PT767796E - Proteina quimiotactica - Google Patents

Description

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Descrição “Proteína quimiotáctica* A presente invenção diz respeito a polinucleótidus rccenlcinente identificados, a polipeptidos codificados por tais polinucleótidos, à utilização desses polinucleótidos e polipeptidos e também à produção de tais polinucleótidos e polipeptidos.

Mais particularmente, o polipeptido da presente invenção é uma proteína quimiotáctica (PQ, em inglês CP). A invenção também diz respeito à inibição da acção desses polipeptidos. Há três formas de proteínas quimiotácticas monocíticas, designadamente as PQM-1, PQM-2 e PQM-3 (em inglês respectivamente MCP-1, MCP-2 e MCP-3). Todas estas proteínas foram já caracterizadas estrutural e funcionalmente e também foram já clonadas e expressas. As PQM-1 e PQM-2 têm capacidade para atrair os leucócitos (monócitos e leucócitos), ao passo que a PQM-3 também atrai os eosinófilos e os linfócitos T (Dahinderi, E. et al., J. Exp. Med., 179:751-756(1994)).

Inicialmente, purificou-se o factor de atraeção específico dos monócitos humanos a partir da linhagem de células de glioma e a partir de uma linhagem de células monocíticas. Matsushima, K. et al., J. Exp. Med., 169:1485-1490 (1989). Este factor foi oiiginaiiamente designado por factor quimiotáctico derivado do glioma (FQDG, em inglês GDCF) e factor activador e quimiotáctico monocítico (FAQM, em inglês MCAF) por Matsushima et al.. Este factor é agora designado por PQM-1. A clonagem subsequente do ADNc para a PQM-1 demonstrou que era muitíssimo semelhante ao gene JE dos murinos. O gene JE pode ser induzido cm grande quantidade nos fibroblastos dos murinos pelo factor de crescimento derivado das plaquetas. Cochran, B.H. et al, Cell, 33:939-947 (1983). O gene JE dos murinos é muitíssimo semelhante à PQM-1. A proteína PQM-1 é 62% idêntica ao gene JE dos murinos numa região de 68 resíduos partilhados do tenninal N. É geralmente aceite que o gene JE e a proteína PQM-1 são espécies homólogas. O polipeptido da presente invenção, PQ, está ao mesmo tempo estrutural c funcionalmente relacionado com α PQM-1 e com a proteína JE dos murinos; ver a figura 2. Há um método para suprimir a formação de tumores num vertebrado, mediante a administração de JE/PQM-1 (em inglês JE/MCP-1), que está descrito no pedido de patente de invenção PCT com o n° WO-92/20372, conjuntamente com métodos para tratar complicações localizadas de tumores malignos e métodos para combater infecções parasíticas mediante a administração de JE/PQM-1. Descobriu-se que a expressão de JE/PQM-1 em células malignas suprime a capacidade das células para formarem tumores in vivo. A PQM-1 humana é um péptido básico de 76 aminoácidos com uma massa molecular prevista de 8700 daltons. A PQM-1 é induzivelmente expressa sobretudo em monócitos, células endoteliais e fibroblastos. Leonard, E.J. e Yoshimura, T., Immunol. Today, 11:97-101 (1990). Os factores que induzem esta expressão são a IL-1, o FNT (em inglês TNF) ou o tratamento de lipopolissacáridos.

Há outras propriedades da PQM-1 que incluem a capacidade para activar fortemente os basófílos humanos plenamente desenvolvidos (maduros) de uma forma sensível à toxina da pertosse (tosse convulsa). A PQM-1 é uma citoquina capaz de induzir directamente a libertação de histamina pelos basófílos (BischofiÇ S.C. et d, J. Exp. Med, 175:1271-1275 (1992)). Além do mais, a PQM-1 favorece a formação do leucotrieno C4 pelos basófílos pré-tratados com inter-leucina 3, interleucina 5 ou com o fàctor estimulador das colónias de granulódtos/macrófagos. A libertação de mediadores basófilos, induzida pela PQM-1, pode desempenhar um papel importante nas inflamações alérgicas e noutras patologias em que seja expressa a PQM-1.

Os clones que possuem uma sequência de nucleótidos que codifica o factor activador e quimiotáctico monocítico humano (FAQM) revelam que a estrutura primária do polipeptido FAQM c constituída por uma sequência putativa do péptido de sinal com 23 aminoácidos e por uma sequência de FAQM madura com 76 resíduos aminoácidos. Funrtani, Y.H. et cã., Biochem. Biophys. Res. Commu., 159:249-55 (1989). Também foi determinada a sequência completa de aminoácidos do factor quimiotáctico monocítico derivado do glioma humano (F-2QDG, em inglês GDCF-2). Este péptido atrai os monócitos humanos mas não os neutrófilos. Concluiu-se que o F-2QDG possui 76 resíduos aminoácidos. A cadeia de péptidos possui 4 meias cisternas, nas posições 11, 12, 36 e 52, o que cria um par de laços, agrupadas nas pontes dissulfureto. Além disso, o gene da PQM-1 foi atribuído ao cromossoma 17 humano. Mehrabian, M.R. et ai, Genomics, 9:200-3 (1991). Há também um análogo da PQM-1 que está descrito no documento EP-A-488900. Determinados dados sugerem que um papel potencial para a PQM-1 é a mediação da infiltração monocítica das paredes das artérias. Parece que os monócitos são fulcrais para a aterogénese, quer como progenitores de células esponjosas quer como uma fonte potencial de factores de crescimento que intervêm indirectamente na hipetplasia da membrana íntima. Nelken, N.A et al., J. Clin. Invest, 88:1121-7 (1991). Descobriu-se também que a produção sinovial de PQM-1 pode desempenhar um papel importante na mobilização de fagócitos mononucleares durante uma inflamação associada à artrite reumatóide e que os macrófagos do tecido sinovial constituem a fonte dominante desta citoquina. Concluiu-se que os níveis de PQM são significativamente mais elevados no fluído sinovial retirado de pacientes com artrite reumatóide, comparativamente com o fluído sinovial de pacientes com osteoartrite, ou proveniente de pacientes com ouras artritidias. Koch, A.E. et al, J. Clin. Invest., 90:772-9 (1992). A PQM-2 e a PQM-3 são classificadas numa subfamília de proteínas pró-inflamatórias e estão fimcionalmente relacionadas com a PQM-1 porque atraem especificamente monócitos, mas não os neuliólilos. Van Dammc, J. et al., J. Exp. MccL, 176:59-65 (1992). A PQM-3 tem uma homologia de aminoáddos de 71% e de 58% respectivamente com a PQM-1 e a PQM-2. A PQM-3 é uma citoquina inflamatória que regula as funções dos macrófagos.

De acordo com um aspecto da presente invenção, esta proporciona um novo polipeptido plenamente desenvolvido (maduro), que é uma PQ, e também os seus fragmentos. O polipeptido da presente invenção é de origem humana.

De acordo com outro aspecto da presente invenção, esta proporciona polinucleótidos (ADN ou ARN) que codificam tais polipeptádos.

Ainda de acordo com outro aspecto da presente invenção, esta proporciona um processo para a produção desses polipeptidos por meio de técnicas recombinantes.

Ainda de acordo com um outro aspecto da invenção, esta proporciona um processo para utilizar tais polipeptidos, ou polinucleótidos que codificam tais polipeptidos para fins terapêuticos, por exemplo, para tratar tumores, para favorecer a cicatrização de ferimentos, para combater infecções parasíticas e para regular a hematopoiese.

Ainda de acordo com mais um outro aspecto da invenção, esta proporciona um anticorpo contra tais polipeptidos.

Também de acordo com mais um outro aspecto da invenção, esta proporciona métodos para a identificação de antagonistas/inibidores de tais polipeptidos, os quais podem ser utilizados para inibir a acção desses polipeptidos para fins terapêuticos, por exemplo, para o tratamento da artrite reumatóide, de infecções pulmonares, alergias e doenças infecciosas e para evitar as inflamações e a aterosclerose.

Estes e outros aspectos da presente invenção são evidentes para os especialistas na matéria à luz dos preceitos aqui descritos.

Os desenhos a seguir apresentados ilustram as variantes da invenção e com eles não se pretende limitar o seu âmbito, tal como definido nas reivindicações anexas. A figura 1 ilustra uma sequência de ADNc e a correspondente sequência deduzida de aminoácidos da PQ. A sequência de 119 aminoácidos representada é a proteína de comprimento completo, em que aproximadamente os primeiros 22 aminoácidos representam uma sequência líder tal que a forma madura da proteína fica com um comprimento de 97 aminoácidos. Utiliza-se a abreviatura convencional de uma letra para designar os aminoácidos A figura 2 ilustra a homologia que há entre as sequências de ADNc da PQ e da proteína JE dos murinos. A sequência de cima, em cada três segmentos, é PQ e a sequência de baixo é a proteína JE dos murinos. A figura 3 mostra os resultados de uma análise pelas autorradiografias à Northern para um transcrito de ARNm para a PQ em células humanas. A figura 4 mostra o padrão de bandas da PQ humana a seguir à expressão bacteriana e à purificação. A figura 5 é uma representação esquemática do vector pQE-9.

De acordo com um aspecto da presente invenção, esta proporciona um ácido nucleico isolado (polinucleótido) que codifica o polipeptido maduro que possui a sequência deduzida de aminoácidos da figura 1 ou para o polipeptido maduro codificado pelo ADNc do clone depositado na instituição ATCC com o n° 75703 de depósito em 10 de Março de 1994.

O polinucleótido da presente invenção foi desvendado a partir de um banco de ADNc de monócitos activados. Este polinucleótido possui um bloco de leitura ininterrupta que codifica uma proteína de comprimento aproximadamente igual a 119 aminoácidos dos quais os primeiros 22 resíduos aminoácidos compreendem uma sequência líder putativa. Antevê-se que a sua proleíua madura tenha um comprimento dc 97 aminoácidos. Está estruturalmente relacionada com a proteína quimiotáctica monocítica do minganho (PQM-1 ou JE), demonstrando uma identidade de 27% e uma semelhança de 56% em relação à sequência completa da proteína PQM-1 humana O polipeptido possui a totalidade dos 4 resíduos cisterna que ocorrem em todas as quimioquinas segundo um motivo característico. O afastamento entre estas cisternas é conservado comparativamente com a PQM-l/JE dos murinos que sugere fortemente que o novo gene é uma quimioquina O polinucleótido da presente invenção pode estar sob a forma de ARN ou sob a forma de ADN, podendo esse ADN ser um ADNc, um ADN genómico ou um ADN sintético. O ADN pode ser de cadeia dupla ou de cadeia singular e se for de cadeia singular pode ser a cadeia codificadora ou a cadeia não codificadora (anti-sentido). A sequência codificadora que codifica o polipeptido maduro pode ser idêntica à sequência codificadora representada na figura 1 ou à do clone depositado ou pode ser uma sequência codificadora diferente que codifique, como resultado da redundância ou da degeneração do código genético, o mesmo polipeptido maduro que é codificado pelo ADN da figura 1 ou pelo ADNc depositado. O polinucleótido que codifica o polipeptido maduro da figura 1 ou o polipeptido maduro, codificado pelo ADNc depositado, pode compreender: apenas a sequência de codificação para o polipeptido maduro; a sequência de codificação para o polipeptido maduro e outra sequência codificadora tal como uma sequência líder ou secretória ou uma sequência de uma pró-proteína; a sequência de codificação para o polipeptido maduro (e facultativamente outra sequência de codificação) e uma sequência não codificadora, tal como um intrão ou uma sequência não codificadora de 5’ e/ou 3’ da sequência de codificação para o polipeptido maduro.

Assim sendo, o expressão “polinucleótido que codifica um polipeptido” designa um polinucleótido que possui apenas a sequência de codificação para o polipeptido e também um polinucleótido que contem a sequência codificadora e/ou não codificadora. A presente invenção também diz respeito a variantes dos polinucleótidos aqui descritos anteriormente que codificam fragmentos, análogos e derivados do polipeptido que possui a sequência deduzida de aminoácidos da figura 1 ou o polipeptido codificado pelo ÂDNc do clone depositado. A variante do polinucleótido pode ser uma variante alélica do polinucleótido que ocorra naturalmente ou pode ser uma variante do polinucleótido que ocorra de uma forma não natural.

Posto isto, a presente invenção compreende os polinucleótidos que codificam o mesmo polipeptido maduro representado na figura 1 ou o mesmo polipeptido maduro codificado pelo ADNc do clone depositado, e também as variantes desses polinucleótidos que codifiquem um fragmento, um derivado ou um análogo do polipeptido da figura 1 ou o polipeptido codificado pelo ADNc do clone depositado. Tais variantes nucleotídicas compreendem as variantes obtidas por supressão, as variantes obtidas por substituição e as variantes obtidas por adição ou inserção.

Conforme se disse antes, o polinucleótido pode ter uma sequência codificadora que é uma variante alélica da sequência codificadora que ocorre naturalmente representada na figura 1 ou da sequência codificadora do clone depositado. Confonne é sabido na especialidade, uma variante alélica é uma forma alternativa de uma sequência polinucleotídica em que pode ter havido uma substituição, uma supressão ou uma adição de um ou vários nucleótidos, a qual não altere de forma significativa a função do polipeptido codificado. A presente invenção também compreende polinucleótidos em que a sequência codificadora do polipeptido maduro pode ser fundida no mesmo bloco de leitura com iimp sequência polinucleotídica que auxilie a expressão e a secreção de um polipeptido a partir de uma célula hospedeira, por exemplo, uma sequência líder que funcione como uma sequência secretória para controlar o transporte de um polipeptido para fora da célula. O polipeptido que possui uma sequência líder é uma pré-proteína e pode ter a sequência líder clivada pela célula hospedeira para dar origem à forma madura do polipeptido. Os polinucleótidos também podem codificar uma pró-proteína que é a proteína madura mais os outros resíduos aminoácidos de 5’. Uma proteína madura que possua uma pró-sequência é uma pró-proteína e constitui uma forma inactiva da proteína. Uma vez clivada a pró-sequência, continua a existir uma proteína madura activa.

Assim, por exemplo, o polinucleótido da presente invenção pode codificar uma proteína madura ou uma proteína que possua uma pró-sequência ou uma proteína que possua simultaneamente uma pró-sequência e uma pré-sequência (sequência líder).

Os polinucleótidos da presente invenção também podem ter a sequência de codificação fundida concatenadamente com uma sequência identificadora que permita a purificação do polipeptido da presente invenção. A sequência identificadora pode ser um identificador hexa-histidina transportado por um vector pQE-9 para permitir a purificação do polipeptido maduro fundido com o marcador no caso de um hospedeiro bacteriano ou então, por exemplo, a sequência marcadora pode ser um identificador hemaglutinina (HA) no caso de se utilizar um hospedeiro mamífero (células COS-7). 0 identificador HA corresponde a nm epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson, I. et al., Cell, 37:767 (1984)). A presente invenção também diz respeito a polinucleótidos que hibridam com as sequências anteriormente aqui descritas se houver pelo menos uma identidade de 70% entre as scqucncias. A presente invenção diz respeito particulanncnte o polinucleótidos que hibridam, em condições rigorosas, com os polinucleótidos anteriormente aqui descritos. Tal como aqui utilizada, a expressão “condições rigorosas” significa que a hibridação apenas irá ter lugar se houver pelo menos 95% e de preferência houver pelo menos 97% de identidade entre as sequências. Os polinucleótidos que hibridam com os polinucleótidos anteriormente aqui descritos, de acordo com uma variante preferencial, codificam polipeptidos que conservam praticamente a mesma função ou actividade biológica do polipeptido maduro codificado pelo ADNc da figura 1 ou pelo ADNc depositado.

Os depósitos aqui referidos irão ser mantidos ao abrigo dos termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para efeitos de Procedimentos de Patentes de Invenção. Estes depósitos são indicados simplesmente aos especialistas na matéria por razões de conveniência e com isso não se deve inferir que é necessário-- um depósito ao abrigo do n° 35 U.S.C. § 112. A sequência dos polinucleótidos contidos nos materiais depositados e também a sequência de aminoácidos dos polipeptidos assim codificados consideram-se aqui incorporadas por referência e servem de contraprova na eventualidade de haver algum conflito com qualquer descrição das sequências aqui apresentadas. Eventualmente pode ser necessária uma licença para se fazer, utilizar ou comercializar os materiais depositados e não há aqui nenhuma licença concedida. A presente invenção também diz respeito a um polipeptido PQ que possui a sequência deduzida de aminoácidos da figura 1 ou que possui a sequência de aminoácidos codificada

' ΙΌ"* pelo ADNc depositado, e também diz respeito a fragmentos, análogos e derivados desse polipeptido.

Os termos “fragmento”, “derivado” e “análogo”, quando se referem ao polipeptido da figura 1 ou àquele que é codificado pelo ADNc depositado, designam um polipeptido que conserva esscucialmcnte a mesma função ou actividade biológica de um polipeptido desse tipo. Assim, um análogo compreende uma pró-proteína que pode ser activada por clivagem da parcela de pró-proteína para produzir um polipeptido maduro activo. O polipeptido da presente invenção pode ser um polipeptido recombinante, um polipeptido natural ou um polipeptido sintético e de preferência é um polipeptido recombinante O fragmento, o derivado ou o análogo do polipeptido da figura 1 ou aquele que é codificado pelo ADNc depositado pode ser (i) um em que um ou vários dos resíduos aminoácidos são substituídos com um resíduo aminoácido conservado ou não conservado (de preferência, um resíduo aminoácido conservado) e esse resíduo aminoácido substituído pode ser ou não ser um resíduo codificado pelo código genético, ou (ii) um em que um ou vários resíduos aminoácidos possuam um grupo substituinte, ou (iii) um em que o polipeptido maduro esteja fundido com outro composto, por exemplo, um composto que sirva para aumentar o período de semi-vida do polipeptido (por exemplo, polietileno-gjicol), ou (iv) um em que os aminoácidos adicionais estejam fundidos com o polipeptido maduro, tal como uma sequência líder ou uma sequência secretória ou uma sequência que seja utilizada para a purificação do polipeptido maduro ou uma sequência de pró-proetmas. Considera-se que tais fragmentos, derivados e análogos estão ao alcance dos conhecimentos dos especialistas na matéria, à luz dos preceitos aqui descritos.

Os polipeptidos e os polinucleótidos da presente invenção são fornecidos preferencialmente sob uma forma isolada e de preferência são purificados até se obter homogeneidade. tf*·* y .s iy

O termo “isolado” significa que o material é retirado do seu ambiente original (v.g. o ambiente natural se for do tipo que ocorre naturalmente). Por exemplo, um polinucleótido ou um polipeptido que ocorra naturalmente, existente num animal vivo, não está isolado, mas o mesmo polinucleótido ou polipeptido, separado de uma parte ou da totalidade dos materiais co-existentes no sistema natural, está isolado. Tais polinucleótidos podem fazer parte de um vector e/ou esses polinucleótidos ou polipeptidos podem fazer parte de uma composição e mesmo assim continuarem a ser considerados como isolados, na medida em que tal vector ou composição não faça parte do seu ambiente natural. Λ presente invenção também diz respeito a vectores que compreendem os polinucleótidos da presente invenção, às células hospedeiras que são engendradas geneticamente com vectores da invenção e à produção de polipeptidos da invenção por meio de técnicas recombinantes.

As células hospedeiras são engendradas geneticamente (traduzidas ou transformadas ou transfectadas) com os vectores da presente invenção que podem ser, por exemplo, um vector de clonagem ou um vector de expressão. O vector pode estar, por exemplo, sob a forma de um plasmídeo, de uma partícula virai, de um fago, etc.. Âs células hospedeiras assim engendradas podem ser criadas em cultura em meios nutrientes convencionais modificados conforme adequado para activar promotores, seleccionar transformantes ou amplificar os genes da PQ. As condições de cultura, tais como temperatura, pH e outras que tais, são as anteriormente utilizarias com a célula hospedeira seleccionada para a expressão e são evidentes para qualquer especialista na matéria.

Os polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados para a produção de polipeptidos por meio de técnicas recombinantes. Assim sendo, por exemplo, o polinucleótido pode ser incluído eventualmente em qualquer um dos inúmeros vectores de expressão para /

/· 12 que um polipeptido seja expresso. Tais vectores compreendem as sequências cromossómcias, não cromossómicas e de ADN sintéticas, v.g., os derivados de VS40 (em inglês SV40); plasmídeos bacterianos; ADN de fagos; baculovírus; plasmídeos de leveduras; vectores derivados de combinações de plasmídeos e de ADN de fagos, ADN virai, tal como o do vírus de vaccima, adenovirus, avipoxvírus e pseudo vírus da raiva. No entanto, é possível utilizar qualquer outro vector desde que seja replicável e viável no hospedeiro. A sequência de ADN adequada pode ser inserida no interior do vector por meio de diversos procedimentos. Em geral, insere-se a sequência do ADN no interior de um ou vários locais de endonucleases de restrição adequadas por meio de procedimentos conhecidos na especialidade. Pressupõe-se que esses e outros procedimentos são do conhecimento dos especialistas na matéria. A sequência de ADN no vector de expressão está funcionalmente ligada a uma sequência adequada (promotor) de controlo da expressão para dirigir a síntese do ARNm. Como exemplos representativos de tais promotores refere-se os seguintes: o promotor RTL ou VS40 (em inglês LTR ou S V40), o promotor lac ou trp de E. coli, o promotor PL do fago lambda e outros promotores sobre os quais se sabe que controlam a expressão de genes em células procarióticas ou eucarióticas ou nos seus vírus. O vector de expressão também pode conter um local de ligação ribossómico para o início da tradução e um terminador de transcrição. O vector também pode conter sequências adequadas para amplificar a expressão.

Além disso, os vectores de expressão contêm preferencialmente um ou vários genes marcadores seleccionáveis que proporcionam uma característica fenotípica para selecção de células hospedeiras transformadas, tais como a resistência à neomicina ou di-hidrofolato-redutase para a cultura de células eucarióticas, ou tais como a resistência à tetraciclina ou à ampicilina emiT. coli. O vector que contém a sequência adequada de ADN, tal como aqui descrita antes, e também uma sequência de controlo ou um promotor adequado, pode ser utilizado para transformar um hospedeiro conveniente para permitir que o hospedeiro exprima a proteína.

Como exemplos representativos de hospedeiros convenientes é possível mencionar células bacterianas, tais como E. colt, Strepiomyces, Sulmurudlu lyphimurium, cclulas dc fungos, tais como leveduras; células de insectos, tais como Drosophila e Sfi\ células de animais, tais como OCC (em inglês CHO), COS ou células do melanoma de Bowes; células de plantas; etc.. Considera-se que a selecção do hospedeiro conveniente é assunto da competência dos especialistas na matéria, a partir dos preceitos aqui explicitados.

Mais particularmente, a presente invenção também diz respeito a arquétipos recombinantes que compreendem uma ou várias das sequências profusamente descritas antes. Os arquétipos compreendem um vector, tal como um vector plasmídico ou virai, no interior do qual tenha sido inserida uma sequência da invenção, com uma orientação directa ou inversa. De acordo com um aspecto preferido desta variante, o arquétipo compreende também sequências regulativas, incluindo, por exemplo, um promotor funcionalmente ligado à sequência. Há inúmeros vectores e promotores adequados que são conhecidos pelos especialistas na matéria e que estão disponíveis nos circuitos comerciais. A título de exemplo refere-se os vedores a seguir indicados. Vectores bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, ‘phagescript’, psiX174, ‘pbluescript SK’, pbsks, pNH8A, pNHlóa, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Vedores eucarióticos: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). No entanto, é possível utilizar quaisquer outros plasmídeos ou vedores desde que sejam replicáveis e viáveis no hospedeiro.

As regiões do promotor podem ser escolhidas a partir de qualquer gene desejado utilizando vectores de CAT (cloranfenicol-transferase) ou outros vectores com marcadores seleccionáveis. Há dois vectores adequados que são PKK232-8 e PCM7. Entre os vectores bacterianos particulares citados refere-se lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda Pr, Pl e trp. Os promotores eucarióticos são selecciouadus eiiUe o promotor arrlecipaíivo imediato de CMV, a timidina--cinase do VI IS (cm inglês HSV), os VS40 (em inglês SV40) antecipativo e postecipativo, as RTL (em inglês LTR) de rctrovírus e a metalotioneina I do muiganho. A selecção do vector e do promotor convenientes é uma questão da competência de qualquer especialista na matéria.

De acordo com outra variante, a presente invenção diz respeito a células hospedeiras que contêm os arquétipos supramencionados. A célula hospedeira pode ser uma célula eucariótica superior, tal como uma célula de mamífero, ou uma célula eucariótica inferior, tal como uma célula de leveduras, ou então a célula hospedeira pode ser uma célula procariótica, tal como uma célula bacteriana. A introdução do arquétipo na célula hospedeira pode ser feita por transfecção com fosfato de cálcio, transfecção mediada por DEAE-dextrano ou por electroporação (Davis, L, Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

Os arquétipos nas células hospedeiras podem ser utilizados de uma forma convencional para produzirem um produto gémeo codificado pela sequência recombinante. Em alternativa, os polipeptidos da invenção podem ser produzidos sinteticamente em sintetizadores convencionais para péptidos.

As proteínas plenamente desenvolvidas (maduras) podem ser expressas em células de mamíferos, leveduras, bactérias ou noutras células hospedeiras sob o controlo de promotores adequados. Também podem ser utilizados sistemas de tradução sem células para a produção de tais proteínas, utilizando para tal os ARN obtidos a partir de arquétipos de ADN da presente invenção. Os vectores de clonagem e expressão adequados, utilizáveis com os hospedeiros procarióticos e eucarióticos, estão descritos na obra de Sambrook et cã. ‘Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual’, segunda edição, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), cujo conteúdo se considera aqui incorporado por referência. A transcrição do ADN que codifica os polipcptidos da presente invenção pelos eucariotas superiores é aumentada inserindo uma sequência intensificadora no vector. Os intensificadores são elementos de ADN cis-actuantes, que possuem vulgarmente entre 10 e 300 pb e que actuam sobre um promotor para aumentarem a sua transcrição. Como exemplos refere-se o intensificador VS40 no último lado dos pb 100 a 270 da origem de replicação, o intensificador do promotor antecipativo de citomegalovirus, o intensificador do polioma no último lado da origem de replicação e os intensificadores de adenovírus.

De um modo geral, os vectores de expressão recombinantes irão conter origens de replicação e marcadores seleccionáveis que permitam a transformação da célula hospedeira, v.g., o gene de E. coli e o gene TRP1 de S. cerevisiae que conferem resistência à ampicilina, e ainda um promotor derivado de um gene fortemente expresso para comandar a transcrição de uma sequência estrutural a jusante. Tais promotores podem ser obtidos a partir de operões que codificam enzimas glicolíticas, tais como a 3-fosfoglicerato-cinase (PGK), o factor a, a fosfàtase ácida ou as proteínas do choque térmico, entre outros. A sequência estrutural heteróloga é montada em fase adequada com as sequências de início e de terminação da tradução e de preferência com uma sequência líder capaz de comandar a secreção da proteína traduzida no interior do espaço periplásmico ou no meio extracelular. Facultativamente, a sequência heteróloga pode codificar uma proteína de fusão que possua um péptido de identificação do terminal N que confira as características desejadas, v.g., estabilização ou purificação simplificada do produto recombinante expresso.

Os vectores de expressão úteis para utilização com bactérias são construídos inserindo uma sequência de ADN estrutural que codifica uma proteína desejada conjuntamente com os sinais adequados de início e de terminação da tradução em fase de leitura executável com um promotor funcional. O vector irá ter um ou vários marcadores seleccionáveis fenotípicos e uma origem de replicaçõo para garantir a conservação do vcctor c tambcm, sc desejado, para favorecer a amplificação no interior do hospedeiro. Como hospedeiros procarióticos convenientes para a transformação refere-se E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium e diversas espécies pertencentes aos géneros Pseudomonas, Streptomyces e Síaphylococcus, embora também seja possível utilizar outros hospedeiros escolhidos por outros critérios.

Como exemplo representativo, mas não limitativo, os vectores de expressão úteis para utilização com bactérias podem ter um marcador seleccionável e uma origem bacteriana de replicação, resultante de plasmídeos comerciahnente disponíveis que contenham elementos genéticos do vector de clonagem bem conhecido PBR322 (ATCC 37017). Tais vectores de natureza comercial compreendem, por exemplo, o pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suécia) e GEMI (Promega Biotec, Madison, WI, E.U.A.). Estas secções “fundamentais” de PBR322 são combinadas com um promotor adequado e com a sequência estrutural que irá ser expressa. A seguir à transformação de uma estirpe hospedeira adequada e subsequente crescimento da estirpe hospedeira até se obter uma densidade de células conveniente, o promotor seleccionado é induzido por meios convenientes (v.g., mudanças de temperatura ou indução química) e as células são criadas em cultura durante um período suplementar.

As células são colhidas tipicamente por centrifugação, desmembradas por meios físicos ou químicos e o extracto bruto resultante é conservado para posterior purificação.

As células microbianas utilizadas na expressão de proteínas podem ser desmembradas por meio de qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelação-descongelação, tratamento com ultra-sons, desmembramento mecânico ou utilização de agentes que induzam a citólise, sendo tais métodos perfeitamente conhecidos pelos especialistas na matéria.

Também é possível utilizar diversos sistemas de cultura de células dc mamíferos para a expressão de proteínas recombinantes. Como exemplos de sistemas de expressão obtidos a partir de mamíferos refere-se as linhagens de células COS-7 dos fibroblastos do rim do macaco, conforme descrito por Gluzman em ‘Cell’, 23:175 (1981), e outras linhagens de células capazes de exprimirem um vector compatível, por exemplo, as linhagens de células C127, 3T3, OCC, HeLa e RCB (em inglês BHK). Os vectores de expressão de mamíferos irão possuir uma origem de replicação, um promotor conveniente e um intensificador e também todos os locais necessários de ligação de ribossomas, locais de poliadenilação, locais de junção do dador e do aceitador, sequências de terminação da transcrição e sequências não transcritas de flanqueamento em 5’. As sequências de ADN obtidas a partir da junção de VS40 e os locais de poliadenilação podem ser utilizados para se obter os necessários elementos genéticos não transcritos. O polipeptido pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de células recombinantes por métodos que compreendem a precipitação em sulfato de amónio ou em etanoL, a extraeção em meio ácido, a cromatografia de permuta de aniões ou de catiões, a cromatografia com fosfocelulose, a cromatografia por interaeção hidrofôbica, a cromatografia por afinidade, a cromatografia com hidroxil-apatite e a cromatografia com lectina. É preferível que haja concentrações muito pequenas (aproximadamente da ordem de 0,15-5 mM) de ião cálcio presente durante a purificação (Price et al., J. Biol. Chem., 244:917 (1969)). Se necessário, é possível recorrer aos passos de redobramento de proteínas para se completar a configuração da proteína madura. Finalmente, é possível fazer uma cromatografia em líquido de elevado rendimento (CLER) para os passos finais de purificação.

Os polipeptidos da presente invenção podem ser um produto purificado naturalmente ou um produto resultante dc procedimentos de síntese química ou produzido por meio de técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariótico ou eucariótico (por exemplo, utilizando células bacterianas, de leveduras, das plantas superiores, de insectos e de mamíferos, criadas em cultura). Consoante o hospedeiro utilizado no procedimento de produção por via recombinante, assim os polipeptidos da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Os polipeptidos da invenção também podem ter um resíduo aminoácido metionina inicial.

Os polipeptidos da presente invenção, em particular a PQ, podem ser utilizados para favorecerem a cicatrização de ferimentos. Uma vez que a PQ é uma quimioquina, é pois um quimioatraente para os leucócitos (tais como os basófilos, etc.); assim sendo, a PQ irá provocar a infiltração de células imunitárias relevantes numa área lesionada.

Os polipeptidos PQ também podem ser utilizados como agentes de tratamento antitumorais e para tratar complicações localizadas de uma doença maligna, por exemplo, efusões pleurais ou ascites. A presença das PQ in vivo está associada a um aumento local da presença de eosinófilos que têm a função distintiva de aniquilarem as larvas de parasitas que invadam os tecidos, tal como sucede nos casos de esquitosomiase, triquinose e ascaríase. Por tal motivo, a PQ pode ser utilizada para combater injecções parasiticas.

Os polipeptídos PQ também podem desempenhar uma função na regulação da hematopoiese, mediante a regulação da activação e da diferenciação de diversas células progenitoras hematopoiéticas.

Os polipeptídos também podem ser utilizados de acordo com a presente invenção mediante a expressão dc tais polipeptídos in vivo, o que c frcqucntcmcnte designado por “terapia gémea”.

Por exemplo, é possível manipular ex vivo as células de um paciente com um poli-nucleótido (ADN ou ARN) que codifica um polipeptido, sendo depois as células manipuladas fornecidas a um paciente que se pretenda tratar com o polipeptido. Os métodos para isso são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, é possível manipular células por meio de procedimentos conhecidos na especialidade, mediante a utilização de partículas retrovirais que contenham ARN que codifique um polipeptido da presente invenção.

De igual modo, é possível manipular as células in vivo para a expressão de um polipeptido PQ in vivo, por exemplo, por meio de procedimentos conhecidos na especialidade. Conforme se sabe no domínio da técnica, é possível administrar uma célula produtora para produzir uma partícula retroviral que contenha ARN que codifique o polipeptido da presente invenção, a um paciente para manipular células in vivo e para que tenha lugar a expressão do polipeptido in vivo. Estes e outros métodos para administrar um polipeptido da presente invenção por meio de tal metodologia são evidentes para os especialistas na matéria à luz dos preceitos da presente invenção. Por exemplo, o veículo de expressão para manipular células pode não ser um retrovírus, por exemplo, pode ser um adenovírus eventualmente utilizado para manipular células in vivo após a combinação com um veículo adequado de administração.

Os polipeptídos da presente invenção podem ser utilizados em combinação com um veículo farmacêutico conveniente. Tais composições compreendem uma quantidade terapeuti- camente eficaz do polipeptido e um veículo ou um excipiente aceitável sob o ponto de vista farmacêutico. Tal veículo pode ser seleccionado, mas sem que isso constitua qualquer limitação, entre solutos salinos, solutos salinos tamponados, dextrose, água, glicerol, etanol e suas combinações. A formulação deve ser adequada ao modo de administração. A invenção também proporciona uma embalagem ou um estojo farmacêutico onde estão contidos um ou vários reservatórios repletos de um ou vários dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Associada a esses reservatórios pode haver uma informação respeitante a prescrições de um departamento governamental que regule o fabrico, a utilização ou a comercialização de produtos farmacêuticos ou biológicos, informação essa que comunica, por parte do departamento governamental, a aprovação de fabrico, de utilização ou de comercialização para administração a seres humanos. Além do mais, os polipeptidos da presente invenção podem ser utilizados em conjunto com outros compostos terapêuticos.

As composições farmacêuticas podem ser administradas de um modo conveniente, por exemplo, pelas vias tópica, intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutânea, intranasal ou intradermal. A PQ é administrada numa quantidade eficaz para o tratamento e/ou para a profilaxia do caso patológico específico. As quantidades e os regimes de dosagem das PQ administradas a um paciente irão depender de diversos factores, tais como o modo de administração, a natureza da doença que se pretenda tratar e a opinião do médico assistente Em geral, administrar-se-á a PQ numa quantidade pelo menos igual a 10 pg/kg de peso corporal e na maior parte dos casos administrar-se-á numa quantidade que não exceda cerca de 8 mg/kg de peso corporal por dia Na maior parte dos casos, a dosagem há estar compreendida entre cerca de 10 pg/kg e 1 mg/kg de peso corporal por dia, tomando em consideração as vias de administração, os sintomas, etc.. **· * /

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As sequências da presente invenção também são valiosas para a identificação cromossómica. A sequência é encaminhada especificamente para um local particular num determinado cromossoma humano para aí poder hibridar. Além disso, há uma necessidade permanente de identificação de locais particulares nos cromossomas. Há alguns reagentes de marcação dc uoinobsomas, com base nos dados reais da sequência (polimorfismos repetidos), que estão prcscntcmcntc disponíveis para marcar locais cromossómicos. A cartografia dos ADN em cromossomas, de acordo com a presente invenção, constitui um primeiro passo importante no corrclacionamento dessas sequências com os genes associados a uma doença.

Dito de forma abreviada, é possível cartografar as sequências em cromossomas mediante a preparação de iniciadores de RCP (de preferência com 15 a 25 pb) a partir do ADNc. Recorre-se a uma análise do ADNc, com o auxílio de um computador, para se seleccionar rapidamente os iniciadores que não abranjam mais de um exão no ADN genómico, o que complicaria o processo de amplificação. Estes iniciadores são depois utilizados para a pesquisa de híbridos de células somáticas, por RCP, que contêm cromossomas humanos individuais. Apenas os híbridos que contenham o gene humano correspondente ao iniciador irão gerar um fragmento amplificado. A cartografia de híbridos de células somáticas, por RCP, é um procedimento rápido para imputar um ADN particular a um cromossoma particular. Utilizando a presente invenção com os mesmos iniciadores oligonucleotídicos, é possível conseguir a sublocalização com painéis de fragmentos provenientes de cromossomas específicos ou de agregados de grandes clones genómicos, de uma forma análoga. É possível utilizar outras estratégias de cartografia, de modo semelhante, para cartografar os seus cromossomas, entre as quais se inclui a hibiidação irt situ, a pesquisa prévia com cromossomas marcados por citometria de fluxo e a pré-selecção por hibridação para a construção de bancos de ADNc específicos dos cromossomas. É possível recorrer à hibridação por fluorescência in situ (HFIS, em inglês FISH) de um clone de ADNc com uma expansão cromossómica metafásica para se conseguir em um só passo uma localização cromossómica exacta. Esta técnica pode ser utilizada com um ADNc que tenha apenas cerca de 500 ou 600 bases; no entanto, os clones com mais de 2000 pb têm uma probabilidade maior de se ligarem a um local cromossómico único com uma intensidade de sinal suficiente para uma detecção simples. A técnica de HFIS requer a utilização de clones a partir dos quais se obteve o ‘EST’, e quanto maiores melhor. Por exemplo, 2000 pb é bom, 4000 pb é melhor e provavelmente não é necessário mais de 4000 pb para se conseguir bons resultados num período razoável. Para um estudo desta técnica veja-se Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, Nova Iorque (1988).

Logo que tenha sido feito o levantamento de uma sequência para um local cromossómico exacto, a posição física da sequência no cromossoma pode ser correlacionada com os dados do mapa genético. Tais dados podem ser encontrados, por exemplo, na obra de V. McKusick TMendelian Inheritance in Man’ (acesso electrónico directo através de “Johns Hopkins University Welch Medicai Libraiy”). As relações entre genes e doenças cujo levantamento tenha sido feito para a mesma região cromossómica são então identificadas por análise das cadeias (co-hereditariedade de genes fisicamente adjacentes). A seguir é necessário determinar as diferenças das sequências de ADNc ou de ADN genómico entre indivíduos afectados e não afectados. Se for observada uma mutação em alguns ou na totalidade dos indivíduos afectados, mas não for observada em nenhuns indivíduos normais, então é provável que a mutação seja o agente causativo da doença.

Com a resolução actual das técnicas de cartografia física e de cartografia genética, um ADNc localizado com exactidão numa região cromossómica associada à doença pode ter entre 50 e 500 genes causativos potenciais. (Isto pressupõe uma resolução cartográfica de 1 megabase e 1 gene por cada 20 kb). A comparação de indivíduos afectados com indivíduos não afectados implica geralmente que se olhe em primeiro lugar para as alterações estruturais nos cromossomas, tais como supressões ou transloeações que são visíveis α partir de expansões de cromossomas ou detectáveis utilizando a RCP, com base nessa sequência de ADNc. Em última análise, é necessária uma sequenciaçâo completa dos genes de vários indivíduos para se confirmar a presença de uma mutação e para se efectuar a distinção entre mutações e polimorfismos.

Os polipeptidos, os seus fragmentos ou outros derivados ou seus análogos, ou as células que os exprimam, podem ser utilizados como imunogénios para a produção dos correspondentes anticorpos. Estes anticorpos podem ser, por exemplo, anticorpos policlonais ou monoclonais. A presente invenção também diz respeito a anticorpos quiméricos, de cadeia singular e humanizados e também aos fragmentos Fia (em inglês Fab) ou ao produto de um banco de expressão de Fia. É possível utilizar diversos procedimentos conhecidos na especialidade para a produção desses anticorpos e fragmentos.

Os anticorpos gerados contra os polipeptidos correspondentes a uma sequência da presente invenção podem ser obtidos por injecção directa dos polipeptidos num animal ou mediante a administração dos polipeptidos a um animal, de preferência não humano. O anticorpo assim obtido irá ligar-se então aos próprios polipeptidos. Deste modo, até mesmo uma sequência que codifique apenas um fragmento dos polipeptidos pode ser utilizada para gerar anticorpos que se ligam aos polipeptidos naturais intactos. Tais anticorpos podem ser utilizados depois para isolar o polipeptido a partir do tecido que exprime esse polipeptido.

Para a preparação de anticorpos monoclonais é possível praticar todas as técnicas que permitam obter anticorpos produzidos por culturas contínuas de linhagens de células. Como exemplos refere-se a técnica dos hibridomas (Kohler e Milstein, 1975, Nature, 256:495-497), a técnica dos triomas , a técnica do hibridoma das células B humanas (Kosbor et ah, 1983, ‘Immunology Today’ 4:72) e a técnica do hibridoma de VEB (em inglês EBV) para produzir anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., 1985, em ‘Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy', Alan R. Liss, Iuc., págs. 77-96).

As técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia singular (patente de invenção norte-americana n° 4 946 778) podem ser adaptadas para a produção de anticorpos de cadeia singular contra produtos polipeptídicos imunogénicos da presente invenção. A presente invenção também diz respeito a um teste de diagnóstico para a detecção do nível de PQ, tanto quantitativa como qualitativamente. Tais testes são bem conhecidos na especialidade e compreendem os testes de EISLE e os radioimunoensaios. Os níveis de PQ detectados nos testes podem ser úteis para o esclarecimento da significância da PQ em diversas doenças e para o diagnóstico de doenças em que a PQ possa desempenhar um papel. A presente invenção proporciona um método para a identificação de receptores de PQ. O gene que codifica um receptor de PQ pode ser identificado por clonagem de expressão. Dito de forma abreviada, prepara-se ARN poliadenilado a partir de uma célula que responda à PQ e um banco de ADNc criado a partir deste ARN é dividido em diversas porções e é utilizado para transfectar células COS ou outras células que não respondam à PQ. As células transfectadas que se desenvolveram sobre lamelas de vidro são expostas à PQ marcada. A PQ pode ser marcada de várias maneiras, incluindo a iodação ou a inclusão de um local de reconhecimento para uma cinase proteínica específica do local. A seguir à fixação e à incubação, as lamelas são submetidas a uma análise autorradiográfica. As parcelas positivas são identificadas e as subparcelas são preparadas e retransfectadas utilizando um processo iterativo de subparcelamento e de reanálise, gerando eventualmente um clone singular que codifica o receptor putativo. Como via alternativa para a identificação do receptor é possível ligar à membrana celular, por fotoafinidade, a PQ marcada, ou é possível extrair preparações que exprimam uma molécula receptora de PQ. A resolução do material interligado efectua-se por EGPA e depois expõe-se uma película de raios X à sua acção. O complexo marcado, que contém o receptor de PQ, pode ser excisado, resolvido em fragmentos peptídicos e sujeito a uma microssequenciação de proteínas. A sequência de aminoácidos, obtida através do processo de microssequenciação, poderia ser utilizada para se conceber um conjunto de sondas oligonucleotídicas para pesquisa de um banco de ADNc para a identificação de um gene que codifique o receptor putativo. A presente invenção também proporciona um método para a pesquisa de fármacos para a identificação daqueles que reforcem (agonistas) ou bloqueiem (antagonistas) a interacção da PQ com o seu receptor. Um agonista aumenta as funções biológicas da PQ, ao passo que um antagonista reduz ou elimina essas funções. Como exemplo, poder-se-ia fazer a incubação de uma preparação de células ou de membranas de mamífero que exprimam um receptor da PQ, conjuntamente com a PQ marcada, na presença do fármaco. A capacidade do fármaco para reforçar ou bloquear esta interacção poderia então ser medida. Em alternativa, poder-se-ia medir a resposta de um sistema conhecido de segundos mensageiros a seguir à interacção da PQ e do seu receptor, efectuando a comparação na presença ou na ausência de fármaco. Tal sistema de segundos mensageiros compreende, mas sem que isso constitua qualquer limitação, guanilato-ciclase de cAMP, canais de iões ou hidrólise dos fosfoinositídeos. A presente invenção também diz respeito a um método para identificar moléculas antagonistas/inibidoras para os polipeptidos da presente invenção. Os antagonistas compreendem os mutantes de PQ dominantes negativos. A PQ é um polipeptido tetramérico em que a unidade mutacionada irá fazer com que todo o polipeptido deixe de ser funcional. O mutante de PQ dominante negativo liga-se ao receptor da PQ mas não consegue activar as células (leucócitos a que se liga). Uma experiência para detectar mutantes de PQ dominantes negativos consiste num ensaio quimiotáctico in vitm em que se utiliza um compartimento de quimiotaxia multicavidades equipado com membranas de policarbonato sem polivinil-pirrolidona, para se medir a capacidade quimioatraente da PQ para os leucócitos na presença e na ausência de potenciais moléculas antagonistas/inibidoras ou agonistas.

Como exemplo de um inibidor refere-se um arquétipo de ARN ou de ADN anti-sentido. É possível utilizar a tecnologia anti-sentido para controlar a expressão de genes através da formação de uma hélice tripla ou ARN ou ADN anti-sentido, baseando-se qualquer destes dois métodos na ligação de um polinucleótido ao ARN ou ao ADN. Por exemplo, utiliza-se a parte da sequência do polinucleótido de codificação em 5’, que vai codificar os polipeptidos perfeitamente desenvolvidos da presente invenção, para construir um oligonucleótido de ARN anti-sentido que possui um comprimento compreendido aproximadamente entre 10 e 40 pares de bases. Constrói-se um oligonucleótido de ADN de modo a que seja complementar de uma região do gene implicado na transcrição (hélice tripla - ver Lee et al., Nucl. Acid. Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); e Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991)), assim se evitando a transcrição e a produção de PQ. O oligonucleótido de ARN anti-sentido híbrida com o ARNm in vivo e bloqueia a tradução da molécula de ARNm no interior da PQ (anti-sentido - Okano, J. Neurochem., 56:560 (1991); OJigodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expresáon, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Em ahemativa, é possível fornecer às células ARN e ADN anti-sentido, de tal modo que sejam expressas in vivo para inibirem a produção de PQ.

Outro exemplo de um antagonista identificável pelo método da presente invenção é um péptido obtido a partir da PQ, o qual é um análogo de PQ modificado naturalmente ou por via sintética e que perdeu a sua função biológica mas que ainda reconhece os receptoies e a eles se liga, bloqueando pois eficientemente os receptores. É possível utilizar antagonistas/mibiduies para tratar uma inflamação, procurando impedir a atracção de monócitos para um ferimento ou para o local de um trauma, e também para regular as populações normais de macrófagos pulmonares, uma vez que as doenças pulmonares inflamatórias agudas e crónicas estão associadas ao sequestro de fagócitos mononucleares no pulmão.

Os antagonistas/inibidores podem ser utilizados numa composição conjuntamente com um veículos aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, v.g., conforme anteriormente aqui descrito. A presente invenção também diz respeito a um ensaio para identificar potenciais antagonistas/inibidores específicos para a PQ. Como exemplo de um ensaio desses refere-se aquele em que se combina a PQ e um potencial antagonista/inibidor com receptores de PQ ligados à membrana ou com receptores de PQ recombinantes, em condições adequadas para um ensaio de inibição competitiva. A PQ pode ser marcada, por exemplo, por meio de radioisótopos, de tal modo que o número de moléculas de PQ ligadas ao receptor permita determinar a eficiência do potencial antagonista/inibidor. A presente invenção será melhor descrita tomando como referência os exemplos subsequentes; no entanto, faz-se observar que a presente invenção não fica limitada por esses exemplos. Todas as partes ou quantidades, salvo quando especificado de outro modo, são relativas ao peso.

Para se facilitar a compreensão dos exemplos subsequentes, efectuar-se-á a descrição de determinados métodos e/ou termos vulgannente utilizados.

Os “plasmídeos” são identificados por uma letra p minúscula precedida e/ou seguida de letras maiusculas e/ou números. Os plasmídeos de partida aqui utilizados ou se encontram disponíveis nos circuitos comerciais, sem nenhum tipo dc restrições, ou podem scr construídos a partir de plasmídeos existentes, de acordo com procedimentos que constam de obras publicadas. Além disso, os plasmídeos equivalentes aos descritos são conhecidos na especialidade e são evidentes para qualquer especialista na matéria. O termo “digestão" dc ADN designa uma clivagem catalítica do ADN com uma enzima de restrição que actua apenas em determinadas sequências no ADN. As diversas enzimas de restrição estão disponíveis nos circuitos comerciais e foram praticadas condições de reacção e utilizados co-factores e bem assim todos os outros parâmetros necessários, como é do conhecimento de qualquer especialista na matéria. Para fins analíticos, utilizou-se tipicamente 1 pgde plasmídeo ou de fragmento de ADN conjuntamente com cerca de 2 unidades de enzima em cerca de 20 pL de solução tampão. Para se isolar os fragmentos de ADN para a construção dos plasmídeos fez-se digerir tipicamente 5 a 50 pg de ADN com 20 a 250 unidades de enzima num volume maior. As soluções tampão convenientes e as quantidades de substratos para as enzimas de restrição particulares são as especificadas pelos fabricantes. Os períodos de incubação foram normalmente de 1 hora a 37°C, mas podem variar em conformidade com as instruções dos fornecedores. Após a digestão, submctc-sc a mistura de reacção α uma operação de electroforese directameute sobre um gel de poliacrilamida para se isolar o fragmento desejado. A separação dimensional dos fragmentos clivados tem lugar utilizando gel de poliacrilamida a 8%, descrito por Goeddel, D. Et al., Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980): O termo “oligonucleótidos” designa quer um polidesoxinucleótido de cadeia singular quer duas cadeias complementares de polidesoxinucleótidos que podem ser sintetizadas por via química. Tais oligonucleótidos sintéticos não têm nenhum radical fosfato em 5’ e por tal motivo não se ligam a outros oligonucleótidos sem a adição de um radical fosfato com uma ATP na picscuça de uma cinasc. Um oligonucleótidos sintético ligar-sc-á a um fragmento que não tenha sido desfofosforilado. O termo “ligação” designa um processo de formação de pontes fosfodiéster entre dois fragmentos de ácido nucleico de cadeia dupla (Maniatis, T. et al., Id., pág.146). Salvo quando especificado e outro modo, a ligação pode ter lugar utilizando tampões conhecidos e as condições correspondentes com 10 unidades de ligase do ADN das T4 (“ligase”) por cada 0,5 pg de quantidades aproximadamente equimolares dos fragmentos de ADN que se pretende ligar.

Salvo quando especificado de outro modo, a operação de transformação foi executada conforme descrito no método de Graham, F. E Van der Eb, A, ‘Virology’, 52:456-457 (1973).

Exemplo 1

Expressão bacteriana da PO e sua purificação

Inicialmente amplificou-se a sequência de ADN que codifica a PQ (ATCC # 75703) utilizando os iniciadores oligonucleotídicos de RCP correspondentes às sequências de 5’ e 3’ da PQ transformada (menos a sequência do péptido de sinal) e às sequências vectoriais de 3’ para o gene da PQ. Foram acrescentados outros nucleótidos correspondentes à PQ, respecti-vamente às sequências de 5’ e de 3’. O iniciador oligonucleotídico de 5’ possui a sequência 5’-TCAGGATCCCCTACGGGCTCGTGGTC-3’ que contém um local para a enzima de restrição Bom Hl seguido de 18 nucleótidos de sequência codificadora da PQ, começando no :V --‘v __J 30 resíduo aminoácido terminal putativo do codão da proteína transformada. A sequência de 3 ’ é V-CfiCTCTAGAGTAAAACGACGGCCAGT-5’ e contém as sequências complementares para o local Xba I e para uma sequência do vector 'pBluescript SK’ localizada para 3’ em relação ao fragmento intercalar de ADN da PQ. Os locais da enzima de restrição correspondem aso locais da enzima de resUição uo vector pQE-9 dc expressão bactcriana (Qiogen, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA 91311). O vector pQE-9 codifica a resistência aos antíbióticos (Ampr), uma origem bacteriana de replicação (ori), um promotor/operador (P/O) regulável pelo IPTG, um local de ligação dos ribossomas (LLR, em inglês RBS), um identificador 6-His e os locais da enzima de restrição. O vector pQE-9 foi depois digerido com Bam Hl e Xba L As sequências amplificadas foram ligadas no interior do vector pQE-9 e foram inseridas de forma concatenada com a sequência que codifica o identificador histidina e o LLR. A figura 5 ilustra uma representação esquemática desta configuração. A mistura de ligação foi depois utilizada para transformar a estirpe M15/rep4 de E. coli que pode ser adquirida em “Qiagen” com a marca comercial M15/rep 4, tendo sido utilizado o procedimento descrito por Sambrook, J. et ai na obra ‘Molecular Cloning: A Laboratory Manual’ Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. A estirpe ‘M15/rep4’ possui cópias múltiplas do plasmídeo pREP4 que exprime o repressor lacl e também confere resistência à canamicina (Can1). Os transformantes são identificados pela sua capacidade para crescerem em placas de CL (em inglês LB), tendo sido seleedonadas as colónia resistentes à ampicilina/canamicina Isolou-se o ADN plasmídico e confirmou-se por análise de restrição. Os clones que continham os arquétipos desejados cresceram de um dia para o outro (D/O) numa cultura em meio líquido de CL enriquecido com Amp (100 pg/mL) e Can (25 pgfaiL). Utilizou-se a cultura D/O para inocular uma cultura grande diluída a valores entre 1:100 e 1:250. As células cresceram até terem atingido uma densidade óptica 600 (DOcoo)

31 compreendida entre 0,4 e 0,6. Depois acrescentou-se IPTG (“isopropil-β-D-tio-galacto-piranósido”) até uma concentração final igual a 1 mM O TPTG induz por inactivação do repressor lacl, depurando o P/O e fazendo com que haja uma maior expressão dos genes. As células ficaram a desenvolver-se durante mais 3 a 4 horas. A seguir efectuou-se a colheita das células por centrifugação. Solubilizou-se a massa celular em agente caotrópico guamdina»HCl 6 M. Depois de realizada a clarificação, a PQ solubilizada foi purificada a partir desta solução por cromatografia em coluna de quelato de níquel em condições que permitem a ligação correcta pelas proteínas que contêm o identificador 6-His. Hochuli, E. et ai., ‘J. Chromatography 411:177-184 (1984). Efectuou-se a eluição da PQ (com uma pureza de 95%) a partir da coluna em guanidina«HCl 6 M a pH 5,0 e para efeitos de renaturação ajustou-se a concentração de guanidina»HCl para o valor de 3 M, com fosfato de sódio 100 mM, glutaíiona 10 mM (reduzida) e glutationa 2 mM (oxidada). Após a incubação desta solução durante 12 horas, efectuou-se a diálise da proteína para um valor da concentração do fosfato de sódio 10 mM. Figura 4.

Exemplo 2

Padrão de expressão da PO em células humanas

Foram obtidas autorradiografias à Northern para se examinar os níveis de expressão da PQ em células humanas. Foram isoladas amostras de ARN celular total com o sistema B de marca ‘RNAzol™’ (Biotecx Laboratories, Inc. 6023 South Loop East, Houston, TX 77033). Efecluou-se a separação de cerca de 10 pg de ARN total, isolado a partir de cada tecido humano especificado, sobre gel de agarose a 1% e aplicou-se sobre um filtro de ‘nylon’. (Sambrook,

Fritsch e Maniatis, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Press (1989)). A reacção de marcação foi realizada com o estojo ‘Stratagene Prime-It’ conjuntamente com 50 ng e fragmento de ADN. O ADN marcado foi purificado através de uma coluna ‘Select-G-50’ (5.Prime -- 3.Prime, Inc. 5603 Araphoe Road, Boulder, CO 80303). Depois efectuou-se a hibridação do filtro com o gene da PQ de comprimento completo marcado radioactivamente, à razão de 1 000 000 cpm/mL em NaPC>4 0,5 M a pH 7,4 e contendo 7% de DSS, de um dia para o outro a 65°C. após a lavagem duas vezes à temperatura ambiente e duas vezes a 60°C com SSC 0,5X c DSS a 0,1%, expôs-se então o filtro, a uma temperatura de -70°C de um dia para o outro, com um ecrã intensificador. O ARN mensageiro para a PQ é abundante nas células T activadas e não activas, nos monócitos e nas linhagens de células T. Figura 3. São possíveis inúmeras modificações e variações da presente invenção à luz dos preceitos anteriormente explicitados e consequentemente, no âmbito das reivindicações anexas, a invenção pode ser praticada de outras maneiras diferentes daquela que foi particularmente descrita.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: LI et al. (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: “Proteína quimiotáctica” (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 2 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: CARELLA, BYRNE, BAIN, GILFILLAN, CECCFH,

STEWART & OLSTEIN

(B) RUA: 6 BECKER FARM ROAD

(C) CIDADE: ROSELAND

(D) ESTADO: NEW JERSEY (E) PAÍS: E.U.A. (F) CÓDIGO POSTAL: 07068 (v) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR:

(A) SUPORTE: DISQUETE DE 3,5 POLEGADAS (B) COMPUTADOR IBM PS/2

(C) SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS (D) PROGRAMA INFORMÁTICO: WORD PERFECT 5.1 (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: aqui submetido (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE DEPÓSITO: aqui sUbhietido

(viii) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: FERRARO, GREGORY D. (B) NÚMERO DO PEDIDO: 36 134 (C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: 325800-160 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: 201-994-1700 (B) TELEFAX: 201-994-1744 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 360 PARES DE BASES

(B) TIPO: ÁCIDO NUCLEICO

(C) TIPO DE CORDÃO: SIMPLES

(D) TOPOLOGIA: LINEAR (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 1: ATGGCAGGCC TGATGACCAT AGTAACCAGC CTTCTGTTCC TTGGTGTCTG TGCCCACCAC 60 ATCATCCCTA CGGGCTCTGT GGTCATACCC TCTCCCTGCT GCATGTTCIT TGTTTCCAAG 120 AGAATTCCTG AGAACCGAGT GGTCAGCTAC CAGCTGTCCA GCAGGAGCAC ATGCCTGAAG 180

GGAGGAGTGA TCITCACCAC CAAGAAGGGC CAGCAGTTCT GTGGCGACCC CAAGCAGGAG 240 TGGGTCCAGA GGTACATGAA GAACCTGGAC GCCAAGCAGA AGAAGGCTTC CCCTAGGGCC 300 AGGGCAGTGG CTGTCAAGGG CCCTGTCCAG AGATATCCTG GCAACCAAAC CACCTGCTAA 360 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA:

(A) COMPRIMENTO: 119 AMINOÁCIDOS 35

(B) TIPO: AMINOACIDO (C) TIPO DE CORDÃO:

(D) TOPOLOGIA: LINEAR

(ii) TIPO DE MOLÉCULA: PROTEÍNA (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA SEQ ID NO:2:

Met Ala GE leu Mel Thr De Val Thr Ser Leu Leu Phe Leu GE Vai -20 -15 -10 Cis Ala Ifc Ifc De Ife Rd Thr a Ser Val Val De Pro Sa Pro -5 1 5 Cis Cis Mel Phe Phe Vai Ser Lis Aig De Pro Ghi Asn Aig Vai Vai 15 20 25 Ser Tir Gin Leu Ser Ser Aig Ser Thr Gs Leu Tis GE Oi Vai De 30 35 40 Phe Thr Thr Lis Lis GE Gin On Phe Gs Oi Asp Pro Lis On Ou 45 50 55 Τφ Vai Gin Aig Tir Ma Lis Asn Leu Asp Ala T is GEi Lis Lis Ala 60 65 70 Ser Pro Aig Ala Aig Ala Vai Ala Val Lis O Pro Val Gin Arg Tr 75 80 85 Pro GE Asn Gin Thr Thr Cis 95 oa, 11 de Dezembro de 2001 ~? ·, 1 // G OiiC! ,ai da Prcprl· íiGGCÍ8,

Claims (17)

1 1 % . •y" Reivindicações 1. Polinucleótido seleccionado entre o conjunto constituído por: (a) polinucleótidos que codificam pelo menos uma forma madura do polipeptido que possui a sequência deduzida de aminoácidos representada na figura 1; (b) polinucleótidos que possuem a sequência codificadora representada na figura 1, que codifica pelo menos a forma madura do polipeptido; (c) polinucleótidos que codificam o polipeptido que possui a sequência de aminoácidos pelo menos da forma madura do polipeptido purificado pelo ADNc contido no depósito ATCC n° 75703; (d) polinucleótidos que possuem a sequência de codificação do ADNc contido no depósito ATCC n° 75703 que codifica pelo menos a forma madura do polipeptido; (e) polinucleótidos que codificam um fragmento de um polipeptido codificado por um polinucleótido de uma qualquer das alíneas (a) a (d), sendo esse fragmento um quimio-atraente para os leucócitos; (f) polinucleótidos cuja sequência é pelo menos 70% idêntica à sequência de um polinucleótido de uma qualquer das alíneas (a) a (d) e que codifica um polipeptido que é um quimioatraente para os leucócitos; (g) polinucleótidos cuja sequência é pelo menos 70% idêntica à sequência de um polinucleótido de uma qualquer das alíneas (a) a (d) e cuja cadeia complementar híbrida, em condições rigorosas, com um polinucleótido tal como definido numa qualquer das alíneas (a) a (d) e o qual codifica um polipeptido que é um quimioatraente para os leucócitos; ou a cadeia complementar desse polinucleótido. • 2-

2. Polinucleótido de acordo com a reivindicação 1, em que o polipeptido codificado ou o seu fragmento é um quimioatraente para os basófilos. 3. polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 ou 2, o qual é ADN ou ARN.

4. ADN de acordo com a reivindicação 3, o qual é ADN genómico.

5. Vector que contém o polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4.

6. Vector de acordo com a reivindicação 5, em que o polinucleótido está funcionalmente ligado às sequências de controlo da expressão que permitem a expressão em células hospedeiras procaiióticas ou eucarióticas.

7. Célula hospedeira manipulada geneticamente com o vector de uma das reivindicações 5 • ou6· ----------

8. Processo para a produção de um polipeptido, que é um quimioatraente para os leucócitos» o qual compreende os passos seguintes: criar em cultura a célula hospedeira da reivindicação 7 e recuperar a partir da cultura o polipeptido codificado pelo referido polinucleótido.

9. Processo para a produção de células capazes de exprimirem um polipeptido, que é um quimioatraente para os leucócitos, o qual consiste em manipular geneticamente as células com um vector de uma das reivindicações 5 ou 6. 3' 10. Polipeptido que compreende a sequência de aminoácidos codificada por um polipeptido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 ou que pode ser obtido pelo processo da reivindicação 8.

11. Polipeptido de acordo com a reivindicação 10, o qual compreende um resíduo mctionina no terminal N.

12. Anticorpo contra o polipeptido de uma das reivindicações 10 ou 11.

13. Antagonista/inibidor contra o polipeptido de uma das reivindicações 10 ou 11, em que o referido antagonista/inibidor é um arquétipo de ADN ou de ARN anti-sentido.

14. Molécula de ácido nucleico que híbrida de forma específica, em condições rigorosas, com um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4.

15. Composição farmacêutica que compreende o polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, a molécula de ácido nucleico da reivindicação 14, um antagonista/ /inibidor da reivindicação 13 ou o polipeptido de uma das reivindicações 10 ou 11 e facultativamente um veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.

16. Composição de diagnóstico que compreende um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4, a molécula de ácido nucleico da reivindicação 14 ou o anticorpo da reivindicação 12. 4

17. Utilização de um polipeptido de acordo com uma das reivindicações 10 ou 11 ou utilização de um polinucleótido de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 4 para a preparação de uma composição farmacêutica para favorecer a cicatrização de ferimentos, para o tratamento de tumores, efusões pleurais ou ascites, para combater mfccçõcs parasíticas ou para regular a hematopoiese.

Utilização de acordo com a reivindicação 17, em que a infecção parasítica é a esqui tosomiase, triquinose ou ascaríase.

19. Utilização do antagonistas/inibidor da reivindicação 13 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de inflamações, artrites reumatóides, ateros-cleroses, alergias ou doenças infecciosas.

20. Método para identificar um antagonista/inibidor ou um agonista/activador para o polipeptido da reivindicação 10, o qual compreende os passos seguintes:

(a) fazer contactar com um fármaco o polipeptido e uma preparação de células ou de membranas de mamífero que exprimam um receptor do polipeptido; e (b) confirmar se o fármaco reforça ou bloqueia a interaeção do polipeptido com o seu receptor ou a resposta que resulte dessa interaeção. Lisboa, 11 de Dezembro de 2001