BR102012025657A2

BR102012025657A2 - Moléculas de ácido nucleico que se direcionam a rps6 e conferem resistência a pestes coleópteras

Info

Publication number: BR102012025657A2
Application number: BRBR102012025657-6A
Authority: BR
Inventors: Kenneth E Narva; Huarong Li; Chaoxian Geng; Ignacio Larrinua; Monica Britt Olson; Navin Elango
Original assignee: Dow Agrosciences Llc
Priority date: 2011-10-06
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2014-03-18
Also published as: AR088263A1; US20130097730A1; UY34371A; TW201321511A; WO2013052908A2; WO2013052908A3; US9534232B2

Abstract

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE SE DIRECIONAM A RPS6 E CONFEREM RESISTÊNCIA A PESTES COLEÓPTERAS. A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico e métodos para uso das mesmas para controle de pestes coleópteras através da inibição mediada por interferência de RNA de sequências de codificação e não codificação transcritas-alvo em pestes coleôpteras. A invenção refere-se também a métodos para fabricação de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pestes coleópteras e a células de planta e plantas então obtidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO QUE SE DIRECIONAM A RPS6 E CONFEREM RESISTÊNCIA A PESTES COLEÓPTERAS".

Pedidos Relacionados O presente pedido reivindica prioridade para Pedido de Patente

Provisório U.S. N0. 61/544.219 depositado em 6 de outubro de 2011.

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se em geral a controle genético de dano à planta causado por pestes coleópteras. Em modalidades particulares, 10 a presente invenção refere-se à identificação de seqüências de codificação e não codificação-alvo e ao uso de tecnologias de DNA recombinante para reprimir ou inibir pós-transcripcionalmente expressão de seqüências de codi- ficação e não codificação-alvo nas células de uma peste coleóptera para prover um efeito protetor à planta.

Antecedentes

A lagarta da raiz do milho do oeste (WCR) (Western Corn Rootworm), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de lagarta da raiz do milho mais devastadoras na América do Norte e é uma preocupação particular em áreas de cultivo de milho do meio-oeste dos 20 Estados Unidos. A lagarta da raiz do milho do norte (NCR) (Northern Corn Rootworm), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie intima- mente relacionada que co-habita muito da mesma faixa que WCR. Há várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pestes significantes na América do Norte: a lagarta da raiz do milho do México 25 (MCR) (Mexican Corn Rootworm), D. virgifera zeae Krysan e Smith; a la- garta da raiz do milho do sul (SCR) (Southern Corn Rootworm), D. unde- cimpunctata howardi Barber; D. baiteata LeConte; D. undecimpunctata tenella] e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agri- cultura dos Estados Unidos estima que as lagartas da raiz do milho cau- 30 sem 1 bilhão de dólares em receita perdida a cada ano, incluindo 800 mi- lhões de dólares em perda de rendimento e 200 milhões de dólares em custos de tratamento. Ambas a WCR e a NCR são depositadas no solo como ovos du- rante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante todo o in- verno. Os ovos são oblongos, brancos e de menos do que 0,1 mm (0,004 polegada) de comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou início de 5 junho, com o momento preciso de eclosão do ovo variando de ano para ano devido a diferenças em temperatura e local. As larvas recém-eclodidas são vermes brancos que são de menos do que 3,18 mm (0,125 polegada) de comprimento. Uma vez eclodida, a larva começa a se alimentar das raízes de milho. As lagartas da raiz do milho passam por três estágios larvais. Após 10 se alimentarem por várias semanas, as larvas mudam para o estágio pupal. Elas pupam no solo e então elas emergem do solo como adultos em julho e agosto. Lagartas da raiz adultas são de cerca de 6,35 mm (0,25 polegada) de comprimento.

As larvas da lagarta da raiz do milho completam o desenvolvi- mento em milho e várias outras espécies de gramíneas. As larvas cultivadas em foxtail amarela emergem mais tarde e têm um tamanho de cápsula de cabeça menor como adultos do que as larvas cultivadas em milho. Ellsbury e outros (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. WCR adultas se alimentam do cabelo, pólen e grãos de milho nas pontas das espigas expostas. Se WCR adultas emergirem antes dos tecidos reprodutivos de milho estarem presen- tes, elas podem se alimentar de tecido de folha, desta maneira deixando mais lento o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hos- pedeiro. No entanto, os adultos vão rapidamente mudar para cabelos e pó- len preferidos quando eles estiverem disponíveis. NCR adultas se alimentam também de tecidos reprodutores da planta de milho, mas em contraste rara- mente se alimentam de folhas do milho.

A maioria do dano da lagarta da raiz em milho é causada por a- limentação larval. Lagartas da raiz recém-eclodidas inicialmente se alimen- tam de pelos da raiz do milho finos e se escondem nas pontas da raiz. Con- 30 forme as larvas crescem, elas se alimentam de e se escondem em raízes primárias. Quando as lagartas da raiz do milho são abundantes, alimentação larval frequentemente resulta em corte das raízes em todo o caminho para a base do caule do milho. Dano à raiz severo interfere com a habilidade da raiz em transportar água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta e resulta em produção de grão reduzida, desta maneira reduzindo drasticamente o rendimento geral. Dano à raiz severo também resulta fre- 5 quentemente em alojamento de plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e diminui mais o rendimento. Ainda, alimentação por adultos nos teci- dos reprodutores do milho pode resultar em corte de cabelos na ponta da espiga. Se esta "redução em cabelo" for severa o suficiente durante a dis- persão do pólen, polinação pode ser interrompida.

Controle de lagartas da raiz do milho pode ser tentado através

de rotação de cultura, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva de formação de esporo, Bacillus thuringiensis) ou uma combinação dos mesmos. Rotação de cultura sofre da desvantagem signifi- cante de imposição de restrição indesejada ao uso da terra. Além disso, ovi- 15 posição de algumas espécies de lagarta da raiz pode ocorrer em campos de soja, desta maneira mitigando a eficácia de rotação de cultura praticada com milho e soja.

Inseticidas químicos são a estratégia mais usada para obter con- trole da lagarta da raiz do milho. Uso de inseticida químico, no entanto, é 20 uma estratégia de controle da lagarta da raiz do milho imperfeita; mais de 1 bilhão de dólares pode ser perdido nos Estados Unidos a cada ano devido à lagarta da raiz do milho quando os custos dos inseticidas químicos são adi- cionados aos custos do dano da lagarta da raiz que pode ocorrer apesar do uso dos inseticidas. Grande número de populações de larva, chuvas fortes e 25 aplicação imprópria do(s) inseticida(s) podem resultar em controle da lagarta da raiz do milho inadequado. Ainda, o uso contínuo de inseticidas pode sele- cionar linhagens da lagarta da raiz do milho resistentes a inseticida, bem como criar preocupações ambientais significantes devido à toxidez de muitos deles a espécies não alvo.

Interferência de RNA (RNAi) é um processo utilizando cursos ce-

lulares endógenos, desta maneira uma molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para toda, ou qualquer porção de tamanho adequado, uma seqüência de gene-alvo resulta na degradação do mRNA então codificado. Nos últimos anos, RNAi tem sido usado para realizar "inativação" de gene em várias espécies e sis- temas experimentais; por exemplo, Caenorhabitis elegans, plantas, embriões 5 de inseto e células em cultura de tecido. Vide, por exemplo, Fire e outros (1998) Nature 391:806-11; Martinez e outros (2002) Cell 110:563-74; McMa- nus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.

RNAi realiza degradação de mRNA através de um curso endó- geno incluindo o complexo de proteína DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, chamados RNA de interferência pequenos (siRNA). O siRNA é não espirala- do em dois RNAs de filamento simples: o filamento passageiro e o filamento guia. O filamento passageiro é degradado, e o filamento guia é incorporado ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC) (RNA-induced si- Iencing complex). Moléculas de ácido ribonucleico microinibidoras (miRNA) podem ser similarmente incorporadas a RISC. Silenciamento de gene pós- transcripcional ocorre quando o filamento guia se liga especificamente a uma seqüência complementar de uma molécula de mRNA e induz ciivagem por Argonauta, o componente catalítico do complexo RISC. Este processo é co- nhecido se espalhar sistemicamente através do organismo apesar de con- centrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucarion- tes tais como plantas, nematoides e alguns insetos.

Apenas transcritos complementares ao siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados, e então a inativação de expressão de mRNA é espe- 25 cífica de seqüência. Em plantas, vários grupos funcionais de genes de DI- CER existem. O efeito de silenciamento de gene de RNAi persiste por dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio em abundância do transcrito direcionado de 90% ou mais, com redução conseqüente em níveis da proteína correspondente.

A Patente U.S. N0. 7.612.194 e as Publicações de Patente U.S.

Nos. 2007/0050860 e 2010/0192265 revelam uma biblioteca de 9112 se- qüências de etiqueta de seqüência expressa (EST) (Expressed Sequence Tag) isoladas de pupa de D. v. virgifera LeConte. É sugerido na Patente U.S. N0. 7.612.194 e na Publicação de Patente U.S. N0. 2007/0050860 ligar ope- ravelmente a um promotor uma molécula de ácido nucleico que é comple- mentar a uma de várias seqüências parciais particulares de H+-ATPase tipo 5 vacuolar de D. v. virgifera (V-ATPase) reveladas nelas para a expressão de RNA de antissentido em células de planta. A Publicação de Patente U.S. N0. 2010/0192265 sugere ligar operavelmente um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma seqüência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não revelada (a se- 10 quência parcial é declarada ser 58% idêntica ao produto de gene C56C10.3 em C. eiegans) para a expressão de RNA de antissentido em células de planta.

Nenhuma sugestão adicional é provida nessas publicações de usar qualquer seqüência particular das mais de nove mil seqüências listadas 15 nelas para interferência de RNA1 que não as várias seqüências parciais par- ticulares de V-ATPase e a seqüência parcial particular de um gene de fun- ção desconhecida. Ainda, nenhuma da Patente U.S. N0. 7.612.194 e das Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860 e 2010/0192265 provê qualquer orientação das quais outras das mais de nove mil seqüências pro- 20 vidas seriam letais, ou até mesmo úteis, em espécies de lagarta da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A maioria esmagadora dessas seqüências não é letal em espécies da lagarta da raiz do milho quando usa- das como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum e outros (2007) Nat. Biote- ch. 25(11): 1322-6 descrevem os efeitos de inibição de vários-alvos de gene 25 de WCR por RNAi. Esses autores relataram que 8 de 26 genes-alvo que e- Ies testaram não foram capazes de prover mortalidade de peste coleóptera experimentalmente significante em uma concentração de iRNA muito alta (por exemplo, dsRNA) de mais de 520 ng/cm2.

Sumário da Invenção São reveladas aqui moléculas de ácido nucleico (por exemplo,

genes-alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs), e métodos de uso das mesmas, para o controle de pestes coleópteras, incluindo, por exemplo, D. v. virgifera LeConte (lagarta da raiz do milho do oeste, 'WCR"); D. barberi Smith e Lawrence (lagarta da raiz do milho do norte, "NCR"); D. u. howardi Barber (lagarta da raiz do milho do sul, "SCR"); D. v. zeae Krysan e Smith (lagarta da raiz do milho do México, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. te- 5 nella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. Em exemplos particulares, mo- léculas de ácido nucleico exemplares são reveladas, as quais podem ser homólogas a pelo menos uma porção de uma ou mais seqüências de ácido nucleico nativas em uma peste coleóptera.

Nesses e em exemplos adicionais, a seqüência de ácido nuclei- co nativa pode ser um gene-alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um pro- cesso reprodutor; ou envolvido em desenvolvimento larval. Em alguns e- xemplos, inibição pós-traducional da expressão de um gene-alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma seqüência homóloga ao mesmo pode ser letal em pestes coleópteras ou resultar em crescimento e/ou reprodução reduzidos. Em exemplos específicos, o pelo menos um ge- ne selecionado da lista consistindo em comprimento integral de PP1-87B (algumas vezes referido aqui como "PP1-87B"); proteína fosfatase con- tig0011_87B; comprimento integral de RPA70 (algumas vezes referido aqui como "RPA70"); D_vir_c43870_RPA70 (algumas vezes referido aqui como "região 1 de RPA70" ou "RPA70 Regl"); D_vir_c18764_RPA70 (algumas vezes referido aqui como "região 2 de RPA70" ou "RPA70 Reg2"); D_vir_c7971_RPA70 (algumas vezes referido aqui como "região 3 de RPA70" ou "RPA70 Reg3"); e RPS6 pode ser selecionado como um gene- alvo para silenciamento pós-traducional. Em exemplos particulares, um ge- ne-alvo útil para inibição pós-transcripcional é RPS6.

São também reveladas moléculas de ácido nucleico compreen- dendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma seqüência de aminoácido dentro de um 30 produto de gene-alvo (por exemplo, um produto de um gene selecionado do grupo consistindo em PP1-87B; proteína fosfatase contig0011_87B; RPA70; RPA70 Regi; RPA70 Reg2; RPA70 Reg3; e RPS6). Por exemplo, uma mo- lécula de ácido nucleico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma seqüên- cia de aminoácido selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N°:67 (PP1- 87B); SEQ ID N°:95 (proteína fosfatase contig0011_87B); SEQ ID N°:68 5 (RPA70); SEQ ID N°:96 (RPA70 Regi); SEQ ID N°:97 (RPA70 Reg2); SEQ ID N°:98 (RPA70 Reg3); e SEQ ID N°:69 (RPS6). Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico compreende uma seqüência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma seqüên- cia de aminoácido dentro de um produto de RPS6. São ainda reveladas mo- 10 léculas de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que é o complemento reverso de uma seqüência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntica a uma seqüência de aminoácido dentro de um produto de gene-alvo.

São também reveladas seqüências de cDNA que podem ser u- 15 sadas para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene-alvo de peste coleóptera, por exemplo: PP1-87B; RPA70; RPA70 Regi; RPA70 Reg2; RPA70 Reg3; e/ou RPS6. Em modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser produzidas in vitro ou in vivo por 20 um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Em exemplos particulares, moléculas de cDNA são empregadas, as quais podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que são complementa- res a todo ou parte de RPS6 (SEQ ID N°:7).

São ainda revelados meios para inibição da expressão de um 25 gene essencial em uma peste coleóptera e meios para provisão de resistên- cia à peste coleóptera a uma planta. Um meio para inibição de expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera é uma molécula de RNA de filamento simples ou duplo consistindo em qualquer uma de SEQ ID NoS:25- 28 ou o seu complemento. Equivalentes funcionais de meios para inibição da 30 expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera incluem molécu- las de RNA de filamento simples ou duplo que são substancialmente homó- logas a todo ou parte de um gene de WCR compreendendo qualquer uma das SEQ ID Nos^, 5, 6 e 7. Um meio para provisão de resistência à peste coleóptera a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo uma se- qüência de ácido nucleico codificando um meio para inibição da expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera operavelmente ligada a um 5 promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada ao genoma de uma planta de milho.

São revelados aqui métodos para controle de uma população de uma peste coleóptera compreendendo provisão a uma peste coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que funciona quando sendo absorvida pela peste coleóptera para inibir uma fun- ção biológica dentro da peste coleóptera, em que a molécula de iRNA com- preende toda ou parte de uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o com- plemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-7; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreenden- do toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7; uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID N°s:1-7; e o complemento de uma seqüência de não codificação na- tiva de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7.

Em exemplos particulares, são revelados métodos para controle de uma população de uma peste coleóptera compreendendo provisão a uma peste coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, 30 miRNA e hpRNA) que funciona quando sendo absorvida pela peste coleóp- tera para inibir uma função biológica dentro da peste coleóptera, em que a molécula de iRNA compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: toda ou parte de SEQ ID N°:1; o complemento de toda ou parte de SEQ ID N°:1; toda ou parte de SEQ ID N°:2; o complemento de toda ou parte de SEQ ID N°:2; toda ou parte de SEQ ID N°:7; o comple- mento de toda ou parte de SEQ ID N°:7; toda ou parte de uma seqüência de 5 codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) com- preendendo SEQ ID N°:1; toda ou parte do complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N0:1; toda ou parte de uma seqüência de não codificação nativa de um or- ganismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa com- 10 preendendo SEQ ID N°:1; toda ou parte do complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1; toda ou parte de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea (por e- xemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte do complemento 15 de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea com- preendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte de uma seqüência de não codifica- ção nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte do complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é 20 transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2; toda ou parte de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Di- abrotiea (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:7; toda ou parte do complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Di- abrotiea compreendendo SEQ ID N°:7; toda ou parte de uma seqüência de 25 não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; e toda ou parte do complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7.

São também revelados aqui métodos em que dsRNAs, siRNAs,

miRNAs e/ou hpRNAs podem ser providos a uma peste coleóptera em um ensaio baseado em dieta ou em células de planta geneticamente modifica- das expressando os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nesses e em exemplos adicionais, os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos por larvas de peste coleóptera. Ingestão de dsRNAs, siRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar em RNAi na larva, o 5 que por sua vez pode resultar em silenciamento de um gene essencial para viabilidade da peste coleóptera e levando por último à mortalidade larval. Desta maneira, são revelados métodos em que moléculas de ácido nucleico compreendendo sequência(s) de ácido nucleico exemplare(s) úteis para con- trole de pestes coleópteras são providas a uma peste coleóptera. Em exem- 10 pios particulares, a peste coleóptera controlada pelo uso de moléculas de ácido nucleico da invenção pode ser WCR ou NCR.

As características acima e outras se tornarão mais aparentes a partir da Descrição Detalhada que segue de várias modalidades, que pros- segue com referência às Figuras acompanhantes.

Breve Descricão das Fiauras

A Figura 1 inclui uma mostra da estratégia usada para prover moldes específicos para produção de dsRNA.

A Figura 2 inclui um gráfico de variabilidade para a mortalidade percentual de pestes coleópteras exemplares (isto é, larva da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares se direcionando a PP1-87B, RPA70 Regl e RPA70 Reg2.

A Figura 3 inclui um gráfico de variabilidade para a mortalidade percentual de pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exempla- res se direcionando a RPS6.

A Figura 4 inclui um gráfico de variabilidade para a inibição do crescimento (GI) (Growth inhibition) de pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares se direcionando a PP1-87B, RPA70 Regl e RPA70 Reg2.

A Figura 5 inclui um gráfico de variabilidade para inibição de crescimento (GI) de pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) tratadas com moléculas de ácido nucleico exem- plares se direcionando a RPS6.

A Figura 6 provê um gráfico de variabilidade de dano por ali- mentação da raiz por pestes coleópteras exemplares (isto é, larvas da Iagar- 5 ta da raiz do milho do oeste) em raízes de plantas de estufa Ti de eventos compreendendo um construto de dsRNA grampo de cabelo PP1-87B e ou- tros eventos compreendendo um construto de dsRNA grampo de cabelo RPS6.

A Figura 7 inclui um sumário de Análise de Variância (ANOVA) de dano por alimentação da raiz causado por alimentação por pestes coleóp- teras exemplares (isto é, larvas da lagarta da raiz do milho do oeste) em raí- zes de plantas de estufa Ti de eventos compreendendo um construto de dsRNA grampo de cabelo RPA70.

Listaaem de Seqüência As seqüências de ácido nucleico listadas na listagem de se-

qüência acompanhante são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. Ape- nas um filamento de cada seqüência de ácido nucleico é mostrado, mas o filamento complementar é compreendido como incluído por qualquer refe- 20 rência ao filamento exibido. Uma vez que o complemento e o complemento reverso de uma seqüência de ácido nucleico primária são necessariamente revelados pela seqüência primária, a seqüência complementar e a seqüên- cia complementar reversa de uma seqüência de ácido nucleico são incluídas por qualquer referência à seqüência de ácido nucleico, a menos que seja 25 explicitamente declarado de outra maneira (ou fique claro ser de outra ma- neira a partir do contexto em que a seqüência aparece). Na listagem de se- qüência acompanhante:

A SEQ ID N0:1 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida como proteína fosfatase PP1-87B (comprimento integral): CGCAAAAAAGT GTTGTTT GGTTT GTAGTTAAAAGGCT CT GTA

AAAAT CATTAAAAAT CCGAGCCAT CTTTTAGTTTTAAGTTT CTTAAATATT GT CAAAGAGTAT CACAAGGATTT CT CAAATGGCAGAAGCAGATAAATT G AATATCGACAGTATAATAGCCCGTTTATTAGAAGTGCGTGGAGCAAGAC CAGGCAAAAATGTACAACTCACAGAAAATGAAATTAGGGGGCTCTGTTT AAAAT CTAGAGAGATCTTCCTTAGCCAGCCGATTTT GTT GGAACTT GAAG CTCCT CT GAAGATTTGCGGT GATATACATGGT CAGTACTAT GACTT GCTT 5 CGT CT CTTT GAATAT GG AGGTTTCCCT CCCGAAT CAAACTACTTATTTTT GGGAGATTATGTAGATCGT GGTAAACAATCATT GGAAACCAT CT GCTTA CTT CT CGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTT CCTACT CAGAGG CAACCACGAATGCGCATCAATTAATCGTATATATGGATTCTATGATGAAT GCAAAAGAAGGTATAACAT CAAGTT GT GGAAAACTTTTACGGACT GTTT C 10 AATTGCCTACCTGTAGCAGCCATCGTCGATGAAAAAATTTTCTGTTGCCA TGGTGGTTTAAGTCCGGACCTACAATCAATGGAACAAATTAGAAGAATTA T GAGACCGACT GAT GTACCT GACCAAGGGCTT CTTT GT GACCTTTTAT G GT CT GAT CCAGACAAAGACCAGATGGGAT GGGGAGAAAACGATAGAGG AGTTAGTTTTACTTTT GGTGCT GAAGTT GTAGGAAAGTT CTT GCACAAAC 15 ACGATTTT GATTT GATAT GT CGAGCGCAT CAAGTCGTAGAAGAT GGATAT GAATTCTTCGCCAAAAGACAGTTAGTCACACTGTTTÀGTGCGCCAAATTA TT GTGGAGAGTTT GATAACGCAGGT GCGAT GAT GTCGGT GGAT GAGAC ACTAAT GT GTAGTTTTCAAATTTTAAAGCCAGCAGACAAGAGGAAATTCC AGTACAACATGAACGCAGGCAGACCTGTGACGCCGCCAAGAGGCGCAA 20 C G AATAAAAAC AAGAAG AAGT GAAT GAATAATATATTTATAAGGTTAGGT TTAGTCGCAACATAAACATGTTCAAAACATTTTAAATACTAAAATTTTCTA AAG GTTACAAAGATT CAAGATAAATTAAGATTTT CTT CAT GTTTTT GTTG G TTGTTTTATAGGTTAGGATAGTAAACTATATAATAATAAAGTTCTCAATAT TGTTAAAAAGAAGTGAATGTTAGTATTTAAAATGTTCGATTATTTCGGCC 25 GTTTTACTTTATTTTATATCTGATATTACTAGAAAAGGGTGATATCTATGA ACCCAGACAACTAAACGTT CGATTT GAACAAAT GAAAATTTATT GAAAAC ATTAAT CCT CACAAC CTT G CTTATTTAATTAAAG AAC AAGAT CAGTAATAC ATTAAAGT CTAT CATTAATAA

A SEQ ID N°:2 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida como RPA70 (comprimento integral):

CAAAGGTTTCGTTT CAAACTT CACACCGATAAAGACTT GTTT GTT CTT GT CAGT GT CAGTT CT GG CGGTAAAATATTT GCGGTATACACATT TTTTACGTCGTACGTAATTTGCAGGGGTTGATTACTGATCTTTATTTGAT AATTT GTTTATTTATTTT GCAACATAAGCAAAATGCGTTCGCCT CAAACCT ATAACAT GT cagaaggat CACTCCAGACAAT CAT GT ctggaggt GAATT TCCAAATCCCATTATGCAAGTTTTGGGTAGCAAAAAGATAAACGCCGGA 5 TT GGGT GATAAAGAAAGAATTCGTATTTTACT GT CAGAT GGAAAATACAC TATTT CTTTT GCCATGCTAACAGCCCAAATTAAT GATCGACTT GGTCCAA AT GGT GT GGAAACTTTTAGCATTATACAAATAGATAGATAT GTTACGAGT ATCATCAACAATTCTGGGAAAGGAGAAGCACGAGTACTTTTAATCCTCG ATATGCAT GTT GTTGT CCCT GGAACT GAAGTTACAGAAAAAGTAGGCT C 10 TCCCATTCCCCTACCAACTGATGCTGACGCAGCTAAAGGCTCTACTGCC GCT CCAGCTACAAACAATTCCATTAAGAAT GTAACT GTTGCTAAACCAAA CAT CAGTAAT GGCAAT GGCACAACT GCAAT GAAT GCCAGTACTAAT GAT GATATAGCCACACATAT GATCCATCCTATTT CAAGT CT CACACCTTACCA AAACAGATGGACTATCAAAGCGAGAATTACTAATAAACCTCCAATAAGAA 15 CGT GGT CAAATT CTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTTTT GAT CT GGT GGAT GAAAGTGGCGAAATCCGTTGCACAGCTTTTAAAGAAATGGTT GAT AAATT CTAT GATTACCTGCAGGTGG ATAAAGTATATTACAT CAAC AAAT G TCAACTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATGAGTATG AAAT GACT GTTACGCAT GATACT GT CATTAAAGAATGCCTT GATGCAGAT 20 TCTACAATACCCACCACACAGTATAACTTTGTTCCTATAGATAAAATTGC T GATAAAGAAGTAAATT CT GTT GTAGAT GTAATAGGTATTGCCAAAAGT G TCAGTGAATTACAAACATTCCAAGCAAGATCAACAGGAAGAGAATTGAA AAAGAAAGAAGTTGTCTTGGTTGATCAGTCACAAACAGCTATATCGTTAA CACTTTGGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTTGATGGTACCAATAATCCTGT 25 CGTAGTTATAAAAAGTGCCAAAATTGGCGAGTTTGGAGGTGGCAAGAAT TTAACTACTCTTGTTAGCAGCACTGTAAAAATAAATCCCGAATTAAAAGA AT GTTACAGGAT CAGAGGAT GGTACGACAGT GAGGGT GAAAAT CT GAAT GCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTTGGATCCTCGAATATGTCTGCCACTT GGAT GACCTTTAAGGAAGTTAAAGAT CAAAAATTAGGAT CAT CT GAAAAA 30 GGT GATTATTATAAAGCTATT GCTACT GTT CTT CTT GT CAAAGCCGATAA TATT GT GTATAGAGCTT GTCCCACCGCT GAAT GTAATAAGAAAGTT GTT G ATATGGAAAATAGTATGTACAGATGTGAAAAATGTAATAGAGAATTTCCA AATTT CAAATACAGACT GTTAGCCAGCAT GAAT GTT GGAGACCACACAG GAAACCAATGGGTTAGCATGTTCAGTTCAGAAGCCGAAAAAATTCTGGG GAT GACT GCT GAGGAAGTAGGACAGACCTTGGAACACAATAAAGAAGAA ATAGCCAACATCGTAGATAGAGCTCATTTTAAAGTATTTAGTCTTACTTG 5 CAGGGCAAAAATT GAGACTTACAAT GAT GAAGCTCGTTTAAAAACT GTTT GTATAAGAGT CGATCCAATTAATTAT GAGGAGTATAGT GCATT GCTCACA GAAAAAATTCAGCAGTTAACAGGCGAATCTCATGATTAGATATACACCAA CACTACAGCTATGCTATTATTT CTAGTT CTTTTTTTTTTTAGAAAATAT CGT TAAGAAATCTGTGTTTTGTATTTATmTTATAAACAGTGAATCAGTGAAT 10 AAGATTTTATTAGAAAGGTACTGTATAAATAAAAATCTGTATGTTCACAAT Alll ITATTTATTTAAATATACATTGGTACAAAATAAAATATATATTCGTAA CAACTATATTATTGTTTATTATTGTTTATTCTTAAGCCCCATCATCTAAAG AGGTTCTAAATGTGCTTGTTTTCTTGCATACGCACCTAAACAAGCTAAAA TTAGTATTACACTCATAAATAATCCTATTAATAAGGCTAAAGTATCTCCAA 15 AAT CAAAC ATTTT GCT GTATTATT GAGT GTTTAAATAATTACAT CAAAATA AAATATTTTTTATTTTTTGCTTGTCTTGTATGTTTATTTACGTnrTACTTGT CAAT C AG CT GTCTATTT CTT CTTTTTAATTA

A SEQ ID N°:3: mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugar como contig0011_PP1-87B:

AATTCAAGCTGCCGCAAAAAAGTGTTGTTTGGTTTGTAGTTA

AAAGGCTCTGTAAAAATCATTAAAAATCCGAGCCATCTTTTAGTTTTAAG TTT CTTAAATATT GT CAAAG AGTATCACAAGG ATTTCTCAAATGGCAGAA GCAGATAAATTGAATATCGAÇAGTATAATAGCCCGTTTATTAGAAGTGCG TGGAGCAAGACCAGGCAAAAAT GTACAACTCACAGAAAAT GAAATTAGG 25 GGGCTCTGTTTAAAATCTAGAGAGATCTTCCTTAGCCAGCCGATTTTGTT GGAACTT GAAGCT CCT CT gaagatttgcggt GATATACAT GGT CAGTAC TATGACTTGCTTCGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAA CTACTTAI ITTTGGGAGATTATGTAGATCGTGGTAAACAATCATTGGAAA CCATCTGCTTACTTCTCGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCC 30 TACT CAGAGGCAACCACGAAT GCGCAT CAATTAATCGTATATAT GGATT C TAT GAT GAAT GCAAAAGAAGGTATAACAT CAAGTT GT GGAAAACTTTTAC GGACTGTTT CAATT GCCTACCT GTAGCAGCCATCGTCGAT GAAAAAATTT T CT GTT GCCAT GGTGGTTTAAGTCCGGACCTACAAT CAAT GGAACAAAT TAGAAGRATTAATAGAGACCGACTGAT GTACCT GACCAAGGSTTT CTTT GT GACCTTTTANGGT CT GAT CCAGACAAAGACC

A SEQ ID N°:4: mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c43870_RPA70, região 1 de RPA70 ou RPA70 Regi:

ATAATTT GC AGGGGTT GATTACT GAT CTTTATTT GATTAATTT GTTTATTTAI I TTTGCAACATAAGCAAAATGCGTTCGCCTCAAACCTATAA CAT GT CAGAAGGATCACTCCAGACAAT CAT GT CTGGAGGT GAATTTCCA AATCCCATTATGCAAGTTTTGGGTAGCAAAAAGATAAACGCCGGATTGG GTGATAAAGAAAGAATTCGTATTTTACTGTCAGATGGAAAATACACTATT TCTTTTGCCATGCTAACAGCCCAAATTAATGATCGACTTGGTCCAAATGG TGTGGAAACI I I I 1'AGCATTATACAAATAGATAGATATGTTACGAGTATC AT CAACAATT CTGGGAAAGGAGAAGCACGAGTACTTTTAATCCTCGATAT GCAT GTT GTT GTCCCT GGAACT GAAGTTACAGAAAAAGTAGGCT CTCCC ATTCCCCTACCAACTGATGCTGACKCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTC CAGCTACAAACAATTCCATTAAGAAT GTAACT GTT GCTAAACCAAACAT C AGTAATGGCAAT GGCACAACTGCAAT GAATGCCAGTACTAAT GAT GATA TAGCC ACACATAT GAT C CATCCTATTT CAAGT CT C AC ACCTTA A SEQ ID N0:5 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica

exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c18764_RPA70, região 2 de RPA70 ou RPA70 Reg2:

ATGGTCAAATTCTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTTTT GA TCTGGT GGATGAAAGT GGCGAAAT CCGTT GCAC AGCTTTTAAAG AAAT G 25 GTT GATAAWTTCTATGATTACCT GCAGGTGGATAAAGTATATTACATCAA CAAATGTCAACTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATG AGTAT GAAAT GACT GTTACG C AT GATACT GT CATTAAAGAAT GCCTT GAT GCAGATTCTACAATACCCACCACACAGTATAACTTTGTTCCTATAGATAA AATTGCTGATAAAGAAGTAAATTCTGTTGTAGATGTAATAGGTATTGCCA 30 AAAGT GT CAGTGAATTACAAACATTCCAAGCAAGAT CAACAGGAAGAGA ATT GAAAAAGAAAGAAGTTGTCTT GGTT GATCAGT CACAAACAGCTATAT CGTTAACACTTTGGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTTGATGGTACCAATAA TCCTGTCGTAGTTATAAAAA

A SEQ ID N°:6 mostra uma seqüência de cDNA de Diabmtica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c7971_RPA70, região 3 de RPA70 ou RPA70 Reg3:

AACTCTTGTTAGCAGCAMTRTAAAAATAAATCCCGAATTAAA

AGAAT GTTACAGGAT CAGAGGATGGTACGACAGT GAGGGT GAAAAT CT GAATGCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTT GGAT CCTCGAATAT GT CT GCC ACTT GGAT GACCTTTAAGGAAGTTAAAGAT CAAAAATTAGGAT CAT CT GA AAAAGGTGATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCG ATAATATTGTGTATAGAGCTTGTCCCACCGCTGAATGTAATAAGAAAGTT GTTGATATGGAAAATAGTATGTACAGATGTGAAAAATGTAATAGAGAATT TCCAAATTT CAAATACAGACT GTTAGCCAGCAT GAAT GTTGGAGACCAC ACAGGAAACCAAT GGGTTAGCAT GTT CAGTTCAGAAGCCGAAAAAATT C T GGGGAT GACTGCT GAGGAAGTAGGACAGACCTT GGAAC AC AATAAAG AAGAAATAGCCAAC ATCGTAGATAGAGCT CATTTTAAAGTATTTAGT CTT ACTTGCAGGGCAAAAATTGAGACTTACAATGATGAAGCTCGTTTAAAAAC T GTTTGTATAAGAGTCGATCCAATTAATTAT GAGGAGTATAGT GCATT GC TCACAGAAAAAATTCAGCAGTTAACAGGCGAATCTCATGATTAGATATAC ACCAACACTACAGCTATGCTATTATTTCTAG A SEQ ID N°:7 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica

exemplar, referida aqui como RPS6:

ATTAATTTTCTGAAATATCCTTTTTGAAACATGGCAGTTCCAT GT GCACACTAACGAGAAGTTTTT CCCGTATTTAGT GTAATTT GCCAAAAA TAAAGTGTGAAATAGTAGTTTTCGAGTGCAAAATAAGTCAATATGAAGTT 25 GAACGTATCGTACCCGGCCACGGGTTGCCAAAAACTTTTCGAAGTTGTT GACGAACACAAAATT CGTAT CTTTTACGAAAAACGCAT GGGT CAAGAAG TT GAGGCT GAT GCTCTT GGT GACGAAT GGAAGGGCTACAT CTT GAAAAT AT CT GGAGGTAACGACAAACAAGGATT CCCCAT GAAACAAGGT GTT CTT ACAAACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTT CAAAAGGT CACTCCTGCTACAG 30 ACCCAGACGTACCGGTGAACGTAAAAGGAAATCAGTTCGTGGGTGCATT GTT GAT GGGAACCT CAGCGT GTT GGCCCTAGT CATT GTAAGAAAAGGAG AACAAGAAATTCCCGGACTTACTGACACCACCATCCCACGTCGCCTGGG ACCCAAGAGAGCATCCAGAATCCGTAAGCTCTTCAACCTTAGCAAAGAA GACGATGTACGTCAATATGTAGTAAAGAGACCTTTGGCCCAAAAAGAAG GTAAGAAGTTAAGAACCAAGGCCCCCAAAATCCAACGTCTTATTACACC CGTT GTTTT GCAAAGAAAACGT CATCGT CTT GCTTT GAAGAAGAAGAGG 5 TGCCTTAAACGTAAAGAACAAGAAGATGCATATGCTAAACTATTGGCTCA ACGTAAGAAGGAATCCAAGGCT CGTCGT GAGAT GTT GAAGAGGCGTAG GTCT GCCAGTAT GCGT GATAGTAAATCCAGCACGCAGAGT GGT CAGAA

GTAAATTGTAATr Itttatattttaagacaatgtatgaaataaacgttgtt

GCTT

A SEQ ID N°:8 mostra uma seqüência de promotor de fago T7.

As SEQ ID NOs:9-24 mostram seqüências de iniciadores usadas para amplificar porções de regiões de codificação de genes-alvo exemplares através de PCR.

A SEQ ID N°:25 mostra um fragmento amplificado exemplar de PP1-87B usado como um molde para síntese de dsRNA:

CAAATGGCAGAAGCAGATAAATTGAATATCGACAGTATAATA GCCCGTTTATTAGAAGTGCGTGGAGCAAGACCAGGCAAAAATGTACAAC TCACAGAAAATGAAATTAGGGGGCTCTGTTTAAAATCTAGAGAGATCTTC CTTAGCCAGCCGATTTTGTTGGAACTTGAAGCTCCTCTGAAGATTTGCG 20 GT GATATACATGGT CAGTACTAT GACTT GCTT CGT CT CTTT GAATAT GGA GGTTT CCCTCCCGAATCAAACTACTTATTTTTGGGAGATTAT GTAGATCG TGGTAAACAATCATTGGAAACCATCTGCTTACTTCTCGCTTACAAAATTA AATACCCAGAAAACTTTTT CCTACT CAGAGGCAACCACGAAT GCGCAT C AATTAATCGTATATATGGATTCTATGATGAATGCAAAAGAAGGTATAACA 25 T CAAGTT GT GGAAAACTTTTACGGACT GTTT CAATT GCCTACCT GTAGCA GCCAT CGT CGAT GAAAAAATTTT CT GTT GCCAT GGT GGTTTAAGT CCGG ACCTACAAT CAAT GGAAC AAATTAG

A SEQ ID N°:26 mostra um fragmento amplificado exemplar de RPA70 Reg2 usado como um molde para síntese de dsRNA:

AT GGTCAAATT CTAGAGGGGAAGGAAAATTATTTAGTTTT GA

T CT GGTGGAT GAAAGT ggcgaaatccgtt gcacagcttttaaagaaat G GTTGATAAWTTCTATGATTACCTGCAGGTGGATAAAGTATATTACATCAA CAAATGTCAACTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATG AGTATGAAATGACTGTTACGCATGATACTGTCATTAAAGAATGCCTTGAT GCAGATT CTACAATACCCACCACACAGTATAACTTT GTT CCTATAGATAA AATTGCT GATAAAGAAGTAAATT CT GTT GTAGAT gtaataggtatt GCCA 5 AAAGT GT CAGT GkATTACAAACATTCCAAGCAAGAT CAACAGGAAGAGA ATT GAAAAAGAAAGAAGTT GT CTT GGTT GAT CAGT C AC AAACAGCTATAT CGTTAACACTTTGGGGCCAAGAAGCCGAAAATTTT GAT GGTACCAATAA TCCTGTCGTAG

A SEQ ID N°:27 mostra um fragmento amplificado exemplar de RPA70 Reg3 usado como um molde para síntese de dsRNA:

TCCCGAATTAAAAGAATGTTACAGGATCAGAGGATGGTACG ACAGTGAGGGT GAAAAT CT GAAT GCAAAGAATATTAGT GCCAGAGTTGG AT CCTCGAATAT GT CT GCCACTT GGAT GACCTTTAAGGAAGTTAAAGAT C AAAAATTAGGAT CAT CT GAAAAAGGT GATTATTATAAAGCTATT GCTACT 15 GTTCTTCTTGTCAAAGCCGATAATATTGTGTATAGAGCTTGTCCCACCGC T GAAT GTAATAAGAAAGTT GTT GATAT GGAAAATAGTAT GTACAGAT GT G AAAAAT GTAATAjSAGAATTT CCAAATTT CAAATACAGACTGTTAGCCAGC AT GAAT GTT GGAGACCACACAGGAAACCAATGGGTTAGCATGTT CAGTT CAGAAGCCGAAAAAATT CTGGGGAT GACTGCT GAGGAAGTAGGACAGA 20 CCTTGGAACACAATAAAGAAGAAATAGCCAACATCGTAGATAGAGCT CA TTTTAAAGTATTTAGT CTTACTTGCAGGGCAAAAATT GAGACTTACAAT G ATGAAGCTCG

A SEQ ID N°:28 mostra um fragmento amplificado exemplar de RPS6 usado comp um molde para síntese de dsRNA:

T CAATAT GAAGTT GAACGTAT CGTACCCGGCCACGGGTTGC

CAAAAACTTTT GGAAGTT GTT GACGAACACAAAATT CGTATCTTTTACGA AAAACGCAT GGGT CAAGAAGTT GAGGCTGATGCT CTT GGT GACGAAT G GAAGGGCTACAT CTT GAAAATAT CT GGAGGTAACGACAAACAAGGATT C CCCAT GAAACAAGGT GTTCTTACAAACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTT C 30 AAAAGGTCACTCCTGCTACAGACCCAGACGTACCGGTGAACGTAAAAG GAAAT CAGTT CGT GGGT GCATT GTT GAT GGGAACCT CAGCGT GTT GGC CCTAGT CATT GTAAGAAAAGGAGAACAAGAAATTCCCGGACTTACT GAC ACCACCATCCCACGTCGCCTGGGACCCAAGAGAGCAT

A SEQ ID N°:29 mostra uma seqüência de formação de RNA grampo de cabelo de PP1-87B contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado):

CCTCTGAAGATTT GCGGT GATATACAT GGTCAGTACTAT GAC TTGCTTCGTCTCTTTGAATATGGAGGTTTCCCTCCCGAATCAAACTACTT AI ITTTGGGAGATTATGTAGATCGTGGTAAACAATCATTGGAAACCATCT GCTTACTTCTCGCTTACAAAATTAAATACCCAGAAAACTTTTTCCTACTCA GAGGCAACCACGAATGCGCATCAATTAATCGTATATATGGATTCTATGAT GAATGCAAAAGAAGGTATAACATCAAGTTGTGGAAAACTTTTACGGACT GTTT GACTAGTACCGGTT GGGAAAGGTAT GTTTCTGCTT CTACCTTT GAT ATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATTT TTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTAT AAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGG TGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTAAAACAGTCCGTAAAAGTTTTCCAC AACTTGATGTTATACCTTCTTTTGCATTCATCATAGAATCCATATATACGA TTAATTGATGCGCATTCGTGGTTGCCTCTGAGTAGGAAAAAGTTTTCTG GGTATTTAATTTT GTAAGCGAGAAGTAAGCAGATGGTTT CCAAT GATT GT TTACCACGATCTACATAATCTCCCAAAAATAAGTAGTTTGATTCGGGAGG GAAACCTCCATATTCAAAGAGACGAAGCAAGTCATAGTACTGACCATGT ATAT CACCGCAAAT CTT CAGAGG

A SEQ ID N°:30 mostra uma seqüência de formação de RNA grampo de cabelo de RPA70 Reg2 contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado): TACCTGCAGGTGGATAAAGTATATTACATCAACAAATGTCAA CTTAAACAAGCCAACAAACAGTACAGCACTCTAAAACATGAGTATGAAAT GACT GTTACGCAT GATACT GT CATTAAAGAAT GCCTT GATGCAGATT CTA CAATACCCACCACACAGTATAACTTTGTTCCTATAGATAAAATTGCTGAT AAAGAAGTAAATTCTGTTGTAGATGTAATAGGTATTGCCAAAAGTGTCAG T GAATTACAAACATTCCAAGCAAGAT CAACAGGAAGAGAATT GAAAAAG GACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGATATAT ATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGTATI Illll CAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGTTTATAAGT

GTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACATGGTGAT GTGCAGGTTGATCCGCGGTTACI IITTCAATTCTCTTCCTGTTGATCTTG CTT GGAAT GTTT GTAATT CACT G AC ACTTTTGGCAATACCTATTACAT CTA CAACAGAATTTACTTCTTTATCAGCAATTTTATCTATAGGAACAAAGTTAT ACT GT GT GGT GGGTATT GTAGAAT CT GCAT CAAGGCATT CTTTAAT GACA 5 GTATCATGCGTAACAGTCATTTCATACTCATGTTTTAGAGTGCTGTACTG TTT GTT GGCTT GTTTAAGTTGACATTT GTTGAT GTAATATACTTTATCCAC CTGCAGGTA

A SEQ ID N°:31 mostra uma seqüência de formação de RNA grampo de cabelo de RPS6 contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado):

AACGACAAACAAGGATT CCCCATGAAACAAGGT GTT CTTACA

AACGGTAGAGTAAGACTTTTACTTTCAAAAGGTCACTCCTGCTACAGAC CCAGACGTACCGGTGAACGTAAAAGGAAATCAGTTCGTGGGTGCATTGT TGATGGGAACCTCAGCGTGTTGGCCCTAGTCATTGTAAGAAAAGGAGAA CAAGAAATTCCCGGACTTACT GACACCACCAT CCCACGTCGCCT GGGA 15 CCCAAGAGAGCATCCAGAATCCGTAAGCTCTTCAACCTTAGCAAAGAAG ACGATGTACGTCAAGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTT CTACCTTTGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTAT TTCAAGTAI I I I I ITCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTT CTGTAGTTTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGAC 20 CAAAACATGGTGATGTGCAGGTTGATCCGCGGTTATTGACGTACATCGT CTT CTTT GCTAAGGTT GAAGAGCTTACGGATT CTGGAT GCT CT CTT GGG TCCCAGGCGACGTGGGATGGTGGTGTCAGTAAGTCCGGGAATTTCTTG TTCTCCTTTTCTTACAATGACTAGGGCCAACACGCTGAGGTTCCCATCAA CAATGCACCCACGAACTGATTTCCTTTTACGTTCACCGGTACGTCTGGG 25 T CT GTAGCAGGAGT GACCTTTT GAAAGTAAAAGT CTTACT CTACCGTTT G TAAGAACACCTTGTTTCATGGGGAATCCTTGTTTGTCGTT

A SEQ ID N°:32 mostra uma seqüência de DNA da região 1 de

anexina.

A SEQ ID N°:33 mostra uma seqüência de DNA da região 2 de

anexina.

A SEQ ID N°:34 mostra uma seqüência de DNA da região 1 de beta espectrina 2. A SEQ ID N°:35 mostra uma seqüência de DNA da região 2 de beta espectrina 2.

A SEQ ID N°:36 mostra uma seqüência de DNA da região 1 de

mtRP-L4.

A SEQ ID N°:37 mostra uma seqüência de DNA da região 2 de

A SEQ ID N°:38 mostra uma seqüência de YFP.

As SEQ ID NOs:39-66 mostram seqüências de iniciadores usa- das para amplificar regiões de gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para síntese de dsRNA.

A SEQ ID N°:67 mostra uma seqüência de proteína codificada por uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lu- gares como proteína fosfatase 87B.

MAEADKLNIDSIIARLLEVRGARPGKNVQLTENEIRGLCLKSREI 15 FLSQPILLELEAPLKICGDIHGQYYDLLRLFEYGGFPPESNYLFLGDYVDRGK QSLETICLLLAYKIKYPENFFLLRGNHECASINRIYGFYDECKRRYNIKLWKT FTDCFNCLPVAAIVDEKIFCCHGGLSPDLQSMEQIRRIMRPTDVPDQGLLCD LLWSDPDKDQMGWGENDRGVSFTFGAEWGKFLHKHDFDLICRAHQWE DGYEFFAKRQLVTLFSAPNYCGEFDNAGAMMSVDETLMCSFQILKPADKR 20 KFQYNMNAGRPVTPPRGATNKNKKK

A SEQ ID N°:68 mostra uma seqüência de proteína codificada por uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lu- gares como RPA70:

MRSPQTYNMSEGSLQTIMSGGEFPNPIMQVLGSKKINAGLGD 25 KERIRILLSDGKYTISFAMLTAQINDRLGPNGVETFSIIQIDRYVTSIINNSGKG EARVLLILDMHVWPGTEVTEKVGSPIPLPTDADAAKGSTAAPATNNSIKNV TVAKPNISNGNGTTAMNASTNDDIATHMIHPISSLTPYQNRWTIKARITNKPP IRTWSNSRGEGKLFSFDLVDESGEIRCTAFKEMVDKFYDYLQVDKVYYINK CQLKQANKQYSTLKHEYEMTVTHDTVIKECLDADSTIPTTQYNFVPIDKIADK 30 EVNSWDVIGIAKSVSELQTFQARSTGRELKKKEWLVDQSQTAISLTLWGQ EAENFDGTNNPVWIKSAKIGEFGGGKNLTTLVSSTVKINPELKECYRIRGW YDSEGENLNAKNISARVGSSNMSATWMTFKEVKDQKLGSSEKGDYYKAIA TVLLVKADNIVYRACPTAECNKKWDMENSMYRCEKCNREFPNFKYRLLAS MNVGDHTGNQWVSMFSSEAEKILGMTAEEVGQTLEHNKEEIANIVDRAHF KVFSLTCRAKIETYNDEARLKTVCIRVDPINYEEYSALLTEKIQQLTGESHD

A SEQ ID N°:69 mostra uma seqüência de proteína codificada por uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lu- gares como RPS6:

MKLNVSYPATGCQKLFEWDEHKIRIFYEKRMGQEVEADALGD EWKGYILKISGGNDKQGFPMKQGVLTNGRVRLLLSKGHSCYRPRRTGERK RKSVRGCIVDGNLSVLALVIVRKGEQEIPGLTDTTIPRRLGPKRASRIRKLFN 10 LSKEDDVRQYWKRPLAQKEGKKLRTKAPKIQRLITPWLQRKRHRLALKKK RCLKRKEQEDAYAKLLAQRKKESKARREMLKRRRSASMRDSKSSTQSGQ K

A SEQ ID N°:70 mostra uma seqüência de DNA de milho codifi- cando uma proteína tipo TIP41.

As SEQ ID NoS:71-74 mostram seqüências de iniciadores usadas

para análises moleculares de níveis de transcrito em miího transgênico.

A SEQ ID N°:75 mostra uma seqüência de DNA de milho codifi- cando uma proteína invertase.

A SEQ ID N°:76 mostra uma seqüência de DNA de Escherichia coii codificando uma proteína SpnR.

A SEQ ID N°:77 mostra uma seqüência de DNA de íntron ST-L1

exemplar.

As SEQ ID Ν°*:78-89 mostram seqüências de oligonucleotídeos usadas para análises moleculares de sonda de hidrólise de níveis de trans- crito em milho transgênico.

As SEQ ID NoS:90-94 mostram seqüências de oligonucleotídeos usadas para análises moleculares de sonda de hidrólise de grampo de cabe- lo de níveis de transcrito em milho transgênico.

A SEQ ID N°:95 mostra uma seqüência de aminoácido codifica- da por uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como proteína fosfatase ContigOOI 1_87B:

MAEADKLNIDSIIARLLEVRGARPGKNVQLTENEIRGLCLKSREI FLSQPILLELEAPLKICGDIHGQYYDLLRLFEYGGFPPESNYLFLGDYVDRGK

QSLETICLLLAYKIKYPENFFLLRGNHECASINRIYGFYDECKRRYNIKLWKT

FTDCFNCLPVAAIVDEKIFCCHGGLSPDLQSMEQIRRINRDRLMYLTKXFFV

TFXGLIQTKT

A SEQ ID N°:96 mostra uma seqüência de aminoácido codifica-

da por uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPA70 Regi:

MIDLVQMVWKLFSIIQIDRYVTSIINNSGKGEARVLLILDMHVW PGTEVTEKVGSPIPLPTDADXAKGSTAAPATNNSIKNVTVAKPNISNGNGTT AMNASTNDDIATHMIHPISSLTP

A SEQ ID N°:97 mostra uma seqüência de aminoácido codifica- da por uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPA70 Reg2:

WSNSRGEGKLFSFDLVDESGEIRCTAFKEMVDXFYDYLQVDK VYYIN KCQLKQAN KQYSTLKHEYEMTVTH DTVIKEC LDADSTIPTTQYN FVPI DKIADKEVNSWDVIGIAKSVSELQTFQARSTGRELKKKEWLVDQSQTAISL TLWGQEAENFDGTNNPVWIK

A SEQ ID N°:98 mostra uma seqüência de aminoácido codifica- da por uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como RPA70 Reg3:

TLVSSXXKINPELKECYRIRGWYDSEGENLNAKNISARVGSSN MSATWMTFKEVKDQKLGSSEKGDYYKAIATVLLVKADNIVYRACPTAECNK KWDMENSMYRCEKCNREFPNFKYRLLASMNVGDHTGNQWVSMFSSEAE KILGMTAEEVGQTLEHNKEEIANIVDRAHFKVFSLTCRAKIETYNDEARLKTV CIRVDPINYEEYSALLTEKIQQLTGESHD

As SEQ ID N°*:99 e 100 mostram segmentos exemplares de uma seqüência de cDNA de PP1-87B de Diabrotica\

AATTCAAGCTGCCGCAA (SEQ ID N°:99); e TTTTCTGTTGCCATGGTGGTTTAAGTCCGGACCTACAATCAA TGGAACAAATTAGAAGRATTAATAGAGACCGACTGATGTACCTGACCAA GGSTTTCTTTGTGACCTTTTANGGTCTGATCCAGACAAAGACC (SEQ ID N0:100) A SEQ ID N0:101 mostra um segmento exemplar de uma se- qüência de cDNA de RPA70 Reglde Diabrotica:

T GGAACT GAAGTTACAGAAAAAGTAGGCT CT CCCATT CCCC TACCAACTGATGCTGACKCAGCTAAAGGCTCTACTGCCGCTCCAGCTAC AAACAATT CCATTAAGAAT GTAACT GTT GCTAAACCAAACAT CAGTAAT G GCAATGGCACAACT GCAAT GAAT GCCAGTACTAAT GAT GATATAGCCAC ACATAT GATCCATCCTATTT CAAGTCTCACACCTTA

A SEQ ID N0:102 mostra um segmento exemplar de uma se- qüência de cDNA de RPA70 Reg3 de Diabrotica:

AACTCTTGTTAGCAGCAMTRTAAAAATAAATCCCGAATTAAA

AGAAT GTTACAGGAT CAGAGGAT GGTACGAC AGT GAGGGT GAAAAT CT GAATGCAAAGAATATTAGTGCCAGAGTT GGAT CCTCGAATAT GTCTGCC ACTTGGAT GACCTTTAAGG AAGTTAAAGAT CAAAAATTAGGAT CAT CT GA AAAAGGTGATTATTATAAAGCTATTGCTACTGTTCTTCTTGTCAAAGCCG ATAAT

A SEQ ID N0:103 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar codificando uma proteína Brahma:

ACAGTTAAATATTGAAAAT GGCCT GGT GTTTT GATAAAACGG AAGAGGCGAATTTCTAGTAGCATTTTAAGGTTTCATTTGCATTTAAAACA AATTCATGTATTATAAAATGTAGGATACGTTTCCTCGTATCCATCTACTTA ATTTAGGATAACAATAAAGGGTGT GAGACAGTTAAATATT GAAAAT GGCC AGTGCTT CATTATTACCCAAAACTTTCACTTCTATTGGT GGCAAAGCCCT ACCTACCAACTCACAACAAAACATTCAGTCAAAATTTAAAGAGATTACAG TTCCACCAGGAAATACT CCT CAAGAT GTTAAAGAAGGCCCCAGT CACCA AT CAAATCCAAACCATTTGGCTT CTCTT CAAAAGGCCATT GAAACTAT GG AAGAGAAGGGCTTACAAGCTGATCCTAGATATTCACAGTTACTTGCATT GCGAGCTAGCATTCCTGGGGCAGAAGAAAATGGTTCTCCCTTCTCAAAC AACCAAATCAAGCAATTAAGAAACCAAATAATGGCTTACAGGTGTTTGGC AAGAAAT CAACCT GTT CCAAACAATTTAGTATTAGGTTT GCAT GGAAAAA CTCCT GAAAAAGTT CCACATATT GTACCT CCACCGCAACCT CAAGAAGT ACCTAATGGGGGCGATCCAGGACCTTCAACAAGTTCTGCTGCTGCTGTA GCTCCTAGAACACCACAAAAGCTGCCAGCAAAACCAATTGAGGCTCAGC TT GT C AAC AG AG AACCAAG AGT CACTACTTTAT CTAAACC AT CTT CCATA GACCCTGTTGTTCTATTACAAGAACGAGAAAACAGGGTAGCAGCTCGTA TAGCAGCGAGGATT GAACAAGT CAGTAAT CTGCCGACT GATAT GT CT GA GGCATTACGTATTCGGGCACAAATAGAACT CAGAGCTTT GAGAT GT CTA 5 AACCTCCAGAGACAACTTCGTAGTGAGGTTTTGAGCTGTATTCGACGGG ACACAACATTAGAAACAGCAGTAAATGTAAAAGCGTTTAAACGGACCAA ACGTCAAGGT CTTCGAGAAGCTAGAGCAACAGAAAAACTT GAGAAACAA CAAAAGCTGGAAGCAGAGAGAAAGAAACGCCAGAAGAACCAAGAGTT C TTAAACAAT GT GAT GGCACACGCTAAAGATTT CAAAGAATTCCACAGGC 10 AGAACCAAGCAAAACTTTCTAAACTTAATAAAGCTATTCTTACTTATCACG CTAATGCGGAGAGAGAACAAAAGAAGGAACAAGAGAGAAGAGAAAAGG AACGTAT GAAGAAATT GATGGCAGAAGAT GAAGAAGGTTATAGACAGTT GATCGATCAAAAGAAAGACAAACGTCTAGCGTTCTTGCTTTCGCAAACA GATGAGTATATAACTAACCTCACGGAGATGGTAAAGCAACACAAGTTGG 15 AACAAACCAATAAAAAGAAAGAGGAGGAAAAACGCAAGAAGAAGCAGCA GAAAATGCAACAACCAGATAGGAAAGTTACAGTTCTGGAAACTGCAACA GGTAAAAAAGTAACAGGAGAGGCTGCTCCTACACTGCGACAAGTTCAG GAAT GGTTAATCCAACATCCTGGATGGGAGATGGT CGATACAGAT GAT G AGGAT GAT GAAAACGGGGAGAAGAGGGAT GAT GACTAT GAT GAAAATC 20 AAGAAGT GGAT GAT GCAAAAGAAGTTATTAAAAAAGCTAAAGTT GAAGAT GACGAATATCACAAAAACACAAAAGAAGAACAGACTTACTACAGTATTGC T CACACT GTT CAT GAAGT GGTAAC AGAACAAGCAT CCATT CT GGTTAAT G GAAAGCTTAAGGAATAT CAAATTAGAGGGTTAGAAT GGATGGT GT CTTT GTACAATAACAATCTGAATGGTATTCTAGCAGATGAGATGGGTCTAGGT 25 AAAACCATT CAAACGATTGGCTT GTT GACCTATTT GAT GGAAAAAAAGAA GATAAATGGACCG Illll GAT CATAGT GCCACTTT CAACCATTT CTAATT GGATGTTGGAATTTCAAAAGTGGGCCCCTACTGTAGTTGTCATTTCATAC AAAGGCT CTCCT gtggttagaaaagt gatccagagccagttaaaagct G CTAAATT CAAT GT GCTT CT CACTACCTACGAGTACATTATTAAGGACAAG 30 GGT GTATTAGCAAAAAT CCCATTTAAATATAT GAT CATAGAT GAGGGT CA TCGTAT GAAAAACCACCACT GCAAATT GACT CAAGTCCT GAATACGCAC TATTTGGCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAATAA ATTACCAGAATTAT GGGCCTT GTT GAATTT CTT GTT GCCTTCGATTTT CA AGAGTT GCT CCACTTTT GAACAATGGTT CAAT GCGCCATTCGCAACAAC AGGAGAAAAGGTT GAGTTAAACGAAGAAGAAACTAT CCTTATCAT CCGT CGT CTT CACAAAGTACT CAGGCCGTTT CT CCT GAGACGT CT CAAGAAAG 5 AAGTCGAAT CT CAGCTTCCAGACAAAGTGGAATATAT CATAAAGT GT GA CAT GTCGGGCCTACAAAAGGTT CT CTAT GCACACAT GCAGAGCAAGGGT GTGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAAGGAAGGGGATCT AAGGCACT GAT GAACACCATTATGCAGCT GAGGAAACT GTGCAAT CAT C CGTTTAT GTTCCAAAATATCGAAGAGAAATATT GT GAT CAT GTT GGTATT 10 GCT GGT GGAGTGGTTT CTGGACCCGACACTTATAGGGTAT CT GGTAAGT TTGAGCTCTTGGACAGAATATTGCCCAAAATGAAAGCAACTAACCATAG GATT CTT CTTTT CT GT CAAAT GACT CAATTAAT GACCAT CATGGAAGATTA T CTAAATTGGAGAGGATT CAAATAT CTTCGT CTT GAT GGTACAAT CAAAT CAGAAGATCGCGGGGACCTATTATCGAAATTTAATGATAAAAATAGTGAA 15 TAI I I ITTGTTTTTGCTATCTACACGGGCTGGAGGTCTGGGACTTAATTT GCAGACAGCT GATACT GT GATTAT CTTCGATTCCGATT GGAAT CCT CAT C AGGATTTACAAGCT CAGGATCGAGCT CATCGTATTGGACAGCAAAAT GA GGT CCGAGTTTTGCGTTT GATGACT GTTAACTCT GTT GAGGAACGAATTT TAGCTGCAGCTAAATACAAGCTTACTATGGACGAAAAGGTCATTCAAGC 20 T GGTAT GTTCGAT CAGAAGT CTACAGGCT CAGAGAGACAT CAGTTTTT G CAGAGTATTTTACACCAT GACGGAAGCGACGAAGAAGAGGAAAACGAA GTTCCT GAT GACGAAACAGTGAACCAGATGTT GGCCCGAAGGGAAAAC GAATTT CAGCTTTT CCAGAAGATGGAT CAGGAAAGAAAGGAAGAAGAT G AAAAGACCGGAAAGTCGCGACTTATTCAAGAAAGCGAATTGCCCGAATG 25 GCT GTT GAAGCAAGACGAT GAAAT CTACTCGT GGGGCCTT GAT GATCCA GATGCT GTTTTAGGAAGGGGTAGTAGGCAAAGAAAAGAAGTT GATTAT G TTGACAGCCTGACGGAGAAAGAGTGGCTTAAGGCTATTGACGAAGAGG GAGAATTT GAGGAAGAACAAGAAGGT GATAAAGAAGGT CT CAGAAAGAA AAGAGGGAGGAAGAGGAAGAAGCGCGATGATGACGAAGAGGCAAGCC 30 AAATTAAGAGAAGAAAGGTGCAT CTAGCCGAGAT CAAGAT GAAGAAAAA GAT GAAGAGGCTTATGGAAGTT GTT GT GAACTACAGGGACAGGGAT GG TAGAGTATT GAGCGAACCGTTTAT GAAACTTCCAT CAAAGAAGGAGTTA CCT GAGTATTACGATACGATTAAGAAACCTATT G ATATTG AAAAAGT CGT TGCCAACGTAGAAGAAGGAAAATATTT CACGATGCACGATTTGGAAAGA GATTT CGACTTGCT GTGCCAAAACGCCCAACAATACAACGAAGAAGACT CCATGATCTACGAGGACAGCCTCGTTCTTCGACAGGTGTTTAGAAGCGC 5 GAGGGAAAAGATCGACGGTACCTCAGACCACGACGACAACGCCGATGG ACCGGCGGTGGCTCAGATCAAACGACCTCGTGGTAGACCTCGAAAACA CAAGAGACCCGAAGAGATCGAGGCCGAAGCGGCGGCTCAGAAAGCTAT GGAGGAGGCAT CGAAGCT GAGAGCTCAAGCT GAGGCGGAAGAGCTTA GAT CTAAGGTGGAGGAGGCAT CT CAGAGAGCCAAAGAGGAAGCGAAAG 10 CAAGGGAGGAAGCCAAAGCTAGGGAAGAAGCCGAAATCGAGAACATGG AGGAGATT CCCACAAGCACAT GAT CTATAGAGCAACCGGAAACAAAAAG GCAAAAAAG AAATATTATATAG AAAAGAT GTACAT GTT CAAT GGAGATAC ATTTTCGCCGAGTTACAACGGGTAATGCTTTTACAACGGATATTTTGACG TATGAATGTTGACGTTCAGATGAAGTATATTTATAAAATAATCCAGACCTT 15 TACGTTTTGGTT GATTT GTTTT CT GTATT GTT CAGTTTATT GAACAACC AT TAATAGCAGCTTACCTAAATGATTTAGAAAAGCATCTGAGTTATTTAGAT AAGTTTT GAGATTATATTTATTAACTTTAATATTACTAT CTTTATTATAGCA TATTGTAATTAI I I ITTCCTGTCCTTCTTTCGTTGTGTGGTAGATAATCCG AGAGTCAACAGTTATAAGCAAATGAAATTCAGTTAAACCTCAAATGTACA 20 AAATGATCAAATTAATGTTTACAATTTA I I I I I ITACCACGCACATTCACT ATTACTATT GT CAGT CATT GAGATAT CATTTTATATAGCTCCAT GT CT GT C TTCCTCAATTTACAGAGAAGCAATTAGACAAGTAATGACATAATATGGTG CTGAAATAATGTGCTTGATAGTGATGTTCACAAAGTAACTATTCGTTACA AAGTACTCGTTACTTACAAATACCGAAACTAACGATTACTATACAGAGAG 25 GCAAATCGTTACTTT GATTACACT GATTACTT C GTAT C AATCGTAT CAGA GCGAGTAACGA

A SEQ ID N0:104 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587- 707 ou Brahma Reg 1:

ATT CT GGTTAATAGGAAAGCTTAAGGAATATT CAAATTAGAG

GGTTAGAAT GGAT GGT GT CTTT GTACAATAACAAT CT GAAT GGTATT CTA GCAGATGAGATGGGTCTAGGTAAACCNTTCAAACGNTTGGCTTGTTGAC CTATTT GAT GGAAAAAAAGAAGATAAAT GGACCGTTTTT GATCATAGT GC CACTTT CAACCATT CTAATTGGATAGTT GGAATTT CAAAGTAGGGCCCTA CTAGTAGTT GT CATTT CATACAAAGGCT CT CCT GTGGTTAGAAAAGTN AT CCAGAGCCAGTTAAAAGCTGCTAAATTCAATGTGCTTCTCACTACCTAC 5 GAGTACATTATTAAGGCAAGGTGATTAGCAAAAAATCCCAGTTTAAATAT AT GAT CATAGATN AGGT CAT CATN AAACACACT GCAATT GAACT CAAGG CCTGAATACGCA

A SEQ ID N0:105 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns casos como Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2:

AGTGTATTAGCAAAAATCCCATTTAAATATATGATCATAGATG AGGGT CATCGTAT GAAAAACCACCACT GCAAATT GACT CAAGTCCT GAA TACGCACTATTTGGCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTA CAAAATAAATTACCAGAATTATGGGCCTT GTT GAATTT CTT GTT GCCTT C 15 GATTTT CAAGAGTT GCTCCACTTTT GAACAATGGTT CAAT GCGCCATTCG CAACAACAGGAGAAAAGGTTGAGTTAAACGAAGAAGAAACTATCCTTAT CATCCGT CGT CTT CACAAAGTACT CAGGCCGTTT CTCCT GAGACGT CT C AAGAAAGAAGTCGAAT CT CAGCTT CCAGACAAAGT GGAATATAT CATAAA GTGTGACATGTCGGGCCTACAAAAGGTTCTCTATGCACACATGCAGAGC 20 AAGGGTGTGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAGTAAAGGAAGG GGAT CTAAGGACAACTAGAT GAACACCATTAT GCAGCT GAGGAAACT GT GCT

A SEQ ID N0:106 mostra uma seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237- 1333 ou Brahma Reg3:

AGGGCT GGAGGT CT GGGACTTAATTT GCAGACAGCT GATAC T GT GATTAT CTTCGATTCCGATT GGAATCCT CAT CAGGATTTACAAGCT C AGGAT CGAGCT CAT CGTATT GGACAGCAAAAT GAGGTCCGAGTTTT GCG TTT GAT GACT GTTAACT CT GTT G AGGAACGAATTTTAGCTGC AGCTAAAT 30 ACAAGCTTACTAT GGACGAAAAGGT CATT CAAGCT GGTAT GTTCGAT CA GAAGTCTACGGGATCTGAAAGGCAGCAGTTTCTTCAGAGTATTTTACAC AATGATGGTAGTGAT A SEQ ID N0:107 mostra um segmento exemplar de seqüência de cDNA de Brahma Reg3 de Diabrotica AGGGCTGGAGGTCT

A SEQ ID N0:108 mostra um fragmento amplificado exemplar de 5 Brahma Reg2 usado como um molde para síntese de dsRNA:

AT GAGGGT CATCGTAT GAAAAACCACCACT GCAAATT GACT CAAGTCCT GAATACGCACTATTT GGCGCCCTACAGACTCCT GCTTACT G GTACTCCCCTACAAAATAAATTACCAGAATTATGGGCCTTGTTGAATTTC TT GTT GC CTTC GATTTT CAAGAGTT GCT CCACTTTT GAACAAT GGTT CAA 10 T GCGCCATT CGCAACAACAGGAGAAAAGGTT GAGTTAAACGAAGAAGAA ACTAT CCTTAT CATCCGTCGT CTT CACAAAGTACT CAGGCCGTTT CT CCT GAGACGT CT CAAGAAAGAAGTCGAAT CT cagcttccagacaaagt GGAA TATAT CATAAAGT GT GACAT GTCGGGCCTACAAAAGGTT CT CTAT GCACA CATGCAGAGCAAGGGTGTGTTACTTACCGATGGTTCCGAGAAGGGCAG 15 TAAAGGAAGGGGATCTAAGGACA

A SEQ ID N0:109 mostra uma seqüência de formação de RNA grampo de cabelo de Brahma Reg contendo um íntron ST-LS1 (sublinhado): GCGCCCTACAGACTCCTGCTTACTGGTACTCCCCTACAAAA TAAATTAC C AG AATTATGGGCCTTGTT GAATTT CTTGTTGCCTTC GATTTT CAAGAGTTGCTCCACTTTT GAACAAT GGTT CAATGCGCCATT CGCAACA ACAGGAGAAAAGGTT GAGTTAAACGAAGAAGAAACTATCCTTAT CATCC GTCGT CTT CACAAAGTACTCAGGCCGTTT CTCCT GAGACGTCTCAAGAA AG AAGTCGAAT CT CAGCTTCCAGACAAAGT GGAATATAT CATAAAGT GT GACATGTGACTAGTACCGGTTGGGAAAGGTATGTTTCTGCTTCTACCTT TGATATATATATAATAATTATCACTAATTAGTAGTAATATAGTATTTCAAGT ATmTTTCAAAATAAAAGAATGTAGTATATAGCTATTGCTTTTCTGTAGT TTATAAGTGTGTATATTTTAATTTATAACTTTTCTAATATATGACCAAAACA T GGT GAT GTGCAGGTT GAT CCGCGGAC AT GT CACACTTTAT GATATATT CCACTTT GT CT GGAAGCT GAGATTCGACTT CTTT CTT GAGACGT CT CAG GAGAAACGGCCTGAGTACTTTGTGAAGACGACGGATGATAAGGATAGTT TCTTCTTCGTTTAACTCAACCTTTTCTCCTGTTGTTGCGAATGGCGCATT GAACCATT GTT CAAAAGTGGAGCAACT CTT GAAAAT CGAAGGCAACAAG AAATT CAACAAGGCCCATAATT CT GGTAATTTATTTT GTAGGGGAGTACC AGTAAGCAGGAGTCTGTAGGGCGC

A SEQ ID N°:110 mostra uma seqüência de proteína codificada pela seqüência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como Contig[0001]_brahma_949-1126 (Brahma Reg2):

SVLAKIP FKYMIIDEGHRMKNHHCKLT Q VLNTH YLAP YRLLLT G TPLQNKLPELWALLNFLLPSIFKSCSTFEQWFNAPFATTGEKVELNEEETILII RRLHKVLRPFLLRRLKKEVESQLPDKVEYIIKCDMSGLQKVLYAHMQSKGV LLTDGSEKGSKGRGSKDN Descrição Detalhada

/. Visão Geral De Várias Modalidades

São revelados aqui métodos e composições para controle genético de infestações por peste coleóptera. Métodos para identificação de um ou mais gene(s) essencial(ais) para o ciclo de vida de uma peste coleóptera para uso 15 como um gene-alvo para controle mediado por RNAi de uma população de pes- te coleóptera são também providos. Vetores de plasmídeo de DNA codificando uma molécula de RNA podem ser projetados para suprimir um ou mais ge- ne(s)-alvo(s) essenciai(ais) para crescimento, sobrevivência, desenvolvimento e/ou reprodução. Em algumas modalidades, a molécula de RNA pode ser ca- 20 paz de formar moléculas de dsRNA. Em algumas modalidades, são providos métodos para repressão pós-transcripcional de expressão ou inibição de um gene-alvo através de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma seqüência de codificação ou não codificação do gene-alvo em uma peste coleóptera. Nessas e em modalidades adicionais, uma peste coleóptera pode 25 ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA transcri- tas de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucleico que é comple- mentar a uma seqüência de codificação ou não codificação de um gene-alvo, desta maneira provendo um efeito protetor à planta.

Desta maneira, algumas modalidades envolvem inibição especí- fica de seqüência de expressão de produtos de gene-alvo usando dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar a seqüências de codifica- ção e/ou não codificação do(s) gene(s)-alvo para obter controle pelo menos parcial de uma peste coleóptera. É aqui revelado um conjunto de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo uma seqüência de nucleotídeo, por exemplo, conforme mostrado em uma das SEQ ID NoS:1-7 e 103-106, e seus fragmentos. Em algumas modalidades, uma molécula de 5 dsRNA estabilizada pode ser expressa a partir dessas seqüências, seus fragmentos e/ou um gene compreendendo uma dessas seqüências, para o silenciamento ou inibição pós-transcripcional de um gene-alvo. Em certas modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreen- dem toda ou parte de SEQ ID N°:7.

Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeiro recom-

binante (por exemplo, uma célula de planta) tendo em seu genoma pelo me- nos uma seqüência de DNA recombinante codificando pelo menos uma mo- lécula(s) de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em modalidades particulares, a(s) moiécula(s) de dsRNA pode(m) ser produzida(s) quando ingeridas por uma 15 peste coleóptera para pós-transcripcionalmente silenciar ou inibir a expres- são de um gene-alvo na peste coleóptera. A seqüência de DNA recombinan- te pode compreender, por exemplo, qualquer uma de SEQ ID Ν°*:1-7 e 103- 106, fragmentos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1 -7 e 103-106 ou uma seqüência parcial de um gene compreendendo uma de SEQ ID NoS:1-7 e 20 103-106 ou seus complementos.

Modalidades particulares envolvem uma célula hospedeiro re- combinante tendo sem seu genoma uma seqüência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula(s) de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo toda ou parte de SEQ ID N°:7. Quando ingerida por uma 25 peste coleóptera, a(s) molécula(s) de iRNA pode(m) silenciar ou inibir a ex- pressão de um gene-alvo compreendendo SEQ ID N°:7 na peste coleóptera, e desta maneira resulta em parada de crescimento, desenvolvimento, repro- dução e/ou alimentação na peste coleóptera.

Em algumas modalidades, uma célula hospedeiro recombinante tendo em seu genoma pelo menos uma seqüência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de RNA capaz de formar uma molé- cula de dsRNA pode ser uma célula de planta transformada. Algumas moda- Iidades envolvem plantas transgênicas compreendendo tal célula de planta transformada. Em adição a tais plantas transgênicas, plantas progênies de qualquer geração de planta transgênica, sementes transgênicas e produtos de planta transgênica são todos providos, cada um deles compreende se- 5 quência(s) de DNA recombinante. Em modalidades particulares, uma molé- cula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA da invenção pode ser expressa em uma célula de planta transgênica. Desta maneira, nessas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser isolada de uma célula de planta transgênica. Em modalidades particulares, a planta 10 transgênica é uma planta selecionada do grupo consistindo em milho (Zea mays), soja (Glycine max) e plantas da família Poaceae.

Algumas modalidades envolvem um método para modulação da expressão de um gene-alvo em uma célula de peste coleóptera. Nessas e em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser provida, 15 em que a molécula de ácido nucleico compreende uma seqüência de ácido nucleico codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, uma seqüência de nucleotídeo co- dificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA pode ser operavelmente ligada a um promotor, e pode também ser opera- 20 velmente ligada a uma seqüência de terminação de transcrição. Em modali- dades particulares, um método para modulação da expressão de um gene- alvo em uma célula de peste coleóptera pode compreender:

(a) transformação de uma célula de planta com um vetor com- preendendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma molécula de

RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA;

(b) cultura da célula de planta transformada sob condições sufi- cientes para permitir desenvolvimento de uma cultura de célula de planta compreendendo uma pluralidade de células de planta transformadas;

(c) seleção de uma célula de planta transformada que integrou o vetor em seu genoma; e

(d) determinação que a célula de planta transformada seleciona- da compreende a molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsR- NA codificada pela seqüência de nucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula de planta que tem o vetor integrado em seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pela seqüência de nucleotídeo do vetor.

Desta maneira, é também revelada uma planta transgênica

compreendendo um vetor tendo uma seqüência de nucleotídeo codificando uma molécula de RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela seqüência de nucleotídeo do vetor. Em modalidades 10 particulares, expressão de uma molécula de RNA capaz de formar uma mo- lécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um ge- ne-alvo em uma célula de uma peste coleóptera que contata a planta ou cé- lula de planta transformada, por exemplo, através de alimentação na planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula de planta. 15 Plantas transgênicas reveladas aqui podem exibir resistência e/ou tolerância aumentada a infestações por peste coleóptera. Plantas transgênicas particu- lares exibem resistência e/ou tolerância aumentada a uma ou mais pestes coleópteras selecionadas do grupo consistindo em: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. undecimpunctata Mennerheim.

São também revelados aqui métodos para aplicação de agentes

de controle, tal como uma molécula de iRNA, a uma peste coleóptera. Tais agentes de controle podem causar, diretamente ou indiretamente, um prejuí- zo na habilidade da peste coleóptera em se alimentar, crescer ou de outra maneira causar dano em um hospedeiro. Em algumas modalidades, é provi- 25 do um método compreendendo aplicação de uma molécula de dsRNA esta- bilizada a uma peste coleóptera para suprimir pelo menos um gene-alvo na peste coleóptera, desta maneira reduzindo ou eliminando dano à planta em um hospedeiro de peste coleóptera. Em algumas modalidades, um método de inibição da expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera pode 30 resultar na parada do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou ali- mentação na peste coleóptera. Em algumas modalidades, o método pode eventualmente resultar em morte da peste coleóptera. Em algumas modalidades, são providas composições (por e- xemplo, uma composição tópica) que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) da invenção para uso em plantas, animais e/ou no ambiente de uma planta ou animal para obter a eliminação ou redução da 5 infestação de uma peste coleóptera. Em modalidades particulares, a compo- sição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser ali- mentada à peste coleóptera. Algumas modalidades compreendem disponibi- lização da composição nutricional ou fonte de alimento à peste coleóptera. Ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode re- 10 sultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da peste coleóp- tera, o que pode por sua vez resultar na inibição de expressão de pelo me- nos um gene-alvo em céluia(s) da peste coleóptera. Ingestão de ou dano a uma planta ou célula de planta por uma peste coleóptera pode ser limitado ou eliminado em ou qualquer tecido hospedeiro ou ambiente em que a peste 15 coleóptera está presente através da provisão de uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA da invenção no hospedeiro da peste coleóptera.

As composições e os métodos revelados aqui podem ser usados juntos em combinações com outros métodos e composições para controle 20 de dano por peste coleópteras. Por exemplo, uma molécula de iRNA con- forme descrito aqui para proteção de plantas contra pestes coleópteras pode ser usada em um método compreendendo o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma peste coleóptera, biopesticidas efica- zes contra uma peste coleóptera, rotação de cultura ou técnicas genéticas 25 recombinantes que exibem características diferentes das características dos métodos mediados por RNAi e composições de RNAi da invenção (por e- xemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são prejudici- ais para uma peste coleóptera (por exemplo, toxinas Bt)).

II. Abreviações dsRNA ácido ribonucleico de filamento duplo

Gllnibição de crescimento NCBINationaI Centerfor Biotechnology Information gDNA DNA genômico iRNAácido ribonucleico inibidor ORFestrutura de leitura aberta RNAiinterferência de ácido ribonucleico miRNAácido ribonucleico microinibidor

siRNAácido ribonucleico inibidor pequeno hpRNAácido ribonucleico grampo de cabelo UTRregião não traduzida

WCRIagarta da raiz do milho do oeste (Diabrotica virgifera virgi- fera LeConte)

NCRIagarta da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi Smith e

Lawrence)

MCRIagarta da raiz do milho do México (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith)

PCRReação em cadeia da polimerase

RISCComplexo de Silenciamento Induzido por RNA SCRIagarta da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)

III. Termos

No relatório e na tabela que seguem, vários termos são usados.

A fim de prover uma compreensão clara e consistente do relatório e reivindi- cações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as definições que se- guem são providas:

Peste coleóptera: Conforme aqui usado, o termo "peste coleóp- 25 tera" refere-se a insetos pestes da ordem Coleoptera, incluindo insetos pes- tes no gênero Diabrotica, que se alimentam de culturas agriculturais e produ- tos de cultura, incluindo milho e outras gramíneas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma peste coleóptera é selecionada da lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D. barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. 30 howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella-, e D. u. undecimpunctata Mannerheim.

Contato (com um organismo): Conforme aqui usado, o termo "contato com" ou "absorção por" um organismo (por exemplo, uma peste coleóptera), com relação a uma molécula de ácido nucleico, inclui internali- zação da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo, e sem limi- tação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, através da ali- 5 mentação); contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e embebimento de organismos com uma solu- ção compreendendo a molécula de ácido nucleico.

Contíguo: Conforme aqui usado, o termo "contíguo" refere-se a uma seqüência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de seg- mentos de DNA sobrepostos derivados de uma fonte genética única.

Planta de Milho: Conforme aqui usado, o termo "planta de milho" refere-se a uma planta da espécie Zea mays (milho).

Codificando um dsRNA: Conforme aqui usado, a descrição "co- dificando um dsRNA" refere-se a um polinucleotídeo de DNA cujo produto de transcrição de RNA é capaz de formar uma estrutura de dsRNA intramolecu- Iar (por exemplo, um grampo de cabelo) ou estrutura de dsRNA intermolecu- Iar (por exemplo, através de hibridização para uma molécula de RNA-alvo).

Expressão: Conforme aqui usado, "expressão" de uma seqüên- cia de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo através do qual a informação codificada de uma unidade transcrip- cional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA ou cDNA) é convertida para uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. Expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui expressão de gene. Expressão de um gene pode ser também regulada em qualquer ponto no curso de DNA para RNA para proteína. Regulagem de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que agem sobre transcri- ção, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de molécu- Ias intermediárias tal como mRNA ou através da ativação, inativação, com- partimentaiização ou degradação de moléculas de proteína específicas após elas terem sido feitas ou através de suas combinações. Expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou nível de proteína através de qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, northem blot, RT- PCR1 western blot ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in situ ou in vivo.

Material genético: Conforme aqui usado, o termo "material gené-

tico" inclui todos os genes, e moléculas de ácido nucleico, tais como DNA e RNA.

Inibição: Conforme aqui usado, o termo "inibição", quando usado para descrever um efeito sobre uma seqüência de codificação (por exemplo, 10 um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito a partir da seqüência de codificação e/ou peptídeo, polipeptídeo ou produto de proteína da seqüência de codificação. Em alguns exemplos, ex- pressão de uma seqüência de codificação pode ser inibida de maneira que expressão é aproximadamente eliminada. "Inibição específica" refere-se à 15 inibição de uma seqüência de codificação-alvo sem consequentemente afe- tar a expressão de outras seqüências de codificação (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo realizada.

Isolado: Um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido separado ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outros DNA e RNA cromossomais ou extracromossomais e proteínas), enquanto realizando uma mudança química ou funcional no componente (por exemplo, um ácido nucleico pode ser isolado de um cromossomo através da quebra de ligações químicas que conectam o ácido nucleico ao DNA restante no cromossomo). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas através de métodos de purificação padrão. O termo também compreende ácidos nucleicos e proteínas preparados atra- vés da expressão recombinante em uma célula hospedeiro, bem como mo- léculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.

Molécula de ácido nucleico: Conforme aqui usado, o termo "mo- lécula de ácido nucleico" pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotí- deos, que pode incluir ambos os filamentos de sentido e antissentido de RNA1 cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos aci- ma. Um nucleotídeo ou nucleobase pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucleotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleo- 5 tídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" conforme aqui usado é sinônimo de "ácido nucleico" e "polinucleotídeo". Uma molécula de ácido nucleico é ge- ralmente de pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que de outra maneira especificado. Por questão de convenção, a seqüência de nucleotí- deo de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5' para a 3' da 10 molécula. O "complemento" de uma seqüência de nucleotídeo refere-se à seqüência de nucleobases que pode formar pares de base com as nucleo- bases da seqüência de nucleotídeo (isto é, A-T/U e G-C).

Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos compreendendo um DNA molde que é transcrito em uma molécula de RNA que é o comple- mento de uma molécula de mRNA. Nessas modalidades, o complemento da seqüência de nucleotídeo transcrita na molécula de mRNA está presente na orientação 5' a 3', de maneira que a polimerase de RNA (que transcreve DNA na direção 5' para 3') vai transcrever um ácido nucleico do complemen- to que pode hibridizar para a molécula de mRNA. A menos que explicitamen- te declarado de outra maneira, ou está claro ser de outra maneira a partir do contexto, o termo "complemento" desta maneira refere-se à seqüência, de 5' para 3', de nucleobases que pode formar pares de base com as nucleobases de uma seqüência de nucleotídeo particular. Similarmente, a menos que seja explicitamente declarado de outra maneira (ou for claro ser de outra maneira a partir do contexto), o "complemento reverso" de uma seqüência de ácido nucleico refere-se à seqüência do complemento em orientação reversa. O acima é demonstrado na ilustração que segue:

ATGATGATGsequência de nucleotídeo TACTACTAC "complemento" da seqüência de nucleotídeo CATCATCAT "complemento reverso" da seqüência de nucleotí-

deo.

Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas de RNAi de formação de RNA grampo de cabelo. Nessas moléculas de RNAi, ambos o complemento de uma seqüência de nucleotídeo a ser direcionada por interferência de RNA e o complemento reverso da seqüência podem ser encontrados na mesma molécula, de maneira que a molécula de RNA de 5 filamento simples pode "dobrar" e hibridizar para si mesma na região com- preendendo as seqüências complementares e complementares reversas.

"Moléculas de ácido nucleico" incluem formas de filamento sim- ples e duplo de DNA; formas de filamento simples de RNA; e formas de fila- mento duplo de RNA (dsRNA). O termo "seqüência de nucleotídeo" ou "se- 10 quência de ácido nucleico" refere-se a ambos os filamentos de sentido e an- tissentido de um ácido nucleico ou como filamentos simples individuais ou no duplex. O termo "ácido ribonucleico" (RNA) inclui iRNA (RNA inibidor), dsRNA (RNA de filamento duplo), siRNA (RNA de interferência pequeno), mRNA (mRNA mensageiro), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA grampo de cabelo), 15 tRNA (RNAs de transferência, sejam carregados ou descarregados com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar). O termo "ácido desoxirribonucleico" (DNA) inclui cDNA, DNA genômico e híbridos de DNA-RNA. Os termos "segmento de ácido nucleico" e "segmento de seqüên- cia de nucleotídeo", ou mais em geral "segmento", serão compreendidos por 20 aqueles versados na técnica como um termo funcional que inclui ambas as seqüências genômicas, seqüências de RNA ribossomal, seqüências de RNA de transferência, seqüências de RNA mensageiro, seqüências de operon e seqüências de nucleotídeo engenheiradas menores que codificam ou podem ser adaptadas para codificar peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.

Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido

nucleico curto. Oligonucleotídeos podem ser formados através de clivagem de segmentos de ácido nucleico mais longos ou através da polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Sintetizadores automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de base de comprimento. 30 Devido ao fato que os oligonucleotídeos podem se ligar a uma seqüência de nucleotídeo complementar, eles podem ser usados como sondas para de- tecção de DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesso- xirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplifi- cação de seqüências de DNA. Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciadof \ que permite que uma polimerase de DNA es- tenda o oligonucleotídeo e replique o filamento complementar.

Uma molécula de ácido nucleico pode incluir um ou ambos os

nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados juntos por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou não natural. Moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou po- dem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, como será 10 prontamente compreendido por aqueles versados na técnica. Tais modifica- ções incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações in- ternucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc; ligações carre- 15 gadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc; quelantes; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc). O termo "molécula de ácido nucleico" inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de filamento sim- 20 pies, filamento duplo, parcialmente duplexadas, triplexadas, grampo de ca- belo, circular e padlocked.

Conforme aqui usado com relação a DNA, o termo "seqüência de codificação", "seqüência de nucleotídeo estrutural" ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refere-se a uma seqüência de nucleotídeo que é por fim 25 traduzida em um polipeptídeo, através de transcrição e mRNA, quando posta sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. Com relação a RNA, o termo "seqüência de codificação" refere-se a uma seqüência de nucleotí- deo que é traduzida em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma seqüência de codificação são determinados por um códon de início de 30 tradução no terminal 5' e um códon de parada de tradução no terminal 3'. Seqüências de codificação incluem, mas não estão limitadas a: DNA genô- mico; cDNA; EST; e seqüências de nucleotídeo recombinantes. Conforme aqui usado, "seqüência de não codificação transcrita" refere-se a segmentos de moléculas de mRNA tais como 5'UTR, 3'UTR e segmentos de íntron que não são traduzidos em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Ainda, "seqüência de não codificação transcrita" refere-se a 5 uma seqüência de nucleotídeo que é transcrita em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossomal (rRNA) conforme exemplificado por rRNA 5S, rRNA 5.8S, rRNA 16S, rRNA 18S, rRNA 23S e rRNA 28S e similar); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tais como U4, U5 e U6 e similar. Seqüências de não codificação transcritas 10 também incluem, por exemplo e sem limitação, RNAs pequenos (sRNA), termo que é frequentemente usado para descrever RNAs de não codificação bacterianos pequenos; RNAs nucleolares pequenos (snoRNA); microRNAs; RNAs de interferência pequenos (siRNA); RNAs de interação Piwi (piRNA); e RNAs de não codificação longos. Ainda, "seqüência de não codificação 15 transcrita" refere-se a uma seqüência de nucleotídeo que pode existir nati- vamente como uma seqüência "espaçadora" intragênica em um organismo e que é transcrita em uma molécula de RNA.

Genoma: Conforme aqui usado, o termo "genoma" refere-se a DNA cromossomal encontrado dentro do núcleo de uma célula, e refere-se também a DNA de organela encontrado dentro de componentes subcelula- res da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser induzida em uma célula de planta de maneira que a molécula de DNA seja integrada ao genoma da célula de planta. Nessas e em modalida- des adicionais, a molécula de DNA pode ser ou integrada ao DNA nuclear da célula de planta ou integrada ao DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula de planta. O termo "genoma" como ele se aplica a bactérias refere-se a am- bos o cromossomo e os plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algu- mas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria de maneira que a molécula de DNA é integrada ao genoma da bactéria. Nessas e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser ou cromossomicamente integrada ou localizada como ou em um plasmí- deo estável. Identidade de seqüência: O termo "identidade de seqüência" ou "identidade", conforme aqui usado no contexto de duas seqüências de ácido nucleico ou polipeptídeo, refere-se aos resíduos nas duas seqüências que são iguais quando alinhados para correspondência máxima em uma janela de comparação especificada.

Conforme aqui usado, o termo "porcentagem de identidade de seqüência" pode se referir ao valor determinado através da comparação de duas seqüências otimamente alinhadas (por exemplo, seqüências de ácido nucleico ou seqüências de polipeptídeo) em uma janela de comparação, em que a porção da seqüência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) comparado com a seqüência de refe- rência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas seqüências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições em que o resíduo de nucleotídeo ou aminoácido i- dêntico ocorre em ambas as seqüências para dar o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de seqüência. Uma seqüência que é idêntica em toda posição em comparação com uma seqüência de referência é dita ser 100% idêntica à seqüência de referência e vice-versa.

Métodos para alinhamento de seqüências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman 25 (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet e outros (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang e outros (1992) Comp. Appl. Biosei. 8:155-65; Pearson e outros (1994) Methods Mol. Bioi 24:307-31; Tatiana e outros (1999) FEMS Mierobiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalha- 30 da de métodos de alinhamento de seqüência e cálculos de homologia pode ser encontrada em, por exemplo, Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. A _Basic Local Alignment Search Tool (BLAST®; Altschul e ou- tros (1990)) do National Center for Biotechnology Information (NCBI) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários 5 programas de análise de seqüência. Uma descrição de como determinar identidade de seqüência usando este programa está disponível na internet na seção "help" para BLAST®. Para comparação de seqüências de ácido nucleico, a função "BLAST 2 sequences" do programa BLAST® (BIastn) po- de ser empregada usando o ajuste de matriz BLOSUM62 de default para 10 parâmetros de default. Seqüências de ácido nucleico com similaridade ainda maior com as seqüências de referência vão mostrar identidade de porcenta- gem alta quando avaliadas através deste método.

Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Conforme aqui usado, os termos "Especificamente hibridizável" e "Especifi- camente complementar" são termos que indicam um grau de complementa- ridade suficiente de maneira que ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico-alvo. Hibridi- zação entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as seqüências de ácido nucleico das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de for- mar ligações de hidrogênio com bases correspondentes no filamento oposto para formar uma molécula duplex que, se for suficientemente estável, é de- tectável usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de áci- do nucleico não precisa ser 100% complementar à sua sequência-alvo para ser especificamente hibridizável. No entanto, a quantidade de complementa- ridade de seqüência que deve existir para hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.

Condições de hibridização resultando em graus particulares de adstringência vão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e comprimento das seqüências de ácido nuclei- co de hibridização. Em geral, a temperatura de hibridização e a resistência iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibri- dização vão determinar a adstringência de hibridização, embora tempos de lavagem também influenciem a adstringência. Cálculos com relação a condi- ções de hibridização requeridas para obter graus particulares de adstringên- cia são conhecidos daqueles versados na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook e outros (ed.) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. 2a ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hvbridization. IRL Press, Oxford, 1985. Instrução e orientação detalhadas adicionais com relação à hibridização de ácidos nucleicos podem ser encon- tradas, por exemplo, em Tijssen, "Overview of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", em Laboratorv Techniaues in Biochemistrv and Molecular Bioloqy- Hvbridization with Nucleic Acid Probes. Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel e outros, Eds., Current Protocols in Molecular Bioloav. Capítulo 2, Greene Publishing e Wiley- Interscience, NY, 1995.

Conforme aqui usado, "condições adstringentes" compreende condições sob as quais hibridização vai ocorrer apenas se houver menos do que 20% de incompatibilidade entre a molécula de hibridização e uma seqüência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico-alvo. "Condi- 20 ções adstringentes" incluem níveis particulares adicionais de adstringência. Desta maneira, conforme aqui usado, condições de "adstringência modera- da" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 20% de incompatibi- lidade de seqüência não vão hibridizar; condições de "alta adstringência" são aquelas sob as quais seqüências com mais de 10% de incompatibili- 25 dade não vão hibridizar; e condições de "adstringência muito alta" são a- quelas sob as quais seqüências com mais de 5% de incompatibilidade não vão hibridizar.

O que segue são condições de hibridização não limitantes, re- presentativas.

Condição de adstringência alta (detecta seqüências que compar-

tilham pelo menos 90% de identidade de seqüência): Hibridização em tam- pão SSC 5x a 65°C por 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65°C por 20 minutos cada.

Condição de adstringência moderada (detecta seqüências que compartilham pelo menos 80% de identidade de seqüência): Hibridização em tampão SSC 5x-6x a 65-70% por 16-20 horas; lavar duas vezes em tam- pão SSC 2x em temperatura ambiente por 5-20 minutos; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x a 55-70°C por 30 minutos cada.

Condição de controle não adstringente (seqüências que compar- tilham pelo menos 50% de identidade de seqüência vão hibridizar): Hibridi- zação em tampão SSC 6x em temperatura ambiente até 55°C por 16-20 ho- ras; lavar pelo menos duas vezes em tampão SSC 2x-3x em temperatura ambiente até 55°C por 20-30 minutos cada.

Conforme aqui usado, o termo "substancialmente homólogo" ou "homologia substancial", com relação a uma seqüência de ácido nucleico contígua, refere-se a seqüências de nucleotídeo contíguas compreendidas dentro das moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições ads- tringentes para uma molécula de ácido nucleico tendo a seqüência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico compre- endendo seqüências que são substancialmente homólogas a uma seqüência de ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7 e 103- 106 são aquelas moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições adstringentes (por exemplo, as condições de Adstringência Moderada mos- tradas, supra) para uma molécula de ácido nucleico compreendendo a se- qüência de ácido nucleico de referência de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1- 7 e 103-106. Seqüências substancialmente homólogas podem ter pelo me- nos 80% de identidade de seqüência. Por exemplo, seqüências substanci- almente homólogas podem ter de a partir de cerca de 80% a 100% de iden- tidade de seqüência, tal como cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83% cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88% cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93% cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98% cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propri- edade de homologia substancial está intimamente relacionada com hibridi- zação específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especifi- camente hibridizável quando há um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não específica do ácido nucleico a seqüências não alvo 5 sob condições em que ligação específica é desejada, por exemplo, sob con- dições de hibridização adstringente.

Conforme aqui usado, o termo "ortólogo" refere-se a um gene em duas ou mais espécies que se desenvolveu a partir de uma seqüência de nucleotídeo ancestral comum, e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.

Conforme aqui usado, duas moléculas de seqüência de ácido nucleico são ditas exibir "complementaridade completa" quando cada nucle- otídeo de uma seqüência lida na direção 5' a 3' é complementar a todo nu- cleotídeo da outra seqüência quando lida na direção 3' para 5'. Uma se- 15 quência de nucleotídeo que é complementar a uma seqüência de nucleotí- deo de referência vai exibir uma seqüência idêntica à seqüência de comple- mento reverso da seqüência de nucleotídeo de referência. Esses termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles versados na técnica.

Operavelmente ligado: Uma primeira seqüência de nucleotídeo é

operavelmente ligada com uma segunda seqüência de ácido nucleico quan- do a primeira seqüência de ácido nucleico está em uma relação funcional com a segunda seqüência de ácido nucleico. Quando recombinantemente produzidas, seqüências de ácido nucleico operavelmente ligadas são geral- 25 mente contíguas e, em que necessário unir duas regiões de codificação de proteína, na mesma estrutura de leitura (por exemplo, em uma ORF tradu- cionalmente fundida). No entanto, os ácidos nucleicos não precisam ser con- tíguos para serem operavelmente ligados.

O termo "operavelmente ligado", quando usado com referência a uma seqüência reguladora e uma seqüência de codificação, significa que a seqüência reguladora afeta a expressão da seqüência de codificação ligada. "Seqüências reguladoras" ou "elementos de controle" referem-se a sequên- cias de nucleotídeo que influenciam o momento e/ou nível/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da seqüên- cia de codificação associada. Seqüências reguladoras podem incluir promo- tores; seqüências líderes de tradução; íntrons; aumentadores; estruturas de 5 haste-alça; seqüências de ligação de repressor; seqüências de terminação; seqüências de reconhecimento de poliadenilação, etc. Seqüências regulado- ras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma seqüência de codificação operavelmente ligada a elas. Também, seqüências reguladoras particulares operavelmente ligadas a uma seqüência de codifi- 10 cação podem estar localizadas no filamento complementar associado de uma molécula de ácido nucleico de filamento duplo.

Promotor: Conforme aqui usado, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início de transcrição e que pode estar envolvida em reconhecimento e ligação de polimerase de 15 RNA e outras proteínas para iniciar transcrição. Um promotor pode ser ope- ravelmente ligado a uma seqüência de codificação para expressão em uma célula ou um promotor pode ser operavelmente ligado a uma seqüência de nucleotídeo codificando uma seqüência de sinal que pode ser operavelmen- te ligada a uma seqüência de codificação para expressão em uma célula. 20 Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar transcrição em células de planta. Exemplos de promotores sob controle desenvolvimen- tal incluem promotores que preferivelmente iniciam transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueí- dos ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferidos de 25 tecido". Promotores que iniciam transcrição apenas em certos tecidos são referidos como "específicos de tecido". Um promotor "específico de tipo de célula" direciona principalmente expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode estar sob controle am- 30 biental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores específicos de tecido, preferidos de tecido, específicos de tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecido ou célula.

Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas moda- 5 Iidades da invenção. Vide Ward e outros (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Promotores induzíveis exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que respondem a cobre; ge- ne In2 de milho que responde a protetores de herbicida benzenossulfonami- 10 da; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcripcional pode ser induzida por um hormônio glucocorticosteroide (Schena e outros (1991) Proc. Nati Acad. Sei. USA 88:0421).

Promotores constitutivos exemplares incluem, mas não estão Ii- 15 mitados a: Promotores de vírus de planta, tal como o promotor 35S do Vírus do Mosaico da Couve-flor (CaMV); promotores dos genes da actina do arroz; promotores da ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da histona H3 do milho; e o promotor ALS, fragmento Xbal/Ncol 5' para o gene estrutural ALS3 de Bras- sica napus (ou uma seqüência de nucleotídeo similar ao dito fragmento 20 Xbal/Ncol) (Publicação PCT InternacionaIN0. W096/30530).

Ainda, qualquer promotor específico de tecido ou preferido de tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de codificação operavelmente ligada a um promotor específico de 25 tecido podem produzir o produto da seqüência de codificação exclusivamen- te, ou preferivelmente, em um tecido específico. Promotores específicos de tecido ou preferidos de tecido exemplares incluem, mas não estão limitados a: Um promotor preferido de semente, tal como aquele do gene da faseolina; um promotor específico de folha e induzido por Iuz tal como aquele de cab 30 ou rubisco; um promotor específico de antera tal como aquele de LA T52\ um promotor específico de pólen tal como aquele de Zm13\ e um promotor pre- ferido de microesporo tal como aquele de apg. Transformação: Conforme aqui usado, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se à transferência de uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico para uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molé- cula de ácido nucleico transduzida para a célula quando a molécula de ácido 5 nucleico se torna estavelmente replicada pela célula, ou através da incorpo- ração da molécula de ácido nucleico no genoma celular ou através de repli- cação epissomal. Conforme aqui usado, o termo "transformação" compreen- de todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: 10 transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm e outros (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner e outros (1987) Proc. Nati Acad. Sei. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller e outros (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley e outros (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803- 15 7); absorção de DNA direta; e bombardeamento com microprojétil (Klein e outros (1987) Nature 327:70).

Transqene: Uma seqüência de ácido nucleico exógena. Em al- guns exemplos, um transgene pode ser uma seqüência que codifica um ou ambos os filamentos de um RNA capaz de formar uma molécula de dsRNA que compreende uma seqüência de nucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma peste coleóptera. Em exem- plos adicionais, um transgene pode ser uma seqüência de ácido nucleico de antissentido, em que expressão da seqüência de ácido nucleico de antissen- tido inibe expressão de uma seqüência de ácido nucleico-alvo. Ainda em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma seqüência de gene (por exemplo, um gene de resistência a herbicida), um gene codificando um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil ou um gene codificando uma característica agricultural desejável. Nesses e em outros exemplos, um transgene pode conter seqüências reguladoras operavelmente ligadas a uma seqüência de codificação do transgene (por exemplo, um promotor).

Vetor: Uma molécula de ácido nucleico conforme introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir seqüências de ácido nucleico que permitem que ele replique na célula hospedeiro, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que carrega DNA exógeno para uma célula. Um vetor pode também 5 incluir um ou mais genes, incluindo aqueles que produzem moléculas de an- tissentido, e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéti- cos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, desta maneira fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui op- 10 cionalmente materiais para auxiliar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de prote- ína, etc).

Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou mais com relação ao rendimento de variedades de checagem no mesmo 15 local de crescimento crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condi- ções. Em modalidades particulares, "rendimento aperfeiçoado" significa uma cultivar tendo um rendimento estabilizado de 105% ou mais com relação ao rendimento de variedades de checagem no mesmo local de crescimento contendo densidades significantes de pestes coleópteras que são prejudici- 20 ais para esta cultura crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condi- ções.

A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos "um", "uma" e "o", "a" significam "pelo menos um" conforme aqui usado.

A menos que de outra maneira especificamente explicado, todos 25 os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que geralmente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a presen- te invenção pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin1S Genes X. Jones & Bartlett Publishers1 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs e outros (eds.), The Encv- 30 clopedia of Molecular Bioloav. Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632- 02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloav e Biotechnoloqv: A Com- prehensive Desk Reference. VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569- 8). Todas as porcentagens são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que de outra maneira registrado. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.

IV. Moléculas de Ácido Nucleico Compreendendo uma Seauência de Peste Coleóptera

A. Visão aeral

São descritas aqui moléculas de ácido nucleico úteis para o con- trole de pestes coleópteras. Moléculas de ácido nucleico descritas incluem sequências-alvo (por exemplo, genes nativos e seqüências de não codifica- ção), dsRNAs, siRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, moléculas de ds- RNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a toda ou parte de uma ou mais seqüências de ácido nucleico nativas em uma peste coleóptera. Nes- sas e em modalidades adicionais, a(s) sequência(s) de ácido nucleico nati- va(s) pode(m) ser um ou mais gene(s)-alvo, cujo produto pode estar, por exemplo e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutor; ou envolvido em um desenvolvimento larval. Moléculas de ácido nucleico descritas aqui, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos uma sequência(s) de ácido nucleico nati- va à qual moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar RNAi na célula, e consequentemente reduzem ou eliminam expressão da(s) sequência(s) de ácido nucleico nativa(s). Em alguns exem- plos, redução ou eliminação da expressão de um gene-alvo por uma molécu- la de ácido nucleico compreendendo uma seqüência especificamente com- plementar a ele pode ser letal em pestes coleópteras ou resulta em cresci- mento e/ou reprodução reduzido.

Em algumas modalidades, pelo menos um gene-alvo em uma peste coleóptera pode ser selecionado, em que o gene-alvo compreende uma seqüência de nucleotídeo selecionada da lista compreendendo proteína 30 fosfatase PP1-87B (SEQ ID N°:1), D_vir_Contig0011_87B (SEQ ID N°:3), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_c43870_RPA70 ou região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N0:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N0:105) e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou 5 Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106). Em exemplos particulares, um gene-alvo em uma peste coleóptera é selecionado, em que o gene-alvo compreende a seqüência de nucleotídeo nova de SEQ ID N°:7.

Em algumas modalidades, um gene-alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifi- ca um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de aminoácido contígua que é pelo menos 85% idêntica (por exemplo, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% ou 100% idêntica) à seqüência de aminoácido do produto de proteína de uma de PP1-87B (SEQ ID N0:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), D_vir_Contig0011_87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 ou região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), RPS6 (SEQ ID N°:7), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N0:105) e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106).

Um gene-alvo pode ser qualquer seqüência de ácido nucleico em uma peste coleóptera, cuja inibição pós-transcripcional tem um efeito prejudicial sobre a peste coleóptera ou provê um benefício protetor contra a 25 peste coleóptera a uma planta. Em exemplos particulares, um gene-alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleo- tídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma seqüência de ami- noácido contígua que é pelo menos 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca 30 de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica ou 100% idêntica à seqüência de aminoácido do produto de proteína de SEQ ID N°:7.

São providas de acordo com a invenção seqüências de nucleotí- deo, cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por uma seqüência de codificação em uma peste coleóptera. Em algumas modalidades, após 5 ingestão da molécula de RNA expressa por uma peste coleóptera, sub- regulagem da seqüência de codificação em células da peste coleóptera pode ser obtida. Em modalidades particulares, sub-regulagem da seqüência de codificação em células da peste coleóptera pode resultar em um efeito pre- judicial sobre crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da peste 10 coleóptera.

Em algumas modalidades, sequências-alvo incluem seqüências de RNA de não codificação transcritas, tais como 5'UTRs; 3'UTRs; seqüên- cias líderes unidas; seqüências de íntron; seqüências de outron (por exem- plo, RNA de 5'UTR subsequentemente modificado em união trans)·, sequên- 15 cias de donatron (por exemplo, RNA de não codificação requerido para pro- ver seqüências doadoras para união trans)-, e outro RNA transcrito de não codificação de genes de peste coleóptera-alvo. Tais seqüências podem ser derivadas de ambos os genes mono-cistrônicos e poli-cistrônicos.

Desta maneira, são também descritas aqui em conexão com al- gumas modalidades moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma seqüência de nu- cleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma se- quência-alvo em uma peste coleóptera. Em algumas modalidades uma mo- lécula de iRNA pode compreender sequência(s) de nucleotídeo que é/são complementares a todas ou parte de uma pluralidade de sequências-alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências-alvo. Em modali- dades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado tal como uma planta ou bactéria. São também reveladas seqüências de cDNA que podem ser usa- das para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, molécu- las de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de uma sequência-alvo em uma peste coleóptera. São ainda descri- tos construtos de DNA recombinante para uso na obtenção da transforma- ção estável de-alvos hospedeiros particulares. Alvos hospedeiros transfor- mados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA dos construtos de DNA recombinante. Desta maneira, é 5 também descrito um vetor de transformação de planta compreendendo pelo menos uma seqüência de nucleotídeo operavelmente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, em que expressão da(s) se- quência(s) de nucleotídeo resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda 10 ou parte de uma sequência-alvo em uma peste coleóptera.

Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico úteis pa- ra o controle de pestes coleópteras podem incluir: toda ou parte da seqüên- cia de ácido nucleico nativa isolada de Diabrotica de RPS6 (SEQ ID N°:7); uma seqüência de nucleotídeo que quando expressa resulta em uma molé- 15 cuia de RNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que é especifi- camente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por RPS6 (SEQ ID N°:7); moléculas de iRNA (por exemplo, ds- RNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma se- qüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte 20 de RPS6 (SEQ ID N°:7); e construtos de DNA recombinante para uso na ob- tenção de transformação estável de-alvos hospedeiros particulares, em que um-alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico acima.

Nessas e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nu- 25 cleico adicionais úteis para o controle de pestes coleópteras podem incluir: PP1-87B (SEQ ID N0:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ 30 ID N°:6), Brahma (SEQ ID N0:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105) e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B (SEQ ID N0:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase 5 D_vir_Contig0011 87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), Brahma (SEQ ID N0:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 10 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237- 1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106); seqüências de nucleotídeo que quando expressas resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a uma mo- lécula de RNA nativa que é codificada por PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 15 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), Brahma (SEQ ID N0:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ 20 ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N0:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237-1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma seqüência de nu- cleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B 25 (SEQ ID N0:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), Brahma (SEQ ID N0:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 30 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237- 1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a PP1-87B (SEQ ID N0:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 5 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N0:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N°:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237- 10 1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106); moléculas de iRNA {por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B (SEQ ID N0:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 15 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), Brahma (SEQ ID N0:103); F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N0:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237- 20 1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106); seqüências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares a PP1-87B (SEQ ID N°:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 25 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ ID N°:6), Brahma (SEQ ID N0:103); F5XY5KV01DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N0:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237- 30 1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N0:106); moléculas de iRNA {por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de PP1-87B (SEQ ID N0:1), RPA70 (SEQ ID N°:2), proteína fosfatase D_vir_Contig0011_87B ou PP1-87B (SEQ ID N°:3), D_vir_c43870_RPA70 ou Região 1 de RPA70 (SEQ ID N°:4), D_vir_c18764_RPA70 ou Região 2 de RPA70 (SEQ ID N°:5), D_vir_c7971_RPA70 ou Região 3 de RPA70 (SEQ 5 ID N°:6), Brahma (SEQ ID N°:103); F5XY5KV01 DBWKA_brahma_587-707 ou Brahma Regl (SEQ ID N°:104), D_vir_Contig[0001]_brahma_949-1126 ou Brahma Reg2 (SEQ ID N0:105), e F5XY5KV01D0IM6_brahma_1237- 1333 ou Brahma Reg3 (SEQ ID N°:106); e construtos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de-alvos hospedeiros parti- 10 culares, em que um-alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucleico acima.

B. Moléculas de Ácido Nucleico

A presente invenção provê, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que inibem expressão de gene- 15 alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera; e moléculas de DNA capazes de ser expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera.

Algumas modalidades da invenção proveem uma molécula de ácido nucleico isolada compreendendo a seqüência de nucleotídeo de: SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo,. WCR) com- preendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; uma se- qüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é trans- crita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; o com- plemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Di- abrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compre- endendo SEQ ID Ν°:7; ο complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um orga- nismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo me- nos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa 5 de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nati- va compreendendo SEQ ID N°:7; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação na- tiva de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7. Em modalidades particulares, contato 10 com ou absorção por uma peste coleóptera da seqüência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da peste coleóptera.

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico iso- lada da invenção pode compreender pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de nucleotídeo selecionada do grupo con- sistindo em: SEQ ID N0:1; o complemento de SEQ ID N0:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o com- plemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N0:103; o complemento de SEQ ID N0:103; SEQ ID N0:104; o com- plemento de SEQ ID N°:104; SEQ ID N°:105; o complemento de SEQ ID N°:105; SEQ ID N°:106; o complemento de SEQ ID N°:106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6 e 103-106; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1-6 e 103-106; uma seqüência de não codificação nati- va de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; o com- plemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Di- abrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; um fragmento de pelo menos

19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6 e

103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabro- tica compreendendo qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; um frag- mento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma mo- 10 lécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1-6 e 103-106; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106. Em modalidades particulares, 15 contato com ou absorção por uma peste coleóptera da seqüência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou ali- mentação da peste coleóptera.

Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico iso- lada da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, 20 três ou mais) segmento de SEQ ID N0M-T1 103 e/ou 106 (por exemplo, uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N°*:99-102 e 107, que pode ser encontrada como fragmentos em SEQ ID N08-S^ e 106).

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da 25 invenção pode compreender pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene- alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera. Tal sequên- cia(s) de DNA pode ser operavelmente ligada a uma seqüência promotora 30 que funciona em uma célula compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou aumentar a transcrição do RNA codificado capaz de formar uma molécu- la(s) de dsRNA. Em uma modalidade, a pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de DNA pode ser derivada da seqüência de nucleotídeo de SEQ ID N°:7. Derivados de SEQ ID N°:7 incluem fragmentos de SEQ ID N°:7. Em algumas modalidades, tal fragmento pode compreen- der, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos contíguos de SEQ 5 ID N°:7 ou um complemento da mesma. Desta maneira, tal fragmento pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 17, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7 ou um complemento da mesma. Nessas e em modalidades adicionais, tal fragmento pode compreender, por exemplo, mais de cerca de 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7 ou um 10 complemento da mesma. Desta maneira, um fragmento de SEQ ID N°:7 po- de compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7 ou um complemento da mesma.

Em modalidades particulares, pelo menos uma sequência(s) de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma peste coleóptera pode compreender seqüências de DNA que são derivadas de uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo con- sistindo em SEQ ID NoS: 1 -6 e 103-106. Derivados de uma seqüência de nu- cleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:1-6 e 103-106 incluem fragmentos de SEQ ID NoS: 1 -6 e 103-106. Em algumas modalida- des, tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos de SEQ ID N08:1-6 e 103-106 ou um complemento da mesma. Desta maneira, tal fragmento pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NoS:1-

6 e 103-106 ou um complemento da mesma. Nessas e em modalidades adi- cionais, tal fragmento pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106 ou um comple- mento da mesma. Desta maneira, um fragmento de uma seqüência de nu- 30 cleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:1-6 e 103-106 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais nucleotídeos contíguos das SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106 ou um complemento da mesma. Em algumas modalidades particulares, os frag- mentos podem compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleo- tídeos contíguos de uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NoS:99-102 ou um complemento da mesma. Em cer- 5 tas modalidades, os fragmentos podem compreender, por exemplo, os 14 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N0:107 ou um complemento da mesma.

Algumas modalidades compreendem introdução de moléculas de dsRNA parcial- ou integralmente estabilizadas em uma peste coleóptera para inibir expressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão da peste coleóptera. Quando expressas como uma molécula de iRNA (por e- xemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) e absorvidas pela peste coleópte- ra, seqüências de ácido nucleico compreendendo um ou mais fragmentos de qualquer uma de SEQ ID NoS:1-7 podem causar uma ou mais de morte, ini- bição de crescimento, mudança em razão de sexo, redução em tamanho de prole, parada de infecção e/ou parada de alimentação por uma peste coleóp- tera. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA com- preendendo uma seqüência de nucleotídeo incluindo cerca de 19 a cerca de 300 nucleotídeos que são substancialmente homólogos a uma seqüência de gene-alvo de peste coleóptera e compreendendo um ou mais fragmentos da seqüência de nucleotídeo de SEQ ID N°:7 é provida. Essas e moléculas de dsRNA adicionais podem compreender ainda um ou mais fragmentos de uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID N°s:1-6. Expressão de tal molécula de dsRNA pode, por exemplo, levar à mortalidade e/ou inibição de crescimento em uma peste coleóptera que ab- sorve a molécula de dsRNA.

Em certas modalidades, moléculas de dsRNA providas pela in- venção compreendem seqüências de nucleotídeo complementares a uma gene-alvo compreendendo SEQ ID N°:7 e/ou seqüências de nucleotídeo complementares a um fragmento de SEQ ID N°:7, inibição do gene-alvo em 30 uma peste coleóptera resulta na redução ou remoção de um agente de se- qüência de proteína ou nucleotídeo que é essencial para o crescimento, de- senvolvimento ou outra função biológica da peste coleóptera. Uma sequên- cia de nucleotídeo selecionada pode exibir de a partir de cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de seqüência com a SEQ ID N°:7, um frag- mento contíguo da seqüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°:7 ou o complemento de qualquer uma das acima. Por exemplo, uma seqüência de 5 nucleotídeo selecionada pode exibir cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; ou cerca de 100% de 10 identidade de seqüência com a SEQ ID N°:7, um fragmento contínuo da se- qüência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID N°:7 ou o complemento de qualquer uma das acima. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA provida pela invenção pode compreender ainda uma ou mais se- qüências de nucleotídeo complementares a um gene-alvo compreendendo 15 uma das SEQ ID NoS:1-6, a inibição de tal gene-alvo em uma peste coleópte- ra resulta na redução ou remoção de um agente de seqüência de proteína ou nucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou ou- tra função biológica da peste coleóptera.

Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser 20 expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene-alvo pode compreender uma seqüência de nucleotídeo simples que é especificamente complementar a toda ou parte de uma seqüência de ácido nucleico nativa encontrada em uma ou mais espé- cie de peste coleóptera-alvo, ou a molécula de DNA pode ser construída 25 como uma quimera a partir de uma pluralidade de tais seqüências especifi- camente complementares.

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma primeira e uma segunda seqüência de nucleotídeo sepa- rada por uma "seqüência espaçadora". Uma seqüência espaçadora pode ser 30 uma região compreendendo qualquer seqüência de nucleotídeos que facilita formação de estrutura secundária entre as primeira e segunda seqüências de nucleotídeo, em que isto for desejado. Em uma modalidade, a seqüência espaçadora é parte de uma seqüência de codificação de sentido ou antis- sentido para mRNA. A seqüência espaçadora pode compreender alternati- vamente qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de ser ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucleico.

Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA po-

de compreender uma seqüência de nucleotídeo codificando uma ou mais moléculas de RNA diferentes, em que cada uma das moléculas de RNA dife- rentes compreende uma primeira seqüência de nucleotídeo e uma segunda seqüência de nucleotídeo, em que as primeira e segunda seqüências de nu- 10 cleotídeo são complementares umas à outra. As primeira e segunda se- qüências de nucleotídeo podem ser conectadas dentro de uma molécula de RNA através de uma seqüência espaçadora. A seqüência espaçadora pode constituir parte da primeira seqüência de nucleotídeo ou da segunda se- qüência de nucleotídeo. Expressão de uma molécula de RNA compreenden- 15 do as primeira e segunda seqüências de nucleotídeo pode levar à formação de uma molécula de dsRNA da presente invenção, através de emparelha- mento de base intramolecular específico das primeira e segunda seqüências de nucleotídeo. A primeira seqüência de nucleotídeo ou a segunda seqüên- cia de nucleotídeo pode ser substancialmente idêntica a uma seqüência de 20 ácido nucleico nativa para uma peste coleóptera (por exemplo, um gene-alvo ou seqüência de não codificação transcrita), um derivado da mesma ou uma seqüência complementar à mesma.

Moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem filamentos duplos de seqüências de ribonucleotídeo polimerizadas e podem incluir mo- 25 dificações ou na estrutura principal de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. Modificações na estrutura do RNA podem ser feitas especialmente para permitir inibição específica. Em uma modalidade, moléculas de dsRNA po- dem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo de maneira que moléculas de siRNA podem ser geradas. Este processo enzimático po- 30 de utilizar uma enzima RNAse III, tal como DICER em eucariontes ou in vitro ou in vivo. Vide Elbashir e outros (2001) Nature 411:494-8; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286(5441 ):950-2. DICER ou enzimas RNAse Ill funcionalmente equivalentes clivam filamentos de dsRNA e/ou moléculas de hpRNA maiores em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um deles é de cerca de 19-25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por essas enzimas têm 2 a 3 sobreposições 3' de nu- 5 cleotídeo e terminais fosfato 5' e hidroxila 3'. As moléculas de siRNA gera- das por enzimas RNAse Ill não são enroladas e separadas em RNA de fila- mento simples na célula. As moléculas de siRNA então hibridizam especifi- camente com seqüências de RNA transcritas a partir de um gene-alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um 10 mecanismo de degradação de RNA celular inerente. Este processo pode resultar na degradação ou remoção eficaz da seqüência de RNA codificada pelo gene-alvo no organismo-alvo. O resultado é o silenciamento pós- transcripcional do gene direcionado. Em algumas modalidades, moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNAse Ill endógenas a partir de molécu- 15 Ias de ácido nucleico heterólogas podem eficientemente mediar a sub- regulagem de genes-alvo em pestes coleópteras.

Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir pelo menos uma seqüência de nucleotídeo de ocor- rência não natural que pode ser transcrita em uma molécula de RNA de fila- mento simples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo através de hibridização intermolecular. Tais seqüências de dsRNA tipicamente realizam automontagem, e podem ser providas na fonte de nutrição de uma peste coleóptera para obter a inibição pós-transcripcional de um gene-alvo. Nes- sas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico da inven- ção pode compreender duas seqüências de nucleotídeo de ocorrência não natural diferentes, cada uma delas é especificamente complementar a um gene-alvo diferente em uma peste coleóptera. Quando tal molécula de ácido nucleico é provida como uma molécula de dsRNA a uma peste coleóptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes-alvo dife- rentes na peste coleóptera.

C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucleico

Uma variedade de seqüências nativas em pestes coleópteras pode ser usada como sequências-alvo para o projeto de moléculas de ácido nucleico da invenção, tais como moléculas de iRNAs e DNA codificando iR- NAs. Seleção de seqüências nativas não é, no entanto, um processo direto. Apenas um pequeno número de seqüências nativas na peste coleóptera se- 5 rão-alvos eficazes. Por exemplo, não pode ser previsto com certeza se uma seqüência nativa particular pode ser eficazmente sub-regulada pelas molé- culas de ácido nucleico da invenção ou se sub-regulagem de uma seqüência nativa particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da peste coleóptera. A maioria esmagadora de 10 seqüências de peste coleóptera nativas, tais como ESTs isoladas das mes- mas (por exemplo, conforme listado na Patente U.S. N0. 7.612.194), não tem um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou re- produção da peste coleóptera, tal como WCR ou NCR. Também não é pre- visivo quais das seqüências nativas que podem ter um efeito prejudicial so- 15 bre uma peste coleóptera são capazes de ser usadas em técnicas recombi- nantes para expressão de moléculas de ácido nucleico complementares a tais seqüências nativas em uma planta hospedeiro e provisão do efeito pre- judicial sobre a peste coleóptera quando da alimentação sem causar prejuí- zo à planta hospedeiro.

Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico da in-

venção (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem providas na planta hos- pedeiro de uma peste coleóptera) são selecionadas para se direcionarem a seqüências de cDNA-alvo que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais para sobrevivência de peste coleóptera, tais como seqüências de 25 aminoácido envolvidas em cursos bioquímicos metabólicos ou catabólicos, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, digestão, reconheci- mento de planta hospedeiro e similar. Conforme aqui descrito, ingestão de composições por um organismo-alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento do mesmo é especificamente complementar a pelo 30 menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas célu- las do organismo peste-alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do- alvo. Uma seqüência de nucleotídeo, ou DNA ou RNA, derivada de uma pes- te coleóptera pode ser usada para construir células de planta resistentes à infestação pelas pestes coleópteras. A planta hospedeiro da peste coleópte- ra (por exemplo, Z mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais das seqüências de nucleotídeo derivadas da peste 5 coleóptera conforme provido aqui. A seqüência de nucleotídeo transformada no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que se transformam em uma seqüência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, desta maneira disponibilizando o dsRNA se/quando a peste coleóptera formar uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. 10 Isto pode resultar na supressão de expressão de um ou mais genes nas cé- lulas da peste coleóptera, e por fim morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.

Desta maneira, em algumas modalidades, é direcionado um ge- ne que está essencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de uma peste coleóptera. Outros genes-alvo para uso na pre- sente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham pa- péis importantes em viabilidade, movimento, migração, crescimento, desen- volvimento, infectividade, estabelecimento de sítios de alimentação e repro- dução de peste coleóptera. Um gene-alvo pode então ser um gene regulador ou um fator de transcrição. Ainda, uma seqüência de nucleotídeo de peste coleóptera nativa para uso na presente invenção pode ser também derivada de um homólogo (por exemplo, um ortólogo) de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função é conhecida daqueles versados na téc- nica, e cuja seqüência de nucleotídeo é especificamente hibridizável com um gene-alvo no genoma da peste coleóptera-alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma seqüência de nucleotídeo conhecida através de hibridização são conhecidos daqueles versados na técnica.

Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para ob- tenção de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo para produção de uma molécula de iRNA (por exemplo, ds- RNA, siRNA, miRNA e hpRNA). Modalidade do tipo compreende:

(a) análise de um ou mais gene(s)-alvo quanto à sua expressão, função e fenótipo quando da supressão de gene mediada por dsRNA em uma peste coleóptera;

(b) experimentação de uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo toda ou uma porção de uma seqüência de nu-

cleotídeo ou um homólogo da mesma de uma peste coleóptera-alvo que mostra um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exem- plo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA;

(c) identificação de um clone de DNA que hibridiza especifica- mente com a sonda;

(d) isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) se-

quenciamento do fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende toda ou uma porção substancial da seqüência de RNA ou um homólogo da mesma; e (f) sintetizar quimicamente toda ou uma porção substancial de

uma seqüência de gene ou uma siRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.

Em modalidades adicionais, um método para obtenção de um fragmento de ácido nucleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo para produção de uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) inclui:

(a) síntese de primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotí- deo especificamente complementares a uma porção de uma seqüência de nucleotídeo nativa de uma peste coleóptera-alvo; e (b) amplificação de uma inserção de cDNA ou gDNA presente

em um vetor de clonagem usando os primeiro e segundo iniciadores de nu- cleotídeo da etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de uma molécula de siRNA ou miRNA ou hpRNA ou mnRNA ou dsRNA.

Os ácidos nucleicos da invenção podem ser isolados, amplifica-

dos ou produzidos através de várias abordagens. Por exemplo, uma molécu- la de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) pode ser obtida através de amplificação por PCR de uma seqüência de ácido nucleico-alvo (por exemplo, um gene-alvo ou uma seqüência de não codificação transcrita- alvo) derivada de uma biblioteca de gDNA ou cDNA ou suas porções. DNA ou RNA pode ser extraído de um organismo-alvo, e bibliotecas de ácido nu- 5 cleico podem ser preparadas a partir dele usando métodos conhecidos da- queles versados na técnica. Bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo-alvo podem ser usadas para amplificação ou sequencia- mento por PCR de genes-alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser usado como um molde para transcrição in vitro para gerar RNA de sentido e 10 antissentido com promotores mínimos. Alternativamente, moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas através de qualquer número de técnicas (vide, por exemplo, Ozaki e outros (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205- 5214; e Agrawal e outros (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo o uso de um sintetizador de DNA automático (por exemplo, um 15 P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) model 392 ou 394 DNA/RNA Syn- thesizer), usando químicas padrão, tal como química de fosforamidita. Vide, por exemplo, Beaucage e outros (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Paten- tes U.S. Nos. 4.980,460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066 e 4.973.679. Quí- micas alternativas resultando em grupos de estrutura principal não naturais, 20 tais como fosforotioato, fosforamidato, e similar, podem ser também empre- gadas.

Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente por um versado na técnica através de reações manuais ou automáticas ou in 25 vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico com- preendendo uma seqüência codificando a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA ou hpRNA. RNA pode também ser produzido através de síntese or- gânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser intro- duzido através de uma síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécu- 30 Ia de RNA pode ser sintetizada através de uma polimerase de RNA celular ou uma polimerase de RNA de bacteriófago (por exemplo, polimerase de RNA T3, polimerase de RNA T7 e polimerase de RNA SP6). Construtos de expressão úteis para a clonagem e expressão de seqüências de nucleotídeo são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Publicação PCT Internacional N0. WO 97/32016; e Patentes U.S. Nos. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693. Moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamen- te ou através de síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, moléculas de RNA podem ser puri- ficadas a partir de uma mistura através de extração com um solvente ou re- sina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou uma combinação das mesmas. Alternativamente, moléculas de RNA que são sintetizadas quimi- camente ou através de síntese enzimática in vitro podem ser usadas com nenhuma ou um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar perdas de- vido a processamento de amostra. As moléculas de RNA podem ser secas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução po- de conter tampões ou sais para promover anelamento e/ou estabilização de filamentos de duplex de molécula de dsRNA.

Em modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por um filamento de RNA autocomplementar simples ou a partir de dois filamen- tos de RNA complementares. Moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas ou in vivo ou in vitro. Uma polimerase de RNA endógena da célula pode me- 20 diar transcrição de um ou dois filamentos de RNA in vivo ou polimerase de RNA clonada pode ser usada para mediar transcrição in vivo ou in vitro. Ini- bição pós-transcripcional de um gene-alvo em uma peste coleóptera pode ser direcionada a hospedeiro através de transcrição específica em órgão, tecido ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor 25 específico de tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor induzível que é responsivo à infecção, estresse, temperatura e/ou indutores químicos); e/ou transcrição de enge- nharia em um estágio ou idade desenvolvimental do hospedeiro (por exem- plo, usando um promotor específico de estágio desenvolvimental). Filamen- 30 tos de RNA que formam uma molécula de dsRNA, seja transcrita in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadenilados, e podem ou não ser capazes de ser traduzidos em um polipeptídeo por um aparelho de tradução da célula. D. Vetores Recombinantes e Transformação de Célula Hospedeiro

Em algumas modalidades, a invenção também provê uma molé- cula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacte- riana, uma célula de levedura ou uma célula de planta), em que a molécula 5 de DNA compreende uma seqüência de nucleotídeo que, quando da expres- são para DNA e ingestão por uma peste coleóptera, obtém supressão de um gene-alvo em uma célula, tecido ou órgão da peste coleóptera. Desta manei- ra, algumas modalidades proveem uma molécula de ácido nucleico recombi- nante compreendendo uma seqüência de ácido nucleico capaz de ser ex- 10 pressa como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) em uma célula de planta para inibir expressão de gene-alvo em uma peste coleóptera. A fim de iniciar ou aumentar expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender uma ou mais seqüências reguladoras, seqüências reguladoras que podem ser operavelmente ligadas 15 à seqüência de ácido nucleico capaz de ser expressa como um iRNA. Méto- dos para expressar uma molécula de supressão de gene em plantas são conhecidos e podem ser usados para expressar uma seqüência de nucleotí- deo da presente invenção. Vide, por exemplo, Publicação PCT Internacional N0. W006/073727; e Publicação de Patente U.S. N0. 2006/0200878 A1).

Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombi-

nante da invenção pode compreender uma seqüência de ácido nucleico co- dificando um RNA que pode formar uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinantes podem codificar RNAs que podem formar moléculas de dsRNA capazes de inibição da expressão de gene(s)-alvo endógeno(s) 25 em uma peste coleóptera quando da ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode formar uma molécula de dsRNA que pode ser provida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura grampo de cabelo e haste e alça.

Nessas e em modalidades adicionais, um filamento de uma mo- lécula de dsRNA pode ser formado através da transcrição a partir de uma seqüência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga à seqüência de nucleotídeo da SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por e- xemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma se- 5 quência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nati- 10 va compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotí- deos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:7; o complemen- to de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma se- qüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea compreendendo 15 SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea 20 que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7.

Um filamento de uma molécula de dsRNA pode ser também formado através da transcrição a partir de uma seqüência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga a uma seqüência de nucleotídeo selecio- 25 nada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N0:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:3; o com- plemento de SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N°:103; o complemento de SEQ ID N°:103; SEQ ID 30 N0:104; o complemento de SEQ ID N0:104; SEQ ID N0:105; o complemento de SEQ ID N°:105; SEQ ID N°:106; o complemento de SEQ ID N°:106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NoS:1 -6 e 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos

19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por e- xemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6 e 103-106;;

o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica {por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; uma seqüência de não codificação nativa de um orga- nismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compre- endendo qualquer uma de SEQ ID N0Ve e 103-106; o complemento de uma 10 seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabro- tiea {por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6 e 15 103-106; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabro- tiea compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6 e 103-106; um frag- mento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma mo- 20 lécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6 e 103-106; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID Ν^ιΐ-β e 103-106;.

Em modalidades particulares, uma molécula de DNA recombi-

nante codificando uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos duas seqüências de nucleotídeo dentro de uma seqüência transcrita, em que as seqüências estão dispostas de maneira que a seqüência transcrita com- preende uma das seqüências de nucleotídeo em uma orientação de sentido 30 e outra das seqüências de nucleotídeo (compreendendo o complemento da primeira seqüência de nucleotídeo) está em uma orientação de antissentido, com relação a pelo menos um promotor, em que a seqüência de nucleotídeo de sentido e a seqüência de nucleotídeo de antissentido são ligadas ou co- nectadas por uma seqüência espaçadora de a partir de cerca de cinco (~5) a cerca de mil (~1000) nucleotídeos. A seqüência espaçadora pode formar uma alça entre as seqüências de sentido e antissentido na molécula de ds- 5 RNA. A seqüência de nucleotídeo de sentido ou a seqüência de nucleotídeo de antissentido pode ser substancialmente homóloga à seqüência de nucleo- tídeo de um gene-alvo (por exemplo, um gene compreendendo uma de SEQ ID NoS:1-7 e 103-106) ou fragmento da mesma. Em algumas modalidades, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar um RNA que 10 pode formar uma molécula de dsRNA sem uma seqüência espaçadora. Em modalidades, uma seqüência de codificação de sentido e uma seqüência de codificação de antissentido podem ser de comprimentos diferentes.

Seqüências identificadas como tendo um efeito prejudicial sobre pestes coleópteras ou um efeito protetor de planta com relação a pestes co- leópteras podem ser prontamente incorporadas a moléculas de dsRNA ex- pressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais seqüências podem ser expressas como um grampo de cabelo com estrutura haste e alça pegando um primeiro segmento correspondendo a uma se- quência de gene-alvo (por exemplo, qualquer uma das SEQ ID NoS:1-7 e 103-106 e seus fragmentos); ligação dessa seqüência a uma segunda região espaçadora de segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligação desta a um terceiro segmento, em que pelo menos uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Tal construto forma uma estrutura haste e alça através de empa- relhamento de base intramolecular do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de alça forma e compreende o segundo seg- mento. Vide, por exemplo, Publicações de Patente U.S. Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e Publicações PCT Internacionais Nos. W094/01550 e W098/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de filamento duplo tal como uma estrutura de haste alça (por exemplo, grampo de cabelo), com o que a produção de siRNA di- recionado a uma seqüência de peste coleóptera nativa é aumentada pela co- expressão de um fragmento do gene-alvo, por exemplo, em um cassete ex- pressável de planta adicional, que leva à produção de siRNA aumentada, ou reduz metilação para prevenir silenciamento de gene transcripcional do pro- motor de grampo de cabelo dsRNA.

As modalidades da invenção incluem introdução de uma molécu- la de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para obter níveis inibidores em peste coleóptera de ex- pressão de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recom- 10 binante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema de vetor pode ser um vetor ou plasmídeo único, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Ainda, um vetor pode ser um ve- tor de expressão. Seqüências de ácido nucleico da invenção podem, por 15 exemplo, ser adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para direcio- nar expressão de uma seqüência de codificação ligada ou outra seqüência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e seleção do vetor apropriado vai depender principalmente do tamanho do ácido nucleico 20 a ser inserido no vetor e da célula hospedeiro particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo da sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célu- la hospedeiro particular com a qual ele é compatível.

Para fornecer resistência à peste coleóptera a uma planta trans- 25 gênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma mo- lécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma seqüência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga e especificamente hibridizável para uma se- 30 quência de nucleotídeo transcrita correspondente dentro de uma peste cole- óptera que pode causar dano a espécies de planta hospedeiro. A peste co- leóptera pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeiro transgênica, por exemplo, através de ingestão das células ou fluidos da planta hospedeiro transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Desta maneira, expressão de um gene-alvo é suprimida pela molé- cula de iRNA dentro de pestes coieópteras que infestam a planta hospedeiro 5 transgênica. Em algumas modalidades, supressão de expressão do gene- alvo na peste coleóptera-alvo pode resultar na planta sendo resistente a ata- que pela peste.

A fim de permitir fornecimento de moléculas de iRNA a uma pes- te coleóptera em uma relação nutricional com uma célula de planta que foi 10 transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da inven- ção, expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula de plan- ta é requerida. Desta maneira, uma molécula de ácido nucleico recombinan- te pode compreender uma seqüência de nucleotídeo da invenção operavel- mente ligada a uma ou mais seqüências reguladoras, tal como uma sequên- 15 cia promotora heteróloga que funciona em uma célula hospedeiro, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico deve ser ampli- ficada, e uma célula de planta em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.

Promotores adequados para uso em moléculas de ácido nuclei- 20 co da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos são bem conhecidos na técnica. Exemplos não Iimitantes descrevendo tais promotores incluem Patentes U.S. Nos. 6.437.217 (promo- tor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor da actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 25 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores do milho constitutivos);

5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S do CaMV); 6.433.252 (promotor da oleosina L3 do milho); 6.429.357 (promotor 2 da ac- tina do arroz e íntron 2 da actina do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis por luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (promotores 30 induzíveis por patógeno); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e Publicação de Patente U.S. N0. 2009/757.089 (promotor da aldolase do cloroplasto do milho). Promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert e outros (1987) Proc. Nati Acad. Sei. USA 84(16):5745-9) e os promotores da octopina sintase (OCS) (que são carre- gados em plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tumefaciens);

os promotores do caulimovirus tal como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e outros (1987) Plant Moi Biol. 9:315-24); o promotor 35S de CaMV (Odell e outros (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico de fígwort (Walker e outros (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(19):6624-8); o promotor da sacarose sintase (Yang e Russell 10 (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-8); o promotor do complexo do gene R (Chandler e outros (1989) Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína de ligação a/b de clorofila; CaMV 35S (Patentes U.S. Nos.

5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196); FMV 35S (Patentes U.S. Nos. 6.051.753 e 5.378.619); um promotor PC1SV (Patente U.S.N0. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente U.S. N0. 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (No. de Acesso Gen Bank® V00087; Depicker e outros (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan e outros (1983) Nature 304:184-7).

Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico da in- venção compreendem um promotor específico de tecido, tal como um pro- motor específico de raiz. Promotores específicos de raiz direcionam expres- são de seqüências de codificação operavelmente ligadas exclusivamente ou preferivelmente em tecido de raiz. Exemplos de promotores específicos de raiz são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman e outros (1994) Science 263:221-3; e Hirel e outros (1992) Plant Moi Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, uma seqüência ou fragmento de nucleotídeo para controle de peste coleóptera de acordo com a invenção pode ser clonado entre dois promotores específicos de raiz orientados em direções transcripcionais o- postas com relação à seqüência ou fragmento de nucleotídeo, e que são operáveis em uma célula de planta transgênica e expressos nela para pro- duzir moléculas de RNA na célula de planta transgênica que subsequente- mente podem formar moléculas de dsRNA, conforme descrito supra. As mo- léculas de iRNA expressas em tecidos de planta podem ser ingeridas por uma peste coleóptera de maneira que supressão de expressão de gene-alvo é obtida.

Seqüências reguladoras adicionais que podem ser opcionalmen- 5 te operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse incluem 5'UTRs localizadas entre uma seqüência de promotor e uma se- qüência de codificação que funcionam como uma seqüência líder de tradu- ção. A seqüência líder de tradução está presente no mRNA integralmente processado e pode afetar o processamento do transcrito primário e/ou esta- 10 bilidade do RNA. Exemplos de seqüências líderes de tradução incluem líde- res de proteína de choque térmico do milho e da petúnia (Patente U.S. N0.

5.362.865), líderes da proteína de revestimento do vírus de planta, líderes de rubisco da planta e outros. Vide, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não Iimitantes de 5'UTRs incluem 15 GmHsp (Patente U.S. N0. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S.N0. 5.362.865); AtAntI; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (N0. de Acesso GenBank® V00087; e Bevan e outros (1983) Nature 304:184- 7).

Seqüências reguladoras adicionais que podem ser opcionaimen- te operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse também incluem seqüências não traduzidas 3', regiões de terminação de transcrição 3' ou regiões de poliadenilação. Esses são elementos genéticos localizados a jusante de uma seqüência de nucleotídeo, e incluem polinucle- otídeos que proveem sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar transcrição ou processamento de mRNA. O sinal de polia- denilação funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos de poli- adenilação à extremidade 3' do precursor de mRNA. A seqüência de polia- denilação pode ser derivada de uma variedade de genes de planta ou de genes de T-DNA. Um exemplo não Iimitante de uma região de terminação de transcrição 3' é a região 3' da nopalina sintase (nos 3'; Fraley e outros (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões não traduzidas 3' diferentes é provido em Ingelbrecht e outros, (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não Iimitantes de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi e outros (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (No. de Acesso no GenBank® N0. E01312).

Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação

de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada com- preendendo pelo menos uma das seqüências reguladoras descritas acima operavelmente ligada a uma ou mais seqüências de nucleotídeo da presente invenção. Quando expressas, a uma ou mais seqüências de nucleotídeo resultam em uma ou mais molécula(s) de RNA compreendendo uma se- qüência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma peste coleóptera. Desta maneira, a sequência(s) de nucleotídeo pode compreender um segmento codificando toda ou parte de uma seqüência de ribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA de peste coleóptera-alvo, e pode compreender repetições invertidas de todo ou uma parte de um transcrito de peste coleóptera-alvo. Um vetor de transformação de planta pode conter seqüências especifica- mente complementares a mais de uma sequência-alvo, desta maneira per- mitindo produção de mais de um dsRNA para inibição de expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies de pes- tes coleópteras-alvo. Segmentos de seqüência de nucleotídeo especifica- mente complementar a seqüências de nucleotídeo presentes em genes dife- rentes podem ser combinados em uma molécula de ácido nucleico compósi- ta única para expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por uma seqüência espaçadora.

Em algumas modalidades, um plasmídeo da presente invenção já contendo pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção seqüencial de sequência(s) de nucleotídeo adi- cional no mesmo plasmídeo, em que a sequência(s) de nucleotídeo adicional 30 é operavelmente ligada aos mesmos elementos reguladores que a pelo me- nos uma sequência(s) de nucleotídeo original. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser projetada para a inibição de ge- nes-alvo múltiplos. Em algumas modalidades, os genes múltiplos a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de peste coleóptera, o que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modali- dades, os genes podem ser derivados de pestes coleópteras diferentes, o 5 que pode ampliar a faixa de pestes coleópteras contra as quais o(s) agen- te(s) é/são eficazes. Quando genes múltiplos são direcionados para supres- são ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado.

Uma molécula ou vetor de ácido nucleico recombinante da pre- 10 sente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável a uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Marcadores selecionáveis podem também ser usados para selecio- nar plantas ou células de planta que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a 15 biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc) ou resistência a herbicida (por exem- plo, glifosato, etc). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado para uso de canamicina, G418, etc; um gene Marque codifi- 20 ca resistência a bialaphos; um gene da EPSP sintase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene da nitrilase que confere resistência à bromo- xinila; um gene da acetolactato sintase (ALS) mutante que confere resistên- cia à imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene de DHFR resistente a meto- trexato. Marcadores selecionáveis múltiplos estão disponíveis, os quais con- 25 ferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higro- micina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, es- pectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina e similar. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.

Uma molécula de ácido nucleico ou vetor recombinante da pre-

sente invenção pode também incluir um marcador que pode ser avaliado. Marcadores que podem ser avaliados podem ser usados para monitorar ex- pressão. Marcadores que podem ser avaliados exemplares incluem um gene da β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vá- rios substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson e outros (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene de Iocus-R, que codifica um pro- 5 duto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta e outros (1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." Em 18th Stadler Genetics Svmposium. P. Gustafeon e R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263- 82); um gene da β-lactamase (Sutcliffe e outros (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. 10 USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefa- Iosporina cromogênica); um gene da Iuciferase (Ow e outros (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski e outros (1983) Gene 46(2- 15 3):247-55); um gene da amilase (Ikatu e outros (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene da tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinina que por sua vez condensa em melanina

(Katz e outros (1983) J. Gen. MicrobioL 129:2703-14); e uma a- galactosidase.

Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico recom-

binantes, conforme descrito, supra, podem ser usadas em métodos para cri- ação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que exibem susceptibilidade reduzida a pestes coleópteras. Vetores de transformação de planta podem 25 ser preparados, por exemplo, através da inserção de moléculas de ácido nucleico codificando moléculas de iRNA em vetores de transformação de planta e introdução desses em plantas.

Métodos adequados para transformação de células hospedeiro incluem qualquer método através do qual DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como através de transformação de protoplastos (vide, por exem- plo, Patente U.S.N0. 5.508.184), através de absorção de DNA mediada por dissecação/inibição (vide, por exemplo, Potrykus e outros (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), através de eletroporação (vide, por exemplo, Patente U.S. N0. 5.384.253), através de agitação com fibras de carbida de silício (vi- de, por exemplo, Patentes U.S. NoS. 5.302.523 e 5.464.765), através de transformação mediada por Agrobacterium (vide, por exemplo, Patentes U.S.

5 Nos. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840 e 6.384.301) e através de aceleração de partículas revestidas com DNA (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.015.580; 5.550,318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861; e

6.403.865), etc. Técnicas que são particularmente úteis para transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 7.060.876 e 10 5.591.616; e Publicação PCT Internacional W095/06722. Através da aplica- ção de técnicas tais como essas, as células de virtualmente qualquer espé- cie podem ser estavelmente transformadas. Em algumas modalidades, DNA transformante é integrado ao genoma da célula hospedeiro. No caso de es- pécies multicelulares, células transgênicas podem ser regeneradas em um 15 organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser usada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais seqüências de ácido nucleico codificando uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.

O método mais amplamente utilizado para introdução de um ve- tor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacteriu, A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo pato- gênicas de planta que transformam geneticamente células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, car- regam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plas- mídeos Ti (indução de tumor) contêm um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é cercada por repetições terminais. Em vetores binários modificados, os genes de indução de tumor foram deletados, e as funções da região Vir são utilizadas para transferir DNA estranho cercado pelas se- qüências de borda de T-DNA. A região T pode também conter um marcador selecionável para recuperação eficiente de células e plantas transgênicas, e um sítio de clonagem múltiplo para inserção de seqüências para transferên- cia tal como um ácido nucleico de codificação de dsRNA.

Desta maneira, em algumas modalidades, um vetor de transfor- mação de planta é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Vide, por exemplo, Patentes U.S. NoS. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e 5.501.967; e Patente EuropeiaN0. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por e- xemplo e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella e outros (1983) Nature 303:209-13; Bevan e outros (1983) Nature 304:184-7; Klee e outros (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia N0. EP 0 120 516 e aqueles derivados de qualquer um dos acima. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plan- tas naturalmente podem ser modificadas para mediar transferência de gene para várias plantas diferentes. Essas bactérias simbióticas associadas à planta podem ser tornadas competentes para transferência de gene através da aquisição de ambos um plasmídeo Ti desarmado e um vetor binário ade- quado.

Após provisão de DNA exógeno a células recipientes, células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regene- 20 ração de planta. A fim de aperfeiçoar a habilidade em identificar células transformadas, uma pessoa pode desejar empregar um gene marcador se- lecionável ou que pode ser avaliado, conforme anteriormente descrito, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso em que um marcador selecionável é usado, células transformadas são identificadas 25 dentro da população de célula potencialmente transformada através da ex- posição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso em que um marcador que pode ser avaliado é usado, as células podem ser avaliadas quanto à característica de gene marcador desejada.

As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de avaliação, podem ser culturadas em meio que apoia regeneração de plantas. Em algumas mo- dalidades, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por e- xemplo, meios MS e N6) pode ser modificado através da inclusão de subs- tâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. Tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar esforços de regeneração de plan- 5 ta, ou seguindo rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 se- manas), então transferido para meios condutores para formação de ramo. As culturas são transferidas periodicamente até que formação de ramo suficien- te tenha ocorrido. Uma vez formados os ramos, eles são transferidos para 10 meios condutores de formação de raiz. Uma vez raízes suficientes sendo formadas, as plantas podem ser transferidas para solo para crescimento adi- cional e maturação.

Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma seqüência de DNA codificando uma ou mais 15 seqüências de iRNA que inibem expressão de gene-alvo em uma peste co- leóptera) na regeneração de plantas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos molecula- res, tais como Southern e northem blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tal como detecção da presença de um produ- 20 to de proteína, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA e/ou western blots) ou através de função enzimática; ensaios de parte de planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e análise do fenótipo da planta regenera- da inteira.

Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, atra- 25 vés de amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores de oligonu- cleotídeo específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. Genotipificação por PCR é compreendida incluir, mas não ser limitada a, amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA genômico derivado de tecido de calo de planta hospedeiro isolado previsto conter uma 30 molécula de ácido nucleico de interesse integrada ao genoma, seguido por clonagem e análise de seqüência padrão de produtos de amplificação por PCR. Métodos de genotipificação por PCR foram bem descritos (por exem- pio, Rios, G. e outros, (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados a DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas de célula.

Uma planta transgênica formada usando métodos de transfor- mação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma seqüência de DNA recombinante única inserida em um cromossomo. A seqüência de DNA recombinante única é referida como um "evento transgênico" ou "even- to de integração". Tais plantas transgênicas são heterozigotas para a se- qüência exógena inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgêni- ca homozigota com relação a um transgene pode ser obtida através de (au- to) acasalamento sexual de uma planta transgênica segregante independen- te que contém uma seqüência de gene exógena única com ela mesma, por exemplo, uma planta T0, para produzir semente Ti. Um quarto da semente Ti produzida será homozigoto com relação ao transgene. Semente Ti germi- nante resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosida- de, tipicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmi- ca que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).

Em modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula de planta que têm um efeito inibidor de peste coleóptera. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de se- qüências de ácido nucleico múltiplas introduzidas em eventos de transfor- mação diferentes ou a partir de uma seqüência de ácido nucleico única in- troduzida em um evento de transformação único. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de um promotor único. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de promotores múltiplos. Moléculas de siR- NA únicas podem ser expressas, as quais compreendem seqüências de áci- do nucleico múltiplas que são cada uma homólogas para locais diferentes dentro de uma ou mais pestes coleópteras (por exemplo, os Ioci definidos pela SEQ ID N°:7 e uma ou mais de SEQ ID N0M-6 e 103-106), ambos em populações diferentes da mesma espécie de peste coleóptera ou em espé- cies diferentes de pestes coleópteras.

Em adição à transformação direta de uma planta com uma mo- lécula de ácido nucleico recombinante, plantas transgênicas podem ser pre- 5 paradas cruzando uma primeira planta tendo pelo menos um evento trans- gênico com uma segunda planta sem tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido recombinante compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linha- gem de planta que é condescendente à transformação para produzir uma 10 planta transgênica, planta transgênica que pode ser cruzada com uma se- gunda linhagem de planta para introgredir a seqüência de nucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem de planta.

A invenção também inclui produtos de base contendo uma ou mais das seqüências da presente invenção. Modalidades particulares inclu- 15 em produtos de base produzidos a partir de uma planta ou semente recom- binante contendo uma ou mais das seqüências de nucleotídeo da presente invenção. Um produto de base contendo uma ou mais das seqüências da presente invenção pretende incluir, mas não está limitado a, farinhas, óleos, grãos ou sementes moídos ou inteiros de uma planta ou qualquer produto 20 alimentício compreendendo qualquer farinha, óleo ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das se- qüências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das seqüências da presente invenção em uma ou mais base ou produtos de base compre- endidos aqui é de facto evidência que a base ou produto de base é produzi- 25 do a partir de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das seqüências de nucleotídeo da presente invenção para o propósito de controle de doença de planta usando métodos de supressão de gene medi- ada por dsRNA.

Em alguns aspectos, sementes e produtos de base produzidos pelas plantas transgênicas derivadas de células de planta transformadas são incluídos, em que as sementes ou produtos de base compreendem uma quantidade detectável de uma seqüência de ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos de base podem ser produzidos, por e- xemplo, através da obtenção de plantas transgênicas e preparação de ali- mento ou ração a partir das mesmas. Produtos de base compreendendo uma ou mais das seqüências de ácido nucleico da invenção incluem, por 5 exemplo e sem limitação: farinhas, óleos, grãos ou sementes moídos ou in- teiros de uma planta e qualquer produto alimentício compreendendo qual- quer farinha, óleo ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente re- combinante compreendendo uma ou mais das seqüências de ácido nucleico da invenção. A detecção de uma ou mais das seqüências da invenção em 10 uma ou mais base ou produtos de base é de facto evidência de que a base ou produto de base é produzido a partir de uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para o propósito de controle de pestes coleópteras.

Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica 15 compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção pode também compreende pelo menos outro evento transgênico em seu genoma, incluin- do, sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA se direcionando a um Iocus em uma peste coleóptera ou- tros que não os definidos pelas SEQ ID Nos. 1-7 e 103-106 (por exemplo e 20 sem limitação,

Cafl-180 (Pedido de Patente Internacional PCTN0. PCT/US2011/068062 (depositado em 30 de dezembro de 2011)), VatpaseC (Pedido de Patente Internacional PCT N0. PCT/US2011/068144 (depositado em 30 de dezembro de 2011)), VatpaseH (Pedido de Patente Internacional 25 PCT N0. PCT/US2011/068162 (depositado em 30 de dezembro de 2011)) e Rhol (Pedido de Patente Internacional PCT N0. PCT/US2011/068188 (de- positado em 30 de dezembro de 2011)); um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA se direcionando a um gene em um organismo outro que não uma peste coleóptera (por exemplo, um nematoide 30 parasítico de planta); um gene codificando uma proteína inseticida (por e- xemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, tal como, por e- xemplo, Cyr34Ab1 (Pat. U.S. Nos. 6.127.180, 6.624.145 e 6.340.593), Cry35Ab1 (Pat. U.S. Nos. 6.083.499, 6.548.291 e 6.340,593), uma combina- ção "Cry34/35Ab1" em um evento único {por exemplo, evento de milho DAS- 59122-7; Pat. U.S. N0. 7.323,.56), Cry3A (por exemplo, Pat. U.S. N0. 7.230.167), Cry3B (por exemplo, Pedido de Patente Internacional PCTN0.

PCT/US1999/018883), Cry6A (por exemplo, Pat. U.S.N0. 6.831.062) e suas combinações (por exemplo, Pedidos de Patente Internacionais PCT Nos. PCT/US11/033618 (depositado em 15 de abril 2011), PCT/US11/033618 (depositado em 22 de abril de 2011) e PCT/US11/033617 (depositado em 22 de abril de 2011)); um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene 10 provendo tolerância a glifosato, glufosinato, dicamba ou 2,4-D (por exemplo, Patente U.S.N0. 7.838.733)); e um gene contribuindo para um fenótipo dese- jado na planta transgênica, tal como rendimento aumentado, metabolismo de ácido graxo alterado ou restauração de esterilidade masculina citoplásmica). Em modalidades particulares, seqüências codificando moléculas de iRNA da 15 invenção podem ser combinadas com outras características de controle de inseto e doença em uma planta para obter características desejadas para controle aumentado de doença e dano por inseto em planta. Combinação de características de controle de inseto que empregam modos-de-ação distintos pode prover plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior com 20 relação a plantas carregando uma característica de controle única, por e- xemplo, por causa da probabilidade reduzida que resistência à(s) caracterís- tica(s) vá se desenvolver no campo.

V. Supressão de Gene Alvo em uma Peste Coleóptera

A. Visão Geral

Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molé-

cula de ácido nucleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida a uma peste coleóptera, em que a molécula de ácido nucleico leva a silenciamento de gene mediado por RNAi na peste coleóptera. Em modali- dades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, 30 miRNA e hpRNA) pode ser provida ao hospedeiro de coleóptera. Em algu- mas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida a uma peste coleóptera através do con- tado da molécula de ácido nucleico com a peste coleóptera. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida em um substrato de alimentação da peste coleóptera, por exemplo, uma composição nutricional. Nessas e em 5 modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes coleópteras pode ser provida através da ingestão de um material de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela peste coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente em material de planta através da expressão de uma seqüência de 10 ácido nucleico recombinante introduzida no material de planta, por exemplo, através da transformação de uma célula de planta com um vetor compreen- dendo a seqüência de ácido nucleico recombinante e regeneração de um material de planta ou planta inteira a partir da célula de planta transformada.

B. Supressão de Gene Alvo mediada por RNAi Em modalidades, a invenção provê moléculas de iRNA (por e-

xemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que podem ser projetadas para se direcionarem a seqüências de nucleotídeo nativas essenciais-alvo (por e- xemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma peste coleóptera (por exemplo, WCR ou NCR), por exemplo, através do projeto de uma molécula 20 de iRNA que compreende pelo menos um filamento compreendendo uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente complementar à sequên- cia-alvo. A seqüência de uma molécula de iRNA então projetada pode ser idêntica à sequência-alvo ou pode incorporar incompatibilidades que não previnem hibridização específica entre a molécula de iRNA e sua sequência- 25 alvo.

As moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em méto- dos para supressão de gene em uma peste coleóptera, desta maneira redu- zindo o nível ou incidência de dano causado pela peste em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula 30 de iRNA). Conforme aqui usado, o termo "supressão de gene" refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para redução dos níveis de uma proteína produzida como um resultado de transcrição de gene para mRNA e subsequente tradução do mRNA, incluindo a redução de expressão de pro- teína de um gene ou uma seqüência de codificação incluindo inibição pós- transcripcional de expressão e supressão transcripcional. Inibição pós- transcripcional é mediada por homologia específica entre todo ou uma parte 5 de um mRNA transcrito a partir de um gene direcionado para supressão e a molécula de iRNA correspondente usada para supressão. Ainda, inibição pós-transcripcional refere-se à redução substancial e mensurável da quanti- dade de mRNA disponível na célula para ligação por ribossomos.

Em modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula 10 de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de compri- mento). A molécula de siRNA de filamento duplo gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em duas siRNAs de filamento simples; o "filamento passageiro" e o "filamento guia". O filamento 15 passageiro pode ser degradado, e o filamento guia pode ser incorporado a RISC. Inibição pós-transcripcional ocorre através de hibridização específica do filamento guia com uma seqüência especificamente complementar de uma molécula de mRNA, e subsequente clivagem pela enzima, Argonauta (componente catalítico do complexo RISC).

Em modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de

iRNA pode ser usada. Aqueles versados na técnica vão compreender que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis durante preparação e durante a etapa de provisão da molécula de iRNA a uma célula do que são moléculas de RNA de filamento simples, e são tipicamente também mais 25 estáveis em uma célula. Desta maneira, embora moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, possam ser igualmente eficazes em algumas modali- dades, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida devido à sua estabilida- de.

Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico é provida, a qual compreende uma seqüência de nucleotídeo, seqüência de nucleotídeo que pode ser expressa in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por uma seqüência de nucleotídeo dentro do genoma de uma peste coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura haste-alça. Após uma peste coleóptera contatar a molécula de iR- 5 NA transcrita in vitro, inibição pós-transcripcional de um gene-alvo na peste coleóptera (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.

Em algumas modalidades da invenção, expressão de uma molé- cula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contí- guos de uma seqüência de nucleotídeo é usada em um método para inibição 10 pós-transcripcional de um gene-alvo em uma peste coleóptera, em que a seqüência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nu- cleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; uma seqüência de 15 codificação nativa de um organismo Diabrotica {por exemplo, WCR) com- preendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; uma se- qüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é trans- crita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; o com- 20 plemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Di- abrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea {por e- xemplo, WCR) compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de um frag- 25 mento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codi- ficação nativa de um organismo Diabrotiea compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; e o complemento de 30 um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7. Em certas mo- dalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 5 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) com qualquer uma das acima pode ser usada. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de áci- do nucleico pode ser expressa, a qual hibridiza especificamente para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste coleóp- 10 tera.

Em algumas modalidades, expressão de pelo menos uma molé- cula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contí- guos de uma seqüência de nucleotídeo pode ser usada em um método para inibição pós-transcripcional de um gene-alvo em uma peste coleóptera, em 15 que a seqüência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:1; o complemento de SEQ ID N°:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID N°:6; o complemento de SEQ ID N°:6; SEQ ID N0:103; o com- 20 plemento de SEQ ID N°:103; SEQ ID N°:104; o complemento de SEQ ID N0:104; SEQ ID N°:105; o complemento de SEQ ID N°:105; SEQ ID N°:106; o complemento de SEQ ID N°:106; um fragmento de pelo menos 19 nucleo- tídèos contíguos de qualquer uma de SEQ ID Ν^Ι-β e 103-106; o comple- mento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qual- 25 quer uma de SEQ ID NoS: 1-6 e 103-106; uma seqüência de codificação nati- va de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qual- quer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) com- preendendo qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; uma seqüência de 30 não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; o complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa com- preendendo qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo 5 qualquer uma de SEQ ID Nos: 1-6 e 103-106; o complemento de um frag- mento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codi- ficação nativa de um organismo Diabrotiea compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS: 1-6 e 103-106; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo 10 Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS: 1 -6 e 103-106; e o complemento de um frag- mento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma mo- lécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6 e 15 103-106;. Em certas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nu- cleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, 20 cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) com qualquer uma das acima pode ser usada. Nessas e em modalidades adicio- nais, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa, a qual hibridiza especificamente para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste coleóptera. Em exemplos particulares, tal molécula de 25 ácido nucleico pode compreender uma seqüência de nucleotídeo seleciona- da do grupo consistindo em SEQ ID Ν°®:99-102 e 107.

É uma característica importante de algumas modalidades da in- venção que o sistema de inibição pós-transcripcional de RNAi seja capaz de tolerar variações de seqüência dentre os genes-alvo que poderiam ser espe- 30 radas devido à mutação genética, polimorfismo de linhagem ou divergência evolucionária. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não precisar ser absolutamente homóloga ou a um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado de um gene-alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável ou para um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado do gene-alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não 5 precisar ser de comprimento integral, com relação ou a um produto de trans- crição primário ou um mRNA integralmente processado do gene-alvo.

Inibição de um gene-alvo usando a tecnologia de iRNA da pre- sente invenção é específica de seqüência, isto é, seqüências de nucleotídeo substancialmente homólogas à(s) molécula(s) de iRNA são direcionadas 10 para inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo uma seqüência de nucleotídeo idêntica a uma porção de uma seqüência de gene-alvo pode ser usada para inibição. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de RNA compreendendo uma se- qüência de nucleotídeo com uma ou mais inserção, deleção e/ou mutações 15 por ponto com relação a uma seqüência de gene-alvo pode ser usada. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene- alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos de a partir de cerca de 80%, pelo menos de a partir de cerca de 81%, pelo menos de a partir de cerca de 82%, pelo menos de a partir de cerca de 83%, pelo menos de a 20 partir de cerca de 84%, pelo menos de a partir de cerca de 85%, pelo menos de a partir de cerca de 86%, pelo menos de a partir de cerca de 87%, pelo menos de a partir de cerca de 88%, pelo menos de a partir de cerca de 89%, pelo menos de a partir de cerca de 90%, pelo menos de a partir de cerca de 91%, pelo menos de a partir de cerca de 92%, pelo menos de a partir de 25 cerca de 93%, pelo menos de a partir de cerca de 94%, pelo menos de a partir de cerca de 95%, pelo menos de a partir de cerca de 96%, pelo menos de a partir de cerca de 97%, pelo menos de a partir de cerca de 98%, pelo menos de a partir de cerca de 99%, pelo menos de a partir de cerca de 100% e 100% de identidade de seqüência. Alternativamente, a região de 30 duplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma porção de um transcrito de gene-alvo. Em moléculas especifica- mente hibridizáveis, uma seqüência de comprimento menos do que integral exibindo uma homologia maior compensa uma seqüência menos homóloga, mais longa. O comprimento da seqüência de nucleotídeo de uma região du- plex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de um trans- crito de gene-alvo pode ser de pelo menos cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 5 400, 500 ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, uma seqüência maior do que 20-100 nucleotídeos pode ser usada. Em mo- dalidades particulares, uma seqüência maior do que cerca de 200-300 nu- cleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma seqüência maior do que cerca de 500-1000 nucleotídeos pode ser usada, dependendo 10 do tamanho do gene-alvo.

Em certas modalidades, expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da peste coleóp- tera, de maneira que uma inibição significante acontece. Inibição significante 15 refere-se à inibição em um limiar que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, parada de crescimento, alimentação, desenvolvimento, mortalida- de, etc) ou uma diminuição detectável em RNA e/ou produto de gene cor- respondendo ao gene-alvo sendo inibido. Embora em certas modalidades da invenção inibição ocorra em substancialmente todas as células da peste co- 20 leóptera, em outras modalidades inibição ocorre apenas em um subconjunto de células expressando o gene-alvo.

Em algumas modalidades, supressão transcripcional é mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA exibindo identida- de de seqüência substancial com uma seqüência de DNA de promotor ou o 25 seu complemento para realizar o que é referido como "supressão trans de promotor". Supressão de gene pode ser eficaz contra genes-alvo em uma peste coleóptera que pode ingerir ou contatar tais moléculas de dsRNA, por exemplo, através da ingestão ou contato do material de planta contendo as moléculas de dsRNA. Moléculas de dsRNA para uso em supressão trans de 30 promotor podem ser especificamente projetadas para inibir ou suprimir a ex- pressão de uma ou mais seqüências homólogas ou complementares nas células da peste coleóptera. Supressão de gene pós-transcripcional por RNA orientado de antissentido ou sentido para regular expressão de gene em cé- lulas de planta é revelada nas Patentes U.S. Nos: 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184; e 5.231.020,

C. Expressão de Moléculas de iRNA Providas a uma Peste Coleóptera Expressão de moléculas de iRNA para inibição de gene mediada

por RNAi em uma peste coleóptera pode ser realizada em qualquer um de muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem ser então providas a uma peste coleóptera, por exemplo, através do contato das molé- culas de iRNA com a peste, ou fazendo com que a peste ingira ou de outra 10 maneira internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades da invenção incluem plantas hospedeiro transformadas de uma peste coleóptera, células de planta transformadas e progênie de plantas transformadas. As células de planta transformadas e as plantas transformadas podem ser engenheiradas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o con- 15 trole de um promotor heterólogo, para prover um efeito protetor contra peste. Desta maneira, quando uma planta ou célula de planta transgênica é consu- mida por uma peste coleóptera durante alimentação, a peste pode ingerir mo- léculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. As seqüên- cias de nucleotídeo da presente invenção podem ser também introduzidas em 20 uma ampla variedade de hospedeiros de microorganismos procarióticos e eu- carióticos para produzir moléculas de iRNA. O termo "microorganismo" inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos.

Modulação de expressão de gene pode incluir supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para su- 25 pressão de expressão de gene em uma peste coleóptera compreende provi- são no tecido do hospedeiro da peste de uma quantidade supressiva de ge- ne de pelo menos uma molécula de dsRNA formada seguindo transcrição de uma seqüência de nucleotídeo conforme aqui descrito, cujo pelo menos um segmento é complementar a uma seqüência de mRNA dentro das células da 30 peste coleóptera. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA ou hpRNA, ingerida por uma peste coleóptera de acordo com a invenção pode ser de pelo menos a partir de cerca de 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% idênti- ca a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de ácido nu- cleico compreendendo uma seqüência de nucleotídeo selecionada do grupo 5 consistindo em SEQ ID NoS: 1 -7 e 103-106. Moléculas de ácido nucleico iso- ladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitado a, seqüên- cias de nucleotídeo de ocorrência não natural e construtos de DNA recombi- nante para provisão de moléculas de dsRNA da presente invenção são en- tão providas, as quais suprimem ou inibem a expressão de uma seqüência 10 de codificação endógena ou uma seqüência de codificação-alvo na peste coleóptera quando introduzidas na mesma.

Modalidades particulares proveem um sistema de aplicação para aplicação de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcripcional de um ou mais gene(s)-alvo em uma peste de planta coleóptera e controle de uma 15 população de uma peste de planta coleóptera. Em algumas modalidades, o sistema de aplicação compreende ingestão de uma célula de planta trans- gênica hospedeiro ou teores da célula hospedeiro compreendendo molécu- las de RNA transcritas na célula hospedeiro. Nessas e em modalidades adi- cionais, uma célula de planta transgênica ou planta transgênica é criada, a 20 qual contém um construto de DNA recombinante provendo uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. Células de planta transgênicas e plantas transgênicas compreendendo seqüências de ácido nucleico codificando uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são bem conhecidas na 25 técnica) para construir um vetor de transformação de planta compreendendo uma seqüência nucleotídeo codificando uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula de planta ou planta; e para gerar a célula de planta transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.

Para fornecer resistência à peste coleóptera a uma planta trans-

gênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcri- ta em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molé- cuia de siRNA, uma molécula de miRNA ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma mo- lécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Tal molécula de dsRNA pode 5 ser compreendida em parte de uma seqüência de nucleotídeo que é idêntica a uma seqüência de nucleotídeo correspondente transcrita a partir de uma seqüência de DNA dentro de uma peste coleóptera de um tipo que pode in- festar a planta hospedeiro. Expressão de um gene-alvo dentro da peste-alvo é suprimida pela molécula de dsRNA ingerida ou de outra maneira contata- 10 da, e a supressão de expressão de um gene-alvo na peste coleóptera resul- ta em, por exemplo, parada da alimentação pela peste coleóptera, com um último resultando sendo, por exemplo, que a planta transgênica é protegida de dano adicional pela peste coleóptera. Os efeitos moduladores de molécu- las de dsRNA foram mostrados ser aplicáveis a uma variedade de genes 15 expressos em pestes incluindo, por exemplo, genes endógenos responsá- veis por metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes con- troladores; fatores de transcrição; genes relacionados à muda; e outros ge- nes que codificam polipeptídeos envolvidos em metabolismo celular ou cres- cimento e desenvolvimento normais.

Para transcrição a partir de um transgene in vivo ou um constru-

to de expressão, uma região reguladora (por exemplo, promotora, aumenta- dora, silenciadora ou de sinal de poliadenilação) pode ser usada em algu- mas modalidades para transcrever o filamento (ou filamentos) de RNA. Des- ta maneira, em algumas modalidades, conforme mostrado, supra, uma se- 25 quência de nucleotídeo para uso na produção de moléculas de iRNA pode ser operavelmente ligada a uma ou mais seqüências promotoras funcionais em uma célula hospedeiro de planta. O promotor pode ser um promotor en- dógeno, normalmente residente no genoma do hospedeiro. A seqüência de nucleotídeo da presente invenção, sob o controle de uma seqüência de pro- 30 motor operavelmente ligada, pode ser ainda flanqueada por seqüências adi- cionais que vantajosamente afetam sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Tais seqüências podem estar localizadas a montan- te do promotor operavelmente ligado, a jusante da extremidade 3' do cons- truto de expressão e podem ocorrer ambos a montante do promotor e a ju- sante da extremidade 3' do construto de expressão.

Algumas modalidades proveem métodos para redução do dano a uma planta hospedeiro (por exemplo, uma planta de milho) causado por uma peste coleóptera que se alimenta da planta, em que o método compre- ende provisão na planta hospedeiro de uma célula de planta transformada expressando pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a(s) molécula(s) de ácido nucleico funciona(m) quando sendo absorvi- da(s) pela peste coleóptera para inibir a expressão de uma sequência-aivo dentro da peste coleóptera, inibição da expressão que resulta em mortalida- de, crescimento reduzido e/ou reprodução reduzida da peste coleóptera, desta maneira reduzindo o dano à planta hospedeiro causado pela peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de uma seqüência de nucleotídeo que é es- pecificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consiste(m) em uma seqüência de nucleotídeo que é es- pecificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera.

Em algumas modalidades, um método para aumento do rendi- mento de uma cultura de milho é provido, em que o método compreende 25 introdução em uma planta de milho de pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivo da planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a seqüência de ácido nucleico, em que expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a seqüência de ácido nucleico inibe dano pela e/ou crescimento da peste coleóptera, desta 30 maneira reduzindo ou eliminando uma perda de rendimento devido à infes- tação por peste coleóptera. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molécu- la(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que compreen- dem cada uma mais de uma seqüência de nucleotídeo que é especificamen- te hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido 5 nucleico consiste(m) em uma seqüência de nucleotídeo que é especifica- mente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste coleóptera.

Em algumas modalidades, um método para modulação da ex- pressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera é provido, o método compreendendo: transformação de uma célula de planta com um vetor com- preendendo uma seqüência de ácido nucleico codificando pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a seqüência de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor e uma seqüência de terminação de transcrição; cultura da célula de planta transformada sob condições suficien- tes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta inclu- indo uma pluralidade de células de planta transformadas; seleção de células de planta transformadas que integraram a molécula de ácido nucleico em seus genomas; avaliação das células de planta transformadas quanto à ex- pressão de uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nuclei- co integrada; seleção de uma célula de planta transgênica que expressa a molécula de iRNA; e alimentação da célula de planta transgênica seleciona- da à peste coleóptera. Plantas podem também ser regeneradas a partir de células de planta transformadas que expressam uma molécula de iRNA codi- ficada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreende(m) moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico ex- pressa em uma célula de peste coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consiste(m) em uma seqüência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico ex- pressa em uma célula de peste coleóptera. Moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro das sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), ou como um produto de expressão a partir de um gene recombinante incorporado a um genoma das células de planta, ou incorporadas a um revestimento ou trata- 5 mento de semente que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula de planta compreendendo um gene recombinante é considerada ser um e- vento transgênico. Também incluídos nas modalidades da invenção estão sistemas de aplicação para a aplicação de moléculas de iRNA a pestes co- leópteras. Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser dire- 10 tamente introduzidas nas células de uma peste coleóptera. Métodos para introdução podem incluir mistura direta de iRNA com tecido de planta de um hospedeiro para a peste coleóptera, bem como aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção a tecido de planta hospe- deiro. Por exemplo, moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre a su- 15 perfície de uma planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microorganismo, e o microorganismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou caule através de um meio físico tal como injeção. Conforme discutido, supra, uma planta transgênica pode também ser geneticamente engenheirada para expressar 20 pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para ma- tar as pestes coleópteras conhecidas infestar a planta. Moléculas de iRNA produzidas através de síntese química ou enzimática podem ser também formuladas de uma maneira consistente com práticas agriculturais comuns, e usadas como produtos para pulverização para controle de dano à planta 25 por uma peste coleóptera. As formulações podem incluir os agentes de pe- gajosidade e umectantes apropriados requeridos para cobertura de folhagem eficiente, bem como protetores de UV para proteger moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) de dano por UV. Tais aditivos são geralmen- te usados na indústria bioinseticida e são bem conhecidos daqueles versa- 30 dos na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplica- ções de inseticida de pulverização (biologicamente baseado ou outra manei- ra) para aumentar a proteção da planta contra pestes coleópteras. Todas as referências, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, mencionadas aqui são incorporadas a título de referência até o ponto que elas não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos da pre- sente invenção, e são então incorporadas até o mesmo ponto que se cada 5 referência fosse individualmente e especificamente indicada ser incorporada a título de referência e fosse mostrada em sua totalidade aqui. As referên- cias discutidas aqui são providas apenas quanto à sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser considerado como uma admissão que os inventores não estão autorizados a antedatar tal reve- 10 lação em virtude da invenção anterior.

Os EXEMPLOS que seguem são providos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Esses EXEMPLOS não devem ser considerados limitar a revelação às características ou aspectos particula- res descritos.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: Materiais e Métodos Preparação e Bioensaios de Amostra

Várias moléculas de dsRNA (incluindo aquelas correspondendo a PP1-87B, RPA70 Regi, RPA70 Reg2, RPA70 REg3 e RPS6) foram sinte- 20 tizadas e purificadas usando um estojo de RNA MEGAscript®. As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão de TE, e todos os bio- ensaios continham um tratamento controle consistindo neste tampão, que serviu como uma checagem de base quanto à mortalidade ou inibição de crescimento WCR. As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de 25 bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop® 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

As amostras foram testadas quanto à atividade em inseto em bi~ oensaios conduzidos com larvas de inseto neonatais sob dieta de inseto arti- ficial. Ovos de WCR foram obtidos da Crop Characteristics, Inc. (Farmington, MN).

Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 cavidades especificamente projetadas para bioensaios de inseto (C-D Inter- national, Pitman, NJ). Cada cavidade continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta feita para crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 μί de amostra de dsRNA foi aplicada através de pipeta sobre a superfície da dieta de 1,5 cm2 de cada cavidade (40 μ L/cm2). Concentrações de amostra 5 de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área de superfície na cavidade. As bandejas tratadas foram mantidas em uma capela até que o líquido na superfície da dieta eva- porasse ou fosse absorvido na dieta.

Dentro de algumas horas da eclosão, larvas individuais foram 10 pegas com uma escova de cabelo de camelo umedecida e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por cavidade). As cavidades infestadas das bandejas de plástico de 128 cavidades foram então vedadas com folhas adesivas ou plástico transparente e ventiladas para permitir tro- ca de gás. Bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambien- 15 tais controladas (28°C, ~40% de Umidade Relativa, 16:8 (Luz:Escuro)) por

9 dias, após o que o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos e o peso de insetos sobreviventes foram regis- trados. A mortalidade percentual, pesos vivos médios e inibição de cresci- mento foram calculados para cada tratamento. Atrofia foi definida como 20 uma diminuição em pesos vivos médios. Inibição de crescimento (GI) foi calculada como segue:

Gl = [1 - (TWIT/TN IT)/(TWI BC/TNIBC)]

em que TWIT é o Peso Total de Insetos Vivos no Tratamento;

TNIT é o Número Total de Insetos no Tratamento;

TWIBC é o Peso Total de Insetos Vivos na Checagem de Base

(Controle de tampão); e

TNIBC é o Número Total de Insetos na Checagem de Base (Controle de tampão).

A Gl50 é determinada ser a concentração de amostra na dieta na qual o valor de Gl é 50%. A LC50 (Concentração Letal 50%) é registrada co- mo a concentração de amostra na dieta na qual 50% de insetos de teste são mortos. Análise estatística foi feita usando software JMP® (SAS, Cary, NC). Bioensaios replicados demonstraram que ingestão de amostras particulares resultou em mortalidade e inibição surpreendentes e inespera- das de crescimento de larvas da lagarta da raiz do milho.

EXEMPLO 2: Identificação de Genes Alvo Candidatos Estágios múltiplos de desenvolvimento de WCR (Diabrotica virgi-

fera virgifera LeConte) foram selecionados para análise do transcriptoma agrupada para prover seqüências de gene-alvo candidatas para controle através da tecnologia de resistência a inseto de planta transgênica RNAi.

RNA total foi isolado de a partir de cerca de 0,9 g de larvas de WCR de primeiro estágio inteiras (iDiabrotica virgifera virgifera LeConte; 4 a dias pós-eclosão, mantidas a 16°C) e purificado usando o método baseado em fenol/TRI REAGENT® que segue (Molecular Research Center, Cincinna- ti; OH;N°. Cat. TR 118):

As larvas foram homogeneizadas em temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até que uma suspensão homogênea foi obtida. Seguindo 5 minutos de incubação em temperatura ambiente, o homogenato foi despejado em tubos microfuge de

1.5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados e a mistura foi vigorosamente agitada por 15 segundos. Depois de deixar a extração se-

dimentar em temperatura ambiente por 10 minutos, as fases foram separa- das através de centrifugação a 12.000 x g a 4°C. A fase superior (compre- endendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo de

1.5 mL estéril, e um volume igual (0,6 mL) de isopropanol em temperatura ambiente foi adicionado. Depois de incubação em temperatura ambiente por

5 a 10 minutos, a mistura foi centrifugada 8 minutos a 12.000 x g (4°C ou 25°C).

O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado e o pélete de RNA foi lavado duas vezes através de vórtex com etanol 75%, com recuperação através de centrifugação por 5 minutos a 7.500 x g (4°C ou 30 25°C) após cada lavagem. O etanol foi cuidadosamente removido, o pélete foi deixado secar ao ar por 3 a 5 minutos e então foi dissolvido em água es- téril livre de nuclease. Concentração de RNA foi determinada através da medição da absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de a partir de cerca de 0,9 g de larvas deu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão A260/A280 de 1,9. O RNA então extraído foi armazenado a -80°C até ser processado mais.

A qualidade do RNA foi determinada através da passagem de

uma alíquota através de gel de agarose 1%. A solução de gel de agarose foi feita usando tampão TAE 10x autoclavado (EDTA Tris-acetato, concentração 1x é Tris-acetato 0,04M, EDTA 1 mM (sal de sódio do ácido etilenodiamino tetra-acético), pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (dietil pirocarbo- nato) em um recipiente autoclavado. TAE 1x foi usado como o tampão contí- nuo. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente de formação de cavi- dade foram limpos com RNAseAway® (Invitrogen, Inc., Carlsbad, CA). Dois pL de amostra de RNA fora misturados com 8 pL de tampão TE (Tris HC110 mM pH 7,0; EDTA 1 mM) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (Nova- gen®N°. Catálogo 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70°C por 30 minutos, esfriada para temperatura ambiente e 5 μ!_ (contendo 1 pg a 2 pg de RNA) foram carregados por cavidade. Marcadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram simultanea- mente administrados em cavidades separadas para comparação de tama- nho molecular. O gel foi administrado a 60 v por duas horas.

Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA total Iarval por um provedor de serviço comercial (Eurofins MWG Ope- ron, Huntsville, AL), usando preparação aleatória.

A biblioteca de cDNA Iarval normalizada foi sequenciada em es- 25 cala de placa Vz através de química de série GS FLX 454 Titanium® da Euro- fins MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com um com- primento de leitura médio de 348 pb. 350.000 leituras foram reunidas em mais de 50.000 contíguas. Ambas as leituras não reunidas e as contíguas foram convertidas em bancos de dados BLASTabIe usando o programa pu- 30 blicamente disponível, FORMATDB (disponível da NCBI).

Bibliotecas de RNA total e cDNA normalizado foram similarmen- te preparadas a partir de materiais coletados em outros estágios desenvol- vimentais de WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupado para avalia- ção de gene-alvo foi construída combinando membros da biblioteca de cD- NA representando os vários estágios desenvolvimentais.

Genes candidatos para direcionamento de RNAi foram selecio- 5 nados usando informação com relação a efeitos de RNAi letais de genes particulares em outros insetos tais como Drosophila e Tribolium. Esses ge- nes foram hipotetizados ser essenciais para sobrevivência e crescimento em insetos coleópteros. Homólogos de gene-alvo selecionado foram identifica- dos no banco de dados de seqüência de transcriptoma conforme descrito 10 abaixo. Seqüências de comprimento integral ou parcial dos genes-alvo foram amplificadas através de PCR para preparar moldes para produção de RNA de filamento duplo (dsRNA).

Pesquisas TBLASTN usando seqüências de codificação de prote- ína candidatas foram realizadas contra bancos de dados BLASTabIe contendo as leituras de seqüência de Diabrotica não reunidas ou os contíguas reunidas. As mais significantes para uma seqüência de Diabrotica (definidas como me- lhores do que e'20 para homologias contíguas e melhores do que e'10 para homologias de leituras de seqüência não reunidas) foram confirmadas usando BLASTX contra o banco de dados não redundante NCBI. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as seqüências de gene candidatas homó- logas de Diabrotiea identificadas na pesquisa TBLASTN na verdade compre- endiam genes de Diabrotica ou foram as melhores disponíveis nas seqüên- cias de Diabrotiea para a seqüência de gene candidata não Diabmtica. Na maioria dos casos, genes candidatos de Tribolium que foram registrados co- mo codificando uma proteína deram uma homologia de seqüência sem ambi- güidade para uma seqüência ou seqüências nas seqüências de transcriptoma de Diabrotiea. Em poucos casos, ficou claro que algumas das leituras de se- qüência contíguas ou não reunidas de Diabrotiea selecionadas através de homologia com um gene não Diabrotiea candidato se sobrepuseram, e que a montagem das contíguas tinha falhado em se unir a essas sobreposições. Nesses casos, Sequencher® v4.9 (Gene Codes Corporation, Ann. Arbor, Ml) foi usado para montar as seqüências em contíguas maiores. Uma pluralidade de genes-alvo candidatos foi identificada como genes que podem levar à mortalidade ou inibição de crescimento, desenvol- vimento ou reprodução de peste coleóptera em WCR, incluindo SEQ ID NoS:1-7. Clones de comprimento integral ou parciais de seqüências de homó- 5 Iogos de gene candidato de Diabrotiea foram usados para gerar amplicons de PCR para síntese de dsRNA.

A SEQ ID N°:1 compreende uma seqüência codificando uma proteína proteína fosfatase (daqui em diante referida como PP1-87B), que corresponde a uma subunidade catalítica de proteína fosfatase específica de serina/treonina, metalo dependente.

A SEQ ID N°:2 compreende uma seqüência codificando uma proteína RPA70 (daqui em diante referida como RPA70), que corresponde à proteína de Replicação A-70, uma subunidade de uma proteína de ligação de DNA de filamento simples.

A SEQ ID N°:3 representa contigOOl 1_87B, um fragmento de

uma região de codificação para uma proteína fosfatase PP1-87B.

A SEQ ID N°:4 representa D_vir_c43870_RPA70, um fragmento de uma região de codificação para uma proteína RPA70 e referida aqui co- mo região 1 de RPA ou RPA70 Reg 1.

A SEQ ID N°:5 representa D_vir_c18764_RPA70, um fragmento

de uma região de codificação para uma proteína RPA70 e referida aqui co- mo RPA70 Reg2.

A SEQ ID N°:6 representa D_vir_c7971_RPA70, um fragmento de uma região de codificação para uma proteína RPA70 e referida aqui co- mo RPA70 Reg3.

A SEQ ID N°:7 compreende uma seqüência codificando uma proteína RPS6, que é Proteína Ribossomal S-6.

EXEMPLO 3: Amplificação de Genes Alvo

Os iniciadores foram projetados para amplificar porções de regi- ões de codificação de cada gene-alvo através de PCR. Vide Tabela 1. Em que apropriado, uma seqüência de promotor de fago T7 (TTAATACGACT- CACTATAGGGAGA (SEQ ID N°:8)) foi incorporada às extremidades 5' dos filamentos de sentido e antissentido amplificados. Vide Tabela 1. RNA total foi extraído de WCR e cDNA de primeiro filamento foi usado como molde para reações de PCR usando iniciadores opostos posicionados para amplifi- car toda ou parte da seqüência de gene-alvo nativa.

Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciador usados para amplificar porções de

regiões de codificação de genes-alvo exemplares.

Gene Nome do SEQID N0: Seqüência (Região) Iniciador Par 1 PP1-87B PP1-87B- SEQ ID N°:9 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAA F T7 ATGGCAGAAGCAGATAAATTG PP1-87B PP1-87B-R SEQ ID N0:10 CTAATTTGTTCCATTGATTGTAGGTCC Par 2 PP1-87B PP1-87B-F SEQ ID N0:11 CAAATGGCAGAAGCAGATAAATTG PP1-87B PP1-87B- SEQ ID N0:12 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTA R T7 ATTTGTTCCATTGATTGTAGGTCC Par 3 RPA70 RPA70- SEQ ID N0:13 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAATG (região 2) F1 T7 GTCAAATTCTAGAGGGGAA RPA70 RPA70-R1 SEQ ID N0:14 CTACGACAGGATTATTGGTACCATC (reqião 2) Par 4 RPA70 RPA70-F1 SEQ ID N0:15 ATGGTCAAATTCTAGAGGGGAA (região 2) RPA70 RPA70-R1- SEQ ID N0:16 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTA (região 2) T7 CGACAGGATTATTGGTACCATC Par 5 RPA70 RPA70- SEQ ID N0:17 TTAATACGACTCACTATAGGGAGATCC (região 3) F2 T7 CGAATTAAAAGAAT GTTACAGGA RPA70 RPA70-R2 SEQ ID N0:18 CGAGCTTCATCATTGTAAGTCTCAAT (região 3) Par 6 RPA70 RPA70-F2 SEQ ID N°:19 TCCCGAATTAAAAGAATGTTACAGGA (região 3) RPA70 RPA70- SEQ ID N°:20 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACGA (região 3) R2 T7 GCTTCATCATTGTAAGTCTCAAT Par 7 RPS6 RPS-F_T7 SEQ ID N°:21 TTAATACGACTCACTATAGGGAGATCA ATATGAAGTTGAACGTATCG RPS6 RPS-R SEQ ID N°:22 ATGCTCTCTTGGGTCCCAGG Par 8 RPS6 RPS-F SEQ ID N°:23 TCAATATGAAGTTGAACGTATCG RPS6 RPS-R_T7 SEQ ID N°:24 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAATG CTCTCTTGGGTCCCAGG EXEMPLO 4: Construtos de RNAi

Preparação de molde através de PCR e síntese de dsRNA

A estratégia usada para prover moldes específicos para produ- ção de dsRNA é mostrada na Figura 1. DNAs de molde pretendidos para uso em síntese de dsRNA foram preparados através de PCR usando os pa- res de iniciador na Tabela 1 e (como molde de PCR) cDNA de primeiro fila- mento preparado a partir de RNA total isolado de larvas de primeiro estágio de WCR. Para cada região de gene-alvo selecionado, duas amplificações por PCR separadas foram realizadas. A primeira amplificação por PCR in- troduziu uma seqüência de promotor T7 na extremidade 5' dos filamentos de sentido amplificados. A segunda reação incorporou a seqüência de promotor T7 nas extremidades 5' dos filamentos de antissentido. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes-alvo foram então mistura- dos em quantidades aproximadamente iguais e a mistura foi usada como molde de transcrição para produção de dsRNA. Figura 1. As seqüências dos moldes de dsRNA amplificados com os iniciadores particulares foram:

SEQ ID N°:25 (PP1-87B); SEQ ID N°:26 (RPA70 Reg2); SEQ ID N°:27 (RPA70 Reg3) e SEQ ID N°:28 (RPS6). RNA de filamento duplo foi sintetizado e purificado usando um estojo de RNAi Ambion® MEGAscript® 20 seguindo as instruções do fabricante (Invitrogen). As concentrações de ds- RNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop® 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).

Construção de vetores de transformação de planta

Dois tipos de vetores de expressão de RNA grampo de cabelo, 25 um conjunto para transformação de célula de milho mediada por WHIS- KERS® e um segundo conjunto para transformação mediada por Agrobacte- rium convencional, foram montados usando métodos de clonagem padrão Gateway® (Invitrogen). Construtos de gene-alvo para formação de grampo de cabelo compreendendo segmentos de PP1-87B (SEQ ID N°:1; segmento 30 SEQ ID N°:3), RPA70 (SEQ ID N°:2; segmento SEQ ID N°:5) e RPS6 (SEQ ID N°:7) foram montados usando uma combinação de fragmentos quimica- mente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem mole- cular padrão. Formação de grampo de cabelo intramolecular através de transcritos primários de RNA foi facilitada pela disposição (dentro de uma unidade de transcrição única) de duas cópias dos fragmentos de gene-alvo em orientação oposta uma para a outra, os dois fragmentos sendo separa- 5 dos por uma seqüência de íntron ST-LS1 (Vancanneyt e outros (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Vetores de entrada contendo cassetes de ex- pressão dos construtos de grampo de cabelo de PP1-87B, região 2 de RPA70 e RPS60 foram montados usando métodos de clonagem Gateway® e métodos de clonagem padrão. Produção do transcrito de mRNA primário é 10 direcionada por uma cópia do promotor 1 da ubiquitina do milho (Patente U.S.N0. 5.510.474). Desta maneira, o transcrito de mRNA primário contém duas seqüências de fragmento de gene como repetições invertidas grandes uma da outra, separadas pela seqüência de íntron. Um fragmento compre- endendo uma região não traduzida 3' de um gene da peroxidase 5 do milho 15 (ZmPer5 3'UTR v2; Patente U.S.N0. 6.699.984) foi usado para terminar a transcrição dos genes-alvo.

O mesmo conjunto de vetores de entrada foi usado para clona- gem Gateway® em dois vetores de destino de partida para construir dois ti- pos de vetores de transformação de expressão de RNA grampo de cabelo; 20 um conjunto para transformação de célula de milho mediada por WHISKER e um segundo conjunto para transformação mediada por Agrobacterium. Todos os vetores de expressão de RNA grampo de cabelo para transforma- ção mediada por WHISKER® foram construídos usando um vetor de desti- nação de partida (pDAB108916) e um dos vetores de entrada construídos 25 por meio de uma reação de recombinação Gateway® padrão. O vetor de destinação compreendia dois genes marcadores: um gene da proteína fluo- rescente amarela (YFP; Shagin e outros (2004) Mol. Biol. Evoi 21(5):841-50) e um gene de tolerância a herbicida (fosfinotricin acetil transferase (PAT); Wehrmann e outros (1996) Nat. Biotechnol. 14(10): 1274-8). As expressões 30 de ambas a YFP e a PAT foram direcionadas por uma cópia de um promotor de badnavírus baciliforme da cana-de-açúcar (ScBV) respectivamente (S- chenk e outros (1999) Plant Molec. Biol. 39:1221-30). Um fragmento com- preendendo uma região não traduzida 3' de um gene da Iipase do milho (Z- mLip 3'UTR; Patente U.S.N0. 7.179.902) foi usado para terminar a transcri- ção do gene de YFP1 enquanto terminação da transcrição do gene de PAT foi controlada por um fragmento contendo um gene pinll da batata 3'UTR (StPinII 3'UTR; essencialmenteN0. de Acesso GenBank® X04118.1).

Todos os vetores de transformação de expressão de RNA gram- po de cabelo para transformação de embrião de milho mediada por Agrobac- terium foram construídos usando um vetor de destinação binário típico (pDAB101847) e um dos vetores de entrada descritos acima através do uso 10 de uma reação de recombinação Gateway® padrão. O vetor de destinação binário compreendia outro gene de resistência a herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Wright e outros (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-5) sob a regulação do promotor ScBV e terminador ZmLip 3'UTR. Os plasmídeos de vetor binário eram pDAB109818 (compreendendo o cons- 15 truto grampo de cabelo de RPA70), pDAB109822 (compreendendo o cons- truto grampo de cabelo de PP1-87B) e pDAB109823 (compreendendo o construto grampo de cabelo de RPS6).

A SEQ ID N°:29 apresenta uma seqüência de formação de grampo de cabelo de PP1-87B, a SEQ ID N°:30 apresenta uma seqüência de formação de grampo de cabelo de RPA70 Reg2 e a SEQ ID N°:31 apre- senta uma seqüência de formação de grampo de cabelo de RPS6.

Purificação de fragmento para transformação mediada por WHISKERS® é realizada em uma escala preparativa através de çromatogra- fia líquida de alta pressão (HPLC) após os DNAs do vetor de expressão 25 YFP/hpRNA/PAT terem sido digeridos com enzimas de restrição apropriadas para remover um gene de resistência à espectinomicina bacteriano presente na estrutura principal do vetor.

EXEMPLO 5: Avaliação de Genes Alvo Candidatos

dsRNA sintético projetado para inibir algumas, mas não todas, das seqüências de gene-alvo identificadas no EXEMPLO 2 causou mortali- dade e inibição de crescimento quando administrado a WCR em ensaios à base de dieta. PP1-87B, RPA 70 Reg2, RPA70 Reg3 e RPS6 foram obser- vados exibir eficiência bem alta neste ensaio com relação a outros dsRNAs avaliados.

Bioensaios replicados demonstraram que ingestão de preparações de dsRNA derivadas de PP1-87B, RPA70 Reg2, RPA70 Reg3 e RPS6 cada 5 uma resultou em mortalidade e/ou inibição de crescimento de larvas da lagarta da raiz do milho do oeste. A Tabela 2 e a Tabela 3 mostram os resultados de bioensaios de alimentação com base na dieta de larvas WCR seguindo exposi- ção de 9 dias a esses dsRNAs. A Figura 2 e a Figura 3 mostram gráficos de variabilidade para dados de mortalidade e a Figura 4 e a Figura 5 mostram 10 gráficos de variabilidade para os dados de inibição de crescimento de pestes coleópteras tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares.

Tabela 2. Resultados de ensaios de alimentação com dieta obtidos com Iar- vas de lagarta da raiz do milho do oeste.___

Nome da Amostra LC50 Faixa de LC50 GUo Faixa de GI5O PP1-87B 50 23-117 ND ND RPA70 Reg2 42 17-100 ND ND RPA70 Reg3 61 15-331 ND ND RPS6 282 113-1000+ 5 2,5-8,7 *As unidades de dose estão em ng/cm2. **ND = Não feito Tabela 3. Resultados de ensaios de alimentação com dieta obtidos com Iar-

vas de lagarta da raiz do milho do oesl te Nome da Dose Número de Mortalidade Gl média Peso Médio por Amostra (ng/cm2) Fileiras % Média Inseto (mg) (Replicações) (Todos Dados de Réplica) RPS6 1000 4 53 (A)* 0,7075 0,2175 Tampão de TE 0 4 16,5 (B) 0 0,43 Água 0 4 10 (B) 0 1,07 YFP 1000 4 4 (B) -0,7955 0,625 *As letras em parênteses significam níveis estatísticos. Níveis não conecta- dos pela mesma letra são significantemente diferentes (Análise de Contin- gência, P<0,05) Foi anteriormente sugerido que certos genes de Diabrotiea spp. podem ser explorados para controle de inseto mediado por RNAi. Vide Publicação de Patente U.S.N0. 2007/0124836, que revela 906 seqüências, e a Patente U.S.N0. 7.614.924, que revela 9.112 seqüências. No entanto, foi 5 determinado que muitos genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotiea. Foi determi- nado também que PP1-87B, RPA70 Reg2, RPA70 Reg3 e RPS6 proveem cada um controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotiea, com- parado com outros genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto me- 10 diado por RNAi.

Por exemplo, anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4 foram cada um sugeridos na Patente U.S.N0. 7.614.924 ser eficazes em controle de in- seto mediado por RNAi. A SEQ ID N0:32 é a seqüência de DNA da região 1 de anexina e a SEQ ID N°:33 é a seqüência de DNA da região 2 de anexina. 15 A SEQ ID N°:34 é a seqüência de DNA da região 1 de beta espectrina 2 e a SEQ ID N°:35 é a seqüência de DNA da região 2 de beta espectrina 2. A SEQ ID N°:36 é a seqüência de DNA da região 1 de mRP-L4 e a SEQ ID N°:37 é a seqüência de DNA da região 2 de mtRP-L4. Uma seqüência de YFP (SEQ ID N°:38) foi também usada para produzir dsRNA como um con- 20 trole negativo.

Cada uma das seqüências mencionadas acima foi usada para produzir dsRNA através dos métodos do EXEMPLO 4, e os dsRNAs foram cada um testados através dos mesmos métodos de bioensaio baseados em dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as seqüências dos iniciadores usadas 25 para produzir as moléculas de dsRNA de anexina, beta espectrina 2 e mtRP- L14. A Tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação com base em dieta de larvas de WCR seguindo exposição de 9 dias a essas mo- léculas de dsRNA. Bioensaios replicados demonstraram que ingestão des- ses dsRNAs resultou em nenhuma mortalidade ou inibição de crescimento 30 de larvas da raiz do milho do oeste acima daquela vista com amostra contro- le de tampão de TE, YFP ou água. Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciador usados para amplificar porções de

regiões de codificação de genes.

Gene Nome do SEQ ID N0: Seqüência (Região) Iniciador Par 9 anexina (1) Ann-F 1_T7 SEQ ID N°:39 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCT CCAACAGTGGTTCCTTATC anexina (1) Ann-Rl SEQ ID N°:40 CTAATAATTCTI I I I IAATGTTCCTGAGG ParIO anexina (1) Ann-Fl SEQ ID N°:41 GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC anexina (1) Ann- SEQ ID N°:42 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTAA R1 T7 TAATTC1TITTI AATGTTCCTGAGG Par 11 anexina (2) Ann-F2_T7 SEQ ID N°:43 TTAATACGACTCACTATAGGGAGATT GT TACAAGCTGGAGAACTTCTC anexina (2) Ann-R2 SEQ ID N°:44 CTTAACCAACAACGGCTAATAAGG Par 12 anexina (2) Ann-F2 SEQ ID N°:45 TTGTTACAAGCTGGAGAACTTCTC anexina (2) Ann-R2T7 SEQ ID N°:46 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTTA ACCAACAACGGCTAATAAGG Par 13 beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:47 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAT (1) F1 T7 GTTGGCTGCATCTAGAGAA beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:48 GTCCATTCGTCCATCCACTGCA (1) R1 Par 14 beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:49 AGATGTTGGCTGCATCTAGAGAA (1) F1 beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:50 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGTC (1) R1 T7 CATTCGTCCATCCACTGCA Par 15 beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:51 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGCA (2) F2 T7 GATGAACACCAGCGAGAAA beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:52 CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC (2) R2 Par 16 beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:53 GCAGATGAACACCAGCGAGAAA (2) F2 beta-espect2 Betasp2- SEQ ID N°:54 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTG (2) R2 T7 GGCAGCTTCTTGTTTCCTC Par 17 mtRP-L4 (1) L4-F1_T7 SEQ ID N°:55 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGT GAAATGTTAGCAAATATAACATCC mtRP-L4 (1) L4-R1 SEQ ID N°:56 ACCTCTCACTTCAAATCTTGACTTTG Gene Nome do SEQID N0: Seqüência (Região) Iniciador Par 18 mtRP-L4 (1) L4-F1 SEQ ID N°:57 AGTGAAATGTTAGCAAATATAACATCC mtRP-L4 (1) L4-R1J7 SEQ ID N°:58 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAACCT CTCACTTCAAATCTT GACTTT G Par 19 mtRP-L4 (2) L4-F2J7 SEQ ID N°:59 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAAA GT CAAGATTT GAAGT GAGAGGT mtRP-L4 (2) L4-R2 SEQ ID N°:60 CTACAAATAAAACAAGAAGGACCCC Par 20 mtRP-L4 (2) L4-F2 SEQ ID N°:61 CAAAGTCAAGATTTGAAGTGAGAGGT mtRP-L4 (2) L4-R2_T7 SEQ ID N°:62 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACTAC AAATAAAACAAGAAGGACCCC Par 21 YFP YFP-F_T7 SEQ ID N°:63 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAC CATGGGCTCCAGCGGCGCCC YFP YFP-R SEQ ID N°:64 AGATCTTGAAGGCGCTCTTCAGG Par 22 YFP YFP-F SEQ ID N°:65 CACCATGGGCTCCAGCGGCGCCC YFP YFP-R_T7 SEQ ID N°:66 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAGAT CTTGAAGGCGCTCTTCAGG Tabela 5. Resultados de ensaios de alimentação com dieta obtidos com Iar-

vas de lagartas da raiz do milho ti o oeste Nome do Gene Dose Peso médio Mortalidade Inibição de (ng/cm2) por inseto (mg) % Média Crescimento Média anexina-região 1 1000 0,545 0 -0,262 anexina-região 2 1000 0,565 0 -0,301 bèta espectrina 2 região 1 1000 0,340 12 -0,014 beta espectrina2 região 2 1000 0,465 18 -0,367 mtRP-L4 região 1 1000 0,305 4 -0,168 mtRP-L4 região 2 1000 0,305 7 -0,180 Tampão de TE 0 0,430 13 0,000 Água 0 0,535 12 0,000 YFP 1000 0,480 9 -0,386 EXEMPLO 6: Produção de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo

dsRNAs Grampo de Cabelo Inseticidas

Plantas que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseti- cidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma mo- 5 lécula de dsRNA se direcionando a um gene compreendendo uma das SEQ ID NOs:1-7) através da expressão de um gene quimérico estavelmente inte- grado ao genoma da planta são produzidas. Preparações de moléculas de DNA de transformação de planta preparadas essencialmente conforme des- crito no EXEMPLO 4 são aplicadas a culturas de célula de suspensão Hi-Il

de milho através de transformação mediada por WHISKERS® (essencial- mente conforme descrito nas Patentes U.S. NoS. 5.302.523 e 5.464.765; Pu- blicação de Patente U.S.N0. 2008/0182332; e Petolino e Arnold (2009) Me- thods Mol. Biol. 526:59-67, que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade). Tecidos transformados são selecionados quanto à sua 15 habilidade em crescer em meio contendo BASTA® ou haloxifope e são avali- ados quanto à produção de YFP, conforme apropriado. Porções de tais cul- turas de tecido transformado podem ser apresentadas a larvas da lagarta da raiz do milho neonatais para bioensaio, essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 7.

Transformação mediada por Aarobacterium. Alternativamente,

células, tecidos e plantas de milho transgênico que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos

uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA se direcionando a um gene compreendendo uma de SEQ ID Nos: 1-7) através da 25 expressão de um gene quimérico estavelmente integrado ao genoma da planta foram produzidos seguindo transformação mediada por Agrobacteri- um. Métodos de transformação de milho empregando vetores de transfor- mação superbinários ou binários são conhecidos na técnica, conforme des- crito, por exemplo, na Publicação PCT InternacionaIN0. W02010/120452. 30 Tecidos transformados foram selecionados quanto à sua habilidade em crescer em meio contendo haloxifope e foram avaliados quanto à produção de dsRNA, conforme apropriado. Porções de tais culturas de tecido trans- formado podem ser apresentadas a larvas de lagarta da raiz do milho neona- tais para bioensaio, essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 7.

Esterilização de espiga e isolamento de embrião. Embriões ima- turos de milho foram obtidos de plantas de linhagem de cruzamento entre a mesma espécie de Zea mays B104 cultivadas na estufa e auto- ou sib- polinadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamen- te 9 a 12 dias pós-polinação. No dia experimental, as espigas descascadas foram esterilizadas na superfície através de imersão em uma solução 20% de hipoclorito de sódio (6,15%) e agitadas por 20 a 30 minutos, seguido por três enxágues em água estéril. Após esterilização, embriões zigóticos imatu- ros (1,5 a 2,4 mm) foram assepticamente dissecados de cada espiga e alea- toriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo Meio de Ino- culação líquido. O meio de inoculação continha: 2,2 g/L de sais de MS e Vi- taminas MS Modificadas 1X ISU (Frame e outros (2011) "Genetic Transfor- mation Using Maize Immature Zygotic Embryos." Em Plant Embrvo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Bioloav. T. A. Thorpe e E. C. Yeung, (Eds.), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC., pp 327-341); 68,4 gm/L de sacarose; 36 gm/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de m/o-inositol; e 200 μΜ de acetosiringona (preparada em DM- SO); em pH 5,4. Para um dado conjunto de experimentos, embriões de es- pigas agrupadas foram usados para cada transformação.

Início de Cultura de Aarobacterium. Estoques de glicerol de li- nhagem de Agmbacterium DAt13192 contendo um vetor de transformação binário, tal como pDAB109818, pDAB109822 ou pDAB109823, foram risca- dos em placas de meio mínimo AB

(Watson e outros (1975) J. Bacteriol. 123:255-64) contendo anti- bióticos apropriados e foram cultivados a 20°C por 3 a 4 dias. Uma colônia única foi pega e riscada em placas de YEP (10 g/L de extrato de levedura; g/L de Peptona; 5 g/L de NaCI) contendo os mesmos antibióticos e as placas foram incubadas a 20°C por 1-2 dias.

Cultura e Co-cultivo de Aarobacterium. Colônias de Agrobacteri- um foram pegas de uma placa de YEP, suspensas em 10 mL de Meio de Inoculação em um tubo de 50 mL descartável e a densidade celular foi ajus- tada para uma OD550 de 0,2 a 0,4 (Densidade Óptica medida a 550 nm, uma medida indireta de concentração celular) usando um espectrofotômetro. As culturas de Agrobacterium foram incubadas em um agitador giratório a 125 5 rpm (temperatura ambiente) enquanto dissecação de embrião era realizada. Embriões zigóticos imaturos (previamente isolados dos grãos de milho este- rilizados e postos em 1 mL de Meio de Inoculação) foram lavados uma vez no mesmo meio.

Dois mL de suspensão de Agrobacterium foram adicionados a 10 cada tubo de embriões, e os tubos foram postos em uma plataforma de agi- tação por 10 a 15 minutos. Os embriões foram transferidos para Meio de Co- cultura, orientados com o escutelo para cima e incubados a 25°C, sob Iuz 24 horas a 50 pEm'2 seg'1 de intensidade de Iuz por 3 dias. O meio de Co- cultivo continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas MS Modificadas 1X I- 15 SU; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba (áci- do 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO3; 100 pg de acetosiringona em DMSO; e 3 g/L de GELZAN® (SIGMA-ALDRICH); em pH 5,8.

Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Putativos. Seguindo

o período de co-cultivo, os embriões foram transferidos para Meio de Des- canso e incubados a 25°C sob Iuz 24 horas a 50 pEm'2 seg'1 de intensidade de Iuz por 3 dias. O Meio de Descanso continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas MS Modificadas 1X ISU; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L- 25 prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgNO3; 0,5 gm/L de MES (monoidrato do ácido 2-(N-morfolino)etanossulfônico; PHVTOTECHNOLO- GIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L Carbenicilina; e 2,3 gm/L GELZAN®; em pH 5,8. Os embriões foram transferidos para Meio de Seleção 1 (que 30 consistia no Meio de Descanso (acima) com ácido R-Haloxifope 100 nM (0,0362 mg/L)) e incubados ou no escuro e/ou sob Iuz 24 horas em 50 pEm" 2seg‘1 de intensidade de Iuz por 7 a 14 dias a 28°C. Calos embriogênicos em proliferação foram transfectados em Meio de Seleção 2 (que consistia em Meio de Descanso (acima), com ácido R-Haloxifope 500 nM (0,1810 mg/L)) e foram incubados em 24 horas de Iuz a 50 pEm'2seg'1 de intensidade de Iuz por 14 a 21 dias a 28°C. Esta etapa 5 de seleção permitiu que os calos transgênicos proliferassem e diferencias- sem mais.

Calos embriogênicos, em proliferação, foram transferidos para Meio de PreRegeneração e culturados sob Iuz por 24 horas em 50 μΕιτΓ 2seg'1 de intensidade de Iuz por 7 dias a 28°C. Meio de PreRegeneração 10 continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas 1X ISU; 45 gm/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO3; 0,25 gm/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abs- císico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 15 2,5 gm/L de GELZAN®; e 500 nM de ácido R-Haloxifope; em pH 5,8.

Calos embriogênicos com brotos tipo ramo foram transferidos para Meio de Regeneração e culturados sob Iuz por 24 horas a 50 pEm'2seg~

1 de intensidade de Iuz por 7 dias. Meio de Regeneração 1 continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas 1X ISU; 60 gm/L de sa- carose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3,0 gm/L de GELZAN®; e 500 nM de ácido R-Haloxifope; em pH 5,8.

Ramos pequenos com raízes primárias foram transferidos para meio de Ramo/Raiz em PHYTATRAYS® (P/7VTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS) e foram incubados sob 16:8 horas luz:escuro a 140 a 190 μΕπΓ 25 2seg'1 de intensidade de Iuz por 7 dias a 27°C. Meio do e Ramo/Raiz continha 4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas 1X ISU; 30 gm/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 3,5 gm/L de GELZAN®; em pH 5,8.

Mudas transgênicas putativas foram analisadas quanto a núme- ro de cópia de transgene através de ensaios de PCR em tempo real quanti- tativos usando iniciadores projetados para detectar números de cópia relati- vos do ZmPerõ 3' UTR (usado para determinar transcrição de gene de ex- pressão de RNA-grampo de cabelo reptina) e foram transferidas para o solo. Transferência e estabelecimento de plantas Tn na estufa para bioensaio e produção de semente. Tecidos de planta transformados selecio- nados quanto à sua habilidade em crescer em meio contendo 500 nM de ácido R-Haloxifope receberam identificadores únicos, transplantados em 5 meio de crescimento sem solo METRO-MIX® 360 (SUN GRO HORTICUL- TURE) e endurecidos em uma sala de crescimento (~28°C temp. dia/~24°C tem. noite/luz suplementar 16:8). As plantas foram então transplantadas para mistura de solo SUNSHINE CUSTOM BLEND® 160 e cultivadas até flores- cimento na estufa.

As plantas a serem usadas para bioensaios de inseto foram

transplantadas a partir de potes pequenos para TINUS® 350-4 ROOTRAI- NERS® (Spencer-Lemaire Industries, Acheson, Alberta, Canada) (uma plan- ta por evento por ROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias depois do transplante para ROOTRAINERS®, plantas To foram infestadas para bioen- saio.

Plantas da geração Ti foram obtidas através de polinização dos cabelos de plantas transgênicas T0 com pólen coletado de plantas de linha- gem de cruzamento entre a mesma espécie não transgênicas B104 e plantio das sementes resultantes.

EXEMPLO 7: Bioensaios de Inseto

As plantas que produziram um dsRNA inseticida foram bioensai- adas na estufa quanto a dano de alimentação da raiz. Ovos de lagarta da raiz do milho do oeste (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidos em solo da Crop Characteristics (Farmington, MN), e os ovos fo- 25 ram incubados a 28°C por 10-11 dias. Os ovos foram lavados do solo, pos- tos em uma solução de ágar 0,15% e a concentração foi ajustada para apro- ximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Uma placa de oclusão foi posta em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovo pa- ra monitorar taxas de oclusão.

O solo em torno das plantas de milho foi infestado com 150 a

200 ovos de WCR. Os insetos foram deixados se alimentar por 2 semanas, depois desse tempo uma "Classificação de Raiz" foi dada a cada planta. Uma Escala de Lesão de Nó foi utilizada para graduação, essencialmente de acordo com Oleson e outros (2005) J. Econ. Entomol. 98(1): 1-8. As plantas que passaram por este bioensaio foram transplantadas imediatamente para potes de 18,93 I (5 galões) para polinização à mão e produção de semente.

As sementes produzidas por essas plantas foram guardadas para avaliação nas gerações de plantas Ti e subsequentes.

Plantas de controle negativo para os bioensaios consistiam em plantas B104 não transformadas produzidas a partir de semente ou plantas transformadas com um vetor binário carregando uma região de codificação 10 de YFP sob controle de expressão de um promotor da ubiquitinal derivada de milho e Per5 3' UTR, e uma região de codificação AAD1 sob o controle de expressão de um promotor da ubiquitinal derivada de milho e Lip 3'UTR.

O vetor binário de controle negativo não compreendia um construto codifi- cando um dsRNA.

Plantas da geração T0 regeneradas a partir de transformação uti-

lizando vetores binários compreendendo: um construto codificando um dsR- NA grampo de cabelo de RPA70 (Tabela 14); um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B (Tabela 12); e um construto codifi- cando um dsRNA grampo de cabelo de RPS6 (Tabela 13) foram bioensaia- 20 dos na estufa conforme descrito. Poucos eventos T0 de PP1-87B e RPS6 testados demonstraram evidência de proteção de dano por alimentação pela lagarta da raiz do milho do oeste. Tabelas 12 e 13.

Sementes da geração Ti foram produzidas através de poliniza- ção de cabelos de plantas To com pólen coletado de plantas de linhagem de 25 cruzamento entre a mesma espécie de elite não transgênicas B104. Plantas de eventos selecionados foram provocadas em bioensaios com larvas da lagarta da raiz do milho do oeste conforme descrito. As Figuras 6 e 7 mos- tram dados de variabilidade de scores de dano de classificação de raiz mé- dios de plantas Ti compreendendo construtos codificando dsRNAs grampo 30 de cabelo de PP1-87B, RPS6 e RPA70. Os dados mostrados das Figuras são providos ainda nas Tabelas 6 e 7. Tabela 6. Classificações de Dano à Raiz Médio por lagarta da raiz do milho do oeste de plantas de estufa Ti de eventos compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B (pDAB109822; descri- to como Evento 109822), e plantas de outros eventos compreendendo cons- trutos codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPS6 (pDAB109823; descrito como Evento 109823).___

Evento de PP1-87B Nível* N0. de Classificação de Da¬ Erro Padrão de Plantas no à Raiz Médio Média 109822[1 ]-001 B 5 0,404 0,12 109822[1]-009 B 10 0,279 0,07 109822[1 ]-011 B 5 0,140 0,05 Evento de RPS6 Nível* N0. de Classificação de Le¬ Erro Padrão de Plantas são à Raiz Média Média 109823[1 ]-008 B 5 0,400 0,20 109823[1 ]-020 B 5 0,372 0,14 109823[1]-012 B 10 0,342 0,09 109823[1]-007 B 10 0,287 0,11 109823[1J-026 B 5 0,180 0,09 109823[1]-0Ó3 B 5 0,120 0,10 109823[1 ]-019 B 5 0,082 0,04 Controles Negativos 101556[93]-074 A 4,00 1,000 0 B104 A 4,00 1,000 0 *A letras indicam níveis estatísticos conforme separado pelo teste Tukey- Kramer nas médias. Nomes de evento/planta não conectados pela mesma letra são significantemente diferentes (P<0,05). Tabela 7. Classificações de Dano à Raiz Médio da lagarta da raiz do milho do oeste de plantas de estufa Ti de eventos compreendendo um construto

codificando um dsR NA grampo de cabelo de RPA70. Evento Nível* N0. de Classificação de Erro Padrão Plantas Dano à raiz Médio de Média 109818[1]-004 A 5 1,00 0,00 109818[1]-010 A 5 1,00 0,00 109818[1 ]-001 A 5 0,95 0,05 109818[1]-007 A 5 0,95 0,05 109818[1]-013 A 5 0,95 0,05 109818[1]-040 A 5 0,95 0,05 109818[1]-023 AB 5 0,90 0,06 109818[1 ]-006 AB 5 0,85 0,10 109818[1 ]-003 AB 5 0,82 0,18 109818[1 ]-011 AB 5 0,80 0,05 109818[6]-209 AB 5 0,75 0,08 109818[1 ]-017 AB 5 0,70 0,05 109818[1]-019 AB 5 0,70 0,15 109818[1 ]-028 AB 5 0,65 0,10 109818[1 ]-018 AB 5 0,62 0,15 109818[1]-024 BC 5 0,50 0,08 109818[11-026 BC 5 0,50 0,14 109818[1 ]-027 BC 5 0,50 0,08 Controles Negativos 101556[11-007 A 4 1,00 0,00 B104 A 4 1,00 0,00 *A letras indicam níveis estatísticos conforme separado pelo teste Tukey- Kramer nas médias. Nomes de evento/planta não conectados pela mesma letra são significantemente diferentes (P<0,05). EXEMPLO 9: Bioensaios de inseto in vitro

Bioatividade do dsRNA da presente invenção produzido em célu- las de planta é demonstrada através de métodos de bioensaio. Vide, por e- xemplo, Baum e outros (2007) Nat. Biotechnol. 25(11): 1322-6. Alguém seria 5 capaz de demonstrar eficácia, por exemplo, através da alimentação de vá- rios tecidos ou pedaços de tecido de planta derivados de uma planta produ- tora de um dsRNA inseticida a insetos-alvo em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, são preparados extratos de vários tecidos de planta derivados de uma planta produtora de dsRNA inseticida e os ácidos 10 nucleicos extraídos são aplicados em cima de dietas artificiais para bioen- saios conforme anteriormente descrito aqui. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados com bioensaios similarmente conduzidos que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiro que não produzem um dsRNA inseticida ou a outra amostras controle.

EXEMPLO 10: Análises moleculares de Tecidos de Milho Transaênicos

Nível de expressão de transcrito de RNA grampo de cabelo: aP- CR de Per 5 3'UTR. Eventos de célula de calo ou plantas transgênicas foram analisados através de PCR quantitativa (qPCR) em tempo real da seqüência Per 5 3'UTR para determinar o nível de expressão relativa do transcrito 20 grampo de cabelo de comprimento integral, comparado com o nível de transcrito de um gene de milho interno (SEQ ID N°:70;N°. de Acesso GEN- BANK BT069734) que codifica uma proteína tipo TIP41 (isto é, um homólogo de milho deN°. de Acesso GENBANK AT4G34270; score tBLASTX de 74% de identidade).

RNA foi isolado usando o estojo RNAEASY® 96 (QIAGEN, Va-

lencia, CA). Após a primeira lavagem (RW1), as colunas foram tratadas com DNase livre de RNase QIAGEN em tampão RDD® (de acordo com o proto- colo alternativo sugerido pelo estojo). cDNA de primeiro filamento foi prepa- rado usando um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) 30 em um volume de reação de 10 μί com 5 μί de RNA desnaturado, substan- cialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O proto- colo foi modificado ligeiramente para incluir a adição de 10 μί 100 μί de oli- gonucleotídeo T20VN (IDT) no tubo de 1 mL de mistura de estoque de inici- ador aleatório, a fim de preparar um estoque de trabalho de iniciadores alea- tórios e oligo dT combinados.

Seguindo síntese de cDNA, as amostras foram diluídas 1:3 com água livre de nuclease e armazenadas a -20°C até serem ensaiadas. PCR de tempo real foi realizada em um LIGHTCYCLER® 480 (ROCHE DIAG- NOSTICS, Indianapolis, IN) em um volume de reação de 10 μί. Todos os ensaios incluíam controles negativos de não molde (mistura apenas). Para as curvas padrão, um vazio (água em cavidade da fonte) foi também incluído na placa da fonte para checar contaminação cruzada da amostra. As rea- ções foram realizadas com a ROCHE UNIVERSAL PROBE® a 0,5 μΜ e os iniciadores para os genes-alvo e de referência a 10 μΜ. As seqüências de iniciador são mostradas na Tabela 8. Condições de reações de PCR foram como segue: (1) Ativação do-alvo a 95°C por 10 minutos; (2) 43 ciclos de (desnaturação a 95°C por 10 segundos e extensão a 60°C); (3) aquisição a 72°C por 1 segundo; e (4) esfriamento a 40°C por 10 segundos.

Tabela 8. Seqüências de iniciador usadas para análises moleculares de ní- veis de transcrito em milho transgênico _

Alvo Iniciador SEQ ID N0. Seqüência de Iniciador TIP41* MZTIPU67F 71 AGCCAAGCCAGTGGTACTT C TIP41 MZTIPU67R 72 T CGCAGACAAAGTAGCAAAT GT Per5 3'UTR P5U76S (F) 73 TTGTGATGTTGGTGGCGTAT Per5 3'UTR P5U76A (R) 74 TGTTAAATAAAACCCCAAAGATCG *Proteína tipo TIP41.

Os dados foram analisados usando Software LIGHTCYCLER®

v1.5 através de quantificação relativa usando um segundo algoritmo max derivado para cálculo de valores Cq, de acordo com as recomendações do fabricante. Para análises de expressão, valores de expressão foram calcula- dos usando o método ACq (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que se apoia

na comparação de diferenças de valores Cq entre dois-alvos, com o valor de base de 2 sendo selecionado sob a hipótese que, para reações de PCR oti- mizadas, o produto dobra a cada ciclo. Tamanho e integridade do transcrito grampo de cabelo: Ensario Nothern Blot Caracterização molecular adicional de algumas das plantas transgênicas foi realizada através do uso de análise northem blot (blot de RNA) para determinar o tamanho molecular do RNA grampo de cabelo repti- 5 na em plantas transgênicas expressando um dsRNA grampo de cabelo rep- tina. Um transcrito nascente de comprimento integral é esperado ter um ta- manho molecular de cerca de 900 pb, dependendo da quantidade de polia- denilação do RNA.

Todos os materiais e equipamentos foram tratados com RNA- 10 ZAP® (AMBION/INVITROGEN) antes do uso. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) foram coletadas em tubos SAFELOCK® EPPENDORF de 2 mL, rompidas com um pulverizador de tecido KLECKO® (Garcia Manfacturing, Visalia, CA) com três contas de tungsgênio em 1 mL de TRIZOL® (INVI- TROGEN) por 5 minutos, então incubadas em temperatura ambiente (RT) 15 por 10 minutos. Opcionalmente, as amostras foram centrifugadas por 10 mi- nutos a 4°C a 11.000 rpm e o sobrenadante foi transferido para um tubo SA- FELOCK® EPPENDORF de 2 mL.

Depois de 200 pL de clorofórmio terem sido adicionados ao ho- mogenato, o tubo foi misturado através de inversão por 2 a 5 minutos, incu- 20 bado em RT por 10 minutos e centrifugado a 12.000 x g por 15 minutos a 4°C. A fase superior foi transferida para um tubo EPPENDORF de 1,5 mL estéril, e 600 pL de isopropanol 100% foram adicionados, seguido por incu- bação em RT por entre 10 minutos e duas horas, então centrifugação a 12.000 X g por 10 minutos em a partir de 4°C a 25°C. O sobrenadante foi 25 descartado e o pélete de RNA foi lavado duas vezes com 1 mL de etanol 70%, com centrifugação a 7.500 x g por 10 minutos em a partir de 4°C a 25°C entre as lavagens. O etanol foi descartado e o pélete foi rapidamente seco ao ar por 3 a 5 minutos antes de ser ressuspenso em 50 pL de água livre de nuclease.

RNA total foi quantificado usando o NANODROP® 8000

(Thermo-Fisher), e as amostras foram normalizadas para 5 pg/10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) foram então adicionados a cada .« ί» , 126/142

amostra. 5 a 14 ng de mistura de marcador padrão de RNA DIG (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) foram aplicados e adicionados a um volume igual de glioxal. RNAs de amostras e marcador foram desnatura- dos a 50°C por 45 minutos e armazenados em gelo até carregamento em 5 um gel de agarose SEAKEM® GOLD 1,25% (Lonza, Allendale, NJ) em tampão contínuo glioxal NORTHERNMAX® 10 X (AMBION/INVITROGEN). RNAs foram separados através de eletroforese a 65 volts/30 mA por duas horas e 15 minutos.

Seguindo eletroforese, o gel foi enxaguado com SSC 2X por 5 10 minutos e imagem feita em uma estação GEL DOC® (BioRad, Hercules, CA). Então, o RNA foi passivamente transferido para uma membrana de náilon (MILLIPORE) da noite para o dia em temperatura ambiente, usando SSC 10X como o tampão de transferência (SSC 20X consiste em NaCI 3 M e ci- trato de trissódio 300 mM, em pH 7,0). Seguindo a transferência, a membra- 15 na foi enxaguada em SSC 2X por 5 minutos, o RNA foi reticulado com UV para a membrana (Agilent/Stratagene) e a membrana foi deixada secar em temperatura ambiente por até 2 dias.

A membrana foi pré-hibridizada em tampão ULTRAHYB® (AMBION/INVITROGEN) por uma a duas horas. A sonda consistia em um 20 produto amplificado por PCR contendo as seqüências de interesse (por exemplo, as porções de seqüência de antissentido de uma de SEQ ID NoS:29-31) marcadas com digoxigenina por meio de um procedimento de DIG da Roche Applied Science. Hibridização em tampão recomendado foi realizada da noite para o dia em uma temperatura de 60°C em tubos de 25 hibridização. Seguindo hibridização, o blot foi submetido a lavagens com DIG, enrolado, exposto à película por 1 a 30 minutos e então a película foi desenvolvida, tudo através de métodos recomendados pelo fornecedor do estojo de DIG.

Tamanho e integridade do transcrito de grampo de cabelo: En- saio de Sonda de Hidrólise de íntron ST-LS1. Um ensaio de sonda de hidró-

Iise (conforme descrito abaixo; "Hydrolysis Probe Assays” se direcionando à seqüência espaçadora íntron ST-LS1 (SEQ ID N°:77) nos RNAs grampo de « Ii . 127/142

cabelo (SEQ ID Nos^-Sl) foi desenvolvido para medir a integridade do transcrito de dsRNA. Os oligonucleotídeos usados são listados na Tabela 7.

Ensaios de Número de Cópia de Transgene de Sonda de Hidró- lise. Tecidos de plantas de milho transgênicas foram avaliados através de um ensaio de sonda de hidrólise para confirmar a região de codificação aad-

1 (eventos de B104 transformados por Agrobacterium). Os dados foram u- sados para estimar o número de cópia de transgene, comparado com resul- tados obtidos em ensaios similares para detectar um gene da invertase cro- mossomal nativo de duas cópias (SEQ ID N°:75). Os oligonucleotídeos usa- dos são listados na Tabela 9.

Amostras de tecido foram maceradas com um pulverizador de tecido KLECO® e contas de aço inoxidável (Hoover Precision Products, Cumming, GA) em tampão QIAGEN RLT®. DNA genômico foi isolado em formato de alto rendimento usando um estojo BIOSPRINT® 96 Plant (QIA- 15 GEN), de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante, e quantificado através do QUANT-IT® PICO GREEN DNA ASSAY KIT (MOLECULAR PROBES/INVITROGEN). A concentração de DNA foi ajustada para em tor- no de 2 ng/pL para o ensaio de sonda de hidrólise usando um manuseador de líquido automático BIOROBOT® 3000 (QIAGEN). Determinação do núme- 20 ro de cópia de transgene foi realizada através de PCR de tempo real usando o sistema LIGHTCYCLER® 480 (Roche Applied Science, Indianapolis, IN).

Os ensaios foram projetados para aad-1 e um gene da invertase de referência interno (SEQ ID N°:75;N°. de Acesso GENBANK: U16123.1) usando o LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE v2.0, Para ampli- 25 ficação, mistura de LIGHTCYCLER® 480 Probes Master foi preparada em concentração final 1X em uma reação multiplex de 10 pL de volume, con- tendo 0,4 μΜ de cada iniciador para aad-1 e 0,2 μΜ para cada sonda (Tabe- la 9). Uma reação de amplificação de 2 etapas foi realizada com uma exten- são a 60°C por 40 segundos com aquisição de fluorescência. Todas as a- 30 mostras foram administradas, e os valores de Limiar de ciclo (Ct) (Cycle t- hreshold) médios foram usados para análise de cada amostra. Análise de dados de PCR de tempo real foi realizada usando < r* ( 128/142

LIGHTCYCLER® SOFTWARE release 1.5, usando o módulo quant relativo, e foi baseada no método AACt. Controles incluíam uma a- mostra de DNA genômico de uma linha de calibrador de cópia única e che- cagens de duas cópias conhecidas que foram incluídas em cada rodada.

Ensaios de sonda de hidrólise de estrutura principal de vetor.

Tecidos transgênicos foram analisados por meio de um ensaio de sonda de hidrólise projetado para detectar o gene SpnR (de resistência à espectinomi- cina bacteriano) (SEQ ID N°:76) abrigado no plasmídeo transformante, para determinar se qualquer DNA de estrutura principal do vetor tinha sido inte- 10 grado ao genoma de milho. Os oligonucleotídeos usados são listados na Tabela 9.

Tabela 9. Seqüências de iniciador e sonda usadas para ensaios de sonda de hidrólise.___

Alvo Nome do Oligonucleotídeo SEQ Seqüência ID N0: aad-1 GAAD1F (iniciador avançado) 78 TGTTCGGTTCCCTCTACCAA aad-1 GAAD1R (iniciador reverso) 79 CAACATCCATCACCTTGACTGA aad-1 GAAD1P (sonda) 80 CACAGAACCGTCGCTTCAGCAACA Invertase IVF-Taq (iniciador avançado) 81 TGGCGGACGACGACTTGT Invertase IVR-Taq (iniciador reverso) 82 AAAGTTTGGAGGCTGCCGT Invertase IV-P (sonda) 83 CGAGCAGACCGCCGTGTACTTCTACC Intron RNAi DNA F (iniciador avançado) 84 GTATGTTTCTGCTTCTACCTTTGAT ST-LS1 Intron RNAi DNA R (iniciador reverso) 85 CCATGTmGGTCATATATTAGAAAAGTT ST-LS1 íntron RNAi DNA FAM (sonda) 86 AGTAATATAGTATTTCAAGTAI Illlll ST-LS1 CAAAAT SpnR SPC1A (iniciador reverso) 87 CTTAGCTGGATAACGCCAC SpnR SPC1S (iniciador avançado) 88 GACCGTAAGGCTTGATGAA SpnR TQSPEC (sonda) 89 CGAGATTCTCCGCGCTGTAGA < ‘· 129/142

Ensaios de sonda de hidrólise de alca de grampo de cabelo. Te- cidos transgênicos foram analisados quanto à presença de uma alça de grampo de cabelo conforme provido em construtos compreendendo seqüên- cias de grampo de cabelo mostradas em SEQ ID NoS:29-31. Os construtos 5 de grampo de cabelo foram projetados de maneira que a alça do grampo de cabelo compreende uma seqüência de um íntron ST-L1 (SEQ ID N°:77). Os componentes e as condições de reação do ensaio de sonda de hidrólise de alça de grampo de cabelo são dados na Tabela 10, e as seqüências dos oligonucleotídeos são apresentadas na Tabela 11. Os parâmetros de com- 10 ponente e reação dados na Tabela 10 eram padrão para outros ensaios de sonda de hidrólise.

Tabela 10. Componentes de qPCR de alça de grampo de cabelo e parâme- tros de reação____

Componentes Estoque Amt (mL) Final (μΜ) Tampão Roche 2 X 2x 5 1x OrfB-rxnl F 10 μΜ 0,025 0,025 OrfB-rxn1 R 10 μΜ 0,025 0,025 OrfB-rxn 2 F 10 μΜ 0,175 0,175 OrfB-rxn2 R 10 μΜ 0,175 0,175 Sonda 12 PB MGB RNAi 10 μΜ 0,1 0,1 cDNA NA 2 NA H2O 2,5 IO(TotaI) Etapa do Termociclizador Temp. Tempo Np. de ciclos Ativar 95°C 10 min 1 Desnaturar 95°C 10 seg 5 Estender 50°C 40 seg Desnaturar 95°C 10 seg 40 (Acquire FAM) Estender 50°C 40 seg Esfriar 40°C Manter 1 Tabela 11. Seqüências de oligonucleotídeos usadas em ensaios de sonda de hidrólise de grampo de cabelo._

Nome SEQ ID N0: Seqüência OrfB-rxn 2 F 90 GAATCCTTGCGTCATTTGGT OrfB-rxn 2 R 91 CAAT GGACT CACGC AC AACT OrfB-rxn 1 F 92 GAAT CCTT GCGT CATTT GGT GACTAGTACCGGTT GGGA OrfB-rxn 1 R 93 CAAT GGACT CACGCACAACTTAACCGCGGATCAA Sonda 12 PB MGB 94 T GGG AAAGGTT G Plantas To compreendendo construtos de grampo de cabelo fo- ram analisadas conforme acima descrito e os resultados são dados nas Ta- belas 12,13 e 14.

Tabela 12. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas To compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B.__

Evento N0. de N0. de qPCR Transcrito Classifi¬ Northern de Cópia Cópia SpecR RTL cação da Compri¬ AAD1 íntron Per5* Raiz mento Inte¬ gral 109822Γ11-001.001 3,3 0,7 0,0 10,3 (25,6) 0,50 Positivo 109822Γ11-002.001 1,2 0,5 0,0 2,9 1,00 109822Í11-003.001 1,3 0,5 0,0 3,2 (20,3) 1,00 109822Í11-004.001 1.3 0,0 1,7 0,0 1,00 109822Γ11-005.001 0,9 0,5 0,0 2,3 (3,5) 0,02 Positivo 109822f11-006.001 1,4 0,4 0,0 3,0 (7,6) 1,00 109822Í11-007.001 1,6 0,6 0,0 2,8 (14,0) 1,00 109822Π 1-009.001 1,9 0,9 0,0 5,9 0,25 Positivo 109822Γ11-010,001 1,4 0,0 0,0 0,0 NT** Evento N0. de N0. de qPCR Transcrito Classifi¬ Northern de Cópia Cópia SpecR RTL cação da Compri¬ AAD1 íntron Per5* Raiz mento Inte¬ gral 109822f 11-011.001 1,6 0,5 0.0 1,8 (5,3) 0,75 Positivo 109822Γ11-012.001 1,5 0,4 0,0 3,9 (5,4) 1,0 109822Γ11-013.001 1,3 0,6 0,0 3,2 (6,4) 1.0 109822Γ11-014.001 1,6 0,0 0,0 0,0 NT 109822Π1-015.001 1.7 0,6 0,0 3,3 (9,6) 1,0 109822Γ11-016.001 1,3 0,5 0,0 3,2 (5,7) 1,0 109822Γ11-017.001 1,7 0,0 0,0 0,0 NT 109822Γ11-018.001 1,6 0,4 0,0 2,3 (8,5) 1,0 109822Γ11-019.001 2,9 1,0 2,1 4,2(12,1) 1,0 109822Í11-020,001 1.5 0,5 0,0 2,5 (5,3) 1,0 109822Γ11-021.001 0.0 0,0 0,0 0,0 NT 109822M1-022.001 1,5 0,6 0,0 2,3 (5,7) 1,0 109822Γ11-024.001 1,3 0,0 0,0 0,0 NT 109822111-028.001 1.5 0,0 0,0 0,0 NT 109822Γ11-029.001 1.4 0,0 0,0 0,0 NT 109822Γ11-033.001 1,5 0,6 0,0 3,0 (8,0) 1,0 109822f1l-034.001 1,5 0,5 0.0 2,2 (7,8) 1,0 109822Γ11-035.001 1,6 0,4 2,1 1,8 (1,0) 1,0 109822Γ11-036.001 1,1 0,3 1,3 2,3 1,0 109822Γ11-037.001 1,6 0,5 0,0 1.9(11,1) 1.0 109822Γ11-038.001 1,8 0,5 0,0 2,2 (6,0) 1,0 *Nível de Transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. Números em parênteses foram obtidos em repetições do ensaio.

**NT = não testado Tabela 13. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas T0

compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de

RPS6.

Evento N0. de N0. de qPCR Transcrito Classifi Northern de Cópia Cópia SpecR RTL Per5* cação Comprimento AAD1 íntron de Raiz Integral 109823[1 ]-001.001 0,8 0,6 2,2 2,8(13,9) 1,0 109823[1 ]-002.001 0,8 0,5 2,1 2,8 (6,2) 1,0 109823[1 ]-003.001 1,7 0,4 0,0 2,7 (9,4) 0,8 Positivo 109823[11-004.001 1,7 0,5 0,0 3,3(11,8) 1,0 109823[11-005.001 4,2 0,9 0,0 4,7 (0,0) 1,0 109823[11-006.001 1,3 0,4 0,0 2,3 (3,1) 1,0 109823(1 J-007.001 2,2 0,6 0,0 4,0(15,6) 0,5 Positivo 109823[11-008.001 1,0 0,5 0,0 3,1 (30,3) 0,8 Positivo 109823[11-009.001 0,0 0,0 0,0 0,0 (NT*) NT 109823[1]-010,001 4,1 1,3 1,8 3,8 (26,5) 1,0 109823[1 J-011.001 1,6 0,5 0,0 2,1 (7,8) 1,0 109823[1 ]-012.001 1,7 0,5 0,0 3,8(11,9) 0,3 Positivo 109823[1 ]-013.001 2,7 0,9 2,8 3,3(11,0) 1,0 109823[1]-014.001 0,9 0,5 0,0 1,7 (5,6) 1,0 109823(11-015.001 0,9 1,0 1,9 3,9 (8,8) 1,0 109823(11-016.001 0,7 0,5 0,0 3,6 (11,1) 1,0 109823(1 ]-017.001 3,4 0,6 0,0 3,0 (9,3) 1,0. 109823(11-018.001 1,7 0,4 0,0 2,9 (6,5) 1,0 109823(11-019.001 1,6 0,9 2,0 3,2 (8,1) 0,3 Positivo 109823(11-020,001 4,7 1,4 0,0 11,7(17,8) 0,8 Positivo 109823(11-021.001 1,1 0,6 0,0 1,2 (9,2) 1,0 109823(11-022.001 1,8 0,0 0,0 0,0 (NT) NT 109823111-023.001 1,5 0,5 0,0 3,7 (7,8) 1'° 109823(11-024.001 1,0 0,6 0,0 3.0(13,5) 1,0 109823(11-025.001 1,3 0,0 0,0 0,0 (NT) NT 109823(11-026.001 1,2 0,5 1,9 1,9 (8,8) 0,8 Positivo 109823(11-027.001 1,3 0,0 0,0 0,0 (NT) NT 109823(11-028.001 1,6 0,0 2,2 1,9 (NT) NT 109823(11-029.001 3,3 0,6 0,0 1,8 (6,2) 1,0 109823(11-030,001 2,7 0,9 3,2 2,7(11,6) 0,8 Positivo 109823(1 J-031.001 0,8 0,5 0,0 1,3(11.2) 1,0 *Nível de Transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. Números em parênteses foram obtidos em repetições do ensaio.

**NT = Não testado Tabela 14. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas T0 compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPA70.

Vnálises Northern Evento qPCR 4o. de ntron (RNAi gram¬ Franscrito Comprimento siRNA** SpecR Cópia po de cabelo) RTL integral I = Pos AAD1 I = Positivo »er5* I = Pos 0 = ) = Neg ) = Negativo Neg 109818[1]-031.001 m 0,8 1 1,75 109818[1]-036.001 m 0,7 1 1,79 109818[1 ]-002.001 _ 1,1 1,87 109818[11-009.001 0,6 1 1,94 109818[11-016.001 0,9 1 1,95 109818[1]-005.001 1,0 1 1,96 109818[11-012.001 _ 0,6 1 2,05 109818[11-029.001 ■> 0,7 1 2,14 109818[11-001.001 0,9 1 2,15 1 1 109818[11-006.001 1,1 1 2,42 1 1 109818[11-027.001 _ 1,0 1 2,44 1 1 109818[11-014.001 m 1,2 1 2,48 1 1 109818[11-010,001 m 1,2 2,49 1 1 109818[11-017.001 m 0,9 2,51 1 1 ! 09818[1]-011.001 'm 0,9 2,59 1 109818[1]-007.001 m 0,8 1 2,67 1 1 109818[1 ]-004.001 _ 1,2 1 2,85 1 1 109818[1]-024.001 m 0,5 1 3,07 1 1 109818[1]-019.001 1,0 1 3,66 1 1 109818[1]-018.001 m 0,5 1 4,22 1 1 109818[11-026.001 _ 1,1 1 4,25 1 1 109818[1J-023.001 . 0,7 1 4,41 1 1 Vnálises Northern Evento qPCR 4a. de ntron (RNAi gram¬ Transcrito Comprimento SiRNA** SpecR Cópia po de cabelo) RTL integral I = Pos AAD1 I = Positivo *er5* I = Pos 0 = ) = Neg I = Negativo Neg 109818[1]-028.001 . 1,4 1 5,35 1 1 109818[1]-003.001 m 1,9 1 5,15 1 1 109818[6]-209.001 + 1,7 1 9,3 1 NT 109818[1 ]-040,001 1,1 1 gj*** NT NT I09818[1]-013.001 _ 1,8 1 0,97 109818[1 ]-008.001 + 1,0 1 6,88 109818[1 ]-015.001 + 1,1 1 5,89 109818[ 1 ]-020,001 + 0,9 0 I09818[1]-021.001 + 1,1 1 3,89 109818[1 ]-025.001 + 0,6 0 109818[11-032.001 + 1,1 1 3,22 109818[1]-039.001 + 1,2 1 3,38 109818[11-044.001 + 1,3 1 I09818[1J-046.001 + 1,2 1 109818[1]-022.001 0,0 0 109818[11-030,001 • 1,0 0 109818[1]-033.001 m 0,0 0 109818[1 ]-034.001 m 1,4 0 109818[11-035.001 _ 0,6 0 109818[11-037.001 _ 0,6 0 109818[11-038.001 _ 0,8 0 109818[1 ]-040,001 _ 1,1 1 109818[1 ]-041.001 _ 0,7 0 109818[1]-042.001 0,9 1 I09818[1]-043.001 1,2 1 t *

\nálises Northern Evento qPCR J0. de ntron (RNAi gram¬ Transcrito Comprimento siRNA** SpecR Cópia po de cabelo) RTL integral I = Pos AAD1 I = Positivo ser5* I = Pos 0 = ) = Neg ) = Negativo Neg 109818[1 ]-045.001 0,9 1 109818[11-047.001 _ 0,9 1 109818[1 ]-048.001 . 2,5 1 109818[11-049.001 _ 1,3 1 109818[1 ]-050,001 m 1,2 1 I09818[1]-051.001 1,0 1 109818[11-052.001 • 1,3 1 109818[ 1 ]-053.001 • 1,1 1 109818[11-054.001 . 1,5 1 109818[1 J-055.001 • 1,3 1 109818[11-056.001 . 1,1 109818[1 ]-187.001 . 0,7 1 109818[1 ]-188.001 1,2 1 I09818[1]-189.001 . 0,8 1 109818[1 ]-190,001 • 1,0 1 * Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5. Números em parênteses foram obtidos em repetições do ensaio.

**siRNA = Análise Northern blot para RNA de interferência curto *** NT = Não testado

Plantas Ti compreendendo construtos grampo de cabelo foram

analisadas conforme acima descrito e os resultados são dados nas Tabelas 15,16 e 17. Tabela 15. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas Ti compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de PP1-87B.

I Resultados de Northern Blot Evento Tecido RTL RTL Transcrito Transcrito de comprimen¬ Transcrito Alça de gram¬ to integral (Intensidade da Per5* po de cabelo** faixa) 109822[1]-001 .AJ001.031 Folha 43,7 0,11 Positivo (Sinal fraco) 109822[1 ]-009.001 AJ .032 Folha 24,3 0,10 Positivo (Sinal fraco) 109822[1 ]-009. AJ001.046 Folha 22,9 0,06 Positivo (Sinal fraco) 109822[1]-011 .AJ001.040 Folha 10,7 0,02 Positivo (Sinal fraco) 109822[1]-001 .AJ001.031 Raiz 19,0 0,03 Positivo (sinal muito fraco) 109822[1]-009.001 AJ.032 Raiz 20,3 0,02 Positivo (sinal muito fraco) 109822[1 ]-009.AJ001.046 Raiz 108,4 0,02 Positivo (sinal muito fraco) 109822[1]-011 .AJ001.040 Raiz 34,8 0,00 Negativo (sinal muito fraco) Controles Negativos B104=55265 Folha 0,0 0,00 Negativo (Nenhum sinal) 101556[93]-074.001 Folha 0,0 0,00 Negativo (Nenhum sinal) AJ.113*** B104=55265 Raiz 0,4 0,00 Negativo (Nenhum sinal) 101556[93]-074.001 Raiz 0,4 0,00 Negativo (Nenhum sinal) AJ.113 *Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5.

**Nível de transcrito com relação ao nível de alça de grampo de cabelo.

***Plantas 101556[93] são eventos transgênicos B104 que foram obtidos seguindo transformação mediada por Agrobacterium com um vetor binário pDAB101556 através dos métodos revelados aqui. Tabela 16. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas Ti

compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo de RPS6

Resultados de Northern Blot Evento Tecido RTL RTL Transcrito Transcrito de Comprimen¬ Transcrito Alça de grampo to Integral Per5* de cabelo** (Intensidade de faixa) 109823f1l-003.AJ001.031 Folha 8,9 0,33 Positivo (Sinal médio) 109823m-007.001AJ.032 Folha 8.7 0,30 Positivo (Sinal médio) 109823Γ11-007. AJ001.036 Folha 10,9 0,43 Positivo (Sinal médio) 109823Γ11-008. AJ001.041 Folha 34,1 0,86 Positivo (Sinal médio) 109823M1-012.001 AJ.034 Folha 12,7 0,28 Positivo (Sinal médio) 109823m-012.AJ001.032 Folha 14,8 0,33 Positivo (Sinal médio) 109823m-019.AJ001.034 Folha 10,3 0,33 Positivo (Sinal médio) 109823Π1-020. AJ001.036 Folha 9.8 0,24 Positivo (Sinal médio) 109823Γ11-026. AJ001.036 Folha 9.7 0,26 Positivo (Sinal médio) 109823ni-003.AJ001.031 Raiz 38,1 0,05 Positivo (Sinal médio) 109823ni-007.001AJ.032 Raiz 39,1 0,03 Positivo (Sinal médio) 109823Π1-007. AJ001.036 Raiz 11,1 0,07 Positivo (Sinal médio) 109823Π1-008. AJ001.041 Raiz 86.8 0,09 Positivo (Sinal médio) 109823m-012.001AJ.034 Raiz 109,1 0,06 Positivo (Sinal médio) 109823f1l-012.AJ001.032 Raiz 55.3 0,04 Positivo (Sinal médio) 109823ril-019.AJ001.034 Raiz 43,1 0,06 Positivo (Sinal médio) 109823Π1-020. AJ001.036 Raiz 11,1 0.10 Positivo (Sinal médio) 109823Γ11-026. AJ001.036 Raiz 32,9 0,03 Positivo (Sinal médio) ControIesNegativos BI04=55265 Folha 0,0 0.00 Negativo (Nenhum sinal) 101556[93]-074.001 Folha 0,0 0,00 Negativo (Nenhum sinal) AJ.113*** B104=55265 Raiz 0,4 0,00 Negativo (Nenhum sinal) 101556[931-074.001 AJ. 113 Raiz 0,4 0,00 Negativo (Nenhum sinal) *Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5.

**Nível de transcrito com relação ao nível de alça de grampo de cabelo.

***Plantas 101556[93] são eventos transgênicos B104 que foram obtidos seguindo transformação mediada por Agrobacterium com um vetor binário pDAB101556 através dos métodos revelados aqui. Tabela 17. Resultados de análise molecular de plantas B104 transgênicas

Ti compreendendo um construto codificando um dsRNA grampo de cabelo

de PRA70.

Resultados de Northern Blot Evento Classificação Tecido RTL Transcrito de da Raiz Transcrito Comprimento Per5* Integral 109818f11-001.001AJ.#1 0,75 Folha 11,2 Positivo 109818111-003. AJ001.#19 1 Folha 13,9 Positivo 109818f11-004.001AJ.#1 1 Folha 15,5 Positivo 109818[11-006. AJ001 .#2 0,5 Folha 16,6 Positivo 109818111-007. AJ001.#19 0,75 Folha 5,1 Negativo 109818[11-010,001AJ.#4 1 Folha 11,2 Positivo 109818Γ11-011.AJ001. #13 0,75 Folha 10,1 Positivo 109818f 11-013.AJ001.#7 1 Folha 0,2 Negativo 109818Γ11-017. AJ001 .#14 0,75 Folha 7,6 Positivo 109818Γ11-018. AJ001 .#5 0,1 Folha 6,8 Positivo 109818Γ11-019.AJ001 #7 0,25 Folha 7,1 Positivo 109818111-023. AJ001.#27 1 Folha 13,5 Positivo 109818Í11-024. AJ001 .#5 0,25 Folha 8,6 Positivo 109818Γ11-026. AJ001 .#13 0,5 Folha 7,6 Positivo 109818Γ11-027. AJ001.#8 0,5 Folha 6,7 Positivo 109818Π1-028. AJ001.#1 0,5 Folha 41,9 Positivo 109818Π1-040, AJ001. #7 0,75 Folha 5,8 Positivo 109818Í61-209.AJ001 .#22 0,25 Folha 15,8 Positivo 109818Γ11-001.001 AJ.#1 0,75 Raiz 16,7 Positivo 109818Γ11-003. AJ001. #19 1 Raiz 29,4 Positivo 109818f11-004.001 AJ.#1 1 Raiz 16,1 NT** 109818[11-006. AJ001 .#2 0,5 Raiz 11,1 NT 109818Γ11-007.AJ001 .#19 0,75 Raiz 7,3 NT 109818Π1-010,001 AJ.#4 1 Raiz 12,4 Positivo 109818ΓΠ-011.AJ001.#13 0,75 Raiz 17,8 Positivo 109818Í11-013.AJ001.#7 1 Raiz 3,0 Neqativo 109818[11-017.AJ001 .#14 0,75 Raiz 26,9 Positivo 109818[ 11-018. AJ001 .#5 0,1 Raiz 31,1 Positivo 109818Í11-019. AJ001 .#7 0,25 Raiz 28,1 Positivo 109818f1l-023.AJ001.#27 1 Raiz 26,4 Positivo 109818Γ11-024. AJ001 .#5 0,25 Raiz 29,7 Positivo 109818Γ11-026. AJ001.#13 0,5 Raiz 61,0 Positivo 109818Γ11-027. AJ001 .#8 0,5 Raiz 54,9 Positivo 109818f11-028. AJ001 .#1 0,5 Raiz 39,4 Positivo 109818Γ11-040, AJ001 .#7 0,75 Raiz 24,4 Positivo 109818f6l-209.AJ001.#22 0,25 Raiz 26,0 Positivo Controles Negativos B104 1 Folha 0,0 Negativo 101556*** 1 Folha 0,0 Negativo B104 1 Raiz 0,2 Negativo 101556 1 Raiz 5,8 Negativo *Nível de transcrito com relação ao nível de transcrito Per5.

**NT = Não testado

***Plantas 101556 são eventos transgênicos B104 que foram obtidos se-

guindo transformação mediada por Agrobacterium com um vetor binário pDAB101556 através dos métodos revelados aqui.

Os dados acima mostram que certas peste coleópteras, especi- almente pestes de plantas Diabrotica, podem ser controladas através do di- recionamento de certas transcritos produzidos nas pestes, através do conta- to das pestes com quantidades eficazes de dsRNA que hibridizam (isto é, são homólogos) para os transcritos-alvo.

EXEMPLO 9: Zea mavs Transaênico Compreendendo Seauências de Peste Coleóptera

a 20 plantas de Zea mays T0 transgênicas são geradas con- forme descrito no EXEMPLO 6. Mais 10-20 linhagens independentes de Zea mays Ti expressando dsRNA grampo de cabelo para um construto de RNAi I 140/142

conforme revelado nas SEQ ID NOs:1-7 são obtidas para provocação com lagarta da raiz do milho. Essas são confirmadas através de RT-PCR. RNA total de linhagens Ti independentes selecionadas é opcionalmente usado para RT-PCR com iniciadores projetados para se ligarem no íntron ST-LS1 5 do cassete de grampo de cabelo em cada um dos construtos de RNAi. Ain- da, iniciadores específicos para cada gene-alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene-alvo confirma a expressão do RNA 10 grampo de cabelo em cada Zea mays transgênico. Processamento do gram- po de cabelo dsRNA dos genes-alvo em siRNA é subsequentemente opcio- nalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hi- bridizações de blot de RNA.

Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays do tipo selvagem.

Genes ou seqüências de peste coleóptera-alvo selecionados pa- ra criação de dsRNA grampo de cabelo não têm nenhuma similaridade com nenhum gene ou seqüência de planta conhecido. Desta maneira, não é es- perado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos se 20 direcionando a esses genes ou seqüências tenha quaisquer efeitos prejudi- ciais sobre plantas transgênicas. No entanto, características de desenvolvi- mento e morfológicas de linhagens transgênicas são comparadas com plan- tas do tipo selvagem, bem como com aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor grampo de cabelo vazio. Características de 25 raiz, ramo, folhagem e reprodução de planta são comparadas. Não há qual- quer diferença observável em padrões de comprimento e crescimento de raiz de plantas transgênicas e do tipo selvagem. Características de ramo de planta tais como altura, números e tamanhos de folha, momento de floresci- mento, tamanho e aparência floral são similares. Em geral, não há quaisquer 30 diferenças morfológicas observáveis entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA-alvo quando culturadas in vitro e em solo na estufa. EXEMPLO 10: Zea mavs transaênico Compreendendo uma Seqüência de Peste Coleóptera e Construtos de RNAi Adicionais

Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma se- qüência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que se direciona a um organismo outro que não uma pes- te coleóptera é transformada através de WHISKERS® para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molé- cula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA se direcionando a um ge- ne compreendendo uma de SEQ ID NOs:1-7). Transformação mediada por WHISKERS® é empregada para produzir Preparações de moléculas de DNA de transformação de planta preparadas essencialmente conforme descrito no EXEMPLO 4 são aplicadas em culturas de célula de suspensão Hi-Il de milho obtidas de uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma seqüência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que se direciona a um organismo outro que não uma peste coleóptera.

EXEMPLO 11: Plantas Resistentes à Peste Coleóptera Transgênicas

Aplicação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA corresponden- do a genes-alvo e a subsequente absorção por pestes coleópteras através de alimentação resulta em sub-regulagem dos genes-alvo através de silen- ciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene-alvo é importante, crescimento, desenvolvimento e reprodução da peste coleóptera são afetados e, no caso de pelo menos uma de WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva à falha em infestar, se alimentar, se desenvolver e/ou reproduzir com sucesso ou leva à morte da peste coleóptera em um ou mais estágios de desenvol- vimento. A escolha de genes-alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então usadas para controlar pestes coleópteras. Cinco a dez réplicas de 10- linhagens transgênicas de Zea mays independentes para cada cons- truto de RNAi são provocadas com uma espécie de lagarta da raiz do milho. A provocação é duplicada para cada espécie de lagarta da raiz do milho. Sementes Ti de linhagens de RNAi são germinadas e plantas resistentes transferidas para meio de Knop modificado 10-15 dias após germinação. Sementes de Z mays de controle do tipo selvagem são germinadas ao mesmo tempo e usadas para infecção de lagarta da raiz do milho.

Há significantemente mais lagartas da raiz do milho sobreviven- tes (>50%) em controles do que em linhagens de Z. mays transgênicas alo- jando um ou mais construtos de RNAi. Abundância de iRNA é medida em lagartas da raiz do milho que se alimentam em raízes de plantas do tipo sel- vagem e transgênicas usando RT-PCR em tempo real quantitativa. Há signi- ficantemente mais moléculas de iRNA encontradas em linhagens de Zea mays transgênicas alojando um ou mais construtos de RNAi do que em plan- tas controle. Esses resultados indicam que as linhagens transgênicas pro- cessam siRNAs correspondendo a genes-alvo e que esses siRNAs estão disponíveis para absorção através da alimentação de lagartas da raiz do mi- lho. Sobretudo de maior importância, os resultados indicam que inibição me- diada por RNAi de todos os genes-alvo afeta crescimento, desenvolvimento e viabilidade da lagarta da raiz do milho-alvo. Além disso, moléculas de RNAi com seqüências incompatíveis com mais de 80% de identidade de se- qüência com genes-alvo afetam lagartas da raiz do milho de uma maneira similar a seqüências do tipo selvagem. O emparelhamento de seqüência incompatível com seqüências nativas para formar um dsRNA grampo de ca- belo no mesmo construto de RNAi fornece siRNAs processados por planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de pestes coleópteras que se alimentam.

Claims

1. Célula transgênica transformada com um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabmti- ca compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Dia- brotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabmtica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabmtica compreenden- do SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabro- tica compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7.

2. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleo- tídeo compreende ainda pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo sele- cionada do grupo consistindo em: (I)SEQ ID N°:1, o complemento de SEQ ID N°:1, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:1, uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compre- endendo SEQ ID N°:1, o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N0:1, uma se- qüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é trans- crita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:1, o com- plemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Di- abrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N0:1, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea compre- endendo SEQ ID N0:1, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um orga- nismo Diabrotiea compreendendo SEQ ID N°:1, um fragmento de pelo me- nos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nati- va compreendendo SEQ ID N°:1 e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação na- tiva de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N0:1; e (II) SEQ ID N°:2, o complemento de SEQ ID N°:2, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:2, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:2, uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea compre- endendo SEQ ID N°:2, o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea compreendendo SEQ ID N°:2, uma se- quência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é trans- crita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2, o com- plemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Di- abrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2, um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compre- endendo SEQ ID N°:2, o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um orga- nismo Diabrotiea compreendendo SEQ ID N°:2, um fragmento de pelo me- nos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2 e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação na- tiva de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:2.

3.de reivindicação desaparecida.

4. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor heterólogo.

5. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o organismo Diabrotiea é selecionado do grupo consistindo em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardl·, D. v. zeae\ D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undeeimpunctata Mannerheim.

6. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleo- tídeo compreende ainda pelo menos uma seqüência de nucleotídeo codifi- cando um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis.

7. Célula de acordo com a reivindicação 6, em que o polipeptí- deo de B. thuringiensis é selecionado do grupo consistindo em Cry3, Cry34 e Cry35.

8. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleo- tídeo é transcrito para produzir uma molécula de ácido ribonucleico de fila- mento duplo na célula.

9. Célula de acordo com a reivindicação 8, em que contato da molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo com uma peste coleóptera inibe a expressão de um ácido nucleico endógeno compreendendo uma se- qüência de nucleotídeo especificamente complementar à seqüência de nu- cleotídeo compreendida no polinucleotídeo.

10. Célula de acordo com a reivindicação 9, em que contato da molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo com a peste coleóptera mata ou inibe o crescimento, reprodução e/ou alimentação da peste coleóp- tera.

11. Célula de acordo com a reivindicação 8, em que a molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo compreende uma primeira, uma segunda e uma terceira seqüência de nucleotídeo, em que a primeira seqüência de nucleotídeo compreende o poli- nucleotídeo, em que a terceira seqüência de nucleotídeo é ligada à primeira seqüência de nucleotídeo através da segunda seqüência de nucleotídeo, e em que a terceira seqüência de nucleotídeo é substancialmente o complemento reverso da primeira seqüência de nucleotídeo, de maneira que as porções da molécula de ácido ribonucleico compreendendo cada uma das primeira e terceira seqüências de nucleotídeo hibridizam umas para as outras na molécula de ribonucleotídeo de filamento duplo.

12. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucle- otídeo é transcrito para produzir uma molécula de ácido ribonucleico de fila- mento simples com entre cerca de 19 e cerca de 30 nucleotídeos de com- primento.

13. Vetor de transformação de planta compreendendo pelo me- nos uma sequência(s) de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabroti- ca compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Dia- brotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotiea compreenden- do SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabro- tiea compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQIDN0J1 em que pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo é opera- velmente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula de plan- ta.

14. Célula transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 13.

15. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula procariótica.

16. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que a célula é uma célula eucariótica.

17. Célula de acordo com a reivindicação 16, em que a célula é uma célula de planta.

18. Planta compreendendo a célula como definida na reivindica- ção 17.

19. Semente da planta como definida na reivindicação 18, em que a semente compreende o polinucleotídeo.

20. Planta de acordo com a reivindicação 18, em que a pelo me- nos uma sequência(s) de nucleotídeo é expressa na planta como uma molé- cula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

21. Célula de acordo com a reivindicação 17, em que a célula é uma célula de Zea mays.

22. Planta de acordo com a reivindicação 18, em que a planta é Zea mays

23. Planta de acordo com a reivindicação 18, em que a pelo me- nos uma sequência(s) de nucleotídeo é expressa na planta como uma molé- cula de ácido ribonucleico, e a molécula de ácido ribonucleico inibe a ex- pressão de uma seqüência de nucleotídeo de peste coleóptera endógena especificamente complementar a pelo menos uma sequência(s) de nucleotí- deo quando a peste coleóptera ingere uma parte da planta.

24. Célula de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucle- otídeo compreende ainda mais de uma seqüência de nucleotídeo seleciona- da do grupo consistindo em: SEQ ID N°: 1; o complemento de SEQ ID N0:1; SEQ ID N°:2; o complemento de SEQ ID N°:2; SEQ ID N°:3; o complemento de SEQ ID N°:3; SEQ ID N°:4; o complemento de SEQ ID N°:4; SEQ ID N°:5; o complemento de SEQ ID N°:5; SEQ ID Ν°:6; ο complemento de SEQ ID Ν°:6; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6; o complemento de fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabroti- ca compreendendo qualquer uma das SEQ ID NoS:1-6; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-6; uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Dia- brotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6; e o complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nati- va compreendendo qualquer uma de SEQ ID NoS:1-6.

25. Produto de base produzido a partir de uma planta de acordo com a reivindicação 18, em que o produto de base compreende uma quanti- dade detectável do polinucleotídeo.

26. Método para controle de uma população de peste coleópte- ra compreendendo provisão de um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo que funciona quando do contato com a peste coleóptera para inibir uma função biológica dentro da peste coleóptera, em que o agente compreende um polinucleotídeo compreen- dendo pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID N°:7; o complemento de SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N°:7; uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabroti- ca compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID N°:7; uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Dia- brotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; o complemento de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreenden- do SEQ ID N°:7; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de codificação nativa de um organismo Diabro- tica compreendendo SEQ ID N°:7; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma seqüência de não codificação nativa de um organismo Diabrotiea que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID N°:7.

27. Método para controle de uma população de peste coleópte- ra, o método compreendendo: provisão de um agente compreendendo uma primeira e uma segunda seqüência de nucleotídeo que funciona quando do contato com a peste coleóptera para inibir uma função biológica dentro da peste coleóp- tera, em que a primeira seqüência de polinucleotídeo compreende uma região que exibe de a partir de cerca de 90% a cerca de 100% de identi- dade de seqüência com a partir de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotí- deos contíguos de SEQ ID N°:7, e em que a primeira seqüência de poli- nucleotídeo é especificamente hibridizada para a segunda seqüência de polinucleotídeo.

28 Método de acordo com a reivindicação 27, em que a primeira e/ou segunda seqüência de polinucleotídeo compreende ainda uma região que exibe de a partir de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de seqüência com a partir de 19 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de um gene de peste coleóptera selecionado do grupo consistindo em PPI-87B e RPA70.

29. Método para controle da população de uma peste coleópte- ra, o método compreendendo: provisão em uma planta hospedeiro de uma peste coleóptera de uma célula de planta transgênica como definida na reivindicação 1, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona quando do contato com uma peste coleóptera pertencente à população para inibir a expressão de uma sequência-alvo dentro da peste coleóptera e resulta em crescimento menor da peste coleóptera ou popula- ção de peste coleóptera, com relação ao crescimento em uma planta hospe- deiro da mesma espécie sem a célula de planta transformada.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a molécu- Ia de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de filamento duplo.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, em que a popula- ção de peste coleóptera é reduzida com relação a uma população de peste coleóptera que infesta uma planta hospedeiro da mesma espécie sem a cé- lula de planta transformada.

32. Método de controle de infestação de peste coleóptera de planta em uma planta, o método compreendendo provisão na dieta de uma peste coleóptera da célula como definida na reivindicação 1.

33. Método para aperfeiçoamento do rendimento de uma cultura de milho, o método compreendendo: produção de uma planta de milho transgênica a partir da célula como definida na reivindicação 21; e cultivo da planta de milho para permitir a expressão de uma mo- lécula de ácido nucleico compreendendo a pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo; em que expressão da molécula de ácido nucleico inibe infecção por peste coleóptera ou crescimento e perda de rendimento devido à infec- ção por peste coleóptera.

34. Método de acordo com a reivindicação 33, em que a molécu- la de ácido nucleico é uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene-alvo em uma peste coleóptera que contatou uma porção da planta de milho.

35. Método para produção de uma célula de planta transgênica, o método compreendendo: cultura da célula de planta transgênica como definida na reivin- dicação 1, sob condições suficientes para permitir desenvolvimento de uma cultura de célula de planta compreendendo uma pluralidade de células de planta transgênica; seleção das células de planta transgênica que integraram a pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo em seus genomas; avaliação das células de planta transgênica quanto à expressão de uma molécula de ácido ribonucleico codificada pela pelo menos uma se- quência(s) de nucleotídeo; e seleção de uma célula de planta transgênica que expressa a mo- lécula de ácido ribonucleico.

36. Método para produção de uma planta transgênica resistente à peste coleóptera, o método compreendendo: provisão da célula de planta transgênica produzida através do método como definido na reivindicação 35; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada pela pelo menos uma seqüên- cia^) de nucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera que contata a planta transgênica.

37. Método para produção de uma célula de planta transgênica, método compreendendo: transformação de uma célula de planta com um vetor compreen- dendo um meio para provisão de resistência à peste coleóptera a uma plan- ta; cultura da célula de planta transformada sob condições suficien- tes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta com- preendendo uma pluralidade de células de planta transformadas; seleção das células de planta transformadas que integraram o meio para prover resistência à peste coleóptera a uma planta em seus ge- nomas; avaliação das células de planta transformadas quanto à expres- são de um meio para inibição da expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera; e seleção de uma célula de planta que expressa o meio quanto à inibição da expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera.

38. Método para produção de uma planta transgênica resistente à peste coleóptera, o método compreendendo: provisão da célula de planta transgênica produzida através do método como definido na reivindicação 37; e regeneração de uma planta transgênica a partir da célula de planta transgênica, em que expressão do meio para inibição da expressão de um gene essencial em uma peste coleóptera é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma peste coleóptera que contata a planta transformada.