BRPI1107332A2 - polinucleotídeo, vetor de transformação, moléculas de ácido nucleico, célula, bem como métodos para controle de praga coleóptera, para aperfeiçoamento do rendimento de cultura de milho, e para produção de célula e planta resistentes à praga coleóptera - Google Patents

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Abstract

patente de invenção: "moléculas de ácido nucleico que visam a subunidade c da atpase vacuolar e conferem resistência às pragas coleópteras". a presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucleico e a métodos para uso das mesmas para controle de pragas coleópteras através de inibição mediada por interferência de rna de sequências de codificação e não codificação transcritas alvo em pragas coleópteras. a invenção refere- se também a métodos para fabricação de plantas transgênicas que expres- sam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pragas coleópteras e a células de plantas e plantas então obtidas.

Description

(54) Título: POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE TRANSFORMAÇÃO, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO, CÉLULA, BEM COMO MÉTODOS PARA CONTROLE DE PRAGA COLEÓPTERA, PARA APERFEIÇOAMENTO DO
RENDIMENTO DE CULTURA DE MILHO, E PARA PRODUÇÃO DE CÉLULA E PLANTA RESISTENTES À PRAGA COLEÓPTERA (51) Int. Cl.: C12N 15/113; C12N 15/82; C12N 5/10; C12N 15/12; A01H 5/00 (30) Prioridade Unionista: 30/12/2010 US 61/428,608 (73) Titular(es): DOW AGROSCIENCES LLC (72) Inventor(es): HUARONG LI; CHAOXIAN GENG; MONICA BRITT OLSON; NAVIN ELANGO; KENNETH E. NARVA; IGNACIO LARRINUA; MATTHEWJ. HENRY (85) Data do Início da Fase Nacional:
30/12/2011 (57) Resumo: Patente de invenção: MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO QUE VISAM A SUBUNIDADE C DA ATPASE VACUOLAR E CONFEREM RESISTÊNCIA Às PRAGAS COLEÓPTERAS. A presente invenção refere-se a moléculas de ácido nucléico e a métodos para uso das mesmas para controle de pragas coleópteras através de inibição mediada por interferência de RNA de sequências de codificação e não codificação transcritas alvo em pragas coleópteras. A invenção refere- se também a métodos para fabricação de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucléico úteis para o controle de pragas coleópteras e a células de plantas e plantas então obtidas.
Figure BRPI1107332A2_D0001
Vv
T7
1/124
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para POLINUCLEOTÍDEO, VETOR DE TRANSFORMAÇÃO, MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA, BEM COMO MÉTODOS PARA CONTROLE DE PRAGA COLEÓPTERA, PARA APERFEIÇOAMENTO DO RENDIMENTO DE CULTURA DE MILHO, E PARA PRODUÇÃO DE CÉLULA E PLANTA RESISTENTES À PRAGA COLEÓPTERA.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se em geral a controle genético de dano à planta causado por pragas coleópteras. Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de sequências de codificação e não codificação alvo e ao uso de tecnologias de DNA recombinante para reprimir ou inibir transcripcionalmente expressão de sequências de codificação e não codificação alvo nas células de uma praga coleóptera para prover um efeito protetor à planta.
ANTECEDENTES
O verme da raiz do milho do oeste (WCR) (Western Corn Rootworm), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das espécies de verme da raiz do milho mais devastadoras na América do Norte e é uma preocupação particular em áreas de cultivo de milho do Meio Oeste dos Estados Unidos. O verme da raiz do milho do norte (NCR) (Northern Corn Rootworm), Diabrotica barberi Smith e Lawrence, é uma espécie intimamente relacionada que co-habita muito da mesma região que WCR. Há várias outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pragas significantes na América do Norte: o verme da raiz do milho Mexicano (MCR) (Mexican Corn Rootworm), D. virgifera zeae Krysan e Smith; o Verme da Raiz do Milho do Sul (SCR) (Southern corn Rootworm), D. undecimpunctata howardi Barber; D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. O Departamento de Agricultura dos Estados Unidos atualmente estima que os vermes da raiz do milho causem um bilhão de dólares em perda de ganho a cada ano, incluindo 800 milhões de dólares em perda de rendimento e 200 milhões de custos de tratamento.
Ambos o WCR e o NCR são depositados no solo como ovos duSegue-se folha 1a/124
1a/124 rante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo durante o inverno. Os ovos são oblongos, brancos e de menos de 0,1 mm (0,004 polegada) de comprimento. As larvas saem do ovo no final de maio ou início de junho,
Figure BRPI1107332A2_D0002
Segue-se folha 2/124
2/124 com momento preciso da saída do ovo variando de ano para ano devido a diferenças em temperatura e localização. As larvas recém-saídas do ovo são vermes brancos que são de menos do que 3,18 mm (0,125 polegada) de comprimento. Uma vez tendo saído do ovo, as larvas começam a se alimentar de raízes de milho. Os vermes da raiz do milho passam por três estágios larvais. Após se alimentarem por várias semanas, as larvas mudam para o estágio pupal. Elas eclodem no solo e então elas emergem do solo como adultos em julho e agosto. Vermes adultos são de cerca de 6,35 mm (0,25 polegada) de comprimento.
Larvas do verme da raiz do milho completam o desenvolvimento em milho e várias outras espécies de grama. Larvas que crescem em rabo de raposa amarelo emergem mais tarde e têm um tamanho de cápsula de cabeça menor como adultos do que as larvas que crescem em milho. Ellsbury e outros (2005) Environ. Entomol. 34:627-34. Adultos de WCR se alimentam de seda, pólen e grãos de milho em pontas de espiga expostas. Se adultos de WCR emergirem antes dos tecidos reprodutores de milho estarem presentes, eles podem se alimentar de tecido de folha, desta maneira deixando mais lento o crescimento da planta e ocasionalmente matando a planta hospedeira. No entanto, os adultos vão rapidamente mudar para sedas e pólen preferidos quando eles ficarem disponíveis. Adultos de NCR também se alimentam de tecidos reprodutores de planta de milho, mas em contraste raramente se alimentam de folhas de milho.
A maior parte do dano do verme da raiz do milho é causada por alimentação larval. Vermes da raiz recém-saídos do ovo inicialmente se alimentam em pelos de raiz de milho finos e se escondem nas pontas da raiz. Conforme as larvas ficam maiores, elas se alimentam e se escondem em raízes primárias. Quando vermes da raiz são abundantes, alimentação larval frequentemente resulta no corte de raízes até a base do caule do milho. Lesão de raiz severa interfere com a habilidade da raiz em transportar água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta e resulta em produção de grão reduzida, desta maneira frequentemente reduzindo drasticamente o rendimento geral. Lesão de raiz severa também resulta frequente3/124 mente em acomodação de plantas de milho, o que torna a colheita mais difícil e diminui mais o rendimento. Ainda, alimentação por adultos nos tecidos reprodutores de milho pode resultar em corte de sedas na ponta da espiga. Se este corte da seda for severo o suficiente durante dispersão do pólen, polinação pode ser interrompida.
Controle de vermes da raiz do milho pode ser tentado através de rotação de cultura, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva de formação de esporo, Bacillus thuringiensis) ou uma combinação dos mesmos. Rotação de cultura sofre da desvantagem significante de imposição de restrições indesejadas ao uso da terra. Além disso, postura de ovos de algumas espécies de verme da raiz pode ocorrer em campos de soja, desta maneira mitigando a eficácia de rotação de cultura praticada com milho e soja.
Inseticidas químicos são a estratégia mais pesadamente recorrida para obter controle de verme da raiz do milho. Uso de inseticida químico, no entanto, é uma estratégia de controle de verme da raiz do milho imperfeita; mais de 1 bilhão de dólares podem ser perdidos nos Estados Unidos a cada ano devido ao verme da raiz do milho quando os custos de inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano do verme da raiz que pode ocorrer apesar do uso dos inseticidas. Populações grandes de larvas, chuvas fortes e aplicação inapropriada do(s) inseticida(s) podem resultar em controle do verme da raiz do milho inadequado. Ainda, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar linhagens de verme da raiz resistentes a inseticida, bem como criar preocupações ambientais significantes devido à toxidez de muitos deles para espécies não alvo.
Interferência de RNA (RNAi) é um processo utilizando cursos celulares endógenos, com o que uma molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para toda, ou qualquer porção de tamanho adequado, uma sequência de gene alvo resulta na degradação do mRNA então codificado. Nos últimos anos, RNAi tem sido usada para realizar inativação de gene em várias espécies e sistemas experimentais; por exemplo, C. elegans, plantas, embriões de inseto e células
4/124 em cultura de tecido. Vide, por exemplo, Fire e outros (1998) Nature 391:806-11; Martinez e outros (2002) Cell 110:563-74; McManus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-47.
RNAi realiza degradação de mRNA através de um curso endógeno incluindo o complexo de proteína DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, chamados RNA de interferência pequeno (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de fita simples: a fita passageiro e a fita guia. A fita passageiro é degradada, e a fita guia é incorporada ao complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). Moléculas de ácido ribonucleico microinibidoras (miRNA) podem ser similarmente incorporadas em RISC. Silenciamento de gene pós-transcripcional ocorre quando a fita guia se liga especificamente a uma sequência complementar de uma molécula de mRNA e induz divagem pela Argonauta, o componente catalítico do complexo de RISC. Este processo é conhecido se espalhar sistemicamente pelo organismo apesar das concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA em alguns eucariontes tais como plantas, nematóides e alguns insetos.
Apenas transcritos complementares ao siRNA e/ou miRNA são clivados e degradados, e então a inativação de expressão de mRNA é específica de sequência. Em plantas, vários grupos funcionais de genes de DICER existem. O efeito de silenciamento de gene de RNAi persiste por dias e, sob condições experimentais, pode levar a um declínio em abundância do transcrito direcionado de 90% ou mais, com redução consequente em níveis da proteína correspondente.
A Patente U.S. 7.612.194 e as Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, US 2010/0192265 e US 2011/0154545 revelam uma biblioteca de 9112 sequências de sequência tag expressa (EST) (Expressed Sequence Tag) isoladas de pulpas de D. v. virgifera LeConte. É sugerido na Patente U.S. No. 7.612.194 e na Publicação de Patente U.S. No. US 2007/0050860 ligar operavelmente a um promotor uma molécula de ácido nucléico que é complementar a uma de várias sequências parciais particulares de H+-ATPase tipo vacuolar de D. V. virgifera (V-ATPase) reveladas aqui
5/124 para a expressão de RNA de antissenso em células de planta. A Publicação de Patente U.S. No. 2010/0192265 sugere ligar operavelmente um promotor a uma molécula de ácido nucléico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de D. v. virgifera de função desconhecida e não revelada (a sequência parcial é declarada ser 58% idêntica ao produto de gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA de antissenso em células de planta. A Publicação de Patente U.S. No. 2011/0154545 sugere ligar operavelmente um promotor a uma molécula de ácido nucléico que é complementar a duas sequências parciais complementares de genes da subunidade beta de coatomer de D. v. virgifera para a expressão de RNA de antissenso em células de planta. Ainda, a Patente U.S. 7.943.819 revela uma biblioteca de 906 sequências de sequência tag expressa (EST) isoladas de larvas, pulpas e larvas muito pequenas dissecadas de D. v. virgifera LeConte, e sugere ligar operavelmente um promotor a uma molécula de ácido nucléico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene 4b de proteína de corpo multivesicular carregado de D. v. virgifera para a expressão de RNA de fita dupla em células de planta.
Nenhuma sugestão adicional é provida na Patente U.S. 7.612.194 e Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/0050860, US 2010/0192265 e US 2011/0154545 para usar qualquer sequência particular das mais de nove mil sequências listadas aqui para interferência de RNA, que não as várias sequências parciais particulares de V-ATPase e as sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Ainda, nenhuma das Patente U.S. 7.612.194 e Publicações de Patente U.S. Nos. US 2007/0050860 e US 2010/0192265 e US 2011/0154545 provê qualquer orientação das quais outras das nove mil sequências providas seriam letais, ou até mesmo de outra maneira úteis, em espécies de verme da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. A Patente U.S. 7.943,819 não provê nenhuma sugestão de usar nenhuma sequência particular das mais de novecentas sequências listadas aqui para interferência de RNA, que não a sequência parcial particular de um gene 4b de proteína de corpo multivesicular carregado. Ainda, a Patente U.S. 7.943.819 não provê nenhuma orientação
6/124 de quais outras das mais de novecentas sequências providas seriam letais, ou até mesmo de outra maneira úteis, em espécies de verme da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA.
A maioria esmagadora das sequências complementares a DNAs de verme da raiz do milho (tal como o acima) não é letal em espécies de verme da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum e outros (2001) descrevem os efeitos de inibição de vários alvos de gene de WCR por RNAi. Esses autores relataram que os 8 de 26 genes que eles testaram não eram capazes de prover mortalidade de praga coleóptera experimentalmente significante em uma concentração de iRNA muito alta (por exemplo, dsRNA) de mais de 520 ng/cm2.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
São reveladas aqui moléculas de ácido nucléico (por exemplo, genes alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs), e métodos de uso das mesmas, para o controle de pragas coleópteras incluindo, por exemplo, D. v. virgifera LeConte (verme da raiz do milho do oeste, WCR); D. barberi Smith e Lawrence (verme da raiz do milho do norte, NCR); D. u. howardi Barber (verme da raiz do milho do sul, SCR); D. v. zeae Krysan e Smith (verme da raiz do milho Mexicano, MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. Em exemplos particulares, moléculas de ácido nucléico exemplares são reveladas, as quais podem ser homólogas a pelo menos uma porção de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas em uma praga coleoptera.
Nesses e em exemplos adicionais, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene alvo, cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutor; ou envolvido em desenvolvimento larval. Em alguns exemplos, inibição pós-tradução da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência homóloga a ela pode ser letal em pragas coleópteras ou resulta em crescimento e/ou reprodução reduzida. Em exemplos específicos, pelo menos um gene selecionado da lista consistindo em D_vir_c47185_Caf1180; D_vir_c1229_VatpaseC;
7/124
D_vir_c1319_vatpaseH; e Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 pode ser selecionado como um gene alvo para silenciamento pós-traducional. Em exemplos particulares, um gene alvo útil para inibição pós-traducional é uma subunidade C de ATPase vacuolar compreendendo uma sequência de nucleotídeo referida aqui como D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2) ou um homólogo da mesma. Moléculas de ácido nucléico isoladas compreendendo a sequência de D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2), seu complemento e certos fragmentos novos de qualquer um são então reveladas aqui.
São também reveladas moléculas de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácido dentro de um produto de gene alvo (por exemplo, o produto de um gene selecionado do grupo consistindo em D_vir_c47185_Caf1180; D_vir_c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_VatpaseH; e Contig_01_Rho1_1-191_CDC42). Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácido dentro de um polipeptídeo codificado por um gene de subunidade C de ATPase vacuolar compreendendo uma sequência de nucleotídeo referida aqui como D_vir_c1229_Vatpase (SEQ ID NO:2), ou um homólogo da mesma. São ainda reveladas moléculas de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntico a uma sequência de aminoácido dentro de um produto de gene alvo.
São também reveladas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene alvo de praga coleóptera, por exemplo: D_vir_c47185_Caf 1180; D_vir_ c1229_VatpaseC; D_vir_c1319_VatpaseH; e/ou Contig_01_Rho1_1191_CDC42. Em modalidades particulares, dsRNAs, síRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Em exemplos particu8/124 lares, moléculas de cDNA são reveladas, as quais podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a toda ou parte de D_vir_c1229_VatpaseC, ou certos fragmentos novos da mesma.
São revelados ainda meios para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera e meios para provisão de resistência à praga coleóptera a uma planta. Um meio para inibição da expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera é uma molécula de RNA de fita simples ou duplo consistindo em qualquer uma das SEQ ID NOs: 7, 8, 10, 11, 49, 50, 86, 87, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 127, 128, 129, 130, 131 ou o complemento das mesmas. Um meio para provisão de resistência à praga coleóptera a uma planta é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando um meio para inibição de expressão de um gene essencial em uma praga coleóptera operavelmente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada ao genoma de uma planta de milho.
São revelados métodos para controle de uma população de uma praga coleóptera compreendendo provisão a uma praga coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que funciona ao ser absorvida pela praga coleóptera para inibir uma função biológica dentro da praga coleóptera, em que a molécula de iRNA compreende toda ou parte de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:1; o complemento da SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; o complemento da SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; o complemento da SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento da SEQ ID NO:4; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:1-4; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4; e o complemento de uma sequência de
9/124 não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:1-4.
Em exemplos particulares, são revelados métodos para controle de uma população de uma praga coleóptera compreendendo provisão a uma praga coleóptera de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que funciona ao ser absorvida pela praga coleóptera para inibir uma função biológica dentro da praga coleóptera, em que a molécula de iRNA compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: toda ou parte de SEQ ID NO:1; o complemento de toda ou parte de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento de SEQ ID NO:4; toda ou parte de SEQ ID NO:5; toda ou parte do complemento de SEQ ID NO:5; toda ou parte de SEQ ID NO:6; toda ou parte do complemento de SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; o complemento de SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; o complemento de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:112; o complemento de SEQ ID NO:112; SEQ ID NO:113; o complemento de SEQ ID NO: 113; toda ou parte de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO:1; toda ou parte do complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:1; toda ou parte de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:1; e toda ou parte do complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:1;
São também revelados aqui métodos em que dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser providos a uma praga coleóptera em um ensaio baseado em dieta, ou em células de planta geneticamente modificadas expressando os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs. Nesses exemplos e em exemplos adicionais, os dsRNAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs podem ser ingeridos por larvas de praga coleóptera. Ingestão de dsR10/124
NAs, siRNAs, miRNAs e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar em RNAi na larva, que por sua vez pode resultar em silenciamento de um gene essencial para viabilidade da praga coleóptera e levando por fim à mortalidade larval. Desta maneira, são revelados métodos em que moléculas de ácido nucleico compreendendo sequência(s) de ácido nucleico exemplar útil para controle de pragas coleópteras são providas a uma praga coleóptera. Em exemplos particulares, a praga coleóptera controlada pelo uso de moléculas de ácido nucleico da invenção pode ser WCR ou NCR.
As características acima e outras se tornarão mais aparentes a partir da Descrição Detalhada que segue de várias modalidades, que prossegue com referência às Figuras acompanhantes.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
A FIGURA 1 inclui uma figura da estratégia usada para prover moldes específicos para produção de dsRNA.
A FIGURA 2 inclui um gráfico de variabilidade para a inibição de crescimento de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares.
A FIGURA 3 inclui um gráfico de variabilidade para a mortalidade de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares.
A FIGURA 4 inclui um gráfico de variabilidade adicional para a inibição do crescimento de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácido nucleico exemplares.
A FIGURA 5 inclui uma mostra com desenho de várias sequências de nucleotídeo que podem estar presentes em certas moléculas de ácido nucleico da invenção. Onde indicado, (sequência) refere-se a uma região da sequência de ácido nucleico mostrada tendo qualquer comprimento e sequência particular, por exemplo, e sem limitação, um segmento contíguo de uma de SEQ ID NOs:1-4. Regiões em Itálico das sequências de nucleotídeo mostradas são opcionais.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
As sequências de ácido nucleico listadas na listagem de se11/124 quência acompanhante são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, conforme definido em 37 C.F.R. § 1.822. Apenas uma de cada sequência de ácido nucléico é mostrada, mas a fita complementar e a fita complementar reversa são compreendidas como incluídas por qualquer referência à fita exibida. Na listagem de sequência acompanhante:
SEQ ID NO:1 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c47185_Caf1180 ou Caf1180.
SEQ ID NO:2 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c1229_VatpaseC ou VatpaseC.
SEQ ID NO:3 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como D_vir_c1319_VatpaseH ou VatpaseH.
SEQ ID NO:4 mostra uma sequência de cDNA de Diabrotica exemplar, referida em alguns lugares como Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 ou Rho1.
SEQ ID NOs:5-8 mostram fragmentos não contíguos exemplares de um cDNA de subunidade C de ATPase vacuolar de Diabrotica.
SEQ ID NOs:9-11 mostram fragmentos não contíguos exemplares de um cDNA de subunidade H de ATPase vacuolar de Diabrotica
SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência promotora de fago T7.
SEQ ID NOs: 13-38 mostram iniciadores usados para amplificar porções de regiões de codificação de genes alvo exemplares através de PCR.
SEQ ID NOs:39-48 mostram iniciadores usados para amplificar regiões de gene de Caf1-180 e VatpaseC para síntese de RNA grampo de cabelo.
SEQ ID NO:49 mostra uma sequência de DNA de formação de
RNA grampo de cabelo de Caf1-180 contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID
NO:136) para um vetor de expressão de versão 1 que contém uma sequên12/124 cia de consenso de milho.
SEQ ID NO:50 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de VatpaseC contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) para um vetor de expressão de hpRNA versão 1 que contém uma sequência de consenso de milho.
SEQ ID NO.51 mostra uma sequência de DNA de região 1 de anexina.
SEQ ID NO:52 mostra uma sequência de DNA de região 2 de anexina.
SEQ ID NO:53 mostra uma sequência de DNA de região 1 de beta espectrina 2.
SEQ ID NO:54 mostra uma sequência de DNA de região 2 de beta espectrina 2.
SEQ ID NO:55 mostra uma sequência de DNA de região 1 de mtRP-L4.
SEQ ID NO:56 mostra uma sequência de DNA de região 2 de mtRP-L4.
SEQ ID NO:57 mostra uma sequência de DNA codificando uma
YFP.
SEQ ID NOs:58-85 mostram iniciadores usados para amplificar regiões de gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para síntese de dsRNA.
SEQ ID NO:86 mostra um fragmento amplificado de 260 pb exemplar de um cDNA de D_vir_c47185_Caf1-180 que foi usado como um molde para a síntese de uma molécula de dsRNA.
SEQ ID NOs:87-90 mostram fragmentos não contíguos exemplares de um cDNA de Rho1 de Diabrotica.
SEQ ID NO:91 mostra uma sequência de DNA de formação de
RNA grampo de cabelo de Caf1-180 exemplar contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO:136), incluindo um sítio de clonagem opcional flanqueando o intron, para uma versão 1 de vetor de expressão que contém uma sequência de consenso de milho.
13/124
SEQ ID NO:92 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de Caf1-180 exemplar contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 2 que não contém a sequência de consenso de milho.
SEQ ID NO:93 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de VatpaseC exemplar contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136), incluindo um sítio de clonagem opcional flanqueando o intron, para uma versão 1 de vetor de expressão de hpRNA que contém uma sequência de consenso de milho.
SEQ ID NO:94 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de VatpaseC exemplar contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID ΝΟ.Ί36) para uma versão 2 de vetor de expressão de hpRNA que não contém a sequência de consenso de milho.
SEQ ID NO:95 mostra um segmento exemplar de uma fita de senso de DNA de Caf1-180 contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 3.
SEQ ID NO:96 mostra um segmento exemplar de uma fita de antissenso de DNA de Caf1-180 para uma versão 3 do vetor de expressão.
SEQ ID NO:97 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de Caf1-180 contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) para um vetor de expressão versão 3.
SEQ ID NO:98 mostra um segmento exemplar de uma fita de senso de DNA de VatpaseC contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO.136) para um vetor de expressão versão 3.
SEQ ID NO:99 mostra um segmento exemplar de uma fita de antissenso de cDNA de VatpaseC para um vetor de expressão versão 3.
SEQ ID NO: 100 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de VatpaseC contendo um intron de ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) para um vetor de expressão versão 3.
SEQ ID NO:101 mostra um segmento exemplar de uma fita de senso de DNA de VatpaseC contendo um intron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) para um vetor de expressão versão 4.
14/124
SEQ ID NO: 102 mostra um segmento exemplar de uma fita de antissenso de DNA de VatpaseC para um vetor de expressão versão 4.
SEQ ID NO: 103 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de VatpaseC contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) para um vetor de expressão versão 4.
SEQ ID NO: 104 mostra um segmento exemplar de uma fita de senso de DNA de VatpaseH contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) pra um vetor de expressão versão 1.
SEQ ID NO: 105 mostra um segmento exemplar de uma fita de antissenso de DNA de VatpaseH para um vetor de expressão versão 1.
SEQ ID NO: 106 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de VatpaseH contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) para um vetor de expressão versão 1.
SEQ ID NO: 107 mostra um segmento exemplar de uma fita de senso de DNA de Rho1 contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO:136) para um vetor de expressão versão 1.
SEQ ID NO: 108 mostra um segmento exemplar de uma fita de antissenso de DNA de Rho1 para um vetor de expressão versão 1.
SEQ ID NO: 109 mostra uma sequência de DNA de formação de RNA grampo de cabelo de Rho1 exemplar contendo um íntron ST-LS1 (SEQ ID NO: 136) para um vetor de expressão versão 1.
SEQ ID NO:110 mostra um segmento exemplar de um DNA de Caf-180 usado para prover um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:111 mostra um segmento exemplar de DNA de região 1 de VatpaseC usado para prover um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID ΝΟ.Ί12 mostra um segmento exemplar de um DNA (curto) de região 1 de VatpaseC usado para prover um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:113 mostra um segmento exemplar de um DNA de região 2 de VatpaseC usado para prover um molde para síntese de dsRNA
15/124 em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:114 mostra um segmento exemplar de um DNA de região 1 de VatpaseC usado para prover um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID ΝΟ.Ί15 mostra um segmento exemplar de um DNA de região 2 de VatpaseH usado para prover um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:116 mostra um segmento exemplar de um DNA de Rho1 usado para prover um molde para síntese de dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:117 mostra uma fita de senso de RNA de VatpaseC exemplar (VatpaseC5’-‘15) usado como um dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:118 mostra uma fita de senso de RNA de VatpaseC 15 exemplar adicional (VatpaseC5’-25) usado como um dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:119 mostra uma fita de senso de RNA de VatpaseC exemplar adicional (VatpaseC3’-15) usado como um dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO: 120 mostra uma fita de senso de RNA de VatpaseC exemplar (VatpaseC3’-25) usado como um dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NOs:121-126 mostram iniciadores usados para amplificar porções de um gene de VatpaseC de Diabrotica como moldes para sín25 tese de dsRNA.
SEQ ID ΝΟ.Ί27 mostra uma fita de senso de VatpaseC exemplar (VatpaseC5’-50) usado como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO: 128 mostra uma fita de senso de VatpaseC exem30 piar (VatpaseC5’-100) usado como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO:129 mostra uma fita de senso de VatpaseC exem16/124 piar (VatpaseC-174) usado como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO: 130 mostra uma fita de senso de VatpaseC exemplar (VatpaseC3’-50) usado como um molde para dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NO: 131 mostra uma fita de senso de VatpaseC exemplar (VatpaseC3’-100) usado como um dsRNA em bioensaios de alimentação de dieta.
SEQ ID NOs: 132-135 mostram iniciadores usados para análises 10 moleculares de milho transgênico.
SEQ ID NO:136 mostra um íntron ST-LS1 que pode ser útil em algumas modalidades para formação de um RNA grampo de cabelo.
SEQ ID NOs: 137-138 mostram fragmentos não contíguos exemplares de um cDNA de Rho1 de Diabrotica.
DESCRIÇÃO DETALHADA
/. Visão geral de várias modalidades
São revelados aqui métodos e composições para controle genético de infestações por praga coleóptera. Métodos para identificação de um ou mais genes essenciais para o ciclo de vida de uma praga coleóptera para uso como um gene alvo para controle mediado por RNAi de uma população de praga coleóptera são também providos. Vetores de plasmídeo de DNA codificando moléculas de dsRNA podem ser projetados para suprimir um ou mais genes alvos essenciais para crescimento, sobrevivência, desenvolvimento e/ou reprodução. Em algumas modalidades, são providos métodos para repressão pós-transcripcional de expressão ou inibição de um gene alvo através de moléculas de ácido nucléico que são complementares a uma sequência de codificação ou não codificação do gene alvo em uma praga coleóptera. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, uma praga coleóptera pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA transcritas de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucléico que é complementar a uma sequência de codificação ou não codificação de um gene alvo, desta maneira provendo um efeito protetor para a
17/124 planta.
Desta maneira, algumas modalidades envolvem inibição específica de sequência de expressão de produtos de gene alvo, usando dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar a sequências de codifica5 ção e/ou não codificação do(s) gene(s) alvo para obter controle pelo menos parcial de uma praga coleóptera. É revelado aqui um conjunto de moléculas de ácido nucléico isoladas e purificadas compreendendo uma sequência de nucleotídeo, por exemplo, conforme mostrado em uma das SEQ ID NOs:1-8, 50, 93, 94, 98-103, 111-113 e 127-131. Em algumas modalidades, uma mo10 lécula de dsRNA estabilizada (SEQ ID NOs: 117-120) pode ser expressa a partir dessas sequências, seus fragmentos, ou um gene compreendendo uma dessas sequências, para o silenciamento pós-transcripcional ou inibição de um gene alvo. Em certas modalidades, moléculas de ácido nucléico isoladas e purificadas compreendem SEQ ID NO:2 e/ou toda ou parte de SEQ
ID NOs:5 e 6.
Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeiro recombinante (por exemplo, uma célula de planta) tendo em seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em modalidades particulares, a(s) molécula(s) de dsRNA podem ser expressas quando ingeridas por uma praga coleóptera para silenciar ou inibir pós-transcripcionalmente a expressão de um gene alvo na praga coleóptera. A sequência de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, qualquer uma de SEQ ID NOs:1-8, 50, 93, 94, 98-103, 111-113 e 127-131, fragmentos de qualquer uma de SEQ ID
NOs:1-8, 50, 93, 94, 98-103, 111-113 e 127-131, ou uma sequência parcial de um gene compreendendo uma de SEQ ID NOs:1-8, 5-. 93, 94, 98-103, 111-113 e 127-131 ou seus complementos.
Modalidades particulares envolvem uma célula hospedeiro recombinante tendo em seu genoma uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula(s) de iRNA (por exemplo, dsRNA) compreendendo toda ou parte de SEQ ID NO:2 e/ou toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6. Quando ingerida(s) por uma praga coleóp18/124 tera, a(s) molécula(s) de iRNA pode(m) silenciar ou inibir a expressão do gene da subunidade C de ATPase vacuolar alvo compreendendo SEQ ID NOs:2, 5-8, 112e113na praga coleóptera e desta maneira resulta em parada do crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação na praga coleóptera.
Em algumas modalidades, uma célula hospedeiro recombinante tendo em seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de dsRNA pode ser uma célula de planta transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas compreendendo tal célula de planta transformada. Em adição a tais plantas transgênicas, plantas progênies de qualquer geração de planta transgênica, sementes transgênicas e produtos de planta transgênica são todos providos, cada um deles compreende sequência(s) de DNA recombinante. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser expressa em uma célula de planta transgênica. Desta maneira, nessas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser isolada de uma célula de planta transgênica. Em modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo compreendendo plantas de milho (Zea mays), soja (Glycine max) e plantas da família Poaceae.
Algumas modalidades envolvem um método para modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de praga coleóptera. Nessas e em outras modalidades, uma molécula de ácido nucléico pode ser provida, em que a molécula de ácido nucléico compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA pode ser operavelmente ligada a um promotor e pode também ser operavelmente ligada a uma sequência de terminação de transcrição. Em modalidades particulares, um método para modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de praga coleóptera pode compreender: (a) transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA; (b) cultura da célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolví19/124 mento de uma cultura de célula de planta compreendendo uma pluralidade de células de planta transformadas; (c) seleção de uma célula de planta transformada que integrou o vetor em seu genoma; e (d) determinação que a célula de planta transformada selecionada compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada a partir de uma célula de planta que tem o vetor integrado em seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor.
Desta maneira, é também revelada uma planta transgênica compreendendo um vetor tendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Em modalidades particulares, expressão de uma molécula de dsRNA na planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de uma praga coleóptera que contata a planta ou célula de planta transformada, por exemplo, através de alimentação na planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula da planta. Plantas transgênicas reveladas aqui podem mostrar resistência e/ou tolerância aumentada a infestações por praga coleóptera. Plantas transgênicas particulares podem mostrar resistência e/ou tolerância aumentada a uma ou mais pragas coleópteras selecionadas do grupo consistindo em: WCR; NCR; SCR; MCR; D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.
São também revelados aqui métodos para aplicação de agentes de controle, tal como uma molécula de iRNA, a uma praga coleóptera. Tais agentes de controle podem causar, diretamente ou indiretamente, um dano na habilidade da praga coleóptera em se alimentar, crescer ou então causar dano a um hospedeiro. Em algumas modalidades, é provido um método compreendendo aplicação de uma molécula de dsRNA estabilizada a uma praga coleóptera para suprimir pelo menos um gene alvo na praga coleóptera, desta maneira reduzindo ou eliminando dano à planta por uma praga coleóptera. Em algumas modalidades, um método de inibição de expressão de
20/124 um gene alvo em uma praga coleóptera pode resultar na parada de crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação na praga coleóptera. Em algumas modalidades, o método pode eventualmente resultar em morte da praga coleóptera.
Em algumas modalidades, são providas composições (por exemplo, uma composição tópica) que compreendem uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA) da invenção para uso em plantas, animais e/ou no ambiente de uma planta ou animal para obter a eliminação ou redução de infestação de uma praga coleóptera. Em modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte de alimento a ser alimentada à praga coleóptera. Algumas modalidades compreendem fabricação de uma composição nutricional ou fonte de alimento disponível para a praga coleóptera. Ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na absorção das moléculas por uma ou mais células da praga coleóptera, que pode então resultar na inibição de expressão de pelo menos um gene alvo em célula(s) da praga coleóptera. Ingestão de ou dano a uma planta ou célula de planta por uma praga coleóptera pode ser limitada ou eliminada em ou sobre qualquer tecido hospedeiro ou ambiente em que a praga coleóptera está presente através da provisão de uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA da invenção no hospedeiro da praga coleóptera.
As composições e os métodos revelados aqui podem ser usados juntos em combinações com outros métodos e composições para controle de dano por pragas coleópteras. Por exemplo, uma molécula de iRNA conforme descrito aqui para proteção de plantas contra pragas coleópteras pode ser usada em um método compreendendo o uso adicional de um ou mais agentes químicos eficazes contra uma praga coleóptera, biopesticidas eficazes contra uma praga coleóptera, rotação de cultura ou técnicas genéticas recombinantes que exibem características diferentes das características dos métodos mediados por RNAi e composições de RNAi da invenção (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são prejudiciais para uma praga coleóptera (por exemplo, toxinas de B.t.)).
I
21/124
II. Abreviações dsRNAácido ribonucleico de fita dupla
Glinibição de crescimento
NCBINational Centerfor Biotechnology Information gDNADNA genômico iRNAácido ribonucleico inibidor ORFestrutura de leitura aberta RNAiinterferência de ácido ribonucleico miRNAácido ribonucleico inibidor micro siRNAácido ribonucleico inibidor pequeno hpRNAácido ribonucleico grampo de cabelo UTRregião não traduzida
WCRverme da raiz do milho do oeste (Diabrotica virgifera virgifera LeConte)
NCRverme da raiz do milho do norte (Diabrotica barberi Smith e
Lawrence)
MCRverme da raiz do milho Mexicano (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith)
PCRreação em cadeia da polimerase
RISCComplexo de Silenciamento induzido por RNA
SCRverme da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctata howardi Barber)
III. Termos
No relatório e nas tabelas que seguem, vários termos são usados. A fim de prover uma compreensão clara e consistente do relatório e das reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as definições que seguem são providas:
Praga coleóptera: conforme aqui usado, o termo praga coleóptera refere-se a insetos do gênero Diabrotica que se alimentam de milho e outras gramas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma praga coleóptera é selecionada da lista compreendendo D. v. virgifera LeConte (WCR); D.
barberi Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D.
I
22/124 balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.
Contato (com um organismo): Conforme aqui usado, o termo contato com ou absorção por um organismo (por exemplo, uma praga coleóptera), com relação a uma molécula de ácido nucléico, inclui internalização da molécula de ácido nucléico no organismo, por exemplo, e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, através de alimentação); contato do organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucléico; e embebimento de organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucléico.
Contig: Conforme aqui usado o termo contig refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída a partir de um conjunto de segmentos de DNA de sobreposição derivados de uma fonte genética única.
Planta de milho: Conforme aqui usado, o termo planta de milho refere-se a uma planta da espécie Zea mays (milho).
Expressão: Conforme aqui usado, expressão de uma sequência de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo através do qual a informação codificada de uma unidade transcripcional de ácido nucléico (incluindo, por exemplo, DNA ou cDNA genômico) é convertida em uma parte operacional, não operacional ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. Expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido ou organismo a um agente que aumenta ou diminui expressão de gene. Expressão de um gene pode também ser regulada em qualquer local no curso de DNA para RNA para proteína. Regulagem de expressão de gene ocorre, por exemplo, através de controles que agem sobre transcrição, tradução, transporte e processamento de RNA, degradação de moléculas intermediárias tal como mRNA ou através de ativação, inativação, compartimentalização ou degradação de moléculas de proteína específicas após elas terem sido feitas, ou através de suas combinações. Expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou no nível de proteína através de qualquer método conhecido na técnica incluindo, sem limitação, Northern blot, RT-PCR, Western blot ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in
23/124 situ ou in vivo.
Material genético: Conforme aqui usado, o termo material genético inclui todos os genes e moléculas de ácido nucléico, tais como DNA e RNA.
Inibição: Conforme usado aqui, o termo inibição, quando usado para descrever um efeito sobre uma sequência de codificação (por exemplo, um gene), refere-se a uma diminuição mensurável no nível celular de mRNA transcrito a partir da sequência de codificação e/ou peptídeo, ou produto de proteína da sequência de codificação. Em alguns exemplos, expressão de uma sequência de codificação pode ser inibida de maneira que a expressão é aproximadamente eliminada. Inibição específica refere-se à inibição de uma sequência de codificação alvo sem consequentemente afetar a expressão de outras sequências de codificação (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo realizada.
Isolado: Um componente biológico isolado (tal como um ácido nucléico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido separado de ou purificado de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente, isto é, outro DNA e RNA cromossomal e extracromossomal, e proteínas. Moléculas de ácido nucléico e proteínas que foram isoladas incluem moléculas de ácido nucléico e proteínas purificadas através de métodos de purificação padrão. O termo também compreende ácidos nucléicos e proteínas preparados através de expressão recombinante em uma célula hospedeiro, bem como moléculas de ácido nucleico, proteínas e peptídeos quimicamente sintetizados.
Molécula de ácido nucléico: Conforme aqui usado, o termo molécula de ácido nucléico pode se referir a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir ambas as fitas de senso e antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico e formas sintéticas e polímeros mistos dos acima. Um nucleotídeo pode se referir a um ribonucleotídeo, desoxirribonucieotídeo ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma molécula de ácido nucléico conforme aqui usado é sinônimo de ácido nucléico e polinucleotídeo. Uma molécula de ácido nucléico é geralmente de pelo menos 10 ba24/124 ses de comprimento, a menos que de outro modo especificado. A sequência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucléico é lida da extremidade 5’ para a 3’ da molécula por convenção. O complemento de uma sequência de nucleotídeo refere-se à sequência, de 5’ até 3’, das nucleobases que formam pares de base com as nucleobases da sequência de nucleotídeo (isto é, A-T/U e G-C). O complemento reverso de uma sequência de ácido nucleico refere-se à sequência, de 3’ até 5’, das nucleobases que formam pares de base com as nucleobases da sequência de nucleotídeo.
Moléculas de ácido nucléico incluem formas de fita simples e dupla de DNA; formas de fita simples de RNA; e formas de fita dupla de RNA (dsRNA). O termo sequência de nucleotídeo ou sequência de ácido nucleico refere-se a ambas as fitas de senso e antissenso de um ácido nucléico ou como fitas simples individuais ou no duplex. O termo ácido ribonucleico (RNA) é inclusivo de iRNA (RNA inibidor), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (RNA de interferência pequeno), mRNA (RNA mensageiro), miRNA (microRNA), hpRNA (RNA grampo de cabelo), tRNA (RNA de transferência), seja carregado ou descarregado com um aminoácido acilado correspondente) e cRNA (RNA complementar). O termo ácido desoxirribonucleico (DNA) é inclusivo de cDNA, DNA genômico e híbridos de DNA-RNA. Os termos segmento de ácido nucléico e segmento de sequência de nucleotídeo, ou com mais frequência segmento, serão compreendidos por aqueles versados na técnica como um termo funcional que inclui ambas as sequências genômicas, sequências de RNA ribossomal, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de operon e sequências de nucleotídeo engenheiradas menores que codificaram ou podem ser adaptadas para codificar; peptídeos, polipeptídeos ou proteínas.
Oligonucleotídeo: Um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucléico curto. Oligonucleotídeos podem ser formados através de divagem de segmentos de ácido nucléico mais longos ou através de polimerização de precursores de nucleotídeo individuais. Sintetizado res automáticos permitem a síntese de oligonucleotídeos até várias centenas de pares de base de comprimento. Devido ao fato dos oligonucleotídeos poderem se ligar a uma
25/124 sequência de nucleotídeo complementar, eles podem ser usados como sondas para detecção de DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodesoxirribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA e RNA (transcrito reverso em um cDNA). Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um primer, que permite que uma polimerase de DNA estenda o oligonucleotídeo e replique a fita complementar.
Uma molécula de ácido nucléico pode incluir ou um ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados juntos por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou de ocorrência não natural. Moléculas de ácido nucléico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, como será prontamente compreendido por aqueles versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, marcadores, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc; ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc; porções pendentes: por exemplo, peptídeos, intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc; quelantes; alquilantes; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucléicos alfa anoméricos, etc). O termo molécula de ácido nucléico também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, fita dupla, parcialmente duplexadas, triplexadas, grampo de cabelo, circulares e cadeado.
Conforme aqui usado com relação a DNA, o termo sequência de codificação, sequência de nucleotídeo estrutural ou molécula de ácido nucléico estrutural refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é por fim traduzida em um polipeptídeo, através de transcrição e mRNA, quando posta sob o controle de sequências reguladoras apropriadas. Com relação a RNA, o termo sequência de codificação refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é traduzida em um peptídeo, polipeptídeo ou proteína. Os limites de uma sequência de codificação são determinados por um códon de início de
26/124 tradução no terminal 5’ e um códon de parada de tradução no terminal 3’. Sequências de codificação incluem, mas não estão limitadas a: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeo recombinantes.
Genoma: Conforme aqui usado, o termo genoma refere-se a DNA cromossomal encontrado dentro do núcleo de uma célula e também refere-se a DNA organela encontrado dentro de componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula de planta de maneira que a molécula de DNA é integrada ao genoma da célula de planta. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser ou integrada ao DNA nuclear da célula de planta ou integrada ao DNA do cloroplasto ou mitocôndria da célula de planta. O termo genoma uma vez que ele se aplica a bactérias refere-se a ambos o cromossomo e os plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzia em uma bactéria de maneira que a molécula de DNA é integrada ao genoma da bactéria. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, a molécula de DNA pode ser ou cromossomalmente integrada ou localizada como ou em um plasmídeo estável.
Identidade de sequência: O termo identidade de sequência ou identidade, conforme usado aqui no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação especificada.
Conforme aqui usado, o termo porcentagem de identidade de sequência pode se referir ao valor determinado através de comparação de duas sequências otimamente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico) em uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições ou deleções (isto é, lacunas) comparado com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ótimo das duas sequências. A porcentagem é calculada através da determinação do número de posições nas quais o nucleotídeo ou resíduo de aminoácido idêntico ocorre em ambas as
27/124 sequências para dar o número de posições compatíveis, dividindo o número de posições compatíveis pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para dar a porcentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em cada posição em comparação com uma sequência de referência é dita ser 100% idêntica à sequência de referência, e vice-versa.
Métodos para alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos em, por exemplo: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math.
2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-44; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-3; Corpet e outros (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-90; Huang e outros (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-65; Pearson e outros (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-31; Tatiana e outros. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-50. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia pode se encontrada em, por exemplo, Altschul e outros (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10.
A Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul e ou20 tros, (1990)) do The National Center for Biotechnology Information (NCBI) está disponível de várias fontes, incluindo o National Center for Bíotechnology Information (Bethesda, MD), e na internet, para uso em conexão com vários programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar identidade de sequência usando este programa está disponível na internet sob a seção help para BLAST®. Para comparações de sequências de ácido nucléico, a função Blast 2 sequences do programa BLAST® (Blastn) pode se empregada usando o conjunto de matriz BLOSUM62 default para parâmetros de default. Sequências de ácido nucléico com similaridade ainda maior com as sequências de referência vão mostrar identidade de porcentagem alta quando avaliadas através deste método.
Especificamente hibridizável/Especificamente complementar:
Conforme aqui usado, os termos especificamente hibridizável e especifiI
28/124 camente complementar são termos que indicam um grau de complementaridade suficiente de maneira que ligação estável e específica ocorre entre a molécula de ácido nucléico e uma molécula de ácido nucléico alvo. Hibridização entre duas moléculas de ácido nucléico envolve a formação de um alinhamento antiparalelo entre as sequências de ácido nucléico das duas moléculas de ácido nucléico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações hidrogênio com bases correspondentes na fita oposta para formar uma molécula duplex que, se ela for suficientemente estável, é detectável usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de ácido não precisa ser 100% complementar à sua sequência alvo para ser especificamente hibridizável. No entanto, a quantidade de complementaridade de sequência que deve existir para hibridização ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.
Condições de hibridização resultando em graus de adstringência particulares vão variar dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e da composição e do comprimento das sequências de ácido nucléico de hibridização. Em geral, a temperatura de hibridização e a resistência iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) do tampão de hibridização vão determinar a adstringência de hibridização, embora tempos de lavagem e as composições de tampões de lavagem também influenciem a adstringência. Cálculos com relação a condições de hibridização requeridas para atingir graus particulares de adstringência são conhecidos daqueles versados na técnica e são discutidos, por exemplo, em Sambrook e outros (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11; e Hames e Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Instrução e orientação detalhadas adicionais com relação à hibridização de ácidos nucléicos podem ser encontradas, por exemplo, em Tijssen, OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, em Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel e outros, Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Capí29/124 tulo 2, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, NY, 1995.
Conforme aqui usado, condições adstringentes compreende condições sob as quais hibridização vai ocorrer apenas se houver menos do que 20% de incompatibilidade entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucléico alvo. Condições adstringentes incluem níveis de adstringência particulares adicionais. Desta maneira, conforme usado aqui, condições de adstringência moderada são aquelas sob as quais moléculas com mais de 20% de incompatibilidade de identidade de sequência não vão hibridizar; condições de alta adstringência são aquelas sob as quais sequências com mais de 10% de incompatibilidade não vão hibridizar; e condições de adstringência muito alta são aquelas sob as quais sequências com mais de 5% de incompatibilidade não vão hibridizar.
As condições que seguem são condições de hibridização representativas, não limitantes.
Condição de alta adstringência (detecta sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em tampão SSC 5x a 65° C por 16 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x em temperatura ambiente por 15 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 0,5x a 65° C por 20 minutos cada.
Condição de adstringência moderada (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridização em tampão SSC 5x-6x a 65-70° C por 16-20 horas; lavar duas vezes em tampão SSC 2x em temperatura ambiente por 5-20 minutos cada; e lavar duas vezes em tampão SSC 1x a 55-70° C por 30 minutos cada.
Condição de controle não adstringente (sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência vão hibridizar): Hibridização em tampão SSC 6x em temperatura ambiente para 55° C por 16-20 horas; lavagem pelo menos duas vezes em tampão SCC 2x-3x em temperatura ambiente para 55° C por 20-30 minutos cada.
Conforme aqui usado, o termo substancialmente homólogo ou homologia substancial, com relação a uma sequência de ácido nucléico
30/124 contígua, refere-se a sequências de nucleotídeo contíguas que hibridizam sob condições adstringentes para a sequência de ácido nucléico de referência. Por exemplo, sequências de ácido nucléico que são substancialmente homólogas a uma sequência de ácido nucléico de referência de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-6 são aquelas sequências de ácido nucléico que hibridizam sob condições adstringentes (por exemplo, as Condições de Adstringência Moderada mostradas, supra) para a sequência de ácido nucléico de referência de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-6. Sequências substancialmente homólogas podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, sequências substancialmente homólogas podem ter de a partir de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca dé 92%; cerca de 93%; cerca de 94%; cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada com hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico é especificamente hibridizável em que há um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não específica do ácido nucléico a sequências não alvo sob condições em que ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização adstringentes.
Conforme usado aqui, o termo ortólogo refere-se a um gene em duas ou mais espécies que se desenvolveu a partir de uma sequência de nucleotídeo ancestral comum e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.
Conforme usado aqui, duas moléculas de sequência de ácido nucléico são ditas exibir complementaridade completa quando cada nucleotídeo de uma sequência lida na direção 5’ a 3’ é complementar a cada nucleotídeo da outra sequência quando lida na direção 3’ a 5’. Uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeo de referência vai exibir uma sequência idêntica à sequência de complemento reversa da sequência de nucleotídeo de referência. Esses termos e descrições
31/124 são bem definidos na técnica e são facilmente compreendidos por aqueles versados na técnica.
Operavelmente ligado: Uma primeira sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada com uma segunda sequência de ácido nucléico quando a primeira sequência de ácido nucléico está em uma relação funcional com a segunda sequência de ácido nucléico. Quando recombinantemente produzidas, sequências de ácido nucléico operavelmente ligadas são geralmente contíguas e, em que necessário juntar duas regiões de codificação de proteína, na mesma estrutura de leitura (por exemplo, em uma ORF policistrônica). No entanto, ácidos nucléicos não precisam ser contíguos para serem operavelmente ligados.
O termo operavelmente ligado, quando usado com referência a uma sequência reguladora e uma sequência de codificação, significa que a sequência reguladora afeta a expressão da sequência de codificação ligada. Sequências reguladoras ou elementos controle referem-se a sequências de nucleotídeo que influenciam o momento e nívei/quantidade de transcrição, processamento ou estabilidade de RNA ou tradução da sequência de codificação associada. Sequências reguladoras podem incluir promotores; sequências líderes de tradução; íntrons; aumentadores; estruturas de hastealça; sequências de ligação repressoras; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências reguladoras particulares podem estar localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação operavelmente ligada às mesmas. Também, sequências reguladoras particulares operavelmente ligadas a uma sequência de codificação podem estar localizadas na fita complementar associada de uma molécula de ácido nucléico de fita dupla.
Promotor: Conforme aqui usado, o termo promotor refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início de transcrição e que pode estar envolvida em reconhecimento e ligação de polimerase de RNA e outras proteínas para iniciar transcrição. Um promotor pode estar operavelmente ligado a uma sequência de codificação para expressão em uma célula ou um promotor pode estar operavelmente ligado a uma sequên32/124 cia de nucleotídeo codificando uma sequência de sinal que pode estar operavelmente ligada a uma sequência de codificação para expressão em uma célula. Um promotor de planta pode ser um promotor capaz de iniciar a transcrição em células de planta. Exemplos de promotores sob controle desenvolvimental incluem promotores que preferivelmente iniciam a transcrição em certos tecidos, tais como folhas, raízes, sementes, fibras, recipientes de xilema, traqueídos e esclerênquima. Tais promotores são referidos como preferidos de tecido. Promotores que iniciam transcrição apenas em certos tecidos são referidos como específicos de tecido. Um promotor específico de tipo de célula direciona principalmente expressão em certos tipos de célula em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor induzível pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores específicos de tecido, preferidos de tecido, específicos de tipo de célula e induzíveis constituem a classe de promotores não constitutivos. Um promotor constitutivo é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de célula ou tecido.
Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Vide Ward e outros (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Promotores induzíveis exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores do sistema ACEI que responde a cobre; gene In2 de milho que responde a protetores herbicidas benzenossulfonamida; repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, cuja atividade transcripcional pode ser induzida por um hormônio giucocorticosteróide (Schena e outros (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:0421).
Promotores constitutivos exemplares incluem, mas não estão limitados a: Promotores de vírus de planta, tal como promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV); promotores do gene da actina do arroz; prot
33/124 motores da ubiquitina; pEMU; MAS; promotor da histona H3 do milho; e o promotor de ALS, fragmento Xba1/Ncol 5’ para o gene estrutural ALS3 de Brassica napus (ou uma similaridade de sequência de nucleotídeo com o dito fragmento Xba1/Ncol) Publicação PCT Internacional No. W096/30530).
Ainda, qualquer promotor específico de tecido ou preferido de tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de codificação operavelmente ligada a um promotor específico de tecido podem produzir o produto da sequência de codificação exclusivamente, ou preferivelmente, em um tecido específico. Promotores específicos de tecido ou preferidos de tecido exemplares incluem, mas não estão limitados a: Um promotor preferido de raiz, tal como aquele do gene da faseolina; um promotor específico de folha e induzido por luz tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico de antera tal como aquele de LAT52; um promotor específico de pólen tal como aquele de Zm13; e um promotor preferido de micrósporo tal como aquele de apg.
Transformação: Conforme aqui usado, o termo transformação ou tradução refere-se à transferência de uma ou mais molécula(s) de ácido nucléico para uma célula. Uma célula é transformada por uma molécula de ácido nucléico transduzida para a célula quando a molécula de ácido nucleico se torna estavelmente replicada pela célula, ou através de incorporação da molécula de ácido nucléico no genoma celular ou através de replicação epissomal. Conforme aqui usado, o termo transformação compreende todas as técnicas através das quais uma molécula de ácido nucléico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, mas não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm e outros (1986) Nature 319:791-3); lipofecção (Felgner e outros (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7); microinjeção (Mueller e outros (1978) Cell 15:579-85); transferência mediada por Agrobacterium (Fraley e outros (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:48037); absorção de DNA direta; e bombardeamento com microprojétil (Klein e outros (1987) Nature 327:70).
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Transgene: Uma sequência de ácido nucléico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um ou ambos os fitas de uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucléico encontrada em uma praga coleóptera. Em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma sequência de ácido nucléico de antissenso, em que expressão da sequência de ácido nucléico de antissenso inibe expressão de uma sequência de ácido nucléico alvo. Ainda em exemplos adicionais, um transgene pode ser uma sequência de gene (por exemplo, um gene de resistência a herbicida), um gene codificando um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil ou um gene codificando uma característica agricultural desejável. Nesses e em outros exemplos, um transgene pode conter sequências reguladoras operavelmente ligadas a uma sequência de codificação do transgene (por exemplo, um promotor).
Vetor: Uma molécula de ácido nucléico é introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucléico que permitem que ele replique na célula hospedeiro, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, mas não estão limitados a: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que carrega DNA exógeno para uma célula. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, sequências de antissenso e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar ou infectar uma célula, desta maneira fazendo com que a célula expresse as moléculas de ácido nucléico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor inclui opcionalmente materiais para auxiliar na entrada do ácido nucléico na célula (por exemplo, um lipossoma, revestimento de proteína, etc).
Rendimento: Um rendimento estabilizado de cerca de 100% ou mais com relação ao rendimento de variedades de checagem no mesmo local de crescimento crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, rendimento aperfeiçoado ou aperfeiçoando rendimento significa uma cultivar tendo um rendimento estabilizado
35/124 de 105% a 115% ou mais com relação ao rendimento de variedades de checagem no mesmo local de crescimento contendo densidades significantes de pragas coleópteras que são prejudiciais àquela cultura que cresce ao mesmo tempo e sob as mesmas condições.
A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos um, uma e o, a significam pelo menos um conforme usado aqui.
A menos que de outra maneira especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme geralmente compreendido por aqueles versados na técnica à qual a invenção pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas em, por exemplo, Lewin B., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew e outros (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-021829); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as porcentagens estão em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume a menos que de outra maneira mencionado. Todas as temperaturas estão em graus Celsius.
IV. Moléculas de Ácido Nucléico Compreendendo uma Sequência de Praga Coleóptera
A. Visão Geral
São descritas aqui moléculas de ácido nucléico úteis para o controle de pragas coleópteras. Moléculas de ácido nucléico descritas incluem sequências alvo (por exemplo, genes nativos e sequências de não codificação), dsRNAs, siRNAs, hpRNAs e miRNAs. Por exemplo, moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares a toda ou parte de uma ou mais sequências de ácido nucléico nativas em uma praga coleóptera. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, a(s) sequência(s) de ácido nucléico nativa(s) pode(m) ser um ou mais gene(s) alvo(s), cujo produto pode estar, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutor; ou envolvido em desenvolvimento
36/124 larval. Moléculas de ácido nucléico descritas aqui, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos uma sequência(s) de ácido nucléico nativa à qual as moléculas de ácido nucléico são especificamente complementares, podem iniciar RNAi na célula, e consequentemente reduzir ou eliminar expressão da(s) sequência(s) de ácido nucléico nativa(s). Em alguns exemplos, redução ou eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência especificamente complementar à mesma pode ser letal em pragas coleópteras ou resultar em crescimento e/ou reprodução reduzido.
Em algumas modalidades, pelo menos um gene alvo em uma praga coleóptera pode ser selecionado, em que o gene alvo compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada da lista compreendendo D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); e Contig_01_Rho1_1191_CDC42 (SEQ ID NO:4). Em exemplos particulares, um gene alvo em uma praga coleóptera é selecionado, em que o gene alvo codifica uma subunidade C de ATPase vacuolar e compreende SEQ ID NO:2.
Em algumas modalidades, um gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85% idêntica (por exemplo, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% ou 100% idêntica) à sequência de aminoácido do produto de proteína de um de D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); D_vir_c1319_vatpaseH (SEQ ID NO:3); e Contig_01_Rho1_1191_CDC42 (SEQ ID NO:4). Um gene alvo pode ser uma sequência de ácido nucléico em uma praga coleóptera, cuja inibição pós-traducional tem um efeito prejudicial sobre a praga coleóptera, ou provê um benefício de proteção contra a praga coleóptera a uma planta. Em exemplos particulares, um gene alvo é uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma subunidade C de ATPase vacuolar compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85%
37/124 idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% ou 100% idêntica à sequência de aminoácido do produto de proteína de SEQ ID NO:2.
São providas de acordo com a invenção sequências de nucleotídeo, cuja expressão resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por uma sequência de codificação em uma praga coleóptera. Em algumas modalidades, após ingestão da molécula de RNA expressa por uma praga coleóptera, subregulagem da sequência de codificação em células da praga coleóptera pode ser obtida. Em modalidades particulares, sub-regulagem da sequência de codificação em células da praga coleóptera pode resultar em um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera.
Em algumas modalidades, sequências alvo incluem sequências de RNA de não codificação transcritas, tais como 5’UTRs; 3’UTRs; sequências líderes unidas; sequências de íntron; sequências de outron (por exemplo, RNA de 5’UTR subsequentemente modificado em união trans); sequências de donatron (por exemplo, RNA de não codificação requerido para prover sequências doadoras para união trans); e outro RNA transcrito de não codificação de genes de praga coleóptera alvo. Tais sequências podem ser derivadas de ambos os genes monocmonocistrônicos e policistrônicos.
Desta maneira, são também descritas aqui em conexão com algumas modalidades moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera. Em algumas modalidades uma molécula de iRNA pode compreender sequência(s) de nucleotídeo que é complementar a toda ou parte de uma pluralidade de sequências alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais sequências alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro ou in vivo por
38/124 um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. São também reveladas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera. São ainda descritos construtos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis eficazes de moléculas de dsRNA, siRNA, miRNA e/ou hpRNA dos construtos de DNA recombinante. Desta maneira, é também descrito um vetor de transformação de planta compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo operativamente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta, em que expressão da(s) sequência de nucleotídeo resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência alvo em uma praga coleóptera.
Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucléico úteis para o controle de pragas coleópteras podem incluir: toda ou parte da sequência de ácido nucléico nativa isolada de Diabrotica, D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); sequências de nucleotídeo que quando expressas resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de miRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares à D_vir_c1229_VatpaseC (SEQ ID NO:2); e construtos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucléico acima.
Nessas modalidades e em modalidades adicionais, moléculas de
39/124 ácido nucléico úteis para o controle de pragas coleópteras podem incluir: um fragmento de subunidade C de ATPase vacuolar de Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; sequências de nucleotídeo que quando expressas resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a uma molécula de RNA de Diabrotica nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; e construtos de DNA recombinantes para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucléico acima.
Nessas modalidades e em modalidades adicionais, moléculas de ácido nucléico adicionais úteis para o controle de pragas coleópteras podem incluir: D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1319_VatpaseH (subunidade H de ATPase vacuolar) (SEQ ID NO:3); e Contig_01_Rho1_1191_CDC42 (proteína de ligação de GTP pequena de Rho1) (SEQ ID NO:4); sequências de nucleotídeo que quando expressas resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a uma molécula de RNA nativa que é codificada por D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); ou Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4); moléculas de iRN (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); ou Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4); sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de
40/124 dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares à D_vir_c47185_Caf1180 (SEQ ID NO:1); D_vir_c1319_VatpaseH (SEQ ID NO:3); ou Contig_01_Rho1_1-191_CDC42 (SEQ ID NO:4); e construtos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo de célula hospedeiro transformada compreende uma ou mais das moléculas de ácido nucléico acima.
B, Moléculas de Ácido Nucléico
A presente invenção provê, inter alia, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que inibem expressão de gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga coleóptera; e moléculas de DNA capazes de ser expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga coleóptera.
Algumas modalidades da invenção proveem uma molécula de ácido nucléico isolada compreendendo pelo menos uma (por exemplo, uma, duas, três ou mais) sequência(s) de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; o complemento de SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; o complemento de SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; o complemento de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:112; o complemento de SEQ ID NO:112; SEQ ID NO:113; o complemento de SEQ ID NO:113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:2, 5-8, 112
41/124 e/ou 113; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6. Em modalidades particulares, contato com ou absorção por uma praga coleóptera da sequência de ácido nucléico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera.
Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucléico isolada da invenção pode compreender ainda pelo menos uma (por exemplo, um, dois, três ou mais) sequência(s) de nucleotídeo selecionada(s) do grupo consistindo em: toda ou parte de SEQ ID NO:1; toda ou parte do complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento de SEQ ID NO:4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; uma sequência de não codificação nativa de um orga42/124 nismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:1, 3 ou 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4. Em modalidades particulares, contato com ou absorção por uma praga coleóptera da sequência de ácido nucleico isolada inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera.
Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender pelo menos uma sequência(s) de DNA (por exemplo, uma, duas, três ou mais) capaz(es) de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga coleóptera. Tal sequência(s) de DNA pode ser operavelmente ligada a uma sequência promotora que funciona em uma célula compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou aumentar a transcrição da(s) molécula de dsRNA codificada. Em uma modalidade, a pelo menos uma sequência(s) (por exemplo, uma, duas, três ou mais) pode ser derivada de SEQ ID NO:2. Derivados de SEQ ID NO:2 incluem fragmentos de SEQ ID NO:2. Em algumas modalidades, um fragmento de SEQ ID NO:2 pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6,
43/124 ou um complemento de qualquer uma das acima. Desta maneira, um fragmento de SEQ ID NO:2 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2, ou um complemento da mesma, e compreende toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6, ou um complemento da mesma. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, um fragmento de SEQ ID NO:2 pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2, ou um complemento da mesma. Desta maneira, um fragmento de SEQ ID NO:2 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, cerca de 25 (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29), cerca de 30, cerca de 40 (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2, ou um complemento da mesma, e compreende toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6, ou um complemento das mesmas.
Em modalidades particulares, pelo menos uma sequência(s) de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene alvo em uma célula, tecido ou órgão de uma praga coleóptera pode compreender ainda sequência(s) de DNA que são derivadas de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo compreendendo SEQ ID NOs:1, 3 e 4. Derivados de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo compreendendo SEQ ID NOs:1, 3 e 4 incluem fragmentos de uma ou mais de SEQ ID NOs:1, 3 e 4. Em algumas modalidades, um fragmento de uma ou mais de SEQ ID NOs:1, 3 e 4 e pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NOs:1, 3 e 4, ou um complemento das mesmas. Desta maneira, um fragmento de uma ou mais de SEQ ID NOs:1, 3 e 4 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das sequências em SEQ ID NOs:1, 3 e 4, ou um complemento das mesmas. Nessas modalidades e em
44/124 modalidades adicionais, um fragmento de uma ou mais de SEQ ID NOs:1, 3 e 4 pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4, ou um complemento da mesma. Desta maneira, um fragmento de uma ou mais de SEQ ID NOs:1, 3 e 4 pode compreender, por exemplo, 19, 20, 21, cerca de 25 (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29), cerca de 30, cerca de 40 (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, ou mais nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NOs:1, 3 e 4, ou um complemento das mesmas.
Algumas modalidades compreendem introdução de moléculas de dsRNA parcialmente ou totalmente estabilizadas em uma praga coleóptera para inibir expressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera. Quando expressas como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) e absorvidas por uma praga coleóptera, sequências de ácido nucléico compreendendo um ou mais fragmentos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1-4 pode causar um ou mais de morte, inibição de crescimento, mudança em razão de sexo, redução em tamanho da ninhada, cessação de infecção e/ou cessação de alimentação por uma praga coleóptera. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo incluindo cerca de 19 a cerca de 300 nucleotídeos que são substancialmente homólogos a uma sequência de gene alvo de praga coleóptera e compreendendo SEQ ID NO:2 ou toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6 é provida. Exemplos específicos de moléculas de dsRNA compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga à SEQ ID NO:2 ou toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6 podem ser, por exemplo, sem limitação, pelo menos 19, 20, 21, cerca de 25 (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 e 29), cerca de 30, cerca de 40 (por exemplo, 35, 36,37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44 e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca
45/124 de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200, ou mais nucleotídeos de comprimento. Tais moléculas de dsRNA podem compreender ainda um ou mais fragmen5 tos de SEQ ID NOs:1, 3 e/ou 4. Expressão de tal molécula de dsRNA pode, por exemplo, levar à mortalidade em praga coleóptera que absorve a molécula de dsRNA.
Em certas modalidades, moléculas de dsRNA providas pela invenção compreende sequências de nucleotídeo complementares a um gene alvo compreendendo SEQ ID NO:2 e/ou sequências de nucleotídeo complementares a toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6, cuja inibição do gene alvo em uma praga coleóptera resulta na redução ou remoção de um agente proteína ou sequência de nucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da praga coleóptera. Uma sequência de nucleotídeo selecionada pode exibir a partir de cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2; um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:2 compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; ou um complemento de qualquer uma das acima. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo selecionada pode exibir cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94%; cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98,5%; cerca de 99%; cerca de 99,5%; ou cerca de 100% de identidade de sequência com a SEQ ID NO:2; um fragmento contínuo da sequência de nucleotídeo mostrada na SEQ ID NO:2 compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; ou o complemento de qualquer uma das acima. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA provida pela invenção pode compreender ainda uma ou mais sequências de nucleotídeo complementares a um gene alvo compreendendo uma de SEQ ID NOs:1, 3 e 4, inibição do gene alvo em uma praga coleóptera resulta na redução ou remoção de um agente de sequência
46/124 de proteína ou nucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento ou outra função biológica da praga coleóptera.
Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir expressão de gene alvo pode compreender uma sequência de nucleotídeo simples que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência de ácido nucléico nativa encontrada em uma ou mais espécies de praga coleóptera alvo ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera a partir de uma pluralidade de tais sequências especificamente complementares.
Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucléico pode compreender uma primeira sequência de nucleotídeo e uma segunda sequência de nucleotídeo separadas por uma sequência espaçadora. Uma sequência espaçadora pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilite a formação de estrutura secundária entre as primeira e segunda sequências de nucleotídeo, em que isto for desejado. Em uma modalidade, a sequência espaçadora é parte de uma sequência de codificação de senso ou antissenso para mRNA. A sequência espaçadora pode compreender alternativamente qualquer combinação de nucleotídeos ou seus homólogos que são capazes de ser ligados covalentemente a uma molécula de ácido nucléico.
Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo codificando uma ou mais moléculas de RNA diferentes, em que cada uma das moléculas de RNA diferentes compreende uma primeira sequência de nucleotídeo e uma segunda sequência de nucleotídeo, em que as primeira e segunda sequências de nucleotídeo são complementares uma à outra. As primeira e segunda sequências de nucleotídeo podem ser conectadas dentro de uma molécula de RNA por uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode constituir parte da primeira sequência de nucleotídeo ou da segunda sequência de nucleotídeo. Expressão de uma molécula de RNA compreendendo as primeira e segunda sequências de nucleotídeo pode levar à formação de uma
47/124 molécula de dsRNA da presente invenção, através de hibridização específica das primeira e segunda sequências de nucleotídeo. A primeira sequência de nucleotídeo ou a segunda sequência de nucleotídeo pode ser substancialmente idêntica a uma sequência de nucleotídeo nativa para uma praga coleóptera (por exemplo, um gene alvo ou sequência de não codificação transcrita), um derivado da mesma ou uma sequência complementar à mesma.
Moléculas de ácido nucléico de dsRNA compreendem fitas duplas de sequências de ribonucleotídeo polimerizadas e podem incluir modificações ou na estrutura principal de fosfato-açúcar ou no nucleosídeo. Modificações em estrutura de RNA podem ser projetadas para permitir inibição específica. Em uma modalidade, moléculas de dsRNA podem ser modificadas através de um processo enzimático ubíquo de maneira que moléculas de siRNA podem ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNAse III, tal como DICER em eucariontes, ou in vitro ou in vivo. Vide Elbashir e outros (2001) Nature 411:494-8; e Hamilton e Baulcombe (1991) Science 286(5441):950-2. DICER ou enzimas RNAse III funcionalmente equivalentes clivam fitas de dsRNA e/ou moléculas de hpRNA maiores em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada um dos quais é de cerca de 19-25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por essas enzimas têm sobreposições 3’ de 2 a 3 nucleotídeos e terminais fosfato 5’ e hidroxila 3’. As moléculas de siRNA geradas por enzimas RNAse III são desenroladas e separadas em RNA de fita simples na célula. As moléculas de siRNA então hibridizam especificamente com sequências de RNA transcritas a partir de um gene alvo e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradas por um mecanismo de degradação de RNA celular inerente. Este processo pode resultar na degradação ou remoção eficaz da sequência de RNA codificada pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é o silenciamento pós-traducional do gene direcionado. Em algumas modalidades, moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNAse III endógenas a partir de moléculas de ácido nucléico heterólogas podem eficientemente mediar a sub-regulagem de genes alvo em pra48/124 gas coleópteras.
Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucléico da invenção pode incluir pelo menos uma sequência de nucleotídeo de ocorrência não natural que pode ser transcrita em uma molécula de RNA de fita simples capaz de formar uma molécula de sRNA in vivo através de hibridização intermolecular. Tais sequências de dsRNA tipicamente sofrem automontagem e podem ser providas na fonte de nutrição de uma praga coleóptera para obter a inibição pós-transcripcional de um gene alvo. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucléico da invenção pode compreender duas sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural diferentes, cada uma das quais é especificamente complementar a um gene alvo diferente em uma praga coleóptera. Quando tal molécula de ácido nucléico é provida como uma molécula de dsRNA a uma praga coleóptera, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes alvo diferentes na praga coleóptera.
C. Obtenção de Moléculas de Ácido Nucléico
Uma variedade de sequências nativas em pragas coleópteras pode ser usada como sequências alvo para o projeto de moléculas de ácido nucléico da invenção, tais como moléculas de iRNAs e DNA codificando iRNAs. Seleção de sequências nativas não é, no entanto, um processo direto. Apenas um pequeno número de sequências nativas na praga coleóptera serão alvos eficazes. Por exemplo, não pode ser previsto com certeza se uma sequência nativa particular pode ser eficazmente sub-regulada por moléculas de ácido nucléico da invenção, ou se sub-regulagem de uma sequência nativa particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/u reprodução da praga coleóptera. A maioria das sequências de praga coleóptera nativas, tais como ESTs isoladas das mesmas (por exemplo, conforme listado na Patente U.S. 7.612.194 e na Patente U.S. 7.943.819), não tem um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação e/ou reprodução da praga coleóptera, tal como WCR ou NCR. Nem é previsto quais das sequências nativas que podem ter um efeito prejudicial sobre uma praga coleóptera são capazes de ser usadas em técnicas
49/124 recombinantes para expressão de moléculas de ácido nucléico complementares a tais sequências nativas em uma planta hospedeiro e provisão do efeito prejudicial sobre a praga coleóptera quando da alimentação sem causar prejuízo à planta hospedeiro.
Em algumas modalidades, as moléculas de ácido nucléico da invenção (por exemplo, moléculas de dsRNA a serem providas na planta hospedeiro de uma praga coleóptera) são selecionadas para se direcionarem a sequências de cDNA alvo codificando proteínas ou partes de proteínas essenciais para sobrevivência de praga coleóptera, tais como sequências de aminoácido envolvidas em cursos bioquímicos metabólicos ou catabólicos, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, digestão, parasitismo e similar. Conforme descrito aqui, ingestão de composições por um organismo alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento dos quais é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do patógeno alvo, pode resultar na morte ou na inibição do alvo. Uma sequência de nucleotídeo, ou DNA ou RNA, derivada de uma praga coleóptera pode ser usada para construir células de planta resistentes à infestação pelas pragas coleópteras. A planta hospedeiro da praga coleóptera (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais das sequências de nucleotídeo derivadas da praga coleóptera conforme aqui provido. A sequência de nucleotídeo transformada no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que tomam forma em uma sequência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, desta maneira disponibilizando o dsRNA se/quando a praga coleóptera forma uma relação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resultar na supressão de expressão de um ou mais genes nas células da praga coleóptera, e por fim morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.
Desta maneira, em algumas modalidades, um gene é direcionado, o qual está essencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de uma praga coleóptera. Outros genes alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham pa50/124 péis importantes em viabilidade, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, infectividade, estabelecimento de sítios de alimentação e reprodução de praga coleóptera. Um gene alvo pode então ser um gene de manutenção ou um fator de transcrição. Ainda, uma sequência de nucleotídeo de praga coleóptera nativa para uso na presente invenção pode também ser derivada de um homólogo (por exemplo, um hortólogo), de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, cuja função é conhecida daqueles versados comuns na técnica, e cuja sequência de nucleotídeo é especificamente hibridizável com um gene alvo no genoma da praga coleóptera alvo. Métodos de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeo conhecida através de hibridização são conhecidos daqueles versados na técnica.
Em algumas modalidades, a invenção provê métodos para obtenção de uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeo para produção de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA). Tal modalidade compreende: (a) análise de um ou mais gene(s) alvo quanto à sua expressão, função e fenótipo quando da supressão de gene mediada por dsRNA em uma praga coleóptera; (b) sondagem de uma biblioteca de cDNA ou dGNA com uma sonda compreen20 dendo toda ou uma porção de uma sequência de nucleotídeo ou um homólogo da mesma de uma praga coleóptera direcionada que mostra um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificação de um clone de DNA que hibridiza especificamente com a sonda; (d) isolamento do clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciamento do fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucléico sequenciada transcreve toda ou uma porção substancial da sequência de RNA ou um homólogo da mesma; e (f) sintetização quimicamente de toda ou uma porção substancial de uma sequência de ge30 ne ou uma siRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.
Em modalidades adicionais, um método para obtenção de um fragmento de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeo
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51/124 para produção de uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) inclui: (a) sintetização de primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo especificamente complementares a uma porção de uma sequência de nucleotídeo nativa de uma praga coleóptera direcionada; e (b) amplificação de uma inserção de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando os primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo da etapa (a), em que a molécula de ácido nucléico amplificada transcreve uma porção substancial de uma molécula de siRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.
Os ácidos nucléicos da invenção podem ser isolados, amplificados ou produzidos através de várias abordagens. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) pode ser obtida através de amplificação por PCR de uma sequência de ácido nucléico alvo (por exemplo, um gene alvo ou uma sequência de não codificação transcrita alvo) derivada de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou suas porções. DNA ou RNA pode ser extraído de um organismo alvo e bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas a partir dele usando métodos conhecidos daqueles versados na técnica e bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas a partir de um organismo alvo podem ser usadas para amplificação por PCR e sequenciamento de genes alvo. Um produto de PCR confirmado pode ser usado como um molde para transcrição in vitro para gerar RNA de senso e antissenso com promotores mínimos. Alternativamente, moléculas de ácido nucléico podem ser sintetizadas através de qualquer uma de várias técnicas (vide, por exemplo, Ozaki e outros (1992) Nucleic Acids Research, 20: 52055214; e Agrawal e outros (1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo uso de um sintetizador de DNA automático (por exemplo, um P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) Synthesizer DNA/RNA modelo 392 ou 394), usando químicas padrão, tal como química de fosforamidita. Vide, por exemplo, Beaucage e outros (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Patentes U.S. Patentes Nos. 4.980.460, 4.725.677, 4.415.732, 4.458.066 e 4.973.679. Químicas alternativas resultando em grupos de estrutura principal não naturais, tais como fosforioato, fosforamidato, e similar, podem ser também em52/124 pregadas.
Uma molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA da presente invenção pode ser quimicamente ou enzimaticamente produzida por um versado na técnica através de reações manuais ou automáticas ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência codificando a molécula de RNA, dsRNA, siRNA, miRNA ou hpRNA. RNA pode ser também produzido através de síntese orgânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido através de síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma polimerase de RNA celular ou uma polimerase de RNA de bacteriófago (por exemplo, polimerase de RNA T3, polimerase de RNA T7 e polimerase de RNA SP6). Construtos de expressão úteis para a clonagem e a expressão de sequências de nucleotídeo são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Publicação PCT Internacional No. WO 97/32016; e Patentes U.S. 5.593.874, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214 e 5.804.693. Moléculas de RNA que são quimicamente sintetizadas ou através de síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, moléculas de RNA podem ser purificadas a partir de uma mistura através de extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia ou combinação das mesmas. Alternativamente, moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou através de síntese enzimática in vitro podem ser usadas com nenhuma ou uma purificação mínima, por exemplo, para evitar perdas devido a processamento de amostra. As moléculas de RNA podem ser secas para armazenamento ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover anelamento e/ou estabilização de fitas de dúplex de molécula de dsRNA.
Em modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por uma fita de RNA autocomplementar simples ou por duas fitas de RNA complementares. Moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas ou in vivo ou in vitro. Uma polimerase de RNA endógena da célula pode mediar transcrição de um ou dos duas fitas in vivo ou polimerase de RNA clonada pode ser u53/124 sada para mediar transcrição in vivo ou in vitro. Inibição pós-transcripcional de um gene alvo em uma praga coleóptera pode ser direcionada no hospedeiro através de transcrição específica em um órgão, tecido ou tipo de célula do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico de tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor induzível que é responsível a indutores de infecção, estresse, temperatura e/ou químicos); e/ou transcrição de engenharia em um estágio ou idade desenvolvimental do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico de estágio desenvolvimental). Fitas de RNA que formam uma molécula de dsRNA, seja transcrito in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadenilados, e podem ou não ser capazes de ser traduzidos em um polipeptídeo por um aparelho traducional de célula.
D. Vetores Recombinantes e Transformação de Célula Hospedeiro
Em algumas modalidades, a invenção também provê uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura ou uma célula de planta), em que a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeo que, quando da expressão para RNA e ingestão por uma praga coleóptera, atinge supressão de um gene alvo em uma célula, tecido ou órgão da praga coleóptera. Desta maneira, algumas modalidades proveem uma molécula de ácido nucléico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucléico capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) em uma célula de planta para inibir expressão de gene alvo em uma praga coleóptera. A fim de iniciar ou aumentar expressão, tais moléculas de ácido nucléico recombinantes compreendem uma ou mais sequências reguladoras, sequências reguladoras que podem ser operavelmente ligadas à sequência de ácido nucléico capaz de ser expressa como um iRNA. Métodos para expressar uma molécula de supressão de gene em plantas são conhecidos e podem ser usados para expressar uma sequência de nucleotídeo da presente invenção. Vide, por exemplo, Publicação PCT Internacional No. WO6073727; e Publicação de Patente U.S. No. 2006/0200878 Al).
Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombi54/124 nante da invenção pode compreender uma sequência de ácido nucléico codificando uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinantes podem codificar moléculas de dsRNA capazes de inibição da expressão de gene(s) alvo(s) endógeno(s) em uma célula de praga coleóptera quando da ingestão. Em muitas modalidades, uma molécula de dsRNA transcrita pode ser provida em uma forma estabilizada, por exemplo, como uma estrutura de grampo de cabelo e haste e alça.
Nessas modalidades e em modalidades adicionais, um fita de uma molécula de dsRNA pode ser formado através de transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; o complemento de SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; o complemento de SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; o complemento de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:112; complemento de SEQ ID NO:112; SEQ ID NO:113; o complemento de SEQ ID NO: 113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2,5-8, 112 e/ou 113; e o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 1/ou 113; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codi55/124 ficação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6.
Uma fita de uma molécula de dsRNA pode também ser formada através de transcrição a partir de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento de SEQ ID NO:4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NO:1, 3 ou4; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma se56/124 quência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4.
Em modalidades particulares, uma molécula de DNA recombinante codificando uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos duas sequências de nucleotídeo com uma sequência de codificação disposta de maneira tal que uma sequência de nucleotídeo está em uma orientação de senso, e a outra sequência de nucleotídeo está em uma orientação de antissenso, com relação a pelo menos um promotor, em que a sequência de nucleotídeo de senso e a sequência de nucleotídeo de antissenso são ligadas ou conectadas por uma sequência espaçadora de a partir de cerca de cinco (~5) a cerca de mil (~1000) nucleotídeos. A sequência espaçadora pode formar uma alça entre as sequências de senso e antissenso. A sequência de nucleotídeo de senso ou a sequência de nucleotídeo de antissenso pode ser substancialmente homóloga à sequência de nucleotídeo de um gene alvo (por exemplo, um gene compreendendo uma de SEQ ID NOs:1-4) ou um fragmento da mesma. Em algumas modalidades, no entanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar uma molécula de dsRNA sem uma sequência espaçadora. Em modalidades, uma sequência de codificação de senso e uma sequência de codificação de antissenso podem ser de comprimentos diferentes.
Sequências identificadas como tendo um efeito prejudicial sobre pragas coleópteras ou um efeito protetor de planta com relação a pragas coleópteras podem ser prontamente incorporadas a moléculas de dsRNA expressas através da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucléico recombinante da invenção. Por exemplo, tais sequências podem ser expressas como um grampo de cabelo com estrutura de haste e alça pegando um primeiro segmento correspondendo a uma sequência de gene alvo (por exemplo, SEQ ID NO:2 e sequências
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57/124 compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e/ou 6); ligando esta sequência a uma segunda região espaçadora de segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando isto a um terceiro segmento, em que pelo menos uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Tal construto forma uma estrutura de haste e alça através de hibridização do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura de alça se forma compreende o segundo segmento. Vide, por exemplo, Publicações de Patente U.S. Nos. US 2002/0048814 e US 2003/0018993; e Publicações de Patente Internacionais Nos. W094/01550 e W098/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de fita dupla tal como uma estrutura haste-alça (por exemplo, grampo de cabelo), com o que a produção de siRNA se direcionado a uma sequência de praga coleóptera nativa é aumentada através de coexpressão de um fragmento do gene alvo, por exemplo, em um cassete expressável em planta adicional, que leva à produção de siRNA aumentada, ou reduz metilação para prevenir silenciamento de gene transcripcional do promotor de grampo de cabelo de dsRNA.
As modalidades da invenção incluem introdução de uma molécula de ácido nucléico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para obter níveis de expressão inibidores de praga coleóptera de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou circular fechado. O sistema de vetor pode ser um vetor simples ou plasmídeo, ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Ainda, um vetor pode ser um vetor de expressão. Sequências de ácido nucléico da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para direcionar a expressão de uma sequência de codificação ligada ou outra sequência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e seleção do vetor apropriado vai depender principalmente do tamanho do ácido nucléico a ser inserido no vetor e da célula hospedeiro particular a ser transformada
58/124 com o vetor. Cada vetor contém vários componentes dependendo de sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e da célula hospedeiro particular com a qual ele é compatível.
Para fornecer resistência à praga coleóptera a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro de tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga e hibridizável especificamente para uma sequência de nucleotídeo transcrita correspondente dentro de uma praga coleóptera que pode se alimentar da espécie de planta hospedeiro. A praga coleóptera pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeiro transgênica, por exemplo, através da ingestão de células ou fluidos da planta hospedeiro transgênica que compreende a molécula de iRNA. Desta maneira, expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iRNA dentro de pragas coleópteras que infestam a planta hospedeiro transgênica. Em algumas modalidades, supressão de expressão do gene alvo na praga coleóptera alvo pode resultar na planta ser resistente à praga.
A fim de permitir aplicação de moléculas de iRNA a uma praga coleóptera em uma relação nutricional com uma célula de planta que foi transformada com uma molécula de ácido nucléico recombinante da invenção, expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA na célula de planta é requerida. Desta maneira, uma molécula de ácido nucléico recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo da invenção operavelmente ligada a uma ou mais sequências reguladoras, tal como uma sequência promotora heteróloga que funciona em uma célula hospedeiro, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucléico deve ser amplificada ou uma célula de planta em que a molécula de ácido nucléico deve ser expressa.
Promotores adequados para uso nas moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos ou constitutivos, todos são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes
59/124 que descrevem tais promotores incluem, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor da actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores do milho constitutivos); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196 (promotor 35S); 6.433.252 (promotor da oleosina L3 do milho); 6.429.357 (promotor 2 da actina do arroz e íntron 2 da actina do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis por luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno); 6.175.060 (promotores induzíveis de deficiência em fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor da gama-coixina); e Pedido de Patente U.S. No. de Série 09/757,089 (promotor da aldopase de cloroplasto do milho). Promotores adicionais incluem o promotor da nopalina sintase (NOS) (Ebert e outros (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(16):5745-9) e o promotor da octopina sintase (OCS) (ambos são carregados em plasmídeos de indução de tumor de Agrobacterium tumefaciens)-, os promotores do caulimovírus tal como o promotor 19S do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton e outros (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-24); o promotor 35S de CaMV (Odell e outros (1985) Nature 313:810-2; o promotor 35S do vírus do mosaico de fígwort (Walker e outros (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(19):6624-8); o promotor da sintase da sacarose (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:4144-8); o promotor do complexo do gene R (Chandler e outros (1989) Plant Cell 1:1175-83); o promotor do gene da proteína de ligação a/b de clorofila; CaMV35S (Patentes U.S. Nos. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142 e 5.530.196); FMV35S (Patentes U.S. Nos. 6.051.753 e 5.378.619); um promotor de PC1SV (Patente U.S. No. 5.850.019); o promotor da SCP1 (Patente U.S. No. 6.677.503); e promotores de AGRtu.nos (GenBank Accession No. V00087; Depicker e outros (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-73; Bevan e outros (1983) Nature 304:184-7).
Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucléico da invenção compreendem um promotor específico de tecido, tal como um promotor específico de raiz. Promotores específicos de raiz direcionam a ex60/124 pressão de sequências operavelmente ligadas exclusivamente ou preferivelmente em tecido de raiz. Exemplos de promotores específicos de raiz são conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman e outros (1994) Science 263:221-3; e Hirel e outros (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, uma sequência ou fragmento de ácido nucléico para controle de praga coleóptera de acordo com a invenção pode ser clonada entre dois promotores específicos de raiz, que são operáveis em uma célula de planta transgênica e expressos nela para produzir moléculas de RNA na célula de planta transgênica que subsequentemente pode formar moléculas de dsRNA, conforme descrito, supra. As moléculas de iRNA expressas em tecidos de planta podem ser ingeridas por uma praga coleóptera de maneira que supressão da expressão do gene alvo é obtida.
Sequências reguladoras adicionais que podem ser opcionalmente operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucléico de interesse incluem UTRs 5’ localizadas entre uma sequência promotora e uma sequência de codificação que funcionam como uma sequência líder de tradução. A sequência líder de tradução está presente no mRNA integralmente processado e ela pode afetar processamento do transcrito primário e/ou estabilidade do RNA. Exemplos de sequências líder de tradução incluem líderes da proteína do choque térmico do milho e da petúnia (Patente U.S. No.
5.362.865) , líderes da proteína de revestimento de vírus de planta, líderes rubisco da planta e outros. Vide, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de UTRs 5’ incluem GmHsp (Patente U.S. No. 5.659.122); PhDnaK (Patente U.S. No.
5.362.865) ; AtAnl; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (No. de Acesso GenBank V00087; e Bevan e outros (1983) Nature 304:184-7).
Sequências reguladoras adicionais que podem opcionalmente ser operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucléico de interesse também incluem sequências não traduzidas 3’, regiões de terminação de transcrição 3’ ou regiões de poliadenilação. Esses são elementos genéticos
61/124 localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeo e incluem polinucleotídeos que proveem sinal de poliadenilação e/ou outros sinais reguladores capazes de afetar a transcrição ou processamento de mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos de poliadenilação à extremidade 3’ do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes de planta ou de genes de T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de terminação de transcrição 3’ é a região 3’ da nopalina sintase (nos 3’; Fraley e outros (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um exemplo do uso de regiões não traduzidas 3’ diferentes é provido em Ingelbrecht e outros (1989) Plant Cell 1:671-80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um de um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-9; Coruzzi e outros (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (No. de Acesso GenBank E01312).
Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos uma das sequências reguladoras descritas acima operavelmente ligadas a uma ou mais sequências de nucleotídeo da presente invenção. Quando expressas, a uma ou mais sequências de nucleotídeo resultam em uma ou mais molécula(s) de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma praga coleóptera. Desta maneira, a(s) sequência(s) de nucleotídeo pode compreender um segmento codificando toda ou parte de uma sequência de ribonucleotídeo presente dentro de um transcrito de RNA de praga coleóptera alvo, e pode compreender repetições invertidas de todo ou parte de um transcrito de praga coleóptera alvo. Um vetor de transformação de planta pode conter sequências especificamente complementares a mais de uma sequência alvo, desta maneira permitindo a produção de mais de um dsRNA para inibição da expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies de pragas coleópteras alvo. Segmentos de sequência de nucleotídeo especificamente complementares a sequências de nucleotídeo presentes em genes
62/124 diferentes podem ser combinados em uma molécula de ácido nucléico compósita simples para expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por uma sequência espaçadora.
Em algumas modalidades, um plasmídeo da presente invenção já contendo pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de sequência(s) de nucleotídeo adicional no mesmo plasmídeo, em que a(s) sequência(s) de nucleotídeo adicional é operavelmente ligada aos mesmos elementos reguladores que a pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo original. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucléico pode ser projetada para a inibição de genes alvo múltiplos. Em algumas modalidades, os genes múltiplos a serem inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de praga coleóptera, que pode aumentar a eficácia da molécula de ácido nucléico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de pragas coleópteras diferentes, que pode ampliar a faixa de pragas coleópteras contra as quais o(s) agente(s) é/são eficazes. Quando genes múltiplos são direcionados para supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado.
Uma molécula de ácido nucléico recombinante ou vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionado que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula de planta. Marcadores selecionáveis podem ser também usados para selecionar plantas ou células de planta que compreendem molécula de ácido nucléico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência a biocida, resistência a antibiótico (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc) ou resistência a herbicida (por exemplo, glifosato, etc). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a: um gene neo que codifica resistência à canamicina e pode ser selecionado para uso de canamicina, G418, etc; um gene bar que codifica resistência a bialafos; um gene de EPSP sintase mutante que codifica resistência a glifosato; um gene da nitrilase que confere resistência à bromoxinila; um gene da acetolactato sintase mutante (ALS) que confere resistên63/124 cia à imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene de DHFR resistente a metotrexato. Marcadores selecionáveis múltiplos estão disponíveis, os quais conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina e similar. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados nas, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.
Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode também incluir um marcador selecionável. Marcadores selecionáveis podem ser usados para monitorar expressão. Marcadores exemplares que podem ser avaliados incluem um gene da β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para as quais vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson e outros (1987) Plant. Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta e outros (1988) Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac. No 18th Stadler Genetics Symposium, P. Gustafson e R. Appels, eds. (New York: Plenum), pp. 263-82); um gene da β-lactamase (Sutcliffe e outros (1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:373741); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene da luciferase (Ow e outros (1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica uma catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski e outros (1983) Gene 46(2-3):247-55); um gene da amilase (Ikatu e outros (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene da tirosina que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que por sua vez condensa em melanina (Katz e outros (1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma a-galactosidase.
Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico recombinantes, conforme descrito supra, podem ser usadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucléicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que exibem susceptibili64/124 dade reduzida a pragas coleópteras. Vetores de transformação de planta podem ser preparados, por exemplo, inserindo moléculas de ácido nucléico codificando moléculas de iRNA em vetores de transformação de planta e introduzindo esses em plantas.
Métodos adequados para transformação de células hospedeiro incluem qualquer método através do qual DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como através de transformação de protoplastos (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.508.184), através de absorção de DNA mediada por dissecação/inibição (vide, por exemplo, Potrykus e outros (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), através de eletroporação (vide, por exemplo, Patente U.S. 5.384.253), através de agitação com fibras de carbida de silício (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.302.523 e 5.464.765), através de transformação mediada por Agrobacterium (vide, por exemplo, Patentes U.S. 5.563.055; 5.591.616; 5.693.512; 5.824.877; 5.981.840; e 6.384.301) e através da aceleração de partículas revestidas com DNA (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 5.015.580; 5.550.318; 5.538.880; 6.160.208; 6.399.861 e 6.403.865), etc. Técnicas que são particularmente úteis para transformação de milho são descritas, por exemplo, nas Patentes U.S. Nos. 7.060.876 e 5.591.616; e Publicação PCT Internacional WO 95/06722. Através da aplicação de técnicas tais como essas, as células de virtualmente quaisquer espécies podem ser estavelmente transformadas. Em algumas modalidades, DNA de transformação é integrado ao genoma da célula hospedeiro. No caso de espécies multicelulares, as células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer uma dessas técnicas pode ser usada para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucléico codificando uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.
O método mais amplamente utilizado para introdução de um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de Agrobacterium. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias do solo patogênicas para planta que transformam geneticamente células de planta. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, car65/124 regam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos de Ti (indução de tumor) contêm um segmento grande, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo de Ti, a região vir, é responsável pela transferência de T-DNA.
A região de T-DNA é limitada por repetições terminais. Em vetores binários modificados, os genes de indução de tumor foram deletados, e as funções da região vir são utilizadas para transferir DNA estranho limitado pelas sequências de borda de T-DNA. A região T pode também conter um marcador selecionável para recuperação eficiente de plantas e células transgênicas, e um sítio de clonagem múltiplo para inserção de sequências para transferência tal como um ácido nucléico codificando dsRNA.
Desta maneira, em algumas modalidades, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídeo de Ti de A. tumefaciens (vide, por exemplo, Patentes U.S. Nos. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937 e
5.501.967; e Patente Europeia EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella e outros (1983) Nature 303:209-13; Bevan e outros (1983) Nature 304:184-7; Klee e outros (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Europeia EP 0 120 516, e aque20 les derivados de qualquer um dos acima. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizobium e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência de gene para várias plantas diferentes. Essas bactérias simbióticas associadas à planta podem ser tornadas competentes para transferência de gene através da aqui25 sição de ambos um plasmídeo Ti desarmado e um vetor binário adequado.
Após provisão de um DNA exógeno a células recipientes, células transformadas são geralmente identificadas para cultura adicional e regeneração de planta. A fim de melhorar a habilidade em identificar células transformadas, uma pessoa pode desejar empregar um gene marcador selecio30 nável ou avaliável, conforme previamente mostrado, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso em que um marcador selecionável é usado, células transformadas são identificadas dentro da po66/124 pulação de célula potencialmente transformada através de exposição das células a um agente ou agentes seletivos. No caso em que um marcador selecionável é usado, as células podem ser avaliadas quanto a uma característica de gene marcador desejada.
As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de avaliação, podem ser culturadas em meio que apoia regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por exemplo, meios MS e M6) pode ser modificado através da inclusão de subs10 tâncias adicionais, tais como reguladores de crescimento. Tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até que tecido suficiente esteja disponível para começar esforços de regeneração de planta, ou seguindo rodadas repetidas de seleção manual, até que a morfologia do tecido seja adequada para regeneração (por exemplo, pelo menos 2 se15 manas), então transferido para meio condutor para iniciar a formação. As culturas são transferidas periodicamente até que formação de broto suficiente tenha ocorrido. Uma vez formados os brotos, eles são transferidos para meio condutor para formação de raiz. Uma vez raízes suficientes tendo sido formadas, as plantas podem ser transferidas para solo para crescimento adi20 cional e maturação.
Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucléico de interesse (por exemplo, uma sequência de DNA codificando uma ou mais moléculas de iRNA que inibem expressão de gene alvo em uma praga coleóptera) na regeneração de plantas, uma variedade de ensaios pode ser rea25 lizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tais como Southern e Northern blotting, PCR e sequenciamento de ácido nucléico; ensaios bioquímicos, tal como a detecção da presença de um produto de proteína, por exemplo, através de meios imunológicos (ELISA e/ou Western blots) ou através de função enzimática; ensaios de parte de planta, tais como ensaios de folha ou raiz; e análise do fenótipo de planta regenerada inteira.
Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, atra67/124 vés de amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para uma molécula de ácido nucléico de interesse. Genotipificação de PCR é compreendida incluir, mas não está limitada a, amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) de DNA genômico derivado de tecido de calo de planta hospedeiro isolada previsto conter uma molécula de ácido nucléico de interesse integrada ao genoma, seguido por clonagem padrão e análise de sequência de produtos de amplificação por PCR. Métodos de genotipificação de PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. e outros (2002) Plant J., 32:243-53) e podem ser aplicados a DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas de célula.
Uma planta transgênica formada usando métodos de transformação dependentes de Agrobacterium tipicamente contém uma sequência de DNA recombinante simples inserida em um cromossomo. A sequência de DNA recombinante simples é referida como um evento transgênico ou evento de integração. Tais plantas transgênicas são hemizigotas para a sequência exógena inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigota com relação a um transgene pode ser obtida acasalando sexualmente (autopolinação) uma planta transgênica segregante independente que contém uma sequência de gene exógena simples com ela mesma, por exemplo, uma planta Fo, para produzir semente F-ι. Um quarto da semente F-ι produzida será homozigota com relação ao transgene. Germinação de semente F·] resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotos e homozigotos (isto é, um ensaio de zigosidade).
Em modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais moléculas de iRNA diferentes são produzidas em uma célula de planta que têm um efeito inibidor de praga coleóptera. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas a partir de sequências de ácido nucléico múltiplas introduzidas em eventos de transformação diferentes ou a partir de sequência de ácido nucléico simples introdu68/124 zida em um evento de transformação simples. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de um promotor simples. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de promotores múltiplos. Moléculas de iRNA simples podem ser expressas, as quais compreendem sequências de ácido nucléico múltiplas que são homólogas para locais diferentes dentro de uma ou mais pragas coleópteras (por exemplo, os locais definidos pela SEQ ID NO:2 e uma ou mais de SEQ ID NOs:1, 3 e 4), ambos em populações diferentes da mesma espécie de praga coleóptera ou em espécies diferentes de pragas coleópteras.
Em adição à transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucléico recombinante, plantas transgênicas podem ser preparadas cruzando uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta sem tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucléico recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira cepa de planta que é condescendente à transformação para produzir uma planta transgênica, planta transgênica que pode ser cruzada com uma segunda cepa de planta para introgredir a sequência de ácido nucléico que codifica a molécula de iRNA na base genética da segunda cepa de planta.
Algumas modalidades da invenção também incluem produtos comerciais contendo uma ou mais das sequências da presente invenção que são produzidos a partir de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente invenção. Um produto comercial contendo uma ou mais das sequências da presente invenção pretende incluir, mas não está limitado a, farinhas, óleos, grãos ou sementes de uma planta triturados ou inteiros ou qualquer produto alimentício compreendendo qualquer farinha, óleo ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da presente invenção em um ou mais comércio ou produtos de comércio compreendidos aqui é evidência de fato que o comércio ou produto de comércio é composto de
69/124 uma planta transgênica projetada para expressar uma ou mais sequências de nucleotídeo da presente invenção para propósito de controle de doença de planta usando métodos de supressão de gene mediados por dsRNA.
Em alguns aspectos, sementes e produtos comerciais produzi5 dos por plantas transgênicas derivadas de células de planta transformada são incluídos, em que as sementes ou produtos comerciais compreendem uma quantidade detectável de uma sequência de ácido nucléico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos comerciais podem ser produzidos, por exemplo, através da obtenção de plantas transgênicas e prepara10 ção de alimento ou ração a partir deles. Produtos comerciais compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucléico da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação: farinhas, óleos, grãos ou sementes de uma planta moídos ou inteiros e qualquer produto alimentício compreendendo qualquer farinha, óleo ou grão moído ou inteiro de uma planta ou semente recombi15 nante compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucléico da invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da invenção em um ou mais comércio ou produtos comerciais é evidência de facto que o comércio ou produto comercial é composto de planta transgênica projetada para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA da invenção para o propósito de controle de pragas coleópteras.
Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucléico da invenção pode também compreender pelo menos outro evento transgênico em seu genoma, incluindo, sem limitação: um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA se direcionando a um locus em uma praga coleóptera que não aqueles definidos pelas SEQ ID NOs:1-4; um evento transgênico a partir do qual é transcrita uma molécula de iRNA se direcionando a um gene em um organismo outro que não uma praga coleóptera (por exemplo, um nematoide parasítico de planta); um gene codificando uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringíensisy um gene de tolerância a herbicida (por exemplo, um gene provendo tolerância a glifosato); e um gene contribuindo para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal
70/124 como rendimento aumentado, metabolismo de ácido graxo alterado ou restauração de esterilidade masculina citoplásmica). Em modalidades particulares, sequências codificando moléculas de iRNA da invenção podem ser combinadas com características de controle de doença e outras característi5 cas de controle de inseto em uma planta para obter características desejadas para controle maior de doença de planta e dano de inseto. Combinação de características de controle de inseto que empregam modos de ação distintos pode prover plantas transgênicas protegidas com durabilidade superior com relação a plantas carregando uma característica de controle única, por exemplo, por causa da probabilidade reduzida que resistência à característica(s) se desenvolverá no campo.
V. Supressão de Gene Alvo em uma Praga Coleóptera
A. Visão Geral
Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molé15 cuia de ácido nucléico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser provida a uma praga coleóptera, em que a molécula de ácido nucléico leva a silenciamento de gene mediado por RNAi na praga coleóptera. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) pode ser provida ao hospedeiro da coleóptera. Em algu20 mas modalidades, uma molécula de ácido nucléico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser provida por uma praga coleóptera através do contato da molécula de ácido nucléico com a praga coleóptera. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucléico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser provida em um substrato de alimentação da praga coleóptera, por exemplo, uma composição nutricional. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucléico útil para o controle de pragas coleópteras pode ser provida através da ingestão de material de planta compreendendo a molécula de ácido nucléico que é ingerida pela praga coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucléico está presente em material de planta através da expressão de uma sequência de ácido nucléico recombinante introduzida no material de planta, por exemplo, através da transformação de uma célula de planta com um vetor compreen71/124 dendo a sequência de ácido nucléico recombinante e regeneração de um material de planta ou planta inteira a partir da célula de planta transformada. B. Supressão de Gene Alvo mediada por RNAi
Em modalidades, a invenção provê moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA e hpRNA) que podem ser projetadas para se direcionar a sequências de nucleotídeo nativas essenciais (por exemplo, genes essenciais) no genoma e/ou na biblioteca de cDNA de uma praga coleóptera (por exemplo, WCR ou NCR), por exemplo, através do projeto de uma molécula de iRNA que compreende pelo menos uma fita compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à sequência alvo. A sequência de uma molécula de iRNA então projetada pode ser idêntica à sequência alvo, ou pode incorporar incompatibilidades que não previnem hibridização específica entre a molécula de iRNA e sua sequência alvo.
As moléculas de iRNA da invenção podem ser usadas em métodos para supressão de gene em uma praga coleóptera, desta maneira reduzindo o nível ou incidência de dano causado pela praga em uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Conforme aqui usado, o termo supressão de gene refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para redução dos níveis de proteína produzida como um resultado de transcrição de gene em mRNA e subsequente tradução do mRNA, incluindo a redução de expressão de proteína a partir de um gene ou uma sequência de codificação incluindo inibição póstranscripcional de expressão e supressão transcripcional. Inibição póstranscripcional é mediada por homoiogia específica entre todo ou parte de um mRNA transcrito a partir de um gene ou sequência de codificação direcionado para supressão e a molécula de iRNA correspondente usada para supressão. E inibição pós-transcripcional refere-se à redução substancial e mensurável da quantidade de mRNA disponível na célula para ligação por ribossomos.
Em modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em
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72/124 moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de fita dupla gerada pela atividade de DICER sobre a molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de fita simples; a fita passageiro e a fita guia. A fita passageiro pode ser degradada e a fita guia pode ser incorporada a RISC. Inibição pós-transcripcional ocorre através de hibridização específica da fita guia com uma sequência especificamente complementar de uma molécula de mRNA e subsequente divagem pela enzima, Argonauta (componente catalítico do complexo RISC).
Em modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser usada. Aqueles versados na técnica vão compreender que moléculas de dsRNA são tipicamente mais estáveis durante a preparação e durante a etapa de provisão da molécula de iRNA a uma célula do que moléculas de RNA de fita simples, e são tipicamente também mais estáveis em uma célula. Desta maneira, enquanto moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, podem ser igualmente eficazes em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida devido à sua estabilidade.
Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucléico é provida, a qual compreende uma sequência de nucleotídeo, sequência de nucleotídeo que pode ser expressa in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucléico codificada por uma sequência de nucleotídeo dentro do genoma de uma praga coleóptera. Em certas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende uma estrutura haste-alça. Após uma praga coleóptera contatar a molécula de iRNA transcrita in vitro, inibição pós-transcripcional de um gene alvo em uma praga coleóptera (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.
Em algumas modalidades da invenção, expressão de uma molécula de ácido nucléico compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de ácido nucléico é usada em um método para inibição pós-transcripcional de um gene alvo em uma praga coleóptera, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19
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73/124 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2. Em certas modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5-8, 112 e/ou 113 (por exemplo, toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6). Em certas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucléico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de
88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de
93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de
98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) a qualquer um dos acima pode ser usada. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucléico pode ser expressa, a qual hibridiza especificamente para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga
74/124 coleóptera.
Nessas modalidades e em modalidades adicionais, expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucléico adicional compreendendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeo pode ser usada em um método para inibição pós-transcripcional de um gene alvo em uma praga coleóptera, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento de SEQ ID NO:4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; o complemento de um fragmente de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrito em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1, 3 e 4; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:1,
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75/124 e 4. Em certas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100% e 100%) a qualquer um dos acima pode ser usada. Nessas e em modalidades adicionais, uma molécula de ácido nucléico pode ser expressa, a qual hibridiza especificamente para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma praga coleóptera.
É uma característica importante de algumas modalidades da invenção que o sistema de inibição pós-transcripcional de RNAi seja capaz de tolerar variações de sequência dentre genes alvo que poderiam ser esperadas ser devido à mutação genética, polimorfismo de cepa ou divergência evolucionária. A molécula de ácido nucléico introduzida pode não precisar ser absolutamente homóloga ou a um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado de um gene alvo, contanto que a molécula de ácido nucléico introduzida seja especificamente hibridizável ou para um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado do gene alvo. Além disso, a molécula de ácido nucléico introduzida pode não precisar ser de comprimento integral, com relação ou a um produto de transcrição primário ou um mRNA integralmente processado do gene alvo.
Inibição de um gene alvo usando a tecnologia de iRNA da presente invenção é específica de sequência, isto é, sequências de nucleotídeo substancialmente homólogas à molécula(s) de iRNA são direcionadas para inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo idêntica a uma porção de uma sequência de gene alvo pode ser usada para inibição. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo com uma ou mais inserção, deleção e/ou mutações por ponto com relação a uma sequência de gene alvo pode ser usada. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um
76/124 gene alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos de a partir de cerca de 80%, pelo menos de a partir de cerca de 81%, pelo menos de a partir de cerca de 82%, pelo menos de a partir de cerca de 83%, pelo menos de a partir de cerca de 84%, pelo menos de a partir de cerca de 85%, pelo menos de a partir de cerca de 86%, pelo menos de a partir de cerca de 87%, pelo menos de a partir de cerca de 88%, pelo menos de a partir de cerca de 89%, pelo menos de a partir de cerca de 90%, pelo menos de a partir de cerca de 91%, pelo menos de a partir de cerca de 92%, pelo menos de a partir de cerca de 93%, pelo menos de a partir de cerca de 94%, pelo menos de a partir de cerca de 95%, pelo menos de a partir de cerca de 96%, pelo menos de a partir de cerca de 97%, pelo menos de a partir de cerca de 98%, pelo menos de a partir de cerca de 99%, pelo menos de a partir de cerca de 100% e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região duplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma porção de um transcrito de gene alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, uma sequência de comprimento menor do que integral exibindo uma homologia maior compensa uma sequência menos homóloga, mais longa. O comprimento da sequência de nucleotídeo de uma região de duplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de um transcrito de gene alvo pode ser pelo menos de cerca de 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500 ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, uma sequência maior do que 20-100 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência maior do que 200-300 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência maior do que 500-1000 nucleotídeos pode ser usada, dependendo do tamanho do gene alvo.
Em certas modalidades, expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% dentro de uma célula da praga coleóptera, de maneira que uma inibição significante ocorre. Inibição significante refere-se à inibição acima de em um limiar que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, parada do crescimento, parada de alimentação, parada do desenvolvimento e mortalidade de inseto, etc.) ou uma diminuição dei
77/124 tectável em RNA e/ou produto de gene correspondendo ao gene alvo sendo inibido. Embora em certas modalidades da invenção inibição ocorra em substancialmente todas as células da praga coleóptera, em outras modalidades inibição ocorre apenas em um subconjunto de células expressando o gene alvo.
Em algumas modalidades, supressão transcripcional é mediada pela presença em uma célula de uma molécula de dsRNA exibindo identidade de sequência substancial com uma sequência de DNA de promotor ou o seu complemento para realizar o que é referido como uma supressão trans de promotor. Supressão de gene pode ser eficaz contra genes alvos em uma praga coleóptera que pode ingerir ou contatar tais moléculas de dsRNA, por exemplo, através da ingestão ou contato do material de planta contendo as moléculas de dsRNA. Moléculas de dsRNA para uso em supressão de promotor trans podem ser especificamente projetadas para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da praga coleóptera. Supressão de gene pós-transcripcional por RNA orientado de antissenso ou senso para regular expressão de gene em células de planta é revelada nas Patentes U.S. 5.107.065; 5.759.829; 5.283.184; e 5.231.020.
C. Expressão de Moléculas de iRNA Providas a uma Praga Coleóptera
Expressão de moléculas de iRNA para inibição de gene mediada por RNAi em uma praga coleóptera pode ser realizada em qualquer um de muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser providas a uma praga coleóptera, por exemplo, através do contato das moléculas de iRNA com a praga, ou fazendo com que a praga ingira ou de outra maneira internalize as moléculas de iRNA. Algumas modalidades da invenção incluem plantas hospedeiro transformadas de uma praga coleóptera, células de planta transformadas e progênie de plantas transformadas. As células de planta transformadas e as plantas transformadas podem ser engenheiradas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para prover um efeito protetor contra praga. Desta maneira, quando uma planta ou célula de planta
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78/124 transgênica é consumida por uma praga coleóptera durante alimentação, a praga pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. As sequências de nucleotídeo da presente invenção podem ser também introduzidas em uma ampla variedade de hospedeiros microorganismo procariótico ou eucariótico para produzir moléculas de iRNA. O termo microorganismo inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tais como bactérias e fungos.
Modulação de expressão de gene pode incluir supressão parcial ou completa de tal expressão. Em outra modalidade, um método para supressão de expressão de gene em uma praga coleóptera compreende provisão no tecido do hospedeiro da praga de uma quantidade supressora de gene de pelo menos uma molécula de dsRNA transcrita a partir de uma sequência de nucleotídeo conforme aqui descrito, pelo menos um segmento da mesma é complementar a uma sequência de mRNA dentro das células da praga coleóptera. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada tal como uma molécula de siRNA, miRNA ou hpRNA, ingerida por um microorganismo patogênico de acordo com a invenção pode ser pelo menos de a partir de cerca 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou cerca de 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de ácido nucléico compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1-4. Moléculas de ácido nucléico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, mas não limitado a, sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural e construtos de DNA recombinante para transcrição de moléculas de dsRNA da presente invenção são então providas, as quais suprimem ou inibem a expressão de uma sequência de codificação endógena ou uma sequência de codificação alvo na praga coleóptera quando introduzidas na mesma.
Modalidades particulares proveem um sistema de aplicação para aplicação de moléculas de iRNA para a inibição pós-transcripcional de um ou mais gene(s) alvo em uma praga coleóptera parasítica de planta e controle de uma população da praga coleóptera parasítica de planta. Em algumas l
79/124 modalidades, o sistema de aplicação compreende ingestão de uma célula de planta transgênica hospedeira ou teores da célula hospedeiro compreendendo moléculas de RNA transcritas na célula hospedeiro. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, uma célula de planta transgênica ou uma planta transgênica é criada, a qual contém um construto de DNA recombinante transcrevendo uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. Células de planta transgênicas e plantas transgênicas compreendendo sequências de ácido nucléico codificando uma molécula de iRNA particular podem ser produzidas empregando tecnologias de DNA recombinante (tecnologias básicas que são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de planta compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, uma molécula de dsRNA estabilizada); transformar uma célula de planta ou planta; e gerar a célula de planta transgênica ou a planta transgênica que contém a molécula de iRNA transcrita.
Para fornecer resistência à praga coleóptera a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de siRNA, uma molécula de miRNA ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita a partir de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro de tecidos ou fluidos da planta recombinante. Tal molécula de dsRNA pode ser compreendida em parte de uma sequência de nucleotídeo que é idêntica a uma sequência de nucleotídeo correspondente transcrita a partir de uma sequência de DNA dentro de uma praga coleóptera de um tipo que pode parasitar a planta hospedeiro. Expressão de um gene alvo dentro da praga coleóptera é suprimida pela molécula de dsRNA, e a supressão de expressão do gene alvo na praga coleóptera resulta na planta transgênica sendo resistente à praga coleóptera. Os efeitos moduladores de moléculas de dsRNA foram mostrados ser aplicáveis a uma variedade de genes expressos em pragas incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pela metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes de manutenção;
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80/124 fatores de transcrição; genes relacionados à muda; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos em metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.
Para transcrição a partir de um transgene in vivo ou um construto de expressão, uma região reguladora (por exemplo, sinal de promotor, aumentador, silenciador e de poliadenilação) pode ser usada em algumas modalidades para transcrever a fita de RNA (ou fitas). Desta maneira, em algumas modalidades, conforme mostrado, supra, uma sequência de nucleotídeo para uso em produção de moléculas de iRNA pode ser operavelmente ligada a uma ou mais sequências promotoras funcionais em uma célula hospedeiro de planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma hospedeiro. A sequência de nucleotídeo da presente invenção, sob o controle de uma sequência promotora operavelmente ligada, pode ser flanqueada mais por sequências adicionais que afetam vantajosamente sua transcrição e/ou a estabilidade de um transcrito resultante. Tais sequências podem ser localizadas a montante do promotor operavelmente ligado, a jusante da extremidade 3’ do construto de expressão e podem ocorrer ambos a montante do promotor e a jusante da extremidade 3’ do construto de expressão.
Algumas modalidades proveem métodos para redução do dano a uma planta hospedeiro (por exemplo, uma planta de milho) causado por uma praga coleóptera que se alimenta da planta, em que o método compreende provisão na planta hospedeiro de uma célula de planta transformada expressando pelo menos uma molécula de ácido nucléico da invenção, em que a(s) molécula(s) de ácido nucléico funciona ao ser absorvida pela praga coleóptera para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga coleóptera, inibição de expressão que resulta em mortalidade, crescimento reduzido e/ou reprodução reduzida da praga coleóptera, desta maneira reduzindo o dano à planta hospedeiro causado pela praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucléico compreendem moléculas de dsRNA. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucléico compreendem moléculas de dsRNA que comI
81/124 preendem cada uma mais do que uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucléico expressa em uma célula de praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucléico consiste em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucléico expressa em uma célula de praga coleóptera.
Em algumas modalidades, um método para aumento do rendimento de uma cultura de milho é provido, em que o método compreende introdução em uma planta de milho pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivo da planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucléico, em que expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucléico inibe dano por praga coleóptera e/ou crescimento, desta maneira reduzindo ou eliminando uma perda de rendimento devido a uma infestação por praga coleóptera. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucléico compreende moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucléico expressa em uma célula de praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucléico consiste em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucléico expressa em uma célula de praga coleóptera.
Em algumas modalidades, um método para modulação da expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera é provido, o método compreendendo: transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucléico codificando pelo menos uma molécula de ácido nucléico da invenção, em que a sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada a uma sequência promotora e de terminação de transcrição; cultura da célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta incluindo uma pluralidade de células de planta transformadas; seleção de células
82/124 de planta transformadas que têm integrada a molécula de ácido nucléico em seus genomas; avaliação das células de planta transformadas quanto à expressão de uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada; seleção de uma célula de planta transgênica que expressa a molécula de iRNA; e alimentação da célula de planta transgênica selecionada a uma praga coleóptera. As plantas podem ser também regeneradas a partir de células de planta transformadas que expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucléico integrada. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nessas modalidades e em modalidades adicionais, a(s) molécula(s) de ácido nucléico compreendem moléculas de dsRNA que compreendem cada uma mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucléico expressa em uma célula de praga coleóptera. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucléico consiste em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucléico expressa em uma célula de praga coleóptera.
Moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas dentro ou sobre as sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), ou como um produto de expressão a partir de um gene recombinante incorporado em um genoma das células de planta ou incorporado em um revestimento ou tratamento de semente que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula de planta compreendendo um gene recombinante é considerada ser um evento transgênico. São também incluídos sistemas de aplicação para a aplicação de moléculas de iRNA a pragas coleópteras. Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de uma praga coleóptera. Métodos para introdução podem incluir mistura direta de iRNA com tecido de planta de um hospedeiro para a praga coleóptera, bem como aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção a tecido de planta hospedeira. Por exemplo, moléculas de iRNA podem ser pulverizadas sobre a superfície de uma planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um microorganismo, e o microorganismo pode ser aplicado à superfície da planta ou introduzido
83/124 em uma raiz ou caule através de um meio físico tal como uma injeção. Conforme discutido, supra, uma planta transgênica pode ser também geneticamente engenheirada para expressar pelo menos uma molécula de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pragas coleópteras conhecidas infestar a planta. Moléculas de iRNA produzidas através de síntese química ou enzimática podem ser também formuladas de uma maneira consistente com práticas agriculturais comuns e usadas como produtos de pulverização para controle de doença de planta. As formulações podem incluir os adesivos e umidificantes apropriados requeridos para cobertura foliar eficiente, bem como protetores de UV para proteger moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) de dano por UV. Tais aditivos são geralmente usados na indústria bioinseticida, e são bem conhecidos daqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticida de pulverização (biologicamente baseado ou de outra maneira) para aumentar a proteção de planta contra pragas coleópteras.
Todas as referências, incluindo publicações, patentes e pedidos de patente, mencionadas aqui são aqui incorporadas a título de referência até o ponto que elas não sejam inconsistentes com os detalhes explícitos da presente invenção, e são também incorporadas até o ponto como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada estar incorporada a título de referência e fosse mostrada em sua totalidade aqui. As referências discutidas aqui são providas apenas pelo seu relatório antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser considerado como uma admissão que os inventores não são autorizados a antedatar tal relatório em virtude da invenção anterior.
Os Exemplos que seguem são providos para ilustrar certas características e/ou aspectos particulares. Esses Exemplos não devem ser considerados limitar a invenção às características ou aspectos particulares descritos.
EXEMPLOS
Exemplo 1: Materiais e Métodos
Preparação da amostra e bioensaios.
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Várias moléculas de dsRNA (incluindo Cafl-180; região 1 de subunidade C de ATPase vacuolar (v-ATPase); região 2 de subunidade C de vATPase; região 1 de subunidade H de v-ATPase; região 2 de subunidade H de v-ATPase; e Rho1) foram sintetizadas e purificadas usando um estojo de RNAi MEGAscript® (AMBION, Foster City, CA). As moléculas de dsRNA purificadas foram preparadas em tampão de TE e todos os bioensaios continham um tratamento controle consistindo neste tampão, que serviu como uma checagem de base para mortalidade ou inibição de crescimento de WCR. As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando uma espectrofotômetro NanoDrop® 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).
As amostras foram testadas quanto à atividade de inseto em bioensaios conduzidos com larvas de inseto recém-nascidas em dieta de inseto artificial. Ovos de WCR foram obtidos da Crop Characteristics, Inc. (Farmington, MN).
Os bioensaios foram conduzidos em bandejas plásticas de 128 cavidades especificamente projetadas para bioensaios de inseto (C-D International, Pitman, NJ). Cada cavidade continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta planejada para crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pL de amostra de proteína foi aplicada com pipeta em uma superfície de dieta de 1,5 cm2 de cada cavidade (40 pL/cm2). As concentrações de amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área de superfície na cavidade. As bandejas tratadas foram mantidas em uma coifa até que o líquido na superfície da dieta tivesse evaporado ou fosse absorvido na dieta.
Dentro de algumas horas de eclosão, as larvas individuais foram pegas com uma escova de cabelo de camelo umedecida e depositadas na dieta tratada (uma ou duas larvas por cavidade). As cavidades infestadas das bandejas plásticas de 128 cavidades foram então vedadas com folhas adesivas de plástico transparente e ventiladas para permitir troca de gás. Bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28° C, Umidade Relativa -40%, 16:8 [Luz:Escuro]) por 9 dias, após o
85/124 que o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos e o peso de insetos sobreviventes foram registrados. A mortalidade percentual, pesos vivos médios e inibição de crescimento foram calculados para cada tratamento. Atrofiamento foi definido como uma diminuição em pesos vivos médios. Inibição de crescimento (Gl) (Growth inhibition) foi calculada como segue;
Gl = [1 - (TWIT/TNIT)/TWIBC/TNIBC)j em que TWIT é o Peso Total de Insetos vivos no Tratamento;
TNIT é o Número Total de Insetos no Tratamento;
TWIBC é o Peso Total de Insetos Vivos na Checagem de Base (controle Tampão); e
TNIBC é o Número Total de Insetos na Checagem de Base (controle Tampão).
A GI50 é determinada ser a concentração de amostra na dieta na qual o valor Gl é 50%. A LC50 (Concentração 50% Letal) é registrada como a concentração de amostra na dieta na qual 50% de insetos de teste são mortos. Análise estatística foi feita usando software JMP® (SAS, Cary, NC).
Bioensaios replicados demonstraram que ingestão de amostras resulta em uma mortalidade surpreendente e inesperada e inibição de crescimento de larvas de verme da raiz do milho.
Exemplo 2: Identificação de Genes Alvo Candidatos
Larvas de WCR no primeiro estágio foram selecionadas para análise de transcriptoma porque controle neste estágio de crescimento por tecnologia de resistência a inseto transgênico seria vantajoso.
RNA total foi isolado de larvas de WCR no primeiro estágio inteiras a partir de cerca de 0,9 g (Diabrotica virgifera virgifera LeConte; 4 a 5 dias pós-eclosão, mantidas a 16° C) e purificado usando o método baseado em fenol/TRI REAGENT® que segue (Molecular Research Center, Cincinnati, OH; No. Cat. TR 118);
As larvas foram homogeneizadas em temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até que uma suspensão homogênea fosse obtida. Seguindo 5 min de incubação em tem86/124 peratura ambiente, o homogenato foi aplicado a tubos de microcentrífiga de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados e a mistura foi vigorosamente agitada por 15 segundos. Após deixar a extração descansar em temperatura ambiente por 10 min, as fases foram separadas através de centrifugação a 12.000 x g a 4° C. A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 mL) foi cuidadosamente transferida para outro tubo estéril de 1,5 mL e um volume igual (0,6 mL) de isopropanol em temperatura ambiente foi adicionado. Após incubação em temperatura ambiente por 5 a 10 min, a mistura foi centrifugada 8 min a 12.000 x g (4° C ou 25° C).
O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado e o pélete de RNA foi lavado duas vezes através de vórtex com etanol 75%, com recuperação através de centrifugação por 5 min a 7.500 x g (4° C ou 25° C) após cada lavagem. O etanol foi cuidadosamente removido, o pélete foi deixado secar ao ar por 3 a 5 min e então foi dissolvido em água estéril livre de nucleasse. A concentração de RNA foi determinada através da medição da absorbância (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica a partir de larvas de cerca de 0,9 g deu mais de 1 mg de RNA total, com uma razão A260/A280 de 1,9. O RNA então extraído foi armazenado a -80° C até ser processado mais.
A qualidade do RNA foi determinada ativando uma alíquota através de um gel de agarose 1%. A solução de gel de agarose foi feita usando tampão de TAE 10 X autoclavado (EDTA Tris-acetato, concentração 1X é Tris-acetato 0,04M, EDTA 1 mM (sal de sódio do ácido acético tetra etilenodiamina, pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (pirocarbonato de dietila) em um recipiente autoclavado. TAE 1 X foi usado como o tampão de atividade. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente de formação de cavidade foram limpos com RNAseAway® (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA). Dois pL de amostra de RNA foram misturados com 8 pL do tampão de TE (Tris HCI 10 mM pH 7,0; EDTA 1 mM) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (Novagen® No. Catálogo 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70° C por 3 min, esfriada para temperatura ambiente e 5 pL foram carregados por cavidade (contendo 1 pg a 2 pg de RNA). Mar87/124 cadores de peso molecular de RNA comercialmente disponíveis foram simultaneamente ativados em cavidades separadas para comparação do tamanho molecular. O gel foi ativado a 60 v por 2 h.
Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada a partir do RNA total larval através de um provedor de serviço comercial (Eurofins MWG Operon, Huntsville, AL), usando início aleatório.
A biblioteca de cDNA larval normalizada foi sequenciada em escala de placa % através de química da série Titanium® GS FLX 454 na Eurofins MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento de leitura médio de 348 pb. 350.000 leituras foram montadas em mais de 50.000 contigs. Ambas as leituras não montadas e as contigs foram convertidas em bancos de dados BLASTable usando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível do National Center for Biological Information (NCBI)).
Os genes candidatos para direcionamento de RNAi foram selecionados usando informação com relação a efeitos de RNAi letais de genes particulares em outros insetos tais como Drosophila e Tribolium. Esses genes foram tomados como hipótese como sendo essenciais para sobrevivência e crescimento em insetos coleópteros. Homólogos de gene alvo selecionados foram identificados no banco de dados de sequência de transcriptoma conforme descrito abaixo. Sequências de comprimento integral ou parcial dos genes alvo foram amplificadas através de PCR para preparar moldes para produção de RNA de fita dupla (dsRNA).
Pesquisas TBLASTN usando sequências de codificação de proteína candidatas foram feitas contra bancos de dados BALSTable contendo as leituras de sequência de Diabrotica não montadas ou as contigs montadas. Combinações significantes com uma sequência de Diabrotica (definidas como melhor do que e20 para homologias de contigs e melhor do que e10 para homologias de leituras de sequência não montada) foram confirmadas usando BLASTX contra o banco de dados não redundante NCBI. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências de gene candidatas homólogas de Diabrotica identificadas na pesquisa TBLASTN na
88/124 verdade compreendiam genes de Diabrotica, ou eram a melhor combinação disponível nas sequências de Diabrotica para a sequência de gene candidata não Diabrotica. Na maioria dos casos, genes candidatos de Tribolium que foram registrados como codificando uma proteína deram uma homologia de sequência sem ambiguidade para uma sequência ou sequências nas sequências de transcriptoma de Diabrotica. Em alguns poucos casos, ficou claro que algumas das contigs de Diabrotica ou leituras de sequência não montadas selecionadas por homologia com um gene candidato de não Diabrotica se sobrepuseram, e que a montagem das contigs tinha falhado em unir essas sobreposições. Nesses casos, Sequencher® v4.9 (Gene Codes Corporation, Ann. Arbor., Ml) foi usado para montar as sequências em contigs mais longas.
Uma pluralidade de genes alvo candidatos foi identificada como genes que podem levar à mortalidade ou inibição de crescimento, desenvolvimento ou reprodução de praga coleóptera em WCR, incluindo SEQ ID NOs:1-4. Clones de comprimento integral ou parciais de sequências de homólogos de gene candidato de Diabrotica foram usados para gerar amplicons de RCR para síntese de dsRNA.
A SEQ ID NO:1 corresponde a D_vir_c47185, que é um homólogo de Cafl-180, e é aqui referida como Cafl-180. Cafl-180 de Drosophila foi mostrado funcionar na aplicação de histonas a DNA recém-sintetizado e Cafl-180. Mutações de perda de função em Cafl-180 de Drosophila foram mostradas causar parada de crescimento e desenvolvimento larvais e mortalidade larval (Klapholz e outros (2009) Chromosoma 118(2):235-48; Tyler e outros (2001) Mol. Cel. Biol. 21(19):6574-84; Song e outros (2007) Dev. Biol. 311(1):213-22).
A SEQ ID NO:2 corresponde à D_vir_c1229, que é um homólogo de subunidade C de ATPase vacuolar, e é aqui referida como VatpaseC. As SEQ ID NOs:5-8 são fragmentos de sequência não contíguos de VatpaseC.
A SEQ ID NO:3 corresponde à D_vir_c1319, que é um homólogo de subunidade H de ATPase vacuolar, e é aqui referida como VatpaseH. As
SEQ ID NOs:9-11 são fragmentos de sequência não contíguos de VatpaseH.
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ATPase vacuolar de Drosophila é um transportador de próton de subunidade múltipla envolvido em sinalização Notch (Vaccari e outros (2010) Development 137(11):1825-32). Mutações de perda de função em subunidades de ATPase vacuolar de Drosophila foram mostradas ser letais recessivas (Allan e outros (2005) Physiol. Genomics 22(2): 128-38; e Davies e outros (1996) J. Biol. Chem. 271(48):30677-84). VATPaseC (Vha44) e VATPaseH (VhaSFD) são duas subunidades de ATPase vacuolar de Drosophila.
A SEQ ID NO:4 é Contig_01_Rho1_1-191_CDC42, aqui referida como Rho1. Rho1 de Drosophila funciona na regulagem de montagem e desmontagem de fitas de actina e mutações de perda de função em Rho1 de Drosophila têm um impacto significante sobre movimento de componente celular, remodelagem de sinapse, desenvolvimento larval e resposta a estresse (Fox e outros (2005) Development 132(21 ):4819-31; Kadandale e outros (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107(23):10502-7; Rosales-Nieves e outros (2006) Nat. Cell Biol. 8(4):367-76; Magie e Parkhurst (2005) Dev. Biol. 278(1):144-54; e Xu e outros (2008) Dev. Biol. 321(1):88-100).
Exemplo 3: Amplificação de Genes Alvo
Os iniciadores foram projetados para amplificar porções de regiões de codificação de cada gene alvo através de PCR. Vide Tabela 1. Onde apropriado, uma sequência promotora de fago T7 (TTAATACGACTCACTATAGGGAGA (SEQ ID NO: 12)) foi incorporada à extremidade 5’ das fitas de senso e antissenso amplificados. Vide Tabela 1. DNA genômico foi extraído de WCR e os iniciadores de PCR foram usados para amplificar toda ou parte da sequência de gene alvo nativa do DNA genômico através de uma reação por PCR.
Tabela 1. Sequências e emparelhamentos de iniciadores de PCR usados para preparar moldes para produção de dsRNA.
Gene (Região) ID de iniciador SEQ ID NO: Sequência
Par 1 Caf1-180 (1) Caf-FT7 SEQ ID NO:13 TTAATACGACTCACTATAGGGAG ATTCGGAAGCTTCATATTTAAAAG ATC
Cafl-180 (1) Caf-R SEQ ID NO:14 TATCTTCAGCCAAAGGTTTTCTTG
Par 2 Cafl-180 (1) Caf-F SEQ ID NO:15 TTCGGAAGCTTCATATTTAAAAGA TC
Caf1-180 (1) Caf-RT7 SEQ ID NO:16 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA TATCTTCAGCCAAAGGTTTTCT TG
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Par 3 VatpaseC (1) Atp.C-F1T7 SEQ ID NO:17 TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGAAGAAATGACTGAGTATTGG
VatpaseC (1) Atp.C-R1 SEQ ID NO:18 CTGAAGACTTCCTTTCAAGT
Par 4 VatpaseC (1) Atp.C-F1 SEQ IDNO:19 AGAAGAAATGACTGAGTATTGG
VatpaseC (1) Atp.C-R1T7 SEQ ID NO:20 TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACTGAAGACTTCCTTTCAAGT
Par 5 VatpaseC (1) Atp.C-F1 SEQ ID NO:19 AGAAGAAATGACTGAGTATTGG
VatpaseC (1) Atp.C- R1shortT7 SEQ ID NO;21 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA GATGGGATATTTGGCGATGTCCCA
Par 6 VatpaseC (1) Atp.C-F1T7 SEQ ID NO:17 TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGAAGAAATGACTGAGTATTGG
VatpaseC (1) Atp.C-R1short SEQ ID NO:22 GATGGGATATTTGGCGATGTCCCA
Par 7 VatpaseC (2) Atp.C-F2T7 SEQ ID NO:23 TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGAAACAGACAGGAAGTTTACT
VatpaseC (2) Atp.C-R2 SEQ ID NO:24 GGATTAAAATAGCTTGGAAATTG AC
Par 8 VatpaseC (2) Atp.C-F2 SEQ ID NO:25 AGAAACAGACAGGAAGTTTACT
VatpaseC (2) Atp.C-R2T7 SEQ ID NO:26 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAG ATTAAAATAGCTTGGAAATT GAC
Par 9 VatpaseH (1) Atp.H-F1T7 SEQ ID NO:27 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA CATGATTGTTCCAGATATGTT GG
VatpaseH (1) Atp.H-R1 SEQ ID NO:28 AGTGTCTGCGACCAACAAGC
Par 10 VatpaseH (1) Atp.H-F1 SEQ ID NO:29 TCATGATTGTTCCAGATATGTTGG
VatpaseH (1) Atp.H-R1T7 SEQ ID NO:30 TTAATACGACTCACTATAGGGAG AGTGTCTGCGACCAACAAGC
Par 11 VatpaseH (2) Atp.H-F2T7 SEQ ID NO;31 TTAATACGACTCACTATAGGGAG AAGAACATTGTATAGCTATGGTG
VatpaseH (2) Atp.H-R2 SEQ ID NO:32 ATTTACGCCTTGCCTGCGAC
Par 12 VatpaseH (2) Atp.H-F2 SEQ ID NO:33 AGAACATTGTATAGCTATGGTG
VatpaseH (2) Atp.H-R2T7 SEQ ID NO:34 TTAATACGACTCACTATAGGGAGA TTTACGCCTTGCCTGCGAC
Par 13 Rho1 (1) Rho1-FT7 SEQ ID NO:35 TTAATACGACTCACTATAGGGAG ACAGGTCCGATGGCTGCAATAAG
Rho1 (1) Rho1-R SEQ ID NO:36 GACTTGCAGTGCAGCTCGGG
Par 14 Rho1 (1) Rho1-F SEQ ID NO:37 CAGGTCCGATGGCTGCAATAAG
Rho1 (1) Rho1-RT7 SEQ ID NO:38 TTAATACGACTCACTATAGGGAG AGACTTGCAGTGCAGCTCGGG
Exemplo 4: Construtos de RNAi
Preparação de molde através de PCR e síntese de dsRNA
A estratégia usada para prover moldes específicos para produção de dsRNA in vitro é mostrada na FIGURA 1. Os DNAs de molde pretendidos para uso em síntese de dsRNA foram preparados através de PCR usando os pares de iniciador na Tabela 1 e (como molde de PCR) cDNA de primeira fita preparado a partir de RNA total isolado de larvas de primeiro estágio de WCR. Para cada região de gene alvo selecionada, duas amplificações por PCR separadas foram realizadas. A primeira amplificação por PCR introduziu uma sequência promotora T7 na extremidade 5’ das fitas de senso amplificadas. A segunda reação incorporou a sequência promotora T7 nas extremidades 5’ das fitas de antissenso. Os dois fragmentos amplificados de PCR para cada região dos genes alvo foram então misturados em quantidades aproximada91/124 mente iguais e a mistura foi usada como molde de transcrição para produção de dsRNA. FIGURA 1. RNA de fita dupla foi sintetizado e purificado usando um estojo de RNAi Ambíon® MEGAscript® seguindo as instruções do fabricante (Foster City, CA). As sequências dos moldes de dsRNA amplificados com os iniciadores particulares foram: SEG ID NO:86 (Caf1-180); SEQ ID NOs:7 e 8 (VatpaseC); SEQ ID NOs:10 e 11 (VatpaseH); e SEQ ID NO:87 (Rho1). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NanoDrop® 8000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE).
Construção de vetores de transformação de planta - Método 1
Métodos de clonagem Multi-site Gateway® (Invitrogen) padrão foram usados para construir vetores de expressão de RNA grampo de cabelo (hpRNA) para transformação de célula de milho mediada por WHISKERS®. Vetores de inserção separados foram construídos para os dois genes marcadores utilizados para avaliação/seleção de células de milho após transformação; um gene da proteína amarelo fluorescente (YFP, Shagin e outros (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50) e um gene de tolerância a herbicida (fosfinotricin acetil transferase (PAT), Wehrmann e outros (1996) Nat. Biotechnol. 14(10):1274-8). A expressão de cada um desses foi controlada por uma cópia de um promotor da actinal do arroz (OsActl, Patente U.S. 5.641.876). Um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3’ de um gene da peroxidase 5 do milho (ZmPerõ 3’ UTR v2, Patente U.S. 6.699.984) foi usado para terminar a transcrição dos genes.
Um terceiro tipo de vetor de inserção, projetado para produção de hpRNA, foi também construído utilizando fragmentos do gene Caf1-180 ou do gene de VatpaseC. Regiões de gene alvo para Caf1-180 e VatpaseC foram amplificadas para síntese de grampo de cabelo usando os iniciadores mostrados na Tabela 2. Formação de grampo de cabelo intramolecular por transcritos primários de RNA foi facilitada dispondo (dentro de uma unidade de transcrição simples) duas cópias do fragmento de gene alvo em orientação oposta uma à outra, os dois fragmentos sendo separados por uma sequência de íntron ST-LS1 (Vancanneyt e oufros(1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Produção do transcrito de mRNA primário foi direcionada por
92/124 uma cópia do promotor 1 da ubiquitina do milho (Patente U.S. 5.510.474). Desta maneira, o transcrito de mRNA primário contém duas sequências de fragmento de gene como repetições invertidas grandes uma da outra, separadas pela sequência de íntron. Um fragmento compreendendo uma região não traduzida 3’ de um gene da lipase do milho (ZmLip 3’ UTR, Patente U.S. 7.179.902) foi usado para terminar a transcrição dos genes.
Tabela 2. Sequências e emparelhamentos de iniciadores usados para preparar construtos grampo de cabelo para transformação de milho.
Gene ID de iniciador SEQ ID NO: Sequência
Par 15 Cafl-180 hpCaf-F SEQ ID NO:39 GAGAGGTACCTCGGAAGCTTCATATTT AAGATCTGTC
Caf1-180 hpCaf-R SEQ ID NO:40 CTCTGGATCCAAAATGΊΤΊ ΓΙ IAI1TCA CCAAAGGTTTTC
Par 16 Caf1-180 hp-invCaf-F SEQ ID NO: 41 AGAGCCATGGAAAATGI IΊ Tf ΓΑΟΤΤΑ CCAAAGGTTTTC
Caf1-180 hp-invCaf-R SEQ ID NO:42 CTCTGAGCTCTCGGAAGCTTCATATTT AAAGATCTGTC
Par 17 ST-SL1 ST-LS1-F SEQ ID NO:43 AGAGGGATCCAGGCCTAGGTATGTTC GCTTCTACCTTTGAT
ST-SL1 ST-LS1-R SEQ ID NO:44 CTCTCCATGGACCGGTATTTAAATACT CACATCACCATGTTTTGG
Par 18 VatpaseC hpATPaseC-F SEQ ID NO:45 AGAGGGTACCAGAAGAAATGACTGAG ATTGGTTGATATC
VatpaseC hpATPaseC-R SEQ ID NO.46 CTCTGGATCCGATGGGATATTTGCGAT TCC
Par 19 VatpaseC hp-invATPaseC-F SEQ ID NO:47 AGAGCCATGGGATGGGATATTTGGCA TCC
VatpaseC hp-invATPaseC- R SEQ ID NO:48 GCTGAGCTCAGAAGAAATGACTGAGT TTGGTTGATATC
A SEQ ID NO:49 apresenta uma sequência de formação de grampo de cabelo de Caf1-180 e a SEQ ID NO:50 apresenta uma sequência de formação de grampo de cabelo de VatpaseC.
Duas versões de vetores de inserção de expressão de hpRNA foram construídas para cada um de Caf1-180 e VatpaseC. Em uma primeira versão dos vetores de inserção, uma sequência de contexto de início de tra15 dução de consenso de milho estava presente na sequência líder não traduzida 5’ de mRNA, adjacente à extremidade 5’ da primeira sequência de fragmento de gene alvo, que estava presente na orientação direta (isto é, na orientação de senso com relação ao promotor). A sequência de início de tradução de consenso de milho foi omitida em uma segunda versão.
Uma reação de recombinação GATEWAY® padrão foi realizada com 3 vetores de inserção e um vetor de destino (pDAB104124) usando LC
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CLONASE II PLUS® da Invitrogen. Em um vetor de expressão de hpRNA completado, o cassete de hpRNA foi flanqueado pelos cassetes de expressão de gene da YFP e da PAT.
Purificação de fragmento para transformação mediada por WHISKERS® foi realizada em uma escala preparativa através de cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) após os DNAs do vetor de expressão YFP/hpRNA/PAT terem sido digeridos ou com Bcl I (para construtos de Cafl180) ou Bbs I mais Afe I (para construtos de VatpaseC) para remover o gene de resistência à espectinomicina bacteriana presente na estrutura principal do vetor.
Construção de vetores de transformação de planta - Método 2
Vetor de Destino WHISKERS®: Metodologia de clonagem GATEWAY® (INVITROGEN) de um sítio padrão foi usada para construir um vetor de expressão de RNA grampo de cabelo (hpRNA) para transformação de célula de milho mediada por WHISKERS®. Dois genes marcadores foram incorporados a um vetor de destino (chamado pDAB108916) e foram utilizados para avaliação e seleção de células de milho após transformação. Um gene da proteína amarelo fluorescente (YFP, Shagin e outros (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50) foi usado para avaliação visual, e um gene de tolerância a herbicida (fosfinotricin acetil transferase (PAT), Wehrmann e outros (1996) Nat. Biotechnol. 14(10):1274-8) foi usado para seleção de transformantes. A expressão de cada um dos dois genes marcadores foi controlada por cópias separadas de um promotor de badnavírus baciliforme da cana-deaçúcar (SCBV) (Patente U.S. 6.489.462) compreendendo uma sequência 5’UTR quimérica montada a partir de uma porção da 5’UTR do gene da proteína de revestimento do vírus da estria do milho (Acesso GENBANK X01633) e íntronl de um gene da desidrogenase 1 de álcool do milho (Acesso GENBANK X04049). Um fragmento compreendendo uma 3’UTR de um gene da lipase do milho (ZmLip 3’ UTR; Patente U.S. 7.179.902) e um fragmento compreendendo uma 3’UTR de batata (Solanum tuberosurrí) 3'UTR StPinll (An e outros (1989) Plant Cell. 1:115-122) foram usados para terminar a transcrição dos genes da YFP e da PAT, respectivamente.
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Um primeiro vetor de inserção projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos de DNA carregando uma sequência de senso v3 de Cafl-180 (intron +ST-LSI) (SEQ ID NO:95) e fragmentos carregando uma sequência de antissenso v3 de Cafl-180 (SEQ ID NO:96). Esses fragmentos foram separadamente sintetizados por um vendedor comercial (DNA2.0; Menlo Park, CA). Os pedaços sintéticos foram unidos em orientação apropriada através de métodos de clonagem padrão para formar o construto de formação de grampo de cabelo de SEQ ID NO:97 e o construto foi clonado entre uma sequência promotora e de 3’UTR no vetor de inserção. Produção do transcrito de mRNA primário foi direcionada por uma cópia do promotor 1 da ubiquitina do milho (Patente U.S. 5.510.474), enquanto uma sequência compreendendo uma região não traduzida 3’ de um gene 5 da peroxidase do milho (ZmPerõ 3’ UTR v2, Patente U.S. 6.699.984) foi usada para terminar a transcrição do fragmento de gene alvo. Formação de grampo de cabelo intramolecular por transcritos primários de RNA foi facilitada dispondo (dentro de uma unidade de transcrição simples) duas cópias do fragmento de gene alvo em orientação oposta uma à outra, os dois fragmentos sendo separados por uma sequência de intron ST-LS1 (Vancanneyt e outros(1Q9Q) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Desta maneira, o transcrito de mRNA primário contém as duas sequências de fragmento de gene como repetições invertidas grandes uma da outra, separadas pela sequência de intron.
Uma reação de recombinação GATEWAY® padrão foi realizada com o vetor de inserção grampo de cabelo v3 de Caf-180 construído e vetor de destino pDAB108916, usando LR CLONASE II PLUS® da INVITROGEN. Em um vetor de expressão de hpRNA v3 de Caf-180 completado (pDAB109830), o cassete de expressão de gene de YFP foi flanqueado pelos cassetes de expressão de hpRNA e gene de PAT.
De uma maneira similar, métodos de clonagem GATEWAY® de um sítio padrão foram usados para construir outros vetores de expressão de
RNA grampo de cabelo (hpRNA) para transformação de célula de milho mediada por WHISKERS®. Esses vetores adicionais compreendiam construtos de hpRNA para v3 de VatpaseC, v4 de VaptaseC, v1 de VaptaseH e Rhol de v1.
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Um segundo vetor de inserção projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos compreendendo uma sequência de senso de v3 de VatpaseC (íntron +ST-LS1) (SEQ ID NO:98) e uma sequência de antissenso de v3 de VatpaseC (SEQ ID NO:99), unidas em orientação apropriada (SEQ ID NO: 100) através de métodos de clonagem padrão. O vetor de inserção de v3 de VatpaseC usado para clonagem GATEWAY® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir o vetor de expressão de hpRNA de v3 de VatpaseC pDAB109828.
Um terceiro vetor de inserção projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos compreendendo uma sequência de senso de v4 de VatpaseC (íntron +ST-LS1) (SEQ ID NO:101) e uma sequência de antissenso de v4 de VatpaseC (SEQ ID NO:102), unidas em uma orientação apropriada (SEQ ID NO:103) através de métodos de clonagem padrão. O vetor de inserção de v4 de VatpaseC foi usado para clonagem GATEWAY® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir o vetor de expressão de hpRNA de v4 de Vatpase pDAB109838.
Um quarto vetor de inserção projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos compreendendo uma sequência de senso de v1 de VatpaseH (íntron +ST-LS1) (SEQ ID NO:104) e uma sequência de antissenso de v1 de VatpaseH (SEQ ID NO: 105), unidas em orientação apropriada (SEQ ID NO:106) através de métodos de clonagem padrão. O vetor de inserção de v1 de VatpaseH foi usado para clonagem GATEWAY® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir o vetor de expressão de hpRNA de v1 de VatpaseH pDAB109829.
Um quinto vetor de inserção projetado para produção de hpRNA foi construído utilizando fragmentos sintéticos compreendendo uma sequência de senso de v1 de Rho1 (íntron +ST-LS1) (SEQ ID NO:107) e uma sequência de antissenso de v1 de Rho1 (SEQ ID NO:108), unidas em orientação apropriada (SEQ ID NO: 109) através de métodos de clonagem padrão. O vetor de inserção de v1 de Rho1 foi usado para clonagem GATEWAY® com o vetor de destino (pDAB108916) para construir vetor de expressão de hpRNA de v1 de Rho1 pDAB109834.
I
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Transformação mediada por WHISKERS® foi realizada usando DNA de plasmídeo circular purificado. EXEMPLO 9.
Vetor de destino de Agrobacterium: Métodos de clonagem GATEWAY® (Invitrogen) padrão foram usados para construir vetores de expressão de RNA grampo de cabelo (hpRNA) para transformação de embrião de milho mediada por Agrobacterium. Vetores de inserção preparados acima para produção de hpRNAs para v3 de Caf-180, v3 de VatpaseC, v1 de VatpaseH e v1 de Rhol foram usados para clonagem GATEWAY® com um vetor de destino (pDAB108915) construído como um vetor binário de transformação de planta de Agrobacterium. Entre as sequências de repetição de borda de T-DNA da esquerda e da direita foi incluído um gene marcador selecionável /de tolerância a herbicida de planta compreendendo a sequência de codificação para a proteína AAD1 (Patente U.S. 7.838.773) sob o controle transcripcional do promotor de SCBV conforme descrito acima. Terminação de transcrição e poliadenilação dos mRNAs aad1 foram determinadas por uma 3’UTR de lipase de milho, essencialmente conforme revelado como bases 921 a 1277 de No. de Acesso GENBANK® gb|L35913.1|MZELIPASE e na Patente U.S. 7.179.902. Os vetores de expressão binários de hpRNA resultantes foram chamados pDAB109817 (para v3 de Caf-180), pDAB109815 (para v3 de VatpaseC), pDAB109816 (para v1 de VatpaseH) e pDAB109821 (para v1 de Rhol).
Para transformação de milho, os vetores de expressão binários de hpRNA foram introduzidos em cepa DAt13192 de Agrobacterium tumefaciens desarmada, conforme descrito no Pedido de Patente Internacional PCT No. PCT/US11/046028 depositado em 29 de julho de 2011, que é aqui incorporado em sua totalidade.
Exemplo 5: Avaliação de Genes Alvo Candidatos dsRNA sintético projetado para inibir algumas, mas não todas, as sequências de gene alvo identificadas no Exemplo 2 causou mortalidade e inibição de crescimento quando administrado a WCR em ensaios baseados em dieta. Cafl-180; VatpaseC; VatpaseH; e Rhol foram observados exibir eficácia muito aumentada neste ensaio com relação a outros dsRNAs
97/124 avaliados.
Bioensaios replicados demonstraram que ingestão de construtos transcritos em dsRNA de Cafl-180 (SEQ ID NO:110); dsRNA de região 1 de VatpaseC (SEQ ID NO:111); dsRNA curto de região 1 de VatpaseC (SEQ ID
NO: 12); dsRNA de região 2 de VatpaseC (SEQ ID NO: 113); dsRNA de região 1 de VatpaseH (SEQ ID NO:14); dsRNA de região 2 de VatpaseH (SEQ ID NO:115); dsRNA de Rhol (SEQ ID NO:116) resultaram, cada um, em mortalidade e inibição de crescimento robustas surpreendentes de larvas de verme da raiz do milho do oeste. As Tabelas 3 e 4 mostram os resultados de bioensaios de alimentação baseado na dieta de larvas de WCR seguindo exposição de 9 dias a esses dsRNAs. As FIGURAS 2-4 mostram gráficos de variabilidade para a mortalidade e inibição de crescimento de pragas coleópteras tratadas com moléculas de ácido nucléico exemplares.
Tabela 3. Resultados de bioensaios de alimentação de dieta de verme da raiz do milho do oeste (após 9 dias de alimentação)
Nome da Amostra LC50 Faixa de LC50 LCeo Faixa de LC$q GI50 Faixa de GI50 Glso Faixa de Glso
Cafl-180 106* 38-308 ND** ND 22 6-79 558 72-1000+
Região 1 de VatpaseC 9 0,14-83 ND ND 1,8 0,4-9,3 20 1,2-344
Região 1 curta de VatpaseC 13,4 3,6-45 ND ND <1,0 33 2-250+
Região 2 de VatpaseC 2,7 0,18-11,5 >1000 ND 5,1 0,4-68,4 87 0,53-1000+
Região 1 de VatpaseH 2 0,5-4,6 357 91-1000+ 1,7 0,9-3,0 11 4,0-30
Região 2 de VatpaseH 0,70 0,04-2,83 168 40-1000+ 3,2 1,3-7,7 13,9 2,6-72,7
*Unidades de dose são ng/cm2 **ND = não determinado
Tabela 4. Resultados de bioensaios de alimentação de dieta de verme da raiz de milho do oeste (após 9 dias de alimentação).
Nome da Amostra Dose (ng/cm2) % de Mortalidade Média Gl Média
Rho1 1000 84* 0,824
Tampão de TE 0 29,5 0
Água 0 31 0
LC50 Faixa de LC50 GI50
Rho1 302 92-1000+ <4,0
*Contagens de mortalidade de Rho1 significantemente diferentes de contagens de Tampão de TE ou Água (razão de probabilidade P<0,0001)
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Foi anteriormente sugerido que certos genes de Diabrotica spp. podem ser explorados para controle de inseto mediado por RNAi. Vide Publicação de Patente U.S. No. 2007/0124836, que revela 906 sequências, e Patente U.S. 7.614.924, que revela 9.112 sequências. No entanto, foi determinado que muitos genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Foi também determinado que Cafl-180, VatpaseC, VatpaseH e Rhol proveram, cada um, controle superior surpreendente e inesperado de Diabrotica, comparado com outros genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto mediado por RNAi.
Anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4 foram cada um sugeridos na Patente U.S. 7.614.924 ser eficazes em controle de inseto mediado por RNAi. A SEQ ID NO:51 é a sequência de DNA da região 1 da Anexina e a SEQ ID NO:52 é a sequência de DNA da região 2 da Anexina. A SEQ ID NO:53 é a sequência de DNA de região 1 da beta espectrina 2 e a SEQ ID NO:54 é a sequência de DNA da região 2 da beta espectrina 2. A SEQ ID NO:55 é a sequência de DNA da região 1 de mtRP-L4 e a SEQ ID NO:56 é a sequência de DNA da região 2 de mtRP-L4. Uma sequência de YFP (SEQ ID NO:57) foi também usada para produzir dsRNA como um controle negativo.
Cada uma dessas sequências foi usada para produzir dsRNA através dos métodos do Exemplo 4 e os dsRNAs foram cada um testados através dos mesmos métodos de bioensaio com base em dieta descritos acima. A Tabela 5 lista as sequências dos iniciadores usados para produzir as moléculas de dsRNA de anexina, beta espectrina 2 e mtRP-L4. A Tabela 6 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação com base em dieta de larvas de WCR seguindo exposição de 9 dias a essas moléculas de dsRNA. Bioensaios replicados demonstraram que ingestão desses dsRNAs não resultou em nenhuma mortalidade ou inibição de crescimento de larvas do verme da raiz do oeste acima daquela vista com amostras controle de tampão de TE, YFP ou água.
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Tabela 5. Sequências e emparelhamentos de iniciadores usados para amplificar regiões de gene de anexina, beta espectrina 2, mtRP-L4 e YFP para síntese de dsRNA
Gene (Região) ID do iniciador SEQ ID NO: Sequência
Par 20 Anexina (1) An-F1T7 SEQ ID NO;58 TTAATACGACTCACTATAGGGA GAGCTCCAACAGTGGTTCCTT ATC
Anexina (1) An-R1 SEQ ID NO:59 CTAATAATTCrn I I rAATGTT CCTGAGG
Par 21 Anexina (1) An-F1 SEQ ID NO:60 GCTCCAACAGTGGTTCCTTATC
Anexina (1) An-R1T7 SEQ ID NO;61 TTAATACGACTCACTATAGGGA GACTAATAATTCTTTTTTAATG TTCCTGAGG
Par 22 Anexina (2) An-F2T7 SEQ ID NO.62 TTAATACGACTCACTATAGGGA GATTGTTACAAGCTGGAGAACT TCTC
Anexina (2) An-R2 SEQ ID NO.63 CTTAACCAACAACGGCTAATA AGG
Par 23 Anexina (2) An-F2 SEQ ID NO:64 TTGTTACAAGCTGGAGAACTTC TC
Anexina (2) An-R2T7 SEQ ID NO;65 TTAATACGACTCACTATAGGGA GACTTAACCAACAACGGCTAAT AAGG
Par 24 B-spect2 (1) Betaesp2-F1T7 SEQ ID NO:66 TTAATACGACTCACTATAGGG AGAAGATGTTGGCTGCATCTA GAGAA
B-espect2 (1) Betaesp2-R1 SEQ ID NO:67 GTCCATTCGTCCATCCACTGCA
Par 25 B-espect2 (1) Betaesp2-F1 SEQ ID NO:68 AGATGTTGGCTGCATCTAGAG AA
B-espect2 (1) Betaesp2-R1T7 SEQ ID NO;69 TTAATACGACTCACTATAGGGA GAGTCCATTCGTCCATCCACT GCA
Par 26 B-espect2 (2) Betaesp2-F2T7 SEQ ID NO:70 TTAATACGACTCACTATAGGG AGAGCAGATGAACACCAGCGA GAAA
B-espect2 (2) Betaesp2-R2 SEQ ID NO;71 CTGGGCAGCTTCTTGTTTCCTC
Par 27 B-espect2 (2) Betaesp2-F2 SEQ ID NO;72 GCAGATGAACACCAGCGAGA AA
B-espect2 (2) Betaesp2-R2T7 SEQ ID NO:73 TTAATACGACTCACTATAGGGA GA- GACTGGGCAGCTTCTTGTTTC CTC
Par 28 mtRP-L4 (1) L4-F1T7 SEQ ID NO:74 TTAATACGACTCACTATAGGGA GAAGTGAAATGTTAGCAAATAT AACATCC
mtRP-L4(1) L4-R1 SEQ ID NO:75 ACCTCTCACTTCAAATCTTGAC TTTG
Par 29 mtRP-L4(1) L4-F1 SEQ ID NO:76 AGTGAAATGTTAGCAAATATAA CATCC
mtRP-L4(1) L4-R1T7 SEQ ID NO:77 TTAATACGACTCACTATAGGGA GAACCTCTCACTTCAAATCTTG ACTTTG
100/124
Par 30 mtRP-L4 (2) L4-F2T7 SEQ ID NO:78 TTAATACGACTCACTATAGGGA GACAAAGTCAAGATTTGAAGTG AGAGGT
mtRP-L4 (2) L4-R2 SEQ ID NO:79 CTACAAATAAAACAAGAAGGA CCCC
Par 31 mtRP-L4 (2) L4-F2 SEQ ID NO.80 CAAAGTCAAGATTTGAAGTGA GAGGT
mtRP-L4 (2) L4-R2T7 SEQ ID NO:81 TTAATACGACTCACTATAGGGA GACTACAAATAAAACAAGAAGG ACCCC
Par 32 YFP YFP-FT7 SEQ ID NO:82 TTAATACGACTCACTATAGGGA GACACCATGGGCTCCAGCGG CGCCC
YFP YFP-R SEQ ID NO:83 AGATCTTGAAGGCGCTCTTCA GG
Par 33 YFP YFP-F SEQ ID NO:84 CACCATGGGCTCCAGCGGCG CCC
YFP YFP-RT7 SEQ ID NO:85 TTAATACGACTCACTATAGGGA GAAGATCTTGAAGGCGCTCTT CAGG
Tabela 6. Resultados de bioensaios de alimentação com base em dieta de dsRNA de larvas do verme da raiz de milho do oeste (após 9 dias de alimentação)
NOME DO GENE DOSE (NG/CM2) PESO MÉDIO POR INSETO (MG) % DE MORTALIDADE MÉDIA INIBIÇÃO DE CRESCIMENTO MÉDIA
Anexina-região 1 1000 0,545 0 -0,262
Anexina-região 2 1000 0,565 0 -0,301
Beta espectrina2 região 1 1000 0,340 12 -0,014
Beta espectrina2 região 2 1000 0,465 18 -0,367
mtRP-L4 região 1 1000 0,305 4 -0,168
mtRP-L4 região 2 1000 0,305 7 -0,180
Tampão de TE 0 0,430 13 0,000
Água 0 0,535 12 0,000
YFP 1000 0,480 9 -0,386
Exemplo 6: Efeitos de Comprimento de Sequência sobre Eficácia de dsRNA de VatpaseC dsRNAs de subunidade C de ATPase vacuolar (VatpaseC) variando em tamanho de a partir de 349 a 500 pb eram ativos em ensaios de alimentação com dieta contra larvas do verme da raiz do milho do oeste. Tabela 3. Para determinar a dependência do comprimento da eficácia de molé10 cuias de dsRNA, os comprimentos de dsRNAs de VatpaseC foram variados e testados. Sequências foram escolhidas para representar as 15-, 25-, 50- e
100-bases terminais 5’ e as 100-, 50-, 25- e 15- bases terminais 3’ de um
101/124 segmento de 174 pares de base da sequência de codificação de VatpaseC (SEQ ID NO:2).
Fragmentos de dsRNA representando as sequências de VatpaseC 5’ e 3’ de 15 pb e 25 pb foram sintetizados por um vendedor comercial (INTEGRATED DNA TECHNOLOGIES; Coralville, IA). Tabela 7. Os fragmentos de dsRNA de 5’ e 3’ de 50 pb e 100 pb e o fragmento de dsRNA de 174 pb de comprimento integral foram regenerados a partir de moldes de DNA amplificados por PCR usando polimerase de RNA T7 seguindo as instruções de um estojo de RNAi MEGAscript® (AMBION®, Foster City, CA) u10 sando os iniciadores listados na Tabela 8. A combinação de iniciadores usada para amplificar os vários comprimentos de moldes de DNA é listada na Tabela 9.
Tabela 7. RNAs sintéticos projetados para servir como dsRNAs de VatpaseC de 15 pb e 25 pb (de extremidade cega)
Nome do dsRNA Sequência de fita de senso (5' para 3') Identificador de sequência
VatpaseC5'-15 AUGACUGAGUAUUGG SEQ ID NO:117
VatpaseC5'-25 AUGACUGAGUAUUGGUUGAUAUCUG SEQ ID NO:118
VatpaseC3'-15 CUUUCUGAUGAUCUG SEQ ID NO:119
VatpaseC3'-25 GUUAGUAGGACUUUCUGAUGAUCUG SEQ ID NQ:120
Tabela 8. Iniciadores de PCR usados para gerar vários comprimentos de moldes de DNA de VatpaseC compreendendo uma sequência
promotora T7 (su blinhada) para síntese de dsRNA
Nome do iniciador Sequência de iniciador SEQ ID NO. Fita
VatpaseC-FT7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAAT GACTGAGTATTGGTTGATATCTGC SEQ ID NO:121 senso
VatpaseC-R50T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGATG TTGACAGGTCTTATCCCCT SEQ ID NO: 122 antis- senso
VatpaseC-R100T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGATTG ACAAATTATTCTGTTTACTTGTCATAT SEQ ID NO:123 antis- senso
VatpaseC-RT7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGACAG ATCATCAGAAAGTCCTACTAACTG SEQ ID NO:124 Antis- senso
VatpaseC-F50T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAC TTGAAAGTTGGTACTCTGGAT SEQ ID NO:125 senso
VatpaseC-F100T7 TTAATACGACTCACTATAGGGAGAGAC AAGTAAACAGAATAATTTGTCAACC SEQ ID NO:126 senso
102/124
Tabela 9. Combinações de iniciador usadas em PCR para gerar moldes de DNA de VatpaseC para síntese de vários comprimentos de dsRNA.
Nome do dsRNA Par de iniciador Comprimento do Amplicon (pb)* Comprimento do dsRNA (pb)** Ponto de partida para o comprimento
VatpaseC5'-50 VatpaseC-FT7 & VatpaseC-R50T7 50 + 48 = 98 50 + 12 = 62 Extremidade 5’
VatpaseC5'-100 VatpaseC-FT7 & VatpaseC-R100T7 100 + 48 = 148 100 + 12 = 112 Extremidade 5’
VatpaseC-174 VatpaseC-FT7 & VatpaseC-RT7 174 + 48 = 222 174 + 12 = 186 Extremidade 5’
VatpaseC3'-50 VatpaseC-F50T7 & VatpaseC-RT7 51 + 48 = 99 51 + 12 = 63 Extremidade 5’
VatpaseC3'-100 VatpaseC-F100T7 & atpaseC-RT7 100 + 48 = 148 100 + 12 = 112 Extremidade 5’
*Sequência de promotor T7 (24 pb) adicionada à extremidade 5’ de ambos os iniciadores, resultando na adição de 48 pb aos amplicons.
**GGGAGA da sequência de promotor T7 é adicionado à extremidade 5’ de ambas as fitas de dsRNA durante transcrição, resultando na adição de 12 pb aos transcritos.
dsRNAs de VatpaseC (isto é, VatpaseC 5'-15, VatpaseC 5'-25, 10 VatpaseC 5'-50, VatpaseC 5-100, VatpaseC 3'-15, VatpaseC 3'-25, VatpaseC 3'-50, VatpaseC 3-100 e VatpaseC-174) foram cada um testados em uma dose única (1000 ng/cm2) quanto à atividade (letalidade) usando ensaios de alimentação com dieta com larvas de verme da raiz de milho do oeste. Conforme mostrado na Tabela 10, atividades dessas amostras de dsRNA (conforme medido através da mortalidade larval percentual no dia 9 de alimentação) são diferentes. Alimentação das amostras de dsRNA de VatpaseC de 15 pb e 25 pb (ambas 5’ e 3’) não induziu mortalidade larval significante, que é um resultado similar ao controle negativo usando dsRNA de YFP. No entanto, ambos os dsRNAs de VatpaseC 5’ e 3’ de 100 pb e dsR20 NAs de VatpaseC 5’ e 3’ de 174 pb resultaram em mortalidade larval alta similarmente inesperada. As duas amostras de dsRNA de 50 pb mostraram resultados diferentes nos ensaios de alimentação; a amostra de dsRNA de
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VatpaseC5’-50 não resultou em mortalidade larval significante, mas mostrou atrofiamento significante, enquanto a amostra de dsRNA VatpaseC3’-50 causou quase que 60% de mortalidade, que é um nível quase tão alto quanto os valores obtidos com amostras de dsRNAs de 100 pb e 174 pb. Tabela
10.
Ainda, as atividades dos dsRNAs de VatpaseC foram determinadas em seis doses de teste (1,0, 3,9, 62,5, 250 e 1000 ng/cm2) para obter valores de LC50 e GI50 relativos. Tabela 11.0 valor de LC50 obtido com a amostra de VatpaseC 3’-100 foi 3,01 ng/cm2, que foi o valor mais baixo ob10 servado (isto é, a potência mais alta). De nota particular é o valor de LC50 de 9,81 ng/cm2 obtido com a amostra de VatpaseC-174. O construto planejado para produzir um grampo de cabelo de v4 de VatpaseC em plantas de milho mostrou atividade quando testado com plantas cultivadas em estufa. Exemplo 10; Tabela 18. Este fragmento de sequência de v4 de VatpaseC (166 pb) é quase idêntico à sequência de VatpaseC-174 descrita aqui; a sequência de VatpaseC-174 descrita aqui não tem apenas 8 pb (ATGACTGA) na extremidade 5’ do fragmento de sequência de v4 de VatpaseC de 166 pb.
Tabela 10. Resultados de bioensaios de alimentação com dieta de dsRNA de larvas de verme da raiz do milho do oeste (após 9 dias de ali20 mentação) utilizando comprimentos diferentes de dsRNA de VatpaseC a 1000 ng/cm2
Amostra Réplicas Mortalidade % Média Inibição de Crescimento % Média (Gl)
VatpaseC 3'-15 4 12,33 B* 10,28 BC**
VatpaseC 3'-25 4 6,07 B -28,85 C
VatpaseC 3'-50 4 59,38 A 83,60 A
VatpaseC 3'-100 4 69,76 A 84,43 A
VatpaseC-174 2 67,65 A 84,70 A
VatpaseC 5'-15 4 2,94 B 11,50 BC
VatpaseC 5'-25 4 5,00 B 6,90 BC
VatpaseC 5'-50 4 19,12 B 54,75 AB
VatpaseC 5'-100 4 73,53 A 88,75 A
VatpaseC-174 4 71,60 A 83,00 A
YFP (controle neg.) 6 10,12 B 0,09 BC
*Valores de mortalidade % média seguido pela mesma letra não são significantemente diferentes uns dos outros no nível de P = 0,05 (conforme calculado através de comparação de médias ANOVA/Tukey). Valores de mortali104/124 dade para controles negativos sem dsRNA (tampão de TE; e água) foram menos do que 20% e não são mostrados.
**Valores Gl % Médios seguidos pela mesma(s) letra(s) não são significantemente diferentes uns dos outros em P=0,05 (calculado através de comparação de médias ANOVA/Tukey). O peso larval das larvas alimentadas com dsRNA de YFP controle negativo foi usado como a base para o cálculo de Gl.
Tabela 11. Valores de LC50 e Gl5o para comprimentos diferentes de dsRNA de VatpaseC providos a 1,0, 3,9, 62,5, 250 e 1000 ng/cm2 a larvas de verme da raiz do milho do oeste (após 9 dias de alimentação)
Amostra Réplicas LC50 (ng/cm2) GI50 (ng/cm2)
VatpaseC3'-50 4 144,88 9,56
VatpaseC3'-100 4 3,01 0,25
VatpaseC5'-100 4 17,49 0,85
VatpaseC-174 4 9,81 0,23
Exemplo 7: Efeitos de Variação de Sequência de dsRNA sobre a Eficácia de dsRNA de VatpaseC
Moléculas de dsRNA que não são perfeitamente complementares a uma sequência alvo (por exemplo, tendo apenas 95% de identidade com a mRNA alvo) são eficazes para controles pragas coleópteras. Bases não complementares foram introduzidas na fita de senso ou na fita de antissenso de dsRNAs de VatpaseC, resultando em incompatibilidades entre as fitas de senso e antissenso do dsRNA (e, consequentemente, resultando em incompatibilidades entre o dsRNA e o mRNA alvo in vivo). Os efeitos sobre a atividade inseticida dos dsRNAs imperfeitamente compatíveis contra larvas de verme da raiz do milho do oeste foram medidos em bioensaios de dieta.
Apenas uma das duas fitas de DNA codificando um dsRNA de VatpaseC foi mutado de uma vez, e um nucleotídeo não complementar simples foi artificialmente introduzido em cada sítio de mutação. Os sítios de mutação foram arbitrariamente posicionados em intervalos de 20 nucleotídeos ao longo de todo o comprimento da fita mutada de um DNA codificando um dsRNA de VatpaseC. A identidade do nucleotídeo escolhido para substituir o nativo foi feita a partir dos nucleotídeos proximais em qualquer lado do
105/124 sítio de mutação que não complementou o nucleotídeo na fita não mutada oposto ao sítio de mutação. No caso de três ou mais nucleotídeos serem iguais em um dado local, o nucleotídeo diferente mais próximo foi selecionado para substituir o nativo.
Dois dsRNAs (v4) de VatpaseC substancialmente homólogos, imperfeitamente complementares, (isto é, v4.1 e v4.2) foram projetados, gerados e testados quando à atividade inseticida. Ambos os dsRNAs compreendiam 166 pb de uma sequência de v4 de VatpaseC, mais seis nucleotídeos (GGGAGA) na extremidade 5’ de cada fita de RNA que são objetos de transcrição pelo promotor T7. Desta maneira, o comprimento total de cada dsRNA foi 178 pb.
O dsRNA substancialmente homólogo de v4.1 de VatpaseC foi projetado e gerado com bases não complementares introduzidas na fita de antissenso. Este dsRNA foi obtido através das etapas que seguem: (1) uma sequência de fita de antissenso foi projetada para ter uma mutação introduzida a cada 20 nucleotídeos; (2) fragmentos de DNA compreendendo a sequência de DNA de fita de antissenso mutada ou uma sequência de DNA de fita de senso nativa (isto é, sem mutações) foram quimicamente sintetizados (IDT); (3) oligonucleotídeos de DNA compreendendo a fita de antissenso mutada e os oligonucleotídeos compreendendo a fita de senso foram anelados para formar moléculas de fita dupla; (3) amplificação por PCR empregando iniciadores compreendendo sequências promotoras T7 terminais 5’ foi usada para incorporar a sequência promotora T7 nas extremidades 5’ de ambas as fitas, desta maneira provendo um molde suficiente para síntese de dsRNA; e (4) síntese de dsRNA foi realizada usando polimerase de RNA T7 e um estojo de RNAi AMBION® MEGAScript®, de acordo com as instruções do fabricante.
O dsRNA substancialmente homólogo v4.2 de VatpaseC, tendo mutações introduzidas em intervalos de 20 bases na sequência de fita de senso (mas tendo uma sequência de fita de antissenso nativa), foi obtido através de modificações apropriadas dos métodos acima. Ainda, um dsRNA de v4 de VatpaseC compreendendo a sequência nativa (isto é, tendo fitas de
106/124 senso e antissenso perfeitamente complementares) foi construído e usado como um controle para comparação de eficácia com os dsRNAs substancialmente homólogos v4.1 e v4.2 de VatpaseC em ensaios de alimentação com base em dieta contra larvas de verme da raiz do milho do oeste (conduzidos usando métodos descritos anteriormente).
Sete doses desses dsRNAs (0,2, 1,0, 3,9, 15,6, 62,5, 250 e 1000 ng/cm2) foram testadas em bioensaios de alimentação com larvas de primeiro estágio de verme da raiz do milho do oeste para obter valores de LC50 e GI50- Os ensaios foram independentemente conduzidos duas vezes, e cada experimento tinha duas réplicas.
O LC50 calculado para o dsRNA de v4.1 de VatpaseC substancialmente homólogo (fita de antissenso incompatível) era 780,9 ng/cm2, que é 7,9 vezes maior do que o LC50 obtido para o dsRNA de v4 de VatpaseC nativo (isto é, não mutado). Tabela 12. Este resultado indica que, mesmo que a fita de antissenso de 178 bases do dsRNA de v4.1 de VatpaseC contivesse 8 bases mutadas, homologia suficiente com a fita de mRNA alvo de praga coleóptera existia para induzir um efeito letal seguindo ingestão do dsRNA. O valor de LC50 calculado para o dsRNA de v4.2 de VatpaseC substancialmente homólogo (fita de senso incompatível) foi 868,6 ng/cm2, que é similar ao valor obtido com v4.1 de VatpaseC, e 8,8 vezes maior do que aquele obtido nesses ensaios para o dsRNA de v4 de VatpaseC. Esses resultados demonstram que dsRNAs substancialmente homólogos compreendendo incompatibilidades na fita de senso do dsRNA retêm homologia suficiente com uma fita de mRNA alvo de praga coleóptera para induzir um efeito letal seguindo ingestão do dsRNA. Foi ainda constatado que nesses ensaios de alimentação os dsRNAs de v4.1 e v4.2 de VatpaseC tinham valores GI50 que eram maiores do que o valor calculado para o dsRNA de v4 de VatpaseC nativo (isto é, não mutado). Tabela 12. É então visto que dsRNAs de v4.1 e 4.2 de VatpaseC são capazes de induzir ambas a inibição de crescimento aperfeiçoada e a mortalidade aperfeiçoada quando da ingestão por uma praga coleóptera.
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Tabela 12. Atividade inseticida de dsRNAs de VatpaseC substancialmente homólogos (v4.1 e v4.2) e dsRNA de v4 de VatpaseC contra larvas de verme da raiz do milho do oeste
dsRNA Réplicas lc50 (ng/cm2) Aumento de LC50 (vezes) Glso (ng/cm2) Aumento de GI50 (vezes)
VatpaseC v4 8 98,5 NA 0,16 NA
VatpaseC v4.1 4 780,9 7,9 7,50 47,7
VatpaseC v4.2 4 868,6 8,8 0,84 5,4
Exemplo 8. Produção mediada por Agrobacterium de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo dsRNAs Grampo de Cabelo Inseticidas
Esterilização de espiga e isolamento de embrião: Embriões de milho imaturos foram obtidos de plantas de cepa de cruzamento entre a mesma espécie de Zea mays B104 cultivadas na estufa e auto- ou sibpolinadas para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 9 a 12 dias pós-polinação. No dia experimental, as espigas foram esterilizadas na superfície através de imersão em uma solução 20% de hipoclorito de sódio (6,15%) e agitadas por 20 a 30 min, seguido por três enxágues em água estéril. Após esterilização, embriões zigóticos imaturos (1,5 a 2,4 mm) foram assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos de microcentrífuga contendo Meio de Inoculação líquido (2,2 gm/L de sais de MS (Frame e outros, 2011, supra); Vitaminas MS Modificadas ISU 1X (Frame e outros (2011) Genetic Transformation Using Maize Immature Zygotic Embryos, Em Plant Embryo Culture Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Τ. A. Thorpe e E. C. Yeung, (Eds.), SPRINGER SCIENCE AND BUSINESS MEDIA, LLC., pp 327-341); 68,4 gm/L de sacarose; 36 gm/L de glicose; 115 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mioinositol; e 200 μΜ de acetosiringona (preparada em DMSO); em pH 5,4). Para um dado conjunto de experimentos, embriões de espigas agrupadas foram usados para cada transformação.
Início de Cultura de Agrobacterium: Estoques de glicerol de cepa de Agrobacterium DAÍ13192 contendo os vetores de transformação binários descritos acima no Exemplo 4 foram riscados em placas de meio mínimo AB (Watson e outros (1975) J. Bacteriol. 123:255-64) contendo antibióticos a108/124 propriados e foram cultivados a 20°C por 3 a 4 dias. A colônia simples foi pega de cada placa, riscada em placas de YEP (10 g/L de extrato de levedura; 10 g/L de Peptona; e 5 g/L de NaCl) contendo os antibióticos apropriados e incubada a 20°C por 1-2 dias.
Cultura e Cocultivo de Aqrobacterium. Colônias de Agrobacterium foram pegas de uma placa de YEP, suspensas em 10 mL de Meio de Inoculação em um tubo descartável de 50 mL e a densidade celular foi ajustada para um OD550 (Densidade Óptica medida a 550 nm) de a partir de 0,2 a 0,4 usando um espectrômetro. As culturas de Agrobacterium foram incubadas em um agitador giratório a 125 rpm (temperatura ambiente) enquanto dissecação do embrião era realizada. Embriões zigóticos imaturos (previamente isolados dos grãos de milho esterilizados e postos em 1 mL de Meio de Inoculação) foram lavados uma vez em Meio de Inoculação. 2 mL de suspensão de Agrobacterium foram adicionados a cada tubo de embriões e os tubos foram postos em uma plataforma de agitação por entre cerca de 10 e 15 minutos. Os embriões foram transferidos para Meio de Co-cultivo (4,33 g/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas ISU 1X; 30 g/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzoico) em KOH; 100 mg/L de m/o-inositol; 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático Caseína; 15 mg/L de AgNO3; 100 μΜ de actosiringona em DMSO; e 3 gm/L de GELZAN® (SIGMA-ALDRICH®)/ em pH 5,8), orientado com a face do esculeto para cima, e incubados a 25°C, sob luz por 24 horas a 50 pEm'2 s'1 de intensidade de luz por 3 dias.
Seleção de calo e Regeneração de Eventos Putativos: Seguindo o período de cocultivo, os embriões foram transferidos para Meio de Descanso (4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas ISU 1X; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisato Enzimático Caseína; 15 mg/mL de AgNO3; 0,5 gm/L de MES (monoidrato do ácido 2-(N-morfolino) etanossulfônico; PHYTOTECHNOLOGIES LABORATORIES®, Lenexa, KS); 250 mg/L Carbenicilina; e 2,3 gm/L de GELZAN™; em pH 5,8), e incubados sob luz por 24 horas a 50 μΕιτι'2 s'1 de intensidade de luz e a 25°C por 3 dias.
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Os embriões foram transferidos para Meio de Seleção 1 (que consiste no Meio de Descanso (acima) com 100 nM de ácido R-Haloxyfop (0,0362 mg/L)) e incubados no escuro ou sob luz 24 horas a 50 pEm'2sec'1 de intensidade de luz por 7 a 14 dias a 28° C. Calos embriogênicos em proliferação foram transferidos para Meio de Seleção 2 (que consiste em Meio de Descanso (acima), com 500 nM de ácido R-Haloxyfop (0,1810 mg/L)), e foram incubados em luz por 24 h a 50 pEm'2 s'1 de intensidade de luz por 14 a 21 dias a 28° C. Esta etapa de seleção permitiu que calo transgênico proliferasse mais e diferenciasse.
Calos embriogênicos, em proliferação, foram transferidos para Meio de Pré-Regeneração (4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas ISU 1X; 45 gm/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisato Enzimático de Caseína; 1,0 mg/L de AgNO3; 0,25 gm/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalenoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/mL de Carbenicilina; 2,5 mg/L de GELZAN®; e 500 nM de ácido RHaloxyfop; em pH 5,8), e culturados sob luz por 24 horas a 50 pEm’2 s1 de intensidade de luz por 7 dias a 28°C.
Calos embriogênicos com botões tipo broto foram transferidos para Meio de Regeneração I (4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas ISU 1X; 60 gm/L de sacarose; 100 mg/L de m/o-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3,0 gm/L de GELZAN®; e 500 nM de ácido Raloxyfop; em pH 5,8), e culturados sob luz por 24 horas a 50 pEm'2 s'1 de intensidade de luz por 7 dias.
Brotos pequenos com raízes primárias foram transferidos para meio de Broto/Raiz (4,33 gm/L de sais de MS; Vitaminas de MS Modificadas ISU 1X; 30 gm/L de sacarose; 100 mg/L de m/o-inositol; 3,5 gm/L de GELZAN®; em pH 5,8) em PHYTATRAYS™ (RHYTOTECHNOLOGIES LABORATORIES®), e foram incubados sob 16:8 h luz:escuro em a partir de 140 a 190 pEm'2 s'1 de intensidade de luz por 7 dias a 27° C. Mudas transgênicas putativas foram analisadas quanto ao número de cópia transgênica e transferidas para o solo.
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Produção de semente: As plantas foram transplantadas para meio de crescimento sem solo METRO-MIX® 360 (SUN GRO HORTICULTURE; Bellevue, WA) e endurecidas em uma sala de crescimento. As plantas foram então transplantadas para mistura de solo SUNSHINE CUSTOM BLEND® 160 e cultivadas até florescimento na estufa. Polinações controladas para produção de semente foram conduzidas.
Bioensaios de verme da raiz de milho do oeste em plantas cultivadas na estufa foram conduzidos através dos métodos descritos no Exemplo 12. Plantas com uma classificação de raiz de 0,75 ou melhor foram transplantadas imediatamente para potes de 18,93 I (5 galões) para produção de semente. Os transplantes foram tratados com inseticida para prevenir dano adicional pelo verme da raiz e liberação de inseto nas estufas. Plantas B104 foram cruzadas com plantas B104 não transgênicas (doadoras de pólen) para produção de semente. Sementes produzidas por essas plantas são guardadas para avaliação no T-ι e gerações subsequentes de plantas.
Cepa de Agrobacterium DAÍ13192 compreendendo um construto expressável em planta codificando um dsRNA grampo de cabelo de v3 de Cafl-180 (Exemplo 4; construto em plasmídeo pDAB109817) foi usada para produzir plantas de milho transgênicas B104. Bioensaios do verme da raiz do milho do oeste nessas plantas transgênicas cultivadas em estufa foram conduzidos através dos métodos descritos no Exemplo 12. Plantas transformadas com um plasmídeo similar (pDAB101556), que contém um gene para produção de YFP, mas não contém um gene para produção de dsRNA, foram usadas como controles negativos. Os resultados desses bioensaios são mostrados na Tabela 3.
Tabela 13. Resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste de eventos de milho transgênico B104 expressando um dsRNA grampo de cabelo de v3 de Caf1-180
Descrição do Evento No. Total de Plantas Testadas No. de Plantas com Classificação de Raiz <0,5 (%)* No. de Plantas com Classificação de Raiz <0,75 (%)
Caf1-180 v3 hp dsRNA (pDAB109817) 16 1 (6,3) 4(25)
YFP (pDAB101556) 14 1 (7,1) 1 (7,1)
B104 não transgênica 16 2(12,5) 3 (18,8)
*Escala de classificação de dano de raiz de milho: 0-1,0
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Cepa de Agrobacterium DAt13192 compreendendo um construto expressável em planta codificando um dsRNA grampo de cabelo de v3 de VatpaseC (Exemplo 4; construto em plasmídeo pDAB109815) foi usada para produzir plantas de milho transgênicas B104. Bioensaios de verme da raiz do milho do oeste nessas plantas transgênicas cultivadas em estufa foram conduzidos através dos métodos descritos no Exemplo 12. Plantas transformadas com um plasmídeo similar (pDAB101556), que contém um gene para produção de YFP, mas não contém um gene para produção de dsRNA, foram usadas como controles negativos. Os resultados desses bioensaios são mostrados na Tabela 14.
Tabela 14. Resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste de eventos de milho transgênico B104 expressando um dsRNA grampo de cabelo de v3 de VatpaseC
Descrição do Evento No. Total de Plantas Testadas No. de Plantas com Classificação de Raiz <0,5 (%)* No. de Plantas com Classificação de Raiz <0,75 (%)
VatpaseC v3 Hp dsRNA (pDAB109815) 10 6(60) 7(70)
YFP (pDAB101556) 14 1 (7,D 1 (7,1)
B104 não transgênico 16 2 (12,5) 3 (18,8)
*Escala de classificação de dano à raiz de milho: 0-1,0
A cepa de Agrobacterium DAt13192 compreendendo um construto expressável em planta codificando dsRNA grampo de cabelo de v1 de VatpaseH (Exemplo 4; construto em plasmídeo pDAB109816) foi usada para produzir plantas de milho transgênicas B104. Bioensaios de verme da raiz do milho do oeste nessas plantas cultivadas em estufa foram conduzidos através dos métodos descritos no Exemplo 12. Plantas transformadas com um plasmídeo similar (pDAB101556), que contém um gene para produção de YFP, mas não contém um gene para produção de dsRNA, foram usadas como controles negativos. Os resultados desses bioensaios são mostrados na Tabela 15.
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Tabela 15. Resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste de eventos de milho transgênico B104 expressando um dsRNA grampo de cabelo de v1 de VatpaseH
Descrição do Evento No. Total de Plantas Testadas No. de Plantas com Classificação de Raiz <0,5 (%)* No. de Plantas com Classificação de Raiz <0,75 (%)
VatpaseH v1 hp dsRNA (pDAB109816) 18 8 (44,4) 14 (77,8)
YFP (pDAB101556) 14 1 (7,D 1 (7,1)
B104 não transgênico 16 2 (12,5) 3 (18,8)
*Escala de classificação de dano à raiz de milho: 0-1,0
Exemplo 9: Produção Mediada por WHISKERS de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo dsRNAs Grampo de Cabelo de v3 de Cafl-180 Inseticidas
Plantas que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma mo10 lécula de dsRNA se direcionando a um gene compreendendo uma de SEQ ID NOs:1-4) através da expressão de um gene quimérico estavelmente integrado ao genoma da planta foram produzidas. Moléculas de DNA para transformação de planta foram preparadas conforme descrito no Exemplo 4 e foram aplicadas a células de milho em culturas de célula em suspensão Hi-ll através de transformação mediada por WHISKERS (essencialmente conforme descrito nas Patentes U.S. Nos. 5.302.523 e 5.464.765; Publicação de Patente U.S. No. 2008/0182332; e Petolino e Arnold (2009) M. Paul Scott (ed.) Methods in Molecular Biology: Transgenic Maize, Vol. 526, Humana Press, NY, pp 59-67), que são aqui incorporados a título de referência em sua totalidade.
Transformação e seleção de célula de planta: Todos os procedimentos para transformação mediada por WHISKERS foram realizados usando técnicas assépticas padrão, e geralmente seguiram os métodos descritos por Petolino e Arnold (2009), supra. Suspensões de célula embriogê25 nica Hill de Zea mays (Armstrong e outros (1991) Maize Genet. Coop. Newslett. 65:92-3) foram subculturadas através de transferência de 30 mL de células de suspensão sedimentadas, mais 70 mL de meio condicionado (isto é, o
113/124 meio em que as células tinham sido cultivadas), em 200 mL de meio H9CP fresco (4,33 gm/L de Sais Basais de MS (PA/YTOTECHNOLOGIES LABORATORIES, No. Cat M524); 30,0 gm/L de Sacarose; 100,0 mg/L de Mioinositol; 200 mg/L de Hidrolisato Enzimático Caseína; 2,0 mg/L de Ácido 2,4diclorofenoxi acético; 2,0 mg/L de ácido naftalenoacético; 691 mg/L de LProlina; 2,0 mg/L de Glicina; 0,5 mg/L de HCI de tiamina; 0,5 mg/L de HCI de Piridoxina; 0,05 mg/L de Ácido nicotínico; em pH6,0) contendo água de coco 0,5% (SIGMA ALDRICH, St. Louis, MO; No. de Catálogo C5915) em um tubo de centrífuga de fundo cônico descartável NALGENE® de 175 mL (THERMO FISHER SCIENTIFIC; No. de Catálogo 3145-0175). As células diluídas foram então incubadas em um frasco de cultura de célula descartável de 1L estéril no escuro a 28 °C em um agitador giro-rotatório com um raio de arremesso de 2,54 cm (1 polegada) a 120 rpm e as células foram subculturadas a cada 3,5 dias conforme descrito acima.
Um dia seguindo a subcultura, e 18 e 24 horas antes do procedimento de transfecção, 50 mL de meio H9CP contendo 30 mL de células sedimentadas foram adicionados a 150 mL de meio GN6 fresco (3,99 gm/L de Sais Basais N6 Chu com vitaminas (P/7YTOTECHNOLOGIES LABORATORIES, No. Cat. C167); 30 gm/L de Sacarose; 100 mg/L de Mio-lnositol; 2 mg/L de Ácido 2,4-diclorofenoxiacético, em pH 6,0) em um frasco estéril de 1 L, e a cultura foi incubada em um agitador giro-rotatório conforme acima descrito.
Seguindo 18 a 24 horas de incubação em meio GN6, a suspensão de célula toda foi transferida para um tubo de centrífuga de fundo cônico descartável de 175 mL, e as células foram deixadas sedimentar por 1-3 min, dando um volume de célula de cerca de 40 mL. O meio usado foi cuidadosamente decantado e líquido residual foi removido através de pipeta para produzir uma massa de célula úmida. As células foram suspensas em cerca de 180 mL de meio osmótico alto (GN6-SM; meio GN6 suplementado com 45 gm/L de sorbitol e 45 gm/L de manitol) no tubo de centrífuga, e a cultura foi posta em um agitador de mesa em temperatura ambiente (23° C a 25° C) por cerca de 30 minutos, mas não mais do que 45 minutos. Seguindo o tra114/124 tamento osmótico de 30 minutos, as células foram deixadas sedimentar no tubo da centrífuga por 3-5 minutos. Então, o líquido foi cuidadosamente removido para a marca de 50 mL do tubo da centrífuga através de pipeta, tomando cuidado para não perturbar as células.
Para aplicação de DNA de plasmídeo às células de cultura de suspensão de milho, 5 mL de uma suspensão 5% p/p de whiskers de carbida de silício SC-9 BIOGRADE® (ADVANCED COMPOSITE MATERIALS, Greer, SC; lote 981011-101) foram preparados através da adição de uma quantidade apropriada de meio GN6-SM a whiskers secos, esterilizados (autoclavados). Uma quantidade apropriada de DNA depDABI 09830 (Exemplo 4) foi adicionada ao tubo da centrífuga (tipicamente 80 pg/50 mL de suspensão de 40 mL de células), a tampa foi vedada firmemente e o tubo foi suavemente girado para misturar os componentes. O tubo da centrífuga foi preso firmemente em um misturador de tinta comercial (RED DEVIL® Modelo 5400; Minneapolis, MN) modificado para prender com segurança o tubo e agitação por 10-20 segundos. Após diluição para reduzir a osmolaridade do meio com cerca de 150 mL de meio fresco (GN6-SM:GN6; 2:1 v/v) para um volume final de cerca de 200 mL, as células foram incubadas em um agitador de mesa em temperatura ambiente por cerca de 1 hora.
As células transfectadas foram então transferidas através de pipeta em alíquotas de cerca de 8,3 mL para papel filtro No. 4 WHATMAN® de 70 mm estéril (THERMO FISHER SCIENTIFIC), tomando cuidado para distribuir uniformemente as células no papel filtro. Os filtros foram postos em meio de ágar GN6 em placas de plástico de 100 x 20 mm e então incubados em caixas plásticas no escuro a 28° C por 7 dias.
Uma semana após a transformação, os papéis filtros que continham as células foram transferidos para placas frescas de meio de ágar sólido GN6-1H (meio GN6 suplementado com 2,5 gm/L de GELZAN®) contendo 1,0 gm/L de BIALAPHOS em placas de 100 x 20 mm e incubados no escuro a 28° C. BIALAPHOS foi provido como HERBIACE® (20% ai) (MEIJI SEIKA KAISHA LTD.; Tóquio, JP).
Uma semana depois, as células foram entranhadas em ágar mo115/124 le raspando os teores da célula de cada papel filtro em um tubo de centrífuga descartável estéril de 50 mL contendo 15 mL de meio de agarose mole GN6 (meio GN6 com 7,0 gm/L de Agarose SEAPLAQUE®; LONZA, Rockland, ME) a 37° até 40° C, agitando o tubo tampado vigorosamente e então despejando os conteúdos do tubo uniformemente em quatro placas de plástico de 100 x 25 mm contendo meio de ágar sólido GN61H. Cada placa foi agitada para revestir a superfície com uma camada uniforme da suspensão celular, e quando da solidificação as placas foram incubadas a 28° C no escuro.
Seguindo seis a 10 semanas de incubação, colônias emergentes de bom crescimento foram transferidas para placas frescas contendo meio de ágar GN61H. Essas colônias transformadas candidatas foram deixadas crescer por 2-4 semanas no meio de seleção para estabelecer eventos estáveis tendo uma massa de cerca de 50 a 200 mg de tecido, que foram então submetidos à análise molecular.
Amostras de células de calo embaladas 0,1 mL de eventos candidatos foram amostradas e postas em 1,2 mL de tubos de agrupamento de polipropileno COSTAR® de 1,2 mL (CORNING, INC; Corning NY) e congeladas a -80°C.
Análises moleculares: Eventos de célula de calo foram analisados quanto à expressão relativa do transcrito de comprimento integral através de PCR quantitativa de tempo real da 3’UTR Per 5 e o número de cópia foi estimado através de comparação com um gene de milho interno (proteína tipo TIP41). RNA foi isolado usando o estojo Rneasy® 96 (QIAGEN, Valencia, CA). Após a primeira lavagem (RW1), as colunas foram tratadas com DNase livre de Rnase QIAGEN em tampão RDD (de acordo com o protocolo alternativo sugerido pelo estojo). cDNA de primeira fita foi preparado usando um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL de RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo foi modificado ligeiramente para incluir a adição de 10 pL de oligonucleotídeo T20VN (IDT) 100 pM ao tubo de 1 mL de mistura de estoque de iniciador
116/124 aleatório, a fim de preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.
Seguindo a síntese de cDNA, as amostras foram diluídas 1:3 com água livre de nucleasse e armazenadas a -20° C até serem ensaiadas. PCR de tempo real foi realizada em um LIGHTCYCLER® 480 (ROCHE DlAGNOSTICS, Indianapolis, IN) em volume de reação de 10 pl_. Todos os ensaios incluíam controles negativos sem molde (mistura apenas). Para as curvas padrão, uma amostra vazia (água em cavidade de fornecimento) foi também incluída na placa de fonte para checar a contaminação cruzada da amostra. As reações foram realizadas com a ROCHE UNIVERSAL PROBE® a 0,5 μΜ e os iniciadores para os genes alvo e de referência a 10 μΜ. As sequências de iniciador são mostradas na Tabela 16. Condições de reação de PCR foram como segue: (1) Ativação de alvo a 95° C por 10 min; (2) 43 ciclos de (desnatura a 95° C por 10 s e extensão a 60° C); (3) adquirir a 72° C por 1 s; e (4) esfriar a 40° C por 10 s.
Tabela 16. Sequências de iniciador usadas para análises moleculares de milho transgênico
Iniciador Alvo SEQ ID NO. Sequência de iniciador
MZTIPU67F TIP41* SEQ ID NO:132 AGCCAAGCCAGTGGTAOTTO
MZTIPU67R TIP41 SEQ ID NO:133 TCGCAGACAAAGTAGCAAATGT
P5U76S (F) Per5 3'UTR SEQ ID NO:134 TTGTGATGTTGGTGGCGTAT
P5U76A (R) Per5 3'UTR SEQ ID NO:135 TGTTAAATAAAACCCCAAAGATCG
*Proteína tipo TIP41; homólogo de milho de AT4G34270 por tBLASTx (identidade de 74%)
Análise de dados: Os dados foram analisados usando Software LIGHTCYCLER® v1.5 através de quantificação relativa usando um segundo algoritmo max derivado para cálculo dos valores Cq de acordo com as recomendações do fabricante. Para análises de expressão, valores de expressão foram calculados usando o método ACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que se apoia na comparação de diferenças de valores Cq entre dois alvos, com o valor de base de 2 sendo selecionado sob a suposição que, para reações de PCR otimizadas, o produto duplica a cada ciclo.
Regeneração de planta transgênica: Alguns eventos estavelmente transformados foram regenerados em plantas para bioensaios de in117/124 seto in-planta.
Seguindo o processo de seleção, culturas de calo foram transferidas para Meio de Pré-Regeneração 28 (4,33 gm/L de Meio Basal MS com Vitaminas; 30,0 gm/L de Sacarose; 5 mg/L de 6-Benzilaminopurina; 25 pg/L de ácido 2,4-diclorofenoxiacético; 2,5 gm/L de GELZAN®; e 1,0 mg/L de BlALAPHOS). Culturas de calo transferidas foram incubadas por 7 dias a 28° C sob luz fluorescente branca contínua (aproximadamente 50 pEm’2s'1).
Para regeneração, as culturas foram transferidas para Meio de Regeneração 36 (4,33 gm/L de Meio Basal MS com Vitaminas; 30 gm/L de Sacarose; 2,5 gm/L de GELZAN®; e 1,0 mg/L de BIALAPHOS) e as mudas foram deixadas gerar e crescer a 28° C sob luz fluorescente branca contínua por até 3 semanas. Quando as mudas atingiram um estágio de crescimento adequado, elas foram excisadas com um fórceps e escalpeladas, transferidas para um tubo de teste de 20 x 100 mm contendo ágar e postas na luz por 2 dias.
As plantas transgênicas receberam identificadores únicos e foram transferidas para uma câmara de ambiente controlado (-28° C de temperatura de dia; 24° C de temperatura à noite; com um fotoperíodo de luz suplementar 16:8). As plantas transgênicas foram transplantadas de tubos para potes de 8,89 cm (3,5 polegadas) e retornadas para a câmara de ambiente controlado por 1-2 semanas para ajudar a aclimatar as plantas. As plantas transgênicas foram então mudadas para a estufa e transplantadas dos potes pequenos para ROOTRAINERS® (style TINUS® 350-4; SPENCERLEMAIRE INDUSTRIES; Acheson, Alberta, Canadá), em uma planta por evento por ROOTRAINER®, para bioensaios de alimentação de inseto. Aproximadamente quatro dias após o transplante para ROOTRAINERS®, as plantas To estavam prontas para o bioensaio de alimentação de inseto. Bioensaios de alimentação de inseto foram conduzidos através dos métodos descritos no Exemplo 12.
A presença e a expressão de um transgene produzindo dsRNA grampo de cabelo resultam em uma redução em corte de raiz por WCR, como foi evidente naquelas plantas que exibem níveis de expressão altos do
118/124 transcrito de dsRNA (conforme medido através de classificação de PCR relativa de 3’UTR Per5). Os resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste nesses eventos contendo um grampo de cabelo deRNAi compreendendo SEQ ID NO:97, e que têm um nível de expressão relativo 16 vezes maior do que o gene de referência tipo TIP41 interno, são mostrados na Tabela 17. Os resultados indicam o resultado surpreendente que 36% das plantas RNAi transgênicas demonstraram dano por WCR reduzido, comparado com apenas 3% das plantas controle não transgênicas testadas. Embora a resposta biológica seja variável dentro das plantas de milho transgênicas To, as plantas transgênicas mostraram redução apreciável de corte por WCR comparado com as plantas controle não transgênicas.
Tabela 17. Resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste de eventos de milho transgênico Hi-ll expressando um dsRNA grampo de cabelo de Caf1-180.
Evento No. de Plantas com Classificação de Raiz < 0,75 No. Total de Plantas por Evento % de Plantas com Classificação de Raiz < 0,75
109830[2]-001 4 9 44
109830[2]-002 1 4 25
109830[2]-004 4 7 57
109830[2]-025 0 7 0
109830[4]-005 3 6 50
Transgênicos Totais 12 33 36
Plantas Controle Hi-ll 1 30 3
Exemplo 10: Produção mediada por WHISKERS de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo dsRNAs Grampo de Cabelo de v3 de VatpaseC e de v4 de VatpaseC Inseticidas
Os métodos de transformação descritos no Exemplo 9 foram usados para prover plantas transgênicas de milho Hill expressando dsRNA grampo de cabelo de v3 de VatpaseC ou dsRNA grampo de cabelo de v4 de VatpaseC, através da transformação com plasmídeos pDAB109828 e pDAB109838 (Exemplo 4). Avaliação molecular foi realizada de acordo com os métodos de avaliação descritos no Exemplo 9 e bioensaios de verme da raiz do milho do oeste foram realizados de acordo com os métodos de bioensaio descritos no Exemplo 12.
A presença e a expressão de um transgene produzindo dsRNA
119/124 grampo de cabelo resultam em uma redução em corte de raiz por WCR, como era evidente naquelas plantas que exibem níveis de expressão altos do transcrito de dsRNA (conforme medido através de classificação de PCR relativa da 3’UTR Per5). Os resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste naqueles eventos contendo um grampo de cabelo de RNAi compreendendo SEQ ID NO:100 (v3 de VatpaseC) ou SEQ ID NO:103 (v4 de VatpaseC), e que têm um nível de expressão relativo 20 vezes maior do que o gene de referência tipo TIP41 interno, são mostrados na Tabela 18. Os resultados indicam o resultado surpreendente que 43% das plantas RNAi transgênicas demonstraram dano por WCR reduzido, comparado com 0% das plantas controle não transgênicas testadas. Embora a resposta biológica seja variável dentro das plantas de milho transgênicas To, apenas as plantas transgênicas mostraram redução apreciável de corte por WCR.
Tabela 18. Resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste de eventos de milho transgênico Hi-ll expressando um dsRNA grampo de cabelo de v3 ou v4 de VatpaseC
Evento No. de Plantas com Classificação de Raiz < 0,5 No. Total de Plantas por Evento % de Plantas com Classificação de Raiz < 0,5
109828[4]-011 5 10 50
109828[4]-016 1 5 20
109828[4]-006 2 6 33
109838[3]-003 2 2 100
109838[3]-002 5 10 50
109838[3]-001 2 2 100
109838[4]-020 1 5 20
109838[3]-006 0 2 0
Transgênicos Totais 18 42 43
Plantas Controle Hi-ll 0 26 0
Exemplo 11: Produção Mediada por WHISKERS de Tecidos de Milho Transgênico Compreendendo dsRNAs Grampo de Cabelo v1 VatpaseH Inseticidas
Os métodos de transformação descritos no Exemplo 9 foram usados para prover plantas transgênicas de milho Hill expressando dsRNA grampo de cabelo de v1 de VatpaseH, através de transformação com plasmídeo pDAB109829 (Exemplo 4). Avaliação molecular foi realizada de acordo com os métodos de avaliação descritos no Exemplo 9 e bioensaios de
120/124 verme da raiz do milho do oeste foram realizados de acordo com os métodos de bioensaio descritos no Exemplo 12.
A presença e a expressão de um transgene produzindo dsRNA grampo de cabelo resultam em uma redução em corte de raiz por WCR, como era evidente naquelas plantas que exibem níveis de expressão altos do transcrito de dsRNA (conforme medido através de classificação de PCR relativa da 3’UTR Per5). Os resultados de bioensaios de verme da raiz do milho do oeste naqueles eventos contendo um grampo de cabelo de RNAi compreendendo SEQ ID NO: 106, e que têm um nível de expressão relativo 18 vezes maior do que o gene de referência tipo TIP41 interno, são mostrados na Tabela 19. Os resultados indicam o resultado surpreendente que 60% de plantas RNAi transgênicas demonstraram dano por WCR reduzido, comparado com 0% das plantas controle não transgênicas testadas. Embora a resposta biológica seja variável dentro das plantas de milho transgênicas To, apenas as plantas transgênicas mostraram redução apreciável de corte por WCR.
Tabela 19. Resultados de bioensaios de verme de raiz do milho do oeste de um evento de milho transgênico Hi-ll expressando um dsRNA grampo de cabelo de VatpaseH
Evento No. de Plantas com Classificação de Raiz < 0,5 No. Total de Plantas por Evento % de Plantas com Classificação de Raiz < 0,5
109829[1]-005 3 5 60%
Plantas Controle Hi-ll 0 30 0%
Exemplo 12: Bioensaio de Inseto de Milho Transgênico
Ovos de verme da raiz do milho do oeste (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidos em solo da Crop Characteristics (Farmington, MN). Os ovos foram incubados a 28° C por 10-11 dias. Os ovos foram lavados do solo, postos em uma solução de ágar 0,15% e a concentração foi ajustada para aproximadamente 75-100 ovos por alíquota de 0,25 mL. Uma placa de incubação foi preparada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovo para monitorar as taxas de incubação.
O solo em torno das plantas de milho foi infestado com 150-200
121/124 ovos de WCR. Os insetos foram deixados se alimentar por 2 semanas, momento depois do qual uma Classificação de Raiz foi dada a cada planta. Uma Escala de Lesão de Nó foi utilizada para graduação. Oleson e outros (2005) J. Econ. Entomol. 98(1):1-8.
Plantas com uma classificação de raiz de 0,75 ou melhor foram transplantadas imediatamente para potes de 18,93 I (5 galões) para produção de semente. Os transplantes foram tratados com inseticida para prevenir dano do verme da raiz adicional e liberação de inseto na estufa. Plantas Hill foram cruzadas com a cepa de milho de cruzamento entre a mesma espécie 5XH751 (doador de pólen) para produção de semente. Sementes produzidas por essas plantas são guardadas para avaliação em Tj e gerações de planta subsequentes.
Exemplo 13: Zea mays Transgênico Compreendendo Sequências de Praga Coleóptera
Dez a 20 plantas de Zea mays transgênicas são geradas conforme descrito nos Exemplos 8 e 9. Mais 10-20 linhagens independentes de Zea mays expressando dsRNA grampo de cabelo para um construto de RNAi conforme mostrado nas SEQ ID NOs: 1-4 são obtidas para provocação de verme da raiz do milho. Essas são confirmadas através de RT-PCR. RNA total de linhagens Tí independentes selecionadas é opcionalmente usado para RT-PCR com iniciadores projetados para se ligarem no íntron pdk do cassete de grampo de cabelo em cada um dos construtos de RNAi. Ainda, iniciadores específicos para cada gene alvo em um construto de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA préprocessado requerido para produção de siRNA in planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA grampo de cabelo em cada Zea mays transgênico. Processamento do grampo de cabelo de dsRNA dos genes alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de blotde RNA.
Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênicas e Zea mays do tipo selvagem
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Genes ou sequências de praga coleóptera alvo selecionados para criação de dsRNA grampo de cabelo não têm nenhuma similaridade com nenhum gene ou sequência de planta conhecido. Então, não é esperado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por construtos se direcionando a esses genes ou sequências vá ter quaisquer efeitos prejudiciais sobre plantas transgênicas. No entanto, desenvolvimento e características morfológicas de linhagens transgênicas são comparados com plantas do tipo selvagem, bem como aqueles de linhagens transgênicas transformadas com um vetor grampo de cabelo vazio. Características de raiz, broto, folhagem e reprodução de planta são comparadas. Não há nenhuma diferença observável em padrões de comprimento e crescimento de raiz de plantas transgênicas e do tipo selvagem. Características de broto de planta tais como altura, números e tamanhos de folha, momento de floração, tamanho de flor e aparência são similares. Em geral, não há quaisquer diferenças morfológicas entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas de iRNA alvo quando culturadas in vitro e em solo na estufa.
Exemplo 14: Zea mays Transgênico Compreendendo uma Sequência de Praga Coleóptera e Construtos de RNAi Adicionais
Uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que se direciona a um organismo outro que não uma praga coleóptera é transformada através de transformação mediada por Agrobacterium ou WHISKERS® para produzir uma ou mais moléculas de dsRNA inseticidas (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA se direcionando a um gene compreendendo uma de SEQ ID NOs:1-4). Preparações de moléculas de DNA de transformação de planta preparadas essencialmente conforme descrito no Exemplo 4 são aplicadas a culturas de célula de suspensão Hi-ll de milho obtidas de uma planta de Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que se direciona a um organismo outro que não uma praga coleóptera. Exemplo 15: Plantas Resistentes a Praga Coleóptera Transgênicas
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Aplicação in planta de dsRNA, siRNA ou miRNA correspondendo a genes alvo e a absorção subsequente por praga coleópteras através da alimentação resultam em sub-regulagem dos genes alvo através de silenciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante, crescimento, desenvolvimento e reprodução da praga coleóptera são afetados, e no caso de pelo menos um WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella e D. u. undecimpunctata Mannerheim leva à falha em parasitar, se alimentar, desenvolver e/ou reproduzir com sucesso ou leva à morte da praga coleóptera em um ou mais estágio(s) de desenvolvimento. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então usadas para controlar pragas coleópteras. Cinco a dez réplicas de 1020 linhagens transgênicas de Z. mays Ή independentes para cada construto de RNAi são provocadas com uma espécie de verme da raiz do milho. A provocação é duplicada para cada espécie de verme da raiz do milho. Sementes Ti de linhagens de RNAi são germinadas e plantas resistentes transferidas para meio de Knop modificado 10-15 dias após germinação. Sementes de Z. mays de controle do tipo selvagem são germinadas ao mesmo tempo e usadas para infecção do verme da raiz do milho.
Há significantemente mais vermes da raiz do milho sobreviventes (>50%) em controles do que em linhagens de Z. mays transgênicas carregando um ou mais construtos de RNAi. Abundância de RNAi é medida em vermes da raiz se alimentando de raízes de plantas do tipo selvagem e transgênicas usando RT-PCR de tempo real quantitativa. Há significantemente mais moléculas de iRNA encontradas em linhagens de Z. mays transgênicas carregando um ou mais construtos de RNAi do que em plantas controle. Esses resultados indicam que as linhagens transgênicas processam siRNAs correspondendo a genes alvo e que esses siRNAs estão disponíveis para absorção pelos vermes da raiz do milho que se alimentam deles. Mais importante, os resultados indicam que inibição mediada por RNAi de todos os genes alvo afeta crescimento, desenvolvimento e viabilidade do verme da raiz do milho alvo. Além disso, moléculas de RNAi com sequências incompatíveis com mais de 80% de identidade de sequência com genes alvo afetam
124/124 vermes da raiz do milho de uma maneira similar às sequências do tipo selvagem. O emparelhamento de sequência incompatível com sequências nativas para formar um dsRNA grampo de cabelo no mesmo construto de RNAi fornece siRNAs processados por planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de pragas coleópteras que se alimentam deles.
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Claims (27)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; o complemento de SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; o complemento de SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; o complemento de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:112; o complemento de SEQ ID NO:112; SEQ ID NO:113; o complemento de SEQ ID NO:113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é
  2. 2/12 transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6, em que o polinucleotídeo é, preferivelmente, selecionado do grupo consistindo em SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:101, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:103, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO:112, SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:128, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:130 e SEQ ID NO:131.
    2. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: toda ou parte de SEQ ID NO:1; toda ou parte do complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; o complemento de SEQ ID NO:4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:1, 3 ou 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4; e o complemento de um
  3. 3/12 fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NO:1, 3 ou 4.
    3. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende mais de uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; o complemento de SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; o complemento de SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; o complemento de SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:112; o complemento de SEQ ID NO:112; SEQ ID NO:113; o complemento de SEQ ID NO:113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma de SEQ ID NOs:2, 58, 112 e/ou 113; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo qualquer uma das SEQ ID NOs:2, 5-8, 112 e/ou 113; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compre4/12 endendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo toda ou parte de qualquer uma de SEQ ID NOs:5 e 6.
  4. 4. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor heterólogo.
  5. 5. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é de pelo menos cerca de 50 nucleotídeos de comprimento ou é de pelo menos cerca de 100 nucleotídeos de comprimento, preferivelmente em que o polinucleotídeo é de cerca de 100 nucleotídeos de comprimento.
  6. 6. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o organismo Diabrotica é selecionado do grupo consistindo em D. v. virgifera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardi; D. v. zeae; D. balteata LeConte; D. u. tenella; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.
  7. 7. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) ou uma molécula de ácido desoxirribonucleico (DNA), preferivelmente compreendendo SEQ ID NO:136.
  8. 8. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 7 ou molécula de ácido ribonucleico produzida a partir da expressão do polinucleotídeo como definido na reivindicação 7, caracterizado(a) pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é selecionada do grupo consistindo em uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla e uma molécula de ácido ribonucleico de fita simples de entre cerca de 50 e cerca de 300 nucleotídeos de comprimento.
  9. 9. Vetor de transformação de planta, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1.
  10. 10. Vetor de transformação de planta, caracterizado pelo fato de
    5/12 que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 3, em que as sequências de nucleotídeos estão cada uma operavelmente ligadas a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta.
  11. 11. Vetor de transformação de planta, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, em que a pelo menos uma sequência(s) de nucleotídeo é operavelmente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula de planta.
  12. 12. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir da expressão do polinucleotídeo, como definido na reivindicação 7.
  13. 13. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o contato da sequência de polinucleotídeo com a praga coleóptera inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeo endógena especificamente complementar à sequência de polinucleotídeo, como definida na reivindicação 1, em que preferivelmente o contato da referida molécula de ácido ribonucleico com uma praga coleóptera mata ou inibe o crescimento, reprodução e/ou alimentação da praga coleóptera.
  14. 14. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que compreende uma primeira, uma segunda e uma terceira sequências de polinucleotídeo, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, em que a terceira sequência de polinucleotídeo é ligada à primeira sequência de polinucleotídeo pela segunda sequência de polinucleotídeo, e em que a terceira sequência de polinucleotídeo é substancialmente o complemento reverso da primeira sequência de polinucleotídeo, de maneira que as primeira e terceira sequências de polinucleotídeo hibridizam quando transcritas em um ácido ribonucleico para formar a molécula de ribonucleotídeo de fita dupla, em que preferivelmente a segunda sequência de polinucleotídeo compreende SEQ ID NO: 136.
  15. 15. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo que é substancialmente homólogo a
    6/12 um polinucleotídeo de referência selecionado do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:6; SEQ ID NO:7; SEQ ID NO:8; SEQ ID NO:112; SEQ ID NO:113; e um fragmento compreendendo toda ou parte de qualquer uma das SEQ ID NOs:5 e 6 tendo pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de um gene de Diabrotica, em que preferencialmente o polinucleotídeo é pelo menos 80% idêntico ao polinucleotídeo de referência, mais preferencialmente em que o polinucleotídeo é pelo menos 90% idêntico ao polinucleotídeo de referência e ainda mais preferencialmente em que o polinucleotídeo é pelo menos 95% idêntico ao polinucleotídeo de referência e/ou a SEQ ID NO:2 preferencialmente hibridiza à pelo menos um polinucleotídeo sob condições de adstringência moderada, mais preferencialmente em que a SEQ ID NO:2 hibridiza à pelo menos um polinucleotídeo sob condições de adstringência alta.
  16. 16. Célula, caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1 ou 3, em que a referida célula é preferivelmente selecionada dentre uma célula procariótica, uma célula eucariótica, particularmente uma célula de planta.
  17. 17. Célula de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula de Zea mays ou a planta é Zea mays.
  18. 18. Método para controle de uma população de praga coleóptera, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de um agente compreendendo uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla que funciona quando do contato com a praga coleóptera para inibir uma função biológica dentro da praga coleóptera, em que o agente compreende uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de
    7/12
    RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2.
  19. 19. Método para controle de uma população de praga coleóptera, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de um agente compreendendo uma primeira sequência e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona quando do contato com a praga coleóptera para inibir uma função biológica dentro da praga coleóptera, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que exibe a partir de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência a partir de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizada à segunda sequência de polinucleotídeo.
  20. 20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende ainda uma região que exibe a partir de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência a partir de cerca de 19 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de um gene de praga coleóptera selecionado do grupo consistindo em: um gene de Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:1; a subunidade H de ATPase vacuolar; e a proteína de ligação de GTP pequena Rho1.
  21. 21. Método para controle de uma população de praga coleópte8/12 ra, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento em uma planta hospedeira de uma praga coleóptera de uma célula de planta transformada compreendendo um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona quando do contato com uma praga coleóptera pertencente à população para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da praga coleóptera e resulta em crescimento menor da praga coleóptera ou da população de praga coleóptera, com relação a crescimento em uma planta hospedeira da mesma espécie sem a célula de planta transformada, em que preferivelmente a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla.
    9/12
  22. 22. Método de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a população de praga coleóptera é reduzida com relação a uma população de praga coleóptera que infecta uma planta hospedeira da mesma espécie destituída da célula de planta transformada.
  23. 23. Método para controle de infestação de praga coleóptera em planta em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento na dieta de uma praga coleóptera de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2, em que preferivelmente a dieta compreende uma célula de planta transformada para expressar o polinucleotídeo.
  24. 24. Método para aperfeiçoamento do rendimento de uma cultura
    10/12 de milho, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução em uma planta de milho para produzir uma planta de milho transgênica de um polinucleotídeo compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; e o cultivo da planta de milho para permitir a expressão de pelo menos uma sequência de nucleotídeo; em que a expressão da pelo menos uma sequência de nucleotídeo inibe infecção de praga coleóptera ou crescimento e perda de rendimento devido à infecção por praga coleóptera, em que preferivelmente a expressão da pelo menos uma sequência de nucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma praga coleóptera que entrou em contato com uma porção da planta de milho.
    11/12
  25. 25. Método para produção de uma célula de planta transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende:
    transformação de uma célula de planta com um vetor compreendendo um polinucleotídeo operativamente ligado a um promotor e uma sequência de terminação de transcrição, em que o polinucleotídeo compreende pelo menos uma sequência de nucleotídeo selecionada do grupo consistindo em: SEQ ID NO:2; o complemento de SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:2; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NO:2; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:2;
    cultura da célula de planta transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula de planta compreendendo uma pluralidade de células de planta transformadas.
    seleção das células de planta transformadas que integraram a pelo menos uma sequência de nucleotídeo em seus genomas;
    12/12 avaliação das células de planta transformadas quanto à expressão de uma molécula de ácido ribonucleico codificada por pelo menos uma sequência de nucleotídeo; e seleção de uma célula de planta que expressa dsRNA.
  26. 26. Método para produção de uma planta transgênica resistente à praga coleóptera, caracterizado pelo fato de que compreende:
    fornecimento de uma célula de planta transgênica produzida através do método, como definido na reivindicação 25; e regeneração de uma planta transgênica a partir de uma célula de planta transgênica, em que expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada por pelo menos uma sequência de nucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma praga coleóptera que contata a planta transformada.
  27. 27. Invenção, caracterizada por quaisquer de suas concretizações ou categorias de reivindicação englobadas pela matéria inicialmente revelada no pedido de patente ou em seus exemplos aqui apresentados.
    1/4
BRPI1107332A 2010-12-30 2011-12-30 polinucleotídeo, vetor de transformação, moléculas de ácido nucleico, célula, bem como métodos para controle de praga coleóptera, para aperfeiçoamento do rendimento de cultura de milho, e para produção de célula e planta resistentes à praga coleóptera BRPI1107332A2 (pt)

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