DE60216606T2 - Zellwanderungsassay - Google Patents

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Description

  • Verwandte Anmeldungen
  • Diese Anmeldung beansprucht Priorität aus der vorläufigen U.S. Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 60/296.682, eingereicht am 7. Juni 2001.
  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung richtet sich auf einen Assay zum Identifizieren von Antagonisten von Rezeptoren für chemische Lockstoffe wie zum Beispiel Chemokinrezeptoren. Im Vergleich mit früheren Assays besteht ein Vorteil des Assays in seiner Fähigkeit, echte Antagonisten eines Rezeptors für chemische Lockstoffe von den Verbindungen, die falsch positive und negative Signale erzeugen, zu unterscheiden.
  • Hintergrund
  • Verfahren zur Hochdurchsatz-Durchmusterung („High-throughput screening", HTS) zum Identifizieren von Antagonisten von Rezeptoren für chemische Lockstoffe beruhen oft darauf, Störungen in nachgeschalteten Ereignissen, wie zum Beispiel der Zellwanderung, zu ermitteln. Im Fall der Chemokinrezeptoren wird oft die Zellwanderung von Leukozyten untersucht. Jedoch ahmen Verbindungen, die Zellmembranen zerreißen oder nachgeschaltete Ereignisse blockieren, diese Ergebnisse oft nach und geben sich so als Kandidaten für Antagonisten aus. Es ist dann ein erheblicher Aufwand erforderlich, um die echten Antagonisten von den Verbindungen oder Molekülen, die falsch positive Signale ausgelöst haben, zu unterscheiden. Es ist eine beachtliche Aufgabe, echte Antagonisten, die nur einen sehr kleinen Anteil der großen Sammlungen von Kandidaten für Antagonisten, die in Hochdurchsatz-Durchmusterungen untersucht werden, darstellen, zu identifizieren. Das Umsetzen jeglicher Zeit- oder Kosteneinsparungen kann ein neues Arzneimittel schneller und weniger teuer zu den Patienten bringen.
  • Herkömmliche Assays, die zur Verwendung in HTS-Verfahren zum Suchen nach kleinen Molekülen als Antagonisten von Wechselwirkungen zwischen Liganden und Rezeptor und von Signalgebung abgestimmt sind, sind üblicherweise eindimensional. Das heißt, dass sie nur die Wechselwirkung zwischen Liganden und Rezeptor oder die zelluläre Signalgebung, welche die Bindung des Liganden auslöst, isolieren und untersuchen, nicht aber beides. Wegen dieser Trennung der physikalischen Wechselwirkung (Bindung des Liganden an den Rezeptor) von der Funktion (Signalgebung des Rezeptors und nachgeschaltete Ereignisse) werden oft falsch positive Signale beobachtet, was die Ermittlung und Entwicklung verlangsamt. Falsch positiv sind Moleküle, die aus unerwünschten Ursachen zu dem gewünschten Ergebnis führen; man findet sie oft beim Suchen nach kleinen Molekülen als Antagonisten. Kleine Moleküle, die anfänglich Inhibitoren von Wechselwirkungen der Bindung von Rezeptor und Ligand zu sein scheinen (ein erwünschtes Ergebnis), können zu einem solchen Ergebnis führen, indem sie zum Beispiel entweder die Wechselwirkung zwischen Liganden und Rezeptor hemmen, indem sie an den Zielrezeptor oder Liganden binden (erwünschte Ursachen), oder indem sie Zellen krank machen oder abtöten oder andere undefinierte Wirkungen hervorrufen (unerwünschte Ursachen).
  • Weiterhin scheitern herkömmliche Schemata zur Entdeckung von Arzneimitteln für Antagonisten eines Rezeptors für chemische Lockstoffe darin, alle klinisch bedeutenden Moleküle zu erkennen, eine Folge falsch negativer Signale. Falsch negativ bedeutet, dass klinisch bedeutende Moleküle nicht entfasst werden und unentdeckt bleiben. Zum Beispiel wird ein Molekül, das eine Bindung des Liganden für einen Rezeptor für einen chemischen Lockstoff an den Rezeptor für den chemischen Lockstoff zulässt, aber die Signalübertragung durch den Rezeptor für den chemischen Lockstoff inhibiert, in einer anfänglichen Untersuchung auf Hemmstoffe der Ligandenbindung verborgen bleiben.
  • Moleküle, die chemische Lockstoffe darstellen, locken Zellen an. Zum Beispiel wirken Chemokine, eine Gruppe von mehr als 40 kleinen Peptiden (im Allgemeinen mit einer Größe von 7-10 kDa), als molekulare, Krankheitserreger und Tumormassen für die Zerstörung markierende Leitsignale für die Rekrutierung, Aktivierung und gerichtete Wan derung von T-Lymphozyten, Neutrophilen und Makrophagen des Immunsystems. Während das Immunsystem das Individuum gegen eindringende Krankheitserreger und Tumore verteidigt, kann es eine Erkrankung verursachen, wenn es nicht korrekt reguliert ist. Die Bindung von Chemokin an Rezeptor ist mit an G-Protein gebundenen Signalübertragungskaskaden verbunden, um die Signalübertragungsfunktionen von chemischen Lockstoffen und chemischen Stimulanzien zu vermitteln.
  • Eine unangemessene Signalgebung durch Chemokine kann entweder Infektionen fördern, wenn sie nicht richtig ausgelöst wird (Forster et al., 1999) oder zu Krankheiten, die mit fehlerhafter Signalübertragung durch Chemokine verbunden sind, führen, einschließlich Asthma, allergischer Erkrankungen, multipler Sklerose, rheumatoider Arthritis und Arteriosklerose (Übersichtsarbeit in Rossi und Zlotnick, 2000). Weil Chemokine Schlüsselrollen bei Entzündung und Lymphozytenentwicklung spielen, wird die Fähigkeit, ihre Aktivität spezifisch zu manipulieren, gewaltige Auswirkungen auf das Lindern oder Aufhalten von Krankheiten, für die es derzeit keine befriedigende Behandlung gibt, haben. Antagonisten von Chemokinrezeptoren können eingesetzt werden, um die generalisierten und komplizierenden Wirkungen kostspieliger immunsuppressiver Pharmazeutika bei der Transplantatabstoßung zu umgehen (Übersichtsarbeit in DeVries et al., 1999).
  • Um die Identifizierung von Antagonisten eines Rezeptors für chemische Lockstoffe wie zum Beispiel von solchen für Chemokinrezeptoren zu beschleunigen, würde ein Assay, der falsche Signale aussondert, indem er sowohl die Bindung eines Rezeptors für chemische Lockstoffe als auch eine biologische Funktion untersucht, die Arzneimittelentwicklung beschleunigen.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem ersten Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten eines Rezeptors für chemische Lockstoffe bereit. Eine Zelle, die einen Rezeptor für chemische Lockstoffe hat, wird mit einem Kandidaten für einen Antagonisten in Gegenwart eines Überschusses einer optimalen Konzentration eines Liganden für den Re zeptor für chemische Lockstoffe inkubiert und dann wird Zellwanderung untersucht. Zellwanderung zeigt an, dass der Kandidat für einen Antagonisten ein Antagonist ist.
  • In einem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten eines Chemokinrezeptors bereit. Eine Zelle, die einen Chemokinrezeptor exprimiert, wird mit einem Kandidaten für einen Antagonisten in Gegenwart einer hemmenden Konzentration eines Chemokin-Liganden inkubiert und dann wird Zellwanderung untersucht. Zellwanderung zeigt an, dass der Kandidat für einen Antagonisten ein Antagonist ist.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten eines Chemokinrezeptors bereit. Ein Kandidat für einen Antagonisten eines Chemokinrezeptors wird erst in einem herkömmlichen Assay identifiziert. In einem nachfolgenden Schritt wird der Kandidat für einen Antagonisten mit einer Zelle, die einen Chemokinrezeptor trägt, in Gegenwart einer hemmenden Konzentration eines Liganden inkubiert und dann wird Zellwanderung untersucht. Zellwanderung bestätigt, dass der Kandidat für einen Antagonisten ein Antagonist ist.
  • Diese und andere Ausführungsformen werden unten ausführlich erörtert.
  • Beschreibung der Abbildungen
  • 1. zeigt Diagramme, welche die selektive Aktivierung von Zellwanderung durch einen Antagonisten eines Chemokinrezeptors mittels des (B) Tests der „umgekehrten Aktivierung der Wanderung" („reversed-activation of migration", RAM) im Vergleich zu (A) herkömmlichen Assays darstellt.
  • 2. zeigt einen Graphen, der die Dosis-Wirkungs-Kurve für die Wechselwirkung zwischen dem Chemokinrezeptor CXCR4 und dem Liganden SDF in Bezug auf Zellwanderung darstellt. X-Achse: Konzentration (als log ausgedrückt) des Chemokins; Y-Achse: Zellwanderung wie in einem Zellwanderungsassay gemessen (Zahl der Zellen).
  • 3. zeigt ein Diagramm, das typische Kurven, welche die Rechtsverschiebung der Migrationskurve in Gegenwart eines Antagonisten unter RAM-Bedingungen veranschaulichen, darstellt. X-Achse: Konzentration (als log ausgedrückt) des Chemokins; Y-Achse: Zellwanderung wie in einem Zellwanderungsassay gemessen (Zahl der Zellen).
  • 4. stellt eine schematische Darstellung eines herkömmlichen Zellwanderungsassays dar.
  • 5. zeigt Diagramme, welche die Ergebnisse eines RAM-Assay-Validierungsversuchs unter Verwendung eines aus Protein bestehenden Antagonisten von CXCR4 darstellen. Vom Chemokin SDF vermittelte Zellwanderung in Gegenwart des Antagonisten von CXCR4, vMIP-II, unter (A) herkömmlichen Bedingungen und (B) RAM-Bedingungen.
  • 6. zeigt Balkendiagramme, welche die Ergebnisse eines RAM-Assay-Validierungsversuchs unter Verwendung von kleinen, organischen Antagonisten von CXCR4 darstellen. Vom Chemokin SDF vermittelte Zellwanderung in Gegenwart von aus kleinen, organischen Molekülen bestehenden Antagonisten von CXCR4, (A) RAMAG-1, (B) RAMAG-2 und (C) RAMAG-3.
  • 7. stellt die Wirksamkeit des RAM-Assays beim Erkennen falsch positiver Signale dar. (A) herkömmlicher Assay, der eine Inaktivierung von Zellwanderung durch drei Verbindungen, von denen bekannt ist, dass sie nicht spezifisch sind, zeigt; (B) RAM-Assay, bei dem die gleichen drei Verbindungen nicht auf einen Antagonisten eines Chemokinrezeptors hinweisen.
  • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Der Test der „umgekehrten Aktivierung der Wanderung" („reversed-activation of migration", RAM-Assay) der Erfindung identifiziert und unterscheidet Antagonisten, indem er das Übergewicht der verwirrenden falsch positiven und negativen Signale, die in ande ren Assays gefunden werden, wesentlich verringert. Die Zeit und die Arbeit, die damit verbunden sind, eine mögliche pharmazeutische Verbindung zu bestätigen, sind daher in großem Maß verringert.
  • Die Verfahren der Erfindung beinhalten:
    • (1) Inkubieren einer Zelle, die einen Rezeptor für chemische Lockstoffe wie zum Beispiel einen Chemokinrezeptor umfasst, mit einem Kandidaten für einen Antagonisten;
    • (2) Inkontaktbringen der Zelle mit einer hemmenden Konzentration eines Liganden für den Rezeptor für chemische Lockstoffe; und
    • (3) Untersuchen der Zellwanderung.
  • Zellwanderung wird verwendet, um den Kandidaten für einen Antagonisten als einen Antagonisten zu identifizieren.
  • Das Verfahren kann weiter eine „Vorstufe" umfassen, bei der die Konzentration eines Liganden, bei dem es sich um einen chemischen Lockstoff handelt (wie zum Beispiel ein Chemokin), welche die Zellwanderung hemmt, ermittelt wird, die „Hemmkonzentration" des Liganden für einen Rezeptor für chemische Lockstoffe. Weitere Schritte können hinzugefügt werden, abhängig von der Art der Zelle oder des Wirkstoffs, der eingesetzt wird, dem Assay, etc.
  • Während herkömmliche Untersuchungen auf Antagonisten der Zellwanderung die Verminderung der Zellwanderung – eine Verringerung der Aktivität – messen, messen RAM-Assays die Aktivierung der Zellwanderung, eine Zunahme der Aktivität (1A, herkömmlicher Wanderungsassay, 1B RAM-Assay). Im RAM-Assay werden die Zellen dazu herausgefordert, in Gegenwart von die Wanderung hemmenden Konzentrationen von chemischen Lockstoffen als Reaktion auf einen Kandidaten für einen Antagonisten zu wandern; in einem herkömmlichen Assay werden die Zellen dazu herausgefordert, als Reaktion auf einen chemischen Lockstoff in Gegenwart eines Kandidaten für einen Antagonisten zu wandern. Eine Verbindung, die in einem herkömmlichen Zell wanderungsassay ein falsch positives Signal (Hemmen der Wanderung) ergibt, wird beim Aktivieren von Zellwanderung in der RAM-Ausführung versagen. Im RAM-Assay aktiviert nur ein echter Antagonist Wanderung. Diese Unterscheidung erlaubt eine einfache Identifizierung von echten Antagonisten.
  • Ein anderer Vorteil des RAM-Assays besteht darin, dass die identifizierten Antagonisten wahrscheinlicher von therapeutischem Nutzen sind als jene, die in herkömmlichen Assay identifiziert wurden. Ein therapeutischer Antagonist eines Rezeptors für chemische Lockstoffe ist für diesen Rezeptor spezifisch, wobei er seine Wirkung durch den Rezeptor ausübt. Ein solcher Antagonist verringert die effektive Affinität zwischen dem chemischen Lockstoff und dem Rezeptor, ohne die physische Integrität der Zelle zu beeinträchtigen oder die nachgeschalteten Ereignisse der Signalgebung, die zu Wanderung führen, vollständig zu unterbrechen. Ein falsch positiver, der in einem herkömmlichen Assay identifiziert wurde, hat mindestens eines dieser Kennzeichen nicht.
  • Eine mögliche Erklärung für den Erfolg des RAM-Assays beruht auf der Beobachtung, dass eine Zelle eine Polarität in Bezug auf das vordere Ende und das hintere Ende haben muss, um zu wandern. Eine solche Polarität wird oft durch extrazelluläre Signale wie zum Beispiel Chemokine ausgelöst. Für die Zellwanderung wird diese Polarität durch ein unterschiedliches Ausmaß der Besetzung von Rezeptoren für chemische Lockstoffe an den beiden Enden der Zelle erreicht. Allerdings hemmen hohe Konzentrationen des chemischen Lockstoffs die Wanderung, weil alle Rezeptoren in allen Richtungen der Zelle besetzt sind; die Zelle hat keinen Anhaltspunkt für die Richtung. Wenn steigende Konzentrationen des Liganden im Bezug auf Zellwanderung aufgetragen werden, wird eine glockenförmige Kurve beobachtet (ein Beispiel ist in 2 gezeigt). Ein Antagonist eines Rezeptors, der die effektive Affinität eines chemischen Lockstoffs zu einem Rezeptor vermindert, erlaubt es dem Liganden, sich wie ein Ligand mit einer geringeren Affinität zu verhalten. Die glockenförmige Kurve, die zuerst in Abwesenheit von Antagonisten beobachtet wurde, verschiebt sich in Gegenwart steigender Konzentrationen des Antagonisten nach rechts (siehe zum Beispiel 3). Dies ist eine mögliche Erklärung für den Erfolg der vorliegenden Erfindung. Es liegt nicht in der Absicht der Erfinder, durch diesen Vorschlag eingeschränkt zu werden.
  • Definitionen
  • Ein „Zellwanderungsassay" untersucht die Fähigkeit einer Zelle, als Reaktion auf ein Signal zu wandern.
  • Eine „hemmende Konzentration" eines chemischen Lockstoffs ist eine solche, die Zellwanderung hemmt. Diese Konzentration liegt höher als die, die Zellwanderung aktiviert.
  • Ein „Rezeptor für einen chemischen Lockstoff" ist ein Rezeptor, der an einen Liganden, bei dem es sich um einen chemischen Lockstoff handelt, bindet und Zellwanderung auslöst. Zum Beispiel ist ein Chemokinrezeptor ein Rezeptor für einen chemischen Lockstoff, dessen Ligand, bei dem es sich um einen chemischen Lockstoff handelt, mindestens ein Chemokin ist.
  • In den folgenden Abschnitten wird der RAM-Assay unter Verwendung von Chemokinen und Rezeptoren für Chemokine veranschaulicht. Es kann jedoch jeglicher chemische Lockstoff und Rezeptor für einen chemischen Lockstoff, der Zellwanderung auslöst, verwendet werden. Tabelle A zeigt einige Beispiele von bekannten Rezeptoren für chemische Lockstoffe und einige ihrer Liganden. Tabelle A Beispielhafte Rezeptoren für chemische Lockstoffe beim Menschen und beispielhafte Liganden1
    Figure 00080001
    Figure 00090001
  • RAM-Assay
  • Im RAM-Assay wird eine chemokintragende Zelle mit einem Kandidaten für einen Antagonisten inkubiert und dann mit einer hemmenden Konzentration eines Liganden für den Zielchemokinrezeptor in Kontakt gebracht. Dann wird die Fähigkeit der Zelle zu wandern untersucht. Wenn die Zelle in Gegenwart eines Kandidaten für einen Antagonisten im RAM-Assay wandert, dann wurde ein positives Signal beobachtet. „Antagonist" beinhaltet jedes Molekül, das eine biologische Aktivität wie zum Beispiel Zellwanderung teilweise oder vollständig blockiert, hemmt oder neutralisiert. In ähnlicher Weise beinhaltet „Agonist" jedes Molekül, das eine biologische Aktivität des Moleküls wie zum Beispiel eines Chemokins nachahmt. Moleküle, die als Agonisten oder Antagonisten wirken können, schließen kleine organische Moleküle, Makromoleküle, Antikörper oder Fragmente von Antikörpern, Fragmente oder Varianten von Chemokinen, Peptide etc. ein. Ein „Kandidat für einen Antagonisten" ist eine Verbindung, die auf eine Wirkung als Antagonist untersucht wird, gleichermaßen ist ein „Kandidat für einen Agonisten" eine Verbindung, die auf eine Wirkung als Agonist untersucht wird.
  • Es kann jegliche Ausführung eines Zellwanderungsassays verwendet werden, wie zum Beispiel das ChemoTx®-System (NeuroProbe, Rockville, MD) oder jedes andere geeignete Gerät oder System (Bacon et al., 1988; Penfold et al., 1999). In Kürze arbeiten diese Zellwanderungsassays wie folgt. Nach dem Gewinnen und Vorbereiten der Zellen, die den aktiven Zielchemokinrezeptor tragen, werden die Zellen mit Kandidaten für Antagonisten gemischt. Die Mischung wird in die obere Kammer der Zellwanderungsapparatur eingebracht. Zu der unteren Kammer wird eine hemmende Konzentration des Liganden, bei dem es sich um ein Chemokin handelt, zugegeben. Der Wanderungsassay wird dann ausgeführt, beendet und die Zellwanderung wird bewertet.
  • Um den RAM-Assay zu starten, wird die Lösung mit der hemmenden Konzentration des Liganden, bei dem es sich um ein Chemokin handelt, zu der unteren Kammer (6, 4) einer Zellwanderungsapparatur gegeben und die Zellsuspension wird in die obere Kammer (4, 4), die durch eine poröse Membran abgetrennt ist (5, 4) eingebracht. Die Zellen werden unter Kulturbedingungen (37°C für menschliche Zellen) 60 bis 180 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator für Gewebskulturen inkubiert. Die Dauer der Inkubation hängt vom Zelltyp ab und kann, falls erforderlich, empirisch bestimmt werden.
  • Am Ende der Inkubationsperiode wird der Assay beendet. Zum Beispiel werden nicht wandernde Zellen auf der oberen Kammer der Apparatur unter Verwendung eines Gummischabers oder eines anderen manuellen Verfahrens, enzymatisch oder chemisch, zum Beispiel mit EDTA- und EGTA-Lösungen, entfernt. Die Membran (5, 4), welche die zwei Kammern voneinander trennt, wird dann aus der Apparatur entfernt und mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) oder Wasser gespült. Die Zahl der Zellen, die in die untere Kammer wandern, wird dann bestimmt.
  • Die Konzentration des Kandidaten für einen Antagonisten, der in RAM-Assays untersucht werden soll, kann von weniger als nanomolar bis millimolar reichen. Beim Durchmustern einer Sammlung von aus kleinen Molekülen bestehenden Verbindungen (wie zum Beispiel einer mittels kombinatorischer Chemie synthetisierten Bibliothek) beträgt die Konzentration der Kandidaten für einen Antagonisten üblicherweise etwa 1–20 μM. „Verbindung" beinhaltet kleine anorganische und organische Moleküle, Makromoleküle, Peptide, Proteine, Polypeptide, Nukleinsäuren und Antikörper.
  • Bestimmung hemmender Konzentrationen des Liganden
  • Es kann eine Dosis-Wirkungs-Untersuchung der Zellwanderung auf einen Liganden hin, bei dem es sich um ein Chemokin handelt, durchgeführt werden, um die hemmenden Konzentrationen des Liganden, bei dem es sich um ein Chemokin handelt, zu bestimmen. Jegliches Standardverfahren zum Festlegen von Dosis-Wirkungs-Kurven kann verwendet werden. Ein solches Verfahren beinhaltet das Gewinnen von Zellen, die den Zielchemokinrezeptor exprimieren, das Zugeben der Zellen zu einem Zellwanderungsgerät in Gegenwart steigender Chemokinmengen, das Messen der Zellwanderung, das Auftragen von Zellwanderung gegen Chemokinkonzentration und dann das Berechnen derjenigen Chemokinkonzentrationen, die Zellwanderung hemmen, aus dem Graphen.
  • Als Beispiel kann ein herkömmlicher Zellwanderungsassay wie zum Beispiel das ChemoTx®-System (NeuroProbe, Rockville, MD) oder jedes andere geeignete Gerät oder System (Bacon et al., 1988; Penfold et al., 1999) verwendet werden. Zellen, die den Zielrezeptor exprimieren, werden gesammelt, um eine Dosis-Wirkungs-Kurve zu erhalten. Es wird ein Ligand, bei dem es sich um ein Chemokin handelt, in einer Konzentrationsreihe mittels fortgesetzter Verdünnung in einem Puffer zubereitet. Der Bereich der Konzentration liegt üblicherweise zwischen 0,1 nM und 10 mM, wird aber mit dem Liganden variieren.
  • Um den Zellwanderungsassay zu starten, werden Lösungen mit den verschiedenen Konzentrationen des Liganden, bei dem es sich um ein Chemokin handelt, zu der unteren Kammer (6, 4) einer Zellwanderungsapparatur gegeben und die Zellsuspensi on wird in die obere Kammer (4, 4), die durch eine poröse Membran abgetrennt ist (5, 4) eingebracht. Die Zellen werden unter Kulturbedingungen (37°C für menschliche Zellen) 60 bis 180 Minuten lang in einem befeuchteten Inkubator für Gewebskulturen inkubiert. Die Dauer der Inkubation hängt vom Zelltyp ab und kann, falls erforderlich, empirisch bestimmt werden.
  • Nach Beendigung der Zellwanderung werden nicht wandernde Zellen auf der oberen Kammer der Apparatur unter Verwendung eines Gummischabers oder eines anderen manuellen Verfahrens, enzymatisch oder chemisch, zum Beispiel mit EDTA- und EGTA-Lösungen, entfernt. Die Membran (5, 4), welche die zwei Kammern voneinander trennt, wird dann aus der Apparatur entfernt und mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung (DPBS) oder Wasser gespült. Die Zahl der Zellen, die in die untere Kammer wandern, wird dann bestimmt.
  • Zellwanderung (Y-Achse) wird dann gegen den log (Chemokinkonzentration) (X-Achse) aufgetragen; eine glockenförmige Kurve wird beobachtet (2, siehe Beispiele). Aus dieser graphischen Darstellung (2) kann die niedrigste Chemokinkonzentration, die Zellwanderung hemmt, bestimmt werden. Der Übersichtlichkeit halber kann eine zweite Y-Achse (y2, 1, 2), die an der Spitze (maximale Zellwanderung) und dem entsprechenden Wert auf der X-Achse schneidet, durch die Glockenkurve gezogen werden. Die Konzentrationen auf der linken Seite der Y2-Achse (niedriger) sind stimulierend (2, 2); diejenigen auf der rechten Seite (höher) sind hemmend (3, schattierter Bereich, 2). Diese Konzentrationen sind die „hemmenden Konzentrationen" für die Zellwanderung (Chemotaxis). Zum Beispiel wird, um die Konzentration, bei der die Wanderung um 90 % des Maximums (auf der rechten Seite der Y2-Achse, den „hemmenden" Konzentrationen) gehemmt wird, zu bestimmen, der Wert, der 10 % der maximalen Wanderung entspricht, auf der Y-Achse aufgesucht. Wenn das maximale Zellwanderungssignal zum Beispiel 3,5 × 104 Zellen beträgt, würden 10 % davon 350 (3,5 × 104 × 0,1) sein. Die hemmende Konzentration des Liganden wird dann bestimmt, indem die entsprechende Koordinate auf der X-Achse aufgesucht wird. Vorzugsweise beträgt der Grad der Hemmung 50 %, 60 %, 70 % oder 80 % der maximalen Zellwanderung. Bevorzugter beträgt der Grad der Hemmung 90 % oder noch bevorzugter 95 % oder 100 % Hemmung im Vergleich zum maximalen Signal für Wanderung. Die bestimmte Chemokinkonzentration variiert und hängt von der Art des Rezeptors, des Liganden, bei dem es sich um ein Chemokin handelt und der Zielzelle ab. Ein Variieren des Maßes der chemotaktischen Hemmung kann verwendet werden, um die Sensitivität des RAM-Assays zu modulieren.
  • Anwendung von RAM-Assavs in umfangreichen Screening-Untersuchungen auf therapeutische Antagonisten
  • RAM-Assays können in Verbindung mit jedem anderen Assay, der verwendet wird, um nach Antagonisten von Chemokinrezeptoren zu suchen, durchgeführt werden. Die RAM-Ausführung ist nicht nur als primärer HTS-Schritt nützlich, sondern bildet auch einen bestätigenden oder sekundären Assay für Kandidaten für Antagonisten, die in anderen Assays identifiziert wurden. Zum Beispiel kann ein HTS-Verfahren, das die Mobilisierung von Ca2+ misst, einschließlich solcher Verfahren, die auf dem System FLIPRTM (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA) oder anderen auf Reportern basierenden Verfahren, die Anstiege der Spiegel von freiem, intrazellulären Ca2+ untersuchen, beruhen, als primärer Assay verwendet werden. RAM-Assays können dazu verwendet werden, solche Kandidaten zu bestätigen oder umgekehrt. Als sekundärer Assay würde RAM die Kandidaten für Antagonisten unterscheiden, die unspezifische Wirkungen ausüben. Wenn RAM-Assays mit anderen HTS-Verfahren verwendet werden, wird ein Mittel zum Unterscheiden echter Treffer von unspezifischen Blockern bereitgestellt.
  • Der RAM-Assay kann auf jede andere Ausführung eines Assays, der Zellwanderung oder Rezeptoraktivierung misst, angewendet werden, einschließlich von Verfahren, die eine Wanderung von Zellen über eine poröse Membran nicht erfordern. Basierend auf der Verwendung des Konzepts von RAM können mehr nützliche Methoden, die höheren Durchsatz und geringere Kosten bieten, entwickelt werden.
  • Zellen zur Verwendung im RAM-Assay
  • Zellen zur Verwendung im RAM-Assay, die einen Zielchemokinrezeptor (oder einen Rezeptor für chemische Lockstoffe) exprimieren, können mittels einer Reihe von Verfahren gesammelt werden, zum Beispiel durch Zentrifugation nach der Gewinnung aus einem Individuum oder der Freisetzung aus einer Kultur, und dann in einem Puffer bei einer geeigneten Dichte, abhängig von Zelltyp und Zellgröße, resuspendiert werden. Geeignete Zellkonzentrationen reichen von etwa 1 × 106 bis 1 × 107 Zellen/ml; oft sind etwa 2,5 × 106 Zellen/ml geeignet.
  • Chemokinrezeptoren und Liganden
  • Zellen, die in der RAM-Ausführung untersucht werden können, schließen alle diejenigen ein, die mindestens einen Chemokinrezeptor auf der Zelloberfläche exprimieren, wie zum Beispiel Monozyten vom Menschen, oder andere Zellen, die so manipuliert sind, dass sie rekombinante Chemokinrezeptoren exprimieren und in der Lage sind, Zellwanderung zu aktivieren. Bekannte Chemokinrezeptoren und einige ihrer Liganden sind in Tabelle B gezeigt. Beispiele von Chemokinrezeptoren schließen die Klasse CXC, zum Beispiel CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCRS; die Klasse CC, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10 und CCR11; die Klasse CX3CR wie zum Beispiel CX3CR1 und die Klasse XCR wie zum Beispiel XCR1 ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Ein Beispiel für einen Rezeptor für chemische Lockstoffe, bei denen es sich nicht um Chemokine handelt, ist das Formylpeptidrezeptor-ähnliche Protein 1 (FPRL1); die Liganden dafür sind w-Peptid1 und w-Peptid2 (Klein et al., 1998). Siehe auch Tabelle A für weitere Beispiele. Tabelle B Zusammenfassung der bekannten Chemokinrezeptoren und einiger ihrer bekannten Liganden beim Menschen (Rossi und Zlotnik, 2000)
    Figure 00140001
  • Chemokine, die im RAM-Assay verwendet werden können, schließen alle bekannten Chemokine ein. Beispiele von Chemokinen schließen IL-8, GCP-2, Gro α, Gro β, Gro γ, ENA-78, PBP, MIG, IP-10, I-TAC, SDF-1 (PBSF), BLC (BCA-1), MIP-1 α, MIP-1 β, RANTES, HCC-1, -2, -3 und -4, MCP-1, -2, -3 und -4, Eotaxin-1, Eotaxin-2, TARC, MDC, MIP-3α (LARC), MIP-3β (ELC), 6Ckine (LC), I-309, TECK, Lymphotactin, Fractalkin (Neurotactin), TCA-4, Exodus-2, Exodus-3 und CKβ-11 ein, sind aber nicht darauf beschränkt.
  • Rezeptor-Ligand-Kombinationen von Chemokinen schließen solche, die mit entzündlichen Erkrankungen, Infektionskrankheiten und Transplantatabstoßung verbunden sind, ein. Solche Kombinationen schießen CX3CR1/Fractalkin (Transplantation), CCR5/MIP-1α, MIP-1β oder RANTES (HIV), CXCR4/SDF-1 (HIV) und CCR7/MIP-3β, ELC oder 6Ckine LC (entzündliche oder allergische Erkrankungen, zum Beispiel Asthma, multiple Sklerose etc.) ein.
  • Kandidaten für Antagonisten
  • Jedes Molekül oder jede Verbindung kann auf Aktivität als Antagonist eines Chemokinrezeptors überprüft werden. Verbindungen, die Aktivitäten von Rezeptor und Ligand bei Chemokinen wie zum Beispiel das Aktivieren der Zellwanderung oder das Modulieren intrazellulärer Ca2+-Konzentrationen hemmen, sind Kandidaten für Antagonisten.
  • Solche Moleküle, die derartige antagonistische Wirkungen ausüben können, schließen kleine Moleküle, die an Chemokinrezeptoren oder ihre Liganden binden, ein. Beispiele von Antagonisten, bei denen es sich um kleine Moleküle handelt, beinhalten kleine Peptide, peptidähnliche Moleküle, vorzugsweise lösliche und synthetische organische Verbindungen, bei denen es sich nicht um Peptide handelt, oder anorganische Verbindungen. Andere mögliche Antagonistenmoleküle schließen Nukleinsäuren wie zum Beispiel Aptamere und Antikörper ein. Diese Moleküle können in verschiedene Bibliotheken, die unter Verwendung des RAM-Assays schnell nach neuen Antagonisten von Chemokinrezeptoren durchgemustert werden können, zusammengefasst werden.
  • Nahezu jeder Antikörper (Ab, „antibody"), der chemotaktische Zellwanderung hemmt, ist auch ein Kandidat für einen Antagonisten. Beispiele von Antagonisten, bei denen es sich um Antikörper handelt, schließen polyklonale, monoklonale, einzelkettige, antiidiotypische, chimäre Ab oder humanisierte Versionen solcher Ab oder Fragmente ein. Ab können von jeder Spezies stammen, in der eine Immunantwort ausgelöst werden kann. Humanisierte Ab sind außergewöhnlich gut für die Behandlung von Krankheiten geeignet und stellen attraktive Kandidaten für Antagonisten dar (Jones et al., 1986; Riechmann et al., 1988; Verhoeyen et al., 1988); (U.S. Pat. Nr. 4816567, 1989). Solche Antikörper können an Chemokinrezeptoren binden, um Zellwanderung zu hemmen.
  • Alternativ kann ein möglicher Antagonist oder Agonist ein eng verwandtes Protein sein, zum Beispiel eine mutierte Form eines Liganden eines Chemokinrezeptors oder ein anderes Protein, das ein Protein, das mit einem Chemokinrezeptor interagiert, erkennt, aber keine Wirkung vermittelt und damit die Aktivität des Chemokinrezeptors kompetitiv hemmt.
  • Aptamere sind kurze Oligonukleotidsequenzen, die verwendet werden können, um nahezu jedes Molekül zu erkennen und spezifische zu binden; solche Moleküle können auch antagonistisch wirken. Die systematische Evolution von Liganden durch den Prozess der exponentiellen Anreicherung (SELEX) (Ausubel et al., 1987; Ellington und Szostak, 1990; Tuerk und Gold, 1990) ist leisiungsstark und kann dazu verwendet werden, solche Aptamere zu finden. Aptamere haben viele diagnostische und klinische Verwendungsmöglichkeiten einschließlich derer als Antagonisten. Darüber hinaus sind sie billig herzustellen und können leicht in einer Reihe von Ausführungen angewendet werden, einschließlich der Verabreichung in pharmazeutischen Zusammensetzungen, Bioassays und diagnostischen Tests (Jayasena, 1999). Der RAM-Assay kann auch als Raster zum Isolieren von Aptameren de novo verwendet werden.
  • Quantifizieren von wandernden Zellen
  • Das Quantifizieren von wandernden Zellen kann mittels einer großen Zahl verfügbarer Verfahren bewerkstelligt werden, wie zum Beispiel solcher, welche die DNA-Menge untersuchen (zum Beispiel der CyQuant Zellenproliferationskit (Molecular Probes)), und indem man dann das erzeugte Signal wie zum Beispiel Fluoreszenz untersucht. Andere Verfahren schließen das Zählen der Zellen unter Verwendung eines Mikroskops oder das Markieren von Zellen mit einem geeigneten nachweisbaren Markierungsstoff wie zum Beispiel Farbstoffe (wie zum Beispiel Calcein AM (NeuroProbe) oder die vielen Substanzen zur Kennzeichnung, die von Molecular Probes (Eugene, OR) erhältlich sind) oder radioaktives Markieren (zum Beispiel Iodieren der Zelloberfläche mit 135I, Markieren der Proteinsynthese mit 35S-Methionin/35S-Cystein oder Markieren von Nukleinsäure mit 3H) ein.
  • Puffer und Zellkulturmedien
  • Puffer, die verwendet werden können, um die verschiedenen Lösungen zuzubereiten, beinhalten Zellkulturmedien, obwohl Serum oder andere Wachstums- und chemotaktische Faktoren entfernt werden können, so dass die Ergebnisse in einem Zellwanderungsassay nicht durcheinander gebracht werden und größtenteils der Wechselwirkung zwischen Chemokin und Chemokinrezeptor zuzuschreiben sind. In einigen Fällen kann ein Protein wie zum Beispiel verschiedene Albumine einschließlich Rinderserumalbumin zugegeben werden, um die Zellen zu unterstützen. Die optimale Auswahl der Medien hängt vom Zelltyp ab, das zum Kultivieren der Zellen verwendete Medium stellt üblicherweise eine bevorzugte Auswahlmöglichkeit dar. Beispiele geeigneter Kulturmedien schließen „Iscove's Modified Dulbecco's Medium" (IMDM), „Dulbecco's Modified Eagle's Medium" (DMEM), „Minimal Essential Medium Eagle" (MEM), „Basal Medium Eagle" (BME), „Click's Medium", „L-15 Medium Leibovitz", „McCoy's 5A Medium", „Glasgow Minimum Essential Medium" (GMEM), „NCTC 109 Medium", „Williams' Medium E", „RPMI-1640" und „Medium 199" ein. Ein Medium, das spezifisch für einen bestimmten Zelltyp oder eine bestimmte Zelllinie oder Zellfunktion entwickelt wurde, zum Beispiel „Madin-Darby Bovine Kidney Growth Medium", „Madin-Darby Bovine Kidney Maintenance Medium", verschiedene Hybridommedien, „Endothelial Basal Medium", „Fibroblast Basal Medium", „Keratinocyte Basal Medium" und „Melanocyte Basal" Medium sind auch von Nutzen. Wenn gewünscht, kann ein Medium mit reduziertem Protein oder ein proteinfreies und/oder serumfreies Medium und/oder ein chemisch definiertes, von tierischen Bestandteilen freies Medium verwendet werden, zum Beispiel können CHO, Gentherapiemedium oder QBSF serumfreies Medium (Sigma Chemical Co.; St. Louis, MO), DMEM Nährmischung F-12 Ham, MCDB (105, 110, 131, 151, 153, 201 und 302), NCTC 135, Ultra DOMA PF oder HL-1 (beide von Biowhittaker; Walkersville, MD) verwendet werden.
  • Wenn erwünscht können die Medien weiter mit Reagenzien, die eine Azidose der Kulturen begrenzen, ergänzt werden, zum Beispiel mit einer Zugabe von Puffer zum Medium (wie zum Beispiel N,N-Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsäure (BES), Bis(2-hydroxyethyl)amino-tris(hydroxymethyl)methan (BIS-Tris), N-(2-Hydroxyethyl)piperazin- N'3-propansulfonsäure (EPPS oder HEPPS), Glyclclycin, N-2-Hydroxyehtylpiperazin-N'-2-ethansulfonsäure (HEPES), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), Piperazin-N,N'-bis(2-ethan-sulfonsäure) (PIPES), Natriumhydrogencarbonat, 3-(N-Tris(hydroxymethyl)-methyl-amino)-2-hydroxy-propansulfonsäure) TAPSO, (N-Tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethansulfonsäure (TES), N-Tris(hydroxymethyl)methyl-glycin (Tricine), Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris) etc.). Häufige Wechsel des Mediums und Änderungen der zugeführten CO2-Konzentration (oft etwa 5 %) können auch eingesetzt werden, um die Azidose zu beherrschen.
  • Kits
  • Bestandteile zum Ausführen von RAM-Assay können in Kits, Behälter, Packungen oder Spender zusammen mit Anleitungen für die Anwendung konfektioniert werden. Wenn sie als Kit geliefert werden, können die verschiedenen Bestandteile der Zusammensetzung in gesonderte Behälter verpackt und unmittelbar vor der Verwendung vermischt werden. Ein derart getrenntes Verpacken der Bestandteile kann eine Lagerung über lange Zeit ermöglichen, ohne die Funktionen der Wirkstoffe einzubüßen. Zum Bespiel kann ein Kit eine Zellwanderungsapparatur, eine Zelle, die einen Chemokin-Rezeptor trägt, und eine Lösung, die eine für die Zelle, die einen Chemokin-Rezeptor trägt, migrationshemmende Chemokinkonzentration umfasst, enthalten. Die Lösung kann lyophilisiert geliefert werden.
  • (a) Behälter oder Gefäße
  • Die in den Kits enthaltenen Reagenzien können in Behältern jeglicher Art geliefert werden, so dass die Haltbarkeit der verschiedenen Bestandteile erhalten bleibt und sie nicht von den Materialien des Behälters adsorbiert oder verändert werden. Zum Beispiel können abgedichtete Glasampullen lyophilisiertes Chemokin oder einen Puffer, der unter einem neutralen, nicht reagierenden Gas wie zum Beispiel Stickstoff abgefüllt wurde, enthalten. Ampullen können aus jedem geeigneten Material wie zum Beispiel Glas, organischen Polymeren wie zum Beispiel Polycarbonat, Polystyren etc., keramischem Material, Metall oder jedem anderen Material, das üblicherweise dazu eingesetzt wird, Reagenzien zu aufzunehmen, bestehen.
  • Andere Beispiele geeigneter Behälter schließen einfache Flaschen, die aus ähnlichen Substanzen wie Ampullen gefertigt werden können, und Umhüllungen, die aus mit Folien gefütterten Innenseiten wie zum Beispiel Aluminium oder einer Legierung bestehen können, ein. Andere Behälter schließen Teströhrchen, Phiolen, Kolben, Flaschen, Spritzen und Ähnliches ein. Behälter können einen sterilen Zugangsanschluss haben wie zum Beispiel eine Flasche, die einen Pfropfen hat, der von einer Injektionsnadel durchstochen werden kann. Andere Behälter können zwei Kompartimente haben, die von einer leicht zu entfernenden Membran, die es nach der Entfernung ermöglicht, dass sich die Bestandteile vermischen, getrennt werden, zum Beispiel lyophilisiertes Chemokin in einem Kompartiment und ein Puffer oder Wasser in dem anderen. Entfernbare Membranen können Glas, Plastik, Gummi etc. sein.
  • (b) Unterweisendes Material
  • Kits können auch mit unterweisendem Material versehen werden. Die Anweisungen können auf Papier oder einem anderen Trägermaterial gedruckt sein und/oder können als elektronisch lesbares Medium wie zum Beispiel Floppy Disc, CD-ROM, DVD-ROM, Zip Disc, Videoband, Tonband etc. geliefert werden. Ausführliche Anweisungen können nicht physikalisch mit dem Kit verbunden sein; stattdessen kann ein Benutzer auf eine Webseite im Internet, die vom Hersteller oder Vertriebshändler des Kits angegeben ist, dirigiert werden, oder sie können als elektronische Post bereitgestellt werden.
  • BEISPIELE
  • Die folgenden Beispiele sind dazu vorgesehen, das Konzept des RAM-Assays der vorliegenden Erfindung ohne Einschränkung zu veranschaulichen und zu validieren. Der Rezeptor für einen chemischen Lockstoff und die Liganden, die dazu verwendet werden, die Erfindung zu veranschaulichen, sind Chemokinrezeptoren und Chemokine. Es kann jedoch jeder Ligand, bei dem es sich um einen chemischen Lockstoff handelt, für jeden Rezeptor für einen chemischen Lockstoff verwendet werden. Siehe Tabelle A für Beispiele.
  • Die Beispiele 1, 2 und 4 zeigen die Wirksamkeit des RAM-Assays beim Untersuchen von spezifischen und nicht spezifischen Antagonisten von CXCR4, wie sie in herkömmlichen Assays entdeckt wurden. Beispiel 3 zeigt die breite Anwendbarkeit von Rezeptoren für einen chemischen Lockstoff durch Untersuchen von drei Chemokinrezeptoren.
  • Beispiel 1
  • Bestimmen der hemmenden Konzentration von SDF (CXCR4)
  • Es wurde ein herkömmlicher Zellwanderungsassay verwendet (Bacon et al., 1988; Penfold et al., 1999), um eine Dosis-Wirkungs-Kurve für aktivierte Lymphozyten, die CXCR4 auf der Zelloberfläche exprimieren, zu erhalten. Zellen wurden durch Zentrifugation gewonnen und dann in Zellwanderungspuffer („Hank's balanced salt solution" (HBSS)/0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) bei 2,5 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Der CXCR4-Ligand, bei dem es sich von Stroma abgeleiteten Faktor („stroma-derived factor", SDF-1) handelt, wurde mittels fortgesetzter Verdünnung in Zellwanderungspuffer in einer Konzentrationsreihe (0,1 nM bis 10 mM) zubereitet. Bei niedrigen Konzentrationen aktiviert SDF die Zellwanderung von aktivierten Lymphozyten, die CXCR4 tragen.
  • Die untere Kammer einer ChemoTx® Zellwanderungsapparatur (5 μm Porendurchmesser, mit Polyvinylpyrrolidon beschichtete Polycarbonat-Filter (Neuroprobe; Gaithersburg, MD); 29 μl/Vertiefung) wurde mit dem Liganden SDF beschickt und 20 μl der Zellsuspension wurden in die obere Kammer eingebracht. Die Zellen wurden bei 37°C 150 Minuten lang inkubiert. Der Assay wurde beendet, indem die Zellen unter Verwendung eines Gummischabers aus der oberen Kammer und von der Membranoberfläche entfernt wurden. Die Zellen, die in die untere Kammer gewandert waren, wurden mit dem CyQuant-Assay (Molecular Probes; Eugene, OR), einem Fluoreszenzfarbstoffverfahren, das den Gehalt an Nukleinsäure misst, quantifiziert.
  • Um die zum Hemmen von Zellwanderung minimale Konzentration von SDF zu bestimmen, wird die Chemokinkonzentration (X-Achse) gegen relative Fluoreszenzeinheiten (RFU), die mit der Zahl der wandernden Zellen korrelieren (Y-Achse), aufgetragen (2). Anfänglich nimmt die Zellwanderung mit steigender Konzentration von SDF linear zu (2, 2), bei höheren Konzentrationen (3, 2) flacht der Grad der Wanderung jedoch erst ab und nimmt dann ab, bis Wanderung kaum nachweisbar ist. Diese glockenförmige Kurve ist für Zellwanderung, die von Chemokin und Chemokinrezeptor vermittelt wird, kennzeichnend. In diesem Experiment wurde festgestellt, dass 1 μM SDF zu einer vollständigen Hemmung führte, der Bereich der hemmenden Konzentration betrug 200 nM bis 1 μM.
  • Beispiel 2
  • Validierung des RAM-Assays unter Verwendung eines viralen Polypeptidantagonisten von CXCR4
  • Im RAM-Assay werden Antagonisten von Chemokinrezeptoren durch ihre Fähigkeit, Wanderung von Zellen, die mit hemmenden Chemokinkonzentrationen inkubiert sind, zu aktivieren, identifiziert. Um den RAM-Assay zu validieren, wurde das virale Chemokin vMIP-II als Antagonist von CXCR4 verwendet. vMIP-II bindet mit hoher Affinität an CXCR4, wobei es die Signalgebung des Rezeptors blockiert und Zellwanderung hemmt, indem es mit dem üblichen Liganden von CXCR4, SDF, konkurriert (Kledal et al., 1997). Wenn Zellen, die CXCR4 exprimieren und durch hemmende Konzentrationen von SDF immobilisiert sind, dazu aktiviert werden, in Gegenwart von vMIP-II mit erhöhter Migration zu wandern, würde dieses Ergebnis das Prinzip des RAM-Assays bestätigen. Als Bezugspunkt und als Kontrolle wurde ein herkömmlicher Zellwanderungsassay durchgeführt. Im der herkömmlichen Ausführung des Assays wird Zellwanderung durch vMIP-II gehemmt.
  • Zellwanderung wurde unter Verwendung der beiden Ausführungen mit den entsprechenden Mengen des Chemokins SDF gemessen:
    • (1) ein herkömmlicher Assay (Kontrolle); 1 nM SDF und
    • (2) ein RAM-Assay, 1 μM SDF.
  • Aktivierte Lymphozyten, die CXCR4 auf der Zelloberfläche exprimieren, wurden wie in Beispiel 1 gewonnen. Für den herkömmlichen Assay wurde zuerst eine Konzentrationsreihe von vMIP-II mit aktivierten Lymphozyten gemischt und die Lösung wurde dann in die obere Kammer einer ChemoTx® Zellwanderungsapparatur (5 μm Porendurchmesser, mit Polyvinylpyrrolidon beschichtete Polycarbonat-Filter (Neuroprobe); 20 μl/Vertiefung) eingebracht; 29 μl einer 1 nM Lösung von SDF wurde in die untere Kammer eingebracht. Für den RAM-Assay wurden die Zellen wie für den herkömmlichen Assay zubereitet, mit der Ausnahme, dass die Konzentration von SDF in der unteren Kammer 1 μM betrug. Die Zellen wurden bei 37°C 150 Minuten lang inkubiert. Der Assay wurde beendet, indem die Zellen unter Verwendung eines Gummischabers aus der oberen Kammer und von der Membranoberfläche entfernt wurden. Die Zellen, die in die untere Kammer gewandert waren, wurden mit dem CyQuant-Assay (Molecular Probes) quantifiziert.
  • Im herkömmlichen Assay (5A) wurde die Zellwanderung bei 11 nM vMIP-II teilweise gehemmt; die Zellwanderung wurde mit steigender Konzentration von vMIP-II (bis zu 100 nM) weiter gehemmt, was bestätigte, dass vMIP-II ein Antagonist von CXCR4 ist. In der Ausführung des RAM-Assays (5B) wurde in Abwesenheit von vMIP-II geringe Wanderung beobachtet. Die Wanderung wurde jedoch in Gegenwart von vMIP-II bei 11 nM aktiviert, was die Abnahme der Wanderung, die im herkömmlichen Assay (5A) beobachtet wurde, spiegelte. Eine gesteigerte Konzentration von vMIP-II korrelierte mit einer vermehrten Zellwanderung, wobei die maximale Wanderung bei 100 nM beobachtet wurde.
  • Beispiel 3
  • Validierung des RAM-Assavs unter Verwendung bekannter Antagonisten von kleiner Molekülgröße von CXCR3, CXCR4 und CCR1
  • RAM-Assays wurden wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass vorher identifizierte Antagonisten von kleiner Molekülgröße anstelle von vMIP-II wie auch zusätzlich Zelltypen wie in Tabelle 2 beschrieben verwendet wurden. Tabelle 2 Variablen der Experimente
    Figure 00240001
  • Im RAM-Assay, wobei aktivierte Lymphozyten in Gegenwart steigendender Konzentrationen von RAMAG-1 und in Gegenwart des CXCR3-Liganden I-TAQ bei 250 nM inkubiert waren, wurde die Zellwanderung bei weniger als 1 μM aktiviert (6A); mit steigender Konzentration von RAMAG-1 nahm die Zellwanderung zu, wobei sie ein Maximum bei (–6,5 bis –5) von RAMAG-1 erreichte.
  • Bei einer Konzentration des CXCR4-Liganden SDF-1 von 100 nM unter Verwendung von CXCR4 exprimierenden MOLT-4 Zellen aktivierte RAMAG-2 die Zellwanderung bei 5 μM (5, B). Wie es bei RAMAG-1 beobachtet wurde, wurde eine weitere Aktivierung der Wanderung gesehen, wenn die Konzentration von RAMAG-2 auf 10 μM anstieg.
  • Auch der Antagonist von CCR1, RAMAG-3, ergab ähnliche Ergebnisse. In einem RAM-Assay unter Verwendung von CCR1 exprimierenden THP-1 Zellen aktivierte RAMAG-3 die Zellwanderung bei 100 nM; als die Konzentration von RAMAG-3 anstieg, erhöhte sich auch das Wanderungssignal (5, C).
  • Beispiel 4
  • Validierung des RAM-Assays unter Verwendung bekannter kleiner Moleküle, welche die Zellwanderung bei CXCR4 tragenden Zellen in herkömmlichen Assavs unspezifisch hemmen
  • Dieses Experiment zeigt schlüssig die Fähigkeit von RAM-Assays, unspezifische und spezifische Antagonisten von Chemokinrezeptoren zu unterscheiden. Es wurden ein herkömmlicher Assay und RAM-Assays wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, aber mit den folgenden Kandidaten für Antagonisten:
    • (1) Kontrolle (kein Kandidat für einen Antagonisten)
    • (2) positive Kontrolle (vMIP-II; ein bekannter Antagonist von CXCR4)
    • (3) bekannte, unspezifische Hemmstoffe der Zellwanderung: Verbindung # 1 Verbindung # 2 Verbindung # 3
  • Wie in 7A gezeigt wanderten Kontrollzellen, aber diejenigen, die mit vMIP-II und den Verbindungen # 1, # 2 und # 3 inkubiert waren, zeigten eine verminderte Zellwanderung. Wenn die gleichen Kandidaten für Antagonisten einem RAM-Assay unterzogen wurden, (7B), wanderten die Kontrollzellen nicht, wie erwartet, während Zellen, die mit vMIP-II behandelt waren, wanderten (ebenso erwartet). Die Verbindungen # 1, # 2 und # 3, bekannte Verbindungen, welche die Zellwanderung in herkömmlichen Assays unspezifisch hemmen, versagten jedoch dabei, im RAM-Assay die Zellwanderung zu aktivieren.
  • Aus den Ergebnissen, die in den Beispielen 2–4 dargestellt werden, unterscheidet der RAM-Assay zwischen unspezifischen und spezifischen Antagonisten von Rezeptoren für einen chemischen Lockstoff, wie zum Beispiel von Chemokinrezeptoren.
  • Literaturhinweise
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Claims (20)

  1. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten eines Rezeptors für chemische Lockstoffe, umfassend: Inkubieren einer Zelle, die einen Rezeptor für chemische Lockstoffe umfasst, mit einem Kandidaten für einen Antagonisten; Inkontaktbringen der Zelle mit einer hemmenden Konzentration eines Liganden für den Rezeptor für chemische Lockstoffe; und Untersuchen der Zellwanderung, wobei die Zellwanderung den Kandidaten für einen Antagonisten als einen Antagonisten identifiziert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kandidat für einen Antagonisten ein kleines Peptid, ein peptidähnliches Molekül, eine organische Verbindung, bei der es sich nicht um ein Peptid handelt, eine anorganische Verbindung, eine Nukleinsäure oder ein Antikörper ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hemmende Konzentration eines Liganden für den Rezeptor für chemische Lockstoffe die Zellwanderung um mehr als oder gleich 50 % der maximalen Liganden-aktivierten Zellwanderung hemmt.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hemmende Konzentration eines Liganden für den Rezeptor für chemische Lockstoffe die Zellwanderung um mehr als oder gleich 95 % der maximalen Liganden-aktivierten Zellwanderung hemmt.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die hemmende Konzentration eines Liganden für den Rezeptor für chemische Lockstoffe die Zellwanderung um 100 % der maximalen Liganden-aktivierten Zellwanderung hemmt.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor für chemische Lockstoffe den Rezeptor FPRL1 umfasst und der chemische Lockstoff einen Liganden für FPRL1 umfasst.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Ligand für FPRL1 aus der Gruppe, die aus W-Peptid1 und W-Peptid2 besteht, ausgewählt ist.
  8. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten eines Chemokinrezeptors, umfassend: Inkubieren einer Zelle, die einen Chemokinrezeptor umfasst, mit einem Kandidaten für einen Antagonisten; Inkontaktbringen der Zelle mit einer hemmenden Konzentration eines Liganden für den Chemokinrezeptor; und Untersuchen der Zellwanderung, wobei die Zellwanderung den Kandidaten für einen Antagonisten als einen Antagonisten identifiziert.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Kandidat für einen Antagonisten ein kleines Peptid, ein peptidähnliches Molekül, eine organische Verbindung, bei der es sich nicht um ein Peptid handelt, eine anorganische Verbindung, eine Nukleinsäure oder ein Antikörper ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 8, wobei es sich bei dem Chemokinrezeptor um CXCR1, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, CCR11, CX3CR1 oder XCR1 handelt.
  11. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das Chemokin aus der Gruppe, die aus Liganden für CCR, CXCR und CX3CR besteht, ausgewählt ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei es sich bei dem Chemokin um IL-8, GCP-2, Gro α, Gro β, Gro γ, ENA-78, PBP, MIG, IP-10, 1-TAC, SDF-1, BLC, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, HCC-1, HCC-2, HCC-3, HCC-4, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, Eotaxin-1, Eotaxin-2, TARC, MDC, MIP-3α, MIP-3β, 6Ckine, 1-309, TECK, Lymphotactin, Fractalkin, TCA-4, Exodus-2, Exodus-3 oder CKβ-11 handelt.
  13. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Chemokinrezeptor CCR5 umfasst und das Chemokin MIP-1α, MIP-1β oder RANTES umfasst.
  14. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Chemokinrezeptor CXCR4 umfasst und das Chemokin SDF-1 umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Chemokinrezeptor CCR9 umfasst und das Chemokin TECK umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Chemokinrezeptor CCR10 umfasst und das Chemokin CTACK umfasst.
  17. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die hemmende Konzentration eines Liganden für den Chemokinrezeptor die Zellwanderung um mehr als oder gleich 50 % der maximalen Liganden-aktivierten Zellwanderung hemmt.
  18. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die hemmende Konzentration eines Liganden für den Chemokinrezeptor die Zellwanderung um mehr als oder gleich 95 % der maximalen Liganden-aktivierten Zellwanderung hemmt.
  19. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die hemmende Konzentration eines Liganden für den Chemokinrezeptor die Zellwanderung um 100 % der maximalen Liganden-aktivierten Zellwanderung hemmt.
  20. Verfahren zum Identifizieren eines Antagonisten eines Chemokinrezeptors, umfassend: Identifizieren eines Kandidaten für einen Antagonisten eines Chemokinrezeptors in einem herkömmlichen Assay; weiter umfassend einen zweiten Schritt, umfassend: Inkubieren einer Zelle, die den Chemokinrezeptor umfasst, mit dem Kandidaten für einen Antagonisten; Inkontaktbringen der Zelle mit einer hemmenden Konzentration eines Liganden für den Chemokinrezeptor; und Untersuchen der Zellwanderung, wobei die Zellwanderung den Kandidaten für einen Antagonisten als einen Antagonisten identifiziert.
DE60216606T 2001-06-07 2002-05-22 Zellwanderungsassay Expired - Lifetime DE60216606T2 (de)

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