BRPI0618965B1 - método para aumentar a tolerância de uma planta a uma condição de estresse abiótico, método para aumentar a biomassa, vigor e/ou rendimento de uma planta, método para aumentar a eficiência do uso de fertilizante e/ou absorção de uma planta - Google Patents

Abstract

CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLÉICO, POLIPEPTÍDEO ISOLADO COMPREENDENDO UMA SEQÜÊNCIA DE AMINOÁCIDO, CÉLULA DE PLANTA COMPREENDENDO UM POLINUCLEOTÍDEO EXÓGENO, MÉTODO PARA AUMENTAR A TOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UMA CONDIÇÃO DE ESTRESSE, MÉTODO PARA AUMENTAR A BIOMASSA, VIGOR E/OU RENDIMENTO DE UMA PLANTA, MÉTODO PARA AUMENTAR A EFICIÊNCIA DO USO DE FERTILIZANTE E/OU ABSORÇÃO DE UMA PLANTA E CÉLULA DE PLANTA, sendo que as construções de ácido nucléico são fornecidas; essas construções compreendendo quaisquer das seqüências de ácido nucléico pelo menos 85% idênticas às seqüências de nucleotídeos selecionadas a partir do grupo consistindo em SEQ ID N°s: 68, 1, 4, 5, 8, 9, 11, 13, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 30, 32, 37, 42, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 64, 69, 70, 73, 77, 78, 79, 80, 94, 86, 87, 93, 94, 98, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 e 109 e uma seqüência de promotor capaz de instruir a transcrição da referida seqüência de ácido nucléico em uma célula hospedeira; da mesma forma, são fornecidas plantas transgênicas que expressam essas construções de ácido nucléico e métodos para utilizar as mesmas.

Description

CAMPO E HISTÓRICO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se aos polipeptídios isolados, polinucleotídeos codificando os mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e métodos para utilizar os mesmos. Especificamente, a presente invenção pode ser usada para aumentar a eficiência do uso de fertilizante e resistência ao estresse, bem como biomassa, vigor e produção de plantas transgênicas.

Os fertilizantes são o combustível por trás da “revolução verde”, diretamente responsáveis pelo amento excepcional nos rendimentos de safra durante os últimos 40 anos. O aumento dramático nos rendimentos de safra nunca poderia ter ocorrido sem um aumento paralelo no uso de fertilizante. Entretanto, nos anos recentes, houve uma preocupação crescente com o impacto ambiental do uso de fertilizante, especificamente os fertilizantes de nitrogênio, na poluição atmosférica e de água. Os limites sobre o uso de fertilizante foram legislados em diversos países, e restrições adicionais são esperadas no futuro. O maior uso de fertilizantes será necessário no futuro para suportar a produção de alimento e fibra para o rápido crescimento de população sobre recursos limitados de terra. 0 fertilizante é frequentemente 5 mencionado como a despesa geral número um na agricultura.

Dos três macronutrientes fornecidos como principais fertilizantes [Nitrogênio (N) , Fosfato (P) e Potássio (K) ] , o nitrogênio é o único que normalmente necessita ser reabastecido a cada ano, especificamente para grãos, que 10 compreendem mais do que metade das áreas cultivadas no mundo.

Uma abordagem comum para promover o crescimento de planta foi, e continua sendo, o uso de nutrientes (fertilizantes), natural bem como 15 sintético. Os nutrientes sintéticos normalmente fornecem um macronutriente em uma forma utilizável da planta, tal como, uréia, por exemplo, e/ou nitratos inorgânicos, fosfatos ou compostos semelhantes. Enquanto tais nutrientes poderão ser aplicados, mais ou menos, por conveniência do fazendeiro, e 20 poderão ser aplicados na freqüência considerada desejável, a utilização em excesso dos nutrientes sintéticos e o uso ineficiente dos nutrientes sintéticos são fatores principais responsáveis pelos problemas ambientais, tais como, eutroficação do lençol de água, poluição por nitrato, 25 poluição por fosfato e semelhantes.

O nitrogênio é um macronutriente essencial para a planta, responsável pela biossintese dos aminoácidos e ácidos nucléicos, grupos proféticos, hormônios de planta, defesas químicas da planta, etc. 0 nitrogênio é freqüentemente o elemento limitante de taxa no crescimento da planta e todas as safras em campo possuem uma dependência fundamental no fertilizante 5 nitrogenado inorgânico.

Considerando que o fertilizante é rapidamente esgotado da maioria dos tipos de solo, ele deve ser fornecido às safras crescentes duas ou três vezes durante a temporada de crescimento. O fertilizante 10 nitrogenado, que é normalmente fornecido como nitrato de amónia, nitrato de potássio ou uréia, tipicamente contabiliza 40% dos custos associados com as safras, tais como milho e trigo. Foi estimado que até 2050, mais de 150 milhões de toneladas de fertilizante nitrogenado serão 15 utilizados no mundo anualmente. A eficiência aumentada do uso do nitrogênio pelas plantas deve permitir que as safras sejam cultivadas com menor entrada de fertilizante, ou alternativamente nos solos de qualidade inferior e, portanto, teria impacto econômico significativo nos sistemas 2() agrícolas desenvolvidos e em desenvolvimento. Uma visão geral dos efeitos indesejáveis do fertilizante de nitrogênio é apresentada por Byrnes, Fertilizer Research, 26, pp. 209- 215 (1990) . Embora as plantas sejam capazes de obter o nitrogênio orgânico do ambiente, a parte principal do 25 nitrogênio utilizado é proveniente da captação do nitrogênio inorgânico na forma de amónia (NE/) e nitrato (NOj ) e sua conversão posterior ao nitrogênio orgânico em um processo conhecido como assimilação.

O processo de assimilação do nitrogênio tem inicio com o N03’ sendo convertido para NH.f seqüencialmente pelas enzimas Reductase de Nitrato (NR) e Reductase de Nitrito (NiR). 0 nitrogênio é então incorporado 5 em Glutamato (Glu) pela Sintase de Glumamina (GS) para obter a Glutamina (Gin). A via principal da assimilação de nitrogênio é o ciclo GS/GOGAT (Sintase de Transferase de Amina Glumamina/Glutamato-Oxoglutarato).

Os aminoácidos restantes são li) sintetizados de Gin, Glu e Asn por transaminação.

O nitrogênio (como aminoácidos ou na forma de nitratos) é deslocado ao broto, em que é armazenado nas folhas e talo durante a etapa rápida do desenvolvimento de planta e até a floração. No milho, por 15 exemplo, as plantas acumulam-se o volume de seu nitrogênio orgânico durante o periodo da germinação de grão, e até a floração. Assim que a fertilização da planta ocorrer, os grãos começam a se formar e tornam-se o escoadouro principal do Nitrogênio da planta. 0 Nitrogênio armazenado pode ser 20 então redistribuído a partir das folhas e talo que servem como compartimentos de armazenamento até a formação de grão.

Esses são os três parâmetros principais da eficiência usada para definir o metabolismo de Nitrogênio da planta: 25 Eficiência de captação do

Nitrogênio: é a quantia de N na biomassa acima do solo (gr Nt) dividida pela quantidade de N aplicada (gr/hectare); Eficiência de utilização do Nitrogênio: é a Produção de Grão (gr/planta) dividida pela quantidade de N na biomassa acima do solo (gr Nt); e Eficiência de uso do Nitrogênio: é a Produção de Grão (gr/planta) dividida pela 5 quantidade de N aplicado (gr/Ha).

A eficiência de captação do Nitrogênio [a quantidade do N da biomassa acima do solo (gr Nt) / N aplicado (gr/hectare) ] ê a quantidade total do nitrogênio incorporado pela planta e é uma função da 10 "captação" (a capacidade de transporte da planta), a eficiência metabólica do processo de assimilação e a taxa do desenvolvimento de tamanho da planta, considerando que a massa do talo e folhas criada durante o crescimento são os órgãos de armazenamento do Nitrogênio efetivos. A fração do 15 Nitrogênio assimilado encontrada em um broto que é finalmente transferido ao grão (produção) é controlada de forma enzimática, e assim um local potencial para manipulação transgênica. Esse parâmetro é, em efeito, igual à eficiência de Utilização do Nitrogênio (NUE). O melhor 20 particionamento N de grão para broto mais provavelmente melhorará o rendimento e teor de proteina do grao.

De forma semelhante, os mesmos cálculos das eficiências de uso e utilização podem ser feitos para outros macronutrientes, tais como Fósforo (P) e 25 Potássio (K), que possuem uma correlação direta com a produção e tolerância geral da planta.

A NUE para as safras principais varia de 30-70% apenas, com um impacto negativo direto sobre as despesas de entrada para o fazendeiro, devido ao excesso de fertilizante aplicado, que rapidamente se torna um peso ecológico. Dessa forma, os resíduos contendo nitrato representam um problema ambiental de significância global. A 5 infiltração de Nitrato na água provoca eutroficação de lagos, rios e mares (as águas arriscadas devido ao crescimento das algas que conduz à hipoxia e destruição da fauna marinha). A contaminação de Nitrato na água potável pode provocar metemoglobinemia, que é especialmente 10 prejudicial aos infantes e mães lactentes. De fato, a Indústria Agrícola é considerada como a maior poluidora de nitrato de superfície e águas costeiras e abastecimentos de água potável. 15 Eficiência do uso de fertilizante (FUE) em plantas pode ser gerada via procriação tradicional ou via engenharia genética. Entretanto, até a data, nem os produtos transgênicos nem o material de FUE melhorado classicamente procriado foram liberados para uso comercial. Entre os 20 motivos para isso, o mais importante é que os procriadores selecionam suas linhas de elite sob as condições mais favoráveis de fertilizante, assim supervisionando as melhorias na FUE (produção sendo o acionador principal das vendas e não redução nos custos de entrada) . As tentativas 25 nas soluções transgênicas para FUE melhorada estão sendo realizadas pelas empresas, tais como, Monsanto (vide, por exemplo, os Pedidos de Patente Norte-Americana 20020046419 para Choo, et al.; Pedido de Patente Norte-Americana 2005010879 para Edgerton et al.; e Pedido de Patente Norte- Americana 2006 0179511 para Chomet et al), Arcadia Biosciences e Biogemma.

Recentemente, uma revisão 5 resumindo as tentativas para melhorar a FUE através meios transgênicos que foram empreendidas pelos laboratórios acadêmicos foi publicada (Good AG et al. Trends Plant Sci. 2004 Dec;9(12):597-605). Os resultados encorajadores foram relatados por Yanagisawa e co-trabalhadores (Proc Natl Acad It) Sci USA. 2004 May 18 ; 101 (20) : 7833-8 ) que averiguaram que um aumento geneticamente de engenharia no crescimento sustentado na produção de esqueleto de carbono (2- Oxoglutarato, OG do ciclo GS/GOGAT) da Arabidopsis transgênica sob condições baixas de nitrogênio. Conforme 15 muitas enzimas estão envolvidas na produção do esqueleto de carbono, o transgene era um fator chave de transcrição (Dofl) que ativou genes múltiplos envolvidos na via. O teor de Nitrogênio era superior nas plantas transgênicas Arabidopsis por aproximadamente 30 ■' sob baixas condicões de 20 nitrogênio. A Patente Norte-Americana N° 6.084.153 para Good et al. revela o uso de um promotor responsivo ao estresse para controlar a expressão da Alanina Amina Transferase (AlaAT) . Good et al. ainda revela que as plantas transgênicas de canola melhoraram a tolerância da 25 deficiência de nitrogênio e seca quando comparado às plantas de controle. Entretanto, nem as construções de Dofl de Yanagisawa et al, nem as construções de AlaAT induzida por seca de Good et al. foram avaliadas nas linhas comerciais, sob as verdadeiras condições em campo. Assim, a relevância econômica dos resultados ainda deve ser comprovada.

Dessa forma, existe uma necessidade amplamente reconhecida, e seria altamente 5 vantajoso identificar os polinucleotídeos e polipeptidios que melhoram a eficiência de captação/uso de fertilizante nas plantas transgênicas expressando os mesmos, que são destituídos das limitações acima.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

De acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma construção de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico pelo menos 85 % idêntica a uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID N°: 68, 15 1, 4, 5, 8, 9, 11, 13, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 30, 32, 37, 42, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 64, 69, 70, 73, 77, 78, 79, 80, 84, 86, 87, 93, 94, 98, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108 e 109 e uma seqüência de promotor capaz de instruir a transcrição da seqüência de ácido nucléico em uma 2() célula hospedeira.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a seqüência de ácido nucléico é conforme estabelecida na SEQ ID N°: 68, 1, 4, 5, 8, 9,11,13,16, 19, 20, 23, 24, 27, 30, 25 3 2 , 37 , 42 , 49 , 50 , 51, 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 64 , 69 , 70, 73, 77, 78, 79, 80, 84, 86, 87, 93, 94, 98, 101, 102, 103, 104,105, 106, 107, 108, 109, 219-767, 1317, 1318, 1319, 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327,1328, 1329,1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335 ou 1336.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, é fornecido um polipeptidio isolado, compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos 85 % 5 homóloga à seqüência de aminoácido estabelecida na SEQ ID N° : 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 10 216, 217 ou 218 .

De acordo ainda com outro aspecto da presente invenção, é fornecida uma célula de planta compreendendo um polinucleotideo exógeno que compreende uma seqüência de ácido nucléico codificando um 15 polipeptidio com uma seqüência de aminoácido pelo menos 85 homóloga à SEQ ID N° : 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 198, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 20 212, 213, 214, 215, 216, 217 ou 218.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a célula de planta forma uma parte de uma planta.

De acordo com características 25 adicionais nas configurações preferidas descritas, a seqüência de aminoácido é conforme estabelecida na SEQ ID N°: 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 768-1051, 1053-1098, 1100-1315 ou 1316. aspecto da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a tolerância de uma planta a uma condição de estresse, compreendendo a expressão dentro da planta de um polinucleotideo exógeno codificando um polipeptidio com uma seqüência de aminoácido pelo menos 85 % homóloga à SEQ ID II) N°: 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 1341 ou 1343, assim aumentando a tolerância 15 da planta às condição de estresse. adicional da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a biomassa, vigor e/ou produção de uma planta, compreendendo a expressão dentro da planta um 20 polinucleotideo exógeno codificando um polipeptidio com uma seqüência de aminoácido pelo menos 85 % homóloga à SEQ ID N°: 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 25 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 1341 ou 1343, assim aumentando a biomassa, vigor e/ou produção da planta.

De acordo com ainda um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um método para aumentar a eficiência do uso de fertilizante e/ou captação de uma planta compreendendo a expressão dentro da planta um polinucleotideo exógeno codificando um polipeptídio com uma 5 seqüência de aminoácido pelo menos 85 % homóloga à SEQ ID N°: 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 10 216, 217, 218, 1341 ou 1343, assim aumentando a eficiência do uso de fertilizante e/ou captação da planta. adicionais nas configurações preferidas descritas, a expressão é efetuada por: 15 (a) transformar uma célula da planta com o polinucleotideo exógeno; (b) gerar uma planta madura a partir da célula; e (c) cultivar a planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotideo exógeno dentro da planta madura. adicionais nas configurações preferidas descritas, a transformação é efetuada pela introdução na célula de planta uma construção de ácido nucléico incluindo o polinucleotideo exógeno e pelo menos um promotor capaz de instruir a 25 transcrição do polinucleotideo exógeno na célula de planta.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, pelo menos um promotor é um promotor constitutivo.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas da invenção abaixo descrita, o promotor é um promotor constitutivo.

De acordo com características 5 adicionais nas configurações preferidas descritas, o promotor constitutivo é o promotor CaMV 35S.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o promotor é um promotor induzível.

De acordo com características nas configurações preferidas descritas, o promotor induzível é um promotor induzível de estresse abiótico.

De acordo com características 15 adicionais nas configurações preferidas descritas, o promotor é um promotor especifico de tecido.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o tecido é um tecido raiz.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a célula hospedeira é uma célula de planta.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a célula 25 de planta forma uma parte de uma célula de planta dicotiledônea.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a célula de planta forma uma parte de uma célula de planta monodicotiledônea.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a 5 condição de estresse é um estresse abiótico.

De acordo com caracteristicas adicionais nas configurações preferidas descritas, o estresse abiótico é selecionado a partir do grupo consistindo na salinidade, seca, baixa temperatura, alta ]() temperatura, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, osmótico e deficiência de nutriente.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, o nutriente é o nitrogênio.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a planta é uma planta dicotiledônea.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, a planta 2() é uma planta monodicotiledônea.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, polinucleotídio compreende uma seqüência de ácido nucléico selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID N°: 68, 25 1, 4, 5, 8, 9, 11, 13, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 30, 32, 37, 42, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 64, 69, 70, 73, 77, 78, 79, 80, 84, 86, 87, 93, 94, 98, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108,109, 219-767, 1317, 1318, 1319, 1320, 1321,1322, 1323,1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1329, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335, 1336, 1340 ou 1342. adicionais nas configurações preferidas descritas, a 5 seqüência de aminoácido é conforme estabelecida na SEQ ID N°: 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 10 216, 217, 218, 768-1051, 1053-1098, 1100-1316, 1341 ou 1343.

De acordo com características adicionais nas configurações preferidas descritas, as condições são as condições de estresse abiótico. adicionais nas configurações preferidas descritas, as condições são as condições de deficiência de fertilizante. adicional da presente invenção, é fornecido um método para irrigação compreendendo: 20 (a) colocação em um solo um sistema de irrigação por gotejamento de modo a obter os orifícios de irrigação distribuídos 20-40 cm entre si nas direções X e Y; e (b) irrigação continua através de cada um dos referidos orifícios de irrigação em uma taxa de irrigação de 0,5-2 25 litros de água por hora. adicional da presente invenção, é fornecido um sistema de irrigação para imitar as condições de seca, compreendendo: (i) um sistema de irrigação por gotejamento corn orifícios de irrigação distribuídos 20-40 cm entre si nas direções X e Y; e (ii) um sistema de controle e abastecimento de água para 5 continuamente irrigar através de cada um dos referidos orifícios de irrigação 0,5-2 litros de água por hora.

A presente invenção trata de modo bem-sucedido as falhas das configurações atualmente conhecidas ao fornecer os polinucleotídios e polipeptidios Alo que melhoram a eficiência do uso de fertilizante/captação nas plantas transgênicas expressando os mesmos.

Exceto se de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados possuem o mesmo significado conforme comumente 15 entendidos por aquele com habilidade na técnica a quem esta invenção pertence. Embora os métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos descritos no presente possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são abaixo descritos. No caso de ^^20 conflito, a especificação de patente, incluindo definições, controlará. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são somente ilustrativos e não têm a intenção de serem 1imitantes.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A invenção é neste ato descrita, somente como exemplo, com referência aos desenhos anexos. Com referência especifica agora aos desejos em detalhes, é enfatizado que os detalhes mostrados são como exemplo e somente para fins de discussão ilustrativa das configurações preferidas da presente invenção, e são apresentados para fornecer o que é acreditado como sendo a descrição mais útil e prontamente entendida dos princípios e 5 aspectos conceituais da invenção. Com relação a isso, nenhuma tentativa é feita para mostrar os detalhes estruturais da invenção em mais detalhes do que sejam necessários para um entendimento fundamental da invenção, a descrição considerada com os desenhos tornando aparente para ^^10 aqueles com habilidade na técnica como as diversas formas da invenção podem ser configuradas na prática.

Nos desenhos: a figura IA é uma ilustração esquemática descrevendo o 15 desenvolvimento do sistema de raiz da planta na seca. A umidade escassa do solo induz a formação de um sistema de raiz mais profundo. 0 desenho é adaptado de Weaver [Root Development of Field Crops. McGraw Hill Inc., New York, 291 p. (1926)]; 20 a figura 1B é uma representação esquemática das estratégias biológicas escolhidas para melhorar o traço de NUE e a tradução das estratégias para as questões realizadas durante a mineração de dados computacionais; 25 as figuras 2A-D mostram a expressão digital de FUE_1; as figuras 3A-D são gráficos demonstrando a expressão dos genes de controle (transportadores de Nitrogênio e sintase de Glutamina) como uma função do teor de nitrogênio no solo. As 5 plantas foram cultivadas em vasos de litro com concentrações crescentes de NH^NO- (em 0,005, 0,05, 0,5 e 5 mM) ou KNO-, (em 0,01, 0,1, 1 ou 5 mM) . As plantas foram cultivadas por A1" aproximadamente 30 dias e os tecidos foram rompidos congelados em nitrogênio liquido. 0 RNA foi extraido dos tecidos e posteriormente tratado com DNAse. 0 RNA foi transcrito de forma reversa e usado para ensaios de 15 quantificação usando PCR de Tempo Real. Para normalização, a expressão em cada ponto foi dividida pela média geométrica da expressão de quatro rotinas, conforme descrito no Exemplo 2. Os resultados mostrados são a proporção as figuras W 20 entre a expressão normalizada e os níveis de expressão medidos na concentração mais alta verificada (5mM NH^NO ou 5 mM KNO.J; 4A-K são gráficos mostrando a expressão correlacionada da sequências de as figuras 25 polinucleotídio da presente invenção com a disponibilidade do nitrogênio.; 5A-E são gráficos mostrando a expressão correlacionada inversamente da sequências de polinucleotídio da presente invenção com a a figura 6 disponibilidade do nitrogênio; é uma representação gradual esquemática da tecnologia usada para a quantificação da área de roseta da planta a partir das imagens 5 digitais. A etapa de processamento filtra as partes verdes das plantas individuais. Após a designação de ROIs individuais (Região de Interesse) , a área coberta pela área de roseta 10 as figuras é calculada e exportada a uma planilha; 7A-B são fotografias mostrando a capacidade dos polinucleotidios da presente invenção de aumentar a eficiência do uso de nitrogênio. A Figura 7A de plantas TI - transgênicas 15 expressando FUE_504 (SEQ ID N°: 108) de acordo com o promotor TT105. A Figura 7B, um evento transgênico representativo expressando FUE_43 (SEQ ID N°: 70) de acordo com o promotor 35S. As plantas foram cultivadas em condições de • 20 nitrogênio muito limitantes (0,05 e 0,2 mM de nitrogênio inorgânico combinado) . As plantas de controle (expressando um gene repórter sob o mesmo promotor ou plantas não transgênicas) foram tratadas de forma semelhante. As diferenças notórias no tamanho de plantinha são traduzidas em diferenças significativas no peso fresco medido das plantinhas; a figura 8 é uma fotografia mostrando as plantas 25 transgênicas a partir de três eventos transgênicos independentes expressando FUE 34_Evo (SEQ ID N° : 54) . A planta mostra ramificação impressiva em cada nó conforme determinado por um ensaio triplo cego. 0 sistema de raiz a partir das plantas também foi altamente ramificado e compacto (não mostrado); 5 a figura 9 mostra cinco eventos transgênicos independentes das plantas expressando FUE_40 (também denominado FUE6/40, SEQ ID N° : 11). Fica claramente notável que o tronco de floração é raramente perpendicular e rigido. lo Além disso, um número raramente alto de siliquas pode ser contado. Como resultado, as plantas transgênicas expressando FUE_40 são notavelmente prolíficas; e a figura 10 é um esquema de um sistema de irrigação em 15 conformidade com os ensinamentos da presente invenção.

DESCRIÇÃO DAS CONFIGURAÇÕES PREFERIDAS

A presente invenção é de polipeptídios isolados, polinucleotidios codificando os 20 mesmos, plantas transgênicas expressando os mesmos e métodos para usar os mesmos. Especificamente, a presente invenção pode ser usada para aumentar a eficiência do uso de fertilizante e resistência ao estresse, bem como, a biomassa, vigor e rendimento das plantas transgênicas. 25 Os princípios e a operação da presente invenção podem ser melhor entendidos com referência aos desenhos e descrições anexas.

Antes de explicar pelo menos uma configuração da invenção em detalhe, deve ser entendido que a invenção não é limitada em sua aplicação aos detalhes estabelecidos na seguinte descrição ou exemplificados pelos Exemplos. A invenção é capaz de outras configurações ou de 5 ser praticada ou realizada em diversos modos. Da mesma forma, deve ser entendido que a fraseologia e terminologia aqui utilizados são para fins de descrição e não devem ser considerados como limitantes.

Conforme o custo do 10 fertilizante de Nitrogênio (N) aumenta e o lucro da produção de plantas de safra é colocado como risco, os cientistas são desafiados a desenvolver estratégias que melhoram a eficiência do uso de N (NUE) . Dessa forma, os resultados da fertilização escassa ou em excesso resultam em uma perda de 15 lucro. As taxas mais baixas de N aplicado resultam na biomassa reduzida, conforme pode ser comprovado pelo broto reduzido, tamanho, enchimento deficiente de grão, rendimentos reduzidos e baixo teor de aminoácido e proteína. Alternativamente, a aplicação em excesso do nitrogênio pode 20 resultar em rendimento reduzido, custo superior de entrada e risco aumentado ao ambiente.

Ao reduzir a presente invenção para prática, os presentes inventores revelaram através de análises bioinformáticas laboriosas e experimentação, 25 sequências de polinucleotidio e polipeptídios codificados a partir dos mesmos que pode ser usada para gerar as plantas transgênicas com eficiência melhorada do uso de fertilizante, tolerância ao estresse, valor nutricional 21/164 (p.ex., teor de aminoácidos e proteína), biomassa, rendimento e/ou vigor.

Conforme ilustrado abaixo e na seção de exemplos que segue, a seqüências de polinucleotídio 5 do milho foi selecionada com base em diversos critérios (vide Exemplo 1 da seção Exemplos que segue). Isso incluía altos níveis de expressão digital calculada nas pontas de raiz, especialmente nas raizes estressadas de água (p.ex., seca) . Um filtro secundário para a seqüências de lo polinucleotídio acima era com base na expressão digital de suas seqüências ortólogas (i.e., plantas dicotiledôneas ou outras espécies monocotiledôneas) . Os genes ortólogos mostrando expressão digital semelhante que os genes de milho (p.ex., oscilações de raiz das plantas tratadas por estresse 15 expostas) foram selecionados.

A mineração de dados e as ferramentas de anotação foram usadas para filtrar os genes que podem ter efeitos amplos no metabolismo de célula. Por exemplo, os genes que podem modificar a arquitetura de raiz, 2() aumentar a capacidade de armazenamento do nitrogênio, melhorar o processo de assimilação do nitrogênio e otimizar o traço de permanência do verde, foram selecionados. Tais genes foram finalmente selecionados para validação molecular (vide Exemplos 3 e 9) . Uma representação esquemática dos 25 filtros computacionais aplicados para identificar a seqüências de polinucleotídio da presente invenção é apresentada na Figura 1B e é somente fornecida para ilustração.

As seqüências assim identificadas foram experimentalmente validadas. Conforme mostrado nos Exemplos 6-11, as plantas transgênicas expressando as seqüências de ácido nucléico da presente 5 invenção foram mostradas como ter eficiência aumentada de uso de fertilizante/captação, tolerância ao estresse abiótico, biomassa e produção. Esses resultados fortemente suportam a robustez da metodologia da presente invenção e substanciam o uso desses genes na agricultura. 10 Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção, é fornecida uma construção de ácido nucléico compreendendo uma seqüência de ácido nucléico pelo menos cerca de 7 0 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo menos cerca de 15 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 , pelo menos cerca de 89 •, pelo menos cerca de 90 ■ , pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 , pelo menos cerca de 93 %, 20 pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 Í,pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou mais, isto é, 100 % idêntica a uma seqüência de nucleotídeo selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ 25 ID N°: 68, 1, 4, 5, 8, 9, 11,13, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 30, 32, 37, 42, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 64, 69, 70, 73, 77, 78, 79, 80, 84, 86, 87, 93, 94, 98, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1340 e 1342.

As seqüências de ácido nucléico podem codificar as seqüências de polipeptidio compreendendo uma seqüência de aminoácido pelo menos cerca de 7 0 , pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos 5 cerca de 81 %, pelo menos cerca de 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 - , pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 10 92 %, pelo menos cerca de 93 , pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 ?>, pelo menos cerca de 95 1, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 - , pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou mais, isto é, 100 % homóloga à SEQ ID N° 177, 110, 113, 114, 11/, 118, 15 120, 122, 12 5, 12 8, 12 9, 132, 133, 136, 13 9, 141, 14 6, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 1341 ou 1343. 20 de por cento) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, o software BlastP do Centro Nacional das Informações de Biotecnologia (NCBI), tal como, através de usar parâmetros padrão. 25 A identidade (p.ex., homologia de por cento) pode ser determinada usando qualquer software de comparação de homologia, incluindo, por exemplo, do Centro Nacional das Informações de Biotecnologia (NCBI) tal como, através de usar parâmetros padrão.

De acordo com uma configuração preferida deste aspecto da presente invenção, o 5 polinucleotídio isolado é conforme estabelecido na SEQ ID N° : 68, 1, 4, 5, 8, 9, 11, 13, 16, 19, 20, 23, 24, 27, 30, 32, 37, 42, 49, 50, 51, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 64, 69, 70, 73, 77, 78, 79, 80, 84, 86, 87, 93, 94, 98, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 219-767, 1317, 1318, 1319, AUi 1320, 1321, 1322, 1323, 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1329, ~ 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, 1335 ou 1336.

A seqüência de ácido nucléico (também denominada como polinucleotídio isolado) da presente invenção refere-se a uma única ou de filamento duplo de 15 seqüência de ácido nucléico, que é isolada e fornecida na forma de uma seqüência de RNA, uma seqüência de polinucleotideo complementar (cDNA), uma seqüência de polinucleotideo genômica e/ou uma seqüências de polinucleotídio composta (p.ex., uma combinação do acima). 20 Conforme usado no presente, a frase "seqüência de polinucleotideo complementar" refere-se a uma seqüência, que resulta da transcrição reversa do RNA mensageiro usando uma transcriptase reversa ou qualquer outra polimerase de DNA dependente de RNA. Tal seqüência 25 pode ser subsequentemente amplificada in vivo ou in vitro usando uma polimerase de DNA dependente de DNA.

Conforme aqui utilizado, a frase "seqüência de polinucleotideo genômica uma seqüência derivada (isolada) a partir de um cromossomo e, assim, representa uma porção contígua de um cromossomo.

Conforme aqui utilizado, a frase "seqüência de polinucleotídeo composta" refere-se a 5 uma seqüência, que é pelo menos parcialmente complementar e pelo menos parcialmente genômica. Uma seqüência composta pode incluir algumas seqüências de exon exigidas para codificar o polipeptidio da presente invenção, bem como algumas seqüências intrônicas interpondo-se ente elas. As seqüências intrônicas podem ser de qualquer fonte, incluindo de outros genes e tipicamente incluirão as seqüências de sinal de entrançamento conservadas. Tais seqüências intrônicas podem ainda incluir os elementos regulatórios de expressão de atuação cis.

As seqüências de ácido nucléico dos polipeptídios da presente invenção podem ser otimizadas para expressão da planta. Tais seqüências otimizadas são fornecidas na SEQ ID N° : 1317, 1319, 1320, 1321, 1322, 1324, 1325, 1326, 1327, 1328, 1329, 1330, 1331, 1332, 1333, 1334, W 20 1335 e 1336. Os exemplos de tais modificações de seqüência incluem, porém sem limitação, um teor de G/C alterado para aproximar-se mais estreitamente aquele tipicamente averiguado nas espécies de planta de interesse, e a remoção de códons atipicamente averiguada nas espécies de planta 25 comumente mencionadas como otimização de códon.

A frase "otimização de códon"refere-se à seleção dos nucleotídeos apropriados de DNA para uso dentro de um gene estrutural ou fragmento do mesmo que se aproxima à utilização do códon dentro de planta de interesse. Portanto, um gene ou seqüência de ácido nucléico otimizado refere-se a um gene em que a seqüência de nucleotideo de um gene nativo ou naturalmente ocorrente foi 5 modificada com a finalidade de utilizar os códons estatisticamente preferidos ou estatisticamente favorecidos dentro da planta. A seqüência de nucleotideo tipicamente é examinada no nivel de DNA e a região de compilação otimizada para expressão nas espécies de planta determinadas usando 10 qualquer procedimento adequado, por exemplo, conforme descrito em Sardana et al. (1996, Plant Cell Reports 15:677 681). Nesse método, o desvio padrão da utilização do códon, uma medida da tendência de utilização do códon, pode ser calculado ao primeiro encontrar o desvio proporcional 15 quadrado de utilização de cada códon do gene nativo relacionado ao de genes de planta altamente expressos, seguido por um cálculo do desvio quadrado médio. A fórmula usada é: 1 SDCU = n = IN [ ( Xn - Yn ) / Yn ] 2 / N, em que Xn refere-se à freqüência de utilização do códon n em genes 20 de planta altamente expressos, em que Yn, à freqüência de utilização do códon n no gene de interesse e N refere-se ao número total dos códons no gene de interesse. Uma tabela da utilização de códon a partir de genes altamente expressos das plantas dicotiledôneas é compilada utilizando os dados 25 de Murray et al. (1989, Nuc Acids Res. 17:477-498) .

Um método para otimizar a seqüência de ácido nucléico em conformidade com a utilização preferida do códon para um tipo especifico da célula de planta é com base no uso direto, sem realizar quaisquer cálculos estatísticos extras, das tabelas de otimização de códon, tais como, aqueles dispostos on-line no Banco de Dados de Utilização do Códon através do banco de DNA NIAS 5 (Instituto Nacional de Ciências Agrobiológicas) no Japão (http://www.kazusa.ou.jp/codon/). 0 Banco de Dados de Utilização de Códon contém as tabelas de utilização de códon para um número de diferentes espécies, com cada tabela de utilização de códon tendo sido estatisticamente determinada 10 com base nos dados presentes no Genbank.

Ao utilizar as tabelas acima para determinar os códons mais preferidos ou mais favorecidos para cada aminoácido em uma espécie específica (por exemplo, arroz), uma seqüência de nucleotídeo 15 naturalmente ocorrente codificando uma proteína de interesse pode ser otimizada por códon para tal espécie de planta específica. Isso é efetuado pela substituição de códons que possam ter baixa incidência estatística no genoma específico das espécies com os códons correspondentes, com relação a um 20 aminoácido, que é estatisticamente mais favorecido.

Entretanto, um ou mais códons menos favorecidos podem ser selecionados para excluir os locais existentes de restrição, para criar novos em junções potencialmente úteis (extremidades 5'e 3'para adicionar o peptídeo de sinal ou 25 cassetes de terminação, locais internos que poderiam ser usados para corte e dividir os segmentos juntos de modo a produzir uma seqüência correta de comprimento total), ou para eliminar as seqüências de nucleotídeo que poderiam afetar negativamente a estabilidade ou expressão do mRNA.

A seqüência de nucleotideo de codificação naturalmente ocorrente já pode, com antecedência de qualquer modificação, conter um número de códons que 5 correspondem a um códon estatisticamente favorecido em uma espécie especifica de planta. Portanto, a otimização de códon da seqüência de nucleotideo nativa pode compreender a determinação de quais códons, dentro da seqüência de nucleotideo nativa, não são estatisticamente favorecidos com lí) relação a uma planta especifica, e modificação desses códons em conformidade com uma tabela de utilização de códon da planta especifica de modo a produzir um derivativo otimizado de códon. Uma seqüência de nucleotideo modificada pode ser total ou parcialmente otimizada para a utilização de códon 15 da planta, ressalvado que a proteina codificada pela seqüência de nucleotideo modificada seja produzida em um nivel maior do que a proteína codificada pelo gene nativo ou naturalmente ocorrente correspondente. A construção de genes sintéticos ao alterar a utilização de códon é descrita em, 2() por exemplo, Pedido de Patente PCT 93/07278. invenção abrange as seqüências de ácido nucléico acima descritas; seus fragmentos, seqüências passíveis de hibridização com relação a isso, seqüências homólogas a 25 isso, seqüências ortólogas a isso, seqüências codificando os polipeptidios semelhantes com diferente utilização de códon, seqüências alteradas caracterizadas por mutações, tais como, exclusão, inserção ou substituição de um ou mais 29/164 nucleotideos, sejam naturalmente ocorrentes ou induzidos pelo homens, sejam aleatoriamente ou de modo objetivo.

As seqüências de ácido nucléico da presente invenção podem codificar polipeptidios 5 previamente descaracterizados.

Assim, a presente invenção fornece um polipeptidio com uma seqüência de aminoácido pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 81 %, pelo menos cerca de 10 82 %, pelo menos cerca de 83 %, pelo menos cerca de 84 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 86 %, pelo menos cerca de 87 %, pelo menos cerca de 88 %, pelo menos cerca de 89 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 91 %, pelo menos cerca de 92 %, pelo menos cerca de 93 %, 15 pelo menos cerca de 93 %, pelo menos cerca de 94 %, pelo menos cerca de 95 %, pelo menos cerca de 96 %, pelo menos cerca de 97 %, pelo menos cerca de 98 %, pelo menos cerca de 99 %, ou mais, isto é, 100 ■ homóloga a uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo na SEQ ID N° : 177, 110, 113, 114, 117, 118, 120, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 1 - ■ , 17 3, 17 8, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 1341 ou 1343. 25 De acordo com uma configuração deste aspecto da presente invenção, o polipeptidio isolado compreende uma seqüência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em 177, 110, 113, 114, 122, 125, 128, 129, 132, 133, 136, 139, 141, 146, 151, 158, 159, 160, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 173, 178, 179, 182, 186, 187, 188, 189, 193, 195, 196, 202, 203, 207, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 768-1051, 1053-1098,1100- 5 1315,1316,1341 ou 1343. abrange as seqüências homólogas e ortólogas aos polipeptidios acima mencionados, cs fragmentos dos polipeptidios e polipeptidios acima descritos com mutações, 10 tais como, exclusões, inserções ou substituições de um ou mais aminoácidos, sejam naturalmente ocorrentes ou induzidos pelo homem, seja aleatoriamente ou de uma forma objetiva. polinucleotidios polipeptidios da presente invenção são utilizados para a 15 expressão de planta. usado, abrange as plantas inteiras, progenitoras e progénie da plantas e partes da planta, incluindo sementes, brotos, talos, raizes (incluindo tubérculos), e célula de plantas, 20 tecidos e órgãos. O termo "planta" também, portanto, abrange as culturas de suspensão, embriões, regiões meristemáticas, tecido de calo, folhas, gametófitos, esporófitos, pólen e microesporos. As plantas que são especificamente úteis nos métodos da invenção incluem todas as plantas que pertencem à 25 superfamília Viridiplantae, especificamente as plantas monodicotiledônea e dicotiledônea que são de valor comercial, incluindo uma forragem ou legume de forragem, planta ornamental, safra alimentícia, árvore ou arbusto 31/164 selecionado a partir da lista não limitante a seguinte compreendendo Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, 5 Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga,

Bétula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana, Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camélia sinensis, Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Cent roema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, 10 Coffea arabica, Colophospermum mopane, Coronillia varia,

Cotoneaster serotina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Ciyptomeria laponica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davalila divaricata, 15 Desmodium spp., Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Doiycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrartia spp., Eleusine coracana, Era grestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp, Euclea .schimpen Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Felloa 20 sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergi, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia spp, Gossypium hirsutum, Gre villea spp., Guibourtia coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon con tortus, Hordeum vulgare,

Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, índigo incarnata, íris spp., Jatropha curcas, Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesi, Lotus spp.,

Macrotyloma axifiare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobtychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophorum african urn, Pennisetum spp., 5 Persea gratíssima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria flecki, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesi, Pterolobium 10 stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sapida, Rhu.s natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rub us spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineurn,

Sciadopitys verticillata, Sequoia sempen'irens, 15 Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra, Trifollum spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, 20 Zantedeschia aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofra, aspargo, brócolis, couve de Bruxelas, repolho, canola, cenoura, couve-flor, aipo, couve, linho, couve galega, lentilha, colza oleaginosa, quiabo, cebola, batata, arroz, soja, palha, beterraba, cana-de-açúcar, girassol, tomate, 25 arbusto de abóbora, árvores.

Alternativamente, as algas e outras não Viridiplantae podem ser usadas.

A expressão do polinucleotideo exógeno da presente invenção dentro da planta pode ser efetuada ao transformar uma ou mais células da planta com o polinucleotídeo exógeno, seguido pela geração de uma planta madura a partir das células transformadas e cultivação da 5 planta madura sob condições adequadas para expressar o polinucleotídeo exógeno dentro da planta madura. Preferivelmente, a transformação é efetuada pela introdução na célula de planta uma construção de ácido nucléico que inclui o ]() polinucleotídeo exógeno da presente invenção e pelo menos um promotor capaz de instruir a transcrição do polinucleotídeo exógeno na célula de planta. Os detalhes adicionais das abordagens adequadas de transformação são fornecidos abaixo.

Conforme aqui utilizado, o 15 termo "promotor"refere-se a uma região do DNA que fica a montante do local de iniciação de transcrição de um gene, ao qual a polimerase de RNA aglutina-se para iniciar a transcrição do RNA. 0 promotor controla o local em que (p.ex., qual porção de uma planta, qual órgão dentro de um 20 animal, etc.) e/ou quando (p.ex., qual etapa ou condição na vida de um organismo) o gene é expresso.

Qualquer seqüência de promotor adequada pode ser usada pela construção de ácido nucléico da presente invenção. Os seguintes tipos de promotores são os 25 exemplos não limitantes de promotores usados para expressar em excesso os genes selecionados: promotores gerais, promotores específicos de raiz, promotores específicos de pontas de raiz, promotores de raiz induzidos por seca, promotores induzido por estresse biótico, promotores induzidos por estresse abiótico, promotores induzidos por nitrogênio, promotores induzidos por amónia ou nitrato, promotores induzidos por fertilizante de fosfato, promotores 5 específicos de folha, promotores induzíveis, promotores constitutivos, promotores com duas ou mais características acima descritas ou outros promotores recentes.

A escolha do promotor é com base amplamente no fenótipo de interesse e é determinada por tais fatores, como tecido (p.ex., semente, fruto, raiz, pólen, tecido vascular, flor, carpelo, etc.), possibilidade de indução (p.ex., em resposta a prejuízo, calor, frio, seca, luz, patógenos, etc.), ocasião, etapa de desenvolvimento e semelhante. Os numerosos promotores J 15 conhecidos foram caracterizados e podem favoravelmente ser utilizados para promover a expressão de um polinucleotídio da invenção em uma planta transgênica ou célula de interesse.

As medidas devem ser tomadas, entretanto, para selecionar um promotor que mediará os níveis desejáveis de expressão do transgene, de modo a evitar a nova alocação dos recursos energéticos excessivos que podem afetar a produção final, resistência, massa, alojamento e incidência dos patógenos foliares. Isso também 25 deve ser visto de uma perspectiva econômica.

Os promotores constitutivos adequados incluem, por exemplo, promotor CaMV 35S (SEQ ID N°: 1337; Odell et al, Nature 313:810-812, 1985); promotor

Arabidopsis At6669 (SEQ ID N° : 1514, PCT N° W02004/104162); TT105 (SEQ ID N° : 1339, PCT N° : WO2004/081173) milho Ubi 1 (Christensen et al, Plant Sol. Biol. 18:675-689, 1992); actina de arroz (McElroy et al, Plant Cell 2:163-171, 1990); 5 pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588, 1991); e Super MAS Sintético (Ni et al., The Plant Journal 7: 661-76, 1995) . Outros promotores constitutivos incluem aqueles nas Patentes Norte-Americanas N°s 5.659.026. 5.608.149; 5.608.144; 5.604.121; 5.569.597: 5.466.785; 5.399.680; 10 5.268.463; e 5.608.142. Os promotores específicos de tecido adequados incluem, porém sem limitação, promotores específicos de folha, tais conforme descrito, por exemplo, por Yamamoto et al. , Plant J. 12:255-265, 1997; Kwon et al, 15 Plant Physiol. 105:357-67, 1994; Yamamoto et al, Plant Cell Physiol. 35:773-778, 1994; Gotor et al, Plant J. 3:509-18, 1993; Orozco et al, Plant Mol. Biol. 23:1129-1138, 1993; e Matsuoka et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9586-9590, 1993. Os especialmente preferidos são os promotores de raiz, 20 tais como, promotor ROOT? [SEQ ID N° : 1338; Região a montante do gene ATXTH19 (AT4G30290, Xiloglucano endotransglicosilase/hidrolase 19, descrito em Vissenberg K, et al. Plant Cell Physiol. 2005 Jan;46(l): 192-200].

Uma variedade dos promotores de 25 gene de planta é conhecida para regular a expressão do gene em resposta aos sinais ambientais, hormonais, químicos, de desenvolvimento e de uma forma ativa de tecido. Os exemplos dos promotores específicos de semente (tais como, promotor de napina, faseolina ou DC3 descrito na Patente Norte- Americana N° 5.773.697), promotores específicos de fruto que são ativos durante o amadurecimento do fruto, tais como, promotor dru 1 (Patente Norte-Americana N° 5.783.393), ou 5 promotor 2A11 (Patente Norte-Americana N° 4.943.674) e o promotor de poligalacturonase de tomate (Bird et al. (1988)

Plant Mol. Biol. 11: 651-662), promotores específicos de raiz, tais como ARSK1, e aqueles revelados na Patente Norte-

Americana N°s 5.618.988. 5.837.848 e 5.905.186, promotores específicos de epiderme, incluindo CUT1 (Kunst et al. (1999) Biochem. Soc. Tians. 28: 651-654), promotores ativos por pólen, tais como, PTA29, PTA26 e PTA 13 (Patente Norte- Americana N° 5.792.929), promotores ativos no tecido vascular (Ringli e Keller (1998) Plant Mol. Biol. 37; 977988), específico de flor (Kaiser et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28: 231-243), pólen (Baerson et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26: 1947-1959), carpelos (Ohl et al. (1990) Plant Cell 2: 837-848), pólen e óvulos (Baerson et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 255-267), promotores induziveis por auxina (tais como aqueles descritos em van der Kop et al. (1999) Plant Mol. Biol. 39: 979-990 ou Baumann et al. (1999) Plant Cell 11: 323-334), promotor induzível por citocinina (Guevara-Garcia (1998) Plant Mol. Biol. 38: 743-753), promotores responsivos a giberelina (Shi et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1053-1060, Willmott et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 817-825) e semelhantes. Os promotores adicionais são aqueles que induzem a expressão em resposta ao calor (Ainley et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 13-23) , light (p.ex., o promotor de ervilha rbcS-3A, descrito em Kuhlemeier et al. (1989) Plant Cell 1: 471-478, e o promotor de milho rbcS, descrito em Schaffier e Sheen (1991) Plant Cell 3: 997-1012); prejuízo (p.ex., wunl, descrito em

Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1: 961-968), patógenos (tais como, o promotor PR-1 descrito em Buchel et al. (1999)

Plant Mol. Biol. 40: 387-396, e o promotor PDF1.2 descrito em Manners et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38: 1071-1080), e químicos, tais como, metil jasmonato ou ácido salicílico (Gatz (1997) Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89-108) . Além disso, a ocasião da expressão pode ser controlada ao utilizar os promotores, tais como, aqueles atuando em senescência (Gan e Amasino (1995) Science 270: 1986-1988); ou desenvolvimento tardio de semente (Odell et 15 al. (1994) Plant Physiol. 106: 447-458) .

Outros exemplos de promotores são um promotor SUC2 (Truernit e Sauer, Plant. (1995) 196:564-70), e um promotor induzível por estresse, tal como, RD29A (Yamaguchi-Shinozaki e Shinozaki K. Plant Cell (1994) 20 6:251-264), promotores do banco de dados PlantProm (Shahmuradov et al. Nucleic Acids Res. (2003) 31:114-7), o promotor de arroz ÇatB (Iwamoto et al. Plant Physiol Biochem. (2004) 42:241-9), os promotores específicos de raiz e promotores de cevada induzíveis por deficiência de fosfato 25 da família do gene transportador de fosfato (HvPhtl;! e HvPhtl;2) (Schunmann et al. (2004); 55:855-65), promotores específicos de tecido e constitutivos ilustrados na patente N°: W02004/081173, na patente N°: US 5633363, na patente N°: 38/164 WO 2000/15662, na patente N°: WO 2004/013169, na patente N°: US 2005/010974, na patente N° : WO 2005/035770, na patente N°: US 2001/0047525, na patente N°: US 5837848, na patente N°: US 6018099, etc.

A construção de ácido nucléico da presente invenção preferivelmente ainda inclui um marcador selecionável apropriado e/ou uma origem de replicação. Preferivelmente, a construção de ácido nucléico utilizada é um vetor transporte, o qual pode propagar em E. 10 coli (caracterizada pelo fato de que a construção compreende um marcador selecionável apropriado e origem de replicação) e ser compatível com a propagação nas células. A construção de acordo com a presente invenção pode ser, por exemplo, um plasmidio, a bacmidio, um fagemidio, um cosmidio, um fago, 15 um vírus ou um cromossomo artificial.

A construção de ácido nucléico da presente invenção pode ser utilizada para transformar de modo estável ou transitório as células de planta. Na transformação estável, o polinucleotídeo exógeno da presente 20 invenção é integrado no genoma da planta e, como tal, representa um traço estável e herdado. Na transformação transitória, o polinucleotídeo exógeno é expresso pela célula transformada, porém não integrada no genoma e, como tal, representa um traço transitório. 25 Existem diversos métodos para introduzir genes estranhos nas plantas monodicotiledônea e dicotiledônea (Potrykus, I., Annu. Rev. Plant. Physiol., Plant. Mol. Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al, Nature (1989) 338:274-276) .

Os métodos de princípios para provocar a integração estável do DNA exógeno no DNA genômico de planta incluem duas abordagens principais: 5 (i) Transferência de gene mediada por Agrobacterium: Klee et al. (1987) Annu. Rev. Plant Physiol. 38:467-486; Klee e Rogers in Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, eds.

Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, 10 Calif. (1989) p. 2-25; Gatenby, in Plant Biotechnology, eds. Kung, S. e Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass. (1989) p. 93-112. (ii) Captação direta de DNA: Paszkowski et al, in Cell Culture e Somatic Cell Genetics of Plants, Vol. 6, Molecular 15 Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., e Vasil, L. K., Academic Publishers, San Diego, Calif. (1989) p. 52-68; incluindo métodos para captação direta do DNA em protoplastos, Toriyama, K. et al. (1988) Bio/Technology 6:1072-1074. Captação do DNA induzida pelo breve choque 2() elétrico das células de planta: Zhang et al. Plant Cell Rep. (1988) 7:379-384. Fromm et al. Nature (1986) 319:791-793.

Injeção de DNA nas células de planta ou tecidos através de bombardeio de partícula, Klein et al Bio/Technology (1988) 6:559-563; McCabe et al Bio/Technology (1988) 6:923-926; 25 Sanford, Physiol. Plant. (1990) 79:206-209; pelo uso dos sistemas de micro-pipeta: Neuhaus et al, Theor. Appl. Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus e Spangenberg, Physiol. Plant. (1990) 79:213-217; transformação de fibras de vidro ou cristal capital de carboneto de silício das culturas de célula, embriões ou tecido de calo, Patente Norte-Americana N° 5.464.765 ou pela incubação direta do DNA com pólen de germinação, DeWet et al. in Experimental Manipulation of

Ovule Tissue, eds. Chapman, G. P. e Mantell, S. H. e Daniels, W. Longman, London, (1985) p. 197-209; e Ohta, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1986) 83:715-719.

sistema Agrobacterium inclui uso de vetores de plasmidio que contêm segmentos definidos de DNA que integram no DNA genômico da planta. Os métodos de inoculação do tecido da planta variam dependendo das espécies de planta e do sistema de administração de Agrobacterium. Uma abordagem amplamente usada é o procedimento de disco de folha que pode ser realizada com qualquer explante de tecido que fornece uma boa fonte para iniciação de toda a diferenciação da planta. Horsch et al. in Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p. 1-9. Uma abordagem complementar utiliza o sistema de administração de

Agrobacterium em combinação com a infiltração a vácuo. O sistema Agrobacterium é especialmente viável na criação de plantas dicotiledôneas transgênicas.

Existem diversos métodos da transferência direta do DNA nas células de planta. Na eletroporação, os protoplastos são brevemente expostos a um forte campo elétrico. Na micro-injeção, o DNA é mecanicamente injetado diretamente nas células usando micro- pipetas muito pequenas. No bombardeio de micro-particulas, o

DNA é adsorvido em micro-projéteis, tais como, cristais de sulfato de magnésio ou partículas de tungsténio, e os micro- projéteis são fisicamente acelerados nas células ou tecidos de planta.

Após a transformação estável, a propagação de planta ê exercida. O método mais comum da propagação de planta é pela semente. A regeneração pela propagação de semente, entretanto, possui a deficiência que devido à heterozigosidade, existe uma falta de uniformidade na safra, considerando que as sementes são produzidas pelas plantas de acordo com as variâncias genéticas regidas pelas regras Mendelian. Basicamente, cada semente é geneticamente diferente e cada crescerá com seus próprios traços específicos. Portanto, é preferido que a planta transformada seja produzida de modo que a planta regenerada possua os traços idênticos e características da planta transgênica precursora. Portanto, é preferido que a planta transformada seja regenerada pela micro-propagação que fornece uma reprodução rápida e consistente das plantas transformadas.

A Micro-propagação é um processo para crescer novas plantas de geração a partir de uma única peça de tecido que foi cortada de uma planta precursora selecionada ou cultivar. Esse processo permite a reprodução em massa das plantas com o tecido preferido 25 expressando a proteina de fusão. As novas plantas de geração que são produzidas são geneticamente idênticas a, e possuem todas as características de, a planta original. A micro- propagação permite a produção em massa do material de planta 42/164 de qualidade e em um curto periodo de tempo e oferece uma rápida multiplicação de cultivares selecionados na preservação das características da planta transformada ou transgênica original. As vantagens da clonagem de plantas 5 são a velocidade de multiplicação da planta e a qualidade e uniformidade das plantas produzidas.

A micro-propagação é um procedimento multi-etapa que exige a alteração das condições de crescimento ou meio de cultura entre as etapas. Dessa 10 forma, o processo de micro-propagação envolve quatro etapas básicas: Etapa um, cultura do tecido inicial; etapa dois, multiplicação da cultura de tecido; etapa três, diferenciação e formação de planta; e etapa quatro, cultura e endurecimento em estufa. Durante a etapa um, cultura do 15 tecido inicial, a cultura de tecido é estabelecida e certificada como livre de contaminante. Durante a etapa dois, a cultura de tecido inicial é multiplicada até um número suficiente de amostras do tecido ser produzido para atender as metas de produção. Durante a etapa três, as 20 amostras de tecido cultivadas na etapa dois são divididas e cultivadas em plantinhas individuais. Na etapa quatro, as plantinhas transformadas são transferidas a uma estufa para endurecimento, em que a tolerância das plantas à luz é gradualmente aumentada, de modo que pode ser cultivada no 25 ambiente natural. transformadas maduras geradas conforme acima descrito são ainda selecionadas para o traço de interesse (p.ex., FUE 43/164 melhorado, tolerância ao estresse etc.). Os exemplos de tais ensaios de triagem são fornecidos abaixo e na secão de Exemplos que segue. Dessa forma, por exemplo, as plantas transgênicas podem passar por triagem para valor nutricional 5 melhorado (p.ex., teor melhorado de óleo, aminoácidos e/ou proteina, bem como teor de N per se) sob condições normais ou de estresse conforme será ainda descrito abaixo. Alternativamente ou adicionalmente, as plantas transformadas e não transformadas (tipo selvagem) são expostas a uma l(t condição de estresse abiótico, tal como, depravação de água, temperatura sub-ideal, deficiência de nutriente ou preferivelmente uma condição de estresse de sal. 0 estresse de sal pode ser efetuado de diversos modos, tais como, por exemplo, ao irrigar as plantas com uma solução 15 hiperosmótica, ao cultivar as plantas de forma hidropônica em uma solução de crescimento hiperosmótica (p.ex., solução Hoagland) , ou ao cultivar as plantas em um meio de crescimento hiperosmótico (p.ex., meio MS). Considerando que diferentes plantas variam consideravelmente em sua 20 tolerância à salinidade, a concentração de sal na água de irrigação, solução de crescimento ou meio de crescimento é preferivelmente ajustada de acordo com as características especificas do cultivar ou variedade especifica da planta, de modo a infligir um efeito suave ou moderado sobre a 25 fisiologia e/ou morfologia das plantas para diretrizes com relação à concentração apropriada, vide, Bernstein e Kafkafi, Raiz Growth Under Salinity Stress. In: Plant Roots, The Hidden Half 3rd ed. Waisel Y, Eshel A e Kafkafi U. (editors) Marcel Dekker Inc., New York, 2002, e referências là contidas) . Após a exposição à condição de estresse, as plantas são frequentemente monitoradas até os efeitos substanciais fisiológicos e/ou morfológicos em plantas do 5 tipo selvagem. Subsequentemente, as plantas transformadas que não exibem os efeitos substanciais fisiológicos e/ou morfológicos, ou que exibem biomassa maior do que as plantas do tipo selvagem, são identificadas como plantas tolerantes ao estresse abiótico.

Embora a transformação estável é atualmente preferida, a transformação transitória das células de folha, células meristemáticas ou toda a planta também é considerada pela presente invenção.

A transformação transitória 15 pode ser efetuada por quaisquer dos métodos de transferência direta do DNA acima descritos ou por infecção virai utilizando virus modificados de planta.

Os vírus que foram demonstrados como úteis para a transformação de hospedeiros de planta 2» incluem CaMV, TMV e BV. A transformação de plantas usando os vírus de planta é descrita na Patente Norte-Americana N° 4.855.237 (BGV), EP-A 67.553 (TMV), Pedido Publicado Japonês N° 63-14693 (TMV), EPA 194.809 (BV) , EPA 278.667 (BV) ; e Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology: 25 Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp. 172-189 (1988). As partículas pseudo-virais para uso expressando o DNA estrangeiro em muitos hospedeiros, incluindo as plantas, são descritas em WO 87/06261.

Preferivelmente, o virus da presente invenção é avirulento e, assim, é incapaz de provocar diversos sintomas, tais como, taxa reduzida de crescimento, mosaico, marcas de anel, rolo de folha, 5 amarelado, listas, formação de pústula, formação de tumor e formação de sulcos. Um virus avirulento adequado pode ser um virus avirulento naturalmente ocorrente ou um vírus artificialmente atenuado. A atenuação de vírus pode ser efetuada ao usar os métodos bem conhecidos na técnica, 10 incluindo, porém sem limitação, aquecimento sub-letal, tratamento químico ou por técnicas de mutagênese direcionada, tais conforme descrito, por exemplo, por Kurihara e Watanabe (Molecular Plant Pathology 4:259-269, 2003), Gal-on et al. (1992), Atreya et al. (1992) e Huet et 15 al. (1994).

As cepas adequadas de vírus podem ser obtidas das fontes disponíveis, tais como, por exemplo, a Compilação de Cultura de Tipo Norte-Americana (ATCC) ou pelo isolamento das plantas infectadas. isolamento dos vírus dos tecidos infectados de planta pode ser efetuado por técnicas bem conhecidas na técnica, tais conforme descrito, por exemplo, por Foster e Tatlor, Eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998. Brevemente, os tecidos de uma planta infectada acreditados como contendo uma alta concentração de um vírus adequado, preferivelmente folhas jovens e pétalas de flor, são afundados em uma solução tampão (p.ex., solução tampão de fosfato) para produzir uma seiva infectada por virus que pode ser utilizada em inoculações subsequentes.

A construção dos vírus de RNA 5 da planta para a introdução e expressão das seqüências de polinucleotidios exógenas não virais nas plantas é demonstrada pelas referências acima, bem como, por Dawson, W. 0. et al, Virology (1989) 172:285-292; Takamatsu et al . EMBO J. (1987) 6:307-311; French et al Science (1986) |() 231:1294-1297; e Takamatsu et al. FEBS Letters (1990) 269:73-76.

Quando o vírus em um vírus de DNA, as modificações adequadas podem ser feitas ao próprio vírus. Alternativamente, o vírus pode ser primeiro clonado 15 em um plasmídio bacteriano para facilidade de construir o vetor virai desejado com o DNA estranho. 0 vírus pode então ser cortado do plasmídio. Se o vírus for um vírus de DNA, uma origem bacteriana de replicação pode ser ligada ao DNA virai, que é então replicado pela bactéria. A transcrição e 20 a tradução desse DNA produzirão a proteína de revestimento que encapsulará o DNA virai. Se o virus for um vírus de RNA, o vírus é geralmente clonado como um cDNA e inserido em um plasmídio. 0 plasmídio é então usado para realizar todas as construções. 0 vírus de RNA é então produzido pela 25 transcrição da seqüência viral do plasmídio e tradução dos genes virais para produzir a(s) proteína (s) de revestimento que encapsulam o RNA virai.

A construção dos vírus de RNA da planta para a introdução e expressão nas plantas das seqüências de polinucleotidio exógeno não virai, tais como, aquelas incluídas na construção da presente invenção é demonstrada pelas referências acima, bem como na Patente 5 Norte-Americana N° 5.316.931.

Em uma configuração, um polinucleotidio virai de planta é fornecido, em que a seqüência de codificação da proteína de revestimento nativa foi excluída a partir de um polinucleotidio virai, uma 10 seqüência de codificação de proteína de revestimento virai da planta não-nativa e um promotor não nativo, preferivelmente o promotor sub-genômico da seqüência de codificação de proteína de revestimento não-nativa, capaz de expressão no hospedeiro de planta, empacotamento do 15 polinucleotidio recombinante virai de planta, e garantir que uma infecção sistêmica do hospedeiro pelo polinucleotidio recombinante virai de planta, foi inserida. Alternativamente, o gene de proteína de revestimento pode ser desativado por inserção da seqüência de polinucleotídeo 2() não nativa dentro da mesma, de modo que uma proteína seja produzida. 0 polinucleotidio recombinante virai de planta pode conter um ou mais promotores adicionais sub-genômicos não-nativos. Cada promotor sub-genômico não-nativo é capaz de transcrever ou expressar os genes ou seqüências de 25 polinucleotidio adjacentes no hospedeiro de planta e incapaz de recombinação entre si e com promotores sub-genômico nativos. As seqüências de polinucleotidio não-nativas (estranhas) podem ser inseridas adjacentes ao promotor sub 48/164 genômico viral de planta nativa ou os promotores sub- genômicos virais de planta não-nativas e nativas, se mais de uma seqiiência de polinucleotideo for incluída. As seqüências de polinucleotídio não nativos são transcritas ou expressas 5 na planta hospedeira sob controle do promotor sub-genômico para produzir os produtos desejados.

Em uma configuração secundária, um polinucleotídio recombinante viral de planta é fornecido conforme na primeira configuração, exceto que a seqüência de 10 codificação da proteina de revestimento nativa é colocada adjacente a um dos promotores sub-genômico de proteina de revestimento não nativos, ao invés de uma seqüência de codificação de proteina de revestimento não-nativa.

Em uma terceira configuração, 15 um polinucleotídio recombinante viral de planta é fornecido, em que o gene de proteina de revestimento nativo é adjacente ao seu promotor sub-genômico e um ou mais dos promotores sub-genômicos não-nativos foram inseridos no polinucleotídio virai. Os promotores sub-genômicos não-nativos são capazes 20 de transcrever ou expressar os genes adjacentes em um hospedeiro de planta e são capazes de recombinação entre si com os promotores sub-genômicos nativos. As seqüências de polinucleotídio não nativas podem ser inseridas adjacentes aos promotores sub-genômicos virais de planta não nativos, 25 de modo que as seqüências são transcritas ou expressas na planta hospedeira sob controle dos promotores sub-genômicos para produzir o produto desejado.

Em uma quarta configuração, um polinucleotídio recombinante viral de planta é fornecido conforme na terceira configuração, exceto que a seqüência de codificação de proteína de revestimento nativa é substituída por uma seqüência de codificação de proteína de revestimento 5 não-nativa.

Os vetores virais são encapsulados pelas proteínas de revestimento codificadas pelo polinucleotídio recombinante viral de planta para produzir um vírus de planta recombinante. 0 polinucleotídio lo recombinante viral de planta ou vírus de planta recombinante é usado para infectar as plantas hospedeiras apropriadas. 0 polinucleotídio recombinante virai de planta é capaz de replicação no hospedeiro, difusão sistêmica no hospedeiro, e transcrição ou expressão do(s) gene(s) estranho(s) 15 (polinucleotideo exógeno) no hospedeiro para produzir a proteína desejada.

As técnicas para inoculação dos vírus nas plantas podem ser encontradas em Foster e Taylor, eds. "Plant Virology Protocols: From Virus Isolation to 20 Transgenic Resistance (Methods in Molecular Biology (Humana Pr), Vol 81)", Humana Press, 1998; Maramorosh e Koprowski, eds. "Methods in Virology" 7 vols, Academic Press, New York 1967-1984; Hill, S.A. "Methods in Plant Virology", Blackwell, Oxford, 1984; Walkey, D.G.A. "Applied Plant 25 Virology", Wiley, New York, 1985; e Kado e Agrawa, eds.

"Principles and Techniques in Plant Virology", Van Nostrand- Reinhold, New York. polinucleotidio da presente invenção também pode ser introduzido em um genoma de cloroplasto, assim permitindo a expressão do cloroplasto. seqüências de polinucleotidio exógeno ao genoma dos cloroplastos é conhecida. Essa técnica envolve os seguintes procedimentos. Primeiro, as células de planta quimicamente tratadas, de modo a reduzir o número de cloroplastos por célula para cerca de um. Então, polinucleotídeo exógeno é introduzido via bombardeio de partícula das células com o objetivo de introduzir pelo cloroplastos. Os polinucleotideos exógenos selecionados, de modo que são passíveis de integração no genoma do 15 cloroplasto via recombinação homóloga que é prontamente efetuada pelas enzimas inerentes ao cloroplasto. Para essa finalidade, o polinucleotídeo exógeno inclui, além de um gene de interesse, pelo menos um estiramento do polinucleotidio que é derivado a partir do genoma do 20 cloroplasto. Além disso, o polinucleotídeo exógeno inclui um marcador selecionável, que atua por procedimentos substancialmente todas as cópias dos genomas de cloroplasto após tal seleção incluirão o polinucleotídeo exogeno. Os 25 detalhes adicionais relacionados a essa técnica sao averiguados nas Patentes Norte-Americanas N°s 4.945.050; e 5.693.507 que são incorporadas no presente por referência. Um polipeptidio pode assim ser produzido pelo sistema de expressão da proteina do cloroplasto e tornar-se integrado na membrana interna do cloroplasto.

Considerando que os traços da presente invenção (p.ex., NUE e tolerância ao estresse 5 abiótico) nas plantas podem envolver múltiplos genes atuando de modo aditivo ou em sinergia (vide, por exemplo, em Quesda et al., Plant Physiol. 130:951-063, 2002), a presente invenção também considera a expressão de uma pluralidade dos polinucleotideos exógenos em uma única planta hospedeira 10 para assim atingir NUE superior, tolerância, biomassa e/ou produção.

A expressão de uma pluralidade dos polinucleotideos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada pela co-introdução de múltiplas 15 construções de ácido nucléico, cada uma incluindo um diferente polinucleotideo exógeno, em uma única célula de planta. A célula transformada pode ser então regenerada em uma planta madura usando os métodos acima descritos.

Alternativamente, a expressão 20 de uma pluralidade dos polinucleotideos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada pela co-introdução em uma única célula de planta uma única construção de ácido nucléico, incluindo uma pluralidade de diferentes polinucleotideos exógenos. Tal construção pode ser projetada 25 com uma única seqüência de promotor que pode transcrever uma mensagem policistrônica, incluindo todas as diferentes seqüências de polinucleotídio exógeno. Para permitir a co- tradução do diferentes polipeptidios codificados pela 52/164 mensagem policistrônica, as sequências de polinucleotídio podem ser interligadas via uma seqüência de local de entrada de ribossomo interno (IRES) que facilita a tradução das seqüências de polinucleotídio posicionadas a jusante da 5 seqüência IRES. Nesse caso, uma molécula de RNA policistrônica transcrita codificando os diferentes polipeptídios acima descritos será traduzida da extremidade 5'nivelada e duas seqüências internas IRES da molécula de RNA policistrônica, para assim produzir na célula todos os 10 diferentes polipeptídios. Alternativamente, a construção pode incluir diversas seqüências de promotores, cada uma ligada a uma diferente seqüência de polinucleotideo exógeno.

A célula de planta transformada com a construção, incluindo uma pluralidade de diferentes 15 polinucleotídeos exógenos, pode ser regenerada em uma planta madura, usando os métodos acima descritos.

Alternativamente, a expressão de uma pluralidade dos polinucleotídeos exógenos em uma única planta hospedeira pode ser efetuada pela introdução de 20 diferentes construções de ácido nucléico, incluindo diferentes polinucleotídeos exógenos, em uma pluralidade de plantas. As plantas transformadas regeneradas podem ser então criadas de forma cruzada e progénie resultante selecionado para trações superiores, tais como, NUE, 25 tolerância ao estresse abiótico e/ou biomassa, usando as técnicas de criação de planta convencionais.

Conforme acima mencionado, as plantas transgênicas da presente invenção podem ser usadas para melhorar em grande quantidade dos traços comercialmente desejados que são todos inter-relacionados conforme abaixo discutido.

Conforme aqui utilizado, o 5 termo "traço"refere-se a uma característica ou qualidade de uma planta que pode de modo geral (seja direta ou indiretamente) melhorar o valor comercial da planta.

Conforme aqui utilizado, o termo "melhorando" ou "aumentando"refere-se a melhorar ou 10 aumentar o traço da planta transgênica da presente invenção por pelo menos cerca de mais 2 1, mais 5 , mais 10 %, mais 20 %, mais 30 %, mais 40 %, mais 50 %, mais 60 %, mais 70 %, mais 80 %, 90 % ou mais do que a planta não transgênica {p.ex., imitação transfectada ou simples).

Os seguintes são os exemplos ilustrativos dos traços que podem ser melhorados usando os polinucleotideos ou polipeptidios da presente invenção.

Eficiência do uso de fertilizante — Embora o seguinte será melhor elaborado 20 referente à Eficiência do Uso de Nitrogênio (N) (NUE) , deve ser entendido que a presente invenção considera aumento/melhoria da eficiência geral do uso de fertilizante de todos os minerais e metades orgânicas absorvidos do solo, tais como fosfatos (PUE) e potássio (KUE) pelas plantas 25 transgênicas da presente invenção.

A eficiência através da qual o N é usado pela planta é afetada, entre outros, pela eficiência de captação do N e eficiência de utilização do N.

A proporção da quantidade de captação d N pela planta (ou teor de N, kg N) sobre a quantidade do N fornecido/aplicado (kg Ns) é uma eficiência de captação (kg N kg NJ , enquanto a produção de grão (kg grain) para proporção da captação de

N (kg N) é a eficiência de utilização do N (NUE, kg grão kg-1 N) . Vide Moll 1982 Análise e interpretação dos fatores que contribuem para a eficiência da utilização de nitrogênio. Argon. J. 74:562-564. NUE também é efetuado pelas perdas de N através da volatilização de amónia, nitrificação- denitrificação, lixívia e escoamento que diminuem a disponibilidade do N na planta.

Os presentes inventores realizaram que os genes que alteram a arquitetura da raiz podem ser usados para melhorar o NUE. A base racional é para 15 posicionar uma fração superior das raízes nas camadas mais profundas do solo em que o fertilizante é lixiviado ou aumenta a cobertura do solo em que o fertilizante está concentrado. Essa estratégia já foi comprovada de forma bem- sucedida com a deficiência de Fósforo na soja (Miller, CR, I

Ochoa, KL Nielsen, D Beck, JP Lynch. 2003. Genetic variation for adventitious rooting in response to low phosphorus availability: potential utility for phosphorus acquisition from stratified soils. Functional Plant Biology 30:973-985) e milho (Zhu, J, JP Lynch. 2004. The contribution of lateral rooting to phosphorus acquisition efficiency in milho (Zea mays L.) seedlings. Functional Plant Biology 31:949-958) e outras plantas de safra. A morfogênese da raiz dramaticamente afetada pela programação de desenvolvimento, bem como as condições ambientais. A seca leva a um desenvolvimento declinante pronunciado da estrutura da raiz para atingir a água localizada nas camadas mais profundas do solo (vide Figura IA) , enquanto a disponibilidade local do 5 nutriente provoca o amadurecimento local da raiz aumentando a superfície total absortiva do sistema da raiz. 0 desenvolvimento dos sistemas raiz normalmente é altamente assimétrico e reflete a capacidade das raizes de ajustar seu crescimento e desenvolvimento para os fatores ambientais. Os 10 genes e a expressão do gene controlam as alterações de desenvolvimento, conforme é o caso de ANR1: um fator putativo de transcrição com um papel na sinalização de NO. .

Quando ANR1 é regulado de forma descendente por anti-mensageiro ou co-supressão, as linhas 15 transgênicas resultantes são defeituosas em sua resposta de raiz para os suprimentos localizados NO. (Zhang, H.,Forde, B. G. 1998, An Arabidopsis MADS box gene that controls nutriente-induced changes in root architecture, Science 270:407). Consequentemente, a alteração da expressão do 20 polinucleotídeos da presente invenção nas plantas transgênicas pode ter os efeitos desejáveis na moriogênese da raiz, alguns deles poderiam afetar positivamente o NUE e tolerância ao estresse abiótico/biótico e/ou para otimizar a produção e vigor da planta. Os exemplos específicos incluem 25 FUE_7, FUE-16 e FUE_34_Evo.

Adicionalmente, são selecionados aqueles que otimizam o armazenamento intracelular e reduzem a concentração citosólica, assim reduzindo a barreira energética para os transportadores de membrana responsáveis pela captação de diferentes formas do fertilizante. Dessa forma, as taxas superiores da captação de fertilizante podem ser obtidas. De forma semelhante, 5 conforme esperado de qualquer reação enzimática ou via, se o produto da assimilação do fertilizante for removido eficientemente para o ambiente celular, a via enzimática construindo esse produto é esperada para ocorrer na taxa acelerada levando à assimilação melhorada ou eficiência do 10 uso.

Em ainda outra abordagem para melhorar FUE, um terceiro grupo de genes foi identificado. Esses genes sâo relacionados às vias bioquímicas envolvidas na conversão da forma do fertilizante inorgânico para o 15 material orgânico (processo de assimilação) . Os gargalos de liberação no processo de assimilação concederam efeitos prometedores sobre a eficiência otimizada do uso de nutrientes, conforme no caso do fator de transcrição Dofl (Yanagisawa Sd, Akiyama A, Kisaka H, Uchimiya H, Miwa T. 20 Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen assimilation e growth under low- nitrogen conditions. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 May 18;101 (20) :7833-8} . Os genes encontrados usando essa abordagem aliviam os gargalos bioquímicos levando a uma 25 eficiência otimizada do uso de fertilizante. FUE_101 e FUE 102 compreendem uma atividade de transportador e, portanto, podem ser usados para melhorar a captação de nutriente. 57/164

Capacidade de armazenamento as seqüências de polinucleotidio e polipeptidio da presente invenção são instruídas para otimizar a capacidade geral de armazenamento da planta. A capacidade para a produção de 5 grão é pré-determinada pela capacidade da planta de absorver e armazenar o nitrogênio mineral em suas etapas prematuras de desenvolvimento (Hirel et el. Plant Physiol, March 2001, Vol. 125, pp. 1258-1270). Portanto, a capacidade otimizada de armazenamento na forma de nitrato ou aminoácidos 10 altamente tem a probabilidade de aumentar a produção de grão. Essa invenção inclui os mecanismos moleculares para melhorar o nitrogênio ou qualquer capacidade de armazenamento de nutriente metabólico da planta. Os exemplos incluem os aminoácidos, proteína, amido e óleo, fibra, 15 cinza, clorofila e teor de mineral.

O teor de proteína da planta é diretamente relacionado à concentração do N no grão (vide Mosse 1990 J. Agric. Food Chem. 38:18-24). Isso é altamente valioso para melhorar o valor nutricional do alimento. Por 20 exemplo, a alta proteina de consumo por crianças (10 %_ de arroz triturado mostrou crescimento melhorado comparado ao arroz triturado de proteina média de consumo por crianças (6-7 $) [Juliano (1993) Rice in Human Nutrition. IRRI e FAO, Rome]. Assim, as plantas transgênicas que exibem a alta 25 eficiência na nova mobilização do N a partir das partes vegetativas para a parte comestível (p.ex., grão) são altamente valiosas. Considerando que os níveis do nitrogênio na floração determinam a produção do grão, a expressão em excesso das seqüências de polinucleotídio da presente invenção melhorará a produção de grão e/ou otimizará o teor do grão em todo o nível da planta. Além disso, o teor aumentado de soluto da planta impede a evaporação e perda de 5 água devido ao calor, seca, salinidade, osmótico, etc., portanto, melhorando uma melhor tolerância da planta aos estresses acima. A expressão em excesso de FUE_501, FUE_502, FUE_503, FUE_504 ou FUE49, FUE_51, FUE_52, FUE53 ou FUE_100 e FUE_101 é esperada para aumentar a capacidade de armazenamento dos tecidos em que são expressos. Isso pode levar a uma capacidade de submersão mais forte, e para um melhor uso do fertilizante aplicado (especificamente o nitrogênio) devido à absorção otimizada do solo.

Considerando que os níveis de nitrogênio na floração 15 determinam a produção do grão, é esperado que a expressão em excesso dos genes acima também melhorará a produção de grão e/ou melhorar o teor de proteína do grão e todo o nível de proteina da planta. Além disso, o teor aumentado do soluto da planta impedirá a evaporação e perda de água devido ao 20 calor, seca, salinidade, osmótico e semelhante, assim melhorando uma melhor tolerância da planta aos estresses acima.

Senescência atrasada da folha ou "permanência do verde" - prolonga a captação do nutriente 25 por mais tempo no ciclo da planta fornecendo capacidade aumentada para armazenar o nitrogênio e fornecer a fotossíntese durante o enchimento do grão. Se uma planta possuir mais folhas verdes no período de polinização, mais nitrogênio estará disponível para redistribuição às sementes provocando uma melhoria na eficiência do uso de fertilizante e provavelmente a produção de grão. Alguns dos genes apresentados nesta invenção aumentam o traço de "permanência 5 do verde" ou exibem crescimento otimizado (crescimento mais rápido e/ou folhas e talos maiores) como um mecanismo para melhorar a eficiência do uso de fertilizante, produção de grão e tolerância geral ao estresse da planta.

A invertase é uma enzima que é K) conhecida por atrasar a senescência quando expressa sob um promotor ativado por senescência (Balibrea Lara, et al. Plant Cell 16: 1276-1287, 2004). FUE 30 e FUE 31 possuem uma atividade prevista de invertase e, portanto, pode prolongar as características de permanência do verde da planta e, 15 portanto, aumentar a capacidade geral para armazenar o nitrogênio nas plantas para redistribuição durante o enchimento de grão.

A citocinina é envolvida, entre outros processos, na inibição da senescência de folha. FUE__55 é um gene com uma semelhança notável ao isopenteniltransferase tRNA, uma importante enzima na via metabólica da citocinina. A expressão aumentada de FUE_55 nas raízes ou brotos aumentará os níveis da citocinina levando à expansão otimizada da folha e duplicação da 25 célula, senescência atrasada, resistência aumentada de submersão dos tecidos, utilização otimizada do nitrogênio, etc.

A zeatina é uma citocinina naturalmente ocorrente. FUE_505 é um fato de transcrição contendo domínio AP2 putativo que, com base nos experimentos de micro-agrupamento, ela aglomera-se firmemente junta com os genes de ARR (reguladores de resposta de Arabidopsis) que 5 mediam a resposta do broto to citocinina. Os genes de ARR são a Zeatina responsiva e são induzidos após a adição do nitrogênio às plantas deficientes em nitrogênio. A co~ regulação de FUE_505 junto com os ARRs indica um papel na resposta de citocinina. É altamente provável que a expressão 10 constitutiva de FUE_505 atrasará a senescência de folha e melhorará a utilização do nitrogênio e crescimento de planta devido à ativação continua da resposta de citocinina do broto.

Tolerância ao estresse - As 15 plantas transgênicas da presente invenção são esperadas para exibir tolerância ao estresse abiótico e biótico. 0 termo "estresse" aqui utilizado refere-se a qualquer efeito adverso sobre o metabolismo, crescimento, reprodução e/ou viabilidade de uma 20 planta. De forma correspondente, o estresse abiótico pode ser induzido pelas condições sub-ideais de crescimento ambiental, tais como, por exemplo, salinidade, depravação de água, inundação, congelamento, baixa ou alta temperatura, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, deficiência de 25 nutriente (também incluindo inacessibilidade de nutriente, tal como, devido à lixiviação), poluição atmosférica ou irradiação UV. O estresse biótico pode ser induzido, por exemplo, por patógenos que são encontrados no ambiente.

A frase "tolerância ao estresse"conforme aqui utilizada refere-se à capacidade de uma planta de suportar um estresse (abiótico) sem sofrer uma alteração substancial no metabolismo, crescimento, 5 produtividade e/ou viabilidade. Preferivelmente, as plantas geneticamente projetadas da presente invenção exigem pelo menos cerca de mais 2%, mais 5 %, mais 10 %, mais 20 %, mais 30 %, mais 40 %, mais 50 %, mais 60 è,mais 70 %, mais 80 %, mais 90 % ou ainda tolerância mais alta ao estresse abiótico 10 do que as plantas não transgênicas.

As plantas são sujeitas a uma faixa de desafios ambientais. Diversos desses, incluindo estresse por sal, estresse osmótico geral, estresse por seca e estresse por congelamento, possuem a capacidade de ter o 15 impacto sobre toda a planta e disponibilidade de água celular. De forma não surpreendente, então, as respostas de planta para essa compilação de estresses são relacionadas. Em uma revisão recente, Zhu observou que "a maioria dos estudos sobre sinalização do estresse de água enfocaram no 20 estresse de sal principalmente devido às respostas de planta ao sal e seca serem estreitamente relacionadas e os mecanismos sobrepõem-se" (Zhu (2002) Ann. Rev. Plant Biol. 53: 247-273) . Muitos exemplos de respostas e vias semelhantes para esse conjunto de estresses foram 25 documentados. Por exemplo, os fatores da transcrição de CBF foram demonstrados para condicionar a resistência ao sal, congelamento e seca (Kasuga et al. (1999) Nature Biotech. 17; 287-291) . O gene de rd29B Arabidopsis é induzido em resposta aos estresses de sal e desidratação, um processo que é amplamente mediado através de um processo de transdução do sinal ABA (Uno et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 97: 11632-11637), resultando em atividade alterada 5 dos fatores de transcrição que se aglutinam a um. elemento a montante dentro do promotor rd29B. Na Mesembryanthemum crystallinum (planta de gelo), Patharker e Cushman demonstraram que uma quinase de proteína dependente de cálcio (McCDPKl) é induzida pela exposição aos estresses de 10 seca e sal (Patharker e Cushman (2000) Plant J. 24: 679- 691). A quinase induzida por estresse também foi mostrada para fosforilar um fator de transcrição, presumivelmente alterando sua atividade, embora os níveis de transcrição do fator alvo de transcrição não sejam alterados em resposta ao 15 estresse de sal ou seca. De forma semelhante, Saijo et al. demonstraram que uma quinase de proteína dependente de calmodulina induzida por sal/seca do arroz (OsCDPK7) conferiu a tolerância aumentada ao sal e seca do arroz quando expresso em excesso (Saijo et al. (2000) Plant J. 23: 20 319-327) . invoca estratégias semelhantes de sobrevivência nas plantas, assim como o estresse de congelamento (vide, por exemplo, íelenosky (1989) Plant Physiol 89: 444-451) e o estresse de 25 seca induz a tolerância ao congelamento (vide, por exemplo,

Siminovitch et al. (1982) Plant Physiol 69: 250-255; e Guy et al. (1992) Plant 188: 265-270). Além da indução das proteínas de aclimatização ao frio, as estratégias que permitir as plantas para sobreviver em condições de pouca água podem incluir, por exemplo, área de superfície reduzida, ou produção de cera ou óleo de superfície. Em outro exemplo, o teor aumentado de soluto da planta impede a 5 evaporação e perda de água devido ao calor, seca, salinidade, osmótico e semelhante, portanto, fornecendo uma melhor tolerância da planta aos estresses acima. envolvidas na resistência a um estresse (conforme acima lo descrito), também estarão envolvidas na resistência aos outros estresses, regulados pelos mesmos genes ou genes homólogos. Claramente, as vias gerais de resistência são relacionadas, não idênticas e, portanto, nem todos os genes controlando a resistência a um estresse controlarão a 15 resistência aos outros estresses. Não obstante, se uma resistência das condições do gene a um desses estresses, seria aparente para aquele com habilidade na técnica para testar a resistência a esses estresses relacionados. Os métodos para avaliar a resistência ao estresse são ainda 20 fornecidos na seção de Exemplos que segue.

A capacidade das plantas transgênicas da presente invenção de suportar o estresse é esperada para afetar a biomassa, vigor e produção da planta. 0 oposto também é antecipado para apresentar bons 25 resultados, essencialmente, biomassa, vigor e/ou produção melhorados são esperados para melhorar a durabilidade das plantas transgênicas da presente invenção às condições de estresse. 64/164

Conforme aqui utilizado, a frase "biomassa da planta" refere-se à quantia ou quantidade do tecido produzido a partir da planta em uma temporada de crescimento, que também poderia determinar ou afetar a 5 produção da planta ou a produção por área de crescimento.

Conforme aqui utilizado, o termo "vigor da planta" refere-se à quantia ou quantidade do tecido produzido a partir da planta em determinado tempo. Assim, o vigor aumentado poderia determinar ou afetar a 10 produção da planta ou a produção por tempo de crescimento ou área de crescimento.

Conforme aqui utilizado, a frase "produção da planta" refere-se à quantia ou quantidade do tecido produzido e colhido como o produto produzido da 15 planta. Assim, a produção aumentada poderia afetar o beneficio econômico obtido da planta em determinado tempo de crescimento.

Para analisar o efeito do transgene em uma fisiologia da planta, a produção e biomassa 20 geral podem ser avaliadas, a tolerância da plantas à deficiência do fertilizante e aos estresses abiõticos, tais como, estresses de seca, salinidade, frio e calor, congelamento, etc. Também de grande importância é avaliar se a planta ou qualquer de suas partes contém um teor aumentado 25 de proteína, livre de aminoácidos, óleo e quaisquer outros compostos metabólicos de valor.

O seguinte resume os ensaios que podem ser usados para qualificar as plantas transgênicas ou transgenes da presente invenção (a descrição adicional desses e outros ensaios é fornecida na seção de Exemplos que segue).

Eficiência do uso de 5 fertilizante - Para analisar se as plantas transgênicas são mais responsivas aos fertilizantes, as plantas são cultivadas em pratos de ágar ou vasos com uma quantidade limitada de fertilizante. As plantas são analisadas por seu tamanho geral, tempo para floração, produção, teor de 10 proteina do broto e/ou grão. Uma metodologia de exemplo de um teste para eficiência do uso de fertilizante é fornecida no trabalho por Yanagisawa et al (Proc Natl Acad Sei U S A. 2004; 101:7833-8) em que as sementes de Arabidopsis transgênico são verificadas para as taxas de crescimento sob 15 condições limitantes de nitrogênio (por exemplo, em 0,01 mM, 0,05 mM 0,15 mM, 0,3 mM, 1 mM, 3 mM de Nitrogênio na forma de nitrato e amónia). Os parâmetros verificados são o tamanho geral da planta madura, seu peso seco e úmido, o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o 20 número das sementes produzidas por planta. Outros parâmetros que podem ser testados são: o teor de clorofila das folhas (como o status de planta do nitrogênio e o grau de frescor da folha é altamente correlacionado), teor total de aminoácido e de proteina das sementes ou outras partes da 25 planta, tais como, folhas ou brotos, teor de óleo, etc. De forma semelhante, ao invés de fornecer o nitrogênio nas quantidades limitantes, o Fosfato ou Potássio pode ser adicionado em concentrações crescentes. Novamente, os mesmos parâmetros medidos são os mesmos conforme acima listado. Dessa forma, além da Eficiência do Uso de Nitrogênio (NUE) , a Eficiência do Uso de Fosfato (PUE) e a Eficiência do Uso de Potássio (KUE) são avaliadas, verificando a capacidade 5 das plantas transgênicas de prosperar sob condições restringentes de nutriente.

Determinação do Nitrogênio - 0 procedimento para determinação da concentração do N nas partes estruturas das plantas envolve o método de digestão 10 do persulfato de potássio para converter o N orgânico para NO.' (Purcell e King 1996 Argon. J. 88:111-113, a redução do Cd'modificado mediante de NOU to NO/ (Vodovotz 1996 Biotechniques 20:390-394) e a medição de nitrite pelo ensaio Griess (Vodovotz 1996, supra). Os valores de absorvência são 15 medidos em 550 nm contra uma curva padrão de NaNO . O procedimento é descrito em detalhes em Samonte et al. 2006 Agron. J. 98:168-176.

Concentração da proteina do grão - O teor de proteína do grão (g proteína de grão m-"') é 20 estimado como o produto da massa do N de grão (g grão N nf ) multiplicado por N/proporção de conversão da proteína de k- 5,13 (Mosse 1990, supra). Uma concentração da proteína do grão é estimada como a proporção do teor de proteína do grão por massa unitária do grão (g proteína do grão kg-1 grão).

Teor de óleo - A quantidade do óleo expressa como uma porcentagem do peso seco. O teor de óleo é definido como a quantidade máxima do material (lipídio) que pode ser removida da semente por extração com solventes específicos (normalmente hexano ou éter de petróleo). O teor de óleo é medido diretamente ao triturar a semente e extrair o óleo em um extrator contínuo. A análise indireta do teor de óleo pode ser realizada utilizando a

Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (NMR) ou Espectroscopia de Infravermelho Próximo (NI) . A técnica de NMR mede a energia de ressonância absorvida pelos átomos de hidrogênio no estado líquido da amostra, enquanto NI utiliza a absorção da energia infravermelha próxima (1100-2500 nm) 10 pela amostra. Enquanto a precisão dos métodos de NIR não é tão boa quanto os métodos de extração, os métodos de NMR fornecem resultados muito precisos e exatos quando calibrados cuidadosamente.

Ensaio de tolerância à 15 seca/Ensaio osmótico - A tolerância à seca é realizada para identificar os genes que conferem melhor sobrevivência da planta após depravação aguda de água. Para analisar se as plantas transgênicas são mais tolerantes à seca, um estresse osmótico produzido pelo sorbitol de osmolite não iônico no 2o meio realizado. O controle e plantas transgênicas são germinados e cultivados em pratos de ágar de planta por 4 dias, após os quais eles são transferidos aos pratos contendo 500 mM de sorbitol. 0 tratamento provoca a retardação do crescimento, então as plantas de controle e 25 transgênicas são comparadas, ao medir o peso da planta (seca e úmida), produção e pelas taxas de crescimento medidas conforme o momento para floração.

De forma oposta, as triagens de seca com base em solo são realizadas com as plantas expressando em excesso os genes candidatos acima detalhados. As sementes das plantas de controle de Arabidopsis, ou outras plantas transgênicas expressando em excesso ou 5 silenciando um polipeptidio da invenção são germinadas e transferidas aos vasos. 0 estresse de seca é obtido após a irrigação é interrompida, acompanhada pela colocação dos vasos em papel absorvente de modo a otimizar a taxa de secagem do solo. As plantas transgênicas e de controle são 10 comparadas entre si quando a maioria das plantas de controle desenvolve o desvigor grave. As plantas foram regadas novamente após a obtenção de uma fração significativa das plantas de controle exibindo um desvigor grave. As plantas são classificadas comparando aos controles para cada um dos 15 dois critérios: tolerância às condições de seca e recuperação (sobrevivência) após nova rega.

Ensaio de tolerância à salinidade - As plantas transgênicas com tolerância ao alto sal são esperadas para exibir melhor germinação, vigor de 20 muda ou crescimento em alto sal. As plantas diferem em sua tolerância ao NaCl, dependendo de sua etapa de desenvolvimento, portanto, a germinação de semente, vigor da muda e respostas de crescimento da planta são avaliadas. Um teste de tolerância à salinidade está obtendo as plantas em 25 diferentes etapas de desenvolvimento e irrigá-las com concentrações crescentes de NaCl (por exemplo 50 mM, 100 mM, 200 mH, 400 mM) aplicadas a partir de baixo para cima de modo a garantir a dispersão uniforme do sal. As plantas transgênicas são comparadas às plantas de controle em sua aparência fenotípica externa, grau de desvigor e sucesso geral para atingir a maturidade e progénie de produção em concentrações inibitórias às plantas de controle. Os 5 parâmetros quantitativos da tolerância medida são, o peso médio de seco e úmido, e o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios de NaCl e manitol) são conduzidos para determinar se 10 um fenótipo de estresse osmótico era especifico do NaCl ou se era um fenótipo geral relacionado ao estresse osmótico. As plantas tolerantes ao estresse osmótico também poderiam ter mais tolerância à seca e/ou congelamento. Para os experimentos de germinação de estresse de sal e osmótico, o 15 meio é complementado, por exemplo, com 50mM, lOOmM, 200 mM de NaCl ou lOOmM, 200 mM de NaCl, 400 mM de manitol.

Tolerância ao estresse de frio - Para analisar o estresse de frio, as plantas maduras (25 dias) são transferidas para câmaras de 4 °C por 1 ou 2 20 semanas, com luz constitutiva. Após isso, as plantas são colocadas de volta na estufa. Duas semanas depois, os danos do período de frio, resultando em retardação de crescimento e outros fenótipos, são comparados entre as plantas de controle e plantas transgênicas, ao medir o peso da planta 25 (seca e úmida) , e ao comparar as taxas de crescimento medidas como o tempo para floração, tamanho da planta, produção, etc.

A tolerância ao estresse de calor é atingida ao expor as plantas em temperaturas acima de 34 °C por determinado periodo. A tolerância de planta é examinada após a transferência das plantas de volta a 22 °C para recuperação 5 e avaliação após 5 dias relacionada aos controles internos (plantas não transgênicas) ou plantas não expostas ao estresse de frio ou calor.

Os testes de germinação comparam a porcentagem das sementes das plantas transgênicas que poderiam concluir o processo de germinação à porcentagem das sementes das plantas de controle que são tratadas da mesma forma. As condições normais são consideradas, por exemplo, incubações em 22 °C, sob luz de 22 horas com ciclos diários de 2 horas de escuro. A avaliação da germinação e vigor da muda é conduzida entre os dias 4 e 14 após a plantação. O meio basal é o meio Murashige-Skoog de 50;; (MS)+vitaminas.

A germinação também é verificada em condições desfavoráveis, tais como, frio (incubação em temperaturas inferiores a 10 °C, ao invés de °C) ou usando as soluções de absorção da semente que contêm altas concentrações de um osmólito, tal como, sorbitol (em concentrações de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM, e até 1000 mM) ou aplicação de concentrações crescentes de sal (de 50 mM, 100 mM, 200 mM, 300 mM, 500 mM de NaCl).

Os métodos ensaiar o vigor da planta, produção e biomassa são bem-conhecidos na técnica 71/164 (vide Exemplo 9 e Exemplo 10).

A presente invenção também é valiosa para fins de procriação e ornamentais. Assim, é considerado que as seqüências de polinucleotideo e 5 polipeptídio da presente invenção, que são associadas com a arquitetura da raiz (FUE_34_Evo, SEQ ID N°: 54, vide também Exemplo 11 e Figura 8), também podem ser usadas para controlar o broto de planta e, como tais, poderão ser reguladas de forma ascendente ou reguladas de forma l() descendente para controlar a ramificação e broto. Os métodos para regular de modo descendente a expressão de gene nas plantas são bem-conhecidos na técnica.

Dessa forma, a presente invenção é de alto valor agricola para promover traços 15 comercialmente desejados nas plantas de safra.

Conforme aqui utilizado, o termo "cerca de"refere-se a + 10 t.

Os objetos adicionais, vantagens e novas características da presente invenção 20 tornar-se-ão aparentes para aqueles com habilidade na técnica mediante o exame dos seguintes exemplos, que não têm a intenção de serem limitantes. Adicionalmente, cada uma das diversas configurações e aspectos da presente invenção, conforme abaixo delineada e conforme reivindicada na seção 25 de reivindicações abaixo, encontra suporte experimental nos seguintes exemplos.

EXEMPLOS

Referência agora é feita aos seguintes exemplos, que junto com as descrições acima, ilustram a invenção de uma forma não limitante.

De modo geral, a nomenclatura aqui utilizada e os procedimentos laboratoriais utilizados 5 na presente invenção incluem as técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas e de DNA recombinante. Tais técnicas são totalmente explicadas na literatura. Vide, por exemplo, "Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et at., (1989); "Current Protocols in Molecular Biology" io Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley e Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988); Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, 15 New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); metodologias conforme estabelecidas nas Patentes Norte-Americanas N°s 4.666.828; 4.683.202; 4.801.531; 5.192.659 e 5.272.057; "Cell Biology: A 20 Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994); "Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites et al. (eds), "Basic and Clinical Immunology"(8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell e Shiigi (eds), "Selected 25 Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman e Co., New York (1980); os imuno-ensaios disponíveis são extensivamente descritos na patente e literatura científica, vide, por exemplo, Patentes Norte-Americanas N°s 3.791.932; 3.839.153; 3.850.752; 3.850.578; 3.853.987; 3.867.517; 3.879.262; 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; 4.098.876; 4.879.219; 5.011.771 e 5.281.521; "Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984); 5 "Nucleic Acid Hybridization" Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1985); "Transcription and Translation" Hames, B. D., e Higgins S. J., Eds. (1984); "Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986); "A Practical Guide to Molecular Cloning" 10 Perbal, B., (1984) e "Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press; "PCR Protocols: A Guide to Methods And Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press 15 (1996); todos os quais são incorporados por referência como se totalmente aqui estabelecidos. As outras referências gerais são fornecidas por todo este documento. Os procedimentos são lá acreditados como sendo bem conhecidos na técnica e são fornecimento para conveniência do leitor. 20 Todas as informações lá contidas são aqui incorporadas por referência. EXEMPLO 1

Identificação de polinucleotidio e predição do papel do gene usando 25 ferramentas moleculares e de bioinformática

Os polinucleotideos, adequados para aumentar FUE e/ou tolerância ao estresse abiótico ou biótico, foram identificados por análise profunda dos perfis de expressão do RNA, semelhanças da seqüência, anotações de gene, vias bioquímicas, DNA, ESTs, bancos de dados de expressão e proteina, que são publicamente disponíveis e usados como dados de entrada em uma série de algoritmos 5 computacionais proprietários que permitem a mineração hábil de dados.

A associação de traço foi realizada usando a caracterização precisa de expressão através de PCR em Tempo Real quantitativo, para 10 correlacionar entre os niveis de expressão em diferentes tecidos e sob condições especificas de crescimento para elucidar a função do polinucleotídio expresso.

Materiais e Métodos

Identificação das seqüências de 15 polinucleotídio associadas com FUE aumentado

A presente metodologia é com base em três etapas, descritas nos seguintes exemplos, essencialmente a caracterização bioinformática, análise molecular e validação na planta. Acima está uma descrição do 20 algoritmo bioinformático. A. Caracterização bioinformática: Aglutinação das seqüências de DNA em agrupamentos de gene - O objetivo do agrupamento de 25 EST (Rótulo de Seqüência Expressa) é o de incorporar todos os ESTs que compartilham uma transcrição ou gene precursor ao mesmo agrupamento. Tipicamente, os ESTs agrupados são montados em um ou mais seqüências de consenso (clones) que refletem a diversidade da transcrição, fornecendo esses clones, de modo que as informações que contêm refletem de modo mais verdadeiro a biologia amostrada. Um agrupamento de gene é fragmentado, os dados de EST e (se conhecido) dados 5 de seqüência do mRNA de gene, consolidados, colocados no contexto correto e indexados pelo gene, de modo que todos os dados expressos referentes a um único gene esta em uma única classe de indice, e cada classe de indice contém as informações para somente um gene (Burke et al, 1999, K) D2_cluster: A Validated Method for Clustering EST and Full- length cDNA Sequences. Genome Research, 9(11), 1135- 1142). A (http://www.cgen.com/research/Publications/LEADSwhitepaper.p df) foi usada para a montagem. Cálculo da expressão digital para todos os agrupamentos de gene em diversas espécies de planta - A expressão digital, também conhecida como electronic northern blot, compara as ocorrências de grande número de ESTs aleatórios das oscilações de cDNA não 20 normalizadas. A variação na freqüência relativa de tais rótulos, variação na freqüência relativa de tais rótulos, armazenados em bancos de dados, é então usada para elucidar a expressão diferencial dos genes correspondentes. Os dados de Digital Northern podem ser usados para fornecer avaliação 25 quantitativa de expressão diferencial entre os diferentes órgãos na planta ou em diferentes estados fisiológicos (estresse versus normal). Essa ferramenta exibe os perfis virtuais de expressão dos genes com base nas seqüências de

EST formando o agrupamento. A ferramenta pode fornecer o perfil de expressão de um agrupamento em termos da anatomia da planta (i.e., em quais tecidos/órgãos o gene é expresso), etapa de desenvolvimento (i.e., as etapas de desenvolvimento em que um gene pode ser averiguado) e perfil de tratamento (i.e., fornece as condições fisiológicas sob as quais um gene é expresso, tais como, seca, frio, infecção por patógeno e semelhante) . Considerando uma distribuição aleatória de ESTs nos agrupamentos diferentes, a expressão digital fornece um valor de probabilidade que descreve a probabilidade de um agrupamento com um total de N ESTs para conter to X ESTs a partir de determinada compilação de oscilações. Para os cálculos de probabilidade do seguinte, é considerado: a) o número de ESTs no agrupamento, b) o número de ESTs originando-se de uma oscilação especifica ou um grupo de oscilações relacionadas, c) o número geral de ESTs disponíveis representando as espécies. Dessa forma, os agrupamentos com baixos valores de probabilidade são altamente enriquecidos com ESTs a partir do grupo de oscilações de interesse indicando uma expressão especializada. Além disso, um vocabulário proprietário (compêndio limitado de termos) é usado que considera a anotação de cada oscilação de EST e utiliza palavras-chave especificas para descrever os dados experimentais associados com as seqüências com relação ao tipo de tecido, tratamento e etapas de desenvolvimento. Os termos escolhidos do vocabulário proprietário são combinados com a expressão digital calculada para construir um perfil de expressão para cada gene especifico, com base na fonte de oscilações que fornecem as seqüências ao agrupamento de gene. Uma representação estatística e gráfica desse perfil é construída para os cálculos da expressão digital. Devido às 5 anotações serem de um vocabulário controlado, todo o banco de dados é dividido com palavras-chave especificas descrevendo os tecidos específicos, etapas de desenvolvimento ou tratamento.

Integração de todos os dados 10 relevantes para cada gene, incluindo os dados de expressão a partir dos experimentos de micro-arranjo, expressão digital, anotação, ontologia, familias de gene, motivos conservados e semelhantes - Uma ferramenta proprietária que cria os grupos de genes ortólogos a partir de bancos de dados genômicos de 15 múltiplas espécies de planta é usada. Com a finalidade de fornecer o suporte adicional aos genes identificados, os genes ortólogos ou o grupo ortólogo são testados como um todo para ver o envolvimento do traço de interesse de acordo com as palavras-chave que são mais significativas em sua 20 expressão digital calculada.

Seleção do gene - Isso é realizado de acordo com diversas assunções biologicamente idôneas para examinar o banco de dados acima descrito. A seleção de gene é realizada pela filtragem de grupos 25 específicos dos genes usando critérios cuidadosamente selecionados. 0 conjunto final de genes deve conter um número limitado de genes, que poderiam ser manipulados na seguinte análise molecular e experimentos transgênicas. Os diferentes critérios aqui utilizados são descritos em maiores detalhes para cada gene abaixo.

A seleção de gene para esta invenção considera diversos conceitos amplamente aceitos na 5 ciência de planta. As deficiências de nutriente provocam adaptações da arquitetura da raiz, especificamente de forma notável, por exemplo, é a proliferação da raiz dentro das porções ricas em nutriente para aumentar a captação de nutriente. As deficiências de nutriente também provocam a 10 ativação das vias metabólicas da planta, o que maximiza os processos de absorção e assimilação. Nesse processo, os genes são acionados e ativados provocando a alteração arquitetural (Jose Lopez-Bucio et al, The role of nutrient availability in regulating root architecture, Current

Opinion in Plant Biology 2003, 6:280-287) . A engenharia da expressão dos genes acionados pode fazer com que a planta exiba as alterações arquiteturais e o metabolismo otimizado também sob outras condições. Segundo, é amplamente conhecido que as plantas normalmente respondem à seca ao criar um sistema mais profundo de raiz que permite o acesso à umidade localizada em camadas mais profundas do solo (Morgan, J.M., A.G. Condon. 1986. Water use, production of grain, e osmoregulation in wheat. Aust. J. Plant Physiol. 13:523-532 e Yiwei Jiang e Bingru Huang, 2001, Crop Science 41:1168- 25 1173). 0 acionamento desse efeito permitirá que as plantas acessem os nutrientes localizados em horizontes mais profundos do solo, especificamente aqueles prontamente dissolvidos em água, como nitratos. Terceiro, diferentes estresses abióticos (p.ex., seca, osmótico, frio, calor, radiação, salinidade, deficiências de nutriente e semelhantes) deduzem sua resposta usando: vias especificas do estresse, bem como vias comuns de estresse (Gabriela M. 5 Pastori e Christine H. Foyer, Common Components, Newtorks, and Pathways of Cross-Tolerance to Stress, Plant Physiol., June 2002, Vol. 129, PP. 460-468) . Isso fornece a possibilidade de distinguir entre os genes que estão envolvidos em cada via.

A resposta da planta ao estresse é dispendiosa em termos de energia, conforme tal afeta o rendimento da planta. A engenharia precisa dos genes específicos fornece a capacidade de ativar somente parcialmente uma resposta de estresse sem provocar a perda 15 concomitante no rendimento. De forma correspondente, diversas pesquisas para distinguir os genes que são ativados durante as respostas comuns e especificas de estresse foram realizadas. Considerando que algumas respostas de planta, tais como, sistema de raiz otimizado ou capacidades superiores de armazenamento, são altamente preferidas da mesma forma nas condições ideais de crescimento, a presente invenção considera a criação das plantas modificadas com FUE melhorado que demonstra, além disso, também resposta otimizada aos outros estresses abióticos de planta que 25 provocam efeitos adversos no rendimento.

Para fins de identificação dos genes melhorando o FUE, as seqüências de transcrição do mRNA 23563 e EST 416899 do Milho foram extraídas da liberação

Genbank 145 (dezembro de 2004), limpas por triagem para vetores, seqüências de baixa complexidade e repetições conhecidas dos bancos de dados públicos, e então agrupadas e montadas em clones usando a plataforma LEADS da Compugen.

As oscilações de EST no Genbank 146 para Milho e outras espécies, tais como, Soja, Tomate, Cevada, Sorgo, Arroz, Algodão, Trigo e Arabidopsis, foram examinadas e anotadas usando palavras-chave descrevendo o tecido de planta usado, o tratamento aplicado para cultivar as plantas e etapa de desenvolvimento das plantas quando os tecidos foram obtidos. Um valor de significância foi designado à freqüência de ESTs em cada clone a partir de cada oscilação de EST ou conjunto de oscilações compartilhando a mesma anotação. O valor de significância foi com base em um teste estatístico que considera o número de EST de determinada categoria no clone, o número desses ESTs em toda a produção, o tamanho e clone e número total de ESTs na produção. Tabela 2: Expressão Digital de FUE_1 no milho: Anatomia

Tabela 3: Expressão digital do grupo ortólogo FUE_1: Anatomia

FUE _2 é uma proteína de função desconhecida exigindo uma expressão digital ligando-a às 5 raizes e especificamente às raízes sob estresse de seca. FUE_3 é uma proteína de transferência de lipídio não especifica putativa expressa especificamente nas raízes no milho (Tabela 4 e Tabela 5) , porém também na cevada e arroz. Sua expressão nas raízes sob 1() seca é conservada por toda a evolução no sorgo, milho, arroz e cevada (conforme mostrado nas Tabela 6 e 7) . Existem indicações que o gene também é expresso sob estresse de salinidade na cevada e arroz e sob deficiência de nitrogênio na cevada. Tabela 4: Expressão digital de FUE_3 no milho: Anatomia

Tabela 5: Expressão digital de FUE 3 no milho: Tratamento

Tabela 6: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_3: Anatomia

Tabela 7: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_3: Tratamento

FUE-4 também é uma proteína de função desconhecida exibindo a expressão digital especifica sob estresse de seca (conforme mostrado na Tabela 8 e 9) . Tabela 8: Expressão digital de FUE_4 no milho: Anatomia

Tabela 9: Expressão digital de FUE_4 no milho: Tratamento

FUE_5 é um complexo de reductase C de Ubiquinol-citocromo C, como proteína, expressando sob diversos estresses e especificamente sob 5 seca e salinidade no milho (conforme mostrado na Tabela 10) e raízes de arroz. Tabela 10: Expressão digital de FUE_5 no milho: Tratamento

FUE_6 exibe homologia à proteína de dedo de zinco associada ao estresse, expressa no milho durante o desenvolvimento de grão e nas raízes, especificamente sob estresse de seca (conforme mostrado nas 5 Tabelas 11 e 12, respectivamente). Os presentes inventores revelaram que FUE_6 e FUE_40 são parte da mesma transcrição. FUE_6 representa a região 5' da transcrição, enquanto FUE40 a região 3'. Para conveniência, a transcrição é apresentada no presente sob o nome FUE_40. Tabela 11: Expressão digital de FUE_6 no milho: Anatomia

Tabela 12: Expressão digital de FUE_6 no milho: Tratamento

FUE_7 é uma proteína hipotética exibindo semelhança à proteína anti-congelamento expressa predominantemente na cevada e milho nas raízes e com urna expressão mais evidente durante o estresse de seca (conforme mostrado na Tabela 13 e 14) . Tabela 13: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_7: Anatomia

Tabela 14: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_7: Tratamento

FUE_8 exibe homologia a tioesterase Acyl-ACP e expresso nas raízes de milho sob estresse de seca (conforme mostrado na Tabela 15). Os ortólogos de sorgo e arroz também mostram uma associação 10 clara com a seca, conforme revelado pela fonte das • seqüências compondo os genes. Tabela 15: Expressão digital de FUE_8 no milho: Anatomia

FUE_9 é uma proteina hipotética expressa nas raízes de milho sob estresse de seca. 15 FUE_10 exibe homologia às proteínas associadas ao transporte do elétron, exibindo uma forte expressão de raiz exclusivamente associada com a seca no milho (conforme mostrado na Tabela 16 e 17) e aos outros estresses abióticos conforme averiguado para sua expressão ortóloga na soja. Tabela 16: Expressão digital de FUE_10 no milho: Anatomia

Tabela 17: Expressão digital de FUE_10 no milho: Tratamento

FUE 11 exibe homologia à proteina induzida por impedância fisica e é expresso no milho nas raizes também durante os estresse de seca. FUE_12 é uma proteina desconhecida expressa nas raizes de milho sob estresse de 10 água 5 (seca) e em outros estresses abióticos, tais como, seca na cevada e sob deficiência de nitrogênio e estresse de calor no sorgo. FUE_13 exibe homologia à proteina relacionada a Patogênese 10, e é expressa é diferentes estresses no milho (seca, patógenos como Fusarium). Os ortólogos de cevada e arroz são fortemente expressos especificamente sob estresses abióticos e bióticos ligando essa proteina à resposta de planta ubíqua ao estresse. 5 FUE14 é uma proteina do milho exibindo homologia à proteína semelhante a Germina 6. A expressão digital de seu ortólogo de cevada liga essa proteína à resposta de patógeno, bem como à resposta de seca e deficiência de nitrogênio. FUE_15 é uma proteína regulada por auxina putativa expressa nas raízes de milho. Seus ortólogos da cevada, arroz e são relacionados à seca, bem como outros estresses abióticos e bióticos, tais como, resposta de patógeno. No tomate e soja, a proteína é ligada 15 à resposta aos patógenos e deficiências de nutriente. FUE 16 é uma proteína semelhante a Uclacianina 3, expressa fortemente nas raizes de milho sob estresse de água (conforme mostrado na Tabela 18 e 19) . Seus ortólogos da cevada, arroz, soja e tomate 20 também são expressos nas raízes, porém envolvidos na resposta aos outros estresses abióticos e bióticos especificamente a resposta à luz (conforme mostrado na Tabela 20 e 21) . Tabela 18: Expressão digital de FUE 16 no milho: Anatomia

Tabela 19: Expressão digital de FUE16 no milho: Tratamento

Tabela 20: Expressão digital do grupo ortólogo de Fuel_16: Anatomia

Tabela 21: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_16:

hipotética exibindo uma expressão digital no milho e outras espécies de planta ligando-a à resposta da seca (milho, cevada e sorgo), aos patógenos (arroz, soja e tomate) e à 5 deficiência de nitrogênio e submersão na cevada. FUE30 e FUE_31 foram selecionados devido a sua anotação e teor de EST significativo derivado da raiz, especificamente no caso de FUE_30. FUE_30 e FUE_31 possuem uma atividade prevista de Hi invertase, uma enzima que é conhecida por atrasar a senescência quando expressa sob o promotor ativado por senescência (Balibrea Lara, et al. Plant Cell 16: 1276-1287, 2004). FUE_30 pode prolonga as características de permanência de verde da planta e, portanto, aumentar a 15 capacidade geral de armazenar o nitrogênio nas plantas para redistribuição durante o enchimento de grão. FUE_32 è anotado como uma proteína principal semelhante intrínseca e seu ortólogo de trigo contém diversas seqüências isoladas da raiz. Além 20 disso, o gene de milho selecionado demonstra homologia Brevis Radix. Brevis Radix é um novo regulador de proliferação de célula e alongamento que, quando desativada, cria as plantas com raízes mais curtas (Mouchel at al., Genes and Development Vol. 18:700-714, 2004) . 25 FUE 54 exibe homologia a uma proteína responsiva de Auxina. Os genes contêm uma anotação de EST significativa das raízes e tecidos estressados, bem como seu melhor ortólogo do sorgo e arroz que são especialmente expressados sob condições de estresse e provavelmente enriquecidos na raiz. FUE_33 e FUE_100 codificam as nitrilases. A Nitrilase é uma enzima importante na via 5 biosintética de auxina que converte 3-indoleacetonitrila para ácido acético 3-indole (auxina). A expressão aumentada das Nitrilases na raiz ampliará os niveis gerais de auxina e induzirá o alongamento da raiz, formação secundária da raiz, resposta otimizada gravitrópica, etc. 10 FUE_34 e FUE-3 5, bem como, FUE_46 e FUE_47, são fatores prováveis de transcrição, tanto expressos especificamente nas raizes estressadas, quanto considerados pelas oscilações de EST fornecendo as seqüências dos genes. Como esses fatores de transcrição são 15 altamente associados com as oscilações de estresse de água, pode ocorrer que ao modificar a expressão desses genes, os genes que induzem as alterações estruturais e metabólicas associadas com os estresses serão ativados. FUE_36, FUE_37 e FUE_38 mostram 2(1 algum grau de semelhança aos genes responsivos de ABA e/ou genes anotados de estresse, e possuem um teor significativo das seqüências derivadas das oscilações de raiz. FUE_36 possui provavelmente atividade de quinase de proteina com uma semelhança notável a um SAPK8, uma proteina que seus 25 niveis de expressão são aumentados durante o tratamento de ABA ou sob condições de salinidade, demonstrando um papel na resposta do stress. FUE_37 possui quase todas as seqüências derivadas da raiz e especificamente raiz sob estresse de água (conforme mostrado nas Tabelas 22 e 23) . Os ortólogos da cevada, trigo e cana de açúcar também suportam a argumentação de que o gene é principalmente expresso nas raizes. Existem indicações que esse gene implica na resposta 5 ao estresse de depravação da água, resposta de salinidade hiperosmótica, frio e outros estresses. Tabela 22: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE 37: Anatomia

Tabela 23: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE3 7: Tratamento

FUE 38 é derivado de diversas oscilações de raiz estressada (conforme mostrado nas Tabelas 24 e 25) e exibe uma semelhança notória a PKABA1. Os niveis de transcrição de PKABA1 são escassamente detectàveis nas 15 mudas de crescimento, porém são induzidos dramaticamente quando as plantas são sujeitas à desidratação, frio e estresse osmótico (Holappa LD e Walker-Simmons MK Plant Physiol. Vol. 108:1203-1210, 1995). Um padrão modificado de expressão para esse gene pode fornecer tolerância aumentada ao estresse abiótico, vigor aumentado, produção aumentada e melhor eficiência de uso dos fertilizantes. Tabela 24: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE 38: Anatomia

Tabela 25: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_38: Tratamento

FUE 48 foi selecionado usando os dados de expressão de Arabidopsis de micro-arranjo disponível em 10 (http://affymetrix.arabidopsis.info/narrays/supersearch.pl?s earchterms=afgn). Os genes com expressão enriquecida nas raizes e altamente responsivos a ABA e estresses abióticos (salinidade, osmótico e frio) foram identificados. Um dos genes possuía um ortólogo no milho 5 (FUE_48) que demonstrou teor otimizado das seqüências derivadas de raiz. 0 ortólogo provável de sorgo é um gene principalmente composto pelas seqüências derivadas do estresse, especificamente das condições do estresse de água e seca (conforme mostrado na Tabela 26). FUE_48 mostra 10 semelhança a SIP (Proteina de Submersão da Semente). Tabela 26: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_48: Tratamento

FUE_39 é uma proteína aglutinante de Ca+' semelhante a calcineurina B expressa pela 15 raiz. As calcineurinas são Ca’ que sentem as quinases de proteína reguladas diferencialmente pelas condições de estresse, tais como, estresse de sal, seca, frio e prejuízo. 0 cálcio é envolvido em diversos comportamentos importantes de raiz, tal como, gravitropismo, hidrotropismo, etc., e é 20 um importante segundo mensageiro para diversas vias de transdução de sinal. A ativaçao continua da cascata de proteina em que FUE_39 está envolvido pode fornecer propriedades vantajosas ou traços desejados comparados a uma planta de referência, incluindo tolerância melhorada ao 5 estresse abiótico, vigor e produção aumentados, uso melhorado do fertilizante, etc. FUE_40 e FUE_41 são os genes expressos nas raizes especificamente nas condições de estresse. 0 ortólogo de sorgo de FUE 4 0 possui diversas 10 seqüências derivadas dos tecidos estressados, incluindo as raizes. FUE_41 e FUE_40 mostram semelhança às proteinas responsivas de estresse. FUE 43, FUE_44 e FUE_45 possuem uma semelhança distante a uma proteina de estresse universal 15 de E. coli e suas seqüências de composição contêm uma fração significativa dos tecidos estressados de raiz (conforme mostrado na Tabela 27 para FUE_43 e na Tabela 28 para FUE_44). FUE_43 mostra semelhança a uma 20 proteina responsiva de etileno, FUE_4 4 e b'UE _4 5 mostram uma fraca semelhança a uma proteina semelhante à nodulina prematura. Essas proteinas expressadas de forma ectópica ectopicalmente sob um diferente promotor têm a probabilidade de produzir efeitos favoráveis nas plantas transgênicas, 25 tais como, tolerância otimizada ao estresse, crescimento melhorado em condições ideais e adversas, principalmente devido às prováveis modificações na arquitetura da raiz. Tabela 27: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_43: Tratamento

Tabela 28: Expressão digital do grupo ortólogo de FUE_44: Tratamento

FUE 50 foi selecionado 5 utilizando os dados de expressão de Arabidopsis de micro- arranjo, em que os genes específicos da raiz foram selecionados, se também fosse responsivos à auxina e etileno. De acordo com a expressão digital calculada, o ortólogo de milho apresentado nesta invenção é expresso nas 10 raízes sob as condições de estresse de água e nos tecidos relacionados à patogênese. O gene do milho mostra semelhança à nodulina, uma proteína conhecida como estando envolvida (Papadopoulou et al. Plant Mol Biol. 1996; 30:403-17) .

FUE_501 é um transportador de aminoácido putativo de Arabidopsis thaliana que mostra a expressão aumentada sob salinidade, osmótico e também é responsive ao ácido abscísico (ABA - hormônio de resposta ao estresse abiótico). FUE_51, um homólogo do milho de FUE_5Õ1 é composto principalmente pelas seqüências derivadas das seqüências de raiz estressada e possui uma anotação tentativa como um transportador de aminoácido. 0 ortólogo de sorgo de FUE_51 é envolvido nas respostas de estresse de acordo com a expressão digital. Seu ortólogo de cevada possui seqüências derivadas das raizes e raízes estressadas.

Da mesma forma, o ortólogo de trigo mostra diversas seqüências derivadas da raiz.

FUE_502 ê um transportador de aminoácido putativo que mostra a expressão aumentada durante o estresse de salinidade e osmótico, nas raizes e nos brotos. FUE_52, seu ortólogo de milho mais próximo, também possui semelhança às proteínas de transporte de aminoácido e possui uma representação significativa das seqüências derivadas de raiz e raiz estressada.

FUE_503 possui uma expressão impressiva nas sementes, sugerindo um forte papel na captação de aminoácidos nas sementes de desenvolvimento.

Além do gene ser fortemente regulado de forma ascendente sob salinidade e em resposta ao metil jasmonato. FUE_504 foi escolhido por sua forte resposta a ABA, à salinidade (especialmente do broto), a osmótico e frio. FUE_49 mostra uma forte semelhança no nível dos aminoácidos traduzidos para FUE_504, porém baixa no nível dos nucleotideos de codificação. Seu ortólogo de sorgo possui seqüências significativamente derivadas do estresse de oscilações de 5 água/seca. FUE _53 é um transportador de aminoácido putativo com quase todas as seqüências compondo os genes derivados da raiz e especificamente raizes estressadas. Os ortólogos de sorgo, arroz e trigo contêm diversas seqüências derivadas da raiz e raiz sob oscilações de estresse. FUE 101 e FUE 102 mostram semelhanças aos transportadores de aminoácido. FUE_102 é especificamente composto das seqüências derivadas das mudas 15 tratadas a frio e ponta de orelha do milho infectado por patógeno. FUE_55 é um gene com uma semelhança notável a isopenteniltransferase de tRNA, uma enzima importante na via metabólica de citocinina. A 20 expressão aumentada de FUE_55 nas raízes ou brotos aumentará os niveis de citocinina levando à expansão aumentada de folha e duplicação de célula, senescência atrasada, resistência aumentada de submersão dos tecidos, utilização otimizada do nitrogênio, etc. FUE_55 é especificamente 25 expresso no endosperms, um tecido que é provavelmente a submersão mais forte na planta. FUE 505 é um fator de transcrição contendo domínio AP2 putativo presente em duas listas importantes de genes. Uma lista contém os genes que são responsivos da Zeatina (a Zeatina é uma citocinina naturalmente ocorrente) enquanto a segunda lista de genes contém os genes induzidos por nitrogênio após a adição do nitrogênio às plantas deficientes em nitrogênio (Wang et al., Plant Physiology, June 2003, Vol. 132, pp. 556-567) . FUE_505 foi averiguado no agrupamento de ARR (reguladores de resposta de Arabidopsis) que media a resposta do broto à citocinina. A produção de citocinina da raiz aumenta mediante a disponibilidade do nitrogênio (Yamada et al. FEBS Lett. Vol. 436, pp:76-80, 1998). Sua co-regulação junto com ARRs indica um possível papel na resposta de citocinina. É altamente provável que a expressão constitutiva de FUE_505 melhorará a utilização de nitrogênio e crescimento de planta devido à ativação contínua da resposta de citocinina do broto.

EXEMPLO 2 Expressão do mRNA nos polinucleotidios expressos em silício

Os níveis de mRNA são determinados usando o ensaio de transcrição reversa seguido por uma análise de PCR em Tempo Real quantitativa (qRT-PCR). Os níveis de RNA são comparados entre os diferentes tecidos, etapas de desenvolvimento, condicões de crescimento e/ou diferentes históricos genéticos. Uma análise de correlação entre os níveis de mRNA em diferentes condições experimentais/históricos genéticos, como prova para o papel do gene na planta. folhas foram cortadas frescas das plantas de milho cultivadas em baldes brancos de 10 litros enchidos com

Vermiculita Tamanho 3, Os baldes foram regados com água de torneira até as sementes de um híbrido comercial germinaram.

Durante todo o período de crescimento (5 semanas), as plantas foram irrigadas com 2 litros/balde/dias com uma solução pH 5,7 - 5,8 contendo 2mM de CaCl_ , ImM de MgSO , ImM de KH2PO4, 7mM de KC1 e coquetel de micro-elementos. O nitrato de amónia foi adicionado nas seguintes concentrações: 5 mM, 0,5 mM, 0,05 mM, 0, 005 mM ou nenhuma. Para os experimentos com o Nitrato de potássio, ao invés do nitrato de amónia, as concentrações eram conforme segue 2mM de CaCl:, 2 mM de MgSO.;, 1 mM de KH PO.;, 5mM de KOI, e qualquer uma das concentrações de KNO,: 5mM, ImM, 0,1 mM, 0,01 mM, mantida em uma concentração final de potássio de 10 mM com concentrações complementares de KC1.

Quantitativo (qRT-PCR) - Para verificar os níveis de expressão, especificidade e associação de traço, a

Transcrição Reversa seguida por PCR em Tempo Real quantitativo (qRTPCR) foi efetuada no RNA total extraído de diversas partes da planta, incluindo, por exemplo, folhas 25 maduras e jovens, raízes e meristemas de raiz, cascas, borlas, sedas, etc. das plantas cultivadas no solo ou vasos sob condições deficientes de nutriente ou ideais conforme acima descrito. O nível do RNA mensageiro (mRNA) são medidos para todos os genes, previamente previstos de forma bioinformática a ser associado com a Eficiência do uso de fertilizante e correlação entre os niveis de expressão e o status de nutriente da planta foi analisado. O RNA total foi 5 extraído das folhas ou raizes do milho, usando mini-kit de planta RNeasy (Qiagen, Alemanha) usando o protocolo fornecido pelo fabricante. A transcrição reversa foi realizada usando 1,5 μg do RNA total, usando 300 U da enzima de Transcriptase Reversa Super Script II (Invitrogen), 225 10 ng de hexâmeros de deoxinucleotideo aleatório (Invitrogen), 500 μM de mistura de dNTPs (Takara, Japão), volume 0,2 de x tampão 5 RT (Invitrogen), 0,01M DTT, 60U de RNAsin (Promega), DDW tratado por DEPC foi adicionado até 37,5 μl.

As reações de RT foram incubadas por 50 min. a 42 °C, 15 seguido por 70 °C por 15 min. 0 cDNA foi diluído em 1:20 em Tris EDTA, pH=8,5mL do cDNA diluído foi usado para qRT-PCR.

O RT-PCR quantitativo foi realizado no cDNA (5 μL) , usando x 1 mistura máster SYBR GREEN PCR (Applied Biosystems), iniciadores dianteiros e 20 reversos 0,3 μM cada, e DDW foi adicional até 20 μL. A reação de qPCR foi realizada em uma máquina de PCR em tempo real Stratagene MX 3000 com a seguinte condição 50 °C por 2min, 95 °C por lOmin, 40 vezes de 95 °C por 15 seg e lmin a 60 °C, seguido por 95 °C por 15 seg, 60 °C por 60 seg, e 70 25 vezes de 60 °C por 10 seg + 0,5 °C aumento em cada ciclo.

Para cada gene, uma curva padrão é preparada a partir de um pool de RTs de todas as amostras, em 5 diluições (diluições 1:60, 1:200, 1:600, 1:2000, 1:10000). 0 gráfico de curva padrão [ct (limite de ciclo) vs. log (concentração)] deve ter R>=0, 98 com uma eficiência na faixa de 100% +/- 51. Os niveis da expressão (Qty) medida em qPCR foram calculados usando a eficiência (E) da reação de amplificação e CT 5 correspondente (o ciclo em que as amostras cruzaram o limite) Qty=E~'’T'. As curvas de dissociação obtidas foram qualificadas para a ausência dos produtos e PCR não específicos ou iniciador-dímeros. As reações foram repetidas pelo menos duas vezes. O método de cálculo é com base na K) assunção de que as eficiências das reações do GOI (gene de interesse) e dos genes de rotina são semelhantes.

Para normalizar o nível de expressão entre os diferentes tecidos e condições de crescimento das plantas de milho, a expressão de cada gene 15 foi dividida pela média geométrica da expressão dos seguintes quatro genes de rotina: Actina (GenBank Ace N° AY107106) , e RPL19 (GenBank Ace. N° AY103679), Ciclofilina (GenBank Ace N° X68678) e fator 1 de Alongamento alfa (EF1A, GenBank Ace N° AF136823). Tabela 29: Os seguintes iniciadores foram usados para a análise de qRT-PCR:

Resultados

A análise de RT-PCR em Tempo Real forneceu comprovação de que as seqüências selecionadas em silicio de polinucleotídio são, de fato, associadas com o

Uso de Nitrogênio. Embora a maioria dos genes tenha sido escolhida devido a sua associação com a seca, os genes foram averiguados como responsivos ao status do Nitrogênio dentro da planta, sugerindo uma diafonia entre o estresse da deficiência de nutriente e seca. A comprovação de que o K) painel de RNA usado nesse ensaio não reflete as alterações genuínas associadas ao status do nitrogênio pode ser encontradas nas Figuras 3A-D, em que os genes conhecidos associados à captação e assimilação do nitrogênio mostram as alterações em seus níveis de expressão de acordo com o nível 15 do fertilizante de nitrogênio usado na solução de irrigação.

Os gráficos representam os níveis normalizados de expressão encontrados para cada gene, divididos pelo nivel de expressão na concentração mais alta do fertilizante de nitrogênio usada na solução de irrigação. As Figuras 3A e 3B 20 mostram os resultados encontrados para dois transportadores de nitrato de alta afinidade e de amónia, respectivamente.

Conforme esperado, em concentrações mais altas do substrato a expressão dos transportadores de alta afinidade é regulada de forma descendente. De forma oposta, esses transportadores de alta afinidade, obviamente essenciais nas condições em que o substrato é escasso, são regulados de forma ascendente em baixas concentrações de nitrato e amónia (vide Figura 3A e 3B) . Conforme esperado para duas enzimas chave na via de assimilação do nitrogênio, tal como, Sintase de Glumamina 1C e Sintase de Glumamina 2, sua expressão é regulada de forma ascendente sob altas condições de substrato, conforme H) mostrado na Figura 3C e 3D, respectivamente. Tipicamente, os transportadores de baixa afinidade são regulados de forma ascendente com alta concentração do N. De forma oposta, os transportadores de alta afinidade são regulados de forma ascendente com baixa concentração do N. As enzimas envolvidas na assimilação do N (a conversão de n para aminoácidos) são reguladas de forma ascendente na presença de nitrogênio. Os genes identificados no Exemplo 1 mostram o comportamento responsivo distinto do nitrogênio averiguado para os genes de controle (Figuras 3 A-D) . FUE_3 (conforme mostrado na Figura 4A) mostram a regulação de forma ascendente em altas concentrações de substrato conforme averiguado para as enzimas de assimilação de controle chave indicando uma clara associação desse gene com o status de nitrogênio da planta e, assim, sua relação às respostas relacionadas do nitrogênio. A mesma regulação de forma ascendente encontrada para FUE_3 foi encontrada para diversos outros genes incluídos no Exemplo 1, tal como,

FUE—12 (conforme mostrado na Figura 4B) , FUE 3 0 (conforme mostrado na Figura 4C) , FUE_33 (conforme mostrado na Figura 4D) , FUE_34 (conforme mostrado na Figura 4E) , FUE_38 (conforme mostrado na Figura 4F) , FUE_43 (conforme mostrado na Figura 4G), FUE47 (conforme mostrado na Figura 4H) , 5 FUE—48 (conforme mostrado na Figura 41), FUE_49 (conforme mostrado na Figura 4J) e FUE_52 (conforme mostrado na Figura 4K) . Então novamente, incluidos no Exemplo 1 estão os genes que mostram uma regulação de forma K) ascendente firme quando o fertilizante do nitrogênio estiver com pouco abastecimento. Esse tipo de genes é esperado para estar relacionado às vias envolvidas na assimilação do nitrogênio, armazenamento e uso sob condições de deficiência de nitrogênio, conforme no caso dos transportadores de 15 nitrato e amónia de alta afinidade (Figuras 2C e 2D) . A Figura 5A mostra os resultados para FUE_4, um gene que passa por uma forte regulação de forma ascendente em baixa disponibilidade do fertilizante de nitrogênio, indicando um papel claro desse gene na resposta endógena da planta para 20 as condições deficientes de nitrogênio. Da mesma forma, os outros genes no Exemplo 1, exibem uma curva de sensibilidade ao nitrogênio semelhante, conforme FUE_4, tal como FUE_10 (conforme mostrado na Figura 5B), FUE_37 (conforme mostrado na Figura 5C) , FUE46 (conforme mostrado na Figura 5D) e 25 FUE50 (conforme mostrado na Figura 5E). Considerados juntos, os resultados aqui apresentados claramente implicam uma correlação próxima entre os genes selecionados em silício e as vias associadas do nitrogênio.

EXEMPLO 3

Clonagem de gene e criação de vetores binários para expressão da planta

Estratégia de clonagem

Vinte e oito genes dos 50 genes selecionados no Exemplo 1 e validados no Exemplo 2 acima foram clonados em vetores binários para a geração das plantas transgênicas. Para clonagem, a estrutura de leitura • 10 aberta de comprimento total (ORF) foi primeiro identificada. I

Os agrupamentos de EST e, em alguns casos, as seqüências de mRNA, foram analisados para identificar toda a estrutura de leitura aberta ao comparar os resultados de diversos algoritmos de tradução com as 15 proteinas conhecidas de outras espécies de planta. No caso em que toda a seqüência de codificação não foi encontrada, os kits de RACE da Ambion ou Clontech (RACE = Rápido Acesso às Extremidades de cDNA) foram usados para preparar o RNA das amostras de planta descrita no Exemplo 2 acima, de modo a assim acessar toda a transcrição de cDNA do gene.

Com a finalidade de clonar os cDNAs de comprimento total, a Transcrição Reversa seguida por PCR (RT-PCR) foi realizada sobre o RNA total extraído das folhas, raízes ou outros tecidos de planta, cultivados 25 sob condições normais ou deficientes de nutriente. A extração total do RNA, produção de cDNA e amplificação de PCR foram realizadas usando os protocolos padrão descrito em qualquer local (Sambrook J., E.F. Fritsch, e T. Maniatis. 1989. Molecular Cloning. A Laboratory Manual., 2nd Ed. Cold

Spring Harbor Laboratory Press, New York.) e são básicos para aqueles com habilidade na técnica. Os produtos de PCR foram purificados usando o kit de purificação de PCR 5 (Qiagen) e o seqüenciamento dos produtos de PCR amplificados é realizado, usando o seqüenciador ABI 377 (Applied Biosystems). Para facilitar a clonagem dos cDNAs, uma extensão de 8-12 bp foi adicionada à extremidade 10 primitiva 5'de cada iniciador. A extensão do iniciador inclui um local de restrição de endonuclease. Os locais de restrição são selecionados usando dois parâmetros: a. O local não existe na seqüência de cDNA, b. Os locais de restrição nos iniciadores dianteiros e reversos são 15 projetados de modo que o cDNA digerido seja inserido na formação de senso no vetor binário utilizado para transformação. Por exemplo, o vetor de plasmidio pPI foi construído ao inserir uma seqüência sintética de sinal poli- (A) , originando do vetor de plasmidio básico pGL3 (Promega, 20 Ace. N° U47295; bp 4658-4811) no local de restrição Hindlll do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Ace. N° U12640).

Os produtos de PCR foram purificados (Kit de Purificação de PCR, Qiagen, Alemanha) e digeridos com os locais de restrição de acordo com os iniciadores usados (Roche, Suíça). Os produtos de PCR digeridos foram clonados no vetor binário pPI, que foi digerido com as mesmas enzimas de restrição. 0 produto de PCR digerido e ligados usando enzima de ligase de T4 DNA (Roche, Suiça). Os seguintes genes foram clonados a partir do RNA extraido dos tecidos descritos acima usando os seguintes iniciadores: Tabela 30 - genes clonados das oscilações de cDNA e os 5 iniciadores usados para a clonagem

As seqüências sintéticas de alguns dos polinucleotideos clonados foram pedidas de um fornecedor comercial (GeneArt, GmbH). 0 DNA sintético foi projetado em silicic, com base nas seqüências de polipeptidio codificadas putativas descritas no Exemplo 1.

Para otimizar a seqüência de codificação, as tabelas de utilização de códon calculadas a partir dos transcriptomes de planta foram usadas (o exemplo de tais tabelas pode ser averiguado no Banco de Dados de

Utilização de Códon disponível on-line em http://www.kazusa.ou.jp/codon/). As seqüências otimizadas de codificação foram projetadas de uma forma que nenhuma alteração é introduzida na seqüência codificada de aminoácido enquanto usando os códons preferidos para 10 expressão nas plantas dicotiledôneas, principalmente tomate e Arabidopsis; e as plantas monodicotiledônea, tais como o milho. Tais seqüências otimizadas promovem a melhor taxa de tradução e, portanto, níveis mais altos de expressão da proteína. Para as seqüências otimizadas, os locais de enzima 15 únicos adicionais laterais foram adicionados - Sail, Xbal, BamHI, Smal na extremidade 5'e Saci na extremidade 3'. Os genes para os quais as seqüências sintéticas otimizadas de códon foram preparados são: FUE_2 (SEQ ID N°: 1317), FUE_3, 20 (SEQ ID N°: 1319) FUE_4 (SEQ ID N° : 1320), FUE_40 (SEQ ID N°: 1321), FUE_7 (SEQ ID N°: 1322), FUE_8 (SEQ ID N° : 1324), FUE_9 (SEQ ID N° : 1325), FUE_10 (SEQ ID N° : 1326), FUE__12 (SEQ ID N°: 1327), FUE13 (SEQ ID N° : 1328), FUE_14 (SEQ ID N° : 1329), FUE_16 (SEQ ID NG: 1330), FUE_37 (SEQ ID N° : 25 1331), FUE_41 (SEQ ID N° : 1332), FUE4 6 (SEQ ID N° : 1333), FUE_47 (SEQ ID N° : 1334), FUE_49 (SEQ ID N° : 1335), FUE_52 (SEQ ID N°: 1336).

Duas seqüências não otimizadas, designadas como "FUE_2_Original" (SEQ ID N° : 1318) e "FUE_7_Original"(SEQ ID N°: 1323), idênticas às suas seqüências de milho endógeno foram sintetizadas e clonadas para expressão em excesso na criação da planta transgênica.

Geração dos vetores binários compreendendo genes FUE e promotores funcionais da planta para acionar sua expressão - 0 plasmidio pPI foi construído ao inserir uma seqüência sintética de sinal poli-(A), originando do vetor básico de plasmidio pGL3 (Promega, Ace 10 N° U47295; bp 4658-4811) no local de restrição Hindlll do vetor binário pBI101.3 (Clontech, Ace. N° U12640). Em alguns casos, o plasmidio binário de suporte usado foi o pGI, que é semelhante ao pPI, porém o gene GUS foi substituído pelo gene GUS-Intron (Vancanneyt. G, et al MGG 220, 245-50, 15 1990) . O pGI foi usado para clonar todas as seqüências de polinucleotídio, inicialmente sob o controle do promotor 35S [Odell, JT, et al. Nature 313, 810 - 812 (28 February 1985); SEQ ID N°: 1337].

Algumas seqüências de 20 polinucleotídio foram clonadas de acordo com outros promotores preferenciais conforme abaixo descrito. Um dos promotores, aqui nomeado "RootP" (SEQ ID N°: 1338), devido a sua expressão enriquecida nas raizes, foi amplificado e clonado a partir do DNA genômico isolado de Arabidopsis thaliana por PCR direto usando os seguintes iniciadores. Tabela 31

O promotor TT105 (SEQ ID N° : 1339; 2004/081173) foi usado para medir a expressão ubíqua constitutiva em níveis diferentes daqueles mediados pelo promotor 35S. O promotor TT105 contém a região a montante do 15 gene ELP (deposição ectópica de Lignina, ACESSÃO DE GENBANK N° : NM_100466, AT1G05850) incluindo o primeiro exon e parte do primeiro intron. Os genes clonados de acordo com o promotor TT105 foram FUE_502, FUE_504, FUE_39 e FUE_52. Novamente, a enzima β-glucuronidase (GUS) codificada pelo 20 gene uid A foi clonada de acordo com o promotor TT105.

EXEMPLO 4

Geração das plantas transgênicas expressando os genes FUE

Materiais e Métodos

Transformação de Arabidoposis foi efetuada de acordo com Clough SJ, Bent AF. (1998) Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16(6): 735- 43; e Desfeux C, Clough SJ, Bent AF. (20000 Female reproductive tissues are the primary targets of Agrobacterium-mediated transformação by the Arabidopsis floral-dip method. Plant Physiol. 123(3): 895-904.).

Brevemente, Arabidopsis thaliana var Columbia (plantas T-.) foi transformada usando o procedimento de Imersão Floral descrito por Clough SJ e Bent AF (10) e por Desfeux C et al. (11), com modificações menores. Brevemente, as Plantas T, de

Arabidopsis thaliana Columbia (ColO) foram semeadas em potes 10 de 250 ml enchidos com mistura de crescimento com base em turfa úmida. Os vasos foram cobertos com chapas de alumínio e um domo de plástico, mantidos a 4 °C por 3-4 dias, então descobertos e incubados em uma câmara de crescimento em 1824 °C sob 16/8 h de ciclos de dia/noite. As Plantas T,, 15 estavam prontas para transformação seis dias antes da florescência. As únicas colônias de Agrobacterium transportando os vetores binários abrigando os genes FUE foram cultivadas no meio LB complementado com kanamicina (50 mg/L) e gentamicina (50 mg/L). As culturas foram incubadas em 28 °C por 48 h sob agitação vigorosa e centrifugadas em 4000 rpm por 5 minutos. Os grânulos compreendendo as células de Agrobacterium foram suspensos novamente em um meio de transformação que continha Murashige-Skoog (Duchefa) de semi-resistência (2,15 g/L); 0,044 nM de benzilaminopurina (Sigma) ; 112 ng/L de vitaminas B5 Gambourg (Sigma) ; 5 % de sacarose; e 0,2 ml/L de Silwet L-77 (OSI Specialists, CT) em água destilada dupla, no pH de 5,7.

A transformação das Plantas T, foi realizada ao inverter cada planta em uma suspensão de

Agrobacterium, de modo que o talo da floração foi submerso para 3-5 segundos. Cada Planta Toinoculada foi imediatamente colocada em uma bandeja de plástico, então 5 coberta com domo de plástico transparente para manter a umidade e manter no escuro em temperatura ambiente por 18 h para facilitar a infecção e transformação. As plantas transformadas (transgênicas) são então descobertas e transferidas a uma estufa para recuperação e maduração. As 10 Plantas To transgênicas foram cultivadas na estufa por 3-5 semanas até as siliquas ficarem marrons e secas, então as sementes foram colhidas das plantas e mantidas em temperatura ambiental até semeadura.

Para gerar as plantas 15 transgênicas TI e T_ acolhendo os genes, as sementes coletadas das plantas transgênicas T foram esterilizadas na superfície ao encharcar em 70 de etanol por 1 minuto, seguindo por encharcar em 5 de hipoclorito de sódio e 0,05 % de Tritão X-100 por 5 minutos. As sementes esterilizadas 20 na superfície foram totalmente lavadas em água destilada estéril então colocadas nas placas de cultura contendo Murashige-Skoog de semi-resistência (Duchefa); 2 % de sacarose; 0,8 % de ágar da planta; 50 mM de kanamicina; e 200 mM de carbenicilina (Duchefa) . As placas de cultura 25 foram incubadas em 4 °C por 48 horas, então transferidas a uma sala de crescimento em 25 °C por uma semana adicional de incubação. As plantas T} vitais de Arabidopsis foram transferidas às placas frescas de cultura por outra semana de incubação. Após a incubação, as plantas Ti foram removidas das placas de cultura e plantadas em mistura de crescimento contida em vasos de 250 ml. As plantas transgênicas foram permitidas a crescer em uma estufa para 5 maturidade. As sementes colhidas das plantas Ti foram cultivadas e crescidas para maturidade como plantas T. sob as mesmas condições que usadas para cultivação e crescimento das plantas Ti. Pelo menos 10 eventos independentes de transformação foram criados a partir de cada construção para lo a qual o volume das sementes T2 foram coletadas.

Transformação do Milho - Esse procedimento é realizado de acordo com (Bronwyn R. Frame, et al, Agrobacterium tumefaciens-Mediated Transformation of Maize Embryos Using a Standard Binary Vector System, Plant 15 Physiology, May 2002, Vol.129, pp. 13-22) ou com diversos protocolos disponíveis em qualquer local na Dependência de Transformação de Planta na Universidade Estadual de Iowa (http://www.agron.iastate.edu/ptf/Web/mainframe.htm) .

EXEMPLO 5

Seleção das plantas transgênicas de Arabidopsis expressando os genes FUE de acordo com o nível de expressão Materiais e Métodos

As plantas transgênicas foram cultivadas conforme detalhado no Exemplo 4 acima. O RNA total foi extraído a partir de 10 flores recentemente cortadas das plantas transgênicas conforme detalhado no Exemplo 2 acima. Com a finalidade de determinar o nível de expressão relativo do transgene, as reações de qRT-PCR foram realizadas conforme descrito no Exemplo 2 acima e os resultados foram normalizados contra a média geométrica da expressão de dois genes de rotina medidas nas mesmas 5 amostras. Tabela 31 - Iniciadores usados para a seleção das plantas transgênicas

Resultados

Cerca de doze eventos transgênicos foram passados por triagem para cada construção. Os resultados foram altamente repetitivos e 5 mostraram que, dentro de 10 eventos aleatórios de transformação, cerca de 20 a 40 diferenças de dobra na expressão transgene foram encontradas. Os exemplos representativos de tais achados são mostrados nas Tabelas 32, 33 e 34) . Com base nesses achados, cerca de 5 eventos 10 diferentes mostrando os níveis de expressão mais altos do que a média, foram obtidos para a validação adicional da função do gene (vide Exemplos 6 - 9) . Tabela 32

Tabela 33

Tabela 34

Eficiência melhorada do uso de fertilizante no ensaio da cultura de tecido Materiais e Métodos Ensaio 1: Ensaio de eficiência do uso de nitrogênio usando plantinhas - O ensaio foi realizado de acordo com Yanagisawa-S. et al. com modificações menores ("Metabolic engineering with Dofl transcription factor in plants: Improved nitrogen 10 assimilation and growth under low-nitrogen conditions" Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 101, 7833-7B38). foram cultivadas por 7-10 dias em 0,5 x MS [Murashige-Skoog] complementadas com um agente de seleção foram transferidas para duas condições limitantes de nitrogênio: meio MS em que a concentração combinada de nitrogênio (NJ-LNCg e KNO3) era de 0,2 mM ou 0,05 mM. As plantas foram permitidas a crescer por 30-40 dias adicionais e então fotografadas, individualmente removidas do ágar (o broto sem as raizes) e imediatamente pesadas (peso recente) para análise estatística posterior.

As construções para as quais somente as sementes TI estavam disponíveis no meio seletivo e pelo menos 25 mudas (cada uma representando um evento independente de transformação) foram cuidadosamente transferidas ao meio limitante de nitrogênio.

Para as construções que as sementes T2 estavam disponíveis, diferentes eventos de transformação foram analisados. Normalmente, as plantas aleatoriamente selecionadas de cada evento foram transferidas ao meio limitante de nitrogênio permitida para crescer por 3-4 semanas adicionais e individualmente pesadas no final de tal periodo. As plantas transgênicas foram comparadas para controlar as plantas cultivadas em paralelo sob as mesmas condições. As plantas transgênicas de imitação expressando o gene repórter uidA (GUS) sob o mesmo promotor foram usadas como controle.

Análise estatística - Para identificar os genes que conferem a eficiência significativamente melhorada do uso de nitrogênio (ou tolerância aos estresses abióticos ou arquiteturas ampliadas de raiz, vide abaixo), os resultados obtidos das plantas transgênicas foram comparados aos obtidos das plantas de controle. Os dados de área de planta, dados de peso da semente e dados de peso de planta, foram analisados ANOVA unilateral. Para identificar os genes e construções de sobre-realização, os resultados dos eventos independentes de transformação testados foram analisados separadamente. Além disso, os genes e construções também foram analisados considerando os resultados obtidos de todos os eventos 2(1 independentes de transformação testados da construção específica. Para a análise do gene versus controle, o teste Student t ou teste Tukey HSD foi aplicado, usando a significância de p<0,05. 0 pacote de software de estatísticas de JMP foi usado (Versão 5.2.1, SAS Institute 25 Inc., Gary, NC, USA). A mesma análise estatística foi usada nos Exemplos 6-9 que segue. Resultados

As seqüências de polinucleotídio da presente invenção foram, ensaiadas por um número de traços ccmercialmente desejados. A Figura 7 mostra a capacidade de FUE_504 ou FUE39 para melhorar NUE das plantas transgênicas expressando os mesmos. Claramente, as plantas transgênicas crescidas no nitrogênio são maiores e mais pesadas do que as plantas de controle expressando um gene de controle sob o mesmo promotor usado para expressar os transgenes. Para verificar que o aumento na massa atingido pelas plantas transgênicas é estatisticamente significativo, as plantas foram individualmente pesadas e os resultados de toda a população dos eventos analisados. Conforme mostrado na Tabela 35 abaixo, as plantas transgênicas expressando FUE—504 são significativamente mais pesadas do que as contrapartes de controle. Os resultados demonstram uma melhoria em NUE, considerando que as plantas transgênicas expressando o FUE_504 são capazes de produzir significativamente mais biomassa do que as plantas de controle com início a partir de um meio deficiente semelhante de nitrogênio. Tabela 35

Notavelmente, sempre que as plantas TI forem usadas para ensaiar o efeito de FUE—504; portanto, cada planta testada é um resultado de um evento diferente de transformação. Tendo isso em mente, é claro que o efeito averiguado para plantas TI é em decorrência do transgene que não é associado com o local de integração do transgene. 5 Quando as plantas de T2 foram ensaiadas, os resultados foram passíveis de reprodução no caso em que três transformações independentes aumentaram o peso recente eram evidentes sob as condições limitantes de nitrogênio. Os resultados semelhantes foram obtidos para 10 FUE_39 e FUE_52. Conforme mostrado na Tabela 36 abaixo, três eventos transgênicos independentes contribuíram com o aumento da biomassa de plantinha de acordo com condições limitantes de nitrogênio. Os resultados indicam que a expressão de FUE_39 e FUE_502, da mesma forma, induzem uma 15 melhoria significativa na eficiência do uso de nitrogênio. Tabela 36: Média de quadrado menor do peso recente medido a partir de ~25 plantinhas cultivadas por 30 dias na concentração combinada de nitrogênio de OnO5 mM (NH-NO. e KNOj)(resultados analisados usando o teste t Student)

Os resultados semelhantes foram obtidos ao verificar os mesmos eventos em concentração semelhante de nitrogênio de 0,2 mM. Os quatro eventos transformados com TT105::NUE_39 produzido estatisticamente a 5 biomassa maior significativa quando comparado às plantas de controle. Os resultados semelhantes foram obtidos com 3 eventos transformados com TT105::NUE_52 e 2 eventos transformados com TT105 : : NUE_504 conforme mostrado na Tabela 37. Tabela 37: Menor média quadrada do peso recente medida de - 25 plantinhas cultivadas por 30 dias na concentração combinação de nitrogênio de 0,2 mM (NH4NO-. e KNO3) (resultados analisados usando o teste t Student)

Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes

Os resultados positivos também foram obtidos em um ensaio realizado usando sementes TI das plantas transgênicas expressando em excesso FUE_8, FUE_14 ou FUE 40 sob um promotor ubíquo constitutivo (35S), conforme mostrado na Tabela 38 abaixo. Tabela 38: Menor média quadrada do peso recente medido a partir de ~25 plantinhas cultivadas por 27 dias em 0, 05 e 0,2 mM de concentração combinada de nitrogênio (NH4NO-. e KNO3) (resultados analisados usando o teste t Student MANOVA)

Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes Os resultados semelhantes foram obtidos para diferentes eventos de outras construções expressando os genes FUE. Uma construção adicional com o gene FUE_39 sob o promotor 35S foi verificada usando esse ensaio conforme mostrado na Tabela 39 abaixo. Além disso, dois eventos independentes de transformação expressando em excesso o gene FUE,49 e eventos adicionais transformados com FUE_4, FUE_3, ou FUE_43 mostraram significativamente biomassa mais alta produzida nas condições limitantes de nitrogênio testadas conforme mostrado na tabela 39 abaixo. Tabela 39: Menor média quadrada do peso recente medido a partir de ~25 plantinhas cultivadas por 27 dias em 0,05 e 0,2 mM de concentração combinada de nitrogênio (.NH4NO3 e KNO3) (resultados analisados usando o teste t Student MANOVA)

Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes Considerando os resultados obtidos usando esse ensaio, diversos genes FUE mostraram sua 5 capacidade de induzir uma melhoria significativa na eficiência do uso de nitrogênio. Os genes que mostraram os resultados significados são: FUE_504, FUE_39, FUE_S2, FUE_502, bem como o seguinte grupo de genes: FUE_14, FUE_8, FUE_40 e FUE_4 9, FUE_3, FUE_4 e FUE_43. Ensaio 2: Ensaio de planta total da eficiência do uso de nitrogênio: Taxa de crescimento na concentração limitada de nitrogênio - Um ensaio adicional projetado para identificar a eficiência melhorada do uso de nitrogênio foi desenvolvido. Esse ensaio 15 segue o crescimento da área de roseta das plantas cultivadas na estufa com disponibilidade limitada de nitrogênio. As sementes esterilizadas de superfície foram plantadas e as plantas cultivadas em 25 °C sob ciclos diários de 23 horas de luz 1 hora de escuro por 7-10 dias no meio 0,5 x Murashige-Skoog na presença de 2 ■ de sacarose. As mudas de tamanho semelhante foram cuidadosamente transferidas para vasos de 100 ml enchidos com um suporte de meio de crescimento inerte (uma mistura de perlita) . As mudas foram permitidas a desenvolver por uma semana adicional irrigadas com uma solução contendo abastecimento abundante de micro e macronutrientes. O excesso de fertilizante foi lavado dos vasos com pelo menos dois volumes de água de torneira de baixo nitrato. Então, as plantas foram individualmente inspecionadas e somente as plantas saudáveis foram escolhidas para análise da taxa de crescimento. As plantas escolhidas foram aleatoriamente distribuídas em diversas bandejas e usadas para ensaio para análise da taxa de 5 crescimento sob condições limitantes de nitrogênio. As condições limitantes de nitrogênio constantes foram atingidas irrigando as plantas com uma solução contendo 0,5 mM de nitrogênio inorgânico (concentração combinação de KNO3 e NH4NO3) , complementada com 2 mM de CaCl. , 1,25 mM de KH PO,,, H) 1,50 mM de MgSO^, 5 mM de KC1, 0,01 mM H3BO3 e micro- elementos. Para seguir o crescimento da planta, as bandejas foram fotografadas no dia em que as condições limitantes do nitrogênio foram iniciadas e subsequentemente a cada 2-3 dias por ~20 dias adicionais. A área de planta da roseta foi então determinada a partir das fotografias digitais usando a metodologia descrita na Figura 6. O software Imaged foi usado para quantificar o tamanho da planta a partir das fotografias digitais (http://rsb.info.nih.gov/ij/) utilizando scripts proprietários projetados para analisar o tamanho da área de roseta a partir das plantas individuais como uma função do tempo. A porcentagem de crescimento foi calculada como a proporção da área de roseta da planta dividida pela área de planta inicial medida no dia 1 . Para identificar as plantas transgênicas dentro do experimento, a presença do gene marcador de seleção foi verificada usando PCR. As amostras de folha foram obtidas das plantas, o DNA genômico foi extraído e servido como modelo para um PCR usando iniciadores específicos para o gene marcador de seleção. As plantas positivas foram rotuladas com a finalidade de excluir da análise as plantas não transgênicas . Tabela 40: Iniciadores usados para a análise de PCR:

Resultados

Em concordância com os resultados obtidos no ensaio anterior em que o FUE_39 mostrou NUE melhorado, os resultados aqui apresentados mostram que o FUE_39 significativamente melhorou NUE em todas as plantas. Conforme mostrado na Tabela 41 abaixo, dois eventos independentes transgênicos expressando FUE_39 foram encontrados para exibir NUE otimizado quando comparado às plantas do tipo selvagem ou plantas transgênicas expressando o gene repórter GUS sob o mesmo promotor usado para expressar o transgene FUE_39. Tabela 41: FUE_39 mostra os resultados de um ensaio de taxa de crescimento sob condições limitantes de nitrogênio. Dois eventos mostrando NUE otimizado foram mostrados.

Os niveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes

Além de FUE 39, da mesma forma, os eventos expressando em excesso FUE_7 e FUE_41 foram encontrados para exibir a taxa otimizada de crescimento sob condições limitantes do nitrogênio. Conforme mostrado na Tabela 42, a expressão de FUE_7, FUE__41, FUE_50, FUE .16 de acordo com o promotor 35S é significativamente melhor do que as plantas de controle (tipo selvagem ou expressando um gene repórter de acordo com promotor 35S). Tabela 42

Os niveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes Dessa forma, o ensaio aqui K) descrito segue a capacidade da planta de crescer em condições limitantes do nitrogênio. Considerando que as plantas transgênicas acima descritas desenvolveram-se significativamente mais rápidas do que as plantas de controle, pode ser presumido que os eventos pendentes foram 15 capazes de assimilar a disponibilidade do nitrogênio e convertê-lo à matéria orgânica. Como todas as plantas no experimento foram tratadas de forma semelhante, os resultados indicam que os eventos pendentes foram capazes de utilizar de forma mais eficiente o nitrogênio disponível e, 20 portanto, exibir a eficiência otimizada do uso de nitrogênio. Ensaio 3: Ensaio de Produção da

Semente em disponibilidade limitada de nitrogênio - As plantas de milho absorvem e armazenam a maioria do nitrogênio nas folhas e talo até a floração. Os nutrientes armazenados são então redistribuídos às sementes de desenvolvimento. No presente ensaio, as plantas foram cultivadas em condições limitadas do nitrogênio conforme detalhado no Ensaio 2 acima por cerca de 45 dias e então cultivadas até a maturidade total somente com água de torneira. Portanto, as plantas são forcadas a redistribuir o nitrogênio armazenado às sementes de desenvolvimento. As plantas que armazenam mais nitrogênio são esperadas para ter uma melhor produção. As sementes foram coletadas das plantas individuais e a produção foi medida como o peso da semente. A produção de pelo menos cerca de 6 plantas transgênicas foi normalmente medida para cada evento testado. Resultados

Nesse ensaio, as plantas transgênicas expressando em excesso o FUE—43 (sob o promotor 35S) foram encontradas como tendo aumentado o rendimento da 2(» semente conforme mostrado na Tabela 43. Os resultados de um dos eventos são abaixo apresentados. Tabela 43

Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes

Considerados em conjunto, os resultados mostrados aqui demonstram que os genes desta invenção são capazes de melhorar os diferentes aspectos da eficiência do uso de nitrogênio conforme demonstrado pelos resultados dos diferentes ensaios aqui revelados.

EXEMPLO 1

Avaliação do crescimento da planta transgênica sob condições de estresse abiótico

A tolerância à salinidade ou estresse osmótico tem o objeto de identificar os genes que confere melhor germinação, vigor da muda ou crescimento em alto sal, seca ou combinação dos mesmos ou outros estresses ambientais. As plantas diferem em sua tolerância ao estresse de sal, alto osmótico e seca durante diferentes etapas de desenvolvimento. Portanto, a germinação de semente, desenvolvimento da planta e rendimento foram avaliados independentemente sob as diferentes condições de estresse.

Um tipico teste de tolerância de salinidade é produzido obtendo as plantas em diferentes etapas de desenvolvimento e irrigando-as com concentrações crescentes de NaCl (por exemplo, 50 mM, 100 mM, 200 mM, 400 mM) ou concentração constante de NaCl. As plantas transgênicas são então comparadas às plantas de controle em sua aparência fenotipica externa, grau de desvigor e sucesso geral para atingir a maturidade e progénie de rendimento nas concentrações inibitórias para as plantas de controle. Os parâmetros quantitativos da tolerância medida incluem, o peso médio seco e úmido, e o peso das sementes produzidas, o tamanho médio da semente e o número de sementes produzidas por planta. Os ensaios de estresse osmótico (incluindo ensaios de NaCl e manitol) são conduzidos para determinar se um fenótipo tolerante ao estresse osmótico é especifico de NaCl ou se em um fenótipo geral relacionado ao estresse osmótico. Os ensaios de seca são realizados, por exemplo, irrigação de parada durante longo periodo e medição da taxa 5 de desvigor, recuperação e produção final. As plantas tolerantes ao estresse osmótico são de modo geral mais tolerantes às condições de seca, salinidade e congelamento e, portanto, são altamente valiosas em termos de traços agronômicos.

Materiais e Métodos

O método usado para testar as plantas para tolerância aumentada ao estresse abiótico inclui o teste de germinação e crescimento da muda sob condições adversas, tais como, alta salinidade e alto osmótico.

Ensaio de germinação sob estresses abióticos - Os testes de germinação comparam a porcentagem das sementes das plantas transgênicas que poderiam concluir o processo de germinação (protrusão de 20 radicula do revestimento da semente e abertura completa de cotiledôneos) para a porcentagem das sementes das plantas de controle tratadas da mesma forma.

A avaliação da germinação e vigor da muda foi conduzida por três semanas após a 25 plantação. Para medir a germinação e crescimento da muda, as sementes das plantas T2 foram esterilizadas na superfície e individualmente plantadas em placas quadradas de ágar contendo, por exemplo, meio basal solidificado (50 1 de meio

Murashige-Skoog (MS) + vitaminas complementadas com 0,9 de ágar da planta) complementadas com alta salinidade (150 mM de NaCl) ou alto osmótico (210 mM de manitol) . Após a plantação, as placas foram transferidas por 2-3 dias em 4 °C 5 para estratificação e então crescimento por três semanas.

Para seguir a germinação e crescimento em condições adversas, as plantas foram passadas por triagem manual ou automaticamente e o tamanho da planta foi determinado. Diversos eventos independentes de 10 transformação selecionados do Exemplo 5 foram analisados de cada construção. As plantas expressando os genes desta invenção foram comparadas às plantas de controle (tipo selvagem ou plantas de imitação transformadas) plantadas nas mesmas placas sob as mesmas condições.

Crescimento da muda sob estresse abiótico - Um experimento complementar realizado com as mudas após a tolerância das plantas às condições adversas. As sementes esterilizadas de superfície foram plantadas no meio basal [50 do meio Murashige-Skoog (MS) + 20 vitaminas complementadas com 0,8 de ágar da planta como agente de solidificação] na presença de Kanamicina (para plantas transgênicas) ou em sua ausência (para plantas de controle do tipo selvagem). Após a plantação, as placas foram transferidas por 2-3 dias em 4 °C para estratificação 25 e então crescimento em 25 °C sob ciclos diários de 23 horas de luz e 1 hora de escuro por 7 a 10 dias. Nesse ponto de tempo, as mudas aleatoriamente escolhidas foram cuidadosamente transferidas às placas contendo condições de alta salinidade (150 mN de NaCl) ou condições parecidas com a alta osmolaridade encontrada durante a seca (210 mM de manitol) . O crescimento da planta foi seguido como uma função do tempo utilização formação de imagem digital. Para 5 seguir o crescimento da planta em condições adversas, as plantas foram fotografadas no dia em que foram transferidas às condições de estresse (Dia 1) . As fotografias foram subseqíientemente tiradas em dias alternados após a transferência das plantas à condição de estresse e até 12 10 dias após a transferência. A área de planta da roseta foi então determinada a partir das fotografias digitais. O software Imaged foi usado para quantificar o tamanho da planta a partir das fotografias digitais (http://rsb.info.nih.gov/ij/). 0s scripts proprietários 15 foram projetados para analisar o tamanho das áreas de roseta das plantas individuais como uma função do tempo. A Figura 6 mostra a metodologia usada para quantificação da área de imagem. Cinco a dez eventos independentes de transformação foram analisados de cada construção e pelo menos 6 plantas 20 aleatoriamente selecionadas de cada evento foram analisadas em cada experimento de estresse. As plantas expressando os genes desta invenção foram comparadas às plantas de controle plantadas nas mesmas placas induzindo o estresse (controles interno) ou na medição média de todas as plantas de controle 25 usadas no mesmo experimento (todos os 5 controles).

Resultados

A tolerância de salinidade e osmótica foi ensaiada pelo seguinte crescimento da planta durante o estresse, conforme evidenciado pela área verde da planta. Os diversos genes e construções foram verificados usando o procedimento acima descrito e os resultados significativos de tolerância foram averiguados. Por exemplo, 5 as plantas transgênicas expressando em excesso os seguintes genes demonstraram estatisticamente tolerância melhorada significativa ao estresse de alta salinidade: FUE_7, FUE_1Ü, FUE_14, FUE_16, FUE_33, FUE_37, FUE_39, FUE_40, FUE_41, FUE_47, FUE_50, FUE5G2, FUE_503 e FUE_504. I<) Além disso, os seguintes genes fornecem resultados estatisticamente significativos no acúmulo da tolerância ao estresse abiótico das plantas transgênicas expressando em excesso a mesma quando expostas ao estresse de alta osmolaridade: FUE_3, FUE_9, FUE_10, 15 FUE_13, FUE_37, FUE_39, FUE_4 0, FUE_41, FUE_4 3, FUE4 9, FUE_502, FUE_503 e FUE_504.

Além disso, as plantas transgênicas expressando FUE_43 e FUE_503 foram averiguadas como tendo capacidade aumentada de germinar sob as condições altas osmóticas (Dados não demonstrados).

Além do mais, as plantas transgênicas expressando os seguintes genes mostraram significativamente tolerância aumentada ao estresse abiótico à salinidade ou alta osmolaridade: FUE_10, FUE_37, FUE._39, 25 FUE_40, FUE_41, FUE_502 e FUE_504.

Deve ser observado que a significância dos resultados é de modo geral apoiada pelos diversos eventos transgênicos expressando os genes acima e, em alguns casos, sob diferentes promotores. A Tabela 44a-b resume esses achados. Os resultados são expressos como a porcentagem da área de crescimento relacionada ao tamanho da planta quando transferida às condições de estresse (i.e., Dia 1). Tabela 44a - lista de genes mostrando crescimento melhorado da muda sob estresse de salinidade

Tabela 44b - lista de genes mostrando crescimento melhorado da muda sob estresse osmótico

EXEMPLO 8

Avaliações de alterações na arquitetura de raiz nas plantas transgênicas Muitos traços chave na agricultura moderna podem ser explicados por alterações na arquitetura de raiz. 0 tamanho e profundidade da raiz correlacionam-se à tolerância de seca e eficiência do uso de fertilizante. Os sistemas de raiz mais profunda podem acessar a água em camadas mais profundas do solo. De forma 10 semelhante, um sistema de raiz altamente ramificada fornece melhor cobertura do solo, portanto, pode efetivamente absorver todos os macro e micronutrientes disponíveis resultantes na eficiência otimizada do uso de fertilizante.

Para testar se as plantas transgênicas produzem uma diferente estrutura de raiz, as plantas foram cultivadas em placas de ágar colocadas verticalmente. As placas foram fotografadas em dias alternados e o comprimento máximo e área total coberta pelas raizes da planta foram avaliados a partir das fotografias digitais. A partir de cada construção 20 criada, diversos eventos independentes de transformação foram verificados em duplicatas. Para avaliar as diferenças significativas entre as características da raiz, um ANOVA usando o teste t Students foi utilizado com a finalidade de identificar os eventos mostrando as características pendentes de raiz e fornecer um escore estatístico dos achados (ensaios estatísticos estão descritos acima).

Resultados

Ao analisar os diferentes aspectos da arquitetura de raiz, tal como área total da raiz coberta e profundidade máxima (comprimento) atingidos pelo sistema de raiz, foi averiguado que as plantas transgênicas expressando os genes FUE possuem características notáveis.

Por exemplo, as plantas transgênicas expressando em excesso FUE_10 e FUE_49 foram averiguadas como tendo uma maior cobertura de área de raiz com base nas medições realizadas 21 dias após a germinação (vide Tabela 45). Tabela 45: Área de Raiz (em cm") medida no dia 21

Os niveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes

De forma semelhante, as plantas expressando em excesso FUE_16 e FUE7 original foram averiguadas para produzir a arquitetura de raiz mais longa 20 (vide Tabela 46 abaixo). FUE_16 foi averiguado para produzir o sistema de raiz penetrante mais rápido de todas as construções testadas em todos os dias testados (7, 14 e 21 dias após a germinação).

Na prática, esses achados 25 sugerem que as plantas expressando em excesso FUE 16 e 2 5 FUE_7_Original atingem camadas de solo mais profundas comparadas às outras plantas no mesmo período de tempo. Essas plantas são esperadas para recuperar de forma máxima os fertilizantes e água do solo e suportar melhor os períodos mais longos de seca. Tabela 46: Análise estatística do comprimento da raiz (em cm) medida no dia 21

Os níveis não conectados pela mesma letra são significativamente diferentes

A arquitetura otimizada de raiz permite que as plantas transgênicas expressando os genes FUE absorvam de forma bem-sucedida os nutrientes (fertilizantes) e água disponíveis no solo. A captação e recuperação de nutriente aumentadas em uma característica chave para eficiência melhorada do uso de fertilizante e tolerância ao 15 estresse abiótico. Os sistemas de raiz mais profundos permitem que as plantas acessem a água disponível nas camadas mais profundas do solo, otimizando a tolerância para prolongar os períodos de seca e, portanto, garantir altos rendimentos também sob condições rígidas.

EXEMPLO 9

Plantas expressando FUE40 são caracterizadas por uma arquitetura de planta para produção máxima de semente.

A presença de múltiplos órgãos 25 produzindo semente (vagens, frutos, etc.) e fortes talos de floração é a característica chave para produzir altos JG£ rendimentos de semente. Ao reduzir a presente invenção à prática, os presentes inventores averiguaram de forma surpreendente que as plantas transgênicas expressando FUE_40 sob um promotor constitutivo melhoraram a arquitetura do 5 órgão reprodutivo. Os talos de floração eram raramente rigidos e fortes e transporte um grande número de siliquas (vide Figura 9 mostrando os diferentes eventos independentes de transformação). Os resultados foram confirmados por um ensaio triplo cego identificando as plantas com mais 10 siliquas por planta, provavelmente devido ao crescimento mais rápido dos brotos laterais de inflorescência. De forma interessante, todas as plantas eram diferentes eventos de transformação com a mesma construção, gene NUE4 0 sob o promotor 353 (vide Fig. 9) . Essa alteração nas 15 características de desenvolvimento da planta pode ser usada para significativamente aumentar o rendimento de semente de uma planta.

EXEMPLO 10

CT-9 (SEQ ID N° : 1340,1341) e 20 CT-71 (SEQ ID N° : 1342,1343) conferem tolerância à seca e rendimento aumentado do tomate transgênico

Ao ainda reduzir a presente invenção à prática, os presentes inventores revelaram de forma surpreendendo que CT_9 (SEQ ID N° . 1340, 1341 previamente revelada no Pedido PCT N° W02005/121354) e CT_71 (SEQ ID N°. 1342 e 1343, previamente revelada no Pedido -PCT N° WO2005/121364) confere resistência à seca e rendimentos aumentados nas plantas transgênicas expressando o mesmo. CT_9 e 0171 foram revelados no Pedido PCT N° W02005/121364 para Evogene Ltd. e na US5.597.718 (CT_71).

Materiais e Procedimentos Experimentais

Ensaio de seca - 0 ensaio de seca aqui descrito foi efetuado nas condições em campo imitando o estresse de seca ao controlar a quantidade de água abastecida e os intervalos de seca. 0 ensaio, sistema de irrigação por gotejamento de uma fonte (OSDI), é semelhante ao campo do fazendeiro, considerando que cria deficiência de água de uma forma relativamente uniforme e permite a medição do efeito da seca em populações de pequeno tamanho de plantas.

Assim, o presente método de irrigação pode ser efetuado conforme segue: (a) colocação em um solo de um sistema de irrigação por gotejamento de modo a obter os orifícios de irrigação distribuídos 20-40 cm (p.ex., 30 cm) entre si nas direções X e Y; e (b) irrigação continua através de cada um dos referidos orifícios de irrigação em uma taxa de irrigação de 0,5-2 litros de água por hora.

Uma configuração de um sistema de irrigação (10) para imitar as condições de seca que compreende os seguintes componentes e ilustrado na Figura 10 pode ser usada em conformidade com os ensinamentos da presente invenção: (i) um sistema de irrigação por gotejamento com uma pluralidade de orifícios de irrigação 12 distribuídos 20-40 cm entre si nas direções X e Y; e (ii) um sistema de controle e abastecimento de água 14 para continuamente irrigar cada um dos referidos orifícios de irrigação 0,5-2 litros de água por hora. Os gotejadores 5 preferidos usados são a linha de gotejador de parede espessa compensador por pressão com sistemas de anti-sifão e anti- dreno (UniRam™ CNL #16010, Taxa de Fluxo 1,6 1/h da Netafim Israel). O sistema anti-sifão impede o fluxo de retorno de sujeira na linha do gotejador enquanto o sistema de anti- 10 dreno (CNL) elimina o efeito de drenagem e reenchimento, e melhora a eficiência na irrigação por pulso. 0 método de OSDI foi desenvolvido com base nos sistemas de irrigação de aspersores de fonte de linha (Hanks et al. 1976 Soil Sei. 15 Soc Am. J. 40 p. 426-429) com modificações significativas.

Ao invés de irrigação por aspersor, a irrigação por gotejamento foi usada. Com a finalidade de criar uma camada úmida uniforme e profunda (pelo menos profundidade de 60cm) e não a camada com formato de cebola que é tipicamente 20 criada pela irrigação por gotejamento, um sistema de irrigação por gotejamento de compensação de baixa pressão foi usado que permite o fornecimento de pequena quantidade em um período de tempo relativamente longo. 0 experimento foi criado à luz 25 do solo durante o verão de 2006 (de julho a setembro), em um armazém em campo aberto próximo a Rehovot, Israel.

A capacidade de água do solo foi medida usando os procedimentos padrão ao amostrar o solo das seguintes três profundidades: 0 a 20 cm, 20 a 40 cm e 40 a 60 cm. 0 teor de água nessas camadas de solo foi medida rotineiramente a cada semana. 0 solo continha 5 de água higroscópica, enquanto a capacidade máxima de água do solo 5 era de 20 %. Todos os fertilizantes foram aplicados no solo antes da plantação. A quantidade de fósforo e potássio foi calculada como suficiente para toda a temporada. O nitrogênio foi aplicado conforme recomendado, igualmente a todos os tratamentos através do sistema de irrigação. 10 Cada fileira, com largura de 193 cm, continha as linhas de irrigação por gotejamento criando a cobertura de nove gotej adores por 1 metro quadrado. O controle de água foi feito separadamente pars cada tratamento. O solo foi seco completamente antes do 15 inicio do experimento.

A plantação foi feita em uma condição de sementeira sob irrigação regular de água. As mudas foram transplantadas após quatro semanas no solo úmido. A quantidade de água que foi usada para uniformemente 20 irrigar antes do transplante atingiu a capacidade máxima de água (20 % w/w) na profundidade de 60 cm, entretanto sem criação de sobrecarga de água. Cada planta foi transplantada próxima a um gotejador, 30 cm de distância entre as plantas com uma densidade total de 2600 plantas por 1000 metros 25 quadrados, de acordo com o protocolo comercial de crescimento. O experimento foi estruturado em quatro blocos contendo três fileiras irrigadas com diferentes níveis de água e intervalos (WLI-0, WLI-1, WLI-2). Os diferentes regimes de água tiveram inicio somente quatro semanas após a transplantação, quando as plantas atingiram a etapa de floração. A quantidade de água abastecida a cada semana durante o ensaio foi calculada em cada inicio da semana após 5 as recomendações dos protocolos padrão de crescimento. 0 tratamento WLI-0 recebeu o volume de irrigação semanal total recomendado, porém dividido em três irrigações. Os dois outros tratamentos (WLI-1 e WLI-2) representara dois diferentes niveis de 10 deficiência de água. O WLI-1 também foi irrigado três vezes por semana, porém a quantidade de água fornecida foi metade da irrigação fornecida ao WLI-0. No final de cada semana, as plantas WLI-1 receberam a quantidade de água exigida para atingir a capacidade máxima de água do solo. O WLI-2 não foi 15 irrigado durante a semana, porém, ao invés disso, no inicio de cada semana. A água foi fornecida para atingir a capacidade máxima de água. O experimento de estresse de água durou todo o periodo de floração (23 dias) correspondente a 4 ciclos dos estresses acima descritos. Após isso, todos os 20 tratamentos receberam a quantidade recomendada de água. O cálculo da quantidade de água era igual à diferença entre o teor de água no solo seco com capacidade máxima de água. No final de cada ciclo de estresse, a quantidade de água foi comparada entre os 25 tratamentos de acordo com o teor efetivo de água no solo (Tabela 47) . Tabela 47 Teor de água (%) no solo no final do 4o ciclo de estresse (23 dias)

De nota, durante os tratamentos do periodo de estresse WLI-1 e WLI-2 recebidos no total de 75 % menos água comparado ao controle (WLI-0).

Clonagem de gene e expressão 5 A identificação bioinformática, clonagem e avaliação fenotipica de CT-9 e CT-71 foram descritos na Patente N° : WO2005/121364 .

CT-9 ou CT-71 ligados às construções binárias, compreendendo o promotor 35S foram 10 transformados em plantas de tomate via transformação de Agrobacterium tumefacience. 60 μL das células competentes de Agrobacterium tumefaciens LB4404 (cerca de 10' células/mL) foram transformadas com 20 ng de plasmidio binário via 15 eletroporação, usando um eletroporador MicroPulser (Biorad), 0,2 cm de cadinhos (Biorad) e programa de eletroporação EC-2 (Biorad).

As células de Agrobacterium foram cultivadas em 0, 8 mL de meio líquido de LB em 28 °C 20 por 3 h e 0,2 mL da suspensão de célula foi preparada em placas de ágar LB complementadas com a estreptomicina de antibiótico de 300 mg/L (para cepa de Agrobacterium LB4404) e kanamicina 50 mg/L (Sigma) . As placas foram então incubadas em 28 °C por 48 h.

As colônias de Agrobacterium foram cultivadas e a amplificação por PCR foi realizada nas células de Agrobacterium, usando os iniciadores que foram projetados para estender a seqüência inserida no vetor binário.

Os produtos de PCR foram separados em 1,5 % de géis de agarose e os tamanhos de produto foram determinados ao comparar o meio de DNA (MBI Fermentas) . Os produtos de PCR com o tamanho previsto foram seqüenciados usando os iniciadores que foram usados para a amplificação de PCR. O seqüenciamento da seqüência inserida foi realizado para verificar que os clones corretos foram introduzidos nas células de Agrobacterium. 0 seqüenciamento de DNA foi efetuado usando o seqüenciador de ABI 377 (Amersham 15 Biosciences Inc.) .

Transformação das plantas de tomate Micro-Tom com CT_9 ou CT-71 - A transformação de tomate (Lycopersicon esculentum, var MicroTom) e cultivação das plantas transgênicas foi efetuada de acordo com Curtis 20 et al. 1995 Methods Mol Biol. 1995;44:59-70., e Meissner et. al. 2000. Plant J. 2000 May;22(3) :265-74. Após a transformação, as plantas de tomate TI MicroTom foram cultivadas em uma mistura contida em vasos de 1000 ml, até a colheita do conjunto de fruto e sementes T2 . As plantas 25 transgênicas de tomate micro-torn tomate expressando em excesso os genes CT-9 ou CT-71 sob a regulação do promotor 35S foram polinizadas de forma cruzada com as plantas de variedade comercial M82. Obtendo aleatoriamente quatro plantas originadas de quatro diferentes eventos de inserção representando o efeito de posição. Os híbridos de F1 que incluem o transgene foram usados para avaliação adicional. Como um controle negativo, as plantas não transgênicas que 5 se segregaram das mesmas populações transgênicas foram usadas. Para distinguir entre as plantas transgênicas e não transgênicas, uma triagem de PCR foi efetuada usando os iniciadores do gene NPTII conforme descrito no exemplo 6.

Resultados

Na etapa de amadurecimento do fruto de cerca de 90 % das frutas vermelhas, as plantas foram avaliadas e os frutos foram colhidos. O desempenho da planta foi avaliado ao medir a massa das coberturas, comprimento de raiz e massa. A produção foi medida ao obter os frutos de tamanho total vermelhos e verdes para cada planta. Os resultados foram analisados usando o teste de um lado Anova e resumidos na Tabela 48, abaixo. Tabela 48: Rendimento total de fruto das linhas de planta cultivadas sob estresse de água 20 severo (WLI-2) expressando o gene CT-9 comparado às plantas de controle.

a, b, c - Níveis não conectados pela mesma letra são estatisticamente diferentes significativamente em P<0,05 expressando em excesso CT-9 mostraram significativamente maior rendimento do fruto sob condições severas de deficiência de água (WLI-2) comparadas às plantas de controle.

A melhoria no rendimento foi observada também sob irrigação regular de água para as linhas expressando CT-9 e CT-71 (vide Tabela 49, abaixo) . Tabela 49: Rendimento total de fruto das linhas de planta expressando em excesso CT-9 comparado às plantas de controle cultivadas sob irrigação favorável de água (WLI-0)

a, b, c - Niveis não conectados pela mesma letra são estatisticamente diferentes significativamente em P<0,05 EXEMPLO 11 Plants expressando em excessc FUE_34_Evo são caracterizadas pela ramificação otimizada lateral 0 controle da ativação lateral de botões pode ter um importante papel na agricultura 20 moderna e criação de flores e ornamentos. No caso da criação moderna do milho, os criadores trabalharam por muitos anos com relação à redução de brotos (ramos lateral) com a finalidade de criar plantas de única casca que atingem a maturação simultaneamente. Por outro lado, o controle de 25 afilhamento na criação do arroz também possui importância, pois cascas múltiplas permitirão a produção de diversas paniculas na mesma planta, enquanto o afilhamento em excesso possui efeitos deletérios sobre a planta. De forma semelhante, a ramificação lateral é importante para 5 ornamentos, por exemplo, para produzir múltiplas flores a partir do mesmo talo, ou para produzir flores grandes únicas a partir de cada talo. Conforme mostrado na Figura 8, as plantas que expressam FUE_34_Evo exógeno são K) caracterizadas por ramificação múltipla do broto. A expressão de FUE_34 Evo (SED ID N° : 54) sob um promotor ubíquo constitutivo provocava fenótipo de ramificação lateral ativo raramente. Todos os eventos transqênicos obtidos com essas construções exibem esse fenótipo 15 específico de ramificação em cada nó. Esse fenótipo pode ser resultado de perda da dominância apical da planta ou mais provável à expressão contínua de Evo J34 Evo de acordo com o promotor constitutivo ubíquo. Evo_34 é um fator de transcrição de caixa MADS que contém, além disso, os locais 2() de fosforilaçâo putativos para quinase de proteina dependente de cAMP-e cGMP, quinase de caseína II e quinase de Proteína C. A expressão de acordo com um promotor preferido de raiz, tal como, RootP provocada pela criação de um fenótipo de raiz altamente ramificado compacto. 25 FUE_34_Evo pode ser, portanto, usado, por exemplo, para projetar plantas com ramificação controlada, adicionando um promotor induzível ou constitutivo ativo em determinadas partes anatômicas da planta e/ou determinadas etapas de 151/164 desenvolvimento. De forma semelhante, o gene pode ser silenciado e, dessa forma, o afilhamento ou ramificação lateral terão a alta probabilidade de ser evitado. Outro uso potencial para esse gene é para MAS (Criação assistida de 5 marcador).

EXEMPLO 12

Seqüências ortólogas e homólogas A Tabela 50 lista um resumo das 10 seqüências ortólogas e homólogas das seqüências de polinucleotídio e seqüências de polipeptidio da invenção identificada usando BLAST (programa TBLASTX) com pelo menos 85% de semelhança em pelo menos 85? de todo o comprimento da proteína. Tabela 50

É apreciado que determinadas características da invenção, que sâo, descritas no contexto de configurações separadas, também podem ser fornecidas em combinação em uma única 5 configuração. De forma oposta, diversas características da invenção, que são, para brevidade, descritas no contexto de uma única configuração, podem também ser fornecidas separadamente ou em qualquer sub-combinação adequada.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com suas configurações, fica evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão aparentes para aqueles com habilidade na técnica. De forma correspondente, tem a intenção de abranger todas as tais alternativas, modificações e variações que ficam dentro do espirito e amplo escopo das reivindicações anexas. Todas as publicações, patentes e pedidos de patente e números de Acessão de GenBank mencionados nesta especificação são neste ato incorporados em sua totalidade na especificação, na 5 mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual ou número de Acessão de GenBank estava especificamente e individualmente indicado como sendo aqui incorporado por referência. Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência neste pedido não será 10 interpretada como uma admissão de que tal referência está disponível como técnica anterior da presente invenção. Legendas das figuras FIGURA 1a

Claims (9)

1. "MÉTODO PARA AUMENTAR A TOLERÂNCIA DE UMA PLANTA A UMA CONDIÇÃO DE ESTRESSE ABIÓTICO”, caracterizado pelo fato de que compreende expressar exogenamente dentro da planta uma sequência de ácido nucleico definida pela SEQ ID NO: 1331, que codifica o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido descrita na SEQ ID NO: 167, ou uma sequência degenerada da SEQ ID NO: 1331 que codifica o dito polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido descrita na SEQ ID NO: 167, assim aumentando a tolerância de uma planta à condição de estresse abiótico.

2. "MÉTODO PARA AUMENTAR A BIOMASSA, O VIGOR, E/OU O RENDIMENTO DE UMA PLANTA”, caracterizado pelo fato de que compreende expressar exogenamente dentro da planta uma sequência de ácido nucleico definida pela SEQ ID NO: 1331, que codifica o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 167, ou uma sequência degenerada da SEQ ID NO: 1331 que codifica o dito polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido descrita na SEQ ID NO: 167, assim aumentando a biomassa, o vigor e/ou o rendimento de uma planta.

3. "MÉTODO PARA AUMENTAR A EFICIÊNCIA DE USO DE FERTILIZANTE E/OU ABSORÇÃO DE UMA PLANTA”, caracterizado pelo fato de que compreende expressar exogenamente dentro da planta uma sequência de ácido nucleico definida pela SEQ ID NO: 1331, que codifica o polipeptídeo que possui a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 167, ou uma sequência degenerada da SEQ ID NO: 1331, que codifica o dito polipeptídeo que possui a sequência de aminoácido descrita na SEQ ID NO: 167, assim aumentando a eficiência de uso de fertilizante e/ou a captação de uma planta.

4. "MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido estresse abiótico é selecionado do grupo consistindo de salinidade, seca, temperatura baixa, temperatura alta, toxicidade de metal pesado, anaerobiose, osmótico e deficiência de nutriente.

5. "MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido estresse abiótico é selecionado do grupo consistindo de salinidade, seca, osmótico e deficiência de nutriente.

6. "MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que referido estresse abiótico é selecionado do grupo consistindo de salinidade e osmótico.

7. "MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que referido nutriente é nitrogênio.

8. "MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida sequência de ácido nucleico é selecionada do grupo consistindo das SEQ ID NOs: 1331 e 58.

9. "MÉTODO”, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a 5 referida condição é uma condição de deficiência de fertilizante.

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