KR20130055555A - 효모 스트레인 생성용 포유류 유사 복합 ｎ-글리칸들 - Google Patents

효모 스트레인 생성용 포유류 유사 복합 ｎ-글리칸들 Download PDF

Info

Publication number
KR20130055555A
KR20130055555A KR1020127015208A KR20127015208A KR20130055555A KR 20130055555 A KR20130055555 A KR 20130055555A KR 1020127015208 A KR1020127015208 A KR 1020127015208A KR 20127015208 A KR20127015208 A KR 20127015208A KR 20130055555 A KR20130055555 A KR 20130055555A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
glcnac
encoded
nucleic acid
glycans
man
Prior art date
Application number
KR1020127015208A
Other languages
English (en)
Inventor
스티븐 크리스티안 조제프 게이센스
바우터 베르베켄
Original Assignee
옥시레인 유케이 리미티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 옥시레인 유케이 리미티드 filed Critical 옥시레인 유케이 리미티드
Publication of KR20130055555A publication Critical patent/KR20130055555A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/02—Preparation of hybrid cells by fusion of two or more cells, e.g. protoplast fusion
    • C12N15/04—Fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2477—Hemicellulases not provided in a preceding group
    • C12N9/2488—Mannanases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/58—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi
    • C12N9/60—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from fungi from yeast
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/01—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12Y204/01133—Xylosylprotein 4-beta-galactosyltransferase (2.4.1.133)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01024—Alpha-mannosidase (3.2.1.24)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01084—Glucan 1,3-alpha-glucosidase (3.2.1.84), i.e. mutanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01114—Mannosyl-oligosaccharide 1,3-1,6-alpha-mannosidase (3.2.1.114)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

본 발명은 포유류 유사 복합 N-글리칸들을 함유하거나 포유류의 글리코화 경로 내의 중간체들을 함유하는 타겟 분자들을 생성하는 데 유용한 유전공학적으로 제조되는 곰팡이 세포들과 방법들에 관한 것이다.

Description

효모 스트레인 생성용 포유류 유사 복합 Ｎ-글리칸들{YEAST STRAINS PRODUCING MAMMALIAN-LIKE COMPLEX N-GLYCANS}
본 발명은 곰팡이 세포들내에 글리코프로테인들(glycoproteins)을 생성하는 방법들 및 물질들에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 곰팡이 세포들을 유전공학적으로 처리하여 단백질들을 함유하는 포유류 유사 복합 N-글리칸들(glycans) 또는 포유류의 글리코실레이션(glycosylation) 경로 내에 단백질들을 함유하는 중간체들을 생성하는 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2009년 11월 19일자로 출원된 미국 특허 출원 제61/262,828호를 우선권으로 수반하며, 그 내용은 본 명세서에 참조로 기재되어 있다.
고성능 발현 시스템들은 현재 개발 중인 대부분의 바이오 의약품들(예를 들면, 재조합 단백질들)의 생성을 요구하고 있다. 이러한 많은 바이오 의약품들의 생물학적 활성은 번역 변형(예를 들면, 인산화 반응 또는 글리코화 반응)에 의존한다. 효모계 발현 시스템은 유전자 조작 및 미생물 유기체의 발효의 용이성과 단백질들을 분비하고 변형할 수 있는 능력을 결합한 것이다. 그러나, 효모 세포들 내에서 생성되는 재조합 글리코프로테인들은 주로 이질성의 높은 만노스(mannose)와 보다 높은 만노스 구조들을 나타내고, 이는 단백질 기능, 하향 처리 및 후속하는 치료적인 사용에, 특히 글리코실레이션이 생물학적으로 중요한 역할을 수행할 때에 해로울 수 있다.
본 명세서에서 설명되는 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포들 및 그 방법들은 포유류 유사 N-클리칸들을 함유하거나 포유류(예를 들면, 인간)의 글리코실레이션 경로 내에 중간체들을 함유하는 타겟 분자들(예를 들면, 타겟 단백질들)을 생성하는 데 이용될 수 있다. 이러한 유전공학적으로 처리된 세포들로부터 추출되는 타겟 분자들은 항체 생성, 시토킨(cytokine) 생성 등을 포함하며, 리소조말 축적 질환(lysosomal storage disorder)과 같은 물질 대사 질환들의 치료를 위한 생물 약제학상의 응용들에 사용될 수 있다.
일 측면에 있어서, 본 발명은, GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질을 생성할 수 있는 곰팡이 세포(예를 들면, Yarrowia lipolytica 또는 Arxula adeninivorans)를 제조하는 방법에 특징들이 있다. 상기 방법은, Man5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포내로 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I을 도입하는 단계를 구비하며, 여기서 상기 핵산은 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I을 세포내 구간(예를 들면, 골지체)으로 타겟하도록 뉴클레오티드(nucleotide) 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내의 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I의 발현이 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질을 생성한다. 상기 방법은 상기 세포내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 세포는 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성한다. 상기 타겟 단백질은 Fc 수용기에 결합될 수 있다. 상기 타겟 단백질은 항체 또는 그 단편이 될 수 있다. 상기 타겟 단백질은 치료 글리코프로테인(glycoprotein)이 될 수 있다. 상기 타겟 단백질은 인터페론-β, GM-CSF, 인터페론 K 또는 에리쓰로포에틴(erythropoietin)이 될 수 있다.
Man5GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 상기 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 결핍될 수 있고, 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제(mannosidase)를 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제는 상기 코딩된 I-1,2-만노시다제가 소포체(endoplasmic reticulum)에 타겟되도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함한다. 상기 타게팅하는 배열은 HDEL 배열이 될 수 있다.
상기 방법은, 세포내로 핵산 코딩된 만노시다제 II를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 코딩된 상기 만노시다제 II는 상기 코딩된 만노시다제 II가 골지체에 타겟되도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 만노시다제 II의 발현이 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다.
상기 방법은, 세포 내로 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제(galactosyltransferase)를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 핵산 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체에 타겟되도록 뉴클레로티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 또는 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다. 상기 갈락토실트랜스페라제는 UDP-Glc-4-에피메라제(epimerase) 및 β-1,4-갈락토실트랜스페라제의 촉매 도메인의 융합체(fusion)가 될 수 있다. 이와 같은 방법은, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 또는 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성한다. 상기 방법들은 상기 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 또는 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 타겟 단백질을 제조하는 방법에 특징들이 있다. 상기 방법은, 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, I-1,2-만노시다제 및 만노시다제 II를 포함하도록 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포(예를 들면, Yarrowia lipolytica 또는 Arxula adeninivorans)를 제공하는 단계를 구비하며, 상기 핵산은 각 코딩된 단백질이 세포내 구간으로 타겟되도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열 또는 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 결핍되며, 그리고 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 구비하고, 상기 세포가 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 상기 타겟 단백질을 생성한다. 상기 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제는 상기 코딩된 I-1,2-만노시다제가 상기 소포체에 타겟되도록 소포체 타게팅하는 배열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 타게팅하는 배열은 HDEL 배열이 될 수 있다. 상기 핵산 코딩된 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 상기 만노시다제 II는, 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 만노시다제 II가 상기 골지체에 타겟하도록 골지체 타게팅하는 배열 또는 골지체 타게팅하는 배열들을 포함할 수 있다. 상기 타겟 단백질은 Fc 수용기에 결합할 수 있다. 상기 타겟 단백질은 항체 또는 그 단편일 수 있다. 상기 타겟 단백질은 치료 글루코프로테인이 될 수 있다. 상기 타겟 단백질은 인터페론-β, GM-CSF, 인터페론 K 또는 에리쓰로포에틴이 될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 방법은 상기 세포 내로 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 골지체로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성한다. 상기 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질은 상기 곰팡이 세포로부터 추출될 수 있다.
본 발명은 또한 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성할 수 있는 곰팡이 세포(예를 들면, Yarrowia lipolytica 또는 Arxula adeninivorans)를 제조하는 방법에 특징들이 있다. 상기 방법은 Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포를 제공하는 단계; 및 상기 세포 내로 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제를 도입하는 단계를 구비하며, 상기 핵산은 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제가 세포내 구간(예를 들면, 골지체)에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I의 발현이 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다.
상기 방법은 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 GlcNAcMan3GlcNAc2N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성한다. 상기 타겟 단백질은 Fc 수용기에 결합할 수 있다. 상기 타겟 다백질은 항체 또는 그 단편일 수 있다. 상기 타겟 단백질은 치료 글루코프로테인일 수 있다. 상기 타겟 단백질은 인터페론-β, GM-CSF, 인터페론 K, 또는 에리쓰로포에틴을 포함할 수 있다.
Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 상기 곰팡이 세포는 ALG3 활성이 결핍될 수 있으며, 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제를 포함할 수 있고, 여기서 상기 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제는 상기 코딩된 I-1,2-만노시다제를 상기 소포체로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함한다. 이러한 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 더 결핍될 수 있거나 및/또는 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실트랜스페라제(예를 들면, ALG6)를 더 포함할 수 있다.
상기 방법은 상기 세포 내로 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II는 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 세포내 구간에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II의 발현이 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다.
상기 방법은 상기 세포 내로 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다. 상기 갈락토실트랜스페라제는 UDP-Glc-4-에피메라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스페라제 I의 촉매 도메인의 융합일 수 있다. 상기 방법은 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성한다.
상기 방법은, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들을 도입하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성한다.
본 발명은 또한 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 타겟 단백질을 제조하는 방법에 특징들이 있다. 상기 방법은 ALG3 활성이 결핍되게 유전공학적으로 제조되고, 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, GlcNAc-트랜스페라제 II 및 갈락토실트랜스페라제를 포함하는 곰팡이 세포를 제공하는 단계를 구비하며, 여기서 상기 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제는 각 코딩된 단백질을 세포내 구간(예를 들면, 상기 골지체)에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열 또는 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 구비하며, 여기서 상기 세포는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 상기 타겟 단백질을 생성한다. 상기 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 더 결핍될 수 있거나 및/또는 ALG6와 같은 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실트랜스페라제를 더 포함할 수 있다. 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 상기 타겟 단백질을 생성한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되어 추출된 곰팡이 세포에 특징들이 있다. 상기 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 결핍될 수 있으며, 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트랜스페라제 I 및 만노시다제 II를 포함할 수 있고, 여기서 상기 핵산 코딩된 상기 I-1,2-만노시다제, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 상기 만노시다제 II는 각 코딩된 단백질을 세포내 구간에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열 또는 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하며, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 I-1,2-만노시다제, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 상기 만노시다제 II의 발현이 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다. 상기 곰팡이 세포는 핵산이 코딩된 타겟 단백질을 더 포함할 수 있으며, 상기 세포는 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성한다.
일부 실시예들에 있어서, 이러한 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 더 포함하며, 여기서 상기 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II는 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 세포내 구간에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II의 발현이 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 더 포함하며, 여기서 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다.
또 다른 측면에 있어서, 본 발명은 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되어 추출된 곰팡이 세포에 특징들이 있다. 상기 곰팡이 세포는 ALG3 활성이 결핍되게 유전공학적으로 제조되고 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 GlcNAc-트랜스페라제 II를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II는 각 코딩된 단백질이 세포내 구간으로 타겟되도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열 또는 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II의 발현이 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다. 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 더 결핍될 수 있거나 및/또는 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실드랜스페라제를 더 포함할 수 있다. 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 또한 핵산 코딩된 타겟 단백질을 포함할 수 있으며, 여기서 상기 세포는 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성한다. 곰팡이 세포는 또한 핵산 코딩된 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들을 더 포함할 수 있으며, 여기서 곰팡이 세포 내에서 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질을 생성한다. 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다.
본 발명은 또한 그 실질적인 숫자가 Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 글리코프로테인들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되는 Yarrowia lipolytica 세포들의 실질적으로 순수한 배양에 특징들이 있다. 상기 세포들은 ALG3 활성이 결핍되게 유전공학적으로 제조되고 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, GlcNAc-트랜스페라제 II 및 갈락토실트랜스페라제를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제는 각 코딩된 단백질을 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열 또는 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 세포 내에서 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성한다. 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 또한 OCH1 활성이 결핍될 수 있거나 및/또는 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실트랜스페라제(예를 들면, ALG6)를 더 포함할 수 있다. 상기 세포들은 핵산 코딩된 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들을 더 포함할 수 있으며, 여기서 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 상기 타겟 단백질을 생성한다.
다른 측면에 있어서, 본 발명은 Yarrowia lipolytica 세포들의 실질적으로 순수한 배양에 특징들이 있으며, 그 실질적인 숫자가 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 함유하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되며, 상기 세포들은 OCH1 활성이 결핍되게 유전공학적으로 제조되고 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트랜스페라제 I, 만노시다제 II, GlcNAc-트랜스페라제 II 및 갈락토실트랜스페라제를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I, 상기 만노시다제 II, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제는 각 코딩된 단백질이 세폰 구간에 타겟되도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열 또는 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 세포들 내에서 상기 I-1,2-만노시다제, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I, 상기 만노시다제 II, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 생성한다.
본 발명은 또한 글리코프로테인을 포함하는 조성물에 특징들이 있으며, 상기 클리코프로테인 상의 N-글리칸들의 적어도 50%(예를 들면, 적어도 70% 또는 적어도 85%)는 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들이다.
다르게 정의되지 않는 한, 여기서 사용되는 모든 기술적 및 과학적인 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해되는 바와 동일하다. 비록 본 명세서에 기재된 바와 유사하거나 균등한 방법들과 물질들이 실제적으로 또는 본 발명을 검증하기 위하여 사용될 수 있지만, 예시적인 방법들과 물질들이 본 명세서에 기재된다. 언급되는 모든 공개 공보들, 특허 출원들, 특허들, 젠뱅크®(Genbank®) 기탁(Accession) 번호들 및 기타 참조 문헌들은 본 명세서에 참조로 기재된다. 모순되는 경우에 있어서, 정의들을 포함하여 본 출원이 조절될 수 있다. 물질들, 방법들 및 실험예들은 예시적인 것이며 이에 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징들 및 기타 이점들은 다음의 상세한 설명과 특허 청구 범위로부터 명확해질 것이다.
도 1a는 Man5GLcNAc2 및 Man3GlcNAc2 구조들의 대표도이다.
도 1b는 플라스미드(plasmid) pYlOCH1 PUT TOPO의 개략적인 도면이다.
도 2는 po1d lunga Yarrowia lipolytica 야생형 세포들 또는 Δoch1 po1d lnuga Yarrowia lipolytica 세포들로부터 얻어지는 분비된 단백질들의 N-글리칸 분석을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들(electroferograms)이다. OCH1 비활성 상의 주요 N-글리칸은 Man8GlcNAc2이 된다. 분석은 DNA 시퀀서-보조DNA sequencer-assisted), 형광-유도체화 당의 전기영동(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis; DSA-FACE)을 이용하여 수행되었다. "M5", "M6", "M8" 및 "M9"는 염기 N-아세틸글루코사민(acetylglucosamine) 구조에 복합된 만노스(mannose) 잔여물들의 숫자를 가리킨다. Y-축은 각 N-글리칸 구조의 양의 표지로서 관련된 형광 유닛들을 나타낸다. X-축은 모세 혈관을 통한 각 N-글리칸 구조의 관련된 운동성을 나타낸다. 상단의 일렉트로페로그램은 운동 기준으로서의 사용을 위한 덱스트란(dextran)의 분석이다.
도 3은 플라스미드들 pYLHUXdL2preManHDEL 및 pYLTUXdL2preManHDEL의 개략적인 도면이다.
도 4는 G014 스트레인 내로의 ManHDEL(=HDEL-태그된 I-1,2-만노시다제) 발현 카세트(cassette)( TEF1 또는 Hp4d 포로모터 조절 하의 하나)의 도입 후에 N-글리칸 프로파일을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. "Rd"는 도 3에 도시한 벡터들 상에 존재하는 제타(zeta) 배열을 경유하는 "임의적 통합(random integration)"을 나타낸다. 만노시다제 발현에 따른 주요 N-글리칸은 Man5GlcNAc2이다. 이러한 스트레인들(G018, 표 2 참조)의 하나로부터의 URA3 마커의 큐어링은 N-글리칸 프로파일을 변화시키지 않는다.
도 5는 플라스미드들 JME926 pPTLeu2-ADE2ex-Hp4dManHDEL(Yl) 및 OXYP289 pPTAxp1-LEU2ex-Hp4dManHDEL(Yl)를 위한 구성 계획의 개략도이다. 벡터 pYLTmAXrGnTII의 구성을 위한 도 23을 참조하기 바란다.
도 6은 LEU2 또는 AXP1 로쿠스(locus) 중에서 하나 내의 타겟된 통합(Tg)에 의해 스트레인 G014 내로의 ManHDEL(=HDEL-태그된 I-1,2-만노시다제) 발현 카세트( Hp4d 프로모터 조절 하의)의 도입 후의 N-글리칸 프로파일을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. Man5GlcNAc2가 주요 N-글리칸이 된다.
도 7은 Kre2p의 100 N-말단 아미노산들과 인간 GlcNAc-트랜스페라제 I 사이의 융합 단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO:3) 및 Yarrowia 코돈(codon) 최적화 뉴클레오티드 배열(SEQ ID NO:4)을 나타낸다. 굵은 활자는 융합 단백질의 Kre2p 부분이고, 통상적인 활자는 융합 단백질의 GnT I 부분이며, 밑줄은 개시 및 종결 코돈들이다.
도 8은 플라스미드들 pYLTmAXhGnTI 및 pYLHp4mAXhGnTI을 위한 구성 계획의 개략적인 도면이다.
도 9는 GnT I을 발현하는 벡터로 형질전환에 의해 스트레인 G036 내로의 GnT I 활성의 도입 후의 N-글리칸 프로파일을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. "Rd"는 도 8에 도시한 벡터들 상에 존재하는 제타 배열들을 경유하는 "임의적 통합"을 나타낸다. GnT I 활성의 발현에 따른 주요 N-글리칸은 GlcNAcMan5GlcNAc2이다. α-1,2-만노시다제를 사용한 생체 외의(In vitro) 치료는 상기 프로파일을 크게 변화시키지 않고, Man5GlcNAc2 보다는 단지 높은 만노스 N-글리칸들의 작은 양들이 존재함을 나타낸다. 생체 외의 헥소사미니다제(hexosaminidase) 치료는 GlcNAcMan5GlcNAc2로부터 Man5GlcNAc2를 향하는 이동을 야기한다.
도 10은 Mnn2p의 36 N-말단 아미노산들과 드로소필라 멜라노가스테르만노시다제(Drosophila melanogaster mannosidase) II의 촉매 도메인 사이의 융합 단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO:7) 및 Yarrowia 코돈 최적화 뉴클레오티드 배열(SEQ ID NO:8)을 나타낸다. 굵은 활자는 융합 단백질의 Mnn2p 부분이고, 통상적인 활자는 융합 단백질의 Man II 부분이며, 밑줄은 개시 및 종결 코돈들이다.
도 11은 플라스미드들 pYLTmAXDmManII 및 pYLTmAXDmManII(LEU2ex)를 위한 구성 설계를 개략적으로 나타낸다.
도 12는 Man II-발현 벡터로 형질전환에 의go 스트레인 G040내로의 Man II 활성의 도입 후의 N-글리칸 프로파일의 일련의 일렉트로페로그램들이다. "Rd"는 도 11에 도시한 벡터들 상에 존재하는 제타 배열들을 경유하는 "임의적 통합"을 나타낸다. Man II 활성의 발현 상에서, 새로운 피크들이 높은 전기 영동적과 함께 나타날 뿐만 아니라, Man5GlcNAc2와 같이 거의 동일한 위치를 지나는 '숄더(shoulder)' 피크가 나타난다. 생체 외의 헥소사미니다제 치료는 이러한 피크들(GlcNAcMan5GlcNAc2로부터 Man5GlcNAc2를 향하여 관찰되는 이동의 다음에)을 위한 전방 이동을 야기하며, 말단 GlcNAc의 존재를 나타내고, 이에 따라 GlcNAcMan3GlcNAc2 및 GlcNAcMan4GlcNAc2로서 피크들이 확인된다. I-1,2-만노시다제로의 생체 외의 치료는 상기 프로파일을 크게 변화시키지 않으며, 존재하는 Man5GlcNAc2are 보다 높은 만노스 N-글리칸들의 작은 양들만을 나타낸다.
도 13은 Mnn2p의 46 N-말단 아미노산들, 쉬조사크챠로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) UDP-Glc-4-에피메라제(epimerase) 유사 단백질 및 인간 β-1,4-갈락토실트랜스페라제(galactosyl transferase) I 사이의 융합 단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO:9)과 Yarrowia 코돈 최적화 뉴클레오티드 배열(SEQ ID NO:10)을 타나낸다. 상기 융합 단백질의 Mnn2p 부분은 1-46부터이고, 링커(linker) 배열들은 47-49 및 405-408부터이며, 상기 융합 단백질의 에피메라제 배열들은 50-404부터이고, 상기 융합 단백질의 Man II 부분은 SEQ ID NO:9의 409-763부터이다. Mnn2p 부분은 뉴클레오티드들 1-138부터이고, 링커 배열들은 뉴클레오티드들 139-147 및 1213-1224부터이며, 에피메라제 배열들은 뉴클레오티드들 148-1212부터이고, Man II 부분은 SEQ ID NO:10의 1225-2289부터이다. 개시 및 종결 코돈들은 밑줄이 그어져 있다.
도 14는 플라스미드들 pYLTmAXSpGal10hGalTI 및 pYLTmAXSpGal10hGalTI(ADE2ex)를 위한 구성 설계를 개략적으로 나태난 도면이다.
도 15는 스트레인 G040 내로의 Gal10-GalTI 활성의 도입 후의 N-글리칸 프로파일을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. 야기되는 형질전환체(transformant) G044는 2개의 다른 매체들에서 배양되었다. "Rd"은 도 14에 도시한 벡터들 상에 존재하는 제타 배열을 경유하는 "임의적 통합"을 나타낸다. Gal10-GalTI 활성의 발현에 의해, Man7GlcNAc2 및 Man8GlcNAc2 사이의 위치를 지나는 새로운 피크가 나타난다. 생체 외의 갈락토시다제 치료는 이러한 피크와 GlcNAcMan5GlcNAc2(갈락토시다제와 헥소사미니다제의 이중 치료에 의해 후자는 이러한 N-글리칸을 표시하는 것으로 확인됨)의 동등한 증가를 위한 전방으로의 이동을 야기한다. 이는 말단 갈락토스(galactose)의 존재를 나타내며, 이에 따라 GalGlcNAcMan5GlcNAc2로서 G044 프로파일의 새로운 피크가 확인된다.
α-1,2-만노시다제로의 생체 외의 치료는 Man5GlcNAc2에 대해 아직 말단이 절단되지 않은 높은 만노스 N-글리칸들(특히 Man8GlcNAc2)의 많은 양의 존재를 나타낸다.
도 16은 플라스미드 pYLalg3PUT-ALG6의 개략적인 도면이다.
도 17은 스트레인 G036 내로의 pYLalg3PUT-ALG6의 도입 후의 N-글리칸 프로파일을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. ALG6의 과발현은 글루코실화된(glucosylated) 피크들(GlcMan5'GlcNAc2 및 Glc2Man5'GlcNAc2)의 상당한 양을 야기하며, 초기 단백질에 전송되는 the Glc3Man5'GlcNAc2 구조가 글루코시다제 II에 의해 Man5'GlcNAc2를 향하여 완전히 단부가 절단되지 않음을 나타낸다. 생장 매체에 따라서, 발생된 Man5'GlcNAc2는 부분적으로(여전히 일부의 Man5'GlcNAc2 및 Man4'GlcNAc2) 또는 the ER-국소화된(localized) HDEL-태그된 T. reesei α-1,2-만노시다제의 작용에 의해 Man3GlcNAc2를 향하여 거의 말단이 절단된다. Man5'GlcNAc2 및 Man4'GlcNAc2 피크들은, 이들의 α-1,2-만노시다제를 향하는 감도에 의하는 것과 같이 확인된다. 캡핑(cappping) 글루코스들로 인하여, GlcMan5'GlcNAc2 및 Glc2Man5'GlcNAc2는 이러한 치료에 민감하지 않다. 잭 빈(Jack Bean) 만노시다제는 Man3-5'GlcNAc2를 Man1GlcNAc2로 전환시키는 반면에 자유롭게 α-1,6-링크된 만노스를 부분적으로 제거할 수 있다.
도 18은 플라스미드 pYLTmAXhGnTI(Hygr ex)를 위한 구성 설계를 개략적으로 나타낸다.
도 19는 GnT I-발현 벡터로의 형질 전환에 의해 Δalg3-Hp4dALG6 스트레인의 큐어링되지 않거나(G039) 큐어링된(G045) 판(version) 중에서 하나에 GnT 활성을 도입한 후의 N-글리칸 프로파일의 일련의 일렉트로페로그램들이다. GlcNAcMan3GlcNAc2의 발생은 헥소사미니다제 절단을 경유해 입증되었다. 새로운 피크는 완전히 Man3GlcNAc2을 향해 다시 이동한다. 스트레인 G048에서 GlcNAcMan3GlcNAc2를 향하는 전환은 일부 Man3GlcNAc2가 여전히 관찰될 수 있었기 때문에 완전하지 않았다. 이러한 스트레인은 또한 α-1,2-만노시다제 절단에 의해 도시되는 바와 같이 일부 잔류 Man5'GlcNAc2를 포함한다.
도 20은 플라스미드 JME925 pPTAde2-URA3ex-Hp4dhGnTI를 위한 구성 설계를 개략적으로 나타낸다.
도 21은 Δalg3-Hp4dALG6 스트레인(=G045)의 큐어링된 판과 ADE2 locus(Tg-ade2) 내로의 Hp4d-구동(driven) 발현 구조의 통합 내로의 GnT I 활성의 도입 후의 N-글리칸 프로파일들을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. 이러한 배양에서, 글루코실화된 N-글리칸의 양이 높았고, Man4'-5'GlcNAc2의 Man3GlcNAc2로의 전환은 완전하지 않았다. Man4'GlcNAc2에 이어지는 새로운 피크가 형질 전환체 G057에서 관찰되었고, 헥소사미니다제 절단이 있을 경우를 기초로하여 GlcNAcMan3GlcNAc2로서 지정될 수 있었다. 새로운 피크는 Man3GlcNAc2를 향해 완전히 다시 이동한다.
도 22는 Mnn2p의 36 N-말단 아미노산들과 쥐(rat) GlcNAc-트랜스페라제 II의 촉매 도메인 사이의 융합 단백질의 아미노산 배열(SEQ ID NO:17) 및 Yarrowiacodon 최적화 뉴클레오티드 배열(SEQ ID NO:18)을 나타낸다. 굵은 활자는 융합 단백질의 Mnn2p 부분이고, 정상적인 활자는 융합 단백질의 GnT II이며, 밑줄은 개시 및 종결 코돈들이다.
도 23은 플라스미드들 pYLTmAXrGnTII 및 pYLTmAXrGnTII(ADE2 ex)를 위한 구성 설계를 개략적으로 나타낸다.
도 24는 스트레인을 합성하는 GlcNAcMan3GlcNAc2 내로의 GnT II 활성의 도입 후의 N-글리칸 프로파일들을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. 결과적인 스트레인들은 GnTI 및 GnT II 발현 구성체들로서의 G045의 이중 형질 전환을 경유하거나 GnTII 발현 구성체로서의 G047의 형질 전환을 경유하여 관찰되었다. 두 가지 경우들에 있어서, GlcNAcMan3GlcNAc2를 나타내는 피크는 거의 완전히 사라지고, 하나의 글루코스 유닛에 대한 새로운 피크가 나타났다. 헥소사미니다제 치료는 새로운 N-글리칸 상으로의 2개의 말단 GlcNAc 잔여물들의 존재를 나타내고, 2개의 글루코스 유닛들에 대해 피크가 왼쪽으로 이동하며, 이에 따라 GlcNAc2Man3GlcNAc2를 나타낸다. α-1,2-만노시다제 치료는 주요한 차이들을 가져오지 않으며, Man4'-5'GlcNAc2의 제한된 양만이 존재함을 나타낸다.
도 25는 글루코시다제 II 활성의 발현을 위한 플라스미드들 pYLTUXdL2preAnGlcII 및 pYLeu2ExTEFpreLip2AnGlucII의 개략적인 도면이다.
도 26은 플라스미드들 JME923 pPTura3-LEU2ex-TefL2preAnGlcIIa+b[alt1]을 위한 구성 설계를 개략적으로 나타낸다.
도 27은 플라스미드들 JME923 pPTura3-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt1] 및 Zeta-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt]을 위한 구성 설계를 개략적으로 나타낸다..
도 28은 스트레인을 합성하는 GlcNAcMan3GlcNAc2 내로의 글루코시다제 II 활성의 도입 후의 N-글리칸 프로파일을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다. 결과적인 스트레인들은 gls2 및 gls2 서브유닛들을 위한 이중 발현 구조체의 랜덤(G060) 또는 타겟된(G061) 통합을 경유하여 관찰되었다. 양자의 경우들에 있어서, 글루코실화된 피크들의 감소가 관찰된다. I-1,2-만노시다제 치료는 생성된 Man5'GlcNAc2 모두가 이형의(heterologous) HDEL-태그된 I-1,2-만노시다제에 의해 Man3GlcNAc2를 향해 전환되지는 않는 것을 나타낸다. 캡핑 글루코스들로 인하여, GlcMan5'GlcNAc2 및 Glc2Man5'GlcNAc2은 이러한 치료에 대해 민감하지는 않다. 잭 빈 만노시다제는 잔류하는 클루코실화된 N-글리칸들과 GlcNAcMan3GlcNAc2 모두 상의 자유로운 I-1,6-링크된 만노시다제를 부분적으로 제거할 수 있다. 또한, 이러한 치료는 Man3-5'GlcNAc2를 Man1GlcNAc2로 전환시킨다. "Rd"는 도 27에 도시한 벡터들 상에 존재하는 제타 배열들을 경유하는 "임의적 통합"을 나타낸다. "Tg-ade2" 및 "Tg-ura3"는 ADE2 resp. URA3 로쿠스 내의 타겟된 통합을 타나낸다.
도 29는 스트레인들 G070 및 G071의 세크리톰(secretome)의 N-글리칸 프로파일을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이이며, 이들은 스트레인 G061 내로의 GlcNAc-트랜스페라제 II의 도입을 경유하여 생성되었다. N-글리칸들은 I-1,2-만노시다제(말단 I-1,2-링크된 만노스 잔여물들의 모두 제거하는) 또는 헥소사미니다제(말단 I-1,2-링크된 GlcNAc 잔여물들을 제거하는)로 처리되어, G070 및 G071 자연 프로파일들 내의 피크를 확인할 수 있다. 글루코스-함유 N-글리칸들은2가지 효소들 중에서 하나에 민감하지 않다. I-1,2-만노시다제 치료는 Man3GlcNAc2를 향하는 Man5'GlcNAc2 and Man4GlcNAc2의 단부 절단을 야기한다. 헥소사미니다제 치료는 Man3GlcNAc2d 생성성하도록 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 II가 참가되어 있는 I-1,2-링크된 말단 GlcNAc 잔여물들을 제거한다.
도 30a는 합성 preproLip2-경쇄(light chain; LC)(SEQ ID NO:32)의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.
도 30b는 합성 preproLip2-경쇄(LC)(SEQ ID NO:33)의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.
도 31a는 합성 preproLip2-중쇄(heavy chain; HC)(SEQ ID NO:34)의 뉴클레오티드 배열을 나타낸다.
도 31b는 합성 preproLip2-HC(SEQ ID NO:35)의 아미노산 배열을 나타낸다. 도 32는 pYLHp4L2preproHerHC/LC(GUT2ex)-ori2로 형질 전환되었던 글리코-제조된(glyco-engineered) 스트레인들 G045, G057, G061 및 G071의 슈퍼(Super)T/글리세롤 쉐이크-플라스크 배양(shake-flask cultivations)의 N-글리칸 프로파일 분석을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다.
도 33은 G096 유기 발효(fed-batch fermentation) 내의 다른 시간 시점들에서 기능적 ELISA로부터의 결과들을 나타내는 그래프이다.
도 34a 및 도 34b는 G096 유기 발효 내의 다른 시간 시점들에서 세크리톰의 N-글리칸 프로파일 분석을 나타내는 일련의 일렉트로페로그램들이다.
여기서 설명하는 바와 같이, 효모-배출된 글루코프로테인(glycoprotein) 상의 포유류 유사 복합 N-글리칸들(glycans)의 생채 내(in vivo) 합성은 Man5GlcNAc2 또는 Man3GlcNAc2 베이스 구조(도 1a 참조, "Man"은 만노스(mannose)를 언급한 것이고, "GlcNAc"는 N-글루코사민(glucosamine)을 언급한 것이다)를 베이스로 할 수 있다. 상기 Man5GlcNAc2 베이스 구조를 생성하기 위하여, 효모 세포들은 세포내 구간(intracellular compartment)에서 I-1,2-만노시다제(mannosidase) 활성이 증가하고 외측 사슬 확장(Outer Chain elongation; OCH1)이 감소하도록 처리될 수 있다. 상기 Man3GlcNAc2 베이스 구조를 생성하기 위하여, 일부 실시예들에 있어서, 아스파라긴 링크된 글리코실레이션(Asparagine Linked Glycosylation 3; ALG3)의 활성과 외측 사슬 확장(OCH1)이 감소하고, 일부 실시예들에 잇어서, I-1,2-만노시다제의 활성과 I-1,3-글루코실트랜스페라제(glucosyltransferase)의 활성이 감소한다. 이러한 효모 세포들 내에서 생성되는 단백질들의 N-글리칸 프로파일은 상기 효모 세포들이 하나 또는 그 이상의 다음과 같은 활성들을 함유하도록 더 처리됨으로써 변경될 수 있다; GlcNAc 트랜스페라제 I(GnT I) 활성, 만노시다제 II 활성, GlcNAc 트랜스페라제 II(GnT II) 활성, 글루코시다제(glucosidase) II 활성 및 갈락토실트랜스페라제(galactosyltransferase; Gal T) 활성. 예를 들면, Man5GlcNAc2 또는 Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 생성하는 효모 세포 내에서의 GnT I의 발현은 Man5GlcNAc2 또는 Man3GlcNAc2 N-글리칸들에 대한 GlcNAc 일부(moiety)의 전사(transfer)를 가져오므로, GlcNAcMan5GlcNAc2 또는 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들이 각기 생성된다.
IGlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 생성하는 세포들에 있어서, 발현하는 만노시다제 II는 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 생성하도록 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들로부터 제거되는 2개의 만노시다제 잔여물들을 야기한다. GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 생성하는 세포들에 있어서, 발현하는 GnT II는 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 생성하도록 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들에 대한 다른 GlcNAc 일부의 전사를 야기한다. GlcNAcMan3GlcNAc2 또는 GlcNAc2Man3GlcNAc2N-글리칸들을 생성하는 세포들 내에서 발현하는 Gal T는 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 or Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 생성하도록 GlcNAcMan3GlcNAc2 또는 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들에 대한 갈락토스(galactose)의 전사를 야기한다. 일부 실시예들에 있어서, 글루코시다제 II(예를 들면, 발현하는 I 및 β 서브유닛들에 의해)는 Man3GlcNAc2 베이스 구조의 생성을 증가시키도록 발현될 수 있다.
타겟 분자들( Target Molecules )
여기서 사용되는 바와 같은 타겟 분자들은 유전공학적으로 제조된 세포(예를 들면, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans 등의 곰팡이 세포 또는 다른 해당되는 종들의 이형성(dimorphic) 효모 세포; 식물 세포 또는 동물 세포)의 N-글리코실레이션(glycosylation)을 거치는 임의의 분자들을 언급하는 것이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 타겟 분자들은 상기 Yarrowia lipolytica 또는 Arxula adeninivorans(또는 다른 해당되는 종들의 이형성 효모) 분비 경로의 하나 또는 그 이상의 단계들을 통해 수송될 수 있으므로, 호스트 세포 기관에 의해 이들의 N-글리코실레이션을 야기한다. 상기 타겟 분자들은 내생성(endogenous) 또는 외생성(exogenous)이 될 수 있다.
적합한 타겟 단백질들은 파쏘겐(pathogen) 단백질들[예를 들면, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid); 디프테리아 톡소이드(diptheria toxoid); 바이러스 표면 단백질들(예를 들면, 시토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV) 글리코프로테인들 B, H and gCIII; 인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus 1; HIV-1) 외피 글리코프로테인들(envelope glycoproteins); 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus; RSV) 외피 글리코프로테인들; 단순 헤르페스 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 외피 글리코프로테인들; 엡스타인-바 바이러스(Epstein Barr virus; EBV) 외피 글리코프로테인들; 수두 대상 포진 바이러스(varicella-zoster virus; VZV) 외피 글리코프로테인들; 인체유두종 바이러스(human papilloma virus; HPV) 외피 글리코프로테인들; 인플루엔자 바이러스(Influenza virus) 글리코프로테인들; 및 헵타티스 가계 표면 항원들(Hepatitis family surface antigens)], 리소좀 단백질들(lysosomal proteins)[예를 들면, 글루코세레브로시다제(glucocerebrosidase), 세레브로시다제(cerebrosidase) 또는 갈락토세레브로시다제(galactocerebrosidase)], 인슐린(insulin), 글루카곤(glucagon), 생장 인자들(growth factors), 시토킨들(cytokines), 케모킨들(chemokines), Fc 수용기에 결합되는 단백질, 항체들 및 그 단편들 또는 항체들 또는 항체들의 단편들에 대한 임의의 단백질들의 융합체(예를 들면, 단백질-Fc) 등을 포함한다. 생장 인자들은, 예를 들면, 혈관내피 생장인자(vascular endothelial growth factor; VEGF), 인슐린 유사 생장 인자(Insulin-like growth factor; IGF), 뼈형성 단백질(bone morphogenic protein; BMP), 과립구 집락 자극 인자(Granulocyte-colony stimulating factor; G-CSF), 과립 대식세포 집락 자극 인자(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor; GM-CSF), 신경 생장 인자(Nerve growth factor; NGF); 뉴로트로핀(Neurotrophin), 혈소판 유래 증식 인자(Platelet-derived growth factor; PDGF), 에리쓰로포에틴(Erythropoietin; EPO), 쓰롬보포에틴(Thrombopoietin; TPO), 미오스타틴(Myostatin; GDF-8), 생장 차등 인인-9(Growth Differentiation factor-9; GDF9), 염기성 섬유모세포 생장 인자(basic fibroblast growth factor; bFGF 또는 FGF2), 표피 생장 인자(Epidermal growth factor; EGF), 간세포 생장 인자(Hepatocyte growth factor; HGF) 등을 포함한다. 시토킨들(Cytokines)은, 예를 들면, 인터류킨들(interleukins)(예를 들면, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13 또는 IL-15와 같은 IL-1 내지 IL-33) 및 인터페론들(interferons)(예를 들면, 인터페론-β 또는 인터페론 K) 등을 포함한다. 케모킨들은, 예를 들면, I-309, TCA-3, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, C10, MRP-2, MARC, MCP-3, MCP-2, MRP-2, CCF18, MIP-1γ, 에오탁신(Eotaxin), MCP-5, MCP-4, NCC-1, Ckβ10, HCC-1, 류코탁틴(Leukotactin)-1, LEC, NCC-4, TARC, PARC 또는 에오탁신(Eotaxin)-2을 포함한다. 또한 종양(tumor) 글리코프로테인들[예를 들면, 종양-관련 항원들(tumor-associated antigens)]은, 예를 들면, 발암 배아성 항원(carcinoembryonic antigen; CEA), 인체 뮤신들(human mucins), HER-2/neu 및 전립선 특이 항원(prostate-specific antigen; PSA)[핸더슨(Henderson)과 핀(Finn)의 "Advances in Immunology"(62, 217-56 페이지(1996)) 참조] 등을 포함한다. 일 실시예에 있어서, 상기 타겟 단백질은 anti-HER2/neu 항체이다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 타겟 단백질은 리소조말 축적 대사 질환(lysosomal storage disorder)과 관련될 하나일 수 있으며, 타겟 단백질들은, 예를 들면, 알파-L-이두로니다제(alpha-L-iduronidase), 베타-D-갈락토시다제(beta-D-galactosidase), 베타-글루코시다제(beta-glucosidase), 베타-핵소사미니다제(beta-hexosaminidase), 베타-D-만노시다제(beta-D-mannosidase), 알파-L-푸코시다제(alpha-L-fucosidase), 아릴설파타제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타제 A(arylsulfatase A), 알파-N-아세틸갈락도사미니다제(alpha-N-acetylgalactosaminidase), 아스파르틸글루코사미니다제(aspartylglucosaminidase), 이두로나트-2-설파타제(iduronate-2-sulfatase), 알파-글루코사미니다제-N-아세틸트랜스페라제(alpha-glucosaminide-N- acetyltransferase), 베타-D-글루코로니다제(beta-D-glucoronidase), 히알루로니다제(hyaluronidase), 알파-L-만노시다제(alpha-L-mannosidase), 알파-뉴라미니다제(alpha-neuraminidase), 포스포트랜스페라제(phosphotransferase), 산성 리파제(acid lipase), 산성 세라미다제(acid ceramidase), 스핑고미엘리나제(sphingomyelinase), 티오에스테라제(thioesterase), 카테프신 K(cathepsin K) 및 리포단백질 지방 분해 효소(lipoprotein lipase)를 포함한다.
타겟 단백질들은 또한 융합 단백질들이 될 수 있다. 융합 단백질들은, 예를 들면, (i) 본 명세서에서 언급되는 임의의 단백질 또는 그 단편과 (ii) 항체 또는 그 단편의 융합체를 포함한다. 본 명세서에서,"항체 단편(antibody fragment)"이라는 용어는 (a) 항원-결합 단편 또는 (b) Fc 수용기와 상호 작용할 수 있는 항체의 Fc 부분을 지칭한다. 항원 결합 단편은, 예를 들면, Fab, F(ab')2, Fv 및 단일 사슬 Fv(scFv) 단편이 될 수 있다. 상기 scFv 단편은 그로부터 scFv가 유도되는 항체의 중쇄 및 경쇄(heavy and light chain) 가변 영역들을 모두 포함하는 단일 펩티드 사슬이다. 또한, 디아바디들(diabodies)[폴작(Poljak)(1994)의 "Structure"(2(12): 1121-1123), 허드슨 등(Hudson et al.)(1999)의 "J. Immunol. Methods"(23(1-2): 177-189)] 및 인트라바디들(intrabodies)[휴스톤 등(Huston et al.)(2001)의 "Hum. Antibodies"(10(3-4): 127-142); 휠러 등(Wheeler et al.)(2003)의 "Mol. Ther."(8(3): 355-366); 스톡스(Stocks)(2004)의 "Drug Discov. Today"(9(22): 960-966)]이 본 발명의 방법에 이용될 수 있다.
타겟 단백질들은 또한 하나 또는 그 이상의 폴리머, 운반체, 아쥬반트(adjuvant), 면역 독소(immunotoxin) 또는 검출 가능한(예를 들면, 형광성, 발광성 또는 방사성) 부분에 결합될 수 있다. 예를 들면, 타겟 단백질은 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol)에 결합될 수 있고, 작은 단백질들의 분자량을 증가시키거나 및/또는 순환 체류 시간을 증가시키는 데 사용될 수 있다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 타겟 분자는 돌리콜(dolichol)이거나 이를 함유할 수 있다.
유전공학적으로 제조된 세포들( Genetically Engineered Cells )
여기서 설명되는 유전공학적으로 제조된 세포들은 포유류 유사 N-글리칸들을 함유하는 타겟 분자들 또는 포유류의 글리코실레이션 경로 내에 중간체들을 함유하는 타겟 분자들을 생성하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 여기서 설명하는 바와 같이, 핵산들이 코딩된 하나 또는 그 이상의 효소들이 곰팡이 세포 내로 도입될 수 있으므로, 상기 세포가 원하는 N-글리칸(예를 들면, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는r Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들)을 생성한다. 따라서, 본 명세서에서 설명하는 임의의 실시예에 있어서, 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 하나의 효소를 함유할 수 있거나 핵산이 다중 효소에 코딩될 수 있다. 이러한 각 핵산은 또한 후술하는 바와 같이 타게팅하는 배열(targeting sequence)을 함유할 수 있다. 또한, 핵산 코딩된 타겟 분자도 상기 곰팡이 세포 내로 도임될 수 있으므로, 상기 타겟 분자가 원하는 N-글리칸(예를 들면, GlcNAcMan5GlcNAc2, GlcNAcMan3GlcNAc2, GlcNAc2Man3GlcNAc2, GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들)을 함유하도록 생성되고 변형된다.
"핵산(nucleic acid)" 및 "폴리뉴클레오티드(polynucleotide)"라는 용어들은 본 명세서에서 상호 교호적으로 사용되며, cDNA, 게놈(genomic) DNA, 합성(synthetic) DNA 및 핵산 유사물들을 함유하는 DNA(또는 RNA)를 포함하여 RAN 및 DNA를 모두 지칭한다. 핵산들은 임의의 3차원적인 구조를 가질 수 있다. 핵산은 이중 스트랜디드(stranded) 또는 단일 스트랜디드(즉, 센스(sense) 스트랜드 또는 안티센스(antisense) 스트랜드)가 될 수 있다. 핵산들의 비제한적인 예들로서는, 유전자들(genes), 유전자 단편들, 엑손들(exons), 인트론들(introns), 전령(messenger) RNA(mRNA), 운반(transfer) RNA, 리보솜(ribosomal) RNA, siRNA, 마이크로(micro)-RNA, 리보자임들(ribozymes), cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드들(recombinant polynucleotides), 분쇄기 폴리뉴클레오티드들(branched polynucleotides), 플라스미드들(plasmids), 벡터들(vectors), 임의의 배열에서 추출된 DNA, 임의의 배열에서 추출된 RNA, 핵산 탐침 및 프라이머들(primers) 뿐만 아니라 핵산 유사물들 등을 들 수 있다. 여기서 "폴리펩티드(Polypeptide)" 및 "단백질(protein)"이라는 용어들은 서로 교호적으로 사용되며, 길이 또는 번역후 변형에 관계없이 아미노산들의 임의의 펩타이드-링크된 사슬을 의미한다.
"추출된 핵산(isolated nucleic acid)"은 자연적으로 생성되는 게놈(genome)(예를 들면, 효모 게놈) 내의 핵산의 하나 또는 양측에 정상적으로 플랭크(flank)되는 핵산을 포함하여, 자연적으로 생성되는 게놈 내에 존재하는 다른 핵산 분자들로부터 분리된 핵산을 지칭한다. 본 명세서에서 "추출된(isolated)"이라는 용어는 비-자연적으로 생성되는 배열들이 자연에서는 발견되지 않고 자연적으로 생성되는 게놈 내에 직접적으로 근접하는 배열들을 갖지 않으므로 임의의 비-자연적으로 생성되는 핵산 배열을 포함하는 핵산에 대해 사용된다.
추출된 핵산은, 예를 들면, 자연적으로 생성되는 개놈 내의 DNA 분자가 제거되거나 결핍된 직접적으로 플랜킹(flanking)되는 정상적으로 발견되는 핵산 배열들 중의 하나가 제공되는 DNA 분자가 될 수 있다. 따라서, 추출된 핵산은, 비록 이에 제한되지는 않지만, 다른 배열들뿐만 아니라 벡터(vector), 복제기 점염기 플라스미드(autonomously replicating plasmid), 바이러스(예를 들면, 임의의 파라믹소바이러스(paramyxovirus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 아데노바이러스(adenovirus) 또는, 헤르페스(herpes) 바이러스)에 포함되거나 프로카리오트(prokaryote) 또는 유카리오트(eukaryote)의 게놈 DNA에 포함되는 DNA로부터 독립적인 분리된 분자들(예를 들면, 화학적으로 합성된 핵산이거나 cDNA 또는 OCR이나 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 처리에 의해 생성되는 게놈 DNA 단편)로서 존재하는 DNA 분자들을 포함한다. 또한, 추출된 핵산은 하이브리드 또는 융합 핵산의 일부인 DNA 분자와 같이 제조된 핵산을 포함할 수 있다. 수백 내지 수백만의 다른 핵산들, 예를 들면, cDNA 라이브러리들(libraries) 또는 게놈 라이브러리들, 혹은 게놈 DNA 제한 절단(restriction digest)을 함유하는 겔 슬라이스(gel slices)들 가운데 존재하는 핵산은 추출된 핵산으로 간주되지 않는다.
핵산과 특정한 호스트 세포를 참조하여 여기서 사용되는 바와 같은 "외생의(exogenous)"라는 용어는 자연에서 발견되는 특정 세포 내에서 생성되지 않는(그리고 수득될 수 없는) 임의의 핵산을 지칭한다. 따라서, 비-자연적으로 생성되는 핵산은 상기 호스트 세포 내에 한번 도입되면 호스트 세포에 대해 외생으로 간주된다. 비-자연적으로 생성되는 핵산들이 전체적으로는 자연에는 존재하지 않는 핵산이 제공된 자연에서 발견되는 핵산 배열들 또는 핵산 배열들의 단편들을 함유할 수 있는 점은 중요하다. 예를 들면, 벡터의 발현 내에 게놈 DNA 배열을 함유하는 핵산 분자는 비-자연적으로 생성되는 핵산이며, 이에 따라 전체적인 핵산 분자들(게놈 DNA 플러스 벡터 DNA)이 자연에서는 존재하지 않기 때문에 상기 호스트 세포 내로 일단 도입되면 호스트 세포에 대해 외생이 된다. 따라서, 전체적으로는 자연에 존재하지 않는 임의의 벡터, 복제기 점염기 플라스미드 또는 바이러스(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스)는 비-자연적으로 생성되는 핵산으로 간주된다. 다음의 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성되는 게놈 DNA 단편들 뿐만 아니라 cDNA들은 이들이 자연에서는 발견되지 않는 분리된 분자들로서 존재하기 때문에 비-자연적으로 생성되는 핵산으로 간주된다. 다음의 자연에서는 발견되지 않게 정렬되는 프로모터(promoter) 배열과 폴리펩티드-코딩된 배열(예를 들면, cDNA 또는 게놈 DNA)을 함유하는 임의의 핵산은 비-자연적으로 생성되는 핵산이다. 자연적으로 생성되는 핵산은 특정 세포에 대해 외생이 될 수 있다. 예를 들면, 효모 x로부터 추출된 전체 크로모솜(chromosome)은 크로모솜이 효모 세포 내로 일단 도입되면 효모 y의 세포에 대해 외생의 핵산이 된다.
유전공학적인 제조에 적합한 세포들은, 예를 들면, 곰팡이 세포들(예를 들면, Yarrowia lipolytica 또는 여기서 기술하는 임의의 다른 관련된 이형성 효모 세포들), 식물 세포들 또는 동물 세포들을 포함한다. 상기 세포들은 1차(primary) 세포들, 증식(immortalized) 세포들 또는 형질전환(transformed) 세포들이 될 수 있다. 이러한 세포들은, 여기서 구체화되는 유전공학적으로 제조되기 전에, 예를 들면, "American Type Culture Collection(Rockville, MD)"과 같은 다양한 상업적인 소스들 및 조사 자원 기구들로부터 수득될 수 있다.
세포의 유전공학적인 제조는, (i) N-글리코실레이션 활성을 갖는 내생의(endogenous) 유전자 코딩된 단백질의 결실(deletion), (ii) N-글리코실레이션 활성(즉, N-글리코실레이션 활성을 갖는 돌연변이 단백질을 발현)을 갖는 단백질(예를 들면, 내생의 또는 외생의 단백질)의 돌연변이 형태를 코딩하는 재조합 핵산의 도입, (iii) N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질의 기능적인 발현에 간섭하는 RNA 분자의 도입이나 발현, (iv) N-글리코실레이션 활성(즉, N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질을 발현)을 갖는 야생형(예를 들면, 내생의 또는 외생의) 단백질을 코딩하는 재조합 핵산의 도입, (v) N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질들을 코딩하여 이들의 코딩된 단백질들의 발현을 변경하는 하나 또는 그 이상의 내생의 유전자들의 프로토머(promoter) 또는 인핸서(enhancer) 요소들의 변경 등과 같은 유전공학적인 변형들을 포함할 수 있다. RNA 분자들은, 예를 들면, 짧은 간섭( small-interfering) RNA(siRNA), 짧은 헤어핀(short hairpin) RNA(shRNA), 안티-센스(anti-sense) RNA 또는 마이크로 RNA(miRNA)를 포함한다. 상기 (ii)의 사항이, 예를 들면, 그렇게 대체되는 내생의 유전자에 대하여 유전자 코딩된 N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질로 내생의 유전자의 대체를 포함함을 이해할 수 있을 것이다. 유전공학적인 제조는 또한 첨가물들(예를 들면, 이형의(heterologous) 배열), 결실들 또는 치환들(예를 들면, 점 돌연변이들(point mutations), 보존적 또는 비보존적 돌연변이들과 같은 돌연변이들)을 포함하는 단백질을 생성하도록 N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 내성의 유전자의 변경을 포함한다. 돌연변이들은 특별하게(예를 들면, 부위 특이적 돌연변이들 또는 동형의(homologous) 재조합) 도입될 수 있거나, 랜덤하게(예를 들면, 뉴만(Newman) 및 페로-노빅(Ferro-Novick)(1987)의 "J. Cell Biol."(105(4): 1587))에 기재된 바와 같이, 예를 들면, 화학적으로 돌연변이를 일으킬 수 있는 세포들) 도입될 수 있다.
여기서 기재되는 유전자 변형은 (i) 유전자 조작된 세포 내에서 하나 또는 그 이상의 N-글리코실레이션 활성의 증가, (ii) 유전자 조작된 세포 내에서 하나 또는 그 이상의 N-글리코실레이션 활성의 감소, (iii) 유전자 조작된 세포 내에서의 하나 또는 그 이상의 N-글리코실레이션 활성의 편재화(localization) 또는 세포내 분포의 변화, 또는 (iv) 유전자 조작된 세포 내에서 하나 또는 그 이상의 N-글리코실레이션 활성의 비율의 변화 중에서 하나 또는 그 이상을 야기할 수 있다. N-글리코실레이션 활성의 양의 증가는, N-글리코실레이션 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 지나친 발현, 내생의 유전자(예를 들면, 유전자 중복(gene duplication))의 복제 숫자의 증가 또는 유전자에 의해 코딩된 단백질의 발현의 증가를 자극하는 내생의 유전자의 프로모터 또는 인핸서의 변경에 기인할 수 있다는 점을 이해할 수 있을 것이다. 하나 또는 그 이상의 N-글리코실레이션 활성의 감소는, N-글리코실레이션 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 돌연변이 형태(예를 들면, 지배적인 부정적 형태(dominant negative form))의 지나친 발현, N-글리코실레이션 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 간섭 RNA 분자들의 도입이나 발현, 또는 N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 하나 또는 그 이상의 내생의 유전자의 결실에 기인할 수 있다
하나 또는 그 이상의 내생성 유전자를 결실시키고 방해하는 방법들은 첨부된 실험예들에 기재되어 있다. 예를 들면, 동형의(homologous) 재조합에 의해 유전자를 방해하기 위하여, "유전자 치환(gene replacement)" 벡터가 선택 가능한 마커 유전자(marker gene)를 포함하게 하는 방식으로 구성될 수 있다. 다른 선택 가능한 마커 유전자는 5' 및 3' 단부 모두에서 동형의 재조합을 중재하도록 충분할 길이를 갖는 유전자의 부분들에 동작 가능하게 연계될 수 있다. 상기 선택 가능한 마커는, URA3, LEU2 및 HIS3 유전자들을 포함하여, 호스트 세포 영양 요구성(auxotrophy)을 보완하거나 항생 물질 저항을 제공하는 유전자들의 임의의 숫자들 중에서 하나가 될 수 있다. 다른 적절한 선택 가능한 마커들은 CAT 유전자를 포함하며, 이는 효모 세포들 또는 lacZ 유전자에 클로람페니콜(chloramphenicol) 저항을 부여하여, β-갈락토시다제(galactosidase)의 발현에 기인하는 블루 콜로니들(blue colonies)을 야기한다. 유전자 치환 벡터의 선형화된(linearized) DNA 단편들은 이후에 해당 분야에서 알려진 방법들(후술하는 바를 참조 바람)을 이용하여 상기 세포들 내로 도입된다. 선형 단편들의 게놈 내로의 통합과 유전자 방해는 선택 마커를 기초로 하여 결정될 수 있으며, 예를 들면, 서전 블롯(Southern blot) 분석에 의해 증명될 수 있다.
첨부된 실험예들에서 기술하는 바와 같이, 선택에서의 그 용도에 후속하여, 선택 가능한 마커는, 예를 들면 Cre-loxP 시스템들(후술하는 바를 참조 바람)에 의해 호스트 세포의 게놈으로부터 제거될 수 있다. 이러한 마커 제거 과정은 실험예들에서 "큐어링(curing)"로 언급된다.
선택적으로, 유전자 치환 벡터는 방해되는 유전자의 일부를 포함하는 방식으로 구성될 수 있으며, 상기 일부는 어떠한 내생적 유전자 프로모터 배열과 코드들이 없거나, 상기 유전자의 코딩된 배열의 비활성 단편이다. An "비활성 단편(inactive fragment)"이란, 예를 들면 유전자의 전체 길이를 코딩하는 배열로부터 생성되는 단백질의 활성의 약 10% 이하(예를 들면, 약 9% 이하, 약 8% 이하, 약 7% 이하, 약 6% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하 또는 0%)의 포함하는 단백질을 코딩하는 유전자의 단편이다. 상기 유전자의 이와 같은 일부는 상기 유전자 배열에 작동 가능하게 연계되는 알려진 프로모터 배열이 없지만, 종결 코돈과 전사 종결 배열은 상기 유전자 배열에 작동 가능하게 연결되는 방식으로 상기 벡터 내로 삽입된다. 이러한 벡터는 상기 유전자 배열의 일부 내에서 후속적으로 선형화될 수 있고, 세포 내로 형질 전환될 수 있다. 단일 동형의 재조합을 동하여, 이러한 선형화된 백터가 이후에 상기 유전자의 내성성 대응자(counterpart)로 통합된다.
발현 벡터들은 자율적(autonomous) 또는 통합적(integrative)이 될 수 있다.
재조합 핵산은 플라스미드, 페이지(phage), 트랜스포손(transposon), 코스미드(cosmid) 또는 바이러스 입자와 같은 발현 벡터의 형태로 상기 세포 내로 도입될 수 있다. 상기 재조합 핵산은 염색체 외적으로(extrachromosomally) 유지될 수 있거나, 이는 효모 세포 크로모소말(chromosomal) DNA 내로 통합될 수 있다. 발현 벡터들은,
선택된 조건들(예를 들면, 우라실(uracil) 생합성에 필수적인 효소를 코딩하는 URA3 또는 트립토판(tryptophan) 생합성에 요구되는 효소를 코딩하는 TRP1) 하에서 원하는 핵산들(예를 들면, 미국 특허 제4,704,362호 참조)로 형질 전환되는 이러한 세포들의 검출 및/또는 선택이 가능하도록, 선택 마커 유전자들을 포함할 수 있다. 발현 벡터들은 또한 자율 증식 배열(autonomous replication sequence; ARS)을 포함할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,837,148호에는 Pichia pastoris 내에 플라스미드들을 유지하기 위한 적절한 수단을 제공하는 자율 증식 배열이 기재되어 있다.
통합적 벡터들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,882,279호에 기재되어 있다. 통합적 벡터들은 통상적으로 적어도 제1 삽입 가능한 DNA 단편, 선택 가능한 마커 유전자 및 제2 삽입 가능한 DNA 단편이 직렬로 정렬된 배열을 포함한다. 상기 제1 및 제2 삽입 가능한 DNA 단편들은 각기 그 길이가 약 200(예를 들면, 약 250, 약 300, 약 350, 약 400, 약 450, 약 500, 또는 약 1000 혹은 그 이상)인 뉴클레오티드들이며, 형질 전환되는 종들의 게놈 DNA의 부분들에 대해 동형인 뉴클레오티드 배열들을 가진다. 발현을 위해 관심이 있는 유전자(예를 들면, 글루코실레이션 활성을 갖는 유전자 코딩된 단백질)를 함유하는 뉴클레오티드 배열은, 상기 마커 유전자의 전에 또는 후에 제1 및 제2 삽입 가능한 DNA 단편들 사이의 이와 같은 벡터 내에 삽입된다. 통합적 벡터들은, 효모 형질 전환 전에 호스트 셀 게놈 내로의 관심이 있는 뉴클레오티드 배열의 통합이 용이하도록 선형화될 수 있다.
발현 벡터는 효모(예를 들면, Yarrowia lipolytica, Arxula adeninivorans 또는 다른 관련된 이형의 효모 종들) 프로모터의 조절 하에서 재조합 핵산을 특징할 수 있으며, 이는 효모 내에서 이들을 발현시킬 수 있게 한다. 적합한 효모 프로모터들은 TEF1, HP4D, GAP, POX2, ADC1, TPI1, ADH2, POX 및 Gal10 프로모터를 포함한다. 예를 들면, 마드작 등(Madzak et al.)(2000)의 "J. Mol. Microbiol. Biotechnol."(2: 207-216), 구아렌트 등(Guarente et al.)(1982)의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"(79(23): 7410) 등을 참조하기 바란다. 추가적인 적절한 프로모터들은, 예를 들면, 주(Zhu) 및 장(Zhang)(1999)의 "Bioinformatics"(15(7-8): 608-611)과 미국 특허 제6,265,185호에 기재되어 있다. 상기 발현 벡터가 포유류의 세포와 같은 동물 세포 내로 도입되는 곳에, 상기 발현 벡터는 관심이 있는 호스트 세포 내의 발현을 위한 적절한 동물 세포 프로모터의 조절 하에서 재조합 핵산을 특징할 수 있다. 포유류의 포로모터들의 예들은 SV40 안드시토메갈로바이러스(andcytomegalovirus; CMV) 프로모터들을 포함한다.
프로모터는 지속적(constitutive) 또는 유도적(inducible)(조건적)일 수 있다. 지속적 프로모터는 기준 배양 조건들 하에서 그 발현이 일정한 프로모터로서 이해된다. 유도적 프로모터들은 하나 또는 그 이상의 유도 신호(cue)에 응답하는 프로모터들이다. 예를 들면, 유도적 프로모터는 화학적으로 조절(예를 들면, 그 복제 활성이 알코올, 테트라시실린(tetracycline), 스테로이드(steroid), 금속(metal) 또는 다른 작은 분자와 같은 화학적 유도 물질의 존재나 결핍에 의해 조절된 프로모터)되거나 물리적으로 조절(예를 들면, 그 복제 활성이 광이나 고온 또는 저온과 같이 물리적인 유도체(inducer)의 존재나 결핍에 의해 조절되는 프로모터)될 수 있다. 유도적 프로모터는 또한 화학적이나 물리적 신호들에 의해 그들 자신이 직접적으로 조절되는 하나 또는 그 이상의 인자들에 의해 간접적으로 조절될 수 있다.
세포의 유전공학적인 제조는 또한, 호스트 세포 내에 존재하지만, 세포 내에서 정상적으로는 발현하지 않거나 상기 세포 내의 중요한 레벨들에서 발현하지 않는 내생의 유전자(예를 들면, N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자)를 활성화하는 것을 포함한다. 예를 들면, 내성적 유전자의 규정(regulatory) 배열(예를 들면, 유전자 프로모터 또는 인핸서)은 작동 가능하게 연결되는 코딩된 배열이 증가된 발현을 나타내도록 변형될 수 있다. 동형의 재조합 또는 타게팅은,
대응하는 비-유전공학적으로 제조된 세포에 비하여 분명하게 높은 레벨들에서 발현되는 상기 유전자를 야기하거나, 대응하는 비-유전공학적으로 제조된 세포에 비하여 분명히 다른 규정화 또는 유도의 패턴이 표시되는 상기 유전자를 야기하는 규정 배열로서 상기 유전자와 정상적으로 관련된 규정 영역이 치환하거나 무력화하도록 이용될 수 있다. 여기서 설명하는 규정 배열(예를 들면, 프로모터 또는 인핸서)의 변경들에 대한 적절한 방법들은, 예를 들면, 미국 공개 특허 제2003/0147868호에 기재되어 있다.
다른 유전공학적으로 제조된 변형들도 조건적임을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 유전자는, 예를 들어 Cre-loxP 시스템(예를 들면, 고센 등(Gossen et al.)(2002)의 "Ann. Rev. Genetics"(36: 153-173) 및 미국 공개 특허 제2006/0014264호 참조)과 같은 위치-특정 DNA 재조합 효소를 이용하여 조건적으로 결실될 수 있다. 재조합된 핵산은, 스레포플라스트(spheroplast) 기술 또는 전세포 리튬 클로라이드 효모 형질 전환(whole-cell lithium chloride yeast transformation) 방법 등과 같은 다양한 방법들을 이용하여 여기서 설명하는 세포 내로 도입될 수 있다. 여기서 설명되는 세포들 내로의 플라스미드 또는 선형의 핵산 벡터들의 형질 전환을 위한 유용한 다른 방법들은, 예를 들면, 미국 특허 제4,929,555호, 힌넨 등(Hinnen et al)(1978)의 "Proc. Nat. Acad. Sci. USA"(75:1929), 이토 등(Ito et al.)(1983)의 "J. Bacteriol."(153: 163), 미국 특허 제4,879,231호, 그리고 스리크리쉬나 등(Sreekrishna et al.)(1987)의 "Gene"(59: 115)에 기재되어 있다.
전기천공법(electroporation)과 PEG1000 전세포 형질 전환(whole cell transformation) 과정들도 크렉(Cregg) 및 러셀(Russel)의 "Methods in Molecular Biology: Pichia Protocols"(Chapter 3, 휴마나 인쇄사(Humana Press), (Totowa, N.J., 27-39 페이지(1998))에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. 동물 세포들의 형질 주입(transfection)은, 예를 들면, 인산 칼슘(calcium phosphate), 전기천공법, 열 충격(heat shock), 리포솜들(liposomes) 또는 FUGENE®이나 LIPOFECTAMINE® 등과 같은 형질 주입 시약들(transfection reagents)을 이용하거나, 용액(예를 들면, 삼브룩 등(Sambrook et al.)의 "Molecular Cloning: A Laboratory Manual Second Edition"(1, 2 및 3권. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York, USA, Nov. 1989 참조)) 내에서 원상태의(naked) 핵산 백터들을 세포들과 접촉시킴에 의해, 상기 세포들에 대한 벡터의 도입을 특징할 수 있다.
형질 전환된 효모 세포들은, 이에 제한되지는 않지만, 요구되는 생화학적인 생성물의 결핍(상기 세포의 영양 요구성으로 인해) 하에서 형질 전환 후의 영양 요구성 세포들의 배양, 새로운 표현형(phenotype)의 검출과 선택, 또는 형질 전환체들 내에 함유되는 저항 유전자의 결핍 상태에서 효모에 유해한 항생 물질의 존재 하에서의 배양을 을 포함하는 적절한 기술들을 이용하여 선택될 수 있다. 형빌 전환체들은 또한, 예를 들면, 서던블롯(Southern blot) 또는 PCR 분석에 의해 평가될 수 있는 발현 카세트의 통합에 의해 선택 및/또는 증명될 수 있다.
관심이 되는 타겟 세포 내로 상기 벡터들을 도입하기 전에,
상기 벡터들은 Escherichia coli(E. coli)와 같은 세균의 세포들 내에서 생장(예를 들면, 증폭)될 수 있다. 벡터 DNA는 세균의 환경으로부터 벡터 DNA를 정제하는 해당 기술 분야에서 알려진 임의의 방법에 의해 세균의 세포들로부터 분리될 수 있다. 정제된 벡터 DNA는, E. coli 단백질들이 플라스미드 DNA 제조에 존재하지 않는 점을 확실히 하도록 이러한 단백질들이 포유류의 세포들에 해로울 수 있기 때문에 페놀(phenol), 클로로포름(chloroform) 및 이들 중의 하나로 널리 추출될 수 있다.
여기서 설명하는 바와 같이, 유전공학적 제조는 N-글루코실레이션 활성을 갖는 단백질들을 코딩하는 유전자들의 임의의 숫자를 발현(예를 들면, 과도한 발현), 그 내로의 도입 변형들 또는 결실하는 데 사용될 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들면, OCH1, ALG3, I-1,3-글루코실트랜스페라제, GnT I, 만노시다제 II, GnT II, 글루코시다제 II, 또는 Gal T를 포함한다. N-글루코실레이션 활성을 갖는 유전자들이 코딩된 단백질들은 이러한 유전자들을 함유하는 임의의 종들로부터 수득될 수 있다. N-글루코실레이션 활성을 갖는 유전자들이 코딩된 단백질들로부터의 예시적인 곰팡이 종들은, 이에 제한되지는 않지만, Pichia anomala, Pichia bovis, Pichia canadensis, Pichia carsonii, Pichia farinose, Pichia fermentans, Pichia fluxuum, Pichia membranaefaciens, Pichia membranaefaciens, Candida valida, Candida albicans, Candida ascalaphidarum, Candida amphixiae, Candida Antarctica, Candida atlantica, Candida atmosphaerica, Candida blattae, Candida carpophila, Candida cerambycidarum, Candida chauliodes, Candida corydalis, Candida dosseyi, Candida dubliniensis, Candida ergatensis, Candida fructus, Candida glabrata, Candida fermentati, Candida guilliermondii, Candida haemulonii, Candida insectamens, Candida insectorum, Candida intermedia, Candida jeffresii, Candida kefyr, Candida krusei, Candida lusitaniae, Candida lyxosophila, Candida maltosa, Candida membranifaciens, Candida milleri, Candida oleophila, Candida oregonensis, Candida parapsilosis, Candida quercitrusa, Candida shehatea, Candida temnochilae, Candida tenuis, Candida tropicalis, Candida tsuchiyae, Candida sinolaborantium, Candida sojae, Candida viswanathii, Candida utilis, Pichia membranaefaciens, Pichia silvestris, Pichia membranaefaciens, Pichia chodati, Pichia membranaefaciens, Pichia menbranaefaciens, Pichia minuscule, Pichia pastoris, Pichia pseudopolymorpha, Pichia quercuum, Pichia robertsii, Pichia saitoi, Pichia silvestrisi, Pichia strasburgensis, Pichia terricola, Pichia vanriji, Pseudozyma Antarctica, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces momdshuricus, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces exiguous, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces fragilis, Saccharomyces marxianus, Saccharomyces mellis, Saccharomyces rosei, Saccharomyces rouxii, Saccharomyces uvarum, Saccharomyces willianus, Saccharomycodes ludwigii, Saccharomycopsis capsularis, Saccharomycopsis fibuligera, Saccharomycopsis fibuligera, Endomyces hordei, Endomycopsis fobuligera. Saturnispora saitoi, Schizosaccharomyces octosporus, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces dairensis, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora fermentati, Saccharomyces fermentati, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora rosei, Saccharomyces rosei,Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces rosei, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces delbrueckii, Torulaspora delbrueckii, Saccharomyces delbrueckii, Zygosaccharomyces mongolicus, Dorulaspora globosa, Debaryomyces globosus, Torulopsis globosa, Trichosporon cutaneum, Trigonopsis variabilis, Williopsis californica, Williopsis saturnus, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces bisporus, Debaryomyces disporua. Saccharomyces bisporas, Zygosaccharomyces bisporus, Saccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces mellis, Zygosaccharomyces priorianus, Zygosaccharomyces rouxiim, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces barkeri, Saccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces rouxii, Zygosaccharomyces major, Saccharomyces rousii, Pichia anomala, Pichia bovis, Pichia Canadensis, Pichia carsonii, Pichia farinose, Pichia fermentans, Pichia fluxuum, Pichia membranaefaciens, Pichia pseudopolymorpha, Pichia quercuum, Pichia robertsii, Pseudozyma Antarctica, Rhodosporidium toruloides, Rhodosporidium toruloides, Rhodotorula glutinis, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bayanus, Saccharomyces bisporus, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces chevalieri, Saccharomyces delbrueckii, Saccharomyces fermentati, Saccharomyces fragilis, Saccharomycodes ludwigii, Schizosaccharomyces pombe, Schwanniomyces occidentalis, Torulaspora delbrueckii, Torulaspora globosa, Trigonopsis variabilis, Williopsis californica, Williopsis saturnus, Zygosaccharomyces bisporus, Zygosaccharomyces mellis, Zygosaccharomyces rouxii 또는 여기서 설명하거나 해당 분야에서 알려진 다른 곰팡이들(예를 들면, 효모)을 포함한다.
하급 진핵 생물들(eukaryotes)의 예시들도, 이에 제한되지는 않지만, Aspergillus caesiellus, Aspergillus candidus, Aspergillus carneus, Aspergillus clavatus, Aspergillus deflectus, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus glaucus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus oryzae, Aspergillus parasiticus, Aspergillus penicilloides, Aspergillus restrictus, Aspergillus sojae, Aspergillus sydowi, Aspergillus tamari, Aspergillus terreus, Aspergillus ustus 또는 Aspergillus versicolor를 포함하는 Aspergillus의 다양한 종들을 포함한다.
N-글리코실레이션 활성을 가는 유전자들이 코딩된 단백질들로부터의 수득될 수 있는 예시적인 원생동물(protozoal) 유전자들은, 이에 제한되지는 않지만, Blastocrithidia, Crithidia, Endotrypanum, Herpetomonas, Leishmania, Leptomonas, Phytomonas, Trypanosoma(예를 들면, T. bruceii, T. gambiense, T. rhodesiense 및 T. cruzi) 및 Wallaceina를 포함한다. 예를 들면, 유전자 코딩된 GnT I는 인간(스위스 단백질 기탁(Swiss Protein Accession) 번호; P26572호), 쥐, Arabidopsis, 생쥐(mouse) 또는 Drosophila로부터 수득될 수 있고, 유전자 코딩된 Gnt II는 인간, 쥐(스위스 단백질 기탁 번호; Q09326호), Arabidopsis 또는 생쥐로부터 수득될 수 있으며, 유전자 코딩된 Man II는 인간, 쥐, Arabidopsis, 생쥐 또는 Drosophila(스위스 단백질 기탁 번호; Q24451호)로부터 수득될 수 있고, 유전자 코딩된 Gal T는 인간(스위스 단백질 기탁 번호; P15291), 쥐, 생쥐 또는 소(bovine)로부터 수득될 수 있다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 OCH1(젠뱅크 기탁(GenBank Accession) 번호: AJ563920) 유전자 또는 그 유전자 생성물(mRNA 또는 단백질)이 결핍된다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 ALG3(젠뱅크® 기탁 번호들: XM_503488, Genolevures Ref: YALI0E03190g) 유전자 또는 그 유전자 생성물(mRNA 또는 단백질)이 결핍된다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 an I-1,3-글루코실트랜스페라제(예를 들면, ALG6, 젠뱅크® 기탁 번호들: XM_502922, Genolevures Ref: YALI0D17028g) 단백질을 발현(예를 들면, 과도한 발현)시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 I-1,2-만노시다제(예를 들면, 젠뱅크 기탄 번호: AF212153) 단백질을 발현시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 GlcNAc-트랜스페라제 I(예를 들면, 스위스 단백질 기탁 번호 P26572호) 단백질을 발현시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 만노시다제 II 단백질 또는 그 촉매 도메인(예를 들면, 스위스 단백질 기탁 번호; Q24451)을 발현시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 갈락토실트랜스페라제 I 단백질 또는 그 촉매 도메인(예를 들면, 스위스 단백질 기탄 번호; P15291)을 발현시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유전공학적으로 제조된 세포는 GlcNAc-트랜스페라제 II 단백질 또는 그 촉매 도메인(예를 들면, 스위스 단백질 기탁 번호; Q09326)을 발현시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 상기 유전공학적으로 제조된 세포는 Yarrowia lipolytica, Trypanosoma brucei 또는 Aspergillus niger의 글루코시다제 II와 같은 글루코시다제 II의 알파 또는 베타 서브유닛(또는 알파 및 베타 서브유닛 모두)을 발현시킨다. 유전공학적으로 제조된 세포는 이러한 변형들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
예를 들면, 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 OCH1 유전자가 결핍되고, I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트랜스페라제 I, 만노시다제 II 및 갈락토실트랜스페라제 I을 발현시킨다. 일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포는 ALG3 유전자가 결핍되고, I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트랜스페라제 I, GlcNAc-트랜스페라제 I 및 갈락토실트랜스페라제 I을 발현시킨다. 이러한 유전공학적으로 제조된 세포는 또한 I-1,3-글루코실트랜스페라제를 발현시키거나 및/또는 글루코시다제 II의 알파 및 베타 서브유닛들을 발현시키거나 및/또는 OCH1 유전자가 결핍된다.
이러한 단백질의 하나 또는 그 이상은 이형의 타게팅하는 배열을 함유하는 융합 단백질이 될 수 있다. 예를 들면, I-1,2-만노시다제는 HDEL(소포체(endoplasmic reticulum; ER))-유지 아미노산 배열(실험예들 참조)을 포함할 수 있다. N-글리코실레이션 활성을 갖는 임의의 단백질이 HDEL 배열을 포함하는 융합 단백질로 제조될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 다른 단백질들은 상기 단백질을 골지체(Golgi apparatus)로 타겟하는 이형의 배열을 가질 수 있다. 예를 들면,
효모 Kre2p 유전자에 의해 코딩된 제1 100 N-말단 아미노산들, S. cerevisiae Mnn2 유전자에 의해 코딩된 제1 36 N-말단 아미노산들(스위스 단백질 기탁 번호; P38069), 또는 S. cerevisiae Mnn2p 유전자에 의해 코딩된 제1 46 N-말단 아미노산들은 골지체에 대한 타겟 단백질들로 이용될 수 있다. 이와 같이, 곰팡이 세포 내에서 발현되는 핵산들이 코딩된 단백질은 상기 코딩된 단백질을 세포내 구간으로 타겟하는 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함할 수 있다. 예를 들면, I-1,2-만노시다제는 ER에 타겟될 수 있는 반면에, GnT I, GnT II, 만노시다제 및 Gal T는 골지체에 타겟될 수 있다.
N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질이 상기 단백질이 발현되는 세포 보다 다른 형태(예를 들면, 다른 종들의)의 세포로부터 유도되는 실시예들에 있어서,
핵산이 코딩된 단백질은 관심을 갖는 특정한 세포 내에서의 발현을 위해 코돈-최적화(codon-optimized)될 수 있다. 예를 들면, Trypanosoma brucei로부터 N-글리코실레이션을 갖는 핵산이 코딩된 단백질은 Yarrowia lipolytica와 같은 효모 세포 내에서의 발현을 위해 코돈-최적화될 수 있다. 이러한 코돈-최적화는 관심을 갖는 세포 내에서의 핵산 단백질의 발현의 증가를 위해 유용할 수 있다. 핵산이 코딩된 단백질의 코돈-최적화를 위한 방법들은 해당 기술 분야에서 알려져 있고 여기에 기재되어 있다. 예를 들면, 가오 등(Gao et al.)의 "Biotechnol. Prog."((2004)20(2): 443-448), 코툴라 등(Kotula et al.)의 "Nat. Biotechn ."((1991) 9, 1386-1389)), 그리고 벤네트젠 등(Bennetzen et al .)의 "J. Biol . Chem."((1982) 257(6): 2036-3031)). 다음 표 1은 Yarrowia lipolytica를 위한 코돈 사용 빈도를 나타낸다. 데이터는 5,967 코딩 배열들 내의 2,945,919 코돈들로부터 추출되었다. 표 1의 내용은 코돈 사용 빈도 데이터베이스(Codon Usage Database)로부터 수득되었으며, 월드 와이드 웹 사이트(www)인 kazusa.or.jp/codon/cgi-bin/showcodon.cgi?species=284591에서 발견할 수 있다.
Yarrowia lipolytica 코돈 사용 빈도 표
UUU 15,9( 46804) CU 21.8( 64161) AU 6.8( 20043) GU 6.1( 17849)
UUC 23.0( 67672) CC 20.6( 60695) AC 23.1( 68146) GC 6.1( 17903)
UUA 1.8( 5280) CA 7.8( 22845) AA 0.8( 2494) GA 0.4( 1148)
UUG 10.4( 30576) CG 15.4( 45255) AG 0.8( 2325) GG 12.1( 35555)
CUU 13.2( 38890) CU 17.4( 51329) AU 9.6( 28191) GU 6.0( 17622)
CUC 22.6( 66461) CC 23.3( 68633) AC 14.4( 42490) GC 4.4( 12915)
CUA 5.3( 15548) CA 6.9( 20234) AA 9.8( 28765) GA 21.7( 63881)
CUG 33.5( 98823) CG 6.8( 20042) AG 32.1( 94609) GG 7.7( 22606)
AUU 22.4( 66134) CU 16.2( 47842) AU 8.9( 26184) GU 6.7( 19861)
AUC 24.4( 71810) CC 25.6( 75551) AC 31.3( 92161) GC 9.8( 28855)
AUA 2.2( 6342) CA 10.5( 30844) AA 12.4( 36672) GA 8.4( 24674)
AUG 22.6( 66620) CG 8.5( 25021) AG 46.5(136914) GG 2.4( 7208)
GUU 15.8( 46530) CU 25.5( 75193) AU 21.5( 63259) GU 16.6( 48902)
GUC 21.5( 63401) CC 32.7( 96219) AC 38.3(112759) GC 21.8( 64272)
GUA 4.0( 11840) CA 11.2( 32999) AA 18.8( 55382) GA 20.9( 61597)
GUC 25.7( 75765) CG 8.9( 26190) AG 46.2(136241) GG 4.4( 12883)
상기 표 1에 있어서, 구간들은 [삼중기호][1000 마다의 빈도][숫자]를 나타낸다.
일부 실시예들에 있어서, 인간 단백질들은 세포 내로 도입될 수 있으며, 하나 또는 그 이상의 N-글리코실레이션 활성을 갖는 내생성 효모 단백질들은 억제될(예를 들면, 결실되거나 또는 침묵함) 수 있다. "인간화(humanizing)" 곰팡이 글리코실레이션 경로를 위한 기술들은, 예를 들면, 최 등(Choi et al.)(2003)의 "Proc. Natl. Acad. Sci. USA"(100(9): 5022-5027), 베르벡켄 등(Vervecken et al.)(2004)의 "Appl. Environ. Microb."(70(5): 2639-2646), 그리고 게른그로스(Gerngross)(2004)의 "Nature Biotech."(22(11): 1410-1414)에 기재되어 있다.
유전공학적인 제조가 수반되는 위치, 예를 들면, 단백질의 발현 또는 내생성 단백질(내생성 단백질의 돌연변이 형태를 포함하는)의 발현의 변화들에서 유전공학적으로 제조된 세포들이 단백질을 발현시키는 경우를 결정하도록 다양한 기술들이 사용될 수 있다. 예를 들면, mRNA 코딩된 단백질 또는 단백질 자체의 존재는, 예를 들면, 각기 노던 블롯(Northern Blot)이나 RT-PCR 분석 또는 웨스턴 블롯(Western Blot 분석)을 이용하여 검출될 수 있다. N-글리코실레이션 활성을 갖는 단백질의 세포내 국소화는 초원심 세포분획법(subcellular fractionation) 및 면역형광법(immunofluorescence)으을 포함하는 다양한 기술들을 이용하여 분석될 수 있다.
타겟 분자의 글리코실레이션을 검출하는 방법들은 DNA 시퀀서-보조(sequencer-assisted; DSA), 형광-유도체화 당의 전기영동(fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis; FACE) 또는 표면-강화 레이저 탈착/이온화 비행시간 질량 분석법(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry; SELDI-TOF MS)을 포함한다. 예를 들면, 분석은 DSA-FACE를 활용할 수 있으며, 여기서, 예를 들면 글리코프로테인들이, 예를 들면 막 상에 고정됨에 수반하여 변질된다. 글리코실프로테인들은 이후에 디티오트레이올(dithiothreitol; DTT)이나 메르카프토에단올(mercaptoethanol)과 같은 적절한 감소제로 감소될 수 있다. 단백질의 설프히드랄기들(sulfhydryl groups)은 요오드아세트산iodoacetic acid)과 같은 산을 이용하여 카르복실화(carboxylated)될 수 있다. 다음에, N-글리칸들은 N-글리코시다제 F와 같은 효소를 사용하여 상기 단백질로부터 해리될 수 있다. N-글리칸들은, 선택적으로 재구성될 수 있고, 환원성 아미노화(reductive amination)에 의해 유도체화될 수 있다. 유도체화된 N-글리칸들은 이후에 응축될 수 있다. N-글리칸 분석에 적절한 기구 장치는, 예를 들면, ABI PRISM®377 DNA 시퀀서(Applied Biosystems)를 포함한다. 데이터 분석은, 예를 들면, GENESCAN® 3.1 소프트웨어(Applied Biosystems)를 사용하여 수행될 수 있다. 선택적으로, 추출된 만노프로테인들(mannoproteins)은 이들의 N-글리칸 상태를 확인하도록 하나 또는 그 이상의 효소에 의해 더 처리될 수 있다. N-글리칸 분석의 추가적인 방법들은, 예를 들면, 질량 분석법(예를 들면, MALDI-TOF-MS), 정상 상태 상의 고압 액체 크로마토그래피(high-pressure liquid chromatography; HPLC), 역상태 및 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 글리칸들이 라벨되지 않을 때의 펄스 전류 검출과 글리칸들이 적절하게 레벨될 경우의 젤 자외선(UV) 흡수 또는 형광성으로). 또한, 콜레베르트 등(Callewaert et al.)(2001)의 "Glycobiology"(11(4): 275-281) 및 프레이르 등(Freire et al.)(2006)의 "Bioconjug. Chem."(17(2): 559-564)을 참조하기 바란다.
Where any of the genetic modifications of the genetically engineered cell 유전공학적으로 제조된 세포의 임의의 유전학적 변형이 유도 가능하거나 유도되는 신호(예를 들면, 화학적 또는 물리적 신호)의 존재 하의 조건적인 위치에서, 상기 유전공학적으로 제조된 세포는, 선택적으로 핵산의 도입 전에, 그 동안에 또는 후속하여 유도제의 존재 하에서 배양될 수 있다. 예를 들면, 핵산이 코딩된 타겟 단백질의 도입에 후속하여, 상기 세포가 N-글리코실레이션 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 발현을 증진시킬 수 있는 화학적 유도제에 노출될 수 있다.
다중 유도 신호들이 N-글리코실레이션 활성을 갖는 하나 또는 그 이상의 단백질의 조건적인 발현을 유도하는 위치에서, 세포는 다중 유도 신호들과 접촉할 수 있다.
원하는 N-글리칸을 포함하도록 변형된 타겟 분자들은 유전공학적으로 제조된 세포로부터 추출될 수 있다. 상기 변형된 타겟 분자는 효모 세포 내에서 유지될 수 있고, 세포 분쇄(cell lysis)에 의해 해리되거나, 상기 변형된 타겟 분자는 상기 세포로부터 상기 분자들의 분비를 유도하는 배열(외생의 핵산에 대해 자연적이거나 또는 발현 벡터 내로 제조되는)에 의해 제공되는 메커니즘을 경유해 배양 매체 내로 분비된다. 세포 용해액(cell lysate) 또는 배양 매체 내의 변형된 타겟 분자의 존재는 상기 분자의 존재를 검출하는 다양한 표준 포로토콜들(protocols)에 의해 입증될 수 있다. 예를 들면, 변경된 타겟 분자가 단백질인 위치에서, 이러한 프로토콜은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 면역블로팅(immunoblotting) 또는 상기 변경된 타겟 단백질(또는 상기 타겟 단백질 그 자체)에 특이한 항체를 사용하는 방사성면역침강(radioimmunoprecipitation), 상기 변경된 타겟 단백질(또는 상기 타겟 단백질 그 자체)에 특이한 리간드(ligand)의 결합, 또는 상기 변경된 타겟 단백질(또는 상기 타겟 단백질 그 자체)의 특정한 효소 활성의 테스트 등을 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 유전공학적으로 제조된 세포로부터 추출된 타겟 분자들의 적어도 25%는 원하는 N-글리칸을 함유한다. 예를 들면, 적어도 약 27%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95%, 혹은 적어도 약 99%의 유전공학적으로 제조된 세포로부터 추출되는 타겟 분자들이 상기 원하는 N-글리칸을 함유한다.
일부 실시예들에 있어서, 본 명세서에서 설명한 방법에 의해 생성된 타겟 분자들에 있어서, 글리코프로테인 상의 N-글리칸들의 적어도 50%(예를 들면, 적어도 55, 60, 65, 70, 75, 80 또는 85%)는 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들이 될 수 있다. GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸의 백분율은 DSA-FACE 전사체들(electropherograms) 내의 피크 영역들로부터 산정될 수 있다. 실험예 13을 참조하기 바란다.
일부 실시예들에 있어서, 추출되는 변형된 타겟 분자들은 동결, 동결 건조 또는 고정될 수 있으며, 적절한 조건들, 예를 들면, 생물학적 활성을 유지하도록 변경된 타겟 분자들이 가능한 조건들 하에서 저장될 수 있다.
제조된 세포들의 배양들( Cultures of Engineered Cells )
본 발명은 또한 여기서 설명하는 유전공학적으로 제조된 세포의 실질적으로 순수한 배양을 제공한다. 본 명세서에서 설명하는 바와 같이, 유전공학적으로 제조된 세포의 "실질적으로 순수한 배양(substantially pure culture)"은, 배양 내에서 보이는 세포들의 전체 숫자의 약 40% 이하(즉, 약 35%; 30%; 25%; 20%; 15%; 10%; 5%; 2%; 1%; 0.5%; 0.25%; 0.1%; 0.01%; 0.001%; 0.0001% 이하 또는 그 이하)가 유전공학적으로 제조된 세포, 예를 들면 세균성, 곰팡이성(효모를 포함하여), 마이크로플라즈마성(mycoplasmal) 또는 원생동물(protozoan) 세포들 보다 보일 수 있는 세포의 배양을 말한다. 본 명서서에서 "약(about)"이라는 용어는 관련된 퍼센트가 특정한 퍼센트의 15% 정도 특정한 퍼센트 이상이 될 수 있거나 이하가 될 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 예를 들면, 약 20%는 17% 내지 23%가 될 수 있다. 이러한 유전공학적으로 제조된 세포의 배양은 상기 세포들 및 생상, 저장 또는 전송 매체들을 포함한다. 매체들은 액체, 반고체(예를 들면, 젤리 같은 매체), 또는 동결될 수 있다. 상기 배양은 상기 액체 내 또는 상기 반고체 내/상에서 생장하거나, 동결 저장 또는 전송 매체를 포함하는, 저장 또는 전송 매체에 저장되거나 전송되는 상기 세포들을 포함한다. 배양 베셀(vessel)이나 저장 베셀 또는 기질(예를 들면, 배양 접시, 플라스크니 튜브 또는 저장 바이얼(vial) 혹은 튜브) 내에 있다.
여기서 설명되는 유전공학적으로 제조된 세포는, 예를 들면, 동결 세포 현탁액들로서, 예를 들면, 글리세롤(glycerol)이나 수크로스(sucrose)와 같은 저온 보호물질(cryoprotectant)을 함유하는 버퍼 내에서 동결 건조된 세포들로서 저장될 수 있다. 선택적으로, 이들은, 예를 들면 유동층 건조 또는 분무 건조에 의해 건조된 셀 프레파라트들(preparations)로서, 또는 분무 건조에 의해 또는 임의의 다른 적절한 건조 방법으로 저장될 수 있다.
변경된 N-글루코실레이션 분자들에 의해 치료 가능한 질병들(Disorders Treatable by Altered N-Glycosylation Molecules)
The isolated, target molecules modified to contain the desired N-글리칸을 함유하도록 변형된 추출되는 타겟 분자들은 대사 장애들(metabolic disorders), 암(cancer) 및 골반 염증들(inflammatory disorders)을 포함하여, 다양한 질병들을 치료하는 데 사용될 수 있다.
(i) 대사 장애들(Metabolic Disorders)
대사 장애는 개별적 사람(또는 동물) 세포들 내에서의 에너지의 생산에 영향을 미치는 것의 일종이다. 비록 일부가 다이어트, 독소들, 감염을 등의 결과로서 "획득된(acquired)" 것이 될 수 있지만, 대부분의 대사 장애들은 유전적이다. 유전적인 대사 장애들은 또한 신진 대사의 선천적 이상으로 알려져 있다. 일반적으로, 유전적 대사 장애들은 세포의 대사 과정의 일부 단계에서 필수적인 결핍되거나 또는 부적절하게 구성된 효소들을 야기하는 유전적인 결함들에 의해 발생된다. 대사 장애들의 가장 많은 경우들은 탄수화물 대사(carbohydrate metabolism)의 장애들, 아미노산 대사의 장애들, 유기산 대사(유기 산뇨(acidurias))의 장애들, 지방상 산화 및 미토콘드리아(mitochondrial) 대사의 장애들, 포르피린(porphyrin) 대사의 장애들, 퓨린(purine)이나 피리미딘(pyrimidine) 대사의 장애들, 스테로이드 대사의 장애들, 미토콘드리아 기능의 장애들, 페록시소말(peroxisomal) 기능의 장애들, 그리고 리소조말 축적 장애들(lysosomal storage disorders; LSDs)이다.
여기서 설명되는 하나 또는 그 이상의 글리코실화된 분자들(또는 이와 동일한 약제학적인 조성물)의 처방을 통해 치료될 수 있는 대사 장애들의 예들은,
유전성 혈색소침작증(hereditary hemochromatosis), 안피부백피증(oculocutaneous albinism), 단백질 C 결핍(protein C deficiency), I형 유전성 혈관신경부종(type I hereditary angioedema), 선천성 수크라제-이소말타제 결핍(congenital sucrase-isomaltase deficiency), 크리글러-나자르 II형(Crigler-Najjar type II), 라론 증후군(Laron syndrome), 유전성 미엘로페록시다제 결핍(hereditary Myeloperoxidase deficiency), 일차 갑상선 기능저하증(primary hypothyroidism), 선천성 만성 QT 증후군(congenital long QT syndrome), 티록신 결합 글로불린 결핍(tyroxine binding globulin deficiency), 가족성 과콜레스테롤혈증(familial hypercholesterolemia), 가족성 카일로마이크론혈증(familial chylomicronemia), 무베타-지방단백혈증(abeta-lipoproteinema), 저 플라즈마 리포단백질 A 레벨들(low plasma lipoprotein A levels), 간 손상을 동반하는 유전성 폐기종(hereditary emphysema with liver injury), 선천성 갑상선 기능 저하증(congenital hypothyroidism), 골형성부전증(osteogenesis imperfecta), 유전성 저파이브리노젠혈증(hereditary hypofibrinogenemia), 알파-란티치모트립신 결핍(alpha-1antichymotrypsin deficiency), 신성요붕증(nephrogenic diabetes insipidus), 중추성요붕증(neurohypophyseal diabetes insipidus), 아데노신 디아미나제 결핍(adenosine deaminase deficiency), 펠리제우스 메르츠바헤르병(Pelizaeus Merzbacher disease), 폰 빌레브란트병 IIA형(von Willebrand disease type IIA), 결합된 V 및 VIII 인자 결핍(combined factors V and VIII deficiency), 척추골 단이 형성증(spondylo-epiphyseal dysplasia tarda), 맥락막 결여(choroideremia), I 세포병(I cell disease), 배턴병(Batten disease), 혈관확장성 운동실조증(ataxia telangiectasias), ADPKD-상염색체 우성 다낭성 신종(ADPKD-autosomal dominant polycystic kidney disease), 미세융모 내포병(microvillus inclusion disease), 결절성 경화증(tuberous sclerosis), 로에의 안뇌신증후군(oculocerebro-renal syndrome of Lowe), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis), 골수이형성증후군(myelodysplastic syndrome), 베어 림프구 증후군(Bare lymphocyte syndrome), 탄기에르병(Tangier disease), 가족성 간내담즙정체증(familial intrahepatic cholestasis), X연관성 아드레노-류코디스트로피(X-linked adreno-leukodystrophy), 스콧 증후군(Scott syndrome), 헤르만스키-푸득락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome types 1 and 2), 젤웨거 증후군(Zellweger syndrome), 점상연골 이형성증(rhizomelic chondrodysplasia puncta), 상염색체성 열성 원발성 부갑상선기능항진증(autosomal recessive primary hyperoxaluria), 모어 트라네브야르그 증후군(Mohr Tranebjaerg syndrome), 척추 및 수포 근위축증(spinal and bullar muscular atrophy), 원발성 섬모반증(카르타게너 증후군)(primary ciliary diskenesia; Kartagener's syndrome), 거인증 및 말단비대증(giantism and acromegaly), 유즙 분비증(galactorrhea), 에디슨병(Addison's disease), 부싱성 웅성화(adrenal virilism), 커싱 증후군(Cushing's syndrome), (ketoacidosis), 원발성 또는 속발성 알도스테론증(primary or secondary aldosteronism), 밀러 디에르케르 증후군(Miller Dieker syndrome), (lissencephaly), 운동 신경 질환(motor neuron disease), 어서 증후군(Usher's syndrome), 휘스콧-알드리히 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 옵티즈 증후군(Optiz syndrome), 헌팅턴병(Huntington's disease), 유전성 췌장염(hereditary pancreatitis), 안티-포스폴리피드 증후군(anti-phospholipid syndrome), 중복 결합 조직 질환(overlap connective tissue disease), 스죄그렌 증후군(Sjㆆgren's syndrome), 스티프-만 증후군(stiff-man syndrome), 브루가다 증후군(Brugada syndrome), 피니시형 선천성 신장 증후군(congenital nephritic syndrome of the Finnish type), 더빈-존슨 증후군(Dubin-Johnson syndrome), X연관성 저인산혈증(X-linked hypophosphosphatemia), 펜드레드 증후군(Pendred syndrome), 지속성 고인슐린성 유아 저형달증(persistent hyperinsulinemic hypoglycemia of infancy), 유전성 구상적혈구증(hereditary spherocytosis), 아세룰로플라스미네미아(aceruloplasminemia), 영이형 세로이드 리포푸신증(infantile neuronal ceroid lipofuscinosis), 슈도아콘드로플라시아 및 다중 골단 골절(pseudoachondroplasia and multiple epiphyseal), 스타르가르트 유사 시력상실증(Stargardt-like macular dystrophy), X연관성 차르코트-마리에-투스병(X-linked Charcot-Marie-Tooth disease), 상염색체 우성 망막색소 변성증(autosomal dominant retinitis pigmentosa), 월콧-랠리슨 증후군(Wolcott-Rallison syndrome), 쿠싱병(Cushing's disease), 지대근이영양증(limb-girdle muscular dystrophy), 무코플로이-사카리도시스 IV형(mucoploy-saccharidosis type IV), 피니시의 유전적 가족성 유전분증(hereditary familial amyloidosis of Finish), 앤더슨병(Anderson disease), 사르코마(sarcoma), 크로닉 미엘로모노키틱 류케미아(chronic myelomonocytic leukemia), 심근증(cardiomyopathy), 안면 성기형성장애(faciogenital dysplasia), 톨션병(Torsion disease), 헌팅턴 및 유전성 실조증(Huntington and spinocerebellar ataxias), 유전성 과호모시스테인혈증(hereditary hyperhomosyteinemia), 말초신경병증(polyneuropathy), 저운동 신경 질병(lower motor neuron disease), 색소성 망막변성증(pigmented retinitis), 혈청잔응 음성의 다발 관절염(seronegative polyarthritis), 간질성 폐섬유증(interstitial pulmonary fibrosis), 레이노드 현상(Raynaud's phenomenon), 베게너 육아종증(Wegner's granulomatosis), 단백뇨증(proteinuria), CDG-Ia, CDG-Ib, CDG-Ic, CDG-Id, CDG-Ie, CDG-If, CDG-IIa, CDG-IIb, CDG-IIc, CDG-IId, 엘러스-단로스 증후군(Ehlers-Danlos syndrome), 다중 외골증(multiple exostoses), 그리스셀리 증후군 1형 또는 2형(Griscelli syndrome; type 1 or type 2), 또는 X연관성 비특정 정신 지체(X-linked non-specific mental retardation)를 포함한다. 또한, 대사 장애들은, 이에 제한되지는 않지만, 패브리병(Fabry disease), 파르베르병(Farber disease), 가우셔르병(Gaucher disease), GM1-간글리오시도시스(GM1-gangliosidosis), 테이-사츠병(Tay-Sachs disease), 산드호프병(Sandhoff disease), GM2 활성자 질병(GM2 activator disease), 크라베병(Krabbe disease), 메타크로마틱 류코디스트로피(metachromatic leukodystrophy), 니에만-피크병: A, B 및 C형(Niemann-Pick disease; types A, B 및 C), 훌러병(Hurler disease), 쉐이에병(Scheie disease), 헌터병(Hunter disease), 산필리포병(Sanfilippo disease), 모르퀴오병(Morquio disease), 마로테아옥스-라미병(Maroteaux-Lamy disease), 히알루로니다제 결핍(hyaluronidase deficiency), 아스파르틸글루코사미누리아(aspartylglucosaminuria), 푸코시도시스(fucosidosis), 만노시도시스(mannosidosis), 쉰들러병(Schindler disease), 시알리도시스 I형(sialidosis type 1), 폼페병(Pompe disease), 피크노디소스토시스(Pycnodysostosis), 세로이드리포푸스키노시스(ceroid lipofuscinosis), 콜레스테롤 에스테르 저장 질병(cholesterol ester storage disease), 월맨병(Wolman disease), 다증 설파타제 결핍(Multiple sulfatase deficiency), 갈락토시알리도시스(galactosialidosis), 무콜리피도시스 II, III 및 IV형(mucolipidosis; types II, III 및 IV), 시스티노시스(cystinosis), 시알릭산 저장 질병(sialic acid storage disorder), 라미네스코-스죄르겐 증후군에 수반하는 칠로미크론 유지 질병(chylomicron retention disease with Marinesco-Sjㆆgren syndrome), 헤르만스키-푸들락 증후군(Hermansky-Pudlak syndrome), 체디악-히가시 증후군(Chediak-Higashi syndrome), 다논병(Danon disease) 또는 겔레오피직 이형성증(Geleophysic dysplasia)과 같은 리소조말 축적 장애들(lysosomal storage disorders)을 포함할 수 있다.
대사 장애의 징후들은 수많으며, 발산하고, 예를 들면, 빈혈(anemia), 피로, 쉽게 멍듬, 저혈소판들, 간 비대, 비장 비대, 뼈의 약화, 폐 장애, 감염들(예를 들면, 흉부 감염 또는 폐렴), 소아 장애, 진행성 뇌 손상, 발작(seizures), 지나치게 굵은 태변(meconium), 기침, 천식, 과도한 타액 또는 점액 생성, 호흡의 단축, 복부 통증, 폐색된 창자 또는 내장, 생식력 문제들, 비강 내의 폴립들(polyps), 손가락/발가락 손톱들과 피부의 곤봉지(clubbing), 손이나 발의 통증, 맥관각화증(angiokeratoma), 감소된 발한, 각막 또는 수정체의 불투명성, 백내장, 승모판 탈출증(mitral valve prolapse) 및/또는 역출(regurgitation), 심장 비대, 체온 결핍, 보행의 곤란, 삼키기의 곤란, 진행성 시력 상실, 진행성 청력 상실, 근긴장 저하(hypotonia), 대설증(macroglossia), 무반사증(areflexia), 저 요추 염좌, 수면 무호흡(sleep apnea), 기좌호흡(orthopnea), 경면(somnolence), 척추 전만증(lordosis) 또는 척추 측만증(scoliosis) 중에서 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다. 결함이 있거나 결핍된 단백질들의 발현하는 특성과 그 결과적인 질병 표현형들(예를 들면, 대사 장애의 증후적인 존재)로 인하여 주어진 장애가 일반적으로 특정한 질병에 대한 징후들 특성만으로 존재할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 예를 들면, 파브리병(Fabry disease)을 앓는 환자는, 이에 제한되지는 않지만, 체온 결핍(temperature intolerance), 각막 선회증(corneal whirling), 통증, 피부 가려움, 구역질(nausea) 또는 설사병(dirarrhea) 등과 같은 전술한 징후들에서 특정한 하위 세트들에 존재할 수 있다. 가우쳐 증후군(Gaucher syndrome)을 앓는 환자는 비종(splenomegaly), 간경변증(cirrhosis), 발작(convulsions), 긴장 항진(hypertonia), 무호흡(apnea), 골다공증(osteoporosis) 또는 피부 변색(skin discoloration)을 수반할 수 있다.
본 발명에서 설명된 하나 또는 그 이상의 분자들의 투여에 추가하여, 대사 장애는 또한 적절한 영양소 및 비타민들(예를 들면, 보조인자 치료(cofactor therapy), 물리적 치료 및 진통제(pain medications)를 통해서 치료될 수 있다.
주어진 대사 장에의 특정 성질에 따라, 환자는 이들 증상들을 모든 나이에서 나타날 수 있다. 많은 경우들에서, 증상은 어린이 또는 초기 성인기(early adulthood)에 나타날 수 있다. 예를 들면, 파브리병의 증상들은 어린 나이, 예를 들어 10살 또는 11살에 나타날 수 있다.
본 발명에서 사용되는 바와 같이, "대사 장애가 발병할 위험이 있는" 대상체란 장애(disorder)를 발병할 경향(predisposition), 즉 α-L-이듀로니다제(alpha-L-iduronidase), β-D-갈락토시다제(beta-D-galactosidase), β-글루코시다제(beta-glucosidase), β-핵소사미니다제(beta-hexosaminidase), β-D-만노시다제(beta-D-mannosidase), α-L-푸코시다제(alpha-L-fucosidase), 아릴설파타아제 B(arylsulfatase B), 아릴설파타아제 A(arylsulfatase A), α-N-아세틸갈락토사미니다제(alpha-N-acteylgalactosaminidase), 아스파틸글루코사미니다제(aspartylglucosaminidase), 이듀로네이드-2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase), α-글루고사미니데-N-아세틸트랜스페라제(alpha-glucosaminide-N-acetyltransferase), β-D-글루코로니다제(beta-D-glucoronidase), 히알루로니다제(hyaluronidase), α-L-만노시다제(alpha-L-mannosidase), α-뉴로아미니다제(alpha-neurominidase), 포스포트란스페라제(phosphotransferase), 산 리파제(acid lipase), 산 세라미다제(acid ceramidase), (스핑고미엘리나제)sphinogmyelinase, (티오에스터라제)thioesterase, 카텝신 K(cathepsin K) 또는 리포프로틴 리파제(lipoprotein lipase)와 같은 효소의 돌연변이의 결과로서 대사 장애를 발병할 유전적 경향을 가지는 대상체이다.
(ii) 암
암은 세포들의 제어되지 않은 분열 및 이들의 침입을 통한 근접한 조직(tissue)으로 직접 성장 또는 전이를 통한 이격된 위치들로의 착상을(implantation)(암세포들은 혈관 또는 림프 시스템을 통해서 운단됨) 통해서 전파되는 능력을 특징으로 하는 질병 또는 질환의 종류이다. 암은 모든 연령대의 인간에 영향을 미칠 수 있지만, 연령에 따라서 위험도가 증가하는 경향을 갖는다. 암의 종류들은 예를 들면, 폐암, 유방암, 결장암, 췌장암, 신장암, 위암, 간암, 골암, 혈액암, 신경조직암, 흑색증, 갑상선암, 난소암, 고환암, 전립선암, 자궁경부암, 질암 또는 방광암을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 암이 발병할 위험이 있는 대상체란 암을 발병할 경향(predisposition), 즉 종양억제유전자의 돌연변이(예를 들면, BRCA1, p53, RB 또는 APC의 돌연변이)와 같이 암을 발병할 유전적 경향 또는 암을 야기할 수 있는 조건들에 노출된 대상체를 말한다. 이에 따라, 대상체가 특정 화합물들(예를 들면, 아크롤레인(acrolein), 비소, 벤젠, 번즈안트라센, 벤조피렌, 폴로늄-210(라돈), 우레탄 또는 염화 비닐과 같은 담배 연기 내에 발암성 화합물들)에 돌연변이유발성(mutagenic) 또는 발암성(carcinogenic) 레벨로 노출될 때, 상기 대상체는 "암이 발병할 위험이 있는" 대상체가 될 수 있다. 게다가, 대상체가, 예를 들어 다량의 자외선 또는 X-선에 노출되거나, 유두종 바이러스(papillomavirus), 엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus), B형 간염 바이러스(hepatitis B virus), 또는 사람T세포 백혈병 바이러스(human T-cell leukemia-lymphoma virus)와 같이 종양-유발/연관 바이러스에 노출(예를 들어, 감염)되었을 때, 상기 대상체는 "암이 발병할 위험이 있다." 상술한 것으로부터, "암이 발병할 위험이 있는" 대상체는 관심이 있는 종들 내의 모든 대상체가 아님이 명확하다.
"암을 가지는 것으로 의심되는" 대상체는 암의 하나 또는 그 이상의 증상들을 갖는 대상체이다. 암의 증상들을 상기 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있으며, 유방 종괴(breast lumps), 유두 변화(nipple changes), 유방 물혹(breast cysts), 호흡 통증(breast pain), 체중감소, 쇠약함(weakness), 과도한 피로(excessive fatigue), 식사하기 어려움, 식욕 감소, 만성 기침(chronic cough), 호흡곤란 악화(worsening breathlessness), 피가 섞인 기침(coughing up blood), 피가 섞인 소변(blood in the urine), 피가 섞인 대변(blood in stool), 메스꺼움(nausea), 구토(vomiting), 간전이(liver metastases), 폐전이(lung metastases), 골전이(bone metastases), 복부팽만(abdominal fullness), 더부룩함(bloating), 복막내 액체(fluid in peritoneal cavity), 질 출혈(vaginal bleeding), 변비(constipation), 복부팽만(abdominal distension), 결장 천공(perforation of colon), 급성 복막염(acute peritonitis)(감염, 발열, 통증), 통증, 혈토(vomiting blood), 과도한 땀(heavy sweating), 발열, 고혈압, 빈혈(anemia), 설사(diarrhea), 황달(jaundice), 어지럼증(dizziness), 오한(chills), 근육 경련(muscle spasms), 결장전이(colon metastases), 폐전이(lung metastases), 방광전이(bladder metastases), 간전이(liver metastases), 골전이(bone metastases), 신장전이(kidney metastases), 이자전이(pancreas metastases) 및 연하 곤란(difficulty swallowing) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 상술한 것으로부터, "암을 가지는 것으로 의심되는" 대상체는 관심이 있는 종들 내의 모든 대상체가 아님이 명확하다.
본 발명에서 설명된 하나 또는 그 이상의 변형된 N-글리코실레이션 분자들의 투여에 추가하여, 암은 또한 화학치료제(chemotherapeutic agents), 이온화 방사선(ionizing radiation), 면역치료제(immunotherapy agents), 또는 온열치료제(hyperthermotherapy agents)를 통해서 치료될 수 있다. 화학치료제들은 예를 들면, 시스플라틴(cisplatin), 카보플라틴(carboplatin), 프로카바진(procarbazine), 메클로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 캠토테신(camptothecin), 아드라이마이신(adriamycin), 이포스파마이드(ifosfamide), 멜파란(melphalan), 클로람부실(chlorambucil), 비술판(bisulfan), 니트로스우레아(nitrosurea), 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리코마이신(plicomycin), 마이토마이신(mitomycin), 에토포시드(etoposide), 베라파밀(verapamil), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 타목시펜(tamoxifen), 택솔(taxol), 트랜스플라티늄(transplatinum), 5-FU(5-flurouracil), 빈크리스틴(vincristin), 빈블라스틴(vinblastin), 및 메토트렉사트(methotrexate)를 포함한다.
(iii) 염증성 질환들(Inflammatory Disorder)
본 발명에서 사용된 "염증성 질환"은, 하나 또는 그 이상의 물질이(substances)(예를 들면, 상기 대상체 내에서 자연적으로 발생하지 않는 물질), 백혈구(예를 들면, B 세포(B cell), T 세포(T cell), 대식세포(macrophage), 단핵세포(monocyte), 또는 돌기 세포(dendritic cell))의 활동에 의해서 병리학적 반응, 예를 들면 병리학적 면역 반응을 촉발하는 과정을 언급한다. 따라서 상기 염증성 반응에 관여된 그러한 세포들은 "염증 세포들(inflammatory cells)"로 언급된다. 상기 부적절하게 촉발된 염증성 반응은 외부 물질(예를 들면, 항원, 바이러스, 박테리아, 균류)이 상기 대상체 내에 또는 상에 존재하지 않는 경우일 수 있다. 상기 부적절하게 촉발된 반응은 자기-성분(self-component)(예를 들면, 자기-항원)이 상기 염증 세포들에 의해서 타겟된 경우(예를 들면, 다발성 경화증(multiple sclerosis)와 같은 자기면역성 질환(autoimmune disorder))일 수 있다. 상기 부적절하게 촉발된 반응은 또한 예를 들면, 아나필락시스(anaphylaxis)와 같이 크기와 지속기간의 측면에서 부적절한 반응일 수 있다. 이에 따라, 부적절하게 타겟된 반응은 미생물 감염(예를 들면, 바이러스, 박테리아 또는 균류)의 존재 때문일 수 있다. 염증성 질환들(예를 들면, 자기면역성 질환)의 종류는 관절염(osteoarthritis), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis; RA), 척추관절병증(spondyloarthropathies), POEMS 증후군(POEMS syndrome), 크론병(Crohn's disease), 다중심성 캐슬만씨병(multicentric Castleman's disease), 전신홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus; SLE), 다중 경화증(multiple sclerosis; MS), 근육 영양 장애(muscular dystrophy; MD), 인슐린-의존 당뇨병(insulin-dependent diabetes mellitus; IDDM), 피부근염(dermatomyositis), 다발성근염(polymyositis), 길랭-바레증후군(Guillain Barre syndrome)과 같은 염증성 신경장애(inflammatory neuropathies), 베게너육아종증(Wegener's granulomatosus)과 같은 혈관염(vasculitis), 결절성다발성동맥염(polyarteritis nodosa), 류마티스성 다발성근육통(polymyalgia rheumatica), 측두동맥염(temporal arteritis), 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 베체트병(Bechet's disease), 처그스트라우스증후군(Churg-Strauss syndrome), 또는 타까야수동맥염(Takayasu's arteritis)을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 또한 비염(rhinitis), 부비동염(sinusitis), 심마진(urticaria), 두드러기(hives), 혈관부종(angioedema), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 음식 알레르기(food allergies)(예를 들면, 견과류 알레르기(nut allergy)), 약 알레르기(drug allergies) (예를 들면, 페니실린(penicillin)), 곤충 알레르기(insect allergies) (예를 들면, 벌침에 대한 알레르기), 또는 비만세포증(mastocytosis)과 같은 특정 종류의 알레르기도 염증성 질환에 포함된다. 염증성 질환은 또한 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 천식(asthma)도 포함할 수 있다.
"염증성 질환이 발병할 위험이 있는" 대상체란 하나 또는 그 이상의 염증성 질환들의 가족력(예를 들면, 하나 또는 그 이상의 염증성 질환들에 유전적 경향(genetic predisposition))을 갖거나 하나 또는 그 이상의 염증-유발 조건들에 노출된 대상체를 말한다. 예를 들면, 대상체는 포도구균성 장독소(staphylococcal enterotoxins; SEs), 화농연쇄상구균 외독소(streptococcus pyogenes exotoxin; SPE), 황색포도상구균 독성쇼크증후군 독소(staphylococcus aureus toxic shock-syndrome toxin; TSST-1), 연쇄상구균 미토게닉 외독소(streptococcal mitogenic exotoxin; SME) 및 연쇄상구균 슈퍼항원(streptococcal superantigen; SSA)과 같은, 하지만 이에 의해서 제한되지 않는 바이러스성 또는 박테리아성 슈퍼항원에 노출될 수 있다. 상술한 것으로부터, "질환이 발병할 위험이 있는" 대상체는 관심이 있는 종들 내의 모든 대상체가 아님이 명확하다.
"염증성 질병을 가지는 것으로 의심되는" 대상체란 하나 또는 그 이상의 염증성 질환의 증상들이 존재하는 대상체이다. 염증성 질환들의 증상들은 상기 기술분야에서 널리 알려져 있고, 발적(redness), 종착(swelling) (예를 들면, 부어오른 관절들(swollen joints)), 건드리면 따뜻한 관절들, 관절통(joint pain), 결림(stiffness), 관절 기능의 손실(loss of joint function), 열, 오한(chills), 피로, 에너지 손실(loss of energy), 두통, 식욕 감퇴(loss of appetite), 근육 결림(muscle stiffness), 불면증, 가려움, 비한(stuffy nose), 재채기, 기침, 현기증(dizziness), 발작(seizures), 또는 고통과 같은 하나 또는 그 이상의 신경학적 증상들(neurologic symptoms)을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 상술한 것으로부터, "염증성 질병을 가지는 것으로 의심되는" 대상체는 관심이 있는 종들 내의 모든 대상체가 아님이 명확하다.
본 발명에서 설명된 하나 또는 그 이상의 분자들의 투여에 추가하여, 염증성 질병은 또한 비스테로이드성 항염증약물(non-steroidal anti-inflammatory drug; NSAID), 질병-조절 항-류마티스약물(disease-modifying anti-rheumatic drug; DMARD), 생체반응조절물질(biological response modifier) 또는 코르티코스테로이드(corticosteroid)에 의해서 치료될 수 있다. 생체반응조절물질은 예를 들면, 항-TNF 물질(anti-TNF agent)을 포함할 수 있다. 항-TNF 물질의 비한정적인 예들은 용해성 TNF 수용체 또는 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 또는 에타너셉트(etanercept)와 같은 TNF에 특이적인 항체를 포함할 수 있다.
모든 변형된 N-글리코실레이션 분자들(또는 이의 약학 조성물들)을 이용하여, 여기에서 설명된 어떤 질병을 치료하는(예를 들면, 하나 또는 그 이상의 증상즐을 방지하거나 완화함) 적합한 방법들은 아래 부분에서 설명된다.
약학 성분들 및 치료 방법들
상기 원하는 N-글리칸을 갖도록 변형된 타겟 분자는 치료 효과가 있는 양의 상기 분자 및 하나 또는 그 이상의 보조제들(adjuvants), 부형제들(excipients), 운반제들(carriers) 및/또는 희석제들(diluents)을 포함하는 약학 성분으로 혼합될 수 있다. 허용되는 희석제들, 운반제들 및 부형제들은 일반적으로 수용자(recipient)의 항상성(homeostasis)(예를 들면, 전해질 균형)에 부정적인 영향을 미치지 않는다. 허용되는 운반제들은 생체에 적합한, 불활성의 또는 생체 흡수성 염들, 완화제들, 올리고당 또는 다당류들, 중합체들, 점성-개선제들, 방부제 등을 포함한다. 하나의 예시적인 운반제는 생리 식염수(0.15M NaCl, pH 7.0 내지 7.4)이다. 다른 예시적인 운반제는 50mM 인산나트륨, 100mM 나트륨 염화물이다. 약학 성분들의 제제(formulation) 및 투여(administration)에 관한 기술들에 대한 추가적인 세부사항들은, 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton, Pa.)에서 찾을 수 있다. 부가적인 활성 화합물들이 또한 상기 조성물들에 혼합될 수 있다.
N-글리칸들을 갖는 분자들을 포함하는 약학 조성물의 투여는 전체적이거나 부분적일 수 있다. 약학 조성물들은 비경구 및/또는 경구 투여에 적합하도록 제제로 형성될 수 있다. 특정 투여 양식들은 피하, 정맥, 근육내, 복강내(intraperitoneal), 경피성(transdermal), 척추강내(intrathecal), 구강(oral), 직장, 구강적(buccal), 국소, 비강, 눈, 관절내, 동맥내 , 지주막하(subarachnoid), 기관지, 림프, 질 및 자궁내 투여를 포함한다.
투여는 약학 조성물의 1회 분의 주기적인 주입이거나, 외부(예를 들면, 정맥용 백(IV bag)) 또는 내부(예를 들면, 생체부식성 임플란트, 생인공 기관, 임플란트된 변형된 N-글리코실레이션 분자 생산 세포들의 집단(colony of implanted altered N-glycosylation molecule production cell)) 저장소로부터 정맥 또는 복강내 투여를 통해서 중단되지 않거나 계속적 주입일 수 있다. 미국 특허등록번호 4,407,957, 미국 특허등록번호 5,798,113 및 미국 특허등록번호 5,800,828 참조. 약학 조성물의 투여는 다음과 같은 적합한 전달 수단들을 사용하여 달성될 수 있다: 상기 적합한 전달 수단들은 펌프(예를 들면, Annals of Pharmacotherap, 27:912 (1993); Cancer, 41:1270 (1993); Cancer Research, 44:1698 (1984)참조); 미세캡슐형성(microencapsulation)(예를 들면, 미국 특허등록번호 4,352,883; 4,353,888; 및 5,084,350 참조); 연속 방출 중합체 임플란트(continuous release polymer implants)(예를 들면, 미국 특허등록번호 4,883,666, Sabel 참조); 매크로 캡슐처리기술(macroencapsulation)(예를 들면, 미국 특허등록번호 5,284,761, 5,158,881, 4,976,859 및 4,968,733, 및 PCT 특허출원 WO92/19195, WO95/05452 참조); 피하로, 정맥 내로, 동맥 내로, 근육 내로 또는 다른 적합한 위치로 주입(injection); 또는 캡슐, 액체, 정제(tablet), 알약(pill) 또는 방출 지연 제제(prolonged release formulation)로 경구 투여를 포함할 수 있다.
비경구 전달 시스템의 예들은 에틸렌-비닐 아세테이트 공중합체 입자들(ethylene-vinyl acetate copolymer particles), 삼투압 펌프들, 이식용 투입 시스템들(implantable infusion systems), 펌프 전달(pump delivery), 캡슐화된 세포 전달(encapsulated cell delivery), 리포솜 전달(liposomal delivery), 침형-전달 주입(needle-delivered injection), 비침형 주입(needle-less injection), 네뷸라이저(nebulizer), 분무기(aerosolizer), 전기청공법(electroporation), 및 경피투여형 패치(transdermal patch)를 포함한다.
비경구 투여에 적합한 제제들은 편리하게 상기 수용자의 혈액(예를 들면, 생리 식염수)과 바람직하게 등삼투압인 상기 변형된 N-글리코실레이션 분자의 멸균 수성 제제(sterile aqueous preparation)를 포함한다. 제제들은 단위 용량 또는 다중 용량의 형태일 수 있다.
경구 투여에 적합한 제제들은 각각이 미리 정해진 양의 상기 변형된 N-글리코실레이션 분자를 포함하는 캡슐들, 봉인들(cachets), 정제(tablets) 또는 사탕(lozenge)과 같은 개별 단위로 존재하거나; 또는 시럽(syrup), 영약(elixir), 에멀션(emulsion) 또는 물약(draught)과 같은 수성 액체 또는 반-수성(non-aqueous liquid) 내에 현탄액일 수 있다.
국부 투여에 적합한 N-글리칸들을 포함하는 분자들은 예를 들면, 크림, 스프레이, 거품, 젤, 연고(ointment), 고약(salve) 또는 드라이 럽(dry rub)으로 포유류(예를 들면, 인간 환자)에 투여될 수 있다. 드라이 럽은 투여 위치에서 다시 수화될 수 있다. 그러한 분자들은 또한 직접적으로 (예를 들면, 침지되고 건조된) 반창고, 거즈 또는 패치로 스며들고, 이들은 국부적으로 적용될 수 있다. 그러한 분자들은 또한 국부적인 투여를 위해서 반창고, 거즈 또는 패치 내에서 반-액화, 겔화(gelled) 또는 액화(fully-liquid) 상태로 유지될 수 있다(미국 특허등록번호 4,307,717 참조).
치료 효과가 있는 양의 약학 성분이 상기 기술분야에 통상의 지식을 가진 자에 의해서 알아낼 수 있는 복용 요법으로 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 상기 대상체에, 예를 들면, 1회 복용당 상기 대상체의 몸무게를 기준으로 0.01㎍/㎏ 내지 10,000㎍/㎏의 복용량을 전신에 투여할 수 있다. 다른 예들에 있어서, 상기 복용량은 1회 복용당 상기 대상체의 몸무게를 기준으로 1㎍/㎏ 내지 100㎍/㎏일 수 있다. 다른 예들에 있어서, 상기 복용량은 1회 복용당 상기 대상체의 몸무게를 기준으로 1㎍/㎏ 내지 30㎍/㎏일 수 있고, 예를 들면 1회 복용당 상기 대상체의 몸무게를 기준으로 3㎍/㎏ 내지 10㎍/㎏일 수 있다.
치료 효과를 최적화하기 위해서, N-글리칸을 포함하는 분자들은 처음에 다른 복용 요법으로 투여될 수 있다. 상기 유닛 복용량 및 요법은 예를 들면, 포유류의 종들, 그 면역 상태, 상기 포유류의 몸무게를 포함하는 요인들에 의존한다. 전형적으로, 예를 들면, 적용된 치료 요법의 효과를 결정하는 것과 같은 임상적 검사 절차의 일부로서 적절한 스크리닝 분석들(screening assays)을 이용하여, 조직(tissue) 내에서 그러한 분자들의 레벨을 모니터한다.
분자에 대한 복용 빈도는 의료 행위자들(예를 들면, 의사 또는 간호사)의 기술 및 의학적 판단에 달려있다. 전형적으로, 상기 투여 요법은 최적화된 부여 변수들을 수립할 수 있는 의학적 시험들에 의해서 수립된다. 하지만, 상기 의료 행위자는 상기 대상체의 나이, 건강, 무게, 성별 및 의학적 상태에 따라서 그러한 투여 요법들을 변경할 수 있다. 복용 빈도는 상기 치료(treatment)가 예방목적(prophylactic)인지 치료목적(therapeutic)인지에 따라서 변경될 수 있다.
그러한 분자들 또는 이들의 약학 조성물들의 독성 및 치료 효과는 예를 들면, 세포 배양 또는 동물 실험과 같이 알려진 약학 절차에 의해서 결정될 수 있다. 이들 절차들은 예를 들면, LD50(모집단의 50%에 치명적인 복용량) 및 ED50(모집단의 50%에 치료 효과가 있는 복용량)을 결정하는데 이용될 수 있다. 독성 및 치료 효과들 사이에 복용량 비율(dose ratio)은 치료 지수(therapeutic index)이고, LD50/ED50 비율로 표현될 수 있다. 높은 치료 지수를 나타내는 약학 조성물들이 선호된다. 유독성 부작용을 나타내는 약학 조성물들이 사용될 수 있지만, 그러한 조성물들이 일반 세포들(타겟되지 않은 세포들)에 손상을 줄 가능성을 최소화하고 영향을 받는 조직들에 타겟하여, 부작용을 감소시킬 수 있도록 주의를 기울여야 한다.
세포 배양 분석 및 동물 실험으로부터 얻어진 데이터는 적절한 대상체들(예를 들면, 인간 환자들)에 사용되는 적절한 복용량의 범위를 결정하는데 이용될 수 있다. 그러한 약학 조성물의 복용량은 일반적으로 미세한 독성 또는 독성이 없는 ED50을 포함하는 순환 농도(circulating concentrations)의 범위 내에 있다. 상기 복용량은 이 범위 내에서 적용된 복용 형태 및 사용된 투여 경로에 따라서 변경될 수 있다. 본 발명에서 설명된 약학 조성물(예를 들면, 대상체 내에서 대사 이상(metabolic disorder)을 치료)에 대해서, 상기 치료 효과가 있는 복용량은 세포 배양 분석을 통해서 우선적으로 평가될 수 있다. 복용량은 세포 배양에서 결정된 IC50(즉, 증상의 반가-극대 억제(half-maximal inhibition)를 달성하는 약학 조성의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 동물 모델(animal model)에서 달성하도록 결정될 수 있다. 그러한 정보는 인간의 복용량을 보다 정확하게 결정하는데 유용하게 이용될 수 있다. 혈장 내에서 레벨은 예를 들면, 고성능 액체크로마토그래피에 의해서 측정될 수 있다.
본 발명에서 정의된 바와 같이, N-글리칸을 포함하는 분자의 "치료 효과가 있는 양"은 실험된 대상체 내에서 의학적으로 원하는 효과(예를 들면, 대사 장애의 하나 또는 그 이상의 증상들의 개선)를 생성할 수 있는 분자의 양이다. 치료 효과가 있는 양(즉, 유효 복용량)은 대상체 또는 샘플 무게 1킬로 그램당 밀리그램(milligram) 또는 마이크로그램(microgram)의 상기 조성물을 포함할 수 있다(예를 들면, 약 1마이크로그램/킬로그램 내지 약 500밀리그램/킬로그램, 약 100마이크로그램/킬로그램 내지 약 5밀리그램/킬로그램, 또는 약 1마이크로그램/킬로그램 내지 약 50마이크로그램/킬로그램).
상기 대상체는, 예를 들면 인간(예를 들면, 인간 환자), 또는 유인원(예를 들면, 침팬지, 개코원숭이 또는 원숭이), 생쥐(mouse), 쥐(rat), 토끼, 기니 돼지, 게르빌루스쥐(gerbil), 햄스터, 가축의 종류(예를 들면, 소, 돼지, 양 또는 염소), 개, 고양이 또는 고래와 같은 모든 포유류일 수 있다.
본 발명에서 설명된 분자 또는 이의 약학 조성물은 다른 치료, 예를 들면, 대사 장에(예를 들면, 리소좀 저장 장애)의 치료와 같은 다른 치료와 병용 치료로서 대상체에 투여될 수 있다. 예를 들면, 상기 병용 치료는 상기 대상체(예를 들면, 인간 환자)에, 대사 장애(예를 들면, 리소좀 저장 장애)가 발병할(또는 가지는 것으로 의심되는) 위험을 갖는 상기 대상체에 치료 효과를 제공하는 하나 또는 그 이상의 추가적인 물질(agent)을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 이에 따라, 상기 화합물 또는 학학 조성물 및 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 물질은 동시에 투여될 수 있다. 이와 달리, 상기 분자가 우선적으로 투여될 수 있고, 상기 하나 또는 그 이상의 추가적인 물질이 이후에 투여될 수 있으며, 그 반대일 수도 있다.
이전의 치료가 특히 유독성(얘를 들어 상당한 부작용을 갖는 대사 장애 치료)인 경우에, 본 발명에서 설명한 분자들의 투여는 독성없이 이전과 동일하거나 향상된 치료 효과를 줄 수 있도록 충분한 레벨로 이전의 치료의 양을 상쇄시키고/시키거나 감소시키는데 이용될 수 있다.
본 발명에서 설명된 모든 약학 조성물들은 용기(container), 팩(pack) 또는 디스펜서(dispenser) 내에 투여 지침과 함께 포함될 수 있다.
본 발명의 실시예들이 아래에서 설명된다. 이들은 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
실험예들
표 2는 아래에서 설명된 실험예들에서 사용되는 모든 스트레인들의 리스트를 포함한다. 표 2에서, MH = HDEL-tagged α-1,2-만노시다제; ζ = 제타 배열들을 통한 랜덤 삽입; 도킹(docking) Δ = 특정 locus로 삽입; 및 (H) = 하이드로마이신 내성(hygromycin resistant)
[표 2]
실험예들에서 이용된 스트레인들의 리스트
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
실험예 1: Yarrowia lipolytica OCH1 파열(disruption)
글리코-조작된(glyco-engineered) 단백질 표현 스트레인의 생성은 Yarrowia lipolytica 스트레인 po1d lnuga(영양요구성들(auxotrophies) leu2-. ura3-, gut2- 및 ade2- 을 갖는 스트레인) 내에서 수행되었다. Yarrowia lipolytica 내에서 상기 OCH1(젠뱅크 등록번호(GenBank Accession No): AJ563920) 유전자를 녹아웃(knock out)하는 전략은 LIP2 유전자(Fickers et al., 2003 J Microbiol Methods. 55(3):727-37)에 대해서 설명된 바와 같이 결정되었다. 상기 OCH1 유전자에 대한 유전자 (construction) 전략은 미국 특허공개번호 20090069232-A1에서 설명된다. 결과적인 벡터는 pYlOCH1 PUT TOPO로 명명된다(도 1B).
상기 OCH1 KO 단편은 SpeI/Bst1107I 제한 절단(restrict digest)에 의해서 상기 플라스미드로부터 분리되고, Yarrowia lipolytica 스트레인 po1d lnuga로 전환된다. 복수의 우라실 자가영양성(uracil prototrophic) 스트레인들은 유전체 DNA(gDNA)에서 프라이머 Yloch1 prom fw (5'-TCGCTATCACGTCTCTAGC-3', 서열 번호(SEQ ID NO):1) 및 Yloch1 term rev (5'-ACTCTGTATACTTGTATGTACTGTGAGAC-3', 서열 번호:2)을 이용하여 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해서 수득 및 스크린되어서, 상기 플라스미드의 상기 유전체 삽입(genomic integration)을 분석했다. 상기 적절한(correct) 크기의 단편(예를 들면, 야생형에서 2328bp vs. 1894bp)은 복수의 시험된 클론들(clones tested)에 대해 증폭되었다. 상기 OCH1 유전자의 상기 녹-아웃은 또한 상기 성장 배지로 분비된(secreted)(=시크리톰(secretome)) 상기 전체 글리코단백질 풀(pool)의 N-글리칸 분석에 의해서 확인되었다: Man8GlcNAc2 구조는 당 프로파일(sugar profile)(도 2) 내에서 지배적인 N-글리칸이 되었다. 이 프로파일은 보다 많은 양의 만노스 잔류물들을 갖는 일부 구조들을 포함할 뿐만 아니라 보다 많은 양의 Man9GlcNAc2를 포함하는(상기 후자는 대부분 Och1p 활성(activity)의 결과로서 추가적인 만노스(mannose)를 포함함) 상기 야생형(wild-type) 스트레인의 프로파일과 다르다.
상기 URA3 유전자를 제거하기 위해서, 양성 Δoch1 클론(positive Δoch1 clone)(G013으로 명명됨, 표 2 참조)은 Cre 재조합효소(Cre recombinase)에 대한 발현 카세트(expression cassette)를 포함하는 에피소말 플라스미드 pUB4-Cre(episomal plasmid pUB4-Cre)(Fickers et al., 2003, supra)와 함께 전환된다. 상기 URA3 유전자의 제거가 프라이머 Yloch1 prom fw 및 Yloch1 term rev(상술한 설명 참조)를 이용하여 gDNA 상에서 PCR에 의해서 스크린된다. 상기URA3 마커가 적출된 클론들은 더 이상 2328bp 밴드(band)를 증폭시키지 않고; 대신 1075bp의 PCR-단편(URA3 제외)이 수득된다. 양성 클론들은 상기 시크리톰(secretome)의 상기 N-글리칸 수준에서 체크되고, 상기 치유되지 않은 스트레인(non-cured strain)의 프로파일과 매우 유사한 프로파일을 나타낸다(도 2). 상기 치유된 스트레인들 중 하나(G014로 불림, 표 2 참조)는 추가적인 N-글리칸 조작을 위해서 선택되었다.
실험예2: 랜덤 삽입 또는 타겟된/도킹된 삽입에 의한 ER-잔류 α-1,2-만노시다제(ER-retained α-1,2-mannosidase)의 과도발현
Δoch1 스트레인에 의해서 발현된 글리코단백질들에 부착되는 Man5GlcNAc2의 생성을 가능하게 하기 위해서, α-1,2-만노시다제는 발현되어서 Man8GlcNAc2를 Man5GlcNAc2(예를 들면, 골지형(Golgi type) α-1,2-만노시다제 활성)에 달라붙게(cleave) 한다. 그러한 만노시다제는 상기 분비 시스템에 타겟되어야 한다. S. cerevisiae 프리프로 교배인자(S. cerevisiae prepro mating factor)에 융합되고 HDEL 배열(서열 번호:21)로 표식화되어서 상기 ER 내로 국부화시키는 Trichoderma reesei α-1,2-만노시다제(젠뱅크 등록번호: AF212153)는 생체내에서 Trichoderma reesei 및 Aspergillus niger 내뿐만 아니라 Pichia pastoris내에서 Man8GlcNAc2를 Man5GlcNAc2로 손질할(trim) 수 있다. 상기 HDEL-tagged T. reesei α-1,2-만노시다제의 코돈-최적화된 버전이 Y. lipolytica LIP2 사전 시그널 배열(pre signal sequence)에 융합되고, TEF1, Hp4d(Madzak et al., 2000, J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2:207-216), GAP 또는 POX2 프로모터의 전사 조절 하에 위치하는 곳에서 발현 콘스트럭트(expression constructs)가 형성되었다. 이들 플라스미드들의 (construction) 전략은 미국 특허공개번호 20090069232-A1에서 설명된다.
이들 벡터들 중에서 2개, pYLHUXdL2preManHDEL 및 pYLTUXdL2preManHDEL(도 3)는 상기 Hp4d resp. TEF1 프로모터의 전사 조절 하에 있는 상기 만노시다제와 함께 스트레인(G014)(실험예 1에서 얻어짐)을 전환하는데 이용된다. 상기 벡터들은 NotI로 절단되어서, 상기 제타 배열들(zeta sequence)을 통해서 상기 게놈으로 랜덤 삽입을 가능하게 한다. URA3 자가영양성 형질전환체들은 N-글리칸 분석을 위해 선택되었다. 복수의 형질전환체들은 Man5GlcNAc2로 Man8GlcNAc2가 명확하게 전환되는 것을 보여준다(도 4). TEF1 프로모터 조절 하에서 상기 만노시다제를 발현하는 클론들이 느리고 투박한 성장 표현형(growth phenotype)(이들 클론들 중에서 하나는 G016으로 명명됨)을 나타내므로, 글리코-조작에서 추가적인 단계들이 상기 유전자가 Hp4d 전사 조절 하에 있는 스트레인 백그라운드(background) 내에서 수행되었다.
상기 Hp4d 프로모터(G018)의 조절 하에서 ManHDEL을 발현하는 하나의 양성 클론이 선택되었고, 이로부터 상기 URA3 마커는 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드 pRRQ2 (Richard et al., 2001 J. Bacteriol. 183:3098-3107)의 일시적인 전환을 통해서 치유되었다. 복수의 ura3- 클론들은 상기 과정 이후에 선택되었고, 상기 시크리톰 상에서 명백한 Man5GlcNAc2 프로파일을 나타내는 하나의 클론(G036)은 추가적인 조작 작업(engineering work)에 이용되었다(도 4). 이 클론의 서던 분석(Southern analysis)은 하나의 랜덤으로 삽입된 만노시다제 발현 카세트의 존재를 확인시켰다. 이 서던 분석은 프라이머 Man for (5'-GCCTTCCAGACCTCTTGGAACGCCTACCACC-3', 서열 번호:22) 및 Man rev (5'-GCCAGGTGGCCGCCTCGTCGAGAAGAAGATCG-3', 서열 번호:23)를 이용하여 생성된 DIG-labeled 만노시다제-특정 PCR 단편(DIG-labeled mannosidase-specific PCR fragment)을 이용하는 Hind III 절단된 유전체 DNA 상에서 수행되었다.
이와 다른 전략에서, 상기 Hp4d-driven 만노시다제 발현 카세트의 상기 Yarrowia 게놈의 상기 LEU2 또는 AXP1 locus로 타겟된 삽입을 허용하도록 하는 2개의 콘스트럭트들(constructs)이 생성되었다. 이들 플라시미드들의, JME926_pPTLeu2-ADE2ex-Hp4dManHDEL(Yl) 및 OXYP289_pPTAxp1-LEU2ex-Hp4dManHDEL(Yl), 콘스트럭션(construction)이 도 5에서 도시된다. 스트레인 G014로의 전환 이전에, 양쪽 콘스트럭트들은 NotI로 절단되고, 각각의 발현 카세트들은 분리되었다. 선택된 ADE2 자가영양성 클론들은 잠재적으로 상기 만노시다제 발현 카세트를 상기 LEU2 locus로 삽입시켰고, 반면에 LEU2 자가영양체들(prototrophs)은 잠재적으로 상기 카세트를 상기 AXP1 locus로 삽입시켰다. 상기 형질전환체들은 서던 분석에 의해서 체크되어서, 상기 게놈으로의 적절한 타겟팅(targeting)을 평가한다. 이것은 프라이머 Man for (5'-GCCTTCCAGACCTCTTGGAACGCCTACCACC-3', 서열 번호:22) 및 Man rev (5'-GCCAGGTGGCCGCCTCGTCGAGAAGAAGATCG-3', 서열 번호:23)을 이용하여 생성된 DIG-labeled 만노시다제-특정 PCR 단편을 이용하는 Hind III 절단된(AXP1 locus 내 삽입) 또는 BamH1 절단된(LEU2 locus내 삽입) 유전체 DNA 상에서 수행되었다. 상기 선택된 클론들은 또한 상기 분비된 글리코단백질들 상으로 합성된 상기 N-글리칸의 특성(nature)에 대해서 체크되었다. 대부분의 경우들에서, 적절하게(correctly) 타겟된 Hp4d-driven α-1,2-만노시다제 발현은 대부분 Man5GlcNAc2 올리고당(oligosaccharides)의 합성을 야기한다(도 6). 각각의 타겟팅 locus에 대해서, 하나의 만노시다제 발현 클론(LEU2 도킹의 경우 G046; AXP1 도킹의 경우 G053)은 스트레인 G046에 대해서 플라스미드 pRRQ2를 이용하고, 스트레인 G053에 대해서 플라스미드 pUB4-Cre를 이용하는 Cre 재조합효소의 일시적인 발현을 통한 치유를 위해서 선택되었다. 상기 결과적인 치유된 스트레인들(각기 G055 및 G054)은 서던 블롯팅(Southern blotting)을 통해서 체크되었고, 이들의 Man5GlcNAc2 프로파일은 DSA-FACE를 이용하는 N-글리칸을 통해서 확인되었다.
실험예 3: GlcNAc-트랜스페라제(transferase) I의 발현
Yarrowia 코돈-최적화된 배열은 S. cerevisiae Kre2 단백질(SwissProt AccNo P27809)의 첫 번째 100 N-말단 아미노산들(first 100N-terminal amino acids)과 그에 뒤이은 인간 GlcNAc-트랜스페라제 I(SwissProt AccNo P26572)(도 7, 서열 번호:3 및 서열 번호:4)의 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질의 발현을 위해서 생성되었다. 상기 효모(yeast) Kre2p 100 N-말단 아미노산들은 촉매 GnT I 도메인을 위한 골지 국부 시그널(Golgi localization signal)로 역할을 한다. 이러한 방식으로, 효소가 상기 단백질-연계된(protein-linked) N-글리칸들을 Man5GlcNAc2로부터 GlcNAcMan5GlcNAc2로 전환하는 것을 가능하도록 하기 위해서, 상기 GnT I 융합 단백질은 상기 분비 경로 내에서 상기 ER-retained HDEL-tagged α-1,2-만노시다제보다 늦은 위치에서 국부화된다. 상기 융합 단백질의 상기 발현을 위한 상기 코돈 최적화된 합성 유전자는 상기 TEF1 또는 상기 Hp4d 프로모터의 전사 조절 하에 위치하여서, 상기 플라스미드 pYLTmAXhGnTI 및 pYLHp4mAXhGnTI를 발생시켰다. 상기 (construction) 전략은 도 8에 도시된다. Kre2-GnT I 융합 단백질의 기능적 발현은 상기 가능한 Man5GlcNAc2 글리칸들 상으로 β-1,2-linked GlcNAc 잔류물의 추가를 야기하여야 하고, 결과적으로 GlcNAcMan5GlcNAc2를 합성을 야기했다.
상기 플라스미드 pYLTmAXhGnTI 및 pYLHp4mAXGnTI은 그 분비된 단백질들 상에 Man5GlcNAc2 N-글리칸들을 생산하는 것으로 알려진 스트레인 G036(실험예 2 참조)으로 전환되기 이전에, NotI 절단되었다. 형질전환체들은 우라실 자가영양성으로 선택되었다. 이들 클론들 중에 복수의 상기 시크리톰 상에서 상기 N-글리코실레이션 프로파일의 분석은 상기 N-글리칸 패턴에서 명확한 변화를 나타냈다: 상기 Man5GlcNAc2는 상당히 감소되었고, 보다 큰 분자량(약 1개의 글루코스 유닛 추가)을 갖는 N-글리칸을 나타내는 새로운 피크(peak)가 나타났다. 말단 베타-연관(terminal β-linked) GlcNAc 잔류물들을 제거할 수 있는 효소인 Jack Bean β-N-acetylhexosaminidase와 함께 분리된 N-글리칸들의 처리는 상기 새로운 N-글리칸이 GlcNAcMan5GlcNAc2임을 나타냈다: 상기 새로운 피크는 사라졌고, Man5GlcNAc2로 완전히 전환되었다(도 9). 상기 이용된 배양 방법에 따라, 상기 가능한 Man5GlcNAc2의 약 77%는 전환됨과 함께 상기 전체 N-글리칸 풀의 약 70%가 GlcNAcMan5GlcNAc2임이 증명되었다.
상기 TEF1 프로모터의 조절 하에서 상기 Kre2-GnT I 융합 단백질을 발현하는 하나의 형질전환체는 스트레인 G040으로 명명되고, 추가적인 이용을 위해서 선택되었다. 서던 블롯법(Southern blot)을 통한 이 스트레인의 게놈 분석은 하나의 발현 카세트의 존재를 나타냈다. 서던 분석은 5'-GGATGATCACACAATGGCCCTGTTTCTG-3' (서열 번호:5) 및 5'-TGCTCTAGACTAGTTCCAAGAGGGGTC-3' (서열 번호:6) 프라이머들을 이용하여 형성된 DIG-labeled GnT I-specific PCR fragment를 이용하는 BamHI 절단된 유전체 DNA 상에서 수행되었다. Hp4d-driven Kre2-GnT I 발현 카세트의 1 내지 3 카피들(동일한 서던 블롯법을 통해 확인됨)을 운반하는 스트레인들 대 스트레인 G040의 상기 시크리톰 상의 상기 글리코실레이션 프로파일의 분석은 GlcNAc-전환 용량에서 의미있는 차이를 보이지 않았다.
실험예 4: 만노시다제 II의 발현
Yarrowia 코돈-최적화된 배열은 S. cerevisiae Mnn2 단백질(SwissProt AccNo P38069)의 첫 번째 36 N-말단 아미노산들과 그에 뒤이은 Drosophila melanogaster 만노시다제 II(SwissProt AccNo Q24451)(도 10, 서열 번호:7 및 서열 번호:8)의 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질의 발현을 위해서 생성되었다. 효모 Mnn2 36 N-말단 아미노산들은 상기 촉매 Man II 도메인을 위한 골지 국부 시그널(Golgi localization signal)로 역할을 한다. 이러한 방식으로, 상기 Mnn2-Man II 융합 단백질이 상기 분비 경로 내에서 상기 Kre2-GnT I 융합 단백질과 동일하거나 보다 늦은 위치에 국부화되고, 이에 따라 GlcNAcMan5GlcNAc2를 GlcNAcMan3GlcNAc2로 전환할 수 있다. 상기 융합 단백질의 발현을 위한 상기 Yarrowia 코돈 최적화된 합성 유전자는 상기 TEF1 프로모터의 전사 조절 하에 위치하고, 플라스미드 pYLTmAXDmManII 및 pYLTmAXDmManII(LEU2ex)을 발생시켰다. 상기 (construction) 전략은 도 11에 도시된다.
플라스미드 pYLTmAXDmManII (LEU2ex)는 그 분비된 단백들 상에 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 생산하는 것으로 알려진 스트레인 G040(참조 실험예 3)으로 전환되기 전에, NotI 절단되었다. 형질전환체들은 류신 자가영양성으로 선택되었다. 이들 클론들 중에서 복수의 상기 시크리톰 상에서 상기 N-글리코실레이션 프로파일의 분석은 상기 N-글리칸 패턴에서 변화를 나타냈다: 약 2개의 글루코스 유닛들만큼 작은 분자량을 갖는 N-글리칸을 나타내는 새로운 피크(peak)가 나타났고, 이는 GlcNAcMan3GlcNAc2의 형성 및 이에 따라 부분적인 만노시다제 II 활성을 나타낼 수 있다. 또한 다른 피크가 Man5GlcNAcS와 거의 동일한 위치에서(예를 들면 상기 피크의 숄더) 나타났고 이는 잠재적으로 GlcNAcMan4GlcNAc2를 나타낸다. 후자의 구조는 상기 만노시다제 II 활성(mannosidase II activity)이 2개 대신에 오직 하나의 만노스만을 제거하는 부분적인 트리밍(trimming) 사건의 결과일 수 있다. Jack Bean β-N-acetylhexosaminidase와 함께 분리된 N-글리칸들의 처리는 상기 글리칸 패턴을 약 하나의 글루코스 유닛만큼 좌측으로 이동시키고, 이에 따라 말단 GlcNAc 잔류물의 손실로 인해서 보다 높은 전기영동 이동도를 야기했다(도 12). 이것은 추가적으로 기능적인 만노시다제 II 활성의 발현으로 인해서 GlcNAcMan5GlcNAc2로부터 GlcNAcMan4GlcNAc2 및 GlcNAcMan3GlcNAc2의 형성을 확인시킨다. 상기 이용된 배양 방법에 따라, 상기 전체 N-글리칸 풀의 약 15%는 GlcNAcMan3GlcNAc2임이 입증되었고: 상기 가능한 GlcNAcMan5GlcNAc2의 약 35%가 하나 또는 2개의 만노스 잔류물들을 손실하였고, 20%는 완전히 GlcNAcMan3GlcNAc2로 손질되었다(trimmed).
실험예 5: 갈락토실트랜스페라제(galactosyltransferase) I의 발현
말단 갈락토오스 잔류물들와 함께 N-글리칸들의 합성은 상기 분비 경로 내에 기능적이고 적절히 국부화된 갈락토실트랜스페라제의 존재에 의존할 뿐만 아니라, 상기 효소에 의해서 이용되는 도너 기질(donor substrate)인 UDP-Gal의 이용 가능성에도 의존한다. 비록 UDP-G1c 및 UDP-G1cNAc가 일반적으로 효모 유기체들의 골지체 내에서 충분히 이용 가능하다고 생각되지만, UDP-Gal에 대해서는 알려진 것이 적다. 글리코-조작하는 동안 잠재적인 UDP-Gal 결핍을 극복하기 위해서, Pichia pastoris에서 Schizosaccharomyces pombe UDP-Glc-4-에피머라아제(epimerase) (GAL10 like gene SPBC365.14c -SwissProt AccNo Q9Y7X5에 의해서 부호화됨)의 융합 단백질 및 인간 β-1,4-갈락토실트랜스페라제 I(GalT I) (SwissProt AccNo P15291)의 촉매 도메인을 상기 효모 골지체로 타겟하는 이전의 시도들이 있었다(Bobrowicz et al., Glycobiology 14(9):757-766, 2004). Gal10p-GalT I 융합 단백질을 상기 분비 경로, 바람직하게 GlcNAc-전환 및 만노시다제 II 활성이 분비될 단백질들의 N-글리칸들 상에서 이미 역할을 하는 위치에 국부화하는 것은 S. cerevisiae Mnn2p의 첫번째 46N-말단 아미노산을 N-말단 타겟 신호(N-terminal targeting signal)로 이용함으로써 달성되었다.
따라서 Yarrowia 코돈-최적화된 배열은 S. cerevisiae Mnn2 단백질의 첫 번째 46 N-말단 아미노산들과 그에 뒤이은 S. pombe Ga110-유사 단백질 및 인간 GalT I의 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질의 발현을 위해서 생성되었다(도 13). 상기 결과적인 합성 유전자는 TEF1 프로모터의 전사 조절 하에서 위치하고, 플라스미드 pYLTmAXSpGal10hGalTI 및 pYLTmAXSpGal10hGalTI (ADE2ex)를 야기한다. 상기 (construction) 전략은 도 14에 도시된다.
플라스미드 pYLTmAXSpGal10hGalTI (ADE2ex)는 그 분비된 단백들 상에 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 생산하는 것으로 알려진 스트레인 G040(실험예 3 참조)으로 전환되기 전에, NotI 절단되었다. 형질전환체들은 아데닌 자가영양성으로 선택되었다. 이들 클론들 중에서 복수의 상기 시크리톰 상에서 N-글리코실레이션 프로파일의 분석은 상기 N-글리칸 패턴에서 변화를 나타냈다: 새로운 피크가 Man7GlcNAc2와 Man8GlcNAc2 사이의 위치에서 나타난다(도 15). Streptococcus pneumonia β-1,4-갈락토시다제(galactosidase)와 함께 N-글리칸들의 처리는 상기 피크가 GalGlcNAcMan5GlcNAc2를 나타내는 것을 의미하고, 이로 인해서 생체외 절단은 이 새로운 피크의 사라짐과 GlcNAcMan5GlcNAc2에서 동일하게 높은 증가를 야기한다.
이 설정(set-up)을 이용하고, 상기 성장 조건들에 따라, GlcNAcMan5GlcNAc2의 약 75%가 GalGlcNAcMan5GlcNAc2로 전환되었다. 상기 갈락토실화된 구조의 전체 양은 전체 N-글리칸 풀의 약 25%를 차지했다. 생체외 α-1,2-만노시다제 절단으로부터, 하지만, 고-만노스 N-글리칸들(high-mannose N-grycans)의 상당한 양이 Man5GlcNAc2로 전환되지 않은 것이 명백하다(도 15). 상기 이용된 배양 배지에 따라, Man5GlcNAc2의 GlcNAcMan5GlcNAc2로의 전환율은 상기 G040 모 스트레인(G040 parent strain) 내에서 관찰된 값보다 작다. 이것은 대부분 Mnn2-Gal10-GalT I 융합 단백질의 형질전화체들에서 관찰되는 비교적 늦은 성장률과 관계된다.
실험예 6: YlALG3의 녹아웃 및 YlALG6의 동시 과도발현
Man3GlcNAc2 플랫폼(platform)의 형성을 허용하기 위해서, 스트레인 G036(po1d lnuga Δoch1 + Hp4d-driven α-1,2-만노시다제)의 ALG3 유전자는 비활성화될 필요가 있다. 이것은 상기 ER-localized Alg3p α-1,6-mannosyltransferase 활성의 손실을 야기하고, 상기 지질-연관(lipid-linked) N-글리칸 전구체 구조의 조성을 변화시킨다. 미완성 폴리펩티드 사슬의 N-글리코실레이션 위치(N-glycosylated site)로의 이 구조의 전환은 상기 효모 글리코실레이션 프로파일을 상기 만노시다제 II를 발현할 필요없이 포유류-유사 N-글리칸 구조들로 전환하는 것을 가능하게 한다. 하지만, 이 새로운 지질-연관 구조는 효율적으로 미완성 폴리펩티드들로 전환되지 않기 때문에, Yarrowia ALG6 유전자(ER-localized Alg6p a-1,3-glucosyl transferas를 엔코딩함)는 동시 과도발현(overexpressed simultaneously)되어서 가능한 많이 잠재적인 단백질 언더글리코실레이션(underglycosylation)를 감소시킬 필요가 있다.
pYLalg3PUT-ALG6으로 명명된 벡터(도 16)는 이미 제조되어서, YlALG3의 동시 녹아웃과 YlALG6의 Hp4d-driven 과도발현을 가능하게 한다. 미국 특허공개번호 20090069232-A1 참조. 이 녹-아웃/녹-인(knock-out/knock-in) 카세트를 포함하는, 벡터의 NotI/PacI 단편은 Yarrowia lipolytica G036로 전환되었고, 형질전환체들은 이들의 우라실 자가영양체에 근거하여 선택되었다. 상기 콘스트럭트(construct)를 적절하게 삽입한 클론들은 상기 시크리톰 상에서 N-글리칸 분석을 통해서 직접적으로 스크린되었다. 80개의 스크린된 클론들 중에서, 2개의 클론들은 ER-located α-1,2-만노시다제를 발현하는 스트레인 내에서 YlALG3의 비활성화에 적합한 N-글리코실레이션 프로파일을 나타냈다. 부분 Man3GlcNAc2 글리칸들과 달리, 상당한 양의 글루코실화된(glucosylated) N-글리칸들(GlcMan5'GlcNAc2 및 Glc2Man5'GlcNAc2) 뿐만아니라 일부 Man4'GlcNAc2 및 Man5'GlcNAc2 들도 여전히 존재했다. 전자는 글루코시다아제(glucosidase) II (Grinna and Robbins, J. Biol. Chem. 255, 2255-2258, 1980)에 의한 비효율적인 트리밍(trimming)의 결과이다. Man4GlcNAc2 및 Man5GlcNAc2의 상기 구조들의 특성은 α-1,2-만노시다제와 함께 N-글리칸들의 생체외 처리에 의해서 확인되었다(도 17). 이용된 상기 성장 조건들에 따라서, Man3GlcNAc2의 레벨은 전체 N-글리칸 풀의 60%까지 증가할 수 있고, 상기 글루코실화된(glucosylated) 피크들은 α-1,2-만노시다제를 향해서 둔감해지고, 오직 Jack Bean α-만노시다제 처리(α-1,2-, α-1,3- 및 α-1,6 연관 만노스 잔류물 상에서 역할할 수 있는 특정 α-만노시다제)를 향해서 미세하게 민감해진다. 반면에, 후자의 효소는 상기 생성된 Man3GlcNAc2를 Man1GlcNAc2로 전환시킨다(도 17).
2개의 양성 형질전환체들 중에서 하나는 G039로 명명되고, 추가적인 글리코-조작 작업에 이용된다. 상기 스트레인은 상기 Cre-재조합효소를 발현하는 pRRQ2와 함께 일시적으로 전환되어서, pYLalg3PUT-ALG6 벡터와 함께 G036의 전환이 도입되는 상기 URA3 마커의 치유를 가능하게 했다. 분석은 상기 글리코실레이션 프로파일이 치유 후에 동일하게 남아있음을 나타낸다. 하나의 치유된 스트레인은 추가적인 이용을 위해서 선택되고, G045로 명명된다.
실험예 7: 스트레인을 생산하는 Man 3 GlcNAc 2 내에서 GlcNAc-트랜스페라제 I의 발현
실험예 3에서 수행한 것과 유사하게, GnT I 활성의 도입은 Kre-GnT I 융합 단백질의 발현을 통해서 달성되었다. GnT I의 발현 콘스트럭트와 같은 랜덤 삽입은 3가지 방식으로 달성되었다. 1)치유되지 않은 스트레인 G039(실험예 6　참조)는 상기 NotI 절단된 벡터 pYLTmAXhGnTI (Hygr ex)와 함께 전환되고, 클론들을 발현하는 GnT I는 이들의 활성에 기반하여 우선적으로 선택되어서 상기 선택 플레이트들에 추가된 300 ㎍/ml의 히그로마이신(hygromycin)이 생존하도록 했다, 2) 상기 치유된 스트레인 G045(실험예 6 참조)는 상기 NotI 절단된 벡터 pYLTmAXhGnTI (실험예 3 참조)와 함께 전환되고, 클론들을 발현하는 GnT I는 이들의 우라실 자가영양성에 기반하여 우선적으로 선택되었다, 3) 상기 치유된 스트레인 G045(실험예 6 참조)는 상기 NotI 절단된 벡터 pYLHp4mAXhGnTI와 함께 전환되고, 클론들을 발현하는 GnT I는 이들의 우라실 자가영양성에 기반하여 우선적으로 선택되었다. pYLTmAXhGnTI (Hygr ex)의 (construction) 전략은 도 18에 도시된다. 플라스미드 pYLTmAXhGnTI (Hygr ex) 및 pYLTmAXhGnTI을 이용할 때, GnT I의 발현은 상기 TEF I 프로모터의 전사 조절 하에 위치하였고; 플라스미드 pYLHp4mAXhGnTI를 이용할 때, 상기 GnT I 발현은 Hp4d 프로모터의 조절 하에 있었다.
pYLTmAXhGnTI (Hygr ex)와 함께 G039의 전환은 예상했던 것보다 긴 배양 기간 후에, 상기 배양 플레이트들 상에 생겨난 3개의 클론들을 야기했다. 하지만, 이들 클론들의 상기 시트리톰의 N-글리코실레이션 프로파일의 분석은 상기 N-글리칸 패턴에서 명백한 변화를 나타냈다: 상기 비-전환된 G039 스트레인 내에서 상기 Man3GlcNAc2의 존재는 상당히 감소되거나 거의 완벽하게 없어지는 반면에, 보다 높은 분자량(약 하나의 글루코스 유닛 추가)을 갖는 N-글리칸을 나타내는 새로운 피크가 나타났다. 말단 베타-연관 GlcNAc 잔류물을 제거할 수 있는 효소인 Jack Bean β-N-acetylhexosaminidase와 함께 분리된 N-글리칸들의 처리는 새로운 N-글리칸이 실제로 GlcNAcMan3GlcNAc2임을 나타냈다. 상기 새로운 피크는 사라졌고, Man3GlcNAc2로 완벽히 전환되었다(도 19). 평가된 형질전환체들 중에 하나는 추가적인 글리코-조작 작업이 이용되고, G047로 명명되었다. 상기 치유된 스트레인 G045가 pYLTmAXhGnTI (G048) 또는 pYLHp4mAXhGnTI (G056)와 함께 전환될 때, 유사한 결과들이 또한 얻어졌다. 스트레인 G056은 플라스미드 pRRQ2를 이용하는 상기 Cre 재조합효소의 일시적인 발현을 통한 치유를 위해서 선택되었다. 상기 결과적인 스트레인은 G058로 명명된다.
상기 이용된 배양 방법에 따라, 스트레인 G047의 상기 전체 N-글리칸 풀의 약 70%가 일부 남아있는 Glc1-2Man5'GlcNAc2와 함께 GlcNAcMan3GlcNAc2로 밝혀졌고, Man3GlcNAc2는 거의 존재하지 않는다(전환율>>90%)(도 19). 상기 높은 전환율에 관계없이, 오직 한 카피의 상기 GnT I 발현 카세트가 서던 블롯법을 통해서 이 스트레인 내에서 식별될 수 있었다. 서던 분석은 5'-GGATGATCACACAATGGCCCTGTTTCTG-3'(서열 번호:11) 및 5'-TGCTCTAGACTAGTTCCAAGAGGGGTC-3' (서열 번호:12) 프라이머들을 이용하여 형성된 DIG-labeled GnT I-specific PCR fragment을 이용하는 BamHI 절단된 유전체 DNA 상에서 수행되었다.
이와 다른 전략에서, 콘스트럭트 JME925 pPTAde2-URA3ex-Hp4dhGnTI는 형성되어서, 상기 Yarrowia 게놈의 ADE2 locus로 Hp4d-driven GnT I 발현 카세트의 타겟된 삽입을 가능하게 한다. 상기 (construction) 전략은 도 20에 도시된다. 스트레인 G045로 전환하기 전에, 상기 플라스미드는 NotI 절단되고, 상기 타겟/발현 카세트는 분리된다. 형질전환체들은 이들의 아데닌 자가영양성에 기반하여 선택되었다. 상기 ADE2 locus로 상기 발현 카세트의 적절한(correct) 삽입은 정방향 프라이머(forward primer) Ver1Ade2 (5'-CGACGATAGAGCAGGTCTCACTGTTGGGAATGCTG-3', 서열 번호:13) 역방향 프라이머(reverse primer) Ver2Ade2 (5'-CTACACTGACGAAGTGGACATCCCGGCTTGGACTG-3', 서열 번호:14)를 이용하는 PCR을 통해서 체크되고, 서던 블롯팅을 통해서 추가적으로 확인되었다. 이것은 5'-GGATGATCACACAATGGCCCTGTTTCTG-3' (서열 번호:15) 및 5'-TGCTCTAGACTAGTTCCAAGAGGGGTC-3' (서열 번호:16) 프라이머들을 이용하여 형성된 DIG-labeled Gnt I-specific PCR fragment를 이용하는 BamHI/SpeI 절단된 유전체 DNA 상에서 수행되었다. 상기 시크리톰 상으로 GlcNAcMan3GlcNAc2의 합성은 N-글리칸 분석 및 생체외 Jack Bean β-N-acetylhexosaminidas 처리를 통해서 확인되었다(도 21). 하나의 GnT I 발현 형질전환체(G057로 명명됨)는 플라스미드 pRRQ2를 이용하는 Cre 재조합효소의 일시적인 발현을 통해서 치유되도록 선택된다. 상기 결과적인 스트레인은 G059로 명명된다.
실험예 8:　GlcNAc-트랜스페라제(transferase) II의 발현
Yarrowia 코돈-최적화된 배열은 S. cerevisiae Mnn2 단백질(SwissProt AccNo P38069)의 첫 번째 36 N-말단 아미노산들과 그에 뒤이은 rat GlcNAc-트랜스페라제 II (GnT II) (SwissProt AccNo Q09326) (도 22, 서열 번호:17 및 서열 번호:18)의 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질의 발현을 위해서 형성된다. 상기 효모 Mnn2 36 N-말단 아미노산들은 상기 촉매 GnT II 도메인을 위한 골지 국부 시그널(Golgi localization signal)로 역할을 한다. 이러한 방식으로, 상기 Mnn2-GnT II 융합 단백질은 상기 분비 경로 내에서 상기 Kre2-GnT I (및 Mnn-Man II) 융합 단백질과 동일하거나 보다 늦은 위치에 국부화되고, 따라서 GlcNAcMan3GlcNAc2를 GlcNAc2Man3GlcNAc2로 전환하는 것을 가능하다. 상기 융합 단백질의 발현을 위한 합성 유전자는 상기 TEF1 프로모터의 전사 조절 하에 위치하고, 플라스미드 pYLTmAXrGnTII 및 pYLTmAXrGnTII(ADE2ex)을 야기한다. 상기 (construction) 전략은 도 23에 도시된다.
상기 GnT II 활성을 발현하는 스트레인은 2개의 다른 방식으로 형성되었다. 1) 스트레인 G045(실험예 6 참조)는 NotI 절단된 pYLTmAXhGnTI 및 NotI 절단된 pYLTmAXrGnTII (ADE2 ex)와 함께 동시에 전환되었고, 형질전환체들은 이들의 우라실 및 아데닌 자가영양성에 기반하여 선택되었다 또는 2) 스트레인 G047(실험예 7 참조)은 NotI 절단된 pYLTmAXrGnTII (ADE2 ex)와 함께 전환되었고, 형질전환체들은 이들의 아데닌 자가영양성에 기반하여 선택되었다. 상기 발현 카세트들의 삽입은 정방향 프라이머 TefPromFW 5'-GTCCCCGAATTACCTTTCC-3' (서열 번호:19) 및 역방향 프라이머 Lip2TermRV 5'-AGGTAGAAGTTGTAAAGAGTG-3' (서열 번호:20)을 이용하여 체크되었다. Jack Bean β-N-acetylhexosaminidase와 함께 상기 분리된 당들(sugars)의 생체외 처리와 조합하여 상기 시크리톰 상의 N-글리칸 분석은 복수의 형질전환체들이 GlcNAc2Man3GlcNAc2를 생산할 수 있고, 이에 따라 기능적인 GnT II 활성을 발현할 수 있다는 것을 나타내었다(도 24). 하나의 선택된 조건에서, 전체 N-글리칸 풀의 약 40%가 GlcNAc2Man3GlcNAc2로 구성되었다. GlcNAc2Man3GlcNAc2로의 기질 GlcNAcMan3GlcNAc2의 변환율은 90%이었다. 마지막 선택된 스트레인들은 G050 (G045의 이중 변환(double transformation)) 및 G051(G047내에서 GnT II 발현)로 명명되었다.
실험예 9: 글루코시다아제(glucosidase) II 알파 및 베타 서브유닛들(Gls2α 및 Gls2β)의 발현
실험예들 6 내지 8에 설명된 실험들에 기반하여, YlALG3의 녹-아웃 및 YlALG6의 동시 과도발현을 포함하는 상기 전략은 하나 또는 2개의 말단 글루코스 잔여물들(Glc1-2Man5'GlcNAc2)을 운반하는 N-글리칸들의 형성을 야기한다. 이들 글루코스 잔여물들의 존재는 ER-localized HDEL-tagged a-1,2-만노시다제에 의해서 Man3GlcNAc2로의 전환을 방해한다. 상기 글루코스 잔류물들을 제거하기 위해서, 상기 ER 내의 상기 글루코시다아제 II 활성은 증가될 필요가 있다. α-1,2-만노시다제 발현없는 배경에서, Aspergillus niger 글루코시다아제 II 알파 및 베타 서브유닛은 Man5'GlcNAc2로의 Glc1-2Man5'GlcNAc2의 최대 전환을 야기했다 (미국 특허공개번호 20090069232-A1). 상기 A. niger gls2 서브 유닛들의 과도발현을 위한 콘스트럭트들은 아래의 방식으로 생산되었다: 1) Yarrowia 코돈-최적화된 cDNA는 성숙한(mature)(단일 펩티드 부족) A. niger gls2α 및 gls2β 서브유닛들의 발현을 위해서 형성되었다; 2) 상기 cDNA는 상기 Y. lipolytica LIP2pre-배열에 인-프레임(in-frame)으로 복제되었다; 3) 상기 결과적인 LIP2pre-gls2a 및 LIP2pre-gls2b 배열들은 상기 구성 TEF1 프로모터의 전사 조절 하에서 복제되었다. 상기 결과적인 플라스미드들은 pYLTUXdL2preAnGlcIIα 및 pYLeu2ExTEFpreLip2AnGlucIIβ (도 25)로 명명되었다.
이들 플라스미드들을 기반으로, 새로운 콘스트럭트들이 TEF1 프로모터 조절(타겟화된 삽입을 위한 vector JME923 pPTura3-LEU2ex-TefL2preAnGlcIIa+b[alt1] - 도 26) 또는 Hp4d 프로모터 조절(타겟화된 삽입을 위한 벡터 JME923 pPTura3-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt1] 및 랜덤 삽입을 위한 vector Zeta-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt] - 도 27) 하에서 A. niger gls2α 및 gls2β 서브유닛들의 동시 과도발현을 위해서 생성되었다.
스트레인 G057(실험예 7 참조)는 NotI 절단된 플라스미드들 JME923 pPTura3-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt1] 및 Zeta-LEU2ex-Hp4dL2preAnGlcIIa+b[alt]와 함께 전환되고, 형질전환체들은 이들의 류신 자가영양성이 기반하여 선택되었다. 복수의 클론들은 PCR 및 서던 분석을 통해서 유전적으로 분석되어서 상기 gls2α 및 gls2β 발현 카세트의 삽입을 평가한다. gls2α 서브유닛에 대한 DIG 프로브 생성 및 PCR-분석은 프라이머들 AnGls2α-FW (5'-GCTGGACTCTTCTTCTATCC-3') (서열 번호:24) 및 AnGls2α-RV (5'- GGTCTCCTTCAGAGACAGG-3') (서열 번호:25)을 이용하여 수행되었다; 상기 gls2β 서브유닛에 대해서, 프라이머들 AnGls2β-FW (5'-CCAAGTTCTACAAGGACACC-3') (서열 번호:26) 및 AnGlc2β-RV (5'- CCCTTGACGACCTTAGAGG-3') (서열 번호:27)을 사용하였다. 상기 이중(dual) Hp4dGls2α/β 발현 카세트의 타겟된 삽입을 체크하는 서던 분석은 gls2α 프로브를 이용할 때 Eco47III-절단된 gDNA 상에서 수행되었고, gls2β 프로브를 이용할 때 SpeI/SfiI-절단된 gDNA 상에서 수행되었다. 상기 선택된 클론들의 대부분은 상기 URA3 locus로 상기 이중 발현 카세트(dual expression cassette)의 적절한(correct) 삽입을 나타내었다. 상기 이중 Hp4dGls2α/β 발현 카세트들의 랜덤 삽입에 대한 서던 분석은 양쪽 프로브들과 함께 PvuI-절단된 gDNA 상에서 체크되었다. 모든 경우들에서, 오직 한 카피의 상기 이중 발현 카세트가 삽입되었다.
이후, N-글리칸 분석이 적절하게(correctly) 삽입된 상기 이중 Hp4dGls2α/β 발현 카세트를 갖는 것으로 확인된 여러 클론들 상에서 수행되었다. N-글리코실레이션는 3일 간의 팔콘 배양(falcon cultivation) 후에 전체 분비된 단백질 상에서 시험되었다. 복수의 클론들은 상기 글루코실화된(glucosylated) 당들의 상당한 감소와 Man3GlcNAc2 및 GlcNAcMan3GlcNAc2의 증가를 나타내었다. 상기 이중 발현 카세트가 한편으로 랜덤으로 삽입된(= 스트레인 G060) 클론 및 다른 한편으로 타겟화된 방식으로 삽입된(=스트레인 G061) 클론의 프로파일들이 도 28에 도시되었다. α-1,2-만노시다제 및 Jack Bean 만노시다제에 의한 처리에 따라, 2개의 작은 피크들은 Man4'GlcNAc2 및 Man5'GlcNAc2를 나타내며, 이들은 각기 Man3GlcNAc2와 Man1GlcNAc2로 이동하기 때문이다. 후자의 처리는 또한 남아있는 Glc1-2Man5'GlcNAc2를 Glc1-2Man4'GlcNAc2로의 및 GlcNAcMan3GlcNAc2를 GlcNAcMan2GlcNAc2로의 부분적인 전환을 야기한다. Man4'GlcNAc2 및 Man5'GlcNAc2의 존재는 하지만 이종으로 공동-발현된(heterologously co-expressed) HDEL-tagged α-1,2-만노시다제에 의한 Man3GlcNAc2로의 불완전한 전환을 나타낸다. 유사하게 Man3GlcNAc2의 존재는 GlcNAcMan3GlcNAc2를 얻기 위한 재결합 인간 GnT I에 의한 GlcNAc-잔류물의 불완전한 전환을 나타낸다. 하지만, 상술한 결과들(예를 들면, 실험예 7에서 G047 배양, 도 19)을 기반으로, 배양 조건들에서 차이들은 상기 전환율들을 상당히 증가시킬 수 있고 이에 따라 상기 결과들을 향상시킬 수 있다.
실험예 10: 스트레인 G061을 생산하는 GlcNAcMan 3 GlcNAc 2 에서 GlcNAc-트랜스페라제 II의 발현
실험예 8에서 설명한 바와 같이, Yarrowia 코돈-최적화된 배열은 S. cerevisiae Mnn2 단백질(SwissProt AccNo P38069)의 첫 번째 36 N-말단 아미노산들과 그에 뒤이은 rat GlcNAc-트랜스페라제 II (GnT II)(SwissProt AccNo Q09326) (도 22, 각기 서열 번호:17 및 서열 번호:18)의 촉매 도메인으로 구성된 융합 단백질의 발현을 위해서 생성되었다. 상기 효모 Mnn2 36 N-말단 아미노산들은 상기 촉매 GnT II 도메인을 위한 골지 국부 시그널로 역할을 한다. 이 방식에서, 상기 Mnn2-GnT II 융합 단백질은 상기 분비 경로 내에서 상기 Kre2-GnT I 융합 단백질과 동일하거나 보다 늦은 위치에 국부화되고, 따라서 GlcNAcMan3GlcNAc2를 GlcNAc2Man3GlcNAc2로 전환할 수 있다. 상기 융합 단백질의 발현을 위한 합성 유전자는 상기 Hp4d 프로모터의 전사 제어 하에 위치하여 플라스미드 pYLHp4mAXrGnTI를 야기하고, 상기 플라스미드 pYLHp4mAXrGnTI는 상기 Yarrowia 게놈으로 상기 Hp4d-driven GnT II 발현 카세트의 랜덤 삽입에 이용되었다. 이와 다른 전략에서, 콘스트럭트 OXYP289 pPTAxp1-ADE2ex-Hp4dhGnTII는 상기 Yarrowia 게놈의 AXP1 locus로 상기 Hp4d-driven GnT II 발현 카세트의 타겟된 삽입을 허용하도록 생성되었다.
스트레인 G061(실험예 9 참조)의 전환 이전에, 상기 플라스미드들은 NotI 절단되었고, 상기 타겟/발현 카세트는 분리되었다. 형질전환체들은 이들의 아데닌 자가영양성에 기반하여 선택되었다. 상기 ADE2 locus로의 상기 발현 카세트의 적절한(correct) 삽입은 XmnI로 상기 유전체 DNA를 절단한 후, 서던 블롯 분석을 통해서 확인되었다. 상기 GnT II 코딩 배열에 대한 특이성을 갖는 DIG-labeled 프로브(probe)는 정방향 프라이머 rGnTII-FW (5'-GACCAGATGCTGCGAAACG-3')(서열 번호: 28) 및 역방향 프라이머 rGnTII-RV (5'-CTTGACGTCCACCTTGTCG-3')(서열 번호: 29)을 이용하여 형성되었다. 이 전략은 상기 유전자가 상기 Axp1 locus에 성공적으로 삽입되었을 때, 3172bp의 밴드를 생성한다.
이와 다른 전략에서, 상기 Axp1 locus로의 적절한 삽입은 정방향 프라이머 AXPVer1b(5'-GCCTGAACGGCACGATGCGATCGTGGCAATCC-3')(서열 번호: 30) 및 역방향 프라이머 AXPVer2b(5'-CAAGAAGCCTCAGGCTCGGCGAATCTCCA TC-3')(서열 번호: 31)를 사용하는 유전체 DNA 상에서 PCR 반응을 통해서 시험될 수 있다. 상기 Axp1 locus로 적절한 타겟팅할 경우, 6489bp의 PCR 단편이 기대된다.
상기 시크리톰 상에서 N-글리칸 분석과 Jack Bean ??-N-acetylhexosaminidase 또는 T. reesei I-1,2-만노시다제와 함께 분리된 당들의 생체외 처리는 복수의 형질전환체들은 GlcNAc2Man3GlcNAc2를 생산할 수 있고, 따라서 기능적 GnT II 활성을 발현할 수 있다는 것을 나타냈다(도 29). 상기 분석들은 전체 N-글리칸 풀의 약 25% 내지 약 30%가 GlcNAc2Man3GlcNAc2로 구성되었고, GlcNAcMan3GlcNAc2에서 GlcNAc2Man3GlcNAc2로의 전환율이 약 90%인 것을 나타냈다. 상기 마지막으로 선택된 스트레인들은 G070(G061로 pYLHp4mAXrGnTII의 삽입) 및 G071(G061로 OXYP289 pPTAxp1-ADE2ex-Hp4dhGnTII의 삽입)로 명명되었다.
실험예 11: Yarrowia lipolytica 로 anti-HER2 중사슬(heavy chain; HC) 및 경사슬(light chain; LC)의 동시 Hp4d-driven 발현을 위한 탠덤(tandem) 플라스미드의 (construction)
상기 anti-HER2 항체 중사슬 및 경사슬을 위한 상기 아미노산 배열들은 Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA., 89(10): 42854289 (1992); 및 Ward et al., Appl Environ Microbiol., 70(5): 25672576 (2004)에서 얻어졌다. 상기 관련된 아미노산 배열들은 Gen Art(레겐스부르크 독일)에 의해서 역으로 번역(reverse translated)되고, Yarrowia lipolytica에 대해서 코돈-최적화되며, 합성되었다. 매우 높은(>80%) 또는 매우 낮은(<30%) GC 함량의 영역들은 가능하다면 회피되었다. 상기 최적화 과정들 동안, 아래의 시스-작용 배열 모티프들(cis-acting sequence motifs)은 회피되었다: (암호) 스플라이스 도너(cryptic splice donor) 및 어셉터 사이트(acceptor site)뿐만 아니라 내부 TATA 박스들(internal TATA-boxes), 카이-사이트들(chi-sites) 및 리보솜 도입 사이트들(ribosomal entry sites), AT-rich 또는 GC-rich 배열 스트레치들(sequence stretches), 반복 배열들(repeat sequences) 및 RNA 2차 구조들(secondary structures). 이소성(ectopic) 단백질들의 분비를 허용하기 위해서, Lip2 단백질 '프리프로' 신호의 코딩 배열(펩타이드 링커 'GGG'가 뒤따름)은 상기 코딩 배열들의 5' 영역에 추가된다. 'GGG'가 추가되어서 적절한 Kex2 공정을 위한 변화들을 촉진시킨다. 도 30A는 synthetic preproLip2-LC (= 750bp)(서열 번호: 32)의 뉴클레오티드 배열을 포함한다. 도 30B는 preproLip2-LC (= 250Aa; MW= 27.011Da; pI= 8.46)(서열 번호: 33)의 아미노산 배열을 포함한다. 도 31A는 synthetic preproLip2-HC (= 1458bp)(서열 번호: 34)의 뉴클레오티드 배열을 포함한다. 도 31B는 preproLip2-HC(= 486Aa; MW=52.853Da; pI=8.65) (서열 번호: 35)의 아미노산 배열을 포함한다. 상기 preproLip2-HC 및 -LC에 대한 코딩 배열들은 pYLHp4L2preproHerHC/LC (GUT2ex)-ori2로 명명된 동일한 벡터로 도입되었다.
실험예 12: 다양한 정도의 글리코-조작을 거친 Yarrowia lipolytic 스트레인들로 anti-HER2 항체 HC 및 LC의 발현
플라스미드 pYLHp4L2preproHerHC&LC (GUT2ex)-ori2는 NotI로 절단되었고, 상기 HC-/LC-탠덤(tandem) 발현 카세트는 Yarrowia lipolytica 스트레인들 G045, G057, G061 및 G071(표 2 참조)이 전환되기 전에 분리되었다. 상기 랜덤으로 삽입된 HC-/LC- 발현 카세트를 포함하는 형질전환체들은 유일한 탄소 공급원인 글리세롤 상에서 성장하는 이들의 능력에 따라서 선택되었다. 상기 HC 및 LC의 발현 분석은 상기 유일한 탄소 공급원인 글리세롤을 포함하는 농축 배지(슈퍼T/글리세롤 배지(SuperT/glycerol medium): 0.5% 효모 추출물(yeast extract); 2% 몰트 추출물(malt extract); 1% 트립톤(trypton); 1.5% 글리세롤(glycerol); 200mM 인산 완충액(phosphate buffer) pH 6.8) 내에서 상기 선택된 형질전환체들을 4일 간의 진탕 플라스크 배양을(shake flask cultivation) 한 후에, 웨스턴 블롯법(western blotting)을 통해서 수행되었다. LC-검출(detection)이 카파없는 경사슬들(Kappa Free Light Chains)(4C11)(Abcam)에 마우스 단일클론(mouse monoclonal)을 이용하여 수행된 반면에, HC-검출은 마우스 단일클론 항-인간 IgG(γ-사슬 특이성)(Sigma)를 이용하여 수행되었다.
스트레인들을 생산하는 상기 anti-HER2 항체의 상기 시크리톰의 N-글리칸들은 어떤 HC 및 LC를 발현하지 않는 글리코-조작된 대응 스트레인들과 유사한 프로파일들을 나타낸다(도 32). 상기 G045, G057, G061, 및 G071 배경을 갖는 스트레인들 내에서 N-글리칸들의 비율은 슈퍼T/글리세롤 배지 내에서 6일 간의 진탕 플라스크 배양 후에 결정되었다. G045 배경에서, 상기 N-글리칸들의 54.6%는 Man3GlcNAc2이었다. G057 배경에서, 상기 N-글리칸들의 47.5%는 GlcNAc1Man3GlcNAc2이었다. G061 배경에서, 상기 N-글리칸들의 58.9%는 GlcNAc1Man3GlcNAc2이었다. G071 배경에서, 상기 N-글리칸들의 37.6%는 GlcNAc2Man3GlcNAc2이었다.
실험예 13: Yarrowia 스트레인 G096(anti-HER2 항체 HC 및 LC를 발현하는 스트레인을 합성하는 GlcNAc 2 Man 3 GlcNAc 2 )의 발효
GlcNAc2Man3GlcNAc2를 합성할 수 있는 스트레인인, Yarrowia lipolytica G071의 복수의 pYLHp4L2preproHerHC&LC (GUT2ex)-ori2 형질전환체들이 HC 및 LC 발현 레벨들에 대해서 분석되었다. 이들 클론들 중에서 하나, G096,은 추가적인 분석을 위해서 선택되었다.
발효는 공정 제어 및 관리 시스템(Lucillus PIMS)이 장착된 14리터 교반 탱크 바이오반응기(MAVAG　AG) 내에서 수행되었다. 배지 내에서 상대적인 산소 분압, 배출 가스에서 이산화탄소(CO2) 및 산소(O2) 농도들, pH 값, 온도, 반응기 초과압력, 반응기 무게, 공급 무게(feed weight) 및 베이스 무게(base weight)는 모두 온라인으로 모니터된다. 거품 발생은 소포제(antifoaming agent) 폴리프로필렌 글리콜(PPG)을 추가함으로서 억제되었다. pH의 조절은 25% 암모니아 용액 또는 8.5% 인산 용액을 첨가함으로서 수행되었다.
G096의 종균 배양(seed culture)은 농축 배지를 포함하는 진탕 플라스크 내에서 28℃에서 성장되었다. 상기 종균 배양은 미네랄 배지를 포함하는 배양기로 접종되어서, 유일한 탄소 공급원인 글리세롤을 사용하여 28℃에서 무제한 성장하는 배치 단계(batch phase)를 개시한다. 이 단계는 급격하게 높은 바이오매스 농도에 도달하는데 이용되었다. 이 시점 이후로, 상기 과정은 0.02의 일정한 성장 속도와 함께 기하급수적인 글리세롤 공급 배치(fed batch)(글리세롤을 유일한 탄소 및 에너지 공급원으로 함; pH 6)로 이동되었다. 예를 들면, 28℃에서 공급 배치 발효의 결과는 아래에서 설명되었다.
상기 공급-배치 단계는 148시간 동안 지속되었다. 상기 발효의 다른 시점들에서, 샘플들은 아래의 변수들을 거쳤다: 1)웨스턴 블롯(western blow)을 통한 LC 및 HC 단백질 골격의 발현; 2) ELISA를 통한 anti-HER2 항체의 발현; 및 3) 시크리톰의 N-글리코실레이션 프로파일의 발전(evolution). 전체-길이 HC 발현 레벨은 약 시점 7(39시간) 근처에서 최대값에 도달했고, 그 이후로 대략적으로 일정하게 남아있다. LC 발현은 시점 7(39시간)과 시점 10(73시간) 사이에서 최대값에 도달하고, 그러나 이후 시점들에서 다소 감소했다. 일부 LC-이합체들(LC-dimers)은 시점 5(25시간)와 시점 9(62시간) 사이에서 생산되었고, 그러나 그 시점 이후부터 사라졌다.
기능성 ELISA가 개발되어 적어도 하나의 기능성 항원 결합 도메인을 갖는 anti-HER2 항체의 생산을 측정한다. 플레이트들은 상기 자연 HER2 항원의 재조합 변종, 재조합 인간 ErbB2/Fc 키메라(chimera)(R&D 시스템),으로 도포되었다. 이후, 다른 시점들에서 수확된(harvested) 상기 배지의 희석물이 상기 도포된 플레이트들 상에 추가되었다. 항원 결합 단백질 양의 평가는 HRP-공액(conjugated) 항-인간 카파(kappa) LC 항체(Sigma)를 이용하여 수행되었다. 상기 공급-배치 발효 내에서 ErbB2/Fc 키메라 결합 단백질 양의 발전(evolution)(분비된 기능성 anti-HER2 항체의 양의 측정)은 도 33에 도시된다. 상기 데이터는 상기 생산 단계의 끝에서 10 내지 12㎎/L의 최대값에서 anti-HER2 항체의 레벨이 지속적으로 증가하는 것을 나타낸다.
N-글리칸 분석은 상기 공급-배치 발효 동안 여러 시점들에서 수집된 샘플들에 대해서 수행되었다. 상기 결과들이 도 34A 및 도 34B에 도시된다. 상기 공급-배치 단계의 시작에서, 상당한 양의 글루코스-함유 N-글리칸들이 존재했다. 시점 6부터 이후로(기하급수적인 공급의 시작 이후, 34시간), 글루코실화된(glucosylated) N-글리칸들의 레벨은 상당히 감소했고, 수확 시점(시점 18, 148시간)에서 거의 남아있지 않았다. 이것은 글루코스-포함 N-글리칸들을 처음부터 운반하는 단백질들이 상기 발효의 끝에서 희석되어 버렸다는 것을 나타낸다. 그 시점에서 상기 시크리톰으로부터 분리된 N-글리칸들의 86%가 GlcNAc2Man3GlcNAc2 구조를 가진다.
다른 실시예들
본 발명이 이의 상세한 설명과 함께 설명되고 있지만, 전술한 설명은 예시적인 것이며, 본 발명의 범위를 제한하기 위한 것이 아니고, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위에 의해서 정의된다. 다른 측면들, 장점 및 변형들은 아래의 청구항들의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Oxyrane UK Limited <120> YEAST STRAINS PRODUCING MAMMALIAN-LIKE COMPLEX N-GLYCANS <130> 18990-0030WO1 <140> PCT/IB2010/003154 <141> 2010-11-19 <150> US 61/262,828 <151> 2009-11-19 <160> 35 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 1 tcgctatcac gtctctagc 19 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 2 actctgtata cttgtatgta ctgtgagac 29 <210> 3 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion of N-terminal portion of the S. cerevisiae Kre2 protein and catalytic domain of human GlcNAc-transferase I <400> 3 Met Ala Leu Phe Leu Ser Lys Arg Leu Leu Arg Phe Thr Val Ile Ala 1 5 10 15 Gly Ala Val Ile Val Leu Leu Leu Thr Leu Asn Ser Asn Ser Arg Thr 20 25 30 Gln Gln Tyr Ile Pro Ser Ser Ile Ser Ala Ala Phe Asp Phe Thr Ser 35 40 45 Gly Ser Ile Ser Pro Glu Gln Gln Val Ile Ser Glu Glu Asn Asp Ala 50 55 60 Lys Lys Leu Glu Gln Ser Ala Leu Asn Ser Glu Ala Ser Glu Asp Ser 65 70 75 80 Glu Ala Met Asp Glu Glu Ser Lys Ala Leu Lys Ala Ala Ala Glu Lys 85 90 95 Ala Asp Ala Pro Pro Ala Val Ile Pro Ile Leu Val Ile Ala Cys Asp 100 105 110 Arg Ser Thr Val Arg Arg Cys Leu Asp Lys Leu Leu His Tyr Arg Pro 115 120 125 Ser Ala Glu Leu Phe Pro Ile Ile Val Ser Gln Asp Cys Gly His Glu 130 135 140 Glu Thr Ala Gln Ala Ile Ala Ser Tyr Gly Ser Ala Val Thr His Ile 145 150 155 160 Arg Gln Pro Asp Leu Ser Ser Ile Ala Val Pro Pro Asp His Arg Lys 165 170 175 Phe Gln Gly Tyr Tyr Lys Ile Ala Arg His Tyr Arg Trp Ala Leu Gly 180 185 190 Gln Val Phe Arg Gln Phe Arg Phe Pro Ala Ala Val Val Val Glu Asp 195 200 205 Asp Leu Glu Val Ala Pro Asp Phe Phe Glu Tyr Phe Arg Ala Thr Tyr 210 215 220 Pro Leu Leu Lys Ala Asp Pro Ser Leu Trp Cys Val Ser Ala Trp Asn 225 230 235 240 Asp Asn Gly Lys Glu Gln Met Val Asp Ala Ser Arg Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Tyr Arg Thr Asp Phe Phe Pro Gly Leu Gly Trp Leu Leu Leu Ala Glu 260 265 270 Leu Trp Ala Glu Leu Glu Pro Lys Trp Pro Lys Ala Phe Trp Asp Asp 275 280 285 Trp Met Arg Arg Pro Glu Gln Arg Gln Gly Arg Ala Cys Ile Arg Pro 290 295 300 Glu Ile Ser Arg Thr Met Thr Phe Gly Arg Lys Gly Val Ser His Gly 305 310 315 320 Gln Phe Phe Asp Gln His Leu Lys Phe Ile Lys Leu Asn Gln Gln Phe 325 330 335 Val His Phe Thr Gln Leu Asp Leu Ser Tyr Leu Gln Arg Glu Ala Tyr 340 345 350 Asp Arg Asp Phe Leu Ala Arg Val Tyr Gly Ala Pro Gln Leu Gln Val 355 360 365 Glu Lys Val Arg Thr Asn Asp Arg Lys Glu Leu Gly Glu Val Arg Val 370 375 380 Gln Tyr Thr Gly Arg Asp Ser Phe Lys Ala Phe Ala Lys Ala Leu Gly 385 390 395 400 Val Met Asp Asp Leu Lys Ser Gly Val Pro Arg Ala Gly Tyr Arg Gly 405 410 415 Ile Val Thr Phe Gln Phe Arg Gly Arg Arg Val His Leu Ala Pro Pro 420 425 430 Pro Thr Trp Glu Gly Tyr Asp Pro Ser Trp Asn 435 440 <210> 4 <211> 1332 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encodes fusion protein of SEQ ID NO:3 <400> 4 atggccctgt ttctgtctaa gcgactgctg cgattcaccg tgatcgccgg tgccgtgatc 60 gtgctgctgc tgaccctgaa ctctaactct cgaacccagc agtacatccc ctcttctatc 120 tctgccgcct tcgacttcac ctctggctct atctctcccg agcagcaggt gatctctgag 180 gagaacgacg ccaagaagct ggagcagtct gccctcaact ctgaggcttc tgaggactcc 240 gaggccatgg acgaggagtc taaggccctg aaggccgctg ccgagaaggc tgacgctccg 300 ccggctgtga tccccatcct ggtcatcgcc tgtgaccgat ctaccgtgcg acgatgtctg 360 gacaagctgc tgcactaccg accctctgcc gagctgttcc ccatcatcgt gtctcaggac 420 tgtggccacg aggagaccgc ccaggccatt gcctcttacg gctctgccgt gacccacatc 480 cgacagcccg acctgtcctc tatcgccgtg ccccccgacc accgaaagtt ccagggctac 540 tacaagatcg cccgacacta ccgatgggcc ctgggccagg tgttccgaca gttccgattc 600 cccgctgccg tggtggtgga ggacgacctg gaggtggccc ccgacttctt cgagtacttc 660 cgagccacct accccctgct gaaggccgac ccctctctgt ggtgtgtgtc tgcctggaac 720 gacaacggca aggaacagat ggtcgacgcc tctcgacctg agctgctgta ccgaaccgac 780 ttcttccccg gcctgggctg gctgctgctg gctgagctgt gggccgagct ggagcccaag 840 tggcccaagg ccttctggga cgactggatg cgacgacccg agcagcgaca gggccgagcc 900 tgtatccgac ccgagatctc tcgaaccatg accttcggcc gaaagggcgt gtctcacggc 960 cagttcttcg accagcacct gaagttcatc aagctgaacc agcagttcgt gcacttcacc 1020 cagctggacc tgtcttacct gcagcgagag gcctacgacc gagacttcct ggcccgagtg 1080 tacggcgctc cccagctgca ggtggagaag gtgcgaacca acgaccgaaa ggagctgggc 1140 gaggtccgag tgcagtacac cggccgagac tcgttcaagg ccttcgccaa ggccctgggc 1200 gtgatggacg acctgaagtc tggcgtgccc cgagccggat accgaggcat cgtgaccttc 1260 cagttccgag gccgacgagt gcacctggcc cctccaccca cctgggaggg ctacgacccc 1320 tcttggaact ag 1332 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 5 ggatgatcac acaatggccc tgtttctg 28 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 6 tgctctagac tagttccaag aggggtc 27 <210> 7 <211> 1069 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion of N-terminal portion of the S. cerevisiae Mnn2 protein and catalytic domain of Drosophila melanogaster mannosidase II <400> 7 Met Leu Leu Thr Lys Arg Phe Ser Lys Leu Phe Lys Leu Thr Phe Ile 1 5 10 15 Val Leu Ile Leu Cys Gly Leu Phe Val Ile Thr Asn Lys Tyr Met Asp 20 25 30 Glu Asn Thr Ser Arg Asp Asp Pro Ile Arg Pro Pro Leu Lys Val Ala 35 40 45 Arg Ser Pro Arg Pro Gly Gln Cys Gln Asp Val Val Gln Asp Val Pro 50 55 60 Asn Val Asp Val Gln Met Leu Glu Leu Tyr Asp Arg Met Ser Phe Lys 65 70 75 80 Asp Ile Asp Gly Gly Val Trp Lys Gln Gly Trp Asn Ile Lys Tyr Asp 85 90 95 Pro Leu Lys Tyr Asn Ala His His Lys Leu Lys Val Phe Val Val Pro 100 105 110 His Ser His Asn Asp Pro Gly Trp Ile Gln Thr Phe Glu Glu Tyr Tyr 115 120 125 Gln His Asp Thr Lys His Ile Leu Ser Asn Ala Leu Arg His Leu His 130 135 140 Asp Asn Pro Glu Met Lys Phe Ile Trp Ala Glu Ile Ser Tyr Phe Ala 145 150 155 160 Arg Phe Tyr His Asp Leu Gly Glu Asn Lys Lys Leu Gln Met Lys Ser 165 170 175 Ile Val Lys Asn Gly Gln Leu Glu Phe Val Thr Gly Gly Trp Val Met 180 185 190 Pro Asp Glu Ala Asn Ser His Trp Arg Asn Val Leu Leu Gln Leu Thr 195 200 205 Glu Gly Gln Thr Trp Leu Lys Gln Phe Met Asn Val Thr Pro Thr Ala 210 215 220 Ser Trp Ala Ile Asp Pro Phe Gly His Ser Pro Thr Met Pro Tyr Ile 225 230 235 240 Leu Gln Lys Ser Gly Phe Lys Asn Met Leu Ile Gln Arg Thr His Tyr 245 250 255 Ser Val Lys Lys Glu Leu Ala Gln Gln Arg Gln Leu Glu Phe Leu Trp 260 265 270 Arg Gln Ile Trp Asp Asn Lys Gly Asp Thr Ala Leu Phe Thr His Met 275 280 285 Met Pro Phe Tyr Ser Tyr Asp Ile Pro His Thr Cys Gly Pro Asp Pro 290 295 300 Lys Val Cys Cys Gln Phe Asp Phe Lys Arg Met Gly Ser Phe Gly Leu 305 310 315 320 Ser Cys Pro Trp Lys Val Pro Pro Arg Thr Ile Ser Asp Gln Asn Val 325 330 335 Ala Ala Arg Ser Asp Leu Leu Val Asp Gln Trp Lys Lys Lys Ala Glu 340 345 350 Leu Tyr Arg Thr Asn Val Leu Leu Ile Pro Leu Gly Asp Asp Phe Arg 355 360 365 Phe Lys Gln Asn Thr Glu Trp Asp Val Gln Arg Val Asn Tyr Glu Arg 370 375 380 Leu Phe Glu His Ile Asn Ser Gln Ala His Phe Asn Val Gln Ala Gln 385 390 395 400 Phe Gly Thr Leu Gln Glu Tyr Phe Asp Ala Val His Gln Ala Glu Arg 405 410 415 Ala Gly Gln Ala Glu Phe Pro Thr Leu Ser Gly Asp Phe Phe Thr Tyr 420 425 430 Ala Asp Arg Ser Asp Asn Tyr Trp Ser Gly Tyr Tyr Thr Ser Arg Pro 435 440 445 Tyr His Lys Arg Met Asp Arg Val Leu Met His Tyr Val Arg Ala Ala 450 455 460 Glu Met Leu Ser Ala Trp His Ser Trp Asp Gly Met Ala Arg Ile Glu 465 470 475 480 Glu Arg Leu Glu Gln Ala Arg Arg Glu Leu Ser Leu Phe Gln His His 485 490 495 Asp Gly Ile Thr Gly Thr Ala Lys Thr His Val Val Val Asp Tyr Glu 500 505 510 Gln Arg Met Gln Glu Ala Leu Lys Ala Cys Gln Met Val Met Gln Gln 515 520 525 Ser Val Tyr Arg Leu Leu Thr Lys Pro Ser Ile Tyr Ser Pro Asp Phe 530 535 540 Ser Phe Ser Tyr Phe Thr Leu Asp Asp Ser Arg Trp Pro Gly Ser Gly 545 550 555 560 Val Glu Asp Ser Arg Thr Thr Ile Ile Leu Gly Glu Asp Ile Leu Pro 565 570 575 Ser Lys His Val Val Met His Asn Thr Leu Pro His Trp Arg Glu Gln 580 585 590 Leu Val Asp Phe Tyr Val Ser Ser Pro Phe Val Ser Val Thr Asp Leu 595 600 605 Ala Asn Asn Pro Val Glu Ala Gln Val Ser Pro Val Trp Ser Trp His 610 615 620 His Asp Thr Leu Thr Lys Thr Ile His Pro Gln Gly Ser Thr Thr Lys 625 630 635 640 Tyr Arg Ile Ile Phe Lys Ala Arg Val Pro Pro Met Gly Leu Ala Thr 645 650 655 Tyr Val Leu Thr Ile Ser Asp Ser Lys Pro Glu His Thr Ser Tyr Ala 660 665 670 Ser Asn Leu Leu Leu Arg Lys Asn Pro Thr Ser Leu Pro Leu Gly Gln 675 680 685 Tyr Pro Glu Asp Val Lys Phe Gly Asp Pro Arg Glu Ile Ser Leu Arg 690 695 700 Val Gly Asn Gly Pro Thr Leu Ala Phe Ser Glu Gln Gly Leu Leu Lys 705 710 715 720 Ser Ile Gln Leu Thr Gln Asp Ser Pro His Val Pro Val His Phe Lys 725 730 735 Phe Leu Lys Tyr Gly Val Arg Ser His Gly Asp Arg Ser Gly Ala Tyr 740 745 750 Leu Phe Leu Pro Asn Gly Pro Ala Ser Pro Val Glu Leu Gly Gln Pro 755 760 765 Val Val Leu Val Thr Lys Gly Lys Leu Glu Ser Ser Val Ser Val Gly 770 775 780 Leu Pro Ser Val Val His Gln Thr Ile Met Arg Gly Gly Ala Pro Glu 785 790 795 800 Ile Arg Asn Leu Val Asp Ile Gly Ser Leu Asp Asn Thr Glu Ile Val 805 810 815 Met Arg Leu Glu Thr His Ile Asp Ser Gly Asp Ile Phe Tyr Thr Asp 820 825 830 Leu Asn Gly Leu Gln Phe Ile Lys Arg Arg Arg Leu Asp Lys Leu Pro 835 840 845 Leu Gln Ala Asn Tyr Tyr Pro Ile Pro Ser Gly Met Phe Ile Glu Asp 850 855 860 Ala Asn Thr Arg Leu Thr Leu Leu Thr Gly Gln Pro Leu Gly Gly Ser 865 870 875 880 Ser Leu Ala Ser Gly Glu Leu Glu Ile Met Gln Asp Arg Arg Leu Ala 885 890 895 Ser Asp Asp Glu Arg Gly Leu Gly Gln Gly Val Leu Asp Asn Lys Pro 900 905 910 Val Leu His Ile Tyr Arg Leu Val Leu Glu Lys Val Asn Asn Cys Val 915 920 925 Arg Pro Ser Lys Leu His Pro Ala Gly Tyr Leu Thr Ser Ala Ala His 930 935 940 Lys Ala Ser Gln Ser Leu Leu Asp Pro Leu Asp Lys Phe Ile Phe Ala 945 950 955 960 Glu Asn Glu Trp Ile Gly Ala Gln Gly Gln Phe Gly Gly Asp His Pro 965 970 975 Ser Ala Arg Glu Asp Leu Asp Val Ser Val Met Arg Arg Leu Thr Lys 980 985 990 Ser Ser Ala Lys Thr Gln Arg Val Gly Tyr Val Leu His Arg Thr Asn 995 1000 1005 Leu Met Gln Cys Gly Thr Pro Glu Glu His Thr Gln Lys Leu Asp Val 1010 1015 1020 Cys His Leu Leu Pro Asn Val Ala Arg Cys Glu Arg Thr Thr Leu Thr 1025 1030 1035 1040 Phe Leu Gln Asn Leu Glu His Leu Asp Gly Met Val Ala Pro Glu Val 1045 1050 1055 Cys Pro Met Glu Thr Ala Ala Tyr Val Ser Ser His Ser 1060 1065 <210> 8 <211> 3213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encodes fusion protein of SEQ ID NO:7 <400> 8 atgctgctga ccaagcgatt ctctaagctg ttcaagctga ccttcatcgt gctgatcctg 60 tgtggcctgt tcgtgatcac caacaagtac atggacgaga acacctcccg ggatgacccc 120 atccgacccc ccctgaaggt ggcccgatct ccccgacccg gccagtgtca ggacgtggtg 180 caggacgtgc ccaacgtgga cgtgcagatg ctggagctgt acgaccgaat gtctttcaag 240 gacatcgacg gcggcgtgtg gaagcagggc tggaacatca agtacgaccc cctgaagtac 300 aacgcccacc acaagctgaa ggtgttcgtg gtgccccact ctcacaacga ccccggctgg 360 attcagacct tcgaggagta ctaccagcac gacaccaagc acatcctgtc taacgccctg 420 cgacacctgc acgacaaccc tgagatgaag tttatctggg ccgagatctc ttacttcgcc 480 cgattctacc acgacctggg cgagaacaag aagctgcaga tgaagtctat cgtgaagaac 540 ggccagctgg agttcgtgac cggcggctgg gtgatgcccg acgaggccaa ctctcactgg 600 cgaaacgtgc tgctgcagct gaccgagggc cagacctggc tgaagcagtt catgaacgtg 660 acccccaccg cctcttgggc catcgacccc ttcggccact ctcccaccat gccctacatc 720 ctgcagaagt ctggcttcaa gaacatgctg atccagcgaa cccactactc tgtgaagaag 780 gagctggccc agcagcgaca gctggagttt ctgtggcgac agatctggga caacaagggc 840 gacaccgccc tgttcaccca catgatgccc ttctactctt acgacatccc ccacacctgt 900 ggccccgacc ccaaggtgtg ttgtcagttc gacttcaagc gaatgggctc tttcggcctg 960 tcttgtccct ggaaggtgcc ccctcgaacc atctctgacc agaacgtggc cgctcgatct 1020 gacctgctgg ttgaccagtg gaagaagaag gccgagctgt accgaaccaa cgtcctgctg 1080 atccccctgg gcgacgactt ccgattcaag cagaacaccg agtgggacgt gcagcgagtg 1140 aactacgagc gactgttcga gcacatcaac tctcaggccc acttcaacgt gcaggctcag 1200 ttcggcactc tgcaggagta cttcgacgcc gtccaccagg ccgagcgagc cggccaggcc 1260 gagttcccca ccctgtctgg cgactttttc acctacgccg accgatctga caactactgg 1320 tctggctact acacctctcg accctaccac aagcgaatgg accgagtgct gatgcactac 1380 gtgcgagccg ccgagatgct gtctgcctgg cactcttggg acggcatggc ccgaatcgag 1440 gagcgactgg agcaggcccg acgagagctg tctctgttcc agcaccacga cggcatcacc 1500 ggcaccgcca agacccacgt ggtggtggac tacgagcagc gaatgcagga ggccctgaag 1560 gcctgtcaga tggtgatgca gcagtctgtc taccgactcc tgactaagcc ctctatctac 1620 tctcccgact tctctttctc ttacttcacc ctggacgact ctcgatggcc cggctctggc 1680 gtggaggact ctcgaaccac catcatcctg ggcgaggaca tcctgccctc taagcacgtg 1740 gtgatgcaca acaccctgcc ccactggcga gagcagctgg tcgacttcta cgtgtcctct 1800 cccttcgtgt ctgtgaccga cctggccaac aaccccgtgg aggcccaggt gtctcccgtg 1860 tggtcttggc accacgacac cctgaccaag accatccacc cccagggctc taccaccaag 1920 taccgaatca tcttcaaggc ccgagtgccc cccatgggcc tggccaccta cgtgctgacc 1980 atctccgact ctaagcccga gcacacctct tacgcctcta acctgctgct gcgaaagaac 2040 cccacctctc tgcccctggg ccagtacccc gaggacgtga agttcggcga cccccgagag 2100 atctctctgc gagtgggcaa cggccccacc ctggccttct ctgagcaggg cctgctgaag 2160 tctatccagc tgacccagga ctctccccac gtgcccgtgc acttcaagtt tctgaagtac 2220 ggcgtgcgat ctcacggcga ccgatctggc gcctacctgt tcctgcccaa cggacccgcc 2280 tctcccgtgg agctgggaca gcccgtggtg ctggtgacca agggcaagct ggagtcctct 2340 gtgtctgtgg gcctgccctc tgtggtgcac cagaccatca tgcgaggcgg agcccccgag 2400 atccgaaacc tggtggacat cggatctctg gacaacaccg agatcgtgat gcgactggag 2460 acccacatcg actctggcga catcttctac accgacctga acggcctgca gttcatcaag 2520 cgacgacgac tggacaagct gcccctgcag gccaactact accccatccc ctctggcatg 2580 ttcatcgagg acgccaacac ccgactgacc ctgctgaccg gccagcccct gggcggatct 2640 tctctggcct ctggcgagct ggagatcatg caggaccgac gactggcctc tgacgacgag 2700 cgaggcctgg gccagggcgt gctggacaac aagcccgtgc tgcacatcta ccgactggtg 2760 ctggagaagg tgaacaactg tgtgcgaccc tctaagctgc accccgctgg ctacctgacc 2820 tctgccgccc acaaggcctc tcagtctctg ctggaccccc tggacaagtt catcttcgcc 2880 gagaacgagt ggatcggcgc ccagggccag ttcggaggcg accacccctc tgcccgagag 2940 gacctggacg tgtctgtgat gcgacgactg accaagtcct ctgccaagac ccagcgagtg 3000 ggctacgtgc tgcaccgaac caacctgatg cagtgtggca cccccgagga gcacacccag 3060 aagctggacg tctgtcacct gctgcccaac gtcgcccgat gtgagcgaac caccctgacc 3120 tttctgcaga acctggagca cctggacggc atggtggccc ccgaggtgtg tcccatggag 3180 accgccgcct acgtgtcgtc ccactcttct tag 3213 <210> 9 <211> 763 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion of N-terminal portion of the S. cerevisiae Mnn2 protein, the S. pombe Gal10-like protein, and catalytic domain of human GalT I <400> 9 Met Leu Leu Thr Lys Arg Phe Ser Lys Leu Phe Lys Leu Thr Phe Ile 1 5 10 15 Val Leu Ile Leu Cys Gly Leu Phe Val Ile Thr Asn Lys Tyr Met Asp 20 25 30 Glu Asn Thr Ser Val Lys Glu Tyr Lys Glu Tyr Leu Asp Arg Gly Arg 35 40 45 Ala Met Thr Gly Val His Glu Gly Thr Val Leu Val Thr Gly Gly Ala 50 55 60 Gly Tyr Ile Gly Ser His Thr Cys Val Val Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 65 70 75 80 Asp Val Val Ile Val Asp Asn Leu Cys Asn Ser Arg Val Glu Ala Val 85 90 95 His Arg Ile Glu Lys Leu Thr Gly Lys Lys Val Ile Phe His Gln Val 100 105 110 Asp Leu Leu Asp Glu Pro Ala Leu Asp Lys Val Phe Ala Asn Gln Asn 115 120 125 Ile Ser Ala Val Ile His Phe Ala Gly Leu Lys Ala Val Gly Glu Ser 130 135 140 Val Gln Val Pro Leu Ser Tyr Tyr Lys Asn Asn Ile Ser Gly Thr Ile 145 150 155 160 Asn Leu Ile Glu Cys Met Lys Lys Tyr Asn Val Arg Asp Phe Val Phe 165 170 175 Ser Ser Ser Ala Thr Val Tyr Gly Asp Pro Thr Arg Pro Gly Gly Thr 180 185 190 Ile Pro Ile Pro Glu Ser Cys Pro Arg Glu Gly Thr Ser Pro Tyr Gly 195 200 205 Arg Thr Lys Leu Phe Ile Glu Asn Ile Ile Glu Asp Glu Thr Lys Val 210 215 220 Asn Lys Ser Leu Asn Ala Ala Leu Leu Arg Tyr Phe Asn Pro Gly Gly 225 230 235 240 Ala His Pro Ser Gly Glu Leu Gly Glu Asp Pro Leu Gly Ile Pro Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Pro Tyr Ile Ala Gln Val Ala Val Gly Arg Leu Asp His 260 265 270 Leu Asn Val Phe Gly Asp Asp Tyr Pro Thr Ser Asp Gly Thr Pro Ile 275 280 285 Arg Asp Tyr Ile His Val Cys Asp Leu Ala Glu Ala His Val Ala Ala 290 295 300 Leu Asp Tyr Leu Arg Gln His Phe Val Ser Cys Arg Pro Trp Asn Leu 305 310 315 320 Gly Ser Gly Thr Gly Ser Thr Val Phe Gln Val Leu Asn Ala Phe Ser 325 330 335 Lys Ala Val Gly Arg Asp Leu Pro Tyr Lys Val Thr Pro Arg Arg Ala 340 345 350 Gly Asp Val Val Asn Leu Thr Ala Asn Pro Thr Arg Ala Asn Glu Glu 355 360 365 Leu Lys Trp Lys Thr Ser Arg Ser Ile Tyr Glu Ile Cys Val Asp Thr 370 375 380 Trp Arg Trp Gln Gln Lys Tyr Pro Tyr Gly Phe Asp Leu Thr His Thr 385 390 395 400 Lys Thr Tyr Lys Gly Ser Gly Gly Gly Arg Asp Leu Ser Arg Leu Pro 405 410 415 Gln Leu Val Gly Val Ser Thr Pro Leu Gln Gly Gly Ser Asn Ser Ala 420 425 430 Ala Ala Ile Gly Gln Ser Ser Gly Glu Leu Arg Thr Gly Gly Ala Arg 435 440 445 Pro Pro Pro Pro Leu Gly Ala Ser Ser Gln Pro Arg Pro Gly Gly Asp 450 455 460 Ser Ser Pro Val Val Asp Ser Gly Pro Gly Pro Ala Ser Asn Leu Thr 465 470 475 480 Ser Val Pro Val Pro His Thr Thr Ala Leu Ser Leu Pro Ala Cys Pro 485 490 495 Glu Glu Ser Pro Leu Leu Val Gly Pro Met Leu Ile Glu Phe Asn Met 500 505 510 Pro Val Asp Leu Glu Leu Val Ala Lys Gln Asn Pro Asn Val Lys Met 515 520 525 Gly Gly Arg Tyr Ala Pro Arg Asp Cys Val Ser Pro His Lys Val Ala 530 535 540 Ile Ile Ile Pro Phe Arg Asn Arg Gln Glu His Leu Lys Tyr Trp Leu 545 550 555 560 Tyr Tyr Leu His Pro Val Leu Gln Arg Gln Gln Leu Asp Tyr Gly Ile 565 570 575 Tyr Val Ile Asn Gln Ala Gly Asp Thr Ile Phe Asn Arg Ala Lys Leu 580 585 590 Leu Asn Val Gly Phe Gln Glu Ala Leu Lys Asp Tyr Asp Tyr Thr Cys 595 600 605 Phe Val Phe Ser Asp Val Asp Leu Ile Pro Met Asn Asp His Asn Ala 610 615 620 Tyr Arg Cys Phe Ser Gln Pro Arg His Ile Ser Val Ala Met Asp Lys 625 630 635 640 Phe Gly Phe Ser Leu Pro Tyr Val Gln Tyr Phe Gly Gly Val Ser Ala 645 650 655 Leu Ser Lys Gln Gln Phe Leu Thr Ile Asn Gly Phe Pro Asn Asn Tyr 660 665 670 Trp Gly Trp Gly Gly Glu Asp Asp Asp Ile Phe Asn Arg Leu Val Phe 675 680 685 Arg Gly Met Ser Ile Ser Arg Pro Asn Ala Val Val Gly Arg Cys Arg 690 695 700 Met Ile Arg His Ser Arg Asp Lys Lys Asn Glu Pro Asn Pro Gln Arg 705 710 715 720 Phe Asp Arg Ile Ala His Thr Lys Glu Thr Met Leu Ser Asp Gly Leu 725 730 735 Asn Ser Leu Thr Tyr Gln Val Leu Asp Val Gln Arg Tyr Pro Leu Tyr 740 745 750 Thr Gln Ile Thr Val Asp Ile Gly Thr Pro Ser 755 760 <210> 10 <211> 2292 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encodes fusion protein of SEQ ID NO:9 <400> 10 atgctgctga ccaagcgatt ctctaagctg ttcaagctga ccttcatcgt gctgatcctg 60 tgtggcctgt tcgtgatcac caacaagtac atggacgaga acacctctgt gaaggaatac 120 aaggagtacc tggaccgcgg ccgagccatg accggcgtgc acgagggcac cgtgctggtg 180 accggcggag ccggctacat cggctctcac acctgtgtgg tgctgctgga gaagggctac 240 gacgtggtga tcgtggacaa cctgtgtaac tctcgagtgg aggccgtgca ccgaatcgag 300 aagctgaccg gcaagaaggt gatcttccac caggtggacc tgctggacga gcccgccctg 360 gacaaggtgt tcgccaacca gaacatctct gccgtgatcc acttcgccgg cctgaaggct 420 gtgggcgagt ctgtgcaggt gcccctgtct tactacaaga acaacatctc tggcaccatc 480 aacctgatcg agtgtatgaa gaagtacaac gtccgagact tcgtgttctc ttcttctgcc 540 accgtgtacg gcgaccccac ccgacccggc ggaaccatcc ccatccccga gtcttgtccc 600 cgagagggca cctctcccta cggccgaacc aagctgttca tcgagaacat catcgaggac 660 gaaaccaagg tgaacaagtc tctgaacgcc gccctgctgc gatacttcaa ccccggtggc 720 gctcacccct ctggcgagct gggcgaggac cctctgggca tccccaacaa cctgctgccc 780 tacattgctc aggtggctgt gggccgactg gaccacctga acgtgtttgg cgacgactac 840 cctacctctg acggcacccc catccgagac tacatccacg tgtgtgacct ggccgaggcc 900 cacgtggccg ctctggacta cctgcgacag cacttcgtgt cttgtcgacc ctggaacctg 960 ggctctggca ccggctctac cgtgttccag gtgctgaacg ccttctctaa ggctgtcggc 1020 cgagatctgc cctacaaggt gaccccccga cgagccggcg acgtcgtgaa cctgaccgcc 1080 aaccctaccc gagctaacga ggagctgaag tggaagacct ctcgatctat ctacgagatc 1140 tgtgtggaca cctggagatg gcagcagaag tacccctacg gcttcgacct gacccatacc 1200 aagacctaca agggctctgg cggaggacga gatctgtctc gactgcctca gctggtcggc 1260 gtgtctaccc ctctgcaggg cggctctaac tctgccgccg ctatcggcca gtcctccggc 1320 gagctgcgaa ccggtggagc ccgacctccc cctcccctgg gcgcctcttc tcagccccga 1380 cccggtggcg actcttctcc cgtggtggac tctggccccg gacccgcctc taacctgacc 1440 tctgtgcccg tgccccacac caccgccctg tctctgcccg cctgtcccga ggagtctccc 1500 ctgctcgtcg gccccatgct gatcgagttc aacatgcccg tggacctgga gctggtcgcc 1560 aagcagaacc ccaacgtgaa gatgggcgga cgatacgctc cccgagactg tgtgtctccc 1620 cacaaggtgg ccatcatcat ccctttcaga aaccgacagg agcacctgaa gtactggctg 1680 tactacctgc accccgtgct gcagcgacag cagctggact acggcatcta cgtgatcaac 1740 caggccggcg acaccatctt caaccgagcc aagctgctga acgtgggctt ccaggaggcc 1800 ctgaaggact acgactacac ctgtttcgtg ttctccgacg tggacctgat ccccatgaac 1860 gaccacaacg cctaccgatg tttctcccag ccccgacaca tctctgtggc catggacaag 1920 ttcggcttct ctctgcccta cgtgcagtac ttcggcggcg tttctgccct gtctaagcag 1980 cagttcctga ccatcaacgg cttccccaac aactactggg gctggggcgg agaggacgac 2040 gacattttca accgactggt gttccgaggc atgtctatct ctcgacccaa cgccgtggtg 2100 ggccgatgtc gaatgatccg acactctcga gacaagaaga acgagcccaa cccccagcga 2160 tttgaccgaa ttgctcacac taaggaaacc atgctgtctg acggcctgaa ctctctgacc 2220 taccaggtgc tggacgtgca gcgatacccc ctgtacaccc agatcaccgt ggacatcggc 2280 acaccctctt ag 2292 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 11 ggatgatcac acaatggccc tgtttctg 28 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 12 tgctctagac tagttccaag aggggtc 27 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 13 cgacgataga gcaggtctca ctgttgggaa tgctg 35 <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 14 ctacactgac gaagtggaca tcccggcttg gactg 35 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 15 ggatgatcac acaatggccc tgtttctg 28 <210> 16 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 16 tgctctagac tagttccaag aggggtc 27 <210> 17 <211> 391 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion of N-terminal portion of the S. cerevisiae Mnn2 protein and catalytic domain of rat GlcNAc-transferase II <400> 17 Met Leu Leu Thr Lys Arg Phe Ser Lys Leu Phe Lys Leu Thr Phe Ile 1 5 10 15 Val Leu Ile Leu Cys Gly Leu Phe Val Ile Thr Asn Lys Tyr Met Asp 20 25 30 Glu Asn Thr Ser Ser Leu Val Tyr Gln Leu Asn Phe Asp Gln Met Leu 35 40 45 Arg Asn Val Asp Lys Asp Gly Thr Trp Ser Pro Gly Glu Leu Val Leu 50 55 60 Val Val Gln Val His Asn Arg Pro Glu Tyr Leu Arg Leu Leu Ile Asp 65 70 75 80 Ser Leu Arg Lys Ala Gln Gly Ile Arg Glu Val Leu Val Ile Phe Ser 85 90 95 His Asp Phe Trp Ser Ala Glu Ile Asn Ser Leu Ile Ser Ser Val Asp 100 105 110 Phe Cys Pro Val Leu Gln Val Phe Phe Pro Phe Ser Ile Gln Leu Tyr 115 120 125 Pro Ser Glu Phe Pro Gly Ser Asp Pro Arg Asp Cys Pro Arg Asp Leu 130 135 140 Lys Lys Asn Ala Ala Leu Lys Leu Gly Cys Ile Asn Ala Glu Tyr Pro 145 150 155 160 Asp Ser Phe Gly His Tyr Arg Glu Ala Lys Phe Ser Gln Thr Lys His 165 170 175 His Trp Trp Trp Lys Leu His Phe Val Trp Glu Arg Val Lys Val Leu 180 185 190 Gln Asp Tyr Thr Gly Leu Ile Leu Phe Leu Glu Glu Asp His Tyr Leu 195 200 205 Ala Pro Asp Phe Tyr His Val Phe Lys Lys Met Trp Lys Leu Lys Gln 210 215 220 Gln Glu Cys Pro Gly Cys Asp Val Leu Ser Leu Gly Thr Tyr Thr Thr 225 230 235 240 Ile Arg Ser Phe Tyr Gly Ile Ala Asp Lys Val Asp Val Lys Thr Trp 245 250 255 Lys Ser Thr Glu His Asn Met Gly Leu Ala Leu Thr Arg Asp Ala Tyr 260 265 270 Gln Lys Leu Ile Glu Cys Thr Asp Thr Phe Cys Thr Tyr Asp Asp Tyr 275 280 285 Asn Trp Asp Trp Thr Leu Gln Tyr Leu Thr Leu Ala Cys Leu Pro Lys 290 295 300 Val Trp Lys Val Leu Val Pro Gln Ala Pro Arg Ile Phe His Ala Gly 305 310 315 320 Asp Cys Gly Met His His Lys Lys Thr Cys Arg Pro Ser Thr Gln Ser 325 330 335 Ala Gln Ile Glu Ser Leu Leu Asn Asn Asn Lys Gln Tyr Leu Phe Pro 340 345 350 Glu Thr Leu Val Ile Gly Glu Lys Phe Pro Met Ala Ala Ile Ser Pro 355 360 365 Pro Arg Lys Asn Gly Gly Trp Gly Asp Ile Arg Asp His Glu Leu Cys 370 375 380 Lys Ser Tyr Arg Arg Leu Gln 385 390 <210> 18 <211> 1176 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encodes fusion protein of SEQ ID NO:17 <400> 18 atgctgctga ccaagcgatt ctctaagctg ttcaagctga ccttcatcgt gctgatcctg 60 tgtggcctgt tcgtgatcac caacaagtac atggacgaga acacctcgag cctggtgtac 120 cagctgaact tcgaccagat gctgcgaaac gtggacaagg acggcacctg gtctcccggc 180 gagctggtgc tcgtggtgca ggtgcacaac cgacccgagt acctgcgact gctgatcgac 240 tctctgcgaa aggcccaggg catccgagag gtgctggtga tcttctctca cgacttctgg 300 tctgccgaga tcaactccct gatctcttct gtggacttct gtcccgtgct gcaggtgttc 360 ttcccattca gcatccagct gtacccctct gagttccccg gctctgaccc ccgagactgt 420 ccccgagacc tgaagaagaa cgccgccctg aagctgggct gtatcaacgc cgagtacccc 480 gactctttcg gccactaccg agaggccaag ttctctcaga ccaagcacca ctggtggtgg 540 aagctgcact tcgtgtggga gcgagtgaag gtgctgcagg actacaccgg cctgatcctg 600 ttcctggagg aggaccacta cctggccccc gacttctacc acgtgttcaa gaagatgtgg 660 aagctgaagc agcaggagtg tcccggctgc gacgtgctgt ctctgggcac ctacaccacc 720 atccgatctt tctacggcat cgccgacaag gtggacgtca agacctggaa gtctaccgag 780 cacaacatgg gcctggccct gacccgagat gcctaccaga agctgatcga gtgtaccgac 840 accttctgta cctacgacga ctacaactgg gactggactc tgcagtacct gaccctggcc 900 tgtctgccca aggtgtggaa ggtgctggtg ccccaggccc ctcgaatctt ccacgccggc 960 gactgtggca tgcaccacaa gaagacctgt cgaccctcta cccagtctgc ccagatcgag 1020 tctctgctga acaacaacaa gcagtacctg ttccctgaga ccctggtgat cggcgagaag 1080 ttccccatgg ccgccatctc gcctccccga aagaacggcg gctggggcga catccgagac 1140 cacgaactct gtaagtctta ccgacgactg cagtag 1176 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 19 gtccccgaat tacctttcc 19 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 20 aggtagaagt tgtaaagagt g 21 <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> protein tag <400> 21 His Asp Glu Leu 1 <210> 22 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 22 gccttccaga cctcttggaa cgcctaccac c 31 <210> 23 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 23 gccaggtggc cgcctcgtcg agaagaagat cg 32 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 24 gctggactct tcttctatcc 20 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 25 ggtctccttc agagacagg 19 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 26 ccaagttcta caaggacacc 20 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 27 cccttgacga ccttagagg 19 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 28 gaccagatgc tgcgaaacg 19 <210> 29 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 29 cttgacgtcc accttgtcg 19 <210> 30 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 30 gcctgaacgg cacgatgcga tcgtggcaat cc 32 <210> 31 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 31 caagaagcct caggctcggc gaatctccat c 31 <210> 32 <211> 753 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encodes fusion protein of SEQ ID NO:33 <400> 32 atgaagcttt ccaccatcct tttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc cctcccttcc 60 cccatcactc cttctgaggc cgcagttctc cagaagcgag gcggcggcga cattcagatg 120 actcagtctc cctcttctct gtctgcttct gtgggtgacc gagtgaccat tacctgtcga 180 gcttctcagg acgtgaacac tgctgttgct tggtatcagc agaagcctgg aaaggctcct 240 aagctgctga tctactctgc ctctttcctg tactctggcg tgccttctcg attttctggc 300 tctcgatctg gaaccgactt caccctgacc atttcttctc tgcagcctga ggactttgct 360 acctactact gtcagcagca ttacaccacc cctcctactt ttggacaggg caccaaggtt 420 gagattaagc gaaccgtggc tgctccttct gtgttcattt tccccccctc tgacgagcag 480 ctgaagtctg gaactgcttc tgttgtgtgc ctgctgaaca acttttaccc ccgagaggct 540 aaggttcagt ggaaggtgga caacgctctg cagtctggaa actctcagga gtctgttact 600 gagcaggact ctaaggactc gacctactct ctctcttcta ccctgaccct gtctaaggct 660 gactacgaga agcataaggt gtacgcttgt gaggttaccc atcagggact gtcctctccc 720 gtgaccaagt cttttaaccg aggcgagtgc taa 753 <210> 33 <211> 250 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion of Lip2 protein prepro signal and anti-HER2 antibody light chain <400> 33 Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys 20 25 30 Arg Gly Gly Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 35 40 45 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp 50 55 60 Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro 65 70 75 80 Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser 85 90 95 Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 100 105 110 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr 115 120 125 Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 130 135 140 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 145 150 155 160 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 165 170 175 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 180 185 190 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 195 200 205 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 210 215 220 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 225 230 235 240 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 245 250 <210> 34 <211> 1461 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encodes fusion protein of SEQ ID NO:35 <400> 34 atgaagcttt ccaccatcct tttcacagcc tgcgctaccc tggctgccgc cctcccttcc 60 cccatcactc cttctgaggc cgcagttctc cagaagcgag gcggcggcga ggttcagctg 120 gttgagtctg gtggaggact ggttcagcct ggtggatctc tgcgactgtc ttgtgctgct 180 tctggcttca acatcaagga cacctacatt cattgggtcc gacaggctcc cggaaaggga 240 ctggagtggg ttgcccgaat ctaccctacc aacggctaca ctcgatacgc tgactctgtg 300 aagggacgat tcaccatttc tgccgacacc tctaagaaca ctgcctacct gcagatgaac 360 tctctgcgag ctgaggacac tgctgtgtac tactgttctc gatggggagg tgacggtttt 420 tacgccatgg actactgggg acagggaact ctggtgaccg tttcttctgc ttctaccaag 480 ggaccttctg tgtttcctct ggccccctct tctaagtcta cctctggtgg aactgctgct 540 ctgggatgtc tggtgaagga ctactttcct gagcctgtga ctgtgtcttg gaactctggc 600 gctctgactt ctggtgttca caccttccct gctgttctgc agtcctctgg actgtactct 660 ctctcttctg tggtgaccgt gccttcttct tctctgggaa cccagaccta catctgtaac 720 gtgaaccaca agccctctaa cactaaggtg gacaagaagg tggagcctaa gtcttgtgac 780 aagacccata cctgtccccc ttgtcctgct cctgagctgc tgggaggacc ctctgttttt 840 ctgttccccc ccaagcctaa ggacaccctg atgatttctc gaacccctga ggtgacctgt 900 gttgtggtgg acgtttctca tgaggaccct gaggtgaagt ttaactggta cgtggacggt 960 gttgaggttc acaacgctaa gactaagccc cgagaggagc agtacaactc tacttaccga 1020 gtggtgtctg tgctgactgt tctgcatcag gactggctga acggaaagga atacaagtgt 1080 aaggtctcca acaaggctct gcctgctcct attgaaaaga ccatctctaa ggctaaggga 1140 cagcccagag agcctcaggt ttacactctg cccccttccc gagaggagat gaccaagaac 1200 caggtgtccc tgacttgtct ggtcaaggga ttctacccct ctgacattgc tgttgagtgg 1260 gagtctaacg gacagcctga gaacaactac aagaccaccc ctcctgttct ggactctgac 1320 ggctctttct tcctgtactc taagctgacc gtggacaagt ctcgatggca gcagggaaac 1380 gtgttctctt gttccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagtctctg 1440 tctctgtctc ccggcaagta a 1461 <210> 35 <211> 486 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion of Lip2 protein prepro signal and anti-HER2 antibody heavy chain <400> 35 Met Lys Leu Ser Thr Ile Leu Phe Thr Ala Cys Ala Thr Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Pro Ser Pro Ile Thr Pro Ser Glu Ala Ala Val Leu Gln Lys 20 25 30 Arg Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 35 40 45 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn 50 55 60 Ile Lys Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 65 70 75 80 Leu Glu Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr 85 90 95 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys 100 105 110 Asn Thr Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 115 120 125 Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp 130 135 140 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 145 150 155 160 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 165 170 175 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 180 185 190 Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr 195 200 205 Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val 210 215 220 Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn 225 230 235 240 Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro 245 250 255 Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu 260 265 270 Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 275 280 285 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 290 295 300 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 305 310 315 320 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 325 330 335 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 340 345 350 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 355 360 365 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 370 375 380 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 385 390 395 400 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 405 410 415 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 420 425 430 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 435 440 445 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 450 455 460 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 465 470 475 480 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 485

Claims (66)

  1. GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들(glycans)을 포함하는 단백질들을 생성할 수 있는 곰팡이 세포를 제조하는 방법에 있어서,
    (a) Man5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제(transferase) I 내로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 핵산은 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I을 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내의 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I의 발현이 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 세포는 상기 GlcNAcMan5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 Fc 수용기에 결합하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 항체 또는 그 단편(fragment)인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  5. 제 2 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 치료 글리코프로테인(glycoprotein)인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 인터페론-β, GM-CSF, 인터페론 K 또는 에리쓰로포에틴(erythropoietin)인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 세포내 구간은 골지체(Golgi apparatus)인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 Man5GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되는 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 결핍되고, 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제(mannosidase)를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 I-1,2-만노시다제는 상기 코딩된 I-1,2-만노시다제를 소포체(endoplasmic reticulum)로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 타게팅하는 배열은 HDEL 배열인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 Yarrowia lipolytica 또는 Arxula adeninivorans인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포내로 핵산 코딩된 만노시다제 II를 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 만노시다제 II는 상기 코딩된 만노시다제 II를 상기 골지체로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내의 상기 만노시다제 II의 발현이 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  12. 제 1 항 또는 제 11 항에 있어서, 상기 세포내로 핵산 코딩된 갈락토시트랜스페라제(galactosyltransferase)를 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내의 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 또는 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 세포내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 세포는 상기 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 또는 상기 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  14. 제 12 항에 있어서, 상기 갈락토실트랜스페라제는 UDP-Glc-4-에피메라제(epimerase) 및 β-1,4-갈락토실트랜스페라제 I의 촉매 도메인(catalytic domain)의 융합체인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 GalGlcNAcMan5GlcNAc2 또는 상기 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 추출(isolating)하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  16. GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 타겟 단백질을 제조하는 방법에 있어서,
    (a) 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, I-1,2-만노시다제 및 만노시다제 II를 포함하도록 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포를 제공하는 단계를 구비하며, 상기 핵산은 각 코딩된 단백질이 세포내 구간에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 OCH1 활성이 결핍되며,
    (b) 상기 세포내에 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 구비하고, 상기 세포는 상기 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 Yarrowia lipolytica 또는 Arxula adeninivorans인 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  18. 제 16 항에 있어서, 상기 핵산 코딩된 상기 I-1,2-만노시다제는 상기 코딩된 I-1,2-만노시다제를 소포체에 타겟하도록 소포체 타게팅하는 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 타게팅하는 배열은 HDEL 배열인 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  20. 제 16 항에 있어서, 상기 핵산 코딩된 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 상기 만노시다제 II는 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 및 만노시다제 II가 골지체에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 골지 타게팅하는 배열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  21. 제 16 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 Fc 수용기에 결합되는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  22. 제 16 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 항체 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  23. 제 16 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 치료 글리코프로테인인 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  24. 제 16 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 인터페론-β, GM-CSF, 인터페론 K 또는 에리쓰로포에틴인 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  25. 제 16 항에 있어서, 상기 세포내로 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 추출하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  27. GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성할 수 있는 곰팡이 세포의 제조 방법에 있어서,
    (a) Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포를 제공하는 단계; 및
    (b) 상기 세포 내로 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I을 도입하는 단계를 구비하며, 상기 핵산은 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I가 세포내 구간에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I의 발현이 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 세포가 상기 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 Fc 수용기에 결합하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  30. 제 27 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 항체 또는 그 단편인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  31. 제 27 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 치료 글리코프로테인인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  32. 제 27 항에 있어서, 상기 타겟 단백질은 인터페론-β, GM-CSF, 인터페론 K 또는 에리쓰로포에틴인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  33. 제 27 항에 있어서, 상기 세포내 구간은 골지체인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  34. 제 27 항에 있어서, Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 상기 곰팡이 세포는 ALG3 활성이 결핍되고, 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제를 포함하며, 상기 핵산은 상기 코딩된 I-1,2-만노시다제를 상기 소포체에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 상기 곰팡이 세포는 OCH1 활성도 결핍되는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  36. 제 34 항 또는 제 35 항에 있어서, Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조된 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 I-1,3-글리코실트랜스페라제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 I-1,3-글리코실트랜스페라제는 ALG6인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  38. 제 27 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 Yarrowia lipolytica 또는 Arxula adeninivorans인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  39. 제 27 항에 있어서, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II는 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서의 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II의 발현이 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  40. 제 27 항 또는 제 39 항에 있어서, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내의 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 세포는 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  42. 제 40 항에 있어서, 상기 갈락토실트랜스페라제는 UDP-Glc-4-에피메라제 및 β-1,4-갈락토실트랜스페라제 I의 촉매 도메인의 융합체인 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  43. 제 40 항에 있어서, 상기 세포 내로 핵산 코딩된 글루코시다제(Glucosidase) II의 I 및 β 서브유닛들을 도입하는 단계를 더 포함하며, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 GalGlcNAcMan3GlcNAc2 또는 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 반댁질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포의 제조 방법.
  44. Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 타겟 단백질을 제조하는 방법에 있어서,
    (a) ALG3 활성이 결핍되고 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, GlcNAc-트랜스페라제 II 및 갈락토실트랜스페라제를 포함하도록 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포를 제공하는 단계를 구비하고, 상기 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, GlcNAc-트랜스페라제 II 및 갈락토실트랜스페라제는 각기 코딩된 단백질을 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하며,
    (b) 상기 세포 내로 핵산 코딩된 타겟 단백질을 도입하는 단계를 구비하고, 상기 세포는 상기 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 OCH1 활성도 결핍되는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  46. 제 44 항 또는 제 45 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실트랜스페라제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실트랜스페라제는 ALG6인 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  48. 제 44 항, 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들을 더 포함하며, 상기 곰팡이 세포 내에서의 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 상기 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 타겟 단백질의 제조 방법.
  49. GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되어 추출된 곰팡이 세포에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 OCH1 활성이 결핍되고, 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트랜스페라제 및 만노시다제 II를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 I-1,2-만노시다제, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 및 상기 만노시다제 II가 각 코딩된 단백질을 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트랜스페라제 및 만노시다제 II의 발현이 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  50. 제 49 항에 있어서, 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 타겟 단백질을 더 포함하며, 상기 세포가 상기 GlcNAcMan3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  51. 제 49 항 또는 제 50 항에 있어서, 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II는 상기 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 II를 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II의 발현이 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 상기 핵산 코딩된 상기 갈락토실트랜스페라제를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  53. GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되어 추출된 곰팡이 세포에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 ALG3 활성이 결핍되도록 유전공학적으로 제조되고, 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 GlcNAc-트랜스페라제 II를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I 및 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II는 각 코딩된 단백질을 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 OCH1 활성도 결핍되는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  55. 제 53 항 또는 제 54 항에 있어서, 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실트랜스페라제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  56. 제 53 항, 제 54 항 또는 제 55 항에 있어서, 상기 유전공학적으로 제조된 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 타겟 단백질을 더 포함하며, 상기 세포가 상기 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하도록 변형된 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  57. 제 53 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들을 더 포함하며, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 상기 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 곰팡이 세포는 핵산 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 더 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 갈락토실트랜스페라제는 상기 코딩된 갈락토실트랜스페라제를 상기 골지체에 타겟하도록 뉴클레오티드 배열이 코딩된 타게팅하는 배열을 포함하고, 상기 곰팡이 세포 내에서 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 곰팡이 세포.
  59. Yarrowia lipolytica 세포들의 실질적으로 순수한 배양에 있어서, 그 실질적인 숫자가 Gal2GlcNac2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 글리코프로테인을 생성하도록 유전공학적으로 제조되며, 상기 세포들은 ALG3 활성이 결핍되게 유전공학적으로 제조되고 핵산 코딩된 GlcNAc-트랜스페라제 I, GlcNAc-트랜스페라제 II 및 갈락토실트랜스페라제를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제는 각 코딩된 단백질을 세포내 구간으로 타겟하도록 뉴클레오티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 세포들 내에서 상기 GlcNAc-트랜스페라제 I, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 배양.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 세포들이 OCH1 활성도 결핍되는 것을 특징으로 실질적으로 순수한 배양.
  61. 제 59 항 또는 제 60 항에 있어서, 상기 세포들이 핵산 코딩된 I-1,3-글루코실트랜스페라제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 배양.
  62. 제 59 항, 제 60 항 또는 제 61 항에 있어서, 상기 세포들이 핵산 코딩된 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들을 더 포함하며, 상기 세포들 내에서 상기 글루코시다제 II의 I 및 β 서브유닛들의 발현이 상기 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 상기 타겟 단백질을 생성하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 배양.
  63. Yarrowia lipolytica 세포들의 실질적으로 순수한 배양(pure culture)에 있어서, 그 실질적인 숫자가 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 글리코프로테인들을 생성하도록 유전공학적으로 제조되며, 상기 세포들이 OCH1 활성이 결핍되게 유전공학적으로 제조되고 핵산 코딩된 I-1,2-만노시다제, GlcNAc-트랜스페라제, 만노시다제 II, GlcNAc-트랜스페라제 II 및 갈락토실트랜스페라제를 포함하며, 상기 핵산 코딩된 상기 I-1,2-만노시다제, 상기 GlcNAc-트랜스페라제, 상기 만노시다제 II, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제는 각 코딩된 단백질을 세포내 구단으로 타겟하도록 뉴클레어티드 배열들이 코딩된 타게팅하는 배열들을 포함하고, 상기 세포들 내에서 상기 I-1,2-만노시다제, 상기 GlcNAc-트랜스페라제, 상기 만노시다제 II, 상기 GlcNAc-트랜스페라제 II 및 상기 갈락토실트랜스페라제의 발현이 Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들을 포함하는 단백질들을 생성하는 것을 특징으로 하는 실질적으로 순수한 배양.
  64. 글리코프로테인을 포함하는 조성물에 있어서, 상기 글로코프로테인 상의 N-글리칸들의 적어도 50%가 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들인 것을 특징으로 하는 조성물.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 클리코프로테인 상의 상기 N-글리칸들의 적어도 70%가 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들인 것을 특징으로 하는 조성물.
  66. 제 64 항에 있어서, 상기 클리코프로테인 상의 상기 N-글리칸들의 적어도 85%가 GlcNAc2Man3GlcNAc2 N-글리칸들인 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020127015208A 2009-11-19 2010-11-19 효모 스트레인 생성용 포유류 유사 복합 ｎ-글리칸들 KR20130055555A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US26282809P 2009-11-19 2009-11-19
US61/262,828 2009-11-19
PCT/IB2010/003154 WO2011061629A2 (en) 2009-11-19 2010-11-19 Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130055555A true KR20130055555A (ko) 2013-05-28

Family

ID=44060124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020127015208A KR20130055555A (ko) 2009-11-19 2010-11-19 효모 스트레인 생성용 포유류 유사 복합 ｎ-글리칸들

Country Status (9)

Country Link
US (3) US20130053550A1 (ko)
EP (1) EP2501805B1 (ko)
JP (1) JP2013511272A (ko)
KR (1) KR20130055555A (ko)
CN (1) CN102834509A (ko)
BR (1) BR112012011980A2 (ko)
CA (1) CA2781240A1 (ko)
DK (1) DK2501805T3 (ko)
WO (1) WO2011061629A2 (ko)

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101811057B1 (ko) * 2007-04-03 2017-12-20 옥시레인 유케이 리미티드 분자의 글리코실화
CN102712914A (zh) 2009-09-29 2012-10-03 根特大学 水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖
BR112012011980A2 (pt) 2009-11-19 2021-09-08 Oxyrane Uk Limited Métodos de produzir células transformadas de yarrowia lipolytica e proteínas-alvocompreendendo n-glicanos, células transformadas de yarrowia lipolytica e suas culturas, bem como composição compreendendo glicoproteínas
EP2622089B1 (en) 2010-09-29 2023-11-01 Oxyrane UK Limited De-mannosylation of phosphorylated n-glycans
SG189108A1 (en) 2010-09-29 2013-05-31 Oxyrane Uk Ltd Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
SG11201403506TA (en) 2011-12-30 2014-07-30 Oxyrane Uk Ltd Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins
CA2861697C (en) * 2012-01-05 2022-03-15 Novartis Ag Protease deficient filamentous fungal cells and methods of use thereof
KR20190114003A (ko) 2012-03-15 2019-10-08 옥시레인 유케이 리미티드 폼페병의 치료를 위한 방법 및 물질
PL2991683T3 (pl) 2013-05-02 2020-03-31 Glykos Finland Oy Koniugaty glikoproteiny lub glikanu z toksycznym ładunkiem
US9987373B2 (en) 2013-10-14 2018-06-05 Synaffix B.V. Modified glycoprotein, protein-conjugate and process for the preparation thereof
US10260052B2 (en) 2014-02-24 2019-04-16 Novogy, Inc. Diacylgylcerol acyl transferase (DGA1) polynucleotides, and methods of increasing yeast cell lipid production by overexpression of heterologous DGA1
CA2954974A1 (en) 2014-07-21 2016-01-28 Glykos Finland Oy Production of glycoproteins with mammalian-like n-glycans in filamentous fungi
CN109312368B (zh) * 2016-05-03 2023-07-25 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 用于产生衍生自真菌工程化宿主的复合聚糖的手段和方法
WO2020060948A1 (en) 2018-09-17 2020-03-26 Levadura Biotechnology, Inc. Production of cannabinoids in yeast using a fatty acid feedstock
KR102167388B1 (ko) * 2020-01-15 2020-10-19 코스맥스 주식회사 신규 로도스포리디움 토룰로이데스 균주 및 그 균주 배양액을 포함하는 화장료 조성물
CN116042562B (zh) * 2022-03-11 2023-10-20 山东恒鲁生物科技有限公司 重组酵母菌及其应用

Family Cites Families (89)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4307717A (en) 1977-11-07 1981-12-29 Lectec Corporation Sterile improved bandage containing a medicament
US4704362A (en) 1977-11-08 1987-11-03 Genentech, Inc. Recombinant cloning vehicle microbial polypeptide expression
US4352883A (en) 1979-03-28 1982-10-05 Damon Corporation Encapsulation of biological material
JPS5754588A (en) 1980-09-19 1982-04-01 Eiji Ichijima Alpha-mannosidase
US4353888A (en) 1980-12-23 1982-10-12 Sefton Michael V Encapsulation of live animal cells
US4407957A (en) 1981-03-13 1983-10-04 Damon Corporation Reversible microencapsulation of a core material
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4837148A (en) 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4882279A (en) 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4883666A (en) 1987-04-29 1989-11-28 Massachusetts Institute Of Technology Controlled drug delivery system for treatment of neural disorders
US4929555A (en) 1987-10-19 1990-05-29 Phillips Petroleum Company Pichia transformation
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5283187A (en) 1987-11-17 1994-02-01 Brown University Research Foundation Cell culture-containing tubular capsule produced by co-extrusion
DE3829766A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Verfahren zur herstellung von membranen
DE3829752A1 (de) 1988-09-01 1990-03-22 Akzo Gmbh Integrale asymmetrische polyaethersulfonmembran, verfahren zur herstellung und verwendung zur ultrafiltration und mikrofiltration
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5084350A (en) 1990-02-16 1992-01-28 The Royal Institution For The Advance Of Learning (Mcgill University) Method for encapsulating biologically active material including cells
US5272070A (en) 1991-03-08 1993-12-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Method for the preparation of cell lines producing Man3 GlcNac 2 asparagine-linked gylcans and cell lines produced thereby
ES2107537T3 (es) 1991-04-25 1997-12-01 Univ Brown Res Found Vehiculo inmunoaislante biocompatible implantable para suministrar productos terapeuticos seleccionados.
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US6042828A (en) 1992-09-07 2000-03-28 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Humanized antibodies to ganglioside GM2
WO1995005452A2 (en) 1993-08-12 1995-02-23 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5589359A (en) 1994-08-05 1996-12-31 Chiron Corporation Chimeric proteins
US5834251A (en) * 1994-12-30 1998-11-10 Alko Group Ltd. Methods of modifying carbohydrate moieties
AU2887897A (en) 1996-05-21 1997-12-09 Novo Nordisk A/S Novel yeast promoters suitable for expression cloning in yeast and heterologous expression of proteins in yeast
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
US6300065B1 (en) 1996-05-31 2001-10-09 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
AU3255397A (en) 1996-07-05 1998-02-02 Novo Nordisk A/S Method for the production of precursors of insulin, precursors of insulin analogues, and insulin like peptides
JP3998717B2 (ja) 1996-07-05 2007-10-31 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ ポリペプチド類の製造方法
US6110703A (en) 1996-07-05 2000-08-29 Novo Nordisk A/S Method for the production of polypeptides
EP0975775B1 (en) 1997-04-23 2004-03-17 Vlaams Interuniversitair Instituut voor Biotechnologie Regulatory system for inducible expression of genes with lambdoid promoters
US7442772B2 (en) 1997-12-03 2008-10-28 Genentech, Inc. Antibodies to PRO361 polypeptide
AU2241699A (en) 1998-01-27 1999-08-09 Board Of Regents Of The University And Community College System Of Nevada, The Expression of proteolytically-sensitive peptides
WO2001042462A2 (en) 1999-12-08 2001-06-14 National University Of Singapore Phospholipase a2 inhibitory peptides from python reticulatus
EP1246915A2 (en) 1999-12-30 2002-10-09 Maxygen Aps Improved lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
US20020127219A1 (en) 1999-12-30 2002-09-12 Okkels Jens Sigurd Lysosomal enzymes and lysosomal enzyme activators
DK1283265T3 (da) 2000-05-17 2009-11-09 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Fremgangsmåde til fremstilling af protein med reduktion af mannosephosphat i sukkerkæden og glycoprotein fremstillet derved
US7795002B2 (en) * 2000-06-28 2010-09-14 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US7863020B2 (en) 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
WO2002000879A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) * 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
EP2267135A3 (en) 2000-06-30 2011-09-14 Vib Vzw Protein glycosylation modification in pichia pastoris
ES2258371B1 (es) 2000-08-31 2007-05-16 Dong Kook Pharmaceutical Co. Ltd. Levadura transformante productora de hormona paratiroidea humana y procedimiento para producir la hormona.
US7001994B2 (en) 2001-01-18 2006-02-21 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose 6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins
JP4774496B2 (ja) 2001-06-14 2011-09-14 独立行政法人産業技術総合研究所 α−マンノシダーゼ
JP4742191B2 (ja) 2001-06-14 2011-08-10 独立行政法人産業技術総合研究所 糖蛋白質およびその製造方法
ATE434040T1 (de) 2001-10-01 2009-07-15 Dyax Corp Mehrkettige eukaryontische display-vektoren und deren verwendungen
US7473680B2 (en) * 2001-11-28 2009-01-06 Neose Technologies, Inc. Remodeling and glycoconjugation of peptides
US8932825B2 (en) 2001-12-27 2015-01-13 Glycofi Inc. Method to engineer mammalian-type carbohydrate structures
DK1527100T3 (da) 2002-03-29 2009-09-07 Schering Corp Humane monoklonale antistoffer mod interleukin-5 og fremgangsm der og sammens tninger omfattende samme
EP1505149B1 (en) 2002-04-26 2009-01-07 Kirin Pharma Kabushiki Kaisha Methylotroph yeast producing mammalian type sugar chain
IL165717A0 (en) 2002-06-26 2006-01-15 Flanders Interuniversity Inst A strain of methylotrophic yeast for producing proteins
DE60334109D1 (de) 2002-06-29 2010-10-21 Leadbio Inc Yapsin-mangelmutantenstamm von hansenula polymorpha sowie verfahren zur herstellung rekombinanter proteine damit
KR100470978B1 (ko) 2003-01-02 2005-03-10 한국생명공학연구원 앱신 다중 결손 효모 변이 균주 및 이를 이용한 재조합 단백질의 생산 방법
AU2012206984B2 (en) 2003-02-11 2015-07-09 Takeda Pharmaceutical Company Limited Diagnosis and treatment of multiple sulfatase deficiency and other using a formylglycine generating enzyme (FGE)
JP4259169B2 (ja) 2003-04-16 2009-04-30 昭和産業株式会社 新規α−１，２−マンノシダーゼおよびその遺伝子、ならびに該酵素を用いたα−マンノシル糖化合物の製造方法
US7259255B2 (en) 2003-06-25 2007-08-21 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and phosphoglycerate mutase promoters for gene expression in oleaginous yeast
ES2528739T3 (es) 2003-12-24 2015-02-12 Glycofi, Inc. Métodos para eliminar la manosilfosforilación de glucanos en la producción de glucoproteínas
ES2344302T3 (es) 2004-02-10 2010-08-24 Zystor Therapeutics , Inc. Alfa glucosidasa acida y fragmentos de la misma.
US20050265988A1 (en) 2004-03-18 2005-12-01 Byung-Kwon Choi Glycosylated glucocerebrosidase expression in fungal hosts
WO2005100584A2 (en) 2004-04-15 2005-10-27 Glycofi, Inc. Production of galactosylated glycoproteins in lower eukaryotes
CA2501422C (en) 2004-04-29 2014-08-12 University Of Rochester Lymphoid chemokines in the diagnosis, monitoring and treatment of autoimmune disease
WO2005106010A2 (en) 2004-04-29 2005-11-10 Glycofi, Inc. Methods for reducing or eliminating alpha-mannosidase resistant glycans in the production of glycoproteins
US20060014264A1 (en) 2004-07-13 2006-01-19 Stowers Institute For Medical Research Cre/lox system with lox sites having an extended spacer region
US7431927B2 (en) 2005-03-24 2008-10-07 Epitomics, Inc. TNFα-neutralizing antibodies
CA2604917A1 (en) 2005-04-14 2007-01-25 Csir Recombinant yeasts for synthesizing epoxide hydrolases
US8202523B2 (en) 2005-09-22 2012-06-19 ProSci, Inc. Glycosylated polypeptides produced in yeast mutants and methods of use thereof
US20080081035A1 (en) 2006-10-03 2008-04-03 National Enzyme Company Therapeutic protease compositions
EP2068914A4 (en) 2007-02-09 2011-07-20 Medimmune Llc PRESENTATION OF ANTIBODY BANK BY PLASMA MEMBRANES OF YEAST CELLS
KR101811057B1 (ko) * 2007-04-03 2017-12-20 옥시레인 유케이 리미티드 분자의 글리코실화
WO2008143354A1 (ja) 2007-05-18 2008-11-27 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research 酵素補充療法用医薬組成物
US8825012B2 (en) * 2007-09-14 2014-09-02 Unwired Planet, Llc User data notification in a mobile communications system
PT2245145T (pt) 2008-01-18 2017-03-14 Biomarin Pharm Inc Fabrico de enzimas sulfatase lisossómicas humanas altamente fosforiladas e suas utilizações
AU2009215739A1 (en) * 2008-02-20 2009-08-27 Glycofi, Inc. Vectors and yeast strains for protein production
CN102066422B (zh) 2008-05-07 2015-07-22 宝玛瑞制药公司 溶酶体靶向肽及其应用
CA2753584A1 (en) 2009-02-26 2010-09-02 Glaxosmithkline Llc Host cells and methods of use
CN102712914A (zh) 2009-09-29 2012-10-03 根特大学 水解甘露糖-1-磷酸-6-甘露糖连接为磷酸-6-甘露糖
BR112012011980A2 (pt) 2009-11-19 2021-09-08 Oxyrane Uk Limited Métodos de produzir células transformadas de yarrowia lipolytica e proteínas-alvocompreendendo n-glicanos, células transformadas de yarrowia lipolytica e suas culturas, bem como composição compreendendo glicoproteínas
FR2954349A1 (fr) 2009-12-22 2011-06-24 Agronomique Inst Nat Rech Sulfatase modifiant selectivement les glycosaminoglycanes
EP2526193A1 (en) 2010-01-21 2012-11-28 Oxyrane UK Limited Methods and compositions for displaying a polypeptide on a yeast cell surface
US20120135461A1 (en) 2010-07-30 2012-05-31 William James Cook Production of glycoproteins with reduced o-glycosylation comprising the use of an alpha-1,2-mannosidase
SG189108A1 (en) 2010-09-29 2013-05-31 Oxyrane Uk Ltd Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated n-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
EP2622089B1 (en) 2010-09-29 2023-11-01 Oxyrane UK Limited De-mannosylation of phosphorylated n-glycans
SG11201403506TA (en) 2011-12-30 2014-07-30 Oxyrane Uk Ltd Methods and materials for reducing degradation of recombinant proteins
KR20190114003A (ko) 2012-03-15 2019-10-08 옥시레인 유케이 리미티드 폼페병의 치료를 위한 방법 및 물질
EP2964758B1 (en) 2013-03-05 2020-05-27 Oxyrane UK Limited Production of catalytically active type i sulfatase

Also Published As

Publication number Publication date
EP2501805A2 (en) 2012-09-26
US10287557B2 (en) 2019-05-14
US11225646B2 (en) 2022-01-18
EP2501805B1 (en) 2019-02-20
US20130053550A1 (en) 2013-02-28
CN102834509A (zh) 2012-12-19
JP2013511272A (ja) 2013-04-04
DK2501805T3 (en) 2019-04-15
US20150337273A1 (en) 2015-11-26
BR112012011980A2 (pt) 2021-09-08
WO2011061629A3 (en) 2011-12-01
US20190233802A1 (en) 2019-08-01
WO2011061629A2 (en) 2011-05-26
CA2781240A1 (en) 2011-05-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11225646B2 (en) Yeast strains producing mammalian-like complex n-glycans
JP6511476B2 (ja) 分子のグリコシル化
US9347050B2 (en) Mannosidases capable of uncapping mannose-1-phospho-6-mannose linkages and demannosylating phosphorylated N-glycans and methods of facilitating mammalian cellular uptake of glycoproteins
US10344310B2 (en) De-mannosylation of phosphorylated N-glycans
JP2010523102A5 (ko)
CA2762982A1 (en) Glycosylation of molecules

Legal Events

Date Code Title Description
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid