CN111218452B

CN111218452B - 一种重组人tsg-6基因、重组人tsg-6蛋白标准品及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN111218452B
Application number: CN202010116879.1A
Authority: CN
Inventors: 王明丽; 何志远; 吴博; 蒋敏之; 夏兵兵; 周炜
Original assignee: Wuhu Tianming Biotechnology Co ltd
Current assignee: Wuhu Tianming Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2040-02-25
Also published as: CN111218452A

Abstract

本发明公开了一种重组人TSG‑6基因、重组人TSG‑6蛋白标准品及其制备方法和应用，本发明通过对已有的重组人TSG‑6基因进行优化后，克隆至pET‑32a表达载体中并转化至大肠杆菌中，培养后经诱导表达，经表达后的菌体经洗涤、变性、复性即可得到重组人TSG‑6蛋白粗品，再经分离纯化后得到重组人TSG‑6蛋白纯品，然后与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，制备得到所述重组人TSG‑6蛋白标准品；与现有技术相比，本发明通过密码子优化实现重组人TSG‑6蛋白的高效表达，并实现了重组人TSG‑6蛋白标准品的批量制备，以此为标准可使不同批次测定的重组人TSG‑6蛋白效价检测结果更为可靠可信。

Description

一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤坏死因子α刺激基因6(tumor necrosis factor-αstimulated gene 6，TSG-6)是一种炎症相关的分泌性蛋白，是由间充质干细胞或基质细胞(MSCs)对炎症信号的反应产生的，在多种炎症性疾病或类炎症性病理过程中呈高表达。现已知，TSG-6介导了许多免疫调节和组织修复过程，具有抗炎和组织保护作用，是一个正调节的功能蛋白。

TSG-6是由TNFAIP6(tumor necrosis factor-inducible gene 6 protein，TNFAIP6)基因编码，是Lee等在筛选肿瘤坏死因子α干预的人二倍体FS-4成纤维cDNA文库时发现的一个新基因。

TSG-6基因主要是由相邻的两个组件即Link组件和CUB组件组成，其中Link组件负责与信号分子识别，与透明质酸(hyaluronicacid，HA)、硫酸软骨素、蛋白多糖以及蛋白聚糖的G1链等结合，而CUB则作为功能区发挥其生物学作用。TSG-6基因启动子序列中存在激活物蛋白1(AP－1)和核因子白细胞介素(NF-IL6)结合位点，当受到TNF-α、白介素－1(IL-1)等致炎因子刺激后，该基因在成纤维细胞中表达显著增高，因此被认为是一个受TNF-α等炎症因子调节的基因。TSG-6基因位于人染色体2q23 3，mRNA全长1440bp，其编码的蛋白含有277个氨基酸残基，属于透明质酸结合蛋白家族，具有多种功能，包括抑制中性粒细胞移行，蛋白网络的调控等，是一个由TNF-α诱导的、参与多种炎症反应的基因，在多种炎症性疾病或类似炎症的疾病过程中呈高表达，通过与透明质酸、间α-蛋白酶抑制剂结合，介导炎性细胞的迁移、黏附，参与细胞外基质重塑，调节蛋白酶网络，是一个正调节的功能蛋白，在许多病理及生理过程中，以及炎症反应和组织重塑中扮演重要角色。

大量研究表明，TSG-6是一种效果明显的抗炎因子，在肝炎、关节炎、视网膜炎、组织损伤、瘢痕疙瘩等炎症过程中，TSG-6均能够抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6等的表达，并且具有抑制中性粒细胞浸润等功能，发挥较强的抗炎作用。在机体遭受感染、创伤等侵害时，适度的炎症反应会有利于机体清除病原体，修复损伤。而如果炎症反应持续很长时间，程度剧烈，则会对机体有害。

虽然TSG-6的研究及其生物学功能得到日益重视，但至今尚未见到该重组蛋白具有抗病毒活性及其大批量制备其标准品的制备方法等报告。本发明首次发现，重组人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG-6)在体内外均具有抗病毒活性。填补了此领域的空白。

发明内容

本发明提供了一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用。具体为：对已有的重组人TSG-6基因进行优化后，克隆至pET-32a表达载体中并转化至大肠埃希菌中。经培养后诱导表达；对表达后的菌体进行洗涤、变性和复性，即可得到重组人TSG-6蛋白；再经分离纯化后得到重组人TSG-6蛋白纯品。然后与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，制备得到所述重组人TSG-6蛋白标准品。本发明通过密码子优化实现重组人TSG-6蛋白的高效表达，并实现了重组人TSG-6蛋白标准品的批量制备。同时，本发明提供了一种基于rhTSG-6能够保护MDBK细胞，但不限于此种细胞免受VSV病毒，但不限于此种病毒侵害作用的现象作为抗病毒活性检测结果体系，即采用细胞病变抑制法用于体外检测rhTSG-6抗病毒活性的方法。本方法能准确客观地观察与检测TSG-6抗病毒活性，重复性及准确度均高。经本方法验证，rhTSG-6标准品抗VSV病毒的效价高达约1000.00U/mL。

采用上述细胞病变抑制法检测rhTSG-6标准品可抑制感染了VSV病毒的细胞发生细胞病变，以此为评价结果的标准，可使不同批次测定的重组人TSG-6蛋白效价检测结果更为可靠可信。

本发明采取的技术方案为：

一种重组人TSG-6基因，所述重组人TSG-6基因的序列如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示。

所述重组人TSG-6基因编码的重组人TSG-6蛋白的氨基酸序列如SEQUENCELISTING 400〈3〉所示。其在氨基酸残基序列上删除了N端16个氨基酸残基，该部分序列为信号肽序列，不利于rhTSG-6在原核***中表达，而本发明提供的重组人TSG-6表达量较之前提高了100倍。

本发明还提供了一种重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

(1)对如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示的重组人TSG-6基因中AGG、AGA、ATA、CTA、CGA、CGG、CCC和UCG等稀有密码子进行密码子优化，获得如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示的重组人TSG-6基因，通过优化可提高密码子适应指数，能提高目的蛋白的表达量水平；

(2)将步骤(1)所得的重组人TSG-6基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至BL21(DE3)大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，得到重组人TSG-6重组菌BL21/pET32a-rhTSG-6；

(3)将重组人TSG-6重组菌进行放大培养，并经IPTG诱导表达，然后收集菌体；

(4)将步骤(3)收集的菌体破碎，离心后收集沉淀，沉淀经洗涤、变性、复性即可得到重组人TSG-6蛋白粗制品；

(5)重组人TSG-6蛋白粗品经分离纯化后即可得到重组人TSG-6蛋白纯品；

(6)重组人TSG-6蛋白纯品与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，即可得到所述重组人TSG-6蛋白标准品。

进一步地，步骤(2)中，还包括对LB平板上培养得到的单菌落进行PCR及BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，鉴定结果为阳性即说明重组人TSG-6重组菌构建成功。

根据目的基因序列使用Primer Premier 5软件设计首尾引物，所述PCR鉴定时的引物为：

F1：GGATCCTGGGGTTTTAAAGATGGC；

R1：AAGCTTTTACAGATGACTAAAGCGAC。

步骤(3)中，放大培养所用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基；培养至OD值在0.6-0.8，然后经终浓度为1.0mM的IPTG在30℃诱导表达5h。

步骤(5)中，所述分离纯化的方法为：将重组人TSG-6蛋白粗品过滤处理后过His-tag亲和层析柱纯化，收集纯化后的重组人TSG-6蛋白透析，然后调节pH至5.0；再经阴离子交换层析柱纯化，即可得到所述重组人TSG-6蛋白。

步骤(5)中，所述His-tag亲和层析柱纯化所用的洗脱液为50mMTris-Cl和500mM咪唑组成的混合液，其pH为8.0。

步骤(6)中，所述冻干保护剂为终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL组成的PBS混合液。

本发明还提供了根据所述制备方法制备得到的重组人TSG-6蛋白标准品。

本发明还提供了重组人TSG-6蛋白标准品在抗病毒药物中的应用，本发明基于MDBK/VSV效价测定***上测定了其抗病毒活性，结果显示，该重组人TSG-6蛋白标准品可抑制感染了VSV病毒的细胞发生病变，表明其具有抗VSV病毒的活性，且其效价为1.59×10³IU/mL。

本发明首次发现，重组人TSG-6(recombinant human TSG-6，rhTSG-6)在体内外均具有抗病毒活性。rhTSG-6抗病毒活性现象的检测以rhTSG-6抑制病毒致细胞病变效应(cytopathic effect,CPE)现象作为检测其活性的结果，即以每毫升rhTSG-6检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50％)免受病毒的攻击的稀释度的倒数定为rhTSG-6单位(或称效价)，常以单位(U)表示。该结果经用结晶紫对存活的MDBK细胞染色观察后，根据着色深浅，按Reed-Muench公式计算出所测rhTSG-6的抗病毒活性。

本发明具有以下优点：

1、通过密码子优化并删除了N端16个氨基酸残基的信号肽序列，实现重组人TSG-6蛋白的高效表达，较国内已知的重组人TSG-6蛋白的原核表达产量提高了100倍。

2、本发明首次发现，制备的重组人TSG-6蛋白标准品在体外基于MDBK/VSV效价测定***上显示其具有抗VSV病毒活性。

3、本发明重组人TSG-6蛋白标准品经亲和层析和阴离子交换层析，具有比普通大肠埃希工程菌制备的重组蛋白更高的纯度，纯度达90％以上。

4、以重组大肠埃希工程菌BL21/pET32a-rhTSG-6作为表达菌株，具有生产成本低、产量高等优势，适用于大规模的工业化生产。

附图说明

图1为优化后的重组人TSG-6基因PCR鉴定的结果，其中泳道M：DNA MarkerDL2000；泳道1：阴性对照；泳道2-5：优化后的重组人TSG-6基因PCR鉴定结果；

图2所示为重组质粒pET32a-rhTSG-6双酶切鉴定结果；其中M为DNA MarkerDL2000；泳道1为重组质粒pET32a-rhTSG-6经BamHI和HindⅢ双酶切结果，泳道2、3分别为重组质粒pET32a-rhTSG-6经BamHI和HindⅢ单酶切结果，泳道4为重组质粒pET32a-rhTSG-6阴性对照；

图3所示为30℃时使用1.0mM IPTG诱导表达的重组人TSG-6蛋白SDS-PAGE电泳检测结果；其中M为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2为重组人TSG-6工程菌诱导5h后菌体表达的全蛋白；泳道3为重组人TSG-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的沉淀，泳道4为重组人TSG-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的上清。

图4所示为重组人TSG-6蛋白表达方式检测结果，其中M为蛋白marker，泳道1为同条件下诱导所得空载体菌体总蛋白，泳道2为重组人TSG-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的上清，泳道3为重组人TSG-6工程菌诱导5h后菌体破碎后的沉淀；

图5所示为Western Blot鉴定重组人TSG-6蛋白结果；其中M为蛋白marker，泳道1为空载体菌体破碎后总蛋白，泳道2为重组人TSG-6蛋白样品；

图6所示为重组人TSG-6蛋白纯化后SDS-PAGE电泳检测结果；其中M为蛋白marker，泳道2为纯化前的重组人TSG-6蛋白溶液，泳道3为纯化后的重组人TSG-6蛋白标准品；

图7所示为重组人TSG-6蛋白标准品效价滴定结果，其中A为重组人干扰素α标准品，B为重组人TSG-6蛋白标准品。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

一种重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，包括以下步骤：

(1)对根据Genebank中已报道的如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示的重组人TSG-6基因进行密码子优化，使用化学合成的方法获得如SEQUENCE LISTING 400〈2〉所示重组人TSG-6基因，优化前密码子适应指数(CAI)为0.73，优化后CAI为0.97。

(2)将步骤(1)所得的重组人TSG-6基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至BL21大肠杆菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，挑取LB平板上单菌落进行PCR及BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，阳性即表示该表达载体构建成功，得到重组人TSG-6重组菌；PCR扩增和双酶切产物经琼脂糖凝胶电泳1号泳道在800bp附近出现单一条带，如图1、2所示；

PCR鉴定引物为：

F1：GGATCCTGGGGTTTTAAAGATGGC(BamH Ⅰ)；

R1：AAGCTTTTACAGATGACTAAAGCGAC(Hind Ⅲ)。

(3)挑取重组人TSG-6重组菌于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中震荡培养，后在含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中放大培养2～3h后，测OD值在0.6-0.8时，加入终浓度1.0mM IPTG，30℃诱导表达5h，收集菌体；经SDS-PAGE电泳分析，如图3所示，经IPTG诱导表达5h后的菌体蛋白在45.0kD处可见优势表达条带，表达量达到60％；经Western blot鉴定，如图5所示，经IPTG诱导表达5h后的菌体蛋白能与兔抗人TSG-6多克隆抗体发生特异性反应，在45kD左右处出现特异性条带，且特异性高；

其中Western blot鉴定方法为：以Abcam公司兔抗人TSG-6多克隆抗体为一抗(1：500稀释)，以中杉金桥公司HRP标记山羊抗兔IgG为二抗(1：50000稀释)。

(4)将步骤(3)收集的菌体，使用200mL的PBS重悬菌体，4℃超声破碎细菌沉淀，超声的条件为：功率：400W，工作3S，间隔3S，超声6min，重复3～4次；12000r/min离心20min分离上清和沉淀，分离出的包涵体沉淀经过含、洗涤、变性和复性，复性产物即为重组人TSG-6蛋白粗制品。分别取沉淀和上清及菌体经SDS-PAGE电泳检测，如图4所示。经SDS-PAGE电泳分析，该重组蛋白为包涵体表达。

所述洗涤、变性和复性的方法为：

①洗涤：使用洗涤缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，2mol/L尿素，1mmol/LEDTA，0.5％TritonX-100，pH为8.0)以1∶20的湿重体积比对包涵体(10g)进行重悬，洗涤2h，12000r/min离心20min取沉淀，再重复洗涤一次；

②变性：称量洗涤后沉淀湿重(4.8g)，再用溶解缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，7mol/L盐酸胍，0.1％β-巯基乙醇，pH为8.45)以1∶50的湿重体积比重悬沉淀(240ml)，置于磁力搅拌器上过夜，充分溶解；

③稀释复性：配制复性缓冲液(50mmol/L Tris，100mmol/L NaCl，1mmol/L GSH，0.2mmol/L GSSG，pH8.0)进行复性。取溶解后的蛋白溶液，12000r/min离心20min取上清，加入等体积的复性缓冲液(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h；再加入复性缓冲液稀释至原体积的4倍(加500ml复性缓冲液)，4℃静置3h；最后加入复性缓冲液稀释至原体积的5倍(加250ml复性缓冲液)，4℃静置3h。

(5)重组人TSG-6蛋白粗制品过滤处理后过His-tag亲和层析柱，用Elutionbuffer(50mMTris-Cl、500mM咪唑pH 8.0)梯度洗脱，收集显示出重组人TSG-6蛋白紫外吸收峰的蛋白，置于10倍体积的Tris-HCl缓冲液中4℃透析6h以上，透析两次去除高浓度咪唑，调节pH至5.0，使用1M NaCl洗脱液过阴离子交换层析柱收集流穿液即为重组人TSG-6蛋白纯品，经SDS-PAGE检测，结果如图6所示，从图中可以看出制备的目的蛋白纯度达到90％以上。

(6)将步骤(5)得到的重组人TSG-6蛋白纯品与冻干保护剂按照1∶1等体积混合后，经冷冻干燥，即可得到所述重组人TSG-6蛋白标准品，其规格为40μg/支(即每支重组人TSG-6蛋白标准品中含有rhTSG-6完全抗原的量为40μg)；所述冻干保护剂为甘油、甘露醇和蔗糖的PBS混合液，三者在10mmol/L PBS缓冲液中的终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL。

实施例2

重组人TSG-6蛋白标准品的抗病毒活性效价测定

a.实验材料：

重组人干扰素α标准品：其效价为3.0×10⁶IU/mL，作为已知阳性对照品，购自北京中国食品药品鉴定研究院，干扰素α国家标准品，批号：97/04，下称标化干扰素；

重组人TSG-6蛋白标准品：由实施例1制得，作为供试品；

细胞株：牛肾细胞(MDBK)，购自ATCC；

病毒株：攻击病毒为水疱性口炎病毒(VSV)，由安徽医科大学临床病毒研究所惠赠。

b.实验方法

在无菌条件下操作，取重组人TSG-6蛋白标准品1支加入1mL注射用水溶解，接着再将其在试剂瓶中用含10％新生牛血清的DMEM细胞营养液稀释100倍后加入96孔细胞培养板中继续进行二倍递增系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2孔。再取重组人干扰素α标准品，按说明书复溶后，先用含10％新生牛血清的DMEM细胞营养液稀释100000倍至每毫升含30IU，再将其加入96孔细胞培养板中，做二倍递增系列稀释，共10个稀释度，每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。同时设置细胞对照组和病毒对照组。

将处于对数生长期的MDBK细胞即传代后36～48h已形成单层，镜下观察发现，细胞铺满单层，透明度高时，即可用于制备单细胞悬液。调整细胞数为5×10⁵/mL，按100μL/孔加入上述96孔板孔中，置37℃、5％CO₂电热恒温培养箱培养24h左右。观察到细胞长满了单层而且其生长状态良好时，弃去各孔内培养液，加入新鲜配制的含2％新生牛血清DMEM细胞维持液稀释VSV病毒悬液至每毫升为100TCID₅₀，按照每孔100μL量加到各孔中；但细胞对照组仅加入等量的维持液。然后置37℃、5％CO₂电热恒温培养箱内培养24h。

将电热恒温培养箱内的培养物置倒置显微镜下观察。首先观察“细胞对照孔”和“病毒对照孔”，各孔中出现的CPE用“+”表示。当病毒对照孔出现“+++或++++”，即病毒对照孔中的细胞出现75％～100％的明显病变和死亡脱落，而细胞对照孔中的细胞基本生长状态良好时，则表明本次试验对照***合格，否则弃去重做。此时即可判定结果。加结晶紫染色液50μL/孔，3～5min后脱色即可记录结果，结晶紫染色结果如图7所示。

++++表示全部细胞病变；

+++表示75％细胞病变；

++表示50％细胞病变；

+表示25％细胞病变；

肉眼观察记录，板孔着色完整良好呈紫色全覆盖状态如细胞对照孔C，则判为CPE(-)；干扰素保护孔应有板孔结果呈紫色全覆盖状态(-)，100％病变细胞为细胞全脱落故无色，如病毒对照孔和无干扰素保护的板孔均无色，则判为CPE(++++)。

根据Reed-Munch公式计算

稀释度的对数：lg(1/2)＝-0.3；

高于50％病变的细胞病变抑制率的稀释度的对数：lg(1/8)＝-0.9；

lg(抑制50％的细胞病变的最高稀释度)＝距离此例×稀释度对数+高于50％病变率的稀释度的对数+稀释倍数＝0.38×(-0.3)+(-0.9)+(-2)＝-3.01；

抑制50％的细胞病变的最高稀释度＝10^-3.01；

即此次干扰素标准品稀释到10^-3.01(1︰1023)时，能保护半数细胞免受“攻击病毒”侵害。即重组人TSG-6蛋白标准品的工作效价为1.02×10³U/mL。同理可计算重组人干扰素α的工作效价为2.89×10⁶IU/mL。

工作单位修正：R1：R2＝X1：X2

如上所示：R1＝3.0×10⁶IU/mL，R2＝2.89×10⁶IU/mL，X2＝1.02×10³IU/mL；

R1：干扰素标准品的标准工作单位；R2：在相同条件下测定的干扰素标准品的工作单位；X2：待检重组人TSG-6蛋白标准品测定的工作单位；X1：修正后待检重组人TSG-6蛋白标准品的工作单位。

修正后所得效价：X1＝1.59×10³IU/mL即为最终重组人TSG-6蛋白标准品效价标定结果。

从此实施例也可以看出本发明提供的重组人TSG-6蛋白标准品可抑制感染了VSV病毒的MDBK细胞发生细胞病变。因此，其可以作为抗VSV病毒的药物进行应用。

上述参照实施例对一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法及应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均属本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 芜湖天明生物技术有限公司

<120> 一种重组人TSG-6基因、重组人TSG-6蛋白标准品及其制备方法和应用

<130> 1

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 780

<212> DNA

<213> 优化前的TSG-6基因

<400> 1

tggggattca aggatggaat ttttcataac tccatatggc ttgaacgagc agccggtgtg 60

taccacagag aagcacggtc tggcaaatac aagctcacct acgcagaagc taaggcggtg 120

tgtgaatttg aaggcggcca tctcgcaact tacaagcagc tagaggcagc cagaaaaatt 180

ggatttcatg tctgtgctgc tggatggatg gctaagggca gagttggata ccccattgtg 240

aagccagggc ccaactgtgg atttggaaaa actggcatta ttgattatgg aatccgtctc 300

aataggagtg aaagatggga tgcctattgc tacaacccac acgcaaagga gtgtggtggc 360

gtctttacag atccaaagca aatttttaaa tctccaggct tcccaaatga gtacgaagat 420

aaccaaatct gctactggca cattagactc aagtatggtc agcgtattca cctgagtttt 480

ttagattttg accttgaaga tgacccaggt tgcttggctg attatgttga aatatatgac 540

agttacgatg atgtccatgg ctttgtggga agatactgtg gagatgagct tccagatgac 600

atcatcagta caggaaatgt catgaccttg aagtttctaa gtgatgcttc agtgacagct 660

ggaggtttcc aaatcaaata tgttgcaatg gatcctgtat ccaaatccag tcaaggaaaa 720

aatacaagta ctacttctac tggaaataaa aactttttag ctggaagatt tagccactta 780

<210> 2

<211> 783

<212> DNA

<213> 优化后的TSG-6基因

<400> 2

tggggtttta aagatggcat ttttcataat agcatctggc tggaacgcgc cgccggcgtt 60

tatcatcgtg aagcccgtag tggcaaatat aaactgacct atgcagaagc caaagcagtg 120

tgcgaatttg aaggcggtca tctggcaacc tataaacagc tggaagcagc ccgtaaaatt 180

ggctttcatg tgtgcgcagc cggttggatg gccaaaggtc gcgtgggcta tccgattgtg 240

aaaccgggcc cgaattgcgg ttttggcaaa accggtatta ttgattatgg tattcgtctg 300

aatcgtagtg aacgttggga tgcctattgt tataatccgc atgcaaaaga atgcggtggc 360

gtttttaccg atccgaaaca gatttttaaa agcccgggct ttccgaatga atatgaagat 420

aatcagatct gctactggca tattcgtctg aaatatggtc agcgcattca tctgagtttt 480

ctggattttg atctggaaga tgatccgggc tgcctggcag attatgttga aatctatgat 540

agctatgacg atgttcatgg ttttgtgggt cgctattgtg gtgacgaact gccggatgat 600

attattagta ccggcaatgt gatgaccctg aaatttctga gtgatgccag cgtgaccgca 660

ggcggttttc agattaagta tgttgcaatg gaccctgtga gcaaaagcag ccagggcaaa 720

aataccagta ccaccagtac cggtaataag aattttctgg ccggtcgctt tagtcatctg 780

taa 783

<210> 3

<211> 260

<212> PRT

<213> 重组人TSG-6的氨基酸序列

<400> 3

Trp Gly Phe Lys Asp Gly Ile Phe His Asn Ser Ile Trp Leu Glu Arg

1 5 10 15

Ala Ala Gly Val Tyr His Arg Glu Ala Arg Ser Gly Lys Tyr Lys Leu

20 25 30

Thr Tyr Ala Glu Ala Lys Ala Val Cys Glu Phe Glu Gly Gly His Leu

35 40 45

Ala Thr Tyr Lys Gln Leu Glu Ala Ala Arg Lys Ile Gly Phe His Val

50 55 60

Cys Ala Ala Gly Trp Met Ala Lys Gly Arg Val Gly Tyr Pro Ile Val

65 70 75 80

Lys Pro Gly Pro Asn Cys Gly Phe Gly Lys Thr Gly Ile Ile Asp Tyr

85 90 95

Gly Ile Arg Leu Asn Arg Ser Glu Arg Trp Asp Ala Tyr Cys Tyr Asn

100 105 110

Pro His Ala Lys Glu Cys Gly Gly Val Phe Thr Asp Pro Lys Gln Ile

115 120 125

Phe Lys Ser Pro Gly Phe Pro Asn Glu Tyr Glu Asp Asn Gln Ile Cys

130 135 140

Tyr Trp His Ile Arg Leu Lys Tyr Gly Gln Arg Ile His Leu Ser Phe

145 150 155 160

Leu Asp Phe Asp Leu Glu Asp Asp Pro Gly Cys Leu Ala Asp Tyr Val

165 170 175

Glu Ile Tyr Asp Ser Tyr Asp Asp Val His Gly Phe Val Gly Arg Tyr

180 185 190

Cys Gly Asp Glu Leu Pro Asp Asp Ile Ile Ser Thr Gly Asn Val Met

195 200 205

Thr Leu Lys Phe Leu Ser Asp Ala Ser Val Thr Ala Gly Gly Phe Gln

210 215 220

Ile Lys Tyr Val Ala Met Asp Pro Ala Ser Lys Ser Ser Gln Gly Lys

225 230 235 240

Asn Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Asn Tyr Asn Phe Leu Ala Gly Arg

245 250 255

Phe Ser His Leu

260

Claims

1.一种重组人TSG-6基因，其特征在于，所述重组人TSG-6基因的序列如SEQUENCELISTING 400〈2〉所示；所述重组人TSG-6基因编码的重组人TSG-6蛋白的效价为1.59×10³IU/mL。

2.一种重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

（1）对如SEQUENCE LISTING 400〈1〉所示的重组人TSG-6基因进行密码子优化，获得如权利要求1所述的重组人TSG-6基因；

（2）将步骤（1）所得的重组人TSG-6基因亚克隆至pET-32a表达载体中并转化至BL21（DE3）大肠埃希菌中，涂布含氨苄青霉素的LB平板培养过夜，得到重组人TSG-6重组菌；

（3）将重组人TSG-6重组菌进行放大培养，并经IPTG诱导表达，然后收集菌体；

（4）将步骤（3）收集的菌体破碎，离心后收集沉淀，沉淀经洗涤、变性、复性即可得到重组人TSG-6蛋白粗制品；

（5）重组人TSG-6蛋白粗品经分离纯化后即可得到重组人TSG-6蛋白纯品；

（6）重组人TSG-6蛋白纯品与冻干保护剂混合后，经冷冻干燥，即可得到所述重组人TSG-6蛋白标准品。

3.根据权利要求2所述的重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，还包括对LB平板上培养得到的单菌落进行PCR及BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定的步骤，鉴定结果为阳性即说明重组人TSG-6重组菌构建成功。

4.根据权利要求2所述的重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，放大培养所用的培养基为含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基；培养至OD值在0.6-0.8，然后经终浓度为1.0mM的 IPTG在30℃诱导表达5h。

5.根据权利要求2所述的重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述分离纯化的方法为：将重组人TSG-6蛋白粗制品过滤处理后过His-tag亲和层析柱纯化，收集纯化后的重组人TSG-6蛋白透析，然后调节pH至5.0；再经阴离子交换层析柱纯化，即可得到所述重组人TSG-6蛋白纯品。

6.根据权利要求5所述的重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述His-tag亲和层析柱纯化所用的洗脱液为50mMTris-Cl和500mM咪唑组成的混合液，其pH为 8.0。

7.根据权利要求2所述的重组人TSG-6蛋白标准品的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，所述冻干保护剂为终浓度为甘油100mL/L、甘露醇0.12g/mL和蔗糖0.025g/mL组成的PBS混合液。