0,46 1,59 0,30 1,42 0,53 00 0,00 r-~
8
0,19 CM_ 0,44 1,35 0,10 1,94 0,41 1,50 00 o" 1,23 0,53 CO 0,27 00 r-~
05 CM
0,39 1,49 0,47 1,90 0,47 1,23 0,73 LO 0,02 1,95 0,35 LO 0,01 1,25 0,00 1,79
00 CM
r»- CM
0,06 1,02
co CM
1,03 0,10 1,02
LO CM
CO 0,05 1,08
Si
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CM CM
0,19 1,26 0,14 1,29 0,41 1,55 0,44 CM_
CM
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O CM
CM 0,05 CO 0,05
05
LO 0,02 1,23 0,21 LO
00
05 0,03 1,20
Par
CL Q_ ül Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
Ev.
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Gen
BDL 135 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 139 BDL 139 BDL 139 BDL 139 BDL 139
122
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 139
8132,7 Pr.
BDL 139
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BDL 139
8133,2 Pr.
BDL 141
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BDL 141
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BDL 141
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BDL 142
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BDL 142
8282,1 Pr. 1,17 1,21 1,20 1,47 1,31 1,37 1,33 1,49 1,25
BDL 142
8283,1 P 0,27 0,26 0,14 0,03 0,65 0,24 0,33
BDL 142
8283,1 Pr. 4,32 1,94 2,12 1,30 1,17 2,04 1,10
BDL 142
8283,2 P 0,04 0,01 0,30
BDL 142
8283,2 Pr. 1,07 1,14 1,42
BDL 142
8284,1 P 0,68 0,35 0,64 0,85 0,29 0,17
BDL 142
8284,1 Pr. 1,18 1,20 1,23 1,11 1,21 1,13
BDL 142
8285,3 P 0,21 0,60 0,14 0,45 0,61 0,56 0,22 0,03
BDL 142
8285,3 Pr. 2,01 1,50 1,82 1,21 1,28 1,66 1,40 1,16
BDL 142
8285,5 P 0,52 0,65 0,36
BDL 142
8285,5 Pr. 1,33 1,26 1,29
BDL 143
8411,1 P 0,00 0,00 0,11 0,15 0,00 0,02 0,02 0,06
BDL 143
8411,1 Pr. 1,28 1,24 1,41 1,17 1,05 1,02 1,03 1,17
BDL 143
8411,5 P 0,91 0,17
BDL 143
8411,5 Pr. 1,24 1,11
BDL 143
8412,2 P 0,31 0,43 0,09 0,77 0,00 0,24 0,13 0,69 0,02
BDL 143
8412,2 Pr. 1,22 1,24 1,49 1,35 1,31 1,51 1,63 1,52 1,34
BDL 143
8412,4 P 0,23 0,63 0,59 0,03 0,42 0,28 0,78
BDL 143
8412,4 Pr. 1,14 1,21 1,26 1,80 1,90 2,17 1,22
BDL 143
8413,3 P 0,09 0,42 0,03 0,43 0,00 0,27 0,00 0,31 0,44
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 143
8413,3 Pr. 1,69 1,28 1,29 1,40 1,61 1,50 1,55 1,64 1,20
BDL 143
8414,4 P 0,34 0,68 0,73 0,66 0,07 0,67
BDL 143
8414,4 Pr. 1,16 1,72 1,17 1,13 1,25 1,68
BDL 143
8414,5 P 0,35 0,60 0,20 0,26 0,40 0,30 0,29
BDL 143
8414,5 Pr. 1,23 1,13 1,19 1,28 1,38 1,40 1,13
BDL 144
8384,1 P 0,09 0,35 0,10 0,37 0,36
BDL 144
8384,1 Pr. 1,24 1,18 1,23 1,17 1,35
BDL 144
8384,5 P 0,36 0,13
BDL 144
8384,5 Pr. 1,18 1,24
BDL 144
8385,1 P 0,00 0,07 0,39 0,73 0,00 0,05 0,00 0,06 0,13
BDL 144
8385,1 Pr. 2,50 1,35 1,25 1,14 2,06 2,23 1,86 1,71 1,50
BDL 145
8233,2 P 0,25 0,00 0,73 0,08
BDL 145
8233,2 Pr. 1,47 1,47 1,24 1,15
BDL 145
8233,3 P 0,37 0,45 0,58 0,08 0,06 0,30 0,48 0,39 0,23
BDL 145
8233,3 Pr. 9,00 1,13 1,21 2,55 1,79 1,75 1,51 1,35 1,36
BDL 145
8235,1 P 0,36 0,41 0,22 0,32 0,79 0,32
BDL 145
8235,1 Pr. 1,25 1,57 1,27 1,73 1,34 1,16
BDL 145
8235,3 P 0,21 0,16 0,65 0,02 0,14 0,00 0,43 0,41 0,38
BDL 145
8235,3 Pr. 3,39 1,17 1,35 2,32 1,87 1,92 2,33 1,31 1,21
BDL 145
8235,4 P
BDL 145
8235,4 Pr.
BDL 146
8241,1 P 0,29 0,42 0,72 0,32 0,30
BDL 146
8241,1 Pr. 1,18 1,14 1,11 1,10 1,37
BDL 146
8241,3 P 0,10 0,11 0,31 0,01 0,45 0,01 0,42 0,04
BDL 146
8241,3 Pr. 1,19 1,29 1,88 1,26 1,24 1,41 1,96 1,08
BDL 146
8243,2 P 0,62 0,72 0,59 0,15 0,05
BDL 146
8243,2 Pr. 1,52 1,12 1,42 1,18 1,16
BDL 146
8243,5 P 0,50 0,59 0,68 0,32 0,56 0,59 0,62 0,70
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 146
8243,5 Pr. 1,42 1,20 1,13 1,46 1,47 1,34 1,31 1,11
BDL 146
8244,4 P 0,29 0,21 0,33 0,77 0,01 0,89
BDL 146
8244,4 Pr. 1,15 1,17 1,30 1,39 1,04 1,17
BDL 146
8244,7 P 0,07 0,00 0,01 0,29 0,01 0,00 0,00 0,18 0,47
BDL 146
8244,7 Pr. 1,74 1,58 1,42 1,41 1,66 2,03 1,77 1,97 1,26
BDL 146
8245,2 P 0,69 0,50 0,43 0,35 0,59 0,47
BDL 146
8245,2 Pr. 1,21 3,35 1,11 1,12 1,30 3,30
BDL 146
8245,5 P 0,02 0,67 0,08 0,71 0,00
BDL 146
8245,5 Pr. 1,13 2,48 1,07 2,05 1,25
BDL 42
7771,1 P
BDL 42
7771,1 Pr.
BDL 42
7772,1 P
BDL 42
7772,1 Pr.
BDL 42
7772,7 P
BDL 42
7772,7 Pr.
BDL 42
7774,1 P 0,01 0,15 0,35 0,73 0,00 0,00 0,15 0,01
BDL 42
7774,1 Pr. 4,17 1,16 1,25 1,11 2,40 2,04 2,29 2,15
BDL 42
7774,2 P
BDL 42
7774,2 Pr.
BDL 42
7774,4 P 0,43 0,31 0,73 0,24 0,06 0,00 0,12 0,46
BDL 42
7774,4 Pr. 3,46 1,18 1,10 2,06 1,55 1,85 2,09 1,15
BDL 46
7833,3 P 0,02 0,70 0,33 0,47 0,00 0,34 0,09 0,43 0,31
BDL 46
7833,3 Pr. 1,53 1,11 1,19 4,71 1,55 1,52 1,51 6,07 1,24
BDL 46
7833,4 P 0,02 0,02
BDL 46
7833,4 Pr. 1,04 1,17
BDL 46
7833,5 P 0,49 0,43
BDL 46
7833,5 Pr. 1,55 1,44
BDL 46
7833,6 P 0,12 0,54 0,52 0,33 0,53 0,50
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 46
7833,6 Pr. 1,24 1,74 3,06 1,18 1,94 3,78
BDL 46
7834,1 P
BDL 46
7834,1 Pr.
BDL 46
7833,1 P 0,81 0,15 0,06 0,37 0,80 0,25 0,00 0,04
BDL 46
7833,1 Pr. 2,17 1,81 1,26 1,29 2,21 2,29 1,66 1,76
BDL 46
7833,3 P 0,75 0,30 0,00 0,79
BDL 46
7833,3 Pr. 1,13 1,50 1,41 1,44
BDL 46
7833,4 P
BDL 46
7833,4 Pr.
BDL 46
7833,5 P 0,54 0,25 0,09
BDL 46
7833,5 Pr. 1,22 1,77 1,68
BDL 46
7834,4 P 0,25 0,00 0,13 0,04 0,41 0,00 0,04 0,00
BDL 46
7834,4 Pr. 2,23 3,05 2,50 3,07 1,88 3,45 2,95 3,50
BDL 51
7291,1 P 0,17 0,34 0,24 0,07 0,06 0,22 0,13 0,04 0,10
BDL 51
7291,1 Pr. 2,46 1,84 1,59 3,10 2,14 2,30 2,12 4,63 1,11
BDL 51
8021,1 P 0,00 0,58 0,03 0,50
BDL 51
8021,1 Pr. 2,43 3,13 4,73 7,50
BDL 51
8022,4 P 0,02 0,31 0,63 0,02 0,25 0,16 0,49
BDL 51
8022,4 Pr. 2,50 1,54 1,30 4,06 3,15 3,24 1,29
BDL 51
8022,5 P 0,28 0,31 0,21 0,15 0,16 0,15 0,12 0,14
BDL 51
8022,5 Pr. 3,27 2,22 1,66 2,02 2,40 3,77 4,00 5,31
BDL 51
8024,4 P 0,23 0,06 0,32 0,55 0,10 0,12 0,30 0,51 0,85
BDL 51
8024,4 Pr. 2,16 1,60 1,55 3,05 1,80 2,19 2,27 4,90 1,14
BDL 51
8024,7 P 0,40 0,45 0,29 0,79
BDL 51
8024,7 Pr. 1,50 1,12 1,71 1,12
BDL 52
7861,1 P 0,64 0,68
BDL 52
7861,1 Pr. 1,20 1,15
BDL 52
7861,5 P 0,38 0,03 0,38 0,04 0,01
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 52
7861,5 Pr. 1,28 2,63 1,19 2,58 1,16
BDL 52
7863,2 P
BDL 52
7863,2 Pr.
BDL 52
7864,5 P 0,16 0,63 0,62
BDL 52
7864,5 Pr. 1,12 1,30 1,14
BDL 54
7781,1 P 0,51 0,51 0,51
BDL 54
7781,1 Pr. 4,05 3,55 2,68
BDL 54
7781,4 P 0,18 0,29 0,72
BDL 54
7781,4 Pr. 1,67 1,57 1,15
BDL 54
7784,3 P 0,21 0,43 0,17 0,31 0,29
BDL 54
7784,3 Pr. 2,32 2,78 2,05 3,64 2,55
BDL 54
7784,5 P 0,11 0,40 0,01 0,27 0,35 0,18
BDL 54
7784,5 Pr. 1,38 3,91 1,29 1,23 4,08 1,29
BDL 54
7785,4 P 0,00 0,00 0,02
BDL 54
7785,4 Pr. 1,70 1,56 1,23
BDL 54
7781,1 P 0,08 0,78 0,25 0,59 0,52 0,23
BDL 54
7781,1 Pr. 3,23 1,30 3,98 1,88 1,41 1,72
BDL 54
7781,4 P 0,55 0,54 0,24 0,92
BDL 54
7781,4 Pr. 3,16 3,57 1,52 1,12
BDL 54
7784,3 P 0,52 0,17
BDL 54
7784,3 Pr. 1,21 1,51
BDL 54
7785,4 P 0,04 0,53 0,13 0,11 0,34
BDL 54
7785,4 Pr. 6,70 1,20 10,24 1,62 3,57
BDL 54
7785,8 P 0,14 0,37 0,16 0,33 0,00
BDL 54
7785,8 Pr. 6,30 1,51 8,24 1,48 3,47
BDL 56
7181,2 P 0,15 0,21 0,73 0,52 0,14 0,26 0,66 0,50 0,46
BDL 56
7181,2 Pr. 1,26 1,91 1,41 2,39 1,44 2,65 1,64 3,57 2,09
BDL 56
8301,1 P 0,00 0,05 0,11 0,55 0,32 0,01 0,03 0,66
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 56
8301,1 Pr. 1,28 1,27 1,22 1,82 1,13 1,04 1,03 1,45
BDL 56
8301,3 P 0,40 0,81 0,35 0,75
BDL 56
8301,3 Pr. 2,62 1,11 2,83 1,15
BDL 56
8304,1 P 0,38
BDL 56
8304,1 Pr. 1,11
BDL 56
8305,1 P 0,38 0,43 0,07 0,46 0,79
BDL 56
8305,1 Pr. 1,19 1,52 1,17 1,58 1,12
BDL 56
8301,1 P 0,29 0,00
BDL 56
8301,1 Pr. 1,27 1,63
BDL 56
8301,2 P 0,77
BDL 56
8301,2 Pr. 1,68
BDL 56
8301,3 P 0,54 0,95 0,91 0,84 0,36
BDL 56
8301,3 Pr. 1,25 1,36 1,62 1,11 1,80
BDL 56
8303,1 P
BDL 56
8303,1 Pr.
BDL 56
8303,2 P 0,53 0,01 0,33 0,00 0,08 0,51 0,12
BDL 56
8303,2 Pr. 1,11 6,56 1,13 9,42 1,25 1,22 5,45
BDL 59
7792,1 P 0,39 0,07 0,50
BDL 59
7792,1 Pr. 1,69 1,08 1,58
BDL 59
7792,2 P 0,69 0,68
BDL 59
7792,2 Pr. 2,56 2,78
BDL 59
7792,3 P 0,16 0,05
BDL 59
7792,3 Pr. 1,17 1,03
BDL 59
7793,3 P 0,64 0,83 0,57 0,73 0,36
BDL 59
7793,3 Pr. 1,21 1,15 1,26 1,24 1,35
BDL 59
7794,1 P 0,27 0,86 0,17 0,81 0,00
BDL 59
7794,1 Pr. 2,60 1,13 3,67 1,18 3,34
BDL 60
8011,4 P 0,45 0,45
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 60
8011,4 Pr. 1,13 1,12
BDL 60
8011,7 P 0,00 0,48 0,01 0,44 0,41 0,45
BDL 60
8011,7 Pr. 2,02 2,83 1,98 3,86 1,35 2,63
BDL 60
8013,4 P 0,08 0,40 0,01 0,05 0,27
BDL 60
8013,4 Pr. 2,96 2,37 2,30 1,57 3,52
BDL 60
8013,6 P 0,21 0,49 0,00 0,70 0,04 0,47 0,26
BDL 60
8013,6 Pr. 1,96 6,84 1,85 1,11 1,20 8,09 1,42
BDL 60
8014,5 P 0,36 0,90 0,23 0,62 0,76 0,70
BDL 60
8014,5 Pr. 2,07 1,16 1,84 1,19 1,29 1,76
BDL 60
8013,6 P 0,01 0,34 0,32 0,21 0,00 0,04 0,19 0,09 0,77 0,89
BDL 60
8013,6 Pr. 6,90 1,59 1,30 2,17 8,76 1,88 1,59 2,45 1,23 1,17
BDL 60
8014,2 P 0,04 0,18 0,01 0,00 0,16 0,00
BDL 60
8014,2 Pr. 1,58 1,50 2,12 2,04 2,11 3,09
BDL 60
8014,7 P 0,56 0,43 0,42 0,45 0,50
BDL 60
8014,7 Pr. 1,55 1,26 1,23 1,29 2,00
BDL 60
8014,8 P 0,81 0,12 0,16 0,66 0,17 0,25 0,24 0,41
BDL 60
8014,8 Pr. 1,12 7,59 1,18 1,14 9,76 1,41 1,39 4,18
BDL 65
7824,1 P 0,57 0,36 0,65 0,41 0,01 0,55 0,47 0,03
BDL 65
7824,1 Pr. 1,51 1,24 1,37 1,51 1,72 1,21 2,26 1,36
BDL 65
7825,2 P 0,40 0,49 0,11 0,17 0,21 0,15
BDL 65
7825,2 Pr. 1,29 1,18 1,76 1,49 1,45 2,51
BDL 65
8473,2 P 0,13 0,20 0,07 0,51 0,01 0,05 0,00 0,42 0,13
BDL 65
8473,2 Pr. 3,11 1,16 1,31 2,00 2,17 1,78 1,82 2,80 1,34
BDL 65
8474,1 P 0,13 0,22 0,05 0,33 0,64
BDL 65
8474,1 Pr. 1,25 1,78 1,28 2,01 1,12
BDL 67
7901,5 P 0,38 0,26 0,15 0,17 0,36 0,18 0,23 0,12
BDL 67
7901,5 Pr. 1,56 1,22 1,29 1,92 1,46 1,34 1,48 2,49
BDL 67
7902,3 P 0,46 0,65 0,47 0,68 0,48 0,49
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 67
7902,3 Pr. 1,12 1,11 2,65 1,11 3,06 2,43
BDL 67
7902,7 P 0,19 0,54 0,20 0,51 0,66 0,55
BDL 67
7902,7 Pr. 1,49 1,94 1,46 2,91 1,15 2,69
BDL 67
7903,3 P 0,68 0,73 0,71 0,68
BDL 67
7903,3 Pr. 1,19 1,99 1,17 2,50
BDL 67
7903,5 P 0,12 0,54 0,00 0,00 0,05 0,49 0,04
BDL 67
7903,5 Pr. 2,41 2,43 2,03 1,41 1,33 2,85 1,26
BDL 68
7761,3 P 0,59 0,74 0,59 0,66 0,72
BDL 68
7761,3 Pr. 1,42 1,55 1,32 1,17 1,60
BDL 68
7761,8 P 0,45 0,21 0,23 0,00 0,29 0,04 0,09
BDL 68
7761,8 Pr. 7,80 1,77 2,62 2,04 1,30 2,56 2,02
BDL 68
7761,9 P 0,39 0,64 0,96 0,63
BDL 68
7761,9 Pr. 1,60 1,67 1,12 1,41
BDL 68
7763,2 P 0,24 0,30 0,19 0,14 0,46
BDL 68
7763,2 Pr. 2,08 1,62 1,91 1,99 1,28
BDL 68
7764,1 P 0,42 0,54 0,83 0,13 0,46 0,53 0,45 0,40
BDL 68
7764,1 Pr. 9,83 2,45 1,14 2,76 3,43 1,26 1,50 2,71
BDL 78
7911,11 P 0,40 0,08 0,56 0,14 0,00
BDL 78
7911,11 Pr. 1,11 1,16 1,14 1,21 1,24
BDL 78
7911,8 P 0,63 0,15 0,57 0,60 0,36
BDL 78
7911,8 Pr. 1,79 1,21 1,22 2,17 1,30
BDL 78
7911,9 P 0,20 0,00 0,14 0,00 0,69 0,00
BDL 78
7911,9 Pr. 6,36 2,58 1,94 1,88 1,25 1,48
BDL 78
7912,6 P 0,70 0,61 0,63 0,37
BDL 78
7912,6 Pr. 1,21 1,14 1,28 1,16
BDL 78
7913,11 P 0,24 0,66 0,05 0,32 0,24 0,13 0,67
BDL 78
7913,11 Pr. 1,72 1,13 1,84 1,18 1,50 1,60 1,11
BDL 78
7913,3 P 0,53 0,44 0,00
Gen
Ev. Par 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
BDL 78
7913,3 Pr. 1,14 1,20 1,31
BDL 78
7913,6 P 0,45 0,25 0,49 0,68 0,18 0,12 0,06 0,24 0,49 0,42
BDL 78
7913,6 Pr. 8,48 1,13 1,22 1,23 2,37 1,90 1,81 1,92 ,1,16 1,44
BDL 78
7913,8 P 0,31 0,21 0,68 0,04 0,23 0,10 0,52 0,07 0,48
BDL 78
7913,8 Pr. 1,36 1,28 1,29 1,30 1,69 1,58 1,69 1,14 1,11
BDL 78
7913,1 P 0,51 0,52 0,20 0,34 0,49 0,46 0,15 0,07
BDL 78
7913,9 Pr. 1,37 1,14 1,41 1,48 1,25 1,28 1,50 1,53
BDL 82
7801,1 P 0,20 0,00 0,24 0,34 0,00 0,00 0,12 0,25
BDL 82
7801,1 Pr. 2,67 1,39 1,66 2,12 2,04 1,80 2,22 3,05
BDL 82
7801,3 P 0,33 0,83 0,03 0,03 0,14
BDL 82
7801,3 Pr. 8,14 1,12 2,90 1,28 2,08
BDL 82
7802,2 P 0,18 0,44 0,14 0,77 0,01 0,41 0,09
BDL 82
7802,2 Pr. 2,55 5,01 2,16 1,11 1,26 6,53 1,35
BDL 82
7802,3 P 0,16 0,67 0,00 0,43 0,08 0,48 0,21 0,06
BDL 82
7802,3 Pr. 2,36 1,21 1,20 1,58 2,03 1,70 1,72 2,45
BDL 82
7803,9 P 0,24 0,01 0,37 0,00 0,00 0,46
BDL 82
7803,9 Pr. 1,15 1,30 1,18 1,14 1,04 1,28
BDL 89
7812,2 P 0,49 0,67 0,34
BDL 89
7812,2 Pr. 1,15 1,14 1,11
BDL 89
7812,5 P 0,44 0,55 0,26 0,45 0,46 0,29 0,49
BDL 89
7812,5 Pr. 3,98 1,46 7,37 3,87 1,49 7,29 2,55
BDL 89
7814,1 P 0,03 0,20 0,29 0,44 0,42 0,49 0,45 0,43 0,77
BDL 89
7814,1 Pr. 1,22 1,11 1,17 2,98 1,12 1,12 1,14 2,97 1,11
BDL 89
7814,4 P 0,51 0,42 0,00 0,44 0,51 0,39 0,15 0,10 0,33
BDL 89
7814,4 Pr. 3,96 2,15 1,23 1,63 1,94 3,04 1,58 2,16 1,96
BDL 89
7814,5 P 0,42 0,55 0,43 0,31 0,20 0,42 0,19 0,32 0,13
BDL 89
7814,5 Pr. 3,45 1,14 1,67 2,25 1,16 1,45 2,21 1,39 1,12
Tabla 26
Tabla 27
LO
LO
a
LO o CM o o
o_ co o_ co_
O T— o T— o
8
o
CM
O T—
LO
CM 00 05 CO 05 co o 05 CN r-~ co
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132
LO LO
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8
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8
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9
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8
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Gen
BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 106 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108 BDL 108
133
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 108
8121.4 Pr. 1,23 1,44
BDL 108
8122.7 P 0,02
BDL 108
8122.7 Pr. 1,90
BDL 108
8123.7 P 0,48 0,34 0,09 0,74 0,00
BDL 108
8123.7 Pr. 1,21 1,15 1,58 1,11 1,21
BDL 110
8092.1 P 0,24 0,18 0,02
BDL 110
8092.1 Pr. 1,18 1,12 1,15
BDL 110
8092.2 P 0,11 0,01 0,01 0,01 0,00 0,03
BDL 110
8092.2 Pr. 1,75 1,20 1,24 1,20 1,30 1,21
BDL 110
8092.5 P 0,27 0,04 0,04 0,05 0,00
BDL 110
8092.5 Pr. 1,17 1,09 1,09 1,14 1,12
BDL 110
8095.2 P 0,61 0,20 0,01
BDL 110
8095.2 Pr. 1,11 1,16 1,10
BDL 111
8102.7 P 0,24 0,54 0,14 0,04 0,02 0,21 0,04 0,15 0,00 0,37
BDL 111
8102.7 Pr. 1,33 1,24 1,81 1,24 1,30 1,13 1,24 1,26 1,15 1,28
BDL 111
8103.1 P 0,68 0,09 0,04 0,20 0,00 0,07 0,20 0,00 0,00
BDL 111
8103.1 Pr. 1,37 1,70 1,77 1,54 1,37 1,15 1,54 1,20 1,16
BDL 111
8103.2 P 0,26 0,72 0,76 0,72 0,03 0,30 0,00
BDL 111
8103.2 Pr. 2,29 1,13 1,14 1,13 1,34 1,14 1,37
BDL 111
8103.4 P 0,52 0,53 0,08 0,47 0,00 0,12 0,12 0,00
BDL 111
8103.4 Pr. 2,01 1,22 1,81 1,19 1,19 1,11 1,15 1,08
BDL 111
8103.5 P 0,25 0,40 0,17 0,67 0,64 0,27 0,03 0,67 0,64 0,27 0,00 0,01
BDL 111
8103.5 Pr. 1,87 1,19 1,71 1,20 1,12 1,13 1,20 1,20 1,12 1,13 1,16 1,09
BDL 111
8102.7 P 0,31 0,52 0,44 0,27 0,44
BDL 111
8102.7 Pr. 1,32 1,29 1,12 1,23 1,12
BDL 111
8103.1 P 0,45 0,24 0,00 0,24 0,18
BDL 111
8103.1 Pr. 1,24 1,12 1,31 1,12 1,17
BDL 111
8103.2 P 0,61 0,51 0,33 0,25
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 111
8103.2 Pr. 1,93 1,80 1,25 1,22
BDL 111
8103.4 P 0,15 0,25 0,40
BDL 111
8103.4 Pr. 1,66 1,18 1,17
BDL 111
8103.5 P 0,15 0,34 0,10 0,10
BDL 111
8103.5 Pr. 1,80 1,72 1,11 1,11
BDL 112
7502.1 P 0,07 0,38 0,09 0,07 0,31 0,07
BDL 112
7502.1 Pr. 1,30 1,22 1,14 1,30 1,13 1,22
BDL 112
7502.14 P 0,50 0,49 0,49 0,49 0,56 0,12
BDL 112
7502.14 Pr. 9,53 4,98 9,33 4,98 1,11 1,16
BDL 112
7502.4 P 0,40 0,33 0,02 0,65 0,48 0,00 0,03 0,65 0,48 0,00 0,00 0,03
BDL 112
7502.4 Pr. 2,81 1,20 1,35 1,37 1,31 1,23 1,19 1,37 1,31 1,16 1,09 1,07
BDL 112
7502.7 P 0,26 0,31 0,45 0,00 0,20 0,45 0,03
BDL 112
7502.7 Pr. 2,00 1,76 1,21 1,22 1,15 1,21 1,08
BDL 112
7502.9 P 0,59 0,48 0,28 0,15 0,48 0,00 0,08
BDL 112
7502.9 Pr. 1,14 1,29 1,15 1,11 1,29 1,21 1,10
BDL 112
7502.1 P 0,31 0,39 0,03 0,04 0,02 0,03
BDL 112
7502.1 Pr. 2,00 1,38 1,11 1,38 1,26 1,11
BDL 112
7502.4 P 0,01 0,22 0,01 0,02 0,26 0,43 0,01 0,02 0,08
BDL 112
7502.4 Pr. 1,26 1,85 1,15 1,13 1,29 1,19 1,15 1,13 1,10
BDL 112
7502.7 P 0,25 0,11 0,20 0,41 0,00 0,25 0,57 0,41 0,00 0,34 0,05
BDL 112
7502.7 Pr. 1,28 1,50 1,20 1,11 1,23 1,30 1,10 1,11 1,23 1,12 1,23
BDL 112
7502.8 P 0,38 0,49 0,58 0,01 0,01 0,07 0,15 0,01 0,01 0,01
BDL 112
7502.8 Pr. 1,21 1,64 1,17 1,14 1,15 1,16 1,21 1,25 1,14 1,15
BDL 112
7502.9 P 0,06 0,07 0,11 0,00 0,11 0,28 0,09
BDL 112
7502.9 Pr. 1,22 1,63 1,12 1,34 1,12 1,25 1,41
BDL 113
7683.4 P 0,29 0,06 0,28 0,01 0,02 0,07 0,28 0,01 0,39 0,23
BDL 113
7683.4 Pr. 2,64 2,49 1,88 1,23 1,11 1,15 1,88 1,23 1,28 1,14
BDL 113
7683.6 P 0,30 0,24 0,00 0,03 0,33 0,03 0,39 0,26
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 113
7683.6 Pr. 2,33 1,40 1,67 1,47 1,21 1,47 1,29 1,12
BDL 113
7684.3 P 0,68 0,14 0,00 0,34 0,17
BDL 113
7684.3 Pr. 1,42 1,21 1,92 1,30 1,14
BDL 113
7684.6 P 0,25 0,21 0,70 0,51 0,37 0,70 0,51 0,00 0,01
BDL 113
7684.6 Pr. 2,21 1,55 1,20 1,12 1,10 1,20 1,12 1,17 1,09
BDL 113
7684.7 P 0,02 0,32 0,22 0,00
BDL 113
7684.7 Pr. 1,67 1,15 1,19 1,15
BDL 113
7683.1 P 0,05 0,43 0,54 0,41 0,01 0,54
BDL 113
7683.1 Pr. 1,39 1,62 1,15 1,20 1,20 1,15
BDL 113
7683.11 P
BDL 113
7683.11 Pr.
BDL 113
7683.4 P 0,72 0,77 0,69 0,39 0,00 0,69
BDL 113
7683.4 Pr. 1,33 1,21 1,12 1,14 1,24 1,12
BDL 113
7684.1 P
BDL 113
7684.1 Pr.
BDL 113
7684.5 P
BDL 113
7684.5 Pr.
BDL 114
7741.3 P 0,50 0,00 0,50 0,10 0,49 0,33 0,50 0,10 0,26 0,10
BDL 114
7741.3 Pr. 24,7 4 1,73 O OJ ___co___ 1,14 6,56 1,14 10,33 1,14 1,27 1,15
BDL 114
7741.6 P 0,50 0,49 0,50 0,49 0,40 0,72
BDL 114
7741.6 Pr. 65,4 1 11,28 9,24 11,28 1,23 1,12
BDL 114
7742.1 P 0,50 0,39 0,01 0,20 0,39 0,16
BDL 114
7742.1 Pr. 1,51 1,22 1,16 1,11 1,22 1,13
BDL 114
7742.3 P 0,48 0,00 0,03 0,15 0,03 0,20 0,15
BDL 114
7742.3 Pr. 6,61 1,94 1,69 1,30 1,69 1,41 1,16
BDL 114
7742.5 P 0,22 0,29 0,02 0,45 0,17 0,02 0,34 0,45 0,17 0,06 0,07
BDL 114
7742.5 Pr. 3,37 1,93 2,22 1,58 1,14 1,57 1,32 1,58 1,14 1,44 1,21
BDL 115
8152.3 P 0,27 0,11 0,24 0,03 0,08
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 115
8152.3 Pr. 1,28 1,26 1,14 1,25 1,13
BDL 115
8152.4 P 0,05 0,00 0,02 0,07 0,02 0,07 0,15
BDL 115
8152.4 Pr. 1,42 1,67 1,58 1,12 1,58 1,12 1,13
BDL 115
8154.1 P 0,15 0,11 0,40 0,22 0,40 0,05 0,00 0,31
BDL 115
8154.1 Pr. 1,41 1,31 1,32 1,23 1,32 1,31 1,14 1,36
BDL 115
8155.2 P 0,49 0,03 0,50 0,50 0,50 0,00 0,12 0,50
BDL 115
8155.2 Pr. 9,95 1,32 6,80 12,32 6,80 1,24 1,11 1,13
BDL 115
8155.4 P 0,72 0,49 0,00 0,51 0,45 0,51 0,12 0,12
BDL 115
8155.4 Pr. 2,26 4,22 1,60 3,59 1,83 3,59 1,27 1,11
BDL 115
8152.3 P 0,51 0,24 0,01 0,12 0,33 0,01
BDL 115
8152.3 Pr. 1,56 1,84 1,27 1,22 1,13 1,27
BDL 115
8152.4 P 0,01 0,57 0,01 0,25 0,08 0,08 0,02 0,25 0,08
BDL 115
8152.4 Pr. 2,40 1,29 2,01 1,20 1,19 1,63 1,25 1,20 1,19
BDL 115
8154.1 P 0,35 0,85 0,00 0,29 0,01 0,40 0,42 0,29 0,01 0,17
BDL 115
8154.1 Pr. 1,78 1,15 2,51 1,19 1,16 1,47 1,14 1,19 1,16 1,43
BDL 115
8155.2 P 0,11
BDL 115
8155.2 Pr. 1,60
BDL 115
8155.4 P 0,05
BDL 115
8155.4 Pr. 2,30
BDL 116
7481.2 P 0,24 0,16 0,18 0,12 0,22 0,12 0,02 0,00
BDL 116
7481.2 Pr. 1,61 1,19 1,16 1,21 1,17 1,21 1,32 1,17
BDL 116
7481.7 P 0,48 0,69 0,26 0,74 0,44 0,63 0,74 0,44 0,00 0,00 0,27
BDL 116
7481.7 Pr. 1,11 1,11 1,44 1,14 1,13 1,11 1,14 1,13 1,24 1,13 1,10
BDL 116
7481.8 P 0,49 0,50 0,49 0,33 0,50 0,56 0,36 0,04 0,60
BDL 116
7481.8 Pr. 15,7 8 5,33 13,31 1,10 5,33 1,12 1,11 1,22 1,33
BDL 116
7482.2 P 0,45 0,10 0,46 0,02 0,13 0,46 0,02 0,00 0,00
BDL 116
7482.2 Pr. 1,23 1,53 1,34 1,18 1,22 1,34 1,18 1,20 1,04
BDL 116
7485.1 P 0,00 0,13 0,36 0,46 0,08 0,55 0,20 0,46 0,08 0,12 0,24
LO
LO
a
r-- o 00
o_ o_ o_ o_
o o o
8
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CM
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8
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Par.
CL Q_ ül Q_ ül Q_ ül ü_ ül ü_ ül Q_ CL Q_ ül Q_ ül Q_ ül 0_ ül 0_ CL 0_ ül 0_ ül 0_
T— CM CM CM CM T— T— LO LO r»- r-- co CO co co CM CN LO LO T— T— T— T— 05
LO CM CM CO CO T— T— CM CM CM CM co co co co co co co co co co co
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138
LO LO
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a
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8
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LO
LO
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8
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9
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8
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8
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8
05 CO_ 0" CN CN CO 0"
8
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Par.
CL ü_ ül ü_ ül Q_ ül ü_ ül Q_ ül Q_ ül Q_ ül 0_ ül Q_ CL 0_ ül Q_ ül Q_ ül 0_ ül 0_
iS
7513.9 7514.3 7514.3 CO ¡o r-- CO ío r»- 7513.14 7513.14 7513.9 7513.9 7514.3 7514.3 CM 00 O 00 CM 00 O 00 CO CM 00 O 00 CO CM 00 O 00 CO CM 00 o 00 CO CM 00 o 00 CN CO 00 O 00 CN CO 00 0 00 CO CO 00 0 00 CO CO 00 0 00 CM 00 00 CM 00 00 05 r-- 05 r-- 7491.5 7491.5 7492.5
Gen
BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 122 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 123 BDL 124 BDL 124 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125
139
ss
a
3 0,05 3 0,04 0,06 0,04 1,08
8
0,31 1,23 0,41 1,24 0,17 0,03 CO
LO
55
1,23 0,28 1,20 0,24 1,20 0,30 CN 0,01 1,36 0,16 0,01 1,42
8
0,33 CO
CO 0,00 1,09 0,00 1,09 0,00 LO 0,02 1,08 0,00 r»- 0,00 LO 0,12 CO 0,13
CN 0,00 r»- 0,06 0,18 1,29 0,26 CO 0,26 CN 0,06 CO 0,05 r»- 0,33 1,26 0,42 LO 0,00 CN 0,03
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CO 0,47 1,24 0,36 1,30 0,66 LO 0,05
CM 0,37 0,46 3,18 0,02 1,28 0,51 7,47 0,49 3,58 0,03
0,20 o 0,53 CO 0,43 0,19
0,85 CN 0,53 3,76 00 o" 5,56 0,16 1,34 0,51 6,06 0,50 6,16 0,08 0,01
8
1,53 0,59 CN 0,43 1,50 0,82 CN
8
1,62 0,03 1,65 0,17 1,75 0,59 CO r-~ 0,64 CO_ 0,72 LO 0,60 1,46 0,49 1,50 0,70 1,25 0,34 1,38 0,09 1,77 0,68 05 0,27
CO
0,33 1,28 0,79 1,26 0,50 4,09 00 o" 7,01 0,26 0,04 1,34 0,50 11,0 3 0,06 CO 0,50 12,7 0 0,35 1,26 0,33
8
1,72 0,54 1,65 00 ■'Ñf o" 0,55 00 ■'Ñf o" 2,28 0,25 1,88 0,43
8
Par.
ül Q_ ül Q_ ül Q_ CL Q_ CL Q_ CL CL ül CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
Ev.
7492.5 7494.1 7494.1 7495.5 7495.5 7711.3 7711.3 8361.5 8361.5 8362.2 8362.2 CN CO CO CO 00 CN CO CO CO 00 8365.2 8365.2 7691.4 7691.4 7691.6 7691.6 7692.2 7692.2 9369Z 9369Z 7693.1 7693.1 7663.1 7663.1 7663.3
Gen
BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 125 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 128 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 129 BDL 130 BDL 130 BDL 130
140
LO LO
a
8
LO
LO
0,17 1,25 0,16 r»- o" CO 0,60 1,27
8
0,41
1,28 0,00 1,09 0,03 LO 0,04 LO
1,35 0,00 1,27 0,02 r»- 0,06 1,28
CO
0,00 1,30 0,16 CN 0,06 0,46 4,79 0,51 5,70
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CO ■'Ñf 0,01 1,24
CN 0,00 CO 0,26 1,25 0,50 69,02 0,49 10,13 0,23 1,24
CO
0,00 1,30 0,16 CN 0,06 0,46 4,79 0,51 5,70
8
0,05 1,74 0,72 CN 0,45 1,30 0,10
8
1,82 o" 1,24 0,34 1,57 0,43 O 0,03 CO 0,68 1,24 0,50 1,28
CO
1,67 0,38 CO 0,41 1,26 0,57 CO 0,27 LO 0,47 4,65 0,50 8,05 0,45
8
6,12 0,00 1,79 0,45 1,89 0,93 1,24
8
Par.
CL Q_ ül Q_ ül Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
7663.3 7663.6 7663.6 7664.5 7664.5 7461.2 7461.2 7461.4 7461.4 7462.2 7462.2 7463.4 7463.4 7464.5 7464.5 7471.1 7471.1 7471.4 7471.4 7472.4 7472.4 7473.1 7473.1 7474.4 7474.4 7471.1 7471.1 7471.4
Gen
BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 130 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 131 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132
LO LO
0,81 0,21
a
8
0,15 CO 0,58 1,34 0,06 1,25 0,27 1,27 0,00 1,25 0,02
LO
LO
0,02 CN
8
1,25 0,57 1,34 0,32 0,43 r»- 0,10 CO 0,51 CO 0,50 CN
0,04 CN 0,01 CO 0,04 1,07 0,01 r»- 0,05 O
9
0,05 1,08 0,42 O 0,03 1,09 o" CN 0,05 1,08 0,02
0,10 1,09 0,28 1,23 0,24 CO 0,26 LO
0,63 CO 0,02 1,20 0,08 1,26 0,07
£
co 0,73 co
0,30 1,22 0,19 CO o" 1,22 0,00 1,29
0,03 CN 0,51 CO 0,00 co 0,49 0,01
0,70 0,74 CO ■'ñT 0,60 1,76 0,57 3,46
0,10 1,09 0,28 1,23 0,24 co 0,26 LO
0,63 CO 0,02 1,20 0,08 1,26 0,07
8
co 0,73 co
8
0,49 1,87 0,61 1,36 0,56 r»- 0,34 CO 0,12 1,24 0,07 1,39 0,02 1,79 0,07
co
1,84 0,29 1,38 0,66 1,24 0,51 1,38 0,44 1,24 0,16
8
0,37 1,75 0,02 2,12 00 ■'Ñf o" 15,21 0,36 00 0,40 3,72 0,26 4,40 0,46
8
0,63 1,20 0,32 CN 0,16 co
Par.
CL Q_ CL CL CL CL ül CL ül CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
iS
7471.4 7472.4 7472.4 7473.1 7473.1 7475.4 7475.4 8161.1 8161.1 8161.2 8161.2 8161.3 8161.3 8161.4 8161.4 8162.1 8162.1 8162.3 8162.3 8162.5 8162.5 8163.2 8163.2 7671.2 7671.2 7672.1 7672.1 7673.1
Gen
BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 132 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 133 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 134
142
ss
a
0,09 1,03
8
CO 0,40 LO 0,47 LO 0,01 00
LO
0,62 CO
55
0,77
8
0,55 1,20 0,33 O 0,00 1,24 0,27 O
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0,25
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0,25
0,15 00 0,29 CO 0,03 00 0,25 CM 0,13 CM 0,24 0,13 1,25 0,55 0,17
8
0,62 2,29 0,75
8
1,30 0,74 LO 0,71 0,42 0,64 1,25 0,76 CO 0,03
CO
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8
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8
0,12 O
Par.
CL Q_ CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL CL
Ev.
7673.1 7673.2 7673.2 VZZLL VZZLL VZZLL VZZLL 7723.3 7723.3 7723.8 7723.8 7723.9 7723.9 7751.4 7751.4 7751.5 7751.5 7751.8 7751.8 7752.6 7752.6 7701.2 7701.2 7701.5 7701.5 7701.6 7701.6 7702.1
Gen
BDL 134 BDL 134 BDL 134 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 135 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 136 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137 BDL 137
143
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 137
7702.1 Pr. 2,52 1,20 1,51 1,25 1,13 1,43 1,25 1,13 1,24 1,19
BDL 137
7703.2 P 0,18 0,10 0,07 0,37
BDL 137
7703.2 Pr. 1,24 1,43 1,19 1,15
BDL 137
7703.3 P 0,34 0,21 0,67 0,22 0,00 0,67 0,22 0,00 0,14 0,48
BDL 137
7703.3 Pr. 1,27 1,35 1,11 1,15 1,29 1,11 1,15 1,27 1,16 1,17
BDL 137
7703.7 P 0,15 0,02 0,10 0,02 0,06 0,18
BDL 137
7703.7 Pr. 1,32 1,21 1,12 1,21 1,23 1,13
BDL 139
8131.1 P
BDL 139
8131.1 Pr.
BDL 139
8131.2 P 0,25 0,01 0,63 0,56 0,05 0,26 0,56 0,08 0,02 0,10
BDL 139
8131.2 Pr. 1,19 1,83 1,16 1,13 1,23 1,16 1,13 1,15 1,15 1,19
BDL 139
8132.7 P
BDL 139
8132.7 Pr.
BDL 139
8133.2 P
BDL 139
8133.2 Pr.
BDL 141
8141.2 P 0,15 0,15 0,05
BDL 141
8141.2 Pr. 1,16 1,11 1,12
BDL 141
8142.2 P
BDL 141
8142.2 Pr.
BDL 142
8282.1 P 0,03 0,43 0,62 0,20 0,03 0,10 0,20 0,01 0,00 0,68
BDL 142
8282.1 Pr. 1,16 1,25 1,25 1,14 1,20 1,12 1,14 1,24 1,19 1,11
BDL 142
8283.1 P 0,41 0,33 0,52 0,11 0,59 0,16 0,11
BDL 142
8283.1 Pr. 1,23 8,56 1,27 1,16 2,47 1,28 1,16
BDL 142
8283.2 P 0,27 0,05 0,30 0,48 0,30 0,32 0,43
BDL 142
8283.2 Pr. 1,14 1,42 1,18 1,15 1,18 1,12 1,20
BDL 142
8284.1 P 0,83 0,57 0,41 0,38 0,41
BDL 142
8284.1 Pr. 1,11 1,14 1,16 1,32 1,16
BDL 142
8285.3 P 0,03 0,34 0,65 0,41 0,44 0,57 0,01 0,18 0,41 0,44 0,00 0,00 0,63
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 142
8285.3 Pr. 1,17 2,67 1,20 1,22 1,16 2,90 1,31 1,21 1,22 1,16 1,27 1,16 1,12
BDL 142
8285.5 P 0,49
BDL 142
8285.5 Pr. 1,13
BDL 143
8411.1 P 0,40 0,37
BDL 143
8411.1 Pr. 1,21 1,24
BDL 143
8411.5 P 0,54 0,54 0,54 0,03 0,38 0,24
BDL 143
8411.5 Pr. 1,13 1,10 1,13 1,08 1,10 1,21
BDL 143
8412.2 P 0,43 0,01 0,03 0,14 0,03 0,03 0,00 0,05
BDL 143
8412.2 Pr. 1,32 1,54 1,22 1,28 1,22 1,32 1,24 1,03
BDL 143
8412.4 P 0,01 0,47 0,56 0,03 0,47 0,00 0,00
BDL 143
8412.4 Pr. 2,08 1,18 1,17 1,30 1,18 1,37 1,29
BDL 143
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BDL 143
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BDL 143
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BDL 143
8414.4 Pr. 1,18 1,15 1,11 1,18
BDL 143
8414.5 P 0,16 0,11 0,01
BDL 143
8414.5 Pr. 1,17 1,23 1,19
BDL 144
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BDL 144
8384.1 Pr. 1,33 1,47 1,13 1,18 1,13 1,29 1,21 1,03
BDL 144
8384.5 P 0,08 0,14 0,14 0,00 0,01
BDL 144
8384.5 Pr. 1,45 1,20 1,20 1,33 1,32
BDL 144
8385.1 P 0,00 0,76 0,06 0,40 0,05 0,23 0,40 0,05 0,12 0,04
BDL 144
8385.1 Pr. 3,33 1,11 1,69 1,24 1,20 1,40 1,24 1,20 1,44 1,33
BDL 145
8233.2 P 0,15 0,05 0,13 0,15 0,13
BDL 145
8233.2 Pr. 1,48 1,51 1,23 1,14 1,23
BDL 145
8233.3 P 0,39 0,02 0,58 0,56 0,05 0,00 0,58 0,56 0,11 0,10
BDL 145
8233.3 Pr. 14,58 1,62 1,15 1,12 1,28 1,28 1,15 1,12 1,27 1,21
BDL 145
8235.1 P 0,30 0,15 0,21 0,05 0,17 0,19
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 145
8235.1 Pr. 1,19 1,53 1,20 1,08 1,12 1,10
BDL 145
8235.3 P 0,19 0,02 0,29 0,39 0,11 0,29 0,02 0,03
BDL 145
8235.3 Pr. 5,48 1,65 1,20 1,31 1,27 1,20 1,21 1,15
BDL 145
8235.4 P
BDL 145
8235.4 Pr.
BDL 146
8241.1 P 0,17
BDL 146
8241.1 Pr. 1,32
BDL 146
8241.3 P 0,31 0,60 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,47 0,02
BDL 146
8241.3 Pr. 1,18 1,24 1,17 1,35 1,17 1,16 1,15 1,11 1,15
BDL 146
8243.2 P 0,20 0,20 0,00 0,02
BDL 146
8243.2 Pr. 1,14 1,14 1,20 1,15
BDL 146
8243.5 P 0,73 0,33 0,44 0,03 0,00 0,03 0,10 0,01
BDL 146
8243.5 Pr. 1,22 1,43 1,42 1,23 1,39 1,23 1,19 1,10
BDL 146
8244.4 P 0,43 0,19 0,58 0,08 0,67 0,43 0,58 0,08 0,17
BDL 146
8244.4 Pr. 1,15 1,26 2,83 1,16 1,68 1,21 2,83 1,16 1,17
BDL 146
8244.7 P 0,00 0,61 0,23 0,15 0,07 0,15 0,04 0,15
BDL 146
8244.7 Pr. 1,96 1,18 1,39 1,14 1,33 1,14 1,18 1,19
BDL 146
8245.2 P 0,10 0,03 0,02 0,03 0,38
BDL 146
8245.2 Pr. 1,34 1,18 1,50 1,18 1,35
BDL 146
8245.5 P 0,20 0,22 0,06
BDL 146
8245.5 Pr. 1,24 1,21 1,44
BDL 42
7771.1 P
BDL 42
7771.1 Pr.
BDL 42
7772.1 P
BDL 42
7772.1 Pr.
BDL 42
7772.7 P
BDL 42
7772.7 Pr.
BDL 42
7774.1 P 0,07 0,58 0,00 0,06 0,24 0,12 0,06 0,00 0,01
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 42
7774.1 Pr. 5,75 1,14 1,59 1,11 1,21 1,19 1,11 1,31 1,27
BDL 42
7774.2 P
BDL 42
7774.2 Pr.
BDL 42
7774.4 P 0,47 0,01 0,06 0,21
BDL 42
7774.4 Pr. 4,18 1,81 1,36 1,21
BDL 46
7833.3 P 0,02 0,32 0,45 0,19 0,19 0,16 0,00 0,54
BDL 46
7833.3 Pr. 1,37 1,44 1,68 1,36 1,36 1,30 1,15 1,15
BDL 46
7833.4 P 0,56 0,00
BDL 46
7833.4 Pr. 1,19 1,40
BDL 46
7833.5 P 0,47 0,45 0,51 0,54 0,54 0,04 0,07 0,19
BDL 46
7833.5 Pr. 2,25 1,14 1,32 1,31 1,31 1,14 1,03 1,15
BDL 46
7833.6 P 0,14 0,30 0,61 0,61 0,63 0,22
BDL 46
7833.6 Pr. 1,21 1,24 1,19 1,19 1,16 1,52
BDL 46
7834.1 P 0,75 0,46 0,33 0,00 0,01
BDL 46
7834.1 Pr. 1,13 1,15 1,15 1,09 1,07
BDL 46
7833.1 P 0,20 0,43 0,09 0,02 0,21 0,39 0,02 0,12 0,02
BDL 46
7833.1 Pr. 2,16 1,47 1,70 1,18 1,32 1,20 1,18 1,12 1,14
BDL 46
7833.3 P 0,81
BDL 46
7833.3 Pr. 1,20
BDL 46
7833.4 P 0,33 0,73 0,75
BDL 46
7833.4 Pr. 1,73 1,25 1,25
BDL 46
7833.5 P 0,65 0,17 0,32
BDL 46
7833.5 Pr. 1,14 1,77 1,24
BDL 46
7834.4 P 0,02 0,27 0,02 0,02 0,29 0,00 0,02
BDL 46
7834.4 Pr. 1,22 1,96 2,26 1,29 1,13 1,33 1,29
BDL 51
7291.1 P 0,19 0,78 0,00 0,31 0,81 0,49 0,04 0,31 0,04 0,01 0,00
BDL 51
7291.1 Pr. 3,97 1,19 1,77 1,82 1,21 1,32 1,23 1,82 1,22 1,09 1,13
BDL 51
8021.1 P 0,02 0,93 0,50 0,13 0,93 0,50 0,13 0,10 0,11
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 51
8021.1 Pr. 3,28 1,18 26,01 1,15 1,18 26,01 1,15 1,69 1,24
BDL 51
8022.4 P 0,04 0,03 0,34 0,77 0,40 0,34 0,18 0,00
BDL 51
8022.4 Pr. 2,98 2,43 1,54 1,17 1,15 1,54 1,41 1,19
BDL 51
8022.5 P 0,35 0,44 0,44 0,13 0,03 0,50 0,03 0,11 0,01 0,07
BDL 51
8022.5 Pr. 1,19 4,24 2,39 3,03 1,43 1,25 1,43 1,26 1,14 1,05
BDL 51
8024.4 P 0,39 0,00 0,28 0,66 0,53 0,30 0,55 0,28 0,66 0,53 0,30 0,49
BDL 51
8024.4 Pr. 3,38 1,69 1,63 1,32 1,30 1,15 1,30 1,26 1,32 1,30 1,15 1,14
BDL 51
8024.7 P 0,33 0,37 0,41 0,41 0,35
BDL 51
8024.7 Pr. 1,29 1,39 1,21 1,21 1,24
BDL 52
7861.1 P 0,72 0,57 0,61 0,61 0,30
BDL 52
7861.1 Pr. 1,25 1,24 1,18 1,18 1,38
BDL 52
7861.5 P 0,11 0,68 0,01 0,01 0,36 0,10
BDL 52
7861.5 Pr. 1,31 1,14 1,27 1,27 1,17 1,12
BDL 52
7863.2 P 0,82 0,07 0,14 0,02
BDL 52
7863.2 Pr. 1,21 1,03 1,11 1,09
BDL 52
7864.5 P 0,61 0,76 0,71 0,40 0,76 0,71 0,39
BDL 52
7864.5 Pr. 1,25 1,17 1,10 1,26 1,17 1,10 1,35
BDL 54
7781.1 P 0,50 0,73 0,50 0,47 0,50 0,01 0,00
BDL 54
7781.1 Pr. 13,0 3 1,16 6,59 3,90 6,59 1,12 1,09
BDL 54
7781.4 P 0,06 0,09 0,78 0,27 0,55 0,27 0,00 0,50
BDL 54
7781.4 Pr. 1,28 1,25 1,13 1,19 1,22 1,19 1,09 1,31
BDL 54
7784.3 P 0,87 0,49 0,16 0,48 0,05 0,49 0,06 0,48 0,05 0,00 0,05 0,22
BDL 54
7784.3 Pr. 1,49 9,56 1,68 5,77 1,15 14,83 1,26 5,77 1,15 1,35 1,15 1,12
BDL 54
7784.5 P 0,44 0,47 0,07 0,47 0,23 0,75
BDL 54
7784.5 Pr. 1,49 1,19 1,27 1,19 1,15 1,12
BDL 54
7785.4 P 0,16 0,06 0,36 0,00 0,36 0,25 0,15 0,16
BDL 54
7785.4 Pr. 1,52 1,40 1,22 1,30 1,22 1,16 1,12 1,20
BDL 54
7781.1 P 0,55 0,19 0,08 0,23 0,10 0,23
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 54
7781.1 Pr. 1,50 1,33 3,05 1,13 1,27 1,13
BDL 54
7781.4 P 0,04 0,25 0,01 0,52 0,00 0,52 0,15
BDL 54
7781.4 Pr. 1,87 1,36 1,85 1,18 1,37 1,18 1,19
BDL 54
7784.3 P 0,49 0,47 0,43 0,02 0,03 0,02
BDL 54
7784.3 Pr. 1,54 1,37 1,81 1,14 1,30 1,14
BDL 54
7785.4 P 0,40 0,67 0,34 0,26
BDL 54
7785.4 Pr. 1,57 1,13 1,18 1,20
BDL 54
7785.8 P 0,41 0,07 0,10 0,32
BDL 54
7785.8 Pr. 1,39 1,21 1,28 1,21
BDL 56
7181.2 P 0,51 0,51 0,50 0,43 0,50 0,00 0,00 0,70
BDL 56
7181.2 Pr. 3,81 1,79 3,28 3,75 3,28 1,42 1,19 1,13
BDL 56
8301.1 P 0,01 0,05
BDL 56
8301.1 Pr. 1,05 1,24
BDL 56
8301.3 P 0,42 0,64 0,34 0,64
BDL 56
8301.3 Pr. 1,10 1,15 1,11 1,15
BDL 56
8304.1 P 0,40
BDL 56
8304.1 Pr. 1,12
BDL 56
8305.1 P 0,19 0,52 0,76 0,71 0,76 0,71 0,23
BDL 56
8305.1 Pr. 1,17 1,26 1,11 1,13 1,11 1,13 1,20
BDL 56
8301.1 P 0,64 0,70 0,70 0,65 0,41 0,40 0,41
BDL 56
8301.1 Pr. 1,21 1,29 1,11 1,33 1,15 1,19 1,15
BDL 56
8301.2 P 0,44 0,13 0,01 0,01 0,12 0,01 0,07
BDL 56
8301.2 Pr. 2,00 1,67 1,17 1,30 1,32 1,17 1,10
BDL 56
8301.3 P 0,23 0,23 0,63 0,61 0,38 0,61 0,25
BDL 56
8301.3 Pr. 1,11 1,70 1,46 1,18 1,36 1,18 1,11
BDL 56
8303.1 P 0,53
BDL 56
8303.1 Pr. 1,39
BDL 56
8303.2 P 0,29 0,39 0,16 0,16 0,57
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 56
8303.2 Pr. 1,32 1,78 1,12 1,12 1,11
BDL 59
7792.1 P 0,02
BDL 59
7792.1 Pr. 1,10
BDL 59
7792.2 P 0,70 0,20
BDL 59
7792.2 Pr. 1,19 1,16
BDL 59
7792.3 P 0,31 0,04
BDL 59
7792.3 Pr. 1,43 1,06
BDL 59
7793.3 P 0,66 0,04 0,57 0,56 0,57 0,56 0,36 0,20
BDL 59
7793.3 Pr. 1,48 1,43 1,40 1,11 1,40 1,11 1,24 1,14
BDL 59
7794.1 P 0,13 0,01 0,36 0,01 0,02 0,00
BDL 59
7794.1 Pr. 7,90 6,46 4,80 6,46 1,13 1,09
BDL 60
8011.4 P 0,29 0,03 0,12
BDL 60
8011.4 Pr. 1,13 1,24 1,15
BDL 60
8011.7 P 0,49 0,00 0,48 0,47 0,06 0,48 0,15 0,04 0,38 0,04
BDL 60
8011.7 Pr. 00 o ^ 1,51 5,59 2,44 1,28 5,59 1,37 1,18 1,11 1,18
BDL 60
8013.4 P 0,97 0,39 0,50 0,38 0,49 0,35 0,50 0,38 0,06 0,00 0,60
BDL 60
8013.4 Pr. 1,10 1,66 27,18 1,13 16,70 1,20 27,18 1,13 1,56 1,19 1,15
BDL 60
8013.6 P 0,35 0,74 0,62 0,14 0,25 0,62 0,14 0,00 0,08
BDL 60
8013.6 Pr. 2,43 1,34 1,18 1,10 1,12 1,18 1,10 1,53 1,19
BDL 60
8014.5 P 0,48 0,10 0,61 0,72 0,37 0,61 0,07 0,08
BDL 60
8014.5 Pr. 3,21 1,73 1,43 1,20 1,12 1,43 1,38 1,17
BDL 60
8013.6 P 0,78 0,59 0,02 0,24 0,35 0,02
BDL 60
8013.6 Pr. 1,15 1,37 1,12 1,22 1,15 1,12
BDL 60
8014.2 P 0,02 0,01 0,02 0,01
BDL 60
8014.2 Pr. 2,03 2,05 1,35 1,19
BDL 60
8014.7 P 0,40 0,17 0,72 0,07 0,01 0,04 0,07
BDL 60
8014.7 Pr. 1,23 1,32 1,20 1,22 1,33 1,17 1,22
BDL 60
8014.8 P 0,72 0,01 0,46 0,14 0,61 0,29 0,46 0,14 0,25 0,10
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 60
8014.8 Pr. 1,53 1,95 1,30 1,10 1,19 1,18 1,30 1,10 1,16 1,24
BDL 65
7824.1 P 0,73 0,69 0,27 0,13 0,18
BDL 65
7824.1 Pr. 1,40 1,11 1,13 1,44 1,22
BDL 65
7825.2 P 0,20 0,56 0,03 0,00 0,05
BDL 65
7825.2 Pr. 1,25 1,33 1,33 1,27 1,14
BDL 65
8473.2 P 0,10 0,37 0,00 0,01 0,01 0,45 0,50 0,05 0,01 0,01 0,00 0,00
BDL 65
8473.2 Pr. 4,55 1,17 1,69 1,27 1,22 3,42 1,42 1,33 1,27 1,22 1,25 1,18
BDL 65
8474.1 P 0,58 0,01
BDL 65
8474.1 Pr. 1,11 1,08
BDL 67
7901.5 P 0,42 0,46 0,00 0,52 0,38 0,52 0,00 0,00 0,31 0,02
BDL 67
7901.5 Pr. 1,92 1,10 1,70 1,27 1,13 1,27 1,29 1,15 1,13 1,14
BDL 67
7902.3 P 0,30 0,48 0,48 0,50 0,50 0,48 0,12 0,21 0,04 0,00
BDL 67
7902.3 Pr. 1,22 8,10 5,44 20,18 1,19 5,44 1,36 1,13 1,40 1,11
BDL 67
7902.7 P 0,49 0,12 0,50 0,08 0,50 0,50 0,08 0,04 0,04 0,44 0,00
BDL 67
7902.7 Pr. 8,01 1,43 6,31 1,13 6,95 6,31 1,13 1,42 1,16 1,16 1,11
BDL 67
7903.3 P 0,52 0,33 0,19 0,19
BDL 67
7903.3 Pr. 1,23 1,21 1,18 1,46
BDL 67
7903.5 P 0,26 0,00 0,35 0,47 0,00 0,15 0,47 0,00 0,00 0,13
BDL 67
7903.5 Pr. 1,10 3,19 1,61 1,29 1,26 1,39 1,29 1,26 1,34 1,13
BDL 68
7761.3 P 0,26 0,49 0,50 0,49 0,34 0,00
BDL 68
7761.3 Pr. 1,25 12,65 24,18 12,65 1,21 1,14
BDL 68
7761.8 P 0,48 0,50 0,01 0,19 0,08 0,36 0,08 0,19 0,08 0,00 0,08 0,27
BDL 68
7761.8 Pr. 10,41 1,23 1,49 1,67 1,18 1,42 1,41 1,67 1,18 1,36 1,16 1,18
BDL 68
7761.9 P 0,25 0,49 0,44 0,59 0,13 0,00 0,49 0,44 0,00 0,00
BDL 68
7761.9 Pr. 1,73 2,09 1,22 1,23 1,69 1,45 2,09 1,22 1,52 1,18
BDL 68
7763.2 P 0,40 0,03 0,51 0,02 0,75 0,05 0,20 0,51 0,02 0,00 0,04 0,29 0,22
BDL 68
7763.2 Pr. 3,14 1,55 1,54 1,18 1,20 1,46 1,21 1,54 1,18 1,32 1,13 1,31 1,13
BDL 68
7764.1 P 0,55 0,50 0,33 0,49 0,03 0,47 0,01 0,49 0,03 0,09 0,24 0,33
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 68
7764.1 Pr. 10,21 co c¿> o 1,50 7,93 1,16 5,30 1,27 7,93 1,16 1,47 1,17 1,13
BDL 78
7911.11 P 0,13 0,52 0,35 0,00 0,12
BDL 78
7911.11 Pr. 1,12 1,17 1,23 1,20 1,14
BDL 78
7911.8 P 0,51 0,64 0,07 0,22 0,07 0,05 0,08
BDL 78
7911.8 Pr. 1,15 1,26 1,07 1,11 1,07 1,12 1,13
BDL 78
7911.9 P 0,22 0,00 0,06 0,38 0,39 0,06 0,07 0,00 0,19 0,37
BDL 78
7911.9 Pr. 7,52 1,82 1,19 1,17 1,16 1,19 1,37 1,27 1,22 1,12
BDL 78
7912.6 P 0,58 0,14 0,20 0,24 0,20 0,02 0,37
BDL 78
7912.6 Pr. 1,10 1,31 1,19 1,22 1,19 1,09 1,11
BDL 78
7913.11 P 0,20 0,21 0,14 0,29 0,53 0,36 0,14 0,29 0,00 0,00
BDL 78
7913.11 Pr. 1,18 1,99 1,13 1,11 1,23 1,43 1,13 1,11 1,19 1,15
BDL 78
7913.3 P 0,03 0,04
BDL 78
7913.3 Pr. 1,14 1,03
BDL 78
7913.6 P 0,42 0,04 0,09 0,61 0,01 0,09 0,00 0,01
BDL 78
7913.6 Pr. 11,13 1,45 1,21 1,23 1,22 1,21 1,27 1,22
BDL 78
7913.8 P 0,11 0,07 0,04 0,07 0,21 0,00 0,37 0,02
BDL 78
7913.8 Pr. 1,33 1,16 1,15 1,16 1,25 1,16 1,11 1,19
BDL 78
7913.9 P 0,48 0,63 0,24 0,54 0,01 0,24 0,16 0,07
BDL 78
7913.9 Pr. 1,85 1,26 1,16 5,72 1,22 1,16 1,15 1,10
BDL 82
7801.1 P 0,31 0,01 0,23 0,05 0,37 0,27 0,23 0,05 0,07 0,02 0,63 0,03
BDL 82
7801.1 Pr. 3,94 1,88 1,44 1,14 1,45 1,41 1,44 1,14 1,41 1,15 1,13 1,07
BDL 82
7801.3 P 0,39 0,47 0,51 0,47 0,13 0,00
BDL 82
7801.3 Pr. 13,27 1,36 1,21 1,36 1,44 1,21
BDL 82
7802.2 P 0,41 0,46 0,52 0,07 0,45 0,52 0,00 0,16
BDL 82
7802.2 Pr. 3,78 1,20 1,54 1,34 1,17 1,54 1,17 1,12
BDL 82
7802.3 P 0,18 0,02 0,45 0,32 0,12 0,06 0,32 0,13 0,00
BDL 82
7802.3 Pr. 2,14 1,41 1,40 1,14 1,16 1,24 1,14 1,30 1,16
BDL 82
7803.9 P 0,54 0,54 0,28
5
10
15
20
25
30
Gen
Ev. Par. 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55
BDL 82
7803.9 Pr. 1,18 1,18 1,35
BDL 89
7812.2 P 0,67 0,26 0,42
BDL 89
7812.2 Pr. 1,12 1,17 1,13
BDL 89
7812.5 P 0,51 0,51 0,18 0,50 0,51 0,18 0,11 0,18 0,03
BDL 89
7812.5 Pr. 12,2 4 5,84 1,18 16,66 5,84 1,18 1,26 1,12 1,04
BDL 89
7814.1 P 0,23 0,39 0,58 0,06 0,58 0,00 0,00
BDL 89
7814.1 Pr. 1,16 1,14 1,16 1,16 1,16 1,17 1,04
BDL 89
7814..4 P 0,47 0,42 0,46 0,05 0,48 0,43 0,46 0,05 0,36 0,21
BDL 89
7814.4 Pr. 9,40 2,02 5,59 1,17 6,76 1,21 5,59 1,17 1,24 1,13
BDL 89
7814.5 P 0,47 0,26 0,46 0,52 0,20 0,15 0,46 0,02 0,05 0,00 0,10
BDL 89
7814.5 Pr. 7,62 1,57 1,98 1,65 1,26 1,14 1,98 1,38 1,21 1,59 1,15
Tabla 27
EJEMPLO 8
EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO DE LA PLANTA ARABIDOPSIS TRANSGÉNICA BAJO ESTRES ABIÓTICO Y CONDICIONES DE DEFICIENCIA DE NITRÓGENO EN EL ENSAYO DE CULTIVO TISULAR
Ensayo 1: crecimiento de plantas bajo estrés osmótico [poli(etilenglicol) (PEG)] en condiciones de cultivo tisular- Una de las consecuencias de la sequía es la inducción de estrés osmótico en la zona que rodea las raíces; por lo tanto, en muchos estudios científicos, se usa PEG (por ejemplo, PEG8000 al 1,5%) para simular las condiciones de estrés osmótico que se asemejan a la alta osmolaridad encontrada durante el estrés por sequía.
Las semillas esterilizadas en superficie se sembraron en medio basal [medio Murashige-Skoog (MS) al 50 % complementado con agar de planta al 0,8 % como agente solidificante] en presencia de Kanamicina (para seleccionar sólo plantas transgénicas). Después de la siembra, las placas se transfirieron durante 2-3 días para la estratificación a 4 °C y a continuación se cultivaron a 25 °C bajo ciclos diarios de 12 horas de luz-12 horas de oscuridad durante de 7 a 10 días. En este punto temporal, las plántulas elegidas al azar se transfirieron cuidadosamente a placas que contenían PEG al 1,5%: medio MS a 0,5 o condiciones de cultivo normales (medio MS a 0,5). Cada placa contenía 5 plántulas del mismo evento transgénico, y 3-4 placas diferentes (repeticiones) para cada evento. Para cada polinucleótido de la invención, se analizaron al menos cuatro eventos de transformación independientes de cada construcción. Las plantas que expresan los polinucleótidos de la invención se compararon con la medición promedio de las plantas de control (vector vacío o gen indicador GUS bajo el mismo promotor) usadas en el mismo experimento.
Ensayo 2: crecimiento de plantas con deficiencia de nitrógeno en condiciones de cultivo tisular - Los
inventores de la presente invención han descubierto que el ensayo de eficiencia de uso de nitrógeno (EUN) es relevante para la evaluación de los genes candidatos de TEAB, ya que la deficiencia de nitrógeno estimula el alargamiento de la raíz, el aumento de la cobertura de la raíz y permite detectar el potencial de la planta para generar un mejor sistema radicular en condiciones de sequía. Además, hay indicaciones en la bibliografía de que los mecanismos biológicos de la EUN y la tolerancia a la sequía están vinculados (Wesley et al., 2002 Journal of Experiment Botany Vol 53, No.366, págs. 13-25).
Las semillas esterilizadas en superficie se sembraron en medio basal [medio Murashige-Skoog (MS) al 50 % complementado con agar de planta al 0,8 % como agente solidificante] en presencia de Kanamicina (para seleccionar sólo plantas transgénicas). Después de la siembra, las placas se transfirieron durante 2-3 días para la estratificación a 4 °C y a continuación se cultivaron a 25 °C bajo ciclos diarios de 12 horas de luz-12 horas de oscuridad durante de 7 a 10 días. En este punto temporal, las plántulas elegidas al azar se transfirieron cuidadosamente a placas con condiciones limitantes de nitrógeno: medio MS a 0,5 en el que la concentración de
5
10
15
20
25
30
35
40
nitrógeno combinada (NH4NO3 y KNO3) es 0,75 mM (condiciones de deficiencia de nitrógeno). Cada placa contiene 5 plántulas del mismo evento, y 3-4 placas diferentes (repeticiones) para cada evento. Para cada polinucleótido de la invención, se analizaron al menos cuatro eventos de transformación independientes de cada construcción. Las plantas que expresan los polinucleótidos de la invención se compararon con la medición promedio de las plantas de control (vector vacío o indicador GUS bajo el mismo promotor) usadas en el mismo experimento.
Imagenología digital- Se usó un sistema de adquisición de imágenes en laboratorio, que consiste en una cámara reflex digital (Canon EOS 300D) conectada con una lente de 55 mm de distancia focal (serie Canon EF-S), montada en un dispositivo de reproducción (Kaiser RS), que incluía 4 unidades de iluminación (4 bombillas de iluminación de 150 vatios) y ubicado en un cuarto oscuro, para capturar imágenes de plántulas sembradas en placas de agar.
El proceso de captura de imágenes se repitió cada 2-5 días comenzando el día 1 hasta el día 10-15 (ver por ejemplo las imágenes en las figuras 2A-B)
Se usó un sistema de análisis de imágenes, que consiste en una computadora de escritorio personal (procesador Intel P4 a 3,0 GHz) y un programa de dominio público - ImageJ 1.39 (programa de procesamiento de imágenes basado en Java, desarrollado en los Institutos Nacionales de Salud de EE. UU., y disponible gratuitamente en Internet en Hypertext Transfer Protocol://rsbweb (.) nih (.) gov/). Las imágenes se capturaron con una resolución de 10 megapíxeles (3888 x 2592 píxeles) y se almacenaron en un formato de compresión baja JPEG (estandar Joint Photographic Experts Group). A continuación, los datos analizados se guardaron en archivos de texto y se procesaron usando el software de análisis estadístico JMP (instituto SAS).
Análisis de plántulas- se calculó el uso del análisis digital de los datos de las plántulas, incluyendo el área foliar, la cobertura de la raíz y la longitud de la raíz.
El ritmo de crecimiento relativo para los diversos parámetros de la plántula se calculó según las siguientes fórmulas. Fórmula VI:
Ritmo de crecimiento relativo del área de la hoja = (A área de roseta /At) x (1/área de roseta ti)
A del área de roseta es el intervalo entre el área de roseta actual (medida a t2) y el área de roseta medida el día anterior (Área t-i)
At es el intervalo de tiempo (t2-t1, en días) entre el día de la imagen analizada actual (t2) y el día anterior (t1).
Por lo tanto, el ritmo de crecimiento relativo del área foliar está en unidades de 1/día.
Fórmula Vil:
Ritmo de crecimiento relativo de la cobertura de la raíz = (A área de cobertura de la raíz/At) x (1/órea de cobertura de la raíz tj)
A del área de cobertura de la raíz es el intervalo entre el área de cobertura de la raíz (medida a t2) y el área de cobertura de la raíz medida el día anterior (Área b)
At es el intervalo de tiempo (t2-t1, en días) entre el día de la imagen analizada actual (t2) y el día anterior (b).
Por lo tanto, el ritmo de crecimiento relativo del área de cobertura de la raíz está en unidades de 1/día.
Fórmula VIII:
Ritmo de crecimiento relativo de la longitud de la raíz = (A longitud de la raíz/At) x (1/longitud de la raíz tj)
A de la longitud de la raíz es el intervalo entre la longitud de la raíz (medida a t2) y la longitud de la raíz medida el día anterior (Área b)
At es el intervalo de tiempo (t2-t1, en días) entre el día de la imagen analizada actual (t2) y el día anterior (b).
Por lo tanto, el ritmo de crecimiento relativo de la longitud de la raíz está en unidades de 1/día.
Al final del experimento, las plántulas se retiraron del medio y se pesaron para la determinación del peso fresco de la planta. Las plántulas se secaron a continuación durante 24 horas a 60 °C, y se pesaron de nuevo para medir el peso seco de la planta para su posterior análisis estadístico. El ritmo de crecimiento se determinó comparando la cobertura del área foliar, la cobertura de la raíz y la longitud de la raíz entre cada par de fotografías sucesivas, y los resultados se usaron para resolver el efecto del gen introducido sobre el vigor de la planta, bajo estrés osmótico así
como en condiciones óptimas. De forma similar, el efecto del gen introducido sobre la acumulación de biomasa, bajo estrés osmótico así como en condiciones óptimas, se determinó comparando el peso fresco y seco de las plantas con el de las plantas de control (que contienen un vector vacío o el gen indicador GUS bajo el mismo promotor). De cada construcción creada, se examinaron 3-5 eventos de transformación independientes en repeticiones.
5 Análisis estadísticos- Para identificar los genes que confieren tolerancia significativamente mejorada a los estreses
abióticos o arquitectura de raíz ampliada, los resultados obtenidos de las plantas transgénicas se compararon con los obtenidos de las plantas de control. Para identificar los genes y construcciones de rendimiento extraordinario, los resultados de los eventos de transformación independientes evaluados se analizaron por separado. Para evaluar el efecto de un evento génico sobre un control, los datos se analizaron mediante la prueba de la t de Student y se 10 calculó el valor p. Los resultados se consideraron significativos si p < 0,1. Se usó el paquete de software de estadística de JMP (Versión 5.2.1, SAS Institute Inc., Cary, NC, EE. UU.).
Resultados experimentales- Las secuencias de polinucleótidos de la invención se ensayaron para una serie de rasgos comercialmente deseados. La tabla 28 proporciona los parámetros medidos en un ensayo de cultivo tisular (los resultados se presentan en las tablas 29 y 30). En los casos en que un determinado evento aparece más de una 15 vez, el evento se ensayó en varios experimentos independientes.
Tabla 28
Símbolo de parámetro usado en la tabla de resultados 29
Nombre del parámetro
1
Área de la hoja, punto temporal 1
2
Área de la hoja, punto temporal 2
3
Área de la hoja, punto temporal 3
4
Longitud de las raíces, punto temporal 1
5
Longitud de las raíces, punto temporal 2
6
Longitud de las raíces, punto temporal 3
7
Cobertura de las raíces, punto temporal 1
8
Cobertura de las raíces, punto temporal 2
9
Cobertura de las raíces, punto temporal 3
10
RCR del área de la hoja, punto temporal 2
11
RCR del área de la hoja, punto temporal 3
12
RCR de la cobertura de las raíces, punto temporal 2
13
RCR de la cobertura de las raíces, punto temporal 3
14
RCR de la longitud de las raíces, punto temporal 2
15
RCR de la longitud de las raíces, punto temporal 3
16
Peso fresco
17
Peso seco
Tabla 28.
Tabla 29
Gen
pn. SEQ ID NO: Ev. Par. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 100
657 7872.2 P 0,29 0,10 0,53 0,08 0,54 0,03
BDL 100
657 7872.2 Pr 1,55 1,21 1,66 1,95 1,49 1,63
BDL 100
657 7872.3 P 0,60 0,08 0,12 0,18
BDL 100
657 7872.3 Pr 1,10 1,13 1,71 1,51
BDL 100
657 7873.2 P 0,41 0,12 0,01 0,00
BDL 100
657 7873.2 Pr 1,23 1,12 1,61 1,50
BDL 100
657 7873.4 P 0,28 0,32 0,13 0,33 0,21 0,36 0,47 0,01 0,45 0,48
BDL 100
657 7873.4 Pr 1,16 1,18 1,39 1,17 1,41 1,19 1,12 1,28 1,22 1,19
BDL 51
694 8021.1 P 0,13 0,02 0,08
BDL 51
694 8021.1 Pr 1,23 2,20 1,47
BDL 51
694 8022.4 P 0,00 0,09 0,05
BDL 51
694 8022.4 Pr 1,32 1,97 1,49
BDL 51
694 8022.5 P 0,08 0,04
BDL 51
694 8022.5 Pr 1,14 1,49
BDL 51
694 8024.4 P 0,36 0,00 0,16
BDL 51
694 8024.4 Pr 1,41 2,12 1,55
BDL 51
694 8024.7 P 0,34 0,23
BDL 51
694 8024.7 Pr 1,29 1,28
BDL 82
704 7801.3 P 0,23 0,00 0,04 0,00
BDL 82
704 7801.3 Pr 1,18 1,51 2,15 1,67
BDL 82
704 7802.2 P 0,01 0,00 0,01
BDL 82
704 7802.2 Pr 1,24 2,69 1,98
BDL 82
704 7802.3 P 0,02 0,11 0,03
BDL 82
704 7802.3 Pr 1,24 1,57 1,42
BDL 82
704 7803.8 P 0,15 0,16 0,12 0,04 0,02
157
BDL 95_ Corto
BDL 95_ Corto
BDL 95_ Corto
BDL 95_ Corto
BDL 95_ Corto
BDL 95_ Corto
BDL 95_ Corto
BDL 95 JS hórt BDL 95_ Corto BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 89 BDL 82 BDL 82 BDL 82 Gen
706
—vi O 03 —vi O 03 -vi O 03 -vi O 03 -vi O 03 -vi O 03 -vi O 03 -vi O 03 -vi O en -vi O en -vi o en -vi O en -vi O en -vi O en -vi O en -vi O en -vi O en -vi O en -vi O -vi O -vi O z _ <£-o pog?
7843.4
7842.8 7842.8 7842.2 7842.2 7842.12 7842.12 7841.2 7841.2 7814.5 7814.5 7814.4 7814.4 7814.1 7814.1 7812.5 7812.5 7812.2 7812.2 7803.9 7803.9 7803.8
“ü
TJ "0 TJ "0 TJ “Ü TJ "0 TJ "0 TJ “ü TJ “ü TJ “ü TJ “ü TJ “Ü TJ “Ü Pí
-
ro
OJ
en
03
-vi
co
co
0,43
O 0,35 en 0,15 O OJ O To ro 0,14 To co O O CO OJ en O "o -vi OJ O 03 O co O OJ O o
O O o
OJ —vi O O o -vi 0,05 To 03 o co CO 0,33 O O "o O OJ ro 0,05 en o 0,05 To co -
To co O 03 03 "-vi co 0,33 en ro 0,58 ro
o o
ro 00 ro o o -vi To -vi O To co OJ 03 O o ro 0,14 en 03 O OJ o "-vi O "o -vi 2,18 0,24 3,25 O "o ro OJ 0,05 ro To ro OJ
-vi 0,65 en 03 o To o 0,38
o o
IO o —vi o o -vi To 00 o o 00 CO o o -vi To -vi O O OJ o o OJ 03 en ro o "o -vi "-vi O O "o ro o o "o o 03 en O "o 03 OJ en
CO o To o 03
0,41
OJ OJ -vi
Gen
pn. SEQ ID NO: Ev. Par. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 95_ Corto
706 7843.4 Pr 1,14 1,42 3,00 2,12 1,26
BDL 108
659 8122.1 P 0,11 0,18 0,45 0,61 0,73 0,51
BDL 108
659 8122.1 Pr 1,28 1,24 1,44 1,13 1,16 1,20
BDL 108
659 8122.2 P 0,09 0,02 0,00 0,00 0,12 0,01 0,77 0,38
BDL 108
659 8122.2 Pr 1,59 1,37 1,82 2,09 1,29 1,71 1,11 1,17
BDL 108
659 8123.6 P 0,59 0,57 0,40 0,08
BDL 108
659 8123.6 Pr 1,10 1,33 1,27 1,53
BDL 108
659 8123.5 P 0,04 0,29 0,25
BDL 108
659 8123.5 Pr 1,14 1,75 1,36
BDL 59
698 7792.1 P 0,26 0,70
BDL 59
698 7792.1 Pr 1,38 1,11
BDL 59
698 7792.2 P 0,33 0,31 0,02 0,25 0,14 0,01
BDL 59
698 7792.2 Pr 1,33 1,23 1,63 1,26 1,28 1,40
BDL 59
698 7792.3 P 0,02 0,11 0,29
BDL 59
698 7792.3 Pr 1,36 1,43 1,28
BDL 59
698 7793.3 P 0,06 0,32 0,30 0,16 0,11 0,05
BDL 59
698 7793.3 Pr 1,76 1,19 1,99 1,56 1,65 1,27
BDL 59
698 7794.1 P 0,18 0,11 0,13
BDL 59
698 7794.1 Pr 1,15 1,83 1,35
BDL 68
702 7761.3 P 0,32 0,46
BDL 68
702 7761.3 Pr 1,15 1,17
BDL 68
702 7761.5 P 0,40 0,15 0,21 0,14 0,20
BDL 68
702 7761.5 Pr 2,43 1,86 1,58 1,60 1,42
BDL 68
702 7761.9 P
BDL 68
702 7761.9 Pr
Gen
p.n. SEQ ID NO: Ev. Par. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 68
702 7764.1 P 0,00 0,53 0,22
BDL 68
702 7764.1 Pr 1,44 1,45 1,61
Tabla 29. Se proporcionan parámetros de crecimiento y biomasa de plantas transgénicas frente a plantas control medidos en ensayo de cultivo de tejido bajo 1,5% PEG, “P” = valor P; “Pr” = cociente entre los promedios de evento y control. Hay que señalar que cuando el cociente de promedios es mayor que “1” el efecto de la expresión exógena del gen es un incremento del rasgo deseado; “Par” = Parámetro de acuerdo con los parámetros enumerados en la Tabla 28 anterior; “Ev” = evento, “p.n.” = polinucleótido.
Tabla 30
Gen
p.n. SEQ ID NO: Ev. Par. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 100
657 7872.2 P 0,16 0,11 0,08 0,01
BDL 100
657 7872.2 Pr 1,36 1,58 2,18 1,65
BDL 100
657 7872.3 P 0,40 0,19 0,02 0,03
BDL 100
657 7872.3 Pr 1,13 1,13 1,96 1,60
BDL 100
657 7873.2 P 0,03 0,00 0,00
BDL 100
657 7873.2 Pr 1,52 2,08 1,72
BDL 100
657 7873.3 P 0,60 0,36 0,56 0,52 0,15 0,02 0,01
BDL 100
657 7873.3 Pr 1,15 1,12 1,27 1,12 1,23 1,32 1,23
BDL 100
657 7873.4 P 0,24 0,03 0,03 0,00 0,01 0,33 0,21 0,23 0,16 0,02
BDL 100
657 7873.4 Pr 1,25 1,36 1,39 1,55 1,96 1,12 1,18 1,22 1,13 1,42
BDL 51
694 8021.1 P 0,06 0,00 0,00
BDL 51
694 8021.1 Pr 1,33 2,61 1,60
BDL 51
694 8022.4 P 0,51 0,03 0,02 0,14
BDL 51
694 8022.4 Pr 1,31 1,17 2,13 1,46
BDL 51
694 8022.5 P 0,02 0,09 0,08 0,00 0,02 0,06
BDL 51
694 8022.5 Pr 1,24 1,30 1,22 1,36 2,42 1,75
BDL 51
694 8024.4 P 0,00 0,35 0,07
BDL 51
694 8024.4 Pr 1,32 3,10 1,86
Gen
pn. SEQ ID NO: Ev. Par. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 51
694 8024.7 P 0,55 0,04 0,09 0,05 0,24 0,18 0,38 0,23
BDL 51
694 8024.7 Pr 1,11 1,48 1,09 2,30 1,12 1,24 1,19 1,15
BDL 82
704 7801.1 P 0,11 0,02 0,14
BDL 82
704 7801.1 Pr 1,26 3,23 1,76
BDL 82
704 7801.3 P 0,13 0,00 0,00
BDL 82
704 7801.3 Pr 1,27 3,07 1,76
BDL 82
704 7802.2 P 0,14 0,01 0,00
BDL 82
704 7802.2 Pr 1,37 5,55 2,69
BDL 82
704 7802.3 P 0,52 0,43 0,41 0,50
BDL 82
704 7802.3 Pr 1,14 1,11 1,17 1,17
BDL 82
704 7803.8 P 0,01 0,00
BDL 82
704 7803.8 Pr 2,16 1,77
BDL 82
704 7803.9 P 0,61 0,12 0,01 0,53
BDL 82
704 7803.9 Pr 1,11 1,81 1,49 1,14
BDL 89
705 7812.2 P 0,29 0,00 0,00 0,30 0,18
BDL 89
705 7812.2 Pr 1,13 1,30 1,38 1,11 1,16
BDL 89
705 7812.5 P 0,03 0,02 0,01
BDL 89
705 7812.5 Pr 1,39 5,28 2,83
BDL 89
705 7814.1 P 0,00 0,01 0,00
BDL 89
705 7814.1 Pr 1,45 1,84 1,38
BDL 89
705 7814.4 P 0,19 0,30 0,03 0,39 0,01 0,17
BDL 89
705 7814.4 Pr 1,19 1,21 1,61 1,16 1,49 1,14
BDL 89
705 7814.5 P 0,42 0,22 0,09 0,04 0,03
BDL 89
705 7814.5 Pr 1,11 1,20 1,36 1,74 1,59
BDL 95_ Corto
706 7841.2 P 0,07 0,00 0,00
Gen
pn. SEQ ID NO: Ev. Par. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 95_ Corto
706 7841.2 Pr 1,31 2,75 1,81
BDL 95_ Corto
706 7842.12 P 0,28 0,17 0,19 0,22 0,44 0,02 0,11 0,43 0,64
BDL 95_ Corto
706 7842.12 Pr 1,15 1,13 1,17 1,26 1,14 1,24 1,16 1,25 1,11
BDL 95_ Corto
706 7842.2 P 0,17 0,19 0,02 0,00
BDL 95_ Corto
706 7842.2 Pr 1,32 1,17 2,06 1,61
BDL 95_ Corto
706 7842.8 P 0,17 0,03 0,00 0,00
BDL 95_ Corto
706 7842.8 Pr 1,14 1,18 2,17 1,44
BDL 95_ Corto
706 7843.4 P 0,01 0,01 0,00
BDL 95_ Corto
706 7843.4 Pr 1,67 4,58 2,59
BDL 108
659 8122.1 P 0,32 0,31
BDL 108
659 8122.1 Pr 1,25 1,91
BDL 108
659 8122.2 P 0,08 0,00 0,08 0,01 0,27 0,00 0,05 0,00 0,02
BDL 108
659 8122.2 Pr 1,10 1,22 1,24 2,01 1,16 1,81 1,50 1,55 1,39
BDL 108
659 8123.6 P 0,15 0,02 0,09 0,07 0,07
BDL 108
659 8123.6 Pr 1,25 1,56 1,57 1,21 1,36
BDL 108
659 8123.5 P 0,18 0,19
BDL 108
659 8123.5 Pr 1,62 1,40
BDL 59
698 7792.1 P 0,11
BDL 59
698 7792.1 Pr 1,50
BDL 59
698 7792.2 P 0,17 0,21 0,16 0,33 0,50
BDL 59
698 7792.2 Pr 1,31 1,31 1,62 1,11 1,17
BDL 59
698 7792.3 P 0,01 0,27
Gen
pn. SEQ ID NO: Ev. Par. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL 59
698 7792.3 Pr 1,73 1,18
BDL 59
698 7793.3 P 0,33 0,03 0,01 0,03 0,02 0,04
BDL 59
698 7793.3 Pr 1,12 1,89 1,75 1,87 1,39 1,40
BDL 59
698 7794.1 P 0,14 0,08 0,29
BDL 59
698 7794.1 Pr 1,22 1,59 1,18
BDL 68
702 7761.3 P 0,22 0,26 0,14 0,17 0,34
BDL 68
702 7761.3 Pr 1,20 1,15 1,32 1,38 1,13
BDL 68
702 7761.5 P 0,30 0,02 0,46 0,02
BDL 68
702 7761.5 Pr 1,56 1,71 1,22 1,59
BDL 68
702 7761.9 P 0,33
BDL 68
702 7761.9 Pr 1,30
BDL 68
702 7764.1 P 0,08 0,15 0,38
BDL 68
702 7764.1 Pr 1,27 1,77 1,21
Tabla 30. Se proporcionan los parámetros de crecimiento y biomasa de plantas transgénicas frente a plantas control
medidos en ensayo de cultivo de tejidos a una concentración de nitrógeno 0,75 mM
“P” = valor P; “Pr” = cociente
entre los promedios de evento y control. Hay que indicar que cuando el cociente de promedios es mayor que 1 el
efecto de expresión exógena del gen es un incremento del rasgo deseado; "Par" = Parámetro de acuerdo con los parámetros enumerados en la Tabla 28 anterior; "Ev" = evento.
EJEMPLO 9
MEJORAR LOS RASGOS DE INTERÉS DESEADOS EN LAS PLANTAS TRANSGÉNICAS CULTIVADAS EN CONDICIONES NORMALES REDUCIENDO LA EXPRESIÓN DE GENES
5 Las plantas transgénicas que expresaban de forma exógena el gen BDL127 (SEQ ID NO:673) se ensayaron para una serie de características comercialmente deseadas en condiciones normales.
Para analizar el efecto de la expresión del polinucleótido exógeno BDL 127 en plantas transgénicas, las plantas se cultivaron en macetas con una cantidad adecuada de nutrientes y agua. Las plantas se evaluaron usando diversos parámetros para su tamaño general (biomasa), estructura (arquitectura de la planta), ritmo de crecimiento relativo, 10 tiempo hasta aparición de la inflorescencia (subida a flor) y floración, rendimiento de semillas, peso de 1.000 semillas, materia seca, contenido de aceite e índice de cosecha [(HI) rendimiento de semillas/materia seca]. El rendimiento de las plantas transgénicas se comparó con plantas de control cultivadas en paralelo en las mismas condiciones. Las plantas transgénicas simuladas con un vector vacío o que expresan el gen indicador uidA (GUS- Intron) bajo el mismo promotor se usaron como control.
15 Los parámetros se midieron como se describe en el ejemplo 3 anterior.
Análisis estadísticos- Todos los parámetros, incluyendo el ritmo de crecimiento de la planta, el área de la planta, la biomasa, la arquitectura de la planta, el tiempo hasta subida a la flor, el tiempo hasta la floración, el peso de 1.000 semillas, el rendimiento de semillas, el rendimiento de aceite, la materia seca y los datos del área de índice de cosecha se analizaron usando la prueba de la t. Para identificar genes y construcciones con rendimiento 20 extraordinario, se analizaron los resultados de la combinación de eventos de transformación o eventos
independientes. Para el análisis de gen frente a control, se aplicó la prueba de la t, usando un umbral de significación de p < 0,1.
Resultados experimentales
Las secuencias de polinucleótidos de la invención se ensayaron para una serie de rasgos comercialmente 5 deseados. La tabla 22 proporciona los parámetros medidos en ensayos de cultivo tisular y en invernadero (los resultados se presentan en las tablas 31 y 32). En los casos en que un determinado evento aparece más de una vez, el evento se ensayó en varios experimentos independientes.
Análisis de plantas en ensayo de cultivo tisular- La tabla 31, a continuación, representa análisis de plantas transgénicas que sobreexpresan el polinucleótido BDL 127 de la invención bajo la regulación del promotor 10 constitutivo 35S (SEQ ID NO:777).
Tabla 31
Gen
Ev. Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
BDL
8172.1 P 8,5E- 1,5E- 2,0E- 2,4E- 1,4E- 1,6E- 1,3E- 4,7E- 1,2E- 2,6E- 3,8E- 2,3E-
127
03 03 03 04 03 01 03 03 01 02 01 02
BDL
8172.1 Pr 7,4E- 6, IE - 6,3E- 2,8E- 5,1E- 6,5E- 1,7E- 3,6E- 5,3E- 7,5E- 8,7E- 7,6E-
127
01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01
BDL
8172.4 P 4,5E- 1,9E- 3,3E- 7,4E- 2,2E- 2,3E- 2,4E- 9,2E- 4,1E- 1,6E- 4,9E- 2,0E-
127
03 05 03 04 05 04 03 04 03 02 01 02
BDL
8172.4 Pr 7,7E- 6,2E- 7,0E- 4,1E- 3,9E- 5,2E- 2,7E- 2,1E- 3,1E- 7,3E- 8,1E- 7,6E-
127
01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01
BDL
8172.7 P 1,8E- 3,8E- 2,0E- 3,4E- 1,8E- 1,7E- 7,9E- 2,9E- 2,8E-
127
01 04 03 02 03 02 02 01 01
BDL
8172.7 Pr 8,4E- 3,5E- 6,0E- 6,7E- 2,3E- 5,3E- 6,0E- 8,9E- 7,5E-
127
01 01 01 01 01 01 01 01 01
BDL
8172.8 P 4,8E- 3,5E- 3,IE - 2,7E- 2,2E- 5,4E- 3,8E- 3,1E-
127
01 01 03 01 01 01 01 01
BDL
8172.8 Pr 8,9E- 8,5E- 5,4E- 8,0E- 6,0E- 9,0E- 8,3E- 8,7E-
127
01 01 01 01 01 01 01 01
BDL
8172.9 P 3,3E- 1,8E- 3,0E- 3,1E- 2,3E- 4,5E- 1,5E- 6,5E- 1,2E- 1,3E- 2,0E- 7,4E- 6,1E- 4,9E-
127
03 05 03 04 05 05 03 04 03 03 01 01 02 02
BDL
8172.9 Pr 7,9E- 5,2E- 5,4E- 3,4E- 3,4E- 3,7E- 2,1E- 1,6E- 1,4E- 5,IE - 6,9E- 9,0E- 7,3E- 6,4E-
127
01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01 01
Tabla 31. “P” = valor P; “Pr” = relación entre los promedios de evento y control. Obsérvese que cuando la relación promedio es menor que “1” el efecto de la expresión exógena del gen es una disminución del rasgo deseado; “Par” = Parámetro según los parámetros enumerados en la tabla 24 anterior; "Ev" = evento.
Ensayos en invernadero- Las tablas 33-36 representan experimentos que se realizaron usando ensayos en invernadero. La tabla 32 especifica los parámetros que se midieron en los ensayos en invernadero y que se 15 presentan en las tablas 33-36. En los casos en que un determinado evento aparece más de una vez, el evento se ensayó en varios experimentos independientes.
Tabla 32
Símbolo de parámetro usado en las tablas de resultados 33-36
Nombre del parámetro
1
Diámetro de roseta, punto temporal 1
2
Diámetro de roseta, punto temporal 2
3
Diámetro de roseta, punto temporal 3
4
Diámetro de roseta, punto temporal 4
5
Área de roseta, punto temporal 1
6
Área de roseta, punto temporal 2
7
Área de roseta, punto temporal 3
8
Área de roseta, punto temporal 4
9
Cobertura de la parcela, punto temporal 1
10
Cobertura de la parcela, punto temporal 2
11
Cobertura de la parcela, punto temporal 3
12
Cobertura de la parcela, punto temporal 4
13
Número de hojas, punto temporal 1
14
Número de hojas, punto temporal 2
15
Número de hojas, punto temporal 3
16
Número de hojas, punto temporal 4
17
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 1
18
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 2
19
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 3
20
Área del cuerpo de la hoja, punto temporal 4
21
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 1
22
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 2
23
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 3
24
Área del peciolo de la hoja, punto temporal 4
25
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 1
26
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 2
27
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 3
28
Área relativa del cuerpo de la hoja, punto temporal 4
29
Área relativa del peciolo, punto temporal 1
30
Área relativa del peciolo, punto temporal 2
31
Área relativa del peciolo, punto temporal 3
32
Área relativa del peciolo, punto temporal 4
33
RCR del área del cuerpo de la hoja, punto temporal 2
34
RCR del área del cuerpo de la hoja, punto temporal 3
35
RCR del área del cuerpo de la hoja, punto temporal 4
36
RCR del número de hojas, punto temporal 2
37
RCR del número de hojas, punto temporal 3
38
RCR del número de hojas, punto temporal 4
39
RCR del área de roseta, punto temporal 2
40
RCR del área de roseta, punto temporal 3
41
RCR del área de roseta, punto temporal 4
42
RCR del diámetro de roseta, punto temporal 2
43
RCR del diámetro de roseta, punto temporal 3
44
RCR del diámetro de roseta, punto temporal 4
45
RCR de la cobertura de la parcela, punto temporal 2
46
RCR de la cobertura de la parcela, punto temporal 3
47
RCR de la cobertura de la parcela, punto temporal 4
48
Subida a flor
49
Floración
50
Peso seco
51
Rendimiento de semillas
52
Índice de cosecha
53
Peso de 1000 semillas
54
contenido de aceite
55
Peso fresco
Tabla 32.
Tabla 33
Gen
Ev Par 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
BDL1 27
8172. 10 P
BDL1 27
8172. 10 Prom
BDL1 27
8172. 4 P 1,2E -03 1,7E -03 7,1E -03 1,7E -03 5,9E -03 1,6E -03 7,1E -03 1,7E -03 5,9E -03 1,6E -03
BDL1 27
8172. 4 Prom 7,6E -01 7,7E -01 7,1E -01 2,0E -01 6,7E -01 6,5E -01 7,1E -01 2,0E -01 6,7E -01 6,5E -01
BDL1 27
8172. 7 P
BDL1 27
8172. 7 Prom
BDL1 27
8172. 8 P 8,0E -04 2,2E -04 1,8E -02 1,2E -02 1,7E -02 3,3E -02 1,8E -02 1,2E -02 1,7E -02 3,3E -02 3,6E -04
BDL1 27
8172. 8 Prom 7,4E -01 7,0E -01 6,2E -01 5,7E -01 5,2E -01 5,2E -01 6,2E -01 5,7E -01 5,2E -01 5,2E -01 7,8E -01
BDL1 27
8172. 9 P 2,1E -02 6,4E -03 8,8E -04 7,1E -04 1,1E -02 4,4E -04 1,1E -02 4,4E -04 4,5E -02
BDL1 27
8172. 9 Prom 8,0E -01 7,1E -01 7,3E -01 7,3E -01 6,1E -01 5,6E -01 6,1E -01 5,6E -01 8,5E -01
5
Tabla 33. "P" = valor P; "Prom" = relación entre los promedios de evento y control. Obsérvese que, cuando la relación promedio es menor que "1", el efecto de la expresión exógena del gen es una disminución del rasgo deseado; "Par" = parámetro según los parámetros enumerados en la tabla 22 anterior; "Ev" = evento.
Tabla 34
Gen
Ev Par 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
BDL1 27
8172. 10 P
BDL1 27
8172. 10 Prom
BDL1 27
8172. 4 P 5,4E -04 2,0E -03 7,7E -03
BDL1 27
8172. 4 Prom 3,3E -01 6,9E -01 6,3E -01
BDL1 27
8172. 7 P 1,8E -02 3,1E -02
BDL1 27
8172. 7 Prom 6,8E -01 8,0E -01
BDL1 27
8172. 8 P 3,3E -03 1,4E -03 2,1E -02
BDL1 27
8172. 8 Prom 6,9E -01 6,2E -01 5,6E -01
BDL1 27
8172. 9 P 3,8E -04
BDL1 27
8172. 9 Prom 5,7E -01
Tabla 34. "P" = valor P; "Prom" = relación entre los promedios de evento y control. Obsérvese que, cuando la relación promedio es menor que "1", el efecto de la expresión exógena del gen es una disminución del rasgo deseado; "Par" = parámetro según los parámetros enumerados en la tabla 22 anterior; "Ev" = evento.
Tabla 35
Gen
Ev Par 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48
BDL1 27
8172. 10 P
BDL1 27
8172. 10 Prom
BDL1 27
8172. 4 P 3,0E - 07 4,1E - 02 4,1E - 02
BDL1 27
8172. 4 Prom - 1,1E -02 - 5,2E -02 - 5,2E -02
BDL1 27
8172. 7 P
BDL1 27
8172. 7 Prom
BDL1 27
8172. 8 P
BDL1 27
8172. 8 Prom
5
10
15
20
25
BDL1 27
8172. 9 P LD ^ CM CO O 2,1E -02 LD ^ CM CO O
BDL1 27
8172. 9 Prom O OO "“*■ o m LD •«ñI- ■*— O CO "“*■ o m
Tabla 35. "P" = valor P; "Prom" = relación entre los promedios de evento y control. Obsérvese que, cuando la relación promedio es menor que "1", el efecto de la expresión exógena del gen es una disminución del rasgo deseado; "Par" = parámetro según los parámetros enumerados en la tabla 22 anterior; "Ev" = evento.
Tabla 36
Gen
Ev Par 49 50 51 52 53 54 55
BDL 127
8172.10 P
BDL 127
8172.10 Av
BDL 127
8172.4 P 2,0E-02
BDL 127
8172.4 Av 6,9E-01
BDL 127
8172.7 P 2,0E-02
BDL 127
8172.7 Av 7,3E-01
BDL 127
8172.8 P
BDL 127
8172.8 Av
BDL 127
8172.9 P 3.1E-02
BDL 127
8172.9 Av 8.1E-01
Tabla 36. "P" = valor P; "Prom" = relación entre los promedios de evento y control. Obsérvese que, cuando la relación promedio es menor que "1", el efecto de la expresión exógena del gen es una disminución del rasgo deseado; "Par" = parámetro según los parámetros enumerados en la tabla 22 anterior; "Ev" = evento.
Estos resultados demuestran que la transformación de plantas con el gen BDL 127 produce una disminución del rendimiento, el rendimiento de semillas, la biomasa y el ritmo de crecimiento y, por lo tanto, agentes que regulan negativamente el nivel de expresión del gen BDL 127 en plantas tales como agentes de cosupresión, supresión antisentido, interferencia de ARN, remodelación de la estructura del promotor y/o Ribozima puede aumentar el rendimiento, el rendimiento de semillas, la biomasa y el ritmo de crecimiento de una planta.
Los genes identificados en la presente memoria mejoran el rendimiento de la planta en general y, más específicamente, el rendimiento de aceite, el rendimiento de semillas, el contenido de aceite, el ritmo de crecimiento de la planta, la biomasa de la planta, las mediciones de raíz, la TEAB, la EUN y el vigor de la planta. El resultado del método bioinformático descrito en la presente memoria es un conjunto de genes altamente predichos para mejorar el rendimiento (rendimiento de semillas, rendimiento y contenido de aceite, biomasa) y/u otros rendimientos agronómicos importantes mediante la modificación de su expresión. Aunque se predice que cada gen tendrá su propio impacto, se espera que la modificación del modo de expresión de más de un gen proporcione un efecto aditivo o sinérgico sobre el rendimiento de la planta, el ritmo de crecimiento de la planta, las mediciones de la raíz, la TEAB, la UEN, el vigor de la planta y/u otros rendimientos agronómicos importantes. La alteración de la expresión de cada gen en solitario o conjunto de genes descrito aquí aumenta el rendimiento global del ritmo de crecimiento de la planta, las mediciones de la raíz, la TEAB, la EUN, el vigor de la planta y/o
Contenido del CD-ROM
A continuación, se enumera el contenido del archivo del CD-ROM que se adjunta y se presenta con la solicitud. La información del archivo se proporciona como: Nombre de archivo/tamaño en bytes/ fecha de creación/sistema operativo/formato de máquina.
CD-ROM1 (1 archivo del LISTADO DE SECUENCIAS):
1. 45731_ST25.txt"/ 1,886,208 bytes/21 May 2009/ Microsoft Windows XP Professional/ PC

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    REIVINDICACIONES
    1. Un método de aumento del contenido de aceite, el rendimiento de semillas, el ritmo de crecimiento y/o la biomasa de una planta en comparación con una planta nativa, que comprende expresar dentro de la planta un polinucleótido exógeno que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 80 % homóloga a la secuencia de aminoácidos indicada en la SEQ ID NO:68, aumentando de este modo el contenido de aceite, el rendimiento de semillas, el ritmo de crecimiento y/o la biomasa de la planta en comparación con la planta nativa.
  2. 2. El método de la reivindicación 1, que comprende además extraer el aceite de la planta.
  3. 3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en donde dicho polinucleótido exógeno está comprendido en una construcción de ácido nucleico que comprende un promotor para dirigir la transcripción de dicha secuencia de ácido nucleico en una célula huésped.
  4. 4. Un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO:18.
  5. 5. Una construcción de ácido nucleico que comprende el polinucleótido aislado de la reivindicación 4 y un promotor para dirigir la transcripción de dicha secuencia de ácido nucleico en una célula huésped.
  6. 6. El método de la reivindicación 3, o la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 5, en donde dicho promotor se selecciona del grupo que consiste en las SEQ ID NO:779-792.
  7. 7. El método de la reivindicación 1, 2, 3 o 6, en donde dicho polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico al menos un 96 % idéntica a la SEQ ID NO:18.
  8. 8. El método de la reivindicación 1, 2, 3 o 6, en donde dicho polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico expuesta en la SEQ ID NO: 18.
  9. 9. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 85 % de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:68.
  10. 10. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha secuencia de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:68.
  11. 11. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha secuencia de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:68.
  12. 12. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha secuencia de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:68.
  13. 13. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha secuencia de identidad con la secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO:68.
  14. 14. El método de la reivindicación 1, 2 o 3, en donde dicha secuencia de aminoácidos se expone en la SEQ ID NO:68.
  15. 15. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y 6-14, que comprende además seleccionar progenie de dichas plantas que expresan dicho polinucleótido exógeno para un aumento de la biomasa o del rendimiento de semillas.
    aminoácidos tiene al menos un 90 % de aminoácidos tiene al menos un 95 % de aminoácidos tiene al menos un 98 % de aminoácidos tiene al menos un 99 % de
ES09750276.9T 2008-05-22 2009-05-21 Polinucleótidos y polipéptidos aislados y métodos de uso de los mismos para aumentar el rendimiento de la planta Active ES2674256T3 (es)

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