BR102016029547A2 - Molecules of lucic ribosomal protein nucleic acid (rpl40) which confer resistance to cole-pepper and hemippter pest - Google Patents

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Abstract

moléculas de ácido nucleico proteína ribossômica l40 (rpl40) que conferem resistência a pestes de coleóperos e hemípteros. esta descrição refere-se a moléculas de ácido nucleico e métodos de uso das mesmas para controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros por meio da inibição mediada por interferência do rna de sequências de codificação alvo e não codificação transcritas em pestes de coleópteros e/ou hemípteros. a descrição também refere-se a métodos para a preparação de plantas transgênicas que expressam moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros, e a células de planta e plantas desse modo obtidas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLEICO PROTEÍNA RIBOSSÔMICA L40 (RPL40) QUE CONFEREM RESISTÊNCIA A PESTES DE COLEÓPEROS E HEMÍPTEROS".
REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE
[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito do Pedido de Patente Provisional dos Estados Unidos Serial Número 62/269.382, depositado em 18 de dezembro de 2015, que é incorporado aqui em sua íntegra.
CAMPO TÉCNICO
[002] A presente invenção refere-se geralmente a controle genético de dano à planta causado por pestes de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, a presente invenção refere-se à identificação de sequências de codificação alvo e não codificação, e o uso de sequências de não codificação, e o uso de tecnologias de DNA recombinante para expressão de repressão ou inibição pós-transcricionalmente de sequências de codificação alvo e não codificação nas células de uma peste de coleóptero e/ou hemíptero para fornecer um efeito protetor à planta.
ANTECEDENTE
[003] A larva da raiz do milho ocidental (WCR), Diabrotica virgifera virgifera LeConte, é uma das mais devastadoras espécies de larva da raiz do milho na América do Norte e é uma preocupação particular em áreas de cultivo de milho do Midwestern United States. A larva da raiz do milho do norte (NCR), Diabroticabarberi Smith e Lawrence, é uma espécie intimamente relacionada que co-habita muito da mesma faixa como WCR. Existem diversas outras subespécies relacionadas de Diabrotica que são pestes significantes nas Américas: a larva da raiz do milho mexicano (MCR), D. virgifera zeaeKrysan e Smith; a larva da raiz do milho do Sul (SCR), D. undecimpunctata howardiBarber, D. balteata LeConte; D. undecimpunctata tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim. The United States Department of Agriculture estima que as larvas da raiz do milho causam $1 bilhão em receita perdida a cada ano, incluindo $800 milhões em perda de produção e $200 milhões em custos de tratamento.
[004] Ambos os ovos de WCR e NCR são depositados em um solo durante o verão. Os insetos permanecem no estágio de ovo em todo o inverno. Os ovos são oblongo, brancos, e menores do que 0.004 polegadas (0.010 cm) de comprimento. As larvas eclodem no final de maio ou início de junho, com o tempo preciso de incubação do ovo variando de ano a ano, devido às diferenças de temperatura e localização. As larvas recentemente eclodidas são lagartas brancas que são menores do que 0,125 polegadas (0,3175 cm) de comprimento. Assim que eclodidas, as larvas começam a alimentar-se de raízes de milho. Larvas da raiz do milho passam por três instares larvais. Após alimentação durante diversas semanas, as larvas mudam para o estágio de pupa. They passam à pupa no solo, e em seguida elas emergem do solo como adultas em julho e agosto. As larvas adultas são de cerca de 0,25 polegadas (0,635 cm) de comprimento.
[005] As larvas da raiz do milho completam o desenvolvimento sobre o milho e diversas outras espécies de gramíneas. As larvas criadas em raposas amarelas emergem mais tarde e têm um tamanho de cápsula de cabeça menor como adultos do que as larvas criadas em milho (Ellsbury etal. (2005) Environ. Entomol. 34:627-634). Adultos de WCR alimentam-se de seda, pólen, e sementes de milho sobre as pontas de espiga expostas. Se adultos de WCR emergem antes de tecidos reprodutivos de milho estarem presentes, eles podem alimentar-se de tecido de folha, desse modo tornando mais lento o crescimento da planta e ocasional mente matando a planta hospedeira.
Entretanto, os adultos rapidamente mudarão para sedas e pólen preferidas quando se tornam disponíveis. Adultos de NCR também se alimentam sobre tecidos reprodutivos da planta de milho, porém ao contrário, raramente se alimentam de folhas de milho.
[006] A maioria dos danos à larva da raiz de milho é causada por alimentação larval. As larvas recentemente eclodidas inicialmente alimentaram-se sobre os finos cabelos da raiz do milho e enterram-se nas pontas da raiz. As larvas desenvolvem-se, alimentam-se sobre e enterram-se nas raízes primárias. Quando as larvas da raiz do milho são abundantes, a alimentação larval frequentemente resulta na pode das raízes até a base da espiga do milho. Severo dano à raiz interfere com a capacidade das raízes transportarem água e nutrientes para a planta, reduz o crescimento da planta, e resulta na produção de grão reduzida, desse modo freqeemente drasticamente reduzindo a produção total. Severo dano à raiz também frequentemente resulta em hospedagem de plantas de milho, que torna a colheita mais difícil e também diminui a produção. Além disso, a alimentação por adultos sobre os tecidos reprodutivos do milho podem resultar em poda de sedas na ponta da espiga. Se este "corte da seda" é suficientemente severo durante o escorrimento da pólen, a polinização pode ser rompida.
[007] O controle de larvas da raiz do milho pode ser tentado por rotação da colheita, inseticidas químicos, biopesticidas (por exemplo, a bactéria gram-positiva formadora de esporo, Bacillus thuringiensis(Bt)), plantas transgênicas que expressam toxinas Bt, ou uma combinação dos mesmos. A rotação da colheita sofre da desvantagem de colocar restrições indesejadas sobre o uso de área agrícola. Além disso, a oviposição de algumas espécies larvas de raiz pode ocorrer em campos de colheita, exceto milho ou diapausa estedida resulta em eclosão de ovos durante vários anos, desse modo mitigando a eficácia de rotação da colheita praticada com milho e soja.
[008] Inseticidas químicos são os mais fortemente acreditados na estratégia para alcançar o controle da larva da raiz do milho. O uso de inseticida químico, entretanto, é uma imperfeita estratégia de controle da larva da raiz do milho; mais de $1 bilhão pode ser perdido nos Estados Unidos a cada ano, devido à larva da raiz do milho quando os custos dos inseticidas químicos são adicionados aos custos do dano da larva da raiz que pode ocorrer, a despeito do uso de inseticidaes. Altas populações de larvas, chuvas pesadas, e aplicação imprópria do(s) inseticida(s) podem todas resultar em controle inadequado da larva da raiz do milho. Além disso, o uso contínuo de inseticidas pode selecionar cepas de larvas de raiz resistentes ao inseticida, bem como criar significantes preocupações ambientais, devido à toxicidade de muitos deles para espécies não alvo.
[009] Percevejos-fedorentos e outros insetos hemípteros (heterópteros) são outra importante complexa peste agrícola. Mundialmente mais de 50 espécies intimamente relacionadas de percevejos-fedorentos são sabidas causarem dano à colheita (McPherson & McPherson, R.M. (2000) Percevejos-fedorentos of economic importance in America north of México CRC Press). Estes insetos estão presentes em um grande número de importantes colheitas incluindo milho, soja, fruto, vegetais, e cereais.
[0010] Percevejos-fedorentos passam por vários estágios ninfa antes de alcançar o estágio adulto. O tempo para se desenvolver de ovos a adultos é de cerca de 30 a 40 dias. Tanto as ninfas quanto adultos alimentam-se de seiva de tecidos moles nos quais eles também injetam enzimas digestivas causando digestão de tecido extra-oral e necrose. Material vegetal digerido e nutrientes são então ingeridos. Depleção de água e nutrientes de um sistema vascular de planta resulta em dano ao tecido da planta. Dano ao grão e sementes em desenvolvimento é o mais significante quando a produção e germinação são significantemente reduzidas. Várias gerações ocorrem em climas quentes, resultando em significante pressão ao inseto. O controle atual de percevejos-fedorentos contam com tratamento com inseticida em uma base de campo individual. Portanto, estratégias de controle alternativo são urgentemente necessários para minimizar perdas contínuas de colheita.
[0011] A interferência de RNA (RNAi) é um processo utilizando séries de reação celulares endógenas, utilizando séries de reação celulares endógenas, por meio das quais uma molécula de RNA de interferência (iRNA) (por exemplo, uma molécula de dsRNA) que é específica para toda, ou qualquer porção de tamanho adequado, de uma sequência de gene alvo resulta na degradação do mRNA codificado codificado dessa forma. Nos últimos anos, RNAi tem sido usado para realizar a "redução" de diversas espécies e sistemas experimentais; por exemplo, Caenorhabditis elegans, plantas, embriões de inseto, e células em cultura de tecido. Veja, por exemplo, Fire et al. (1998) Nature 391:806-811; Martinez et a/.(2002) Cell 110:563-574; McManus e Sharp (2002) Nature Rev. Genetics 3:737-747.
[0012] RNAi realiza a degradação de mRNA por meio de uma série de reação endógena, incluindo o complexo de proteína DICER. DICER cliva moléculas de dsRNA longas em fragmentos curtos de aproximadamente 20 nucleotídeos, denominado RNA de pequena interferência (siRNA). O siRNA é desenrolado em dois RNAs de fita simples: a fita passageiro e a fita guia. A fita passageiro é degradada, e a fita guia é incorporada no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC). O silenciamento de gene pós-transcricional ocorre quando a fita guia se liga especificamente a uma sequência complementar de uma molécula de mRNA e induz a divagem por Argonaute, o componente catalítico do complexo. Este processo é conhecido por disseminar-se sistemicamente em alguns organismos eucarióticos, a despeito de concentrações inicialmente limitadas de siRNA e/ou miRNA, tais como plantas, nematódeos, e alguns insetos.
[0013] Patente dos Estados Unidos No. 7.612.194 e Publicações de Patente dos Estados Unidos Nos. 2007/0050860, 2010/0192265, e 2011/0154545 descrevem uma biblioteca de 9112 sequências rótulo de sequência expressa (EST) isoladas de D. v. virgifera LeConte pupae. É sugerido na Patente dos Estados Unidos No. 7.612.194 e Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2007/0050860 operavelmente ligar-se a um promotor uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma de diversas sequências parciais particulares de H+-ATPase (V-ATPase) tipo D. v. virgifera vacuolar descritas aqui para uma expressão de RNA antissentido em células vegetais. Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2010/0192265 sugere operavelmente ligar um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene D. v. virgifera de função desconhecida e não descrita (a sequência parcial é estabelecida ser 58% idêntica ao produto de gene C56C10.3 em C. elegans) para a expressão de RNA antissentido em células vegetais. Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2011/0154545 sugere operavelmente ligar um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a duas sequências parciais particulares de genes de subunidade beta de D. v. virgifera Coatomer para a expressão de RNA antissentido em células vegetais. Além disso, a Patente dos Estados Unidos No. 7.943.819 descreve uma biblioteca de 906 sequências rótulo de sequência expressa (EST) isoladas de larvas de D. v. virgifera LeConte, pupas, e intestinos médios, e sugere operavelmente ligar um promotor a uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência parcial particular de um gene de proteína 4b de corpo multivesicular carregado de D. v. virgifera para a expressão de RNA de fita dupla em células vegetais.
[0014] Nenhuma outra sugestão é fornecida na Patente dos Estados Unidos No. 7.612.194, e Publicações de Patente dos Estados Unidos Nos. 2007/0050860, 2010/0192265 e 2011/0154545 para usar qualquer sequência particular de mais de nove mil sequências listadas aqui para interferência de RNA, exceto as diversas sequências parciais particulares de V-ATPase e as sequências parciais particulares de genes de função desconhecida. Além disso, nenhuma das Patentes dos Estados Unidos No. 7.612.194, e Publicação de Patente dos Estados Unidos Nos. 2007/0050860 e 2010/0192265, e 2011/0154545 fornece qualquer orientação como para à qual outra das mais de nove mil sequências fornecidas seria letal, ou mesmo de outro modo útil, em espécies de larva da raiz do milho quando usada como dsRNA ou siRNA. A Patente dos Estados Unidos No. 7.943.819 não fornece nenhuma sugestão para uso de qualquer sequência particular das mais de 900 sequências listadas aqui para interferência de RNA, exceto a sequência parcial particular de um gene de proteína 4b de corpo multivesicular carregado. Além disso, a Patente dos Estados Unidos No. 7.943.819 não fornece nenhuma orientação como para à qual outra das mais de 900 sequência fornecidas seria letal, ou mesmo de outro modo útil, em espécies de larva da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. U.S. 2013/040173 e Publicação de Pedido PCT No. WO 2013/169923 descrevem o uso de uma sequência derivada de um gene Diabroticavirgifera Snf7 para interferência de RNA em milho. (Também descrito em Bolognesi et al. (2012) PLoS ONE 7(10): e47534. doi: 10.1371 /journal.pone.0047534).
[0015] A esmagadora maioria de sequências complementares aos DNAs da larva da raiz do milho (tal como os anteriores) não são letais em espécies de larva da raiz do milho quando usadas como dsRNA ou siRNA. Por exemplo, Baum et al. (2007, Nature Biotechnology 25:1322-1326), descreve os efeitos de inibição de diversos alvos de gene de WCR por RNAi. Estes autores reportaram que 8 dos 26 genes alvo que eles testaram não foram capazes de prover a mortalidade da peste de coleópteros experimental mente significante em uma concentração de iRNA muito elevada (por exemplo, dsRNA) de mais de 520 ng/cm2.
[0016] Os autores da Patente dos Estados Unidos 7.612.194 e Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2007/0050860 fizeram o primeiro relato de RNAi em planta em plantas de milho alvejando a larva da raiz do milho ocidental (Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-6). Estes autores descrevem uma alta produtividade de sistema de RNAi dietético in vivo para avaliar os genes alvo potenciais para desenvolver milho de RNAi transgênico. De um lago de gene inicial de 290 alvos, apenas 14 exibiram potencial de controle larval. Um dos mais efetivos RNAs de fita dupla (dsRNA) alvejou um gene codificando subunidade A de ATPase vacuolar (V-ATPase), resultando em uma rápida supressão de correspondente mRNA endógeno e disparando uma resposta de RNAi específica com baixas concentrações de dsRNA. Desse modo, estes autores documentaram pela primeira vez o potencial para RNAi em planta como uma ferramenta de controle de peste possível, embora simultaneamente demonstrando que alvos efetivos podem não ser precisamente identificados a priori, mesmo de um grupo relativamente pequeno de genes candidatos.
SUMÁRIO
[0017] São descritas aqui moléculas de ácido nucleico (por exemplo, genes alvo, DNAs, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs, e hpRNAs), e métodos de uso dos mesmos, para o controle de pestes de coleópteros, incluindo, por exemplo, D. v.virgifera LeConte (larva da raiz do milho ocidental, "WCR"); D. barber/Smith e Lawrence (larva da raiz do milho do norte, "NCR"); D. u. howardi Barber (larva da raiz do milho do sul, "SCR"); D. v. zeae Krysan e Smith (Larva da raiz do milho mexicano, "MCR"); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim e pestes de hemípteros, incluindo, por exemplo, Euschistus heros (Fabr.) (Percevejo-fedorento Marrom Neotropical, "BSB"), Nezara viridula (L.) (Percevejo-fedorento Verde do Sul), Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo-fedorento de Faixa Vermelha), Halyomorpha halys (Stâl) (Percevejo-fedorento Marmorizado Marrom), Chinavia hilare (Say) (Percevejo-fedorento Verde), Euschistus servus (Say) (Percevejo-fedorento Marrom), Dichelops melacanthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Percevejo-fedorento de Ombro Vermelho Neotropical), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Percevejo do Algodão), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Percevejo de Planta Manchado Ocidental), e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois). Em exemplos particulares, moléculas de ácido nucleico exemplares são descritas que podem ser homólogas a pelo menos uma porção de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero.
[0018] Nestes e outros exemplos, a sequência de ácido nucleico nativa pode ser um gene alvo, o produto do qual pode ser, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico ou envolvido em desenvolvimento larval/ninfa. Em alguns exemplos, inibição pós-translacional da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência homóloga a ela pode ser letal em pestes de coleópteros e/ou hemípteros, ou resultar em crescimento e/ou desenvolvimento reduzido. Em exemplos específicos, um gene codificando uma proteína de fusão que é clivado pós-clanslacionalmente em proteína ribossômica RpL40 e uma mono-ubiquitina (referida aqui coletivamente como rpL40) pode ser selecionado como um gene alvo para silenciamento pós-transcricional. Em exemplos particulares, um gene alvo útil para inibição pós-transcricional é o novo gene referido aqui como rpL40. Uma molécula de ácido nucleico isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeo de rpL40 (SEQ ID NOs: 1,3,5, e 89); o complemento de rpL40 (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89); e fragmentos de qualquer um dos anteriores são, portanto, descritos aqui.
[0019] São também descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido em um produto de gene alvo (por exemplo, o produto de um gene referido como RPL40 e/ou mono-ubiquitina, coletivamente referido aqui como RPL40). Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOs: 2,4,6,7,8, e 90 (proteína RPL40). Em exemplos particulares, uma molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo codificando um polipeptídeo que é pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido em um produto de RPL40. São também descritas moléculas de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é o complemento reverso de uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo pelo menos 85% idêntica a uma sequência de aminoácido em um produto de gene alvo.
[0020] São também descritas sequências de cDNA que podem ser usados para a produção de moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que são complementares a todo ou parte de um gene alvo de peste de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo: rpL40. Em modalidades particulares, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser produzidos in vitro ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. Em exemplos particulares, moléculas de cDNA são descritas que podem ser usadas para produzir moléculas de iRNA que são complementares a todo ou parte de rpL40 (S SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89).
[0021] São também descritos métodos para inibir a expressão de um gene essencial em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero, e métodos para proteger uma planta de pestes de coleópteros e/ou hemípteros. Um método para inibir a expressão de um gene essencial em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero é uma molécula de RNA de fita simples ou dupla consistindo em pelo menos uma de SEQ ID NO:9 (Diabrotica rpL40-1 região 1, aqui algumas vezes referida como rpL40-1 regí), ou SEQ ID NO: 10 (Diabrotica rpL40-3 região 3, aqui algumas vezes referida como rpL40-3 reg3), ou SEQ ID NO:11 (Diabrotica rpL40-1 versão 1, aqui algumas vezes referida como rpL40-1v 1), ou SEQ ID NO:12 (Diabrotica rpL40-1 versão 2, aqui algumas vezes referida como rpL40-1 v2), ou SEQ ID NO:13 (Diabrotica rpL40-1 versão 3, aqui algumas vezes referida como rpL40-1 v3), ou SEQ ID NO:14 (Diabrotica rpL40-1 versão 4, aqui algumas vezes referida como rpL40-1 v4), ou SEQ ID NO:15 (Diabrotica rpL40-1 versão 5, aqui algumas vezes referida como rpL40-1 v5), ou SEQ ID NO:91 (Euschistus herosrpL40 região 1, aqui algumas vezes referida como BSB_rpL40 regí), ou SEQ ID NO:92 (Euschistus herosrpL40 versão 1, aqui algumas vezes referida como BSB_rpL40 v1), ou o complemento das mesmas. Equivalentes funcionais de métodos para inibir a expressão de um gene essencial em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero incluem moléculas de RNA de fita simples ou dupla que são substancialmente homólogas a todo ou parte de um gene de WCR ou BSB compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89. Um método para proteger uma planta de pestes de coleópteros e/ou hemípteros é uma molécula de DNA compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando um método para inibir a expressão de um gene essencial em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero operavelmente ligada a um promotor, em que a molécula de DNA é capaz de ser integrada no genoma de uma planta.
[0022] São descritos métodos para controlar uma população de uma peste de inseto (por exemplo, uma peste de coleópteros ou hemípteros), compreendendo prover a uma peste de inseto (por exemplo, uma peste de coleópteros ou hemípteros) uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) que funciona sendo apreendida pela peste para inibir uma função biológica dentro da peste.
[0023] Em algumas modalidades, métodos para controlar uma população de uma peste de coleóptero compreendem prover para a peste de coleóptero uma molécula de iRNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO:98; o complemento de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; o complemento de SEQ ID NO:99; SEQ ID NO:100; o complemento de SEQ ID NO:100; SEQ ID NO:101; o complemento de SEQ ID NO:101; SEQ ID NO:102; o complemento de SEQ ID NO:102; SEQ ID NO:103; o complemento de SEQ ID NO:103; SEQ ID NO:104; o complemento de SEQ ID NO:104; SEQ ID NO:105; o complemento de SEQ ID NO:105; SEQ ID NO:106; o complemento de SEQ ID NO:106; SEQ ID Ν0:107; ο complemento de SEQ ID NO:107; um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo rpL40 nativo de uma peste de coleóptero (por exemplo, WCR); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo rpL40 nativo de uma peste de coleóptero; um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5 e 9-15; e o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 9-15.
[0024] Em algumas modalidades, um método para controlar uma população de uma peste de hemíptero compreende prover a uma peste de hemíptero uma molécula de iRNA que compreende todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO:108; o complemento de SEQ ID NO:108; SEQ ID NO:109; o complemento de SEQ ID NO:109; SEQ ID NO:110; o complemento de SEQ ID NO:110; um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo rpL40 nativo de uma peste de hemíptero (por exemplo, BSB); o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo rpL40 nativo de uma peste de hemíptero; um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 76, 78, e 80-82; e o complemento de um polinucleotídeo que hibridiza para um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 76, 78, e 80-82.
[0025] Em modalidades particulares, um iRNA que funciona sendo apreendido por uma peste de inseto para inibir uma função biológica dentro da peste é transcrito de um DNA compreendendo o todo ou parte de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1,3,5,9-15, 89, e 91-92; o complemento de SEQ ID NOs: 1,3,5, 9-15, 89, e 91-92; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) ou organismo hemíptero (por exemplo BSB) compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92; e o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica ou organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92.
[0026] São também descritos aqui métodos em que dsRNAs, siRNAs,shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser fornecidos para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros em um ensaio com base na dieta, ou em células vegetais geneticamente modificadas expressando os dsRNAs, siRNAs.shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs. Nestes e outros exemplos, os dsRNAs, siRNAs,shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs podem ser ingeridos por larvas de peste de coleóptero e/ou ninfas de peste de hemíptero. Ingestão de dsRNAs, siRNA,shRNAs, miRNAs, e/ou hpRNAs da invenção pode então resultar em RNAi nas larvas ou ninfas, que por sua vez podem resultar em silenciamento de um gene essencial para viabilidade da peste de coleóptero e/ou hemíptero e levando finalmente à mortalidade da larva/ninfa. Desse modo, são descritos métodos em que as moléculas de ácido nucleico compreendendo sequência(s) de ácido nucleico alvo exemplares úteis para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros são fornecidas para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em exemplos particulares, a peste de coleópteros e/ou hemípteros controlada pelo uso de moléculas de ácido nucleico da invenção pode ser WCR.NCR, SCR, MCR,D. balteata, D. u. tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, Euschistus heros, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, C. marginatum, Dichelops melacandesse modo, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e/ou Lygus lineolaris.
[0027] Os anteriores e outros aspectos tornar-se-ão mais evidentes a partir da seguinte Descrição Detalhada de diversas modalidades, que procede com referência às Figuras 1 e 2 de acompanhamento.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0028] A Figura 1 inclui uma representação de uma estratégia usada para fornecer dsRNA de um padrão de única transcrição com um único par de iniciadores.
[0029] A Figura 2 inclui uma descrição de uma estratégia usada para fornecer dsRNA de dois padrões de transcrição.
[0030] A Figura 3 representa um RNA tipo grampo de cabelo. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
[0031] As sequências de ácido nucleico identificadas na listagem de sequências de acompanhamento são mostradas usando abreviações de letra padrão para bases de nucleotídeo, como definido em 37 C.F.R. § 1.822. As sequências de ácido nucleico e aminoácido listadas definem moléculas (isto é, polinucleotídeos e polipeptídeos, respectivamente) tendo os monômeros de nucleotídeo e aminoácido dispostos da maneira descrita. As sequências de ácido nucleico e aminoácido listadas também cada uma define um gênero de polinucleotídeos ou polipeptídeos que compreendem os monômeros de nucleotídeo e aminoácido dispostos da maneira descrita. Em vista da redundância do código genético, será entendido que uma sequência de nucleotídeo incluindo uma sequência de codificação também descreve o gênero de polinucleotídeos codificando o mesmo polipeptídeo como um polinucleotídeo que consiste na sequência de referência. Será também entendido que uma sequência de aminoácido descreve o gênero de ORFs de polinucleotídeo codificando aquele polipeptídeo.
[0032] Apenas uma fita de cada sequência de ácido nucleico é mostrada, porém a fita complementar é entendida como incluída por qualquer referência àfita mostrada. Como o complemento e complemento reverso de uma sequência de ácido nucleico primária são necessariamente mostrados pela sequência primária, a sequência complementar e sequência complementar reversa de uma sequência de ácido nucleico são incluídas por qualquer referência à sequência de ácido nucleico, a menos que seja estabelecido ser de outro modo (ou é claro ser de outro modo do contexto em que a sequência aparece). Além disso, como é entendido na técnica que a sequência de nucleotídeo de uma fita de uma fitao de RNA é determinado pela sequência do DNA do qual é transcrita (porém para a substituição de nucleobases de uracila (U) por timina (T)), uma sequência de RNA é incluída por qualquer referência à sequência de DNA codificando-a. Na listagem de sequências de acompanhamento: [0033] SEQ ID NO:1 mostra uma sequência de DNA compreendendo rpL40-1 de Diabrotica virgifera.
[0034] SEQ ID NO:2 mostra uma sequência de aminoácido de proteína aRPL40-1 de Diabrotica virgifera.
[0035] SEQ ID NO:3 mostra uma sequência de DNA compreendendo rpL40-2 de Diabrotica virgifera.
[0036] SEQ ID NO:4 mostra uma sequência de aminoácido de aRPL40-2 protein de Diabrotica virgifera.
[0037] SEQ ID NO:5 mostra uma sequência de DNA compreendendo rpL40~3 de Diabrotica virgifera.
[0038] SEQ ID NO:6 mostra uma sequência de aminoácido de aRPL40-3 protein de Diabrotica virgifera.
[0039] SEQ ID NO:7 mostra uma sequência de aminoácido de uma proteína hipotética de Diabrotica virgifera SEQ ID NO:5.
[0040] SEQ ID NO:8 mostra uma sequência de aminoácido de uma proteína hipotética de Diabrotica virgifera SEQ ID NO:5.
[0041] SEQ ID NO:9 mostra uma sequência de DNA de rpL40-1 regí ( região 1) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0042] SEQ ID NO:10 mostra uma sequência de DNA de rpL40-3 reg3 ( região 3) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0043] SEQ ID NO:11 mostra uma sequência de complemento reversa de DNA de rpL40-1v 1 (versão 1) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0044] SEQ ID NO:12 mostra uma sequência de DNA de rpL40-1v2 (versão 2) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0045] SEQ ID NO:13 mostra uma sequência de DNA de rpL40-1 ν3 ( versão 3) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0046] SEQ ID NO:14 MOSTRA UMA SEQUÊNCIA DE D NA DE rpL40-1 v4 (versão 4) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0047] SEQ ID NO:15 mostra uma sequência de DNA de rpL40-1 v5 (versão 5) de Diabrotica virgifera que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0048] SEQ ID NO:16 mostra uma sequência de DNA de um promotor de fago T7.
[0049] SEQ ID NO:17 mostra uma sequência de DNA de um YFP coding região segment que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0050] SEQ ID NOS: 18 A 31 mostra iniciadores usados para amplificar porções de uma uma sequência de subunidade rpL40 de Diabrotica virgifera compreendendo rpL40 regí e rpL40 reg3.
[0051] SEQ ID NO:32 mostra uma sequência de codificação de proteína YFP
[0052] SEQ ID NO:33 mostra uma sequência de DNA de Anexina região 1.
[0053] SEQ ID NO:34 mostra uma sequência de DNA de Anexina região 2.
[0054] SEQ ID NO:35 mostra uma sequência de DNA de espectrina beta 2 região 1.
[0055] SEQ ID NO:36 mostra uma sequência de DNA de espectrina beta 2 região 2.
[0056] SEQ ID NO:37 mostra uma sequência de DNA de mtRP-L4 região 1.
[0057] SEQ ID NO:38 mostra uma sequência de DNA de mtRP~L4 região 2.
[0058] SEQ ID NOs: 29 a 66 mostra iniciadores usados para amplificar regiões de gene de YFP, Anexina, espectrina beta 2, e mtRP-L4 for dsRNA synthesis.
[0059] SEQ ID NO:67 mostra uma sequência de DNA de milho codificando uma proteína tipo TIP41.
[0060] SEQ ID NO:68 mostra uma sequência de DNA de oligonucleotide T20NV.
[0061] SEQ ID NOs: 69 a 73 mostram sequências de iniciadores e sondas usadas para medir os níveis de transcrição de milho.
[0062] SEQ ID NO:74 mostra uma sequência de DNA de uma porção de uma região de codificação SpecR para detecção de estrutura principal de vetor binário.
[0063] SEQ ID NO:75 mostra uma sequência de DNA de uma porção de uma região de codificação AAD1 usada para análise de número de cópia genômica.
[0064] SEQ ID NO: 76 mostra uma sequência de DNA de um gene de invertase de milho.
[0065] SEQ ID NOs: 77 a 85 mostram sequências de iniciadores e sondas usadas para análises de número de cópia de gene.
[0066] SEQ ID NOs: 86 a 88 mostram sequências de iniciadores e sondas usadas para análise de expressão de milho.
[0067] SEQ ID NO: 89 mostra um sequência de DNA exemplar de transcrição rpL40 de BSB de um Percevejo-fedorento Marrom Neotropical (Euschistus heros).
[0068] SEQ ID NO: 90 mostra uma sequência de aminoácido de uma proteína rpL40 de Euschistus heros.
[0069] SEQ ID NO:91 mostra uma sequência de DNA de BSB_rpL40 regí (região 1) de Euschistus heros que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0070] SEQ ID NO: 92 mostra uma sequência de DNA de BSB_rpL40 v1 ( versão 1) de Euschistus heros que foi usada para síntese de dsRNA in vitro (Sequências promotoras T7 nas extremidades 5' e 3' não mostradas).
[0071] SEQ ID NO: 93-94 mostra iniciadores usados para amplificar porções de uma de sequência Euschistus /7erosrpL40compreendendo BSB_rpL40 regí.
[0072] SEQ ID NO: 95 é a fita senso de dsRNA:YFPv2 alvejado por YFP
[0073] SEQ ID NO: 96-97 mostra iniciadores usados para amplificar porções de um dsRNA:YFPv2 alvejado por YFP
[0074] SEQ ID NOs: 98-110 mostram RNAs exemplares transcritos de ácidos nucleicos compreendendo polinucleotídeos rpL40 exemplares e fragmentos dos mesmos.
[0075] SEQ ID NO: 111 mostra um Conjunto 1 de PRB de rpl40 de sonda IDT Custom Oligo, rotulada com FAM e saciado duplamente com saciadores Zen e lowa Black.
[0076] SEQ ID NO: 112 mostra um polinucleotídeo ligante exemplar, que forma uma "alça" quando transcrito em uma transcrição de RNA para formar uma estrutura tipo grampo de cabelo: DESCRIÇÃO DETALHADA I. Visão Geral de Diversas Modalidades [0077] Foi desenvolvida interferência de RNA (RNAi) como uma ferramenta para controle de peste de inseto, usando uma das mais prováveis espécies de peste alvo para plantas transgênicas que expressam dsRNA; a larva da raiz do milho ocidental. Até agora, a maioria dos genes propostos como alvos para RNAi em larvas de raiz não alcançam na realidade seus propósitos. Aqui, foi descrita redução mediada por RNAi de proteína ribossômica L40 (rpL40) nas pestes de inseto exemplares, larva da raiz do milho ocidental e Percevejo-fedorento Marrom Neotropical, que é mostrada ter um fenótipo letal quando, por exemplo, moléculas de iRNA são liberadas por meio de dsRNA de rpL40 ingerido ou injetado. Em modalidades aqui, a capacidade de liberar dsRNA de rpl_40 alimentando a insetos confere um efeito de RNAi que é muito I para controle de peste de inseto (por exemplo, coleópteros e hemípteros). Combinando RNAi mediado por rpL40 com outros alvos de RNAi úteis (por exemplo, ROP (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/577811), RNAPII (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/577854), alvos de RNAi de RNA polimerase 11 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133.214), alvos de RNAi de RNA polimerase 11215 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133.202), alvos de RNAi de RNA polimerase 1133 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133.210), alvos de RNAi de nem (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/095487), alvos de RNAi de snap25 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/193502), alvos de RNAi de spt5 de fator de alongamento de transcrição (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/168.613), alvos de RNAi de spt6 de fator de alongamento de transcrição (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/168,606), COPI alfa (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063199), COPIgama (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063192), COPI delta (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063216), COPI beta (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063203), sec23 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 61/989170), sec24 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/061608), e dre4 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 61/989843)), o potential para afetar múltiplas sequências alvo, por exemplo, em lagartas de raiz larvais, pode aumentar as oportunidades desenvolver métodos sustentáveis para o controle de peste de insete, envolvendo tecnologias de RNAi.
[0078] São descritos aqui métodos e composições para controle genético de infestações de peste de coleópteros e/ou hemípteros. São também fornecidos métodos para identificar um ou mais gene(s) essenciais para o ciclo de vida de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros para uso como um gene alvo para controle mediado por RNAi de uma população de peste de coleópteros e/ou hemípteros. Vetores de plasmídeo de DNA codificando uma ou mais moléculas de dsRNA podem ser designados para suprimir um ou mais gene(s) alvo essenciais para crescimento, sobrevivência, desenvolvimento, e/ou reprodução. Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para repressão pós-transcricional de expressão ou inibição de um gene alvo por meio de moléculas de ácido nucleico que são complementares a uma sequência de codificação ou não codificação do gene alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. Nestas e outras modalidades, uma peste de coleópteros e/ou hemípteros pode ingerir uma ou mais moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e/ou hpRNA transcritas de toda ou uma porção de uma molécula de ácido nucleico que é complementar a uma sequência de codificação ou não codificação de um gene alvo, desse modo fornecendo um efeito protetor da planta.
[0079] Desse modo, algumas modalidades envolvem a inibição específica da sequência de expressão de produtos de gene alvo, usando os dsRNA, siRNA,shRNA, miRNA e/ou hpRNA que é complementar a sequências de codificação e/ou não codificação do(s) gene(s) alvo para de não codificação do(s) gene(s) alvo para obter pelo menos controle parcial de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. É descrito um conjunto de moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendendo uma sequência de nucleotídeo, por exemplo, como mencionado em qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, 91-92, e fragmentos das mesmas. Em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA estabilizada pode ser expressa desta sequência, fragmentos da mesma, ou um gene compreendendo uma destas sequências, para o silenciamento pós-transcricional ou inibição de um gene alvo. Em determinadas modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem o todo ou parte de SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem o todo ou parte de SEQ ID NO:3. Em ainda outras modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem o todo ou parte de SEQ ID NO:5. Em outras modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem o todo ou parte de SEQ ID NO:9. Em ainda outras modalidades, moléculas de ácido nucleico isoladas e purificadas compreendem o todo ou parte de SEQ ID NOs: 10-15, SEQ ID NO:89, ou SEQ ID NOs: 91-92.
[0080] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante (por exemplo, uma célula vegetal) tendo em seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA). Em modalidades particulares, a(s) molécula(s) de dsRNA pode(m) ser produzidas quando ingeridas por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros para silenciar pós-translacionalmente ou inibir a expressão de um gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. A sequência de DNA recombinante pode compreender, por exemplo, uma ou mais de qualquer das SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, ou 91-92; fragmentos de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, ou 91-92; ou uma sequência parcial de um gene compreendendo uma ou mais de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, ou 91-92; ou complementos das mesmas.
[0081] Algumas modalidades envolvem uma célula hospedeira recombinante tendo em seu genoma uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos um iRNA (por exemplo, dsRNA) molécula(s) compreendendo todo ou parte de SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:99, SEQ ID NO:100, e/ou SEQ ID NO:108 (por exemplo, pelo menos um polinucleotídeo selecionado de um grupo compreendendo SEQ ID NOs: 101-107 e 109-110), ou o complemento das mesmas. Quando ingerida por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, a molécula de iRNA(s) pode silenciar ou inibir a expressão de um gene alvo compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e/ou 91-92, em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, e desse modo resultar em cessação crescimento, desenvolvimento, reprodução, e/ou alimentação em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros.
[0082] Em algumas modalidades, uma célula recombinante tendo em seu genoma pelo menos uma sequência de DNA recombinante codificando pelo menos uma molécula de dsRNA pode ser uma célula vegetal transformada. Algumas modalidades envolvem plantas transgênicas compreendendo tal célula vegetal transformada. Além de tais plantas transgênicas, plantas de progênie de qualquer geração de planta transgênica, sementes transgênicas, e produtos de planta transgênica, são todos fornecidos, cada um dos quais compreende sequência(s) de DNA recombinante. Em modalidades particulares, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser expressa em uma célula vegetal transgênica. Portanto, nestas e outras modalidades, uma molécula de dsRNA da invenção pode ser isolada de uma célula vegetal transgênica. Em modalidades particulares, a planta transgênica é uma planta selecionada do grupo compreendendo milho (Zea mays), soja (Glycine max), e plantas da família Poaceae.
[0083] Algumas modalidades envolvem um método para modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de peste de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser fornecida, em que a molécula de ácido nucleico compreende uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA. Em modalidades particulares, uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA pode ser operativamente ligada a um promotor, e pode também ser operativamente ligada a uma sequência de terminação de transcrição. Em modalidades particulares, um método para modulação da expressão de um gene alvo em uma célula de peste de coleópteros e/ou hemípteros pode compreender: (a) transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA; (b) cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; (c) selecionar uma célula vegetal transformada que tenha integrado o vetor em seu genoma; e (d) determinar que a célula vegetal transformada selecionada compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Uma planta pode ser regenerada de uma célula vegetal que tenha o vetor integrado em seu genoma e compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vector.
[0084] Desse modo, é também descrita uma planta transgênica compreendendo um vetor tendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de dsRNA integrada em seu genoma, em que a planta transgênica compreende a molécula de dsRNA codificada pela sequência de nucleotídeo do vetor. Em modalidades particulares, expressão de uma molécula de dsRNA em uma planta é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma célula de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros que contata a planta transformada ou célula vegetal, por exemplo, alimentando-se sobre a planta transformada, uma parte da planta (por exemplo, raiz) ou célula vegetal. Plantas transgênicas descritas aqui podem apresentar resistência e/ou tolerância realçada a infestações por peste de coleópteros e/ou hemípteros. Plantas transgênicas particulares podem apresentar resistência e/ou tolerância realçada a uma ou mais pestes de coleópteros e/ou hemípteros selecionadas do grupo que consiste em: WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata, D. u. tenella, D. speciosa, D. u. undecimpunctata, Euschistus heros, E. servus, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Chinavia hilare, C. marginatum, Dichelops melacandesse modo, D. furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus, Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e/ou Lygus lineolaris.
[0085] São também descritos aqui métodos para liberação de agentes de controle, tal como uma molécula de iRNA, para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Tais agentes de controle podem causar, diretamente ou indiretamente, dano na capacidade da peste de coleópteros e/ou hemípteros alimentar-se, desenvolver-se ou de outro modo causar dano em um hospedeiro. Em algumas modalidades, é fornecido um método que compreende a liberação de uma molécula de dsRNA estabilizada para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros para suprimir pelo menos um gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, desse modo reduzindo ou eliminando dano à planta por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, um método de inibir a expressão de um gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar na cessação de crescimento, desenvolvimento, reprodução, e/ou alimentação em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, o método pode eventualmente resultar em morte da peste de coleópteros e/ou hemípteros.
[0086] Em algumas modalidades, composições (por exemplo, uma composição tópica) são fornecidos que compreendem um iRNA (por exemplo, dsRNA) molécula da invenção para uso em plantas, animais, e/ou o ambiente de uma planta ou animal para obter a eliminação ou redução de uma infestação de peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, a composição pode ser uma composição nutricional ou fonte alimentar a ser alimentada para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Algumas modalidades compreendem tornar a composição nutricional ou fonte alimentar disponível para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Ingestão de uma composição compreendendo moléculas de iRNA pode resultar na captação das moléculas por uma ou mais células da peste de coleópteros e/ou hemípteros, que pode por sua vez resultar na inibição de expressão de pelo menos um gene alvo em célula(s) da peste de coleópteros e/ou hemípteros. Ingestão de ou damage a uma planta ou célula vegetal por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros pode ser limitada ou eliminada em ou sobre qualquer tecido ou ambiente hospedeiro em que uma peste de coleópteros e/ou hemípteros está presente fornecendo uma ou mais composições compreendendo uma molécula de iRNA da invenção no hospedeiro da peste de coleópteros e/ou hemípteros.
[0087] Iscas de RNAi são formadas quando o dsRNA é misturado com alimento ou um atraente ou ambos. Quando as pestes comem a isca, eles também consomem o dsRNA. As iscas podem tomar a forma de grânulos, géis, pós fluíveis, líquidos, ou sólidos. Em outra modalidade, rab5 pode ser incorporada em uma formulação de isca tal como aquela descrita na Patente dos Estados Unidos No. 8.530.440 que é pelo presente incorporada por referência. Geralmente, com iscas, as iscas são colocadas em ou em torno do ambiente da peste de inseto, por exemplo, WCR pode entrar em contato com, e/ou ser ligada à isca.
[0088] As composições e métodos descritos aqui podem ser usadas juntas em combinações com outros métodos e composições para controlar dano por pestes de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, uma molécula de iRNA como descrito aqui para proteger plantas de pestes de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada em um método compreendendo o uso adicional de um ou mais agentes químicos efetivos contra uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, biopesticidas efetivos contra uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, rotação de colheita, ou técnicas genéticas recombinantes que exibem aspectos diferentes dos aspectos dos métodos mediados por RNAi e composições de RNAi da invenção (por exemplo, produção recombinante de proteínas em plantas que são nocivas para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, toxinas Bt)). II. Abreviações dsRNA ácido ribonucleico de fita dupla Gl inibição de crescimento NCBI National Center for Biotechnology Information gDNA ácido deoxiribonucleico genômico iRNA ácido ribonucleico inibidor ORF estrutura de leitura aberta RNAi interferência de ácido ribonucleico miRNA ácido micro-ribonucleico shRNA ácido ribonucleico tipo grampo de cabelo pequeno siRNA ácido ribonucleico inibitório pequeno hpRNA ácido ribonucleico tipo grampo de cabelo UTR região não transladada WCR larva da raiz do milho ocidental (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) NCR larva da raiz do milho do norte (Diabroticabarberi Smith e Lawrence) MCR Larva da raiz do milho mexicano (Diabrotica virgifera zeae Krysan e Smith) PCR Reação de cadeia de polimerase RISC Complexo de Silenciamento induzido por RNA SCR Larva da raiz do milho do sul (Diabrotica undecimpunctatahowardi Barber) BSB Percevejo-fedorento Marrom Neotropical (Euschistus heros Fabricius) YFP Proteína fluorescente amarela SEM Erro padrão da média III. Termos [0089] Na descrição e tabelas que seguem, diversos termos são usados. A fim de fornecer um entendimento claro e consistente do relatório descritivo e reivindicações, incluindo o escopo a ser dado a tais termos, as seguintes definições são fornecidas: [0090] Peste de coleóptero: Como usado aqui, o termo "peste de coleóptero" refere-se a insetos do gênero Diabrotica, que se alimenta de milho e outras gramíneas verdadeiras. Em exemplos particulares, uma peste de coleóptero é selecionada da lista compreendendo D. v.virgifera LeConte (WCR); D. õanber/Smith e Lawrence (NCR); D. u. howardi (SCR); D. v. zeae (MCR); D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; e D. u. undecimpunctata Mannerheim.
[0091] Peste de hemíptero: Como usado aqui, o termo "peste de hemíptero" refere-se a insetos da ordem Hemípteros, incluindo, por exemplo, e sem limitação, insetos nas famílias Pentatomidae, Miridae, Pyrrhocoridae, Coreidae, Alydidae, e Rhopalidae, que se alimentam em uma ampla faixa de plantas hospedeiras e têm partes na boca de perfuração e sucção. Em exemplos particulares, uma peste de hemíptero é selecionada da lista compreendendo, Euschistus heros (Fabr.) (Percevejo-fedorento Marrom Neotropical), Nezara viridula (L.) (Percevejo-fedorento Verde do Sul), Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo-fedorento de Faixa Vermelha), Halyomorpha halys (Stâl) (Percevejo-fedorento Marmorizado Marrom), Chinavia hilare (Say) (Percevejo-fedorento Verde), Euschistus servus (Say) (Percevejo-fedorento Marrom), Dichelops melacanthus (Dallas), Dichelops furcatus (F.), Edessa meditabunda (F.), Thyanta perditor (F.) (Percevejo-fedorento de Ombro Vermelho Neotropical), Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois), Horcias nobilellus (Berg) (Percevejo do Algodão), Taedia stigmosa (Berg), Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville), Neomegalotomus parvus (Westwood), Leptoglossus zonatus (Dallas), Niesthrea sidae (F.), Lygus hesperus (Knight) (Percevejo de Planta Manchado Ocidental), e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).
[0092] Contato (com um organismo): Como usado aqui, o termo "contato com" ou "captação por" um organismo (por exemplo, uma peste de coleópteros e/ou hemípteros), com respeito a uma molécula de ácido nucleico, inclui internaiização da molécula de ácido nucleico no organismo, por exemplo, e sem limitação: ingestão da molécula pelo organismo (por exemplo, por alimentação); contatar o organismo com uma composição compreendendo a molécula de ácido nucleico; e embebimento de organismos com uma solução compreendendo a molécula de ácido nucleico.
[0093] Contig: Como usado aqui o termo "contig" refere-se a uma sequência de DNA que é reconstruída de um grupo de segmentos de DNA de sobreposição derivados de uma única fonte genética.
[0094] Planta de milho: Como usado aqui, o termo "planta de milho" refere-se a uma planta da espécie, Zea mays (milho).
[0095] Codificando um dsRNA: Como usado aqui, o termo "codificando um dsRNA" inclui um gene cujo produto de transcrição de RNA é capaz de formar uma estrutura de dsRNA intramolecular (por exemplo, um grampo de cabelo) ou estrutura de dsRNA intermolecular (por exemplo, hibridizando para uma molécula de RNA alvo).
[0096] Expressão: Como usado aqui, "expressão" de uma sequência de codificação (por exemplo, um gene ou um transgene) refere-se ao processo pelo qual a informação codificada de uma unidade transcricional de ácido nucleico (incluindo, por exemplo, DNA genômico ou cDNA) é convertida em uma parte operacional, não operacional, ou estrutural de uma célula, frequentemente incluindo a síntese de uma proteína. A expressão de gene pode ser influenciada por sinais externos; por exemplo, exposição de uma célula, tecido, ou organismo a um agente que aumenta ou diminui a expressão de gene. expressão de um gene pode também ser regulado em qualquer lugar na série de reação de DNA a RNA para proteína. Regulação de expressão de gene ocorre, por exemplo, por meio de controle agindo sobre a transcrição, translação, transporte de RNA e processamento, degradação de moléculas intermediárias, tal como mRNA, ou por meio da ativação, inativação, compartimentalização, ou degradação de moléculas de proteína específicas após elas terem sido preparadas, ou por combinações das mesmas. A expressão de gene pode ser medida no nível de RNA ou o nível de proteína por qualquer método conhecido na técnica, incluindo, sem limitação, manchamento do norte (RNA) RT-PCR, manchamento do oeste (imuno-) manchamento, ou ensaio(s) de atividade de proteína in vitro, in situ, ou in vivo.
[0097] Material genético: Como usado aqui, o termo "material genético" inclui todos os genes e moléculas de ácido nucleico, tal como DNA e RNA.
[0098] Inibição: Como usado aqui, o termo "inibição", quando usado para descrever um efeito sobre uma sequência de codificação (por exemplo, um gene), refere-se a um decréscimo mensurável no nível de celular de mRNA transcrito da sequência de codificação e/ou peptídeo, polipeptídeo, ou produto de proteína da sequência de codificação. Em alguns exemplos, expressão de uma sequência de codificação pode ser inibida de modo que a expressão seja aproximadamente eliminada. "Inibição específica" refere-se à inibição de uma sequência de codificação alvo sem consequentemente afetar a expressão de outras sequências de codificação (por exemplo, genes) na célula em que a inibição específica está sendo realizada.
[0099] Isolado: um componente biológico "isolado" (tal como um ácido nucleico ou proteína) foi substancialmente separado, produzido separado de, ou purificado longe de outros componentes biológicos na célula do organismo em que o componente ocorre naturalmente (isto é, outros DNA e RNA cromossômicos e extracromossômicos, e proteínas). Moléculas de ácido nucleico e proteínas que foram "isoladas" incluem moléculas de ácido nucleico e proteínas purificadas por métodos de purificação padrões. O termo também abrange ácidos nucleicos e proteínas preparados por expressão recombinante em uma célula hospedeira, bem como moléculas de ácido nucleico quimicamente sintetizadas, proteínas, e peptídeos.
[00100] Molécula de ácido nucleico: Como usado aqui, o termo "molécula de ácido nucleico" pode referir-se a uma forma polimérica de nucleotídeos, que pode incluir tanto fitas senso quanto antissenso de RNA, cDNA, DNA genômico, e formas sintéticas e polímeros mistos do acima mencionado. Um nucleotídeo pode referir-se a um ribonucleotídeo, deoxirribonucleotídeo, ou uma forma modificada de qualquer tipo de nucleotídeo. Uma "molécula de ácido nucleico" como usado aqui é sinônimo com "ácido nucleico" e "polinucleotídeo." Uma molécula de ácido nucleico é geralmente de pelo menos 10 bases de comprimento, a menos que de outro modo especificado. Por convenção, a sequência de nucleotídeo de uma molécula de ácido nucleico é lida da extremidade 5' à 3' da molécula. O "complemento" de uma sequência de nucleotídeo refere-se à sequência, de 5' a 3', das nucleobases que formam os pares de base com as nucleobases da sequência de nucleotídeo (isto é, A-T/U, e G-C). O "complemento reverso" de uma sequência de ácido nucleico refere-se à sequência, de 3' a 5', das nucleobases que formam pares de base com as nucleobases da sequência de nucleotídeo.
[00101] Algumas modalidades incluem ácidos nucleicos compreendendo um DNA padrão que é transcrito em uma molécula de RNA que é o complemento de uma molécula de mRNA. Nestas modalidades, o complemento do ácido nucleico transcrito na molécula de mRNA está presente na orientação 5’ a 3’, de modo que a RNA polimerase (que transcreve o DNA na direção 5’ a 3’) transcreva um ácido nucleico do complemento que pode hibridizar para a molécula de mRNA. A menos que explicitamente estabelecido de outro modo, ou esteja claro ser diferente do contexto, o termo "complemento", portanto, refere-se a um polinucleotídeo tendo nucleobases, de 5’ a 3’, que pode formar pares de base com as nucleobases de um ácido nucleico de referência. Similarmente, a menos que seja explicitamente estabelecido ser de outro modo (ou esteja claro ser diferente do contexto), o "complemento reverso" de um ácido nucleico refere-se ao complemento em orientação reversa. O anterior é demonstrado na seguinte ilustração: ATGATGATG polinucleotídeo TACTACTAC "complemento" do polinucleotídeo CATCATCAT "complemento reverso" do polinucleotídeo [00102] Algumas modalidades da invenção podem incluir moléculas RNAi formadoras de RNA tipo grampo de cabelo. Nestas moléculas de RNAi, tanto o complemento de um ácido nucleico a ser alvejado por interferência do RNA quanto o complemento reverso pode ser encontrado na mesma molécula, de modo que a molécula de RNA de fita simples possa "dobrar-se sobre" e hibridizar em si sobre a região compreendendo os polinucleotídeos complementares e complementares reversos, como demonstrado na seguinte ilustração: 5’ AUGAUGAUG -polinucleotídeo ligante - CAUCAUCAU 3’, que hibridiza para formar conforme Figura 3.
[00103] "Moléculas de ácido nucleico" incluem formas de fita simples e dupla de DNA; formas de fita simples de RNA; e formas de fita dupla de RNA (dsRNA). O termo "sequência de nucleotídeo" ou "sequência de ácido nucleico" refere-se a tanto às fitas senso quanto antissenso de um ácido nucleico como fitas simples individuais ou nas duplas. O termo "ácido ribonucleico" (RNA) é inclusive de iRNA (RNA inibitório), dsRNA (RNA de fita dupla), siRNA (RNA de pequena interferência), mRNA (RNA mensageiro), shRNA (RNA pequeno tipo grampo de cabelo), miRNA (micro-RNA), hpRNA (RNA tipo grampo de cabelo), tRNA (RNA de transferência, seja carregado ou descarregado com um correspondente aminoácido acilado), e cRNA (RNA complementar). O termo "ácido deoxirribonucleico" (DNA) é inclusive de cDNA, DNA genômico, e híbridos de DNA-RNA. Os termos "polinucleotídeo" e "ácido nucleico" e "fragmentos" dos mesmos, ou mais geralmente "segmento", será entendido por aqueles na técnica como um termo funcional que inclui ambas as sequências genômicas, sequências de RNA ribossômicas, sequências de RNA de transferência, sequências de RNA mensageiro, sequências de operon, e sequências de nucleotídeo construídas menores que codificam ou podem ser adaptadas para codificar, peptídeos, polipeptídeos, ou proteínas.
[00104] Oligonucleotídeo: um oligonucleotídeo é um polímero de ácido nucleico curto. Oligonucleotídeos podem ser formados por divagem de segmentos de ácido nucleico maiores, ou polimerizando precursores de nucleotídeo individual. Sintetizadores automatizados permitem a síntese de oligonucleotídeos até diversas centenas de bases de comprimento. Porque oligonucleotídeos podem ligar-se a uma sequência de nucleotídeo complementar, eles podem ser usados como sondas para detectar DNA ou RNA. Oligonucleotídeos compostos de DNA (oligodeoxiribonucleotídeos) podem ser usados em PCR, uma técnica para a amplificação de sequências de DNA e RNA (transcrita reversa em um cDNA). Em PCR, o oligonucleotídeo é tipicamente referido como um "iniciador", que permite uma DNA polimerase estender o oligonucleotídeo e replicar a fita complementar.
[00105] Uma molécula de ácido nucleico pode incluir qualquer ou ambos os nucleotídeos de ocorrência natural e modificados ligados entre si por ligações de nucleotídeo de ocorrência natural e/ou não natural. Moléculas de ácido nucleico podem ser modificadas quimicamente ou bioquimicamente, ou podem conter bases de nucleotídeo não naturais ou derivatizadas, como será facilmente apreciado por aqueles versados na técnica. Tais modificações incluem, por exemplo, rótulos, metilação, substituição de um ou mais dos nucleotídeos de ocorrência natural com um análogo, modificações internucleotídeo (por exemplo, ligações não carregadas: por exemplo, fosfonatos de metila, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc/, ligações carregadas: por exemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.; porções pendentes: por exemplo, peptídeos; intercaladores: por exemplo, acridina, psoraleno, etc/, quelantes; alquiladores; e ligações modificadas: por exemplo, ácidos nucleico alfa anoméricos, efc.). O termo "molécula de ácido nucleico" também inclui qualquer conformação topológica, incluindo conformações de fita simples, de fita dupla, parcialmente duplexada, triplexada, tipo grampo de cabelo, circular, e de cadeado.
[00106] Como usado aqui com respeito ao DNA, o termo "sequência de codificação", "sequência de nucleotídeo estrutural", ou "molécula de ácido nucleico estrutural" refere-se a uma sequência de nucleotídeo que é finalmente transladada para dentro de um polipeptídeo, por meio de transcrição e mRNA, quando colocado sob o controle de sequências regulatórias apropriadas. Com respeito ao RNA, o termo "polinucleotídeo de codificação" refere-se a um polinucleotídeo que é transladado em um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína. Os limites de uma sequência de codificação são determinados por um códon de partida de translação na terminação 5' e um códon de interrupção de translação na terminação 3'. Polinucleotídeos de codificação incluem, porém não estão limitados a: DNA genômico; cDNA; EST; e sequências de nucleotídeo recombinantes.
[00107] Como usado aqui, "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se a segmentos de moléculas de mRNA tal como segmentos de 5' UTR, 3' UTR e íntron que não são transladados para dentro de um peptídeo, polipeptídeo, ou proteína. Além disso, "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se a um ácido nucleico que é transcrito em um RNA que funciona na célula, por exemplo, RNAs estruturais (por exemplo, RNA ribossômico (rRNA) como exemplificado por 5S rRNA, 5.8S rRNA, 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, e 28S rRNA, e similares); RNA de transferência (tRNA); e snRNAs tal como U4, U5, U6, e similares. Polinucleotídeos de não codificação transcritos também incluem, por exemplo, e sem limitação, RNAs pequenos (sRNA), cujo termo é frequentemente usado para descrever RNAs de não codificação bacterianos pequenos; RNAs nucleolares pequenos (snoRNA); microRNAs; RNAs de interferência pequenos (siRNA); Piwi-interacting RNAs de interação com Piwi (piRNA); e RNAs de não codificação longos. Além disso, "polinucleotídeo de não codificação transcrito" refere-se a um polinucleotídeo que pode nativamente existir como um "ligante" intragênico em um ácido nucleico e que é transcrito em uma molécula de RNA.
[00108] Genoma: Como usado aqui, o termo "genoma" refere-se a DNA cromossômico dentro do núcleo de uma célula, e também refere-se a DNA de organela encontrado dentro de componentes subcelulares da célula. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma célula vegetal de modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma de uma célula vegetal. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser ou integrada no DNA nuclear de uma célula vegetal, ou integrada no DNA do cloroplasto ou mitocôndrion de uma célula vegetal. O termo "genoma" quando ele se aplica à bactéria, refere-se a ambos, o cromossoma e plasmídeos dentro da célula bacteriana. Em algumas modalidades da invenção, uma molécula de DNA pode ser introduzida em uma bactéria, de modo que a molécula de DNA seja integrada no genoma da bactéria. Nestas e outras modalidades, a molécula de DNA pode ser ou cromossomicamente integrada ou localizada como ou em um plasmídeo estável.
[00109] Identidade de sequência: o termo "identidade de sequência" ou "identidade", como usado aqui no contexto de duas sequências de ácido nucleico ou polipeptídeo, refere-se aos resíduos nas duas sequências que são iguais quando alinhadas para correspondência máxima em uma janela de comparação especificada.
[00110] Como usado aqui, o termo "percentagem de identidade de sequência" pode referir-se ao valor determinado comparando duas sequências idealmente alinhadas (por exemplo, sequências de ácido nucleico ou sequências de polipeptídeo) em uma janela de comparação, em que a porção da sequência na janela de comparação pode compreender adições e deleções (isto é, intervalos) quando comparado com a sequência de referência (que não compreende adições ou deleções) para alinhamento ideal das duas sequências. A percentagem é calculada determinando-se o número de posições nas quais o nucleotídeo idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para produzir o número de posições pareadas, dividindo o número de posições pareadas pelo número total de posições na janela de comparação, e multiplicando o resultado por 100 para produzir a percentagem de identidade de sequência. Uma sequência que é idêntica em toda posição em comparação com uma sequência de referência é dita ser 100% idêntica à sequência de referência, e vice-versa.
[00111] Métodos para alinhar sequências para comparação são conhecidos na técnica. Vários programas e algoritmos de alinhamento são descritos, por exemplo, em: Smith e Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman e Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443; Pearson e Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:2444; Higgins e Sharp (1988) Gene 73:237-244; Higgins e Sharp (1989) CABIOS 5:151-153; Corpet et aí. (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881-10890; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155-165; Pearson et aí. (1994) Methods Mol. Biol. 24:307-331; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247-250. Uma consideração detalhada de métodos de alinhamento de sequência e cálculos de homologia pode ser encontrada, por exemplo, em Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410.
[00112] The National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST™; Altschul et al. (1990)) está disponível de diversas fontes, incluindo o National Center for Biotechnology Information (Bethesda, MD), e na Internet, para uso em conexão com diversos programas de análise de sequência. Uma descrição de como determinar a identidade de sequência usando este programa está disponível na internet sob a seção "ajuda" para BLAST™. Para comparações de sequências de ácido nucleico, a função "sequências Blast 2" do programa BLAST™ (Blastn) pode ser empregada usando o conjunto matriz BLOSUM62 padrão para parâmetros padrão. Sequências de ácido nucleico com similaridade ainda maior com as sequências de referência mostrarão identidade de percentagem crescente quando avaliadas por este método.
[00113] Especificamente hibridizável/Especificamente complementar: Como usado aqui, os termos "Especificamente hibridizável" e "Especificamente complementar" são termos que indicam um grau suficiente de complementaridade, de modo que a ligação estável e específica ocorra entre a molécula de ácido nucleico e uma molécula de ácido nucleico alvo. A hibridização entre duas moléculas de ácido nucleico envolve a formação de um alinhamento anti-paralelo entre as sequências de ácido nucleico das duas moléculas de ácido nucleico. As duas moléculas são então capazes de formar ligações de hidrogênio com bases correspondentes na fita oposta para formar uma molécula duplex que, se for suficientemente estável, é detectável usando métodos bem conhecidos na técnica. Uma molécula de ácido nucleico necessita não ser 100% complementar a sua sequência alvo a ser especificamente hibridizável. Entretanto, a quantidade de complementaridade de sequência que deve existir para hibridização a ser específica é uma função das condições de hibridização usadas.
[00114] As condições de hibridização que resultam em graus particulares de gravidade variarão dependendo da natureza do método de hibridização de escolha e a composição e comprimento das sequências de ácido nucleico de hibridização. Geralmente, a temperatura de hibridização e a força iônica (especialmente a concentração de Na+ e/ou Mg++) da hibridização determinará a gravidade de hibridização. A força iônica do tampão de lavagem e a temperatura de lavagem também influenciam a gravidade. Cálculos considerando as condições de hibridização requeridas para alcançar graus particulares de gravidade são conhecidos por aqueles versados na técnica, e são descritos, por exemplo, em Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloninq: A Laboratorv Manual. 2a. ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, capítulos 9 e 11, e atualizações; e Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hvbridization. IRL Press, Oxford, 1985. Outra instrução detalhada e orientação com respeito à hibridização e ácidos nucleicos pode ser encontrada, por exemplo, em Tijssen, "OverView of principies of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays," em Laboratorv Techniaues in Biochemistrv and Molecular Bioloav-Hvbridization with Nucleic Acid Probes. Parte I, Capítulo 2, Elsevier, NY, 1993; e Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Bioloav. Capítulo 2, Greene Publishing and Wiley-lnterscience, NY, 1995, e atualizações.
[00115] Como usado aqui, "condições rigorosas" abrangem condições sob as quais a hibridização ocorrerá apenas se existir mais do que 80% de comparação de sequência entre a molécula de hibridização e uma sequência homóloga dentro da molécula de ácido nucleico alvo. "Condições rigorosas" incluem ainda níveis particulares de gravidade. Desse modo, como usado aqui, condições de "gravidade moderada" são aquelas sob as quais moléculas com mais de 80% de compatibilidade de sequência (isto é, tendo menos do que 20% de incompatibilidade) hibridizarão; condições de "alta gravidade" são aquelas sob as quais sequências com mais de 90% de compatibilidade (isto é, tendo menos do que 10% de incompatibilidade) hibridizarão; e condições de "gravidade muito elevada" são aquelas sob as quais sequências com mais de 95% de compatibilidade (isto é, tendo menos do que 5% de incompatibilidade) hibridizarão.
[00116] As seguintes são condições de hibridização não limitantes, representativas.
[00117] Condição de alta gravidade (detecta sequências que compartilham pelo menos 90% de identidade de sequência): Hibridização em tampão de 5x SSC a 65Ό durante 16 horas; lavagem duas vezes em tampão de 2x SSC em temperatura ambiente durante 15 minutos cada; e lavagem duas vezes em tampão de 0,5x SSC a 65Ό durante 20 minutos cada.
[00118] Condição de gravidade moderada (detecta sequências que compartilham pelo menos 80% de identidade de sequência): Hibridização em tampão de 5x-6x SSC a 65-70Ό durante 16 a 20 horas; lavagem duas vezes em tampão de 2x SSC em temperatura ambiente durante 5 a 20 minutos cada; e lavagem duas vezes em tampão de 1x SSC a 55-70Ό durante 30 minutos cada.
[00119] Condição de controle não grave (sequências que compartilham pelo menos 50% de identidade de sequência hibridizarão): Hibridização em tampão de 6x SSC em temperatura ambiente até 55Ό durante 16 a 20 horas; lavar pelo menos duas vezes em tampão de 2x-3x SSC em temperatura ambiente até 55Ό durante 20 a 30 minutos cada.
[00120] Como usado aqui, o termo "substancialmente homólogo" ou "homologia substancial", com respeito a uma sequência de ácido nucleico contíguo, refere-se a sequências de nucleotídeo contíguo que são transmitidas por moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições graves para uma molécula de ácido nucleico tendo a sequência de ácido nucleico de referência. Por exemplo, moléculas de ácido nucleico tendo sequências que são substancialmente homólogas a uma sequência de ácido nucleico de referência de SEQ ID NO:1 são aquelas moléculas de ácido nucleico que hibridizam sob condições de gravidade (por exemplo, as condições de gravidade moderada mencionadas, supra) para moléculas de ácido nucleico tendo a sequência de ácido nucleico de referência de SEQ ID NO:1. Sequências substancialmente homólogas podem ter pelo menos 80% de identidade de sequência. Por exemplo, sequências substancialmente homólogas podem ter de cerca de 80% a 100% de identidade de sequência, tal como cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98.5%; cerca de 99%; cerca de 99.5%; e cerca de 100%. A propriedade de homologia substancial está intimamente relacionada à hibridização específica. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico é especificamente hibridizável quando existir um grau suficiente de complementaridade para evitar ligação não específica do ácido nucleico a sequências não alvo sob condições onde ligação específica é desejada, por exemplo, sob condições de hibridização grave.
[00121] Como usado aqui, o termo "ortólogo" refere-se a um gene em duas ou mais espécies que evoluíram de uma sequência de nucleotídeo ancestral comum, e pode reter a mesma função nas duas ou mais espécies.
[00122] Como usado aqui, duas moléculas de sequência de ácido nucleico são ditas exibir "complementaridade completa" quando todo nucleotídeo de uma sequência lida na direção 5' a 3' é complementar a todo nucleotídeo da outra sequência quando lida na direção 3' a 5'. Uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma sequência de nucleotídeo de referência exibirá uma sequência idêntica à sequência complementar reversa da sequência de nucleotídeo de referência. Estes termos e descrições são bem definidos na técnica e são facilmente entendidos por aqueles versados na técnica.
[00123] Operavelmente ligada: uma primeira sequência de nucleotídeo é operavelmente ligada com uma segunda sequência de ácido nucleico quando a primeira sequência de ácido nucleico está em uma ligação funcional com a segunda sequência de ácido nucleico. Quando recombinantemente produzidas, sequências de ácido nucleico operavelmente ligadas são geralmente contíguas, e, onde necessário, duas regiões de codificação de proteína podem ser ligadas no mesma estrutura de leitura (por exemplo, em uma ORF translacionalmente fundidas). Entretanto, ácidos nucleicos não necessitam ser contíguos para ser operavelmente ligados.
[00124] O termo, "operavelmente ligada", quando usado em referência a uma sequência regulatória e uma sequência de codificação, significa que a sequência regulatória afeta a expressão da sequência de codificação ligada. "Sequências regulatórias", ou "elementos de controle", referem-se a sequências de nucleotídeo que influenciam o tempo e nível/quantidade de transcrição, Processamento ou estabilidade de RNA, ou translação da sequência de codificação associada. Sequências regulatórias podem incluir promotores; sequências líder de translação; íntrons; realçadores; estruturas tronco-alça; sequências de ligação repressoras; sequências de terminação; sequências de reconhecimento de poliadenilação; etc. Sequências regulatórias particulares podem ser localizadas a montante e/ou a jusante de uma sequência de codificação operavelmente ligada a elas. Além disso, sequências regulatórias particulares operavelmente ligada a uma sequência de codificação podem ser localizadas sobre a fita complementar associada de uma molécula de ácido nucleico de fita dupla.
[00125] Promotor: Como usado aqui, o termo "promotor" refere-se a uma região de DNA que pode estar a montante do início de transcrição, e que pode ser envolvido em reconhecimento e ligação de RNA polimerase e outras proteínas para iniciar a transcrição. Um promotor pode ser operavelmente ligado a uma sequência de codificação para expressão em uma célula, ou um promotor pode ser operavelmente ligado a uma sequência de nucleotídeo codificando uma sequência sinal que pode ser operavelmente ligada a uma sequência de codificação para expressão em uma célula. Um "promotor de planta" pode ser um promotor capaz de iniciar transcrição em células vegetais. Exemplos de promotores sob controle desenvolví mental incluem promotores que preferencialmente iniciam a transcrição em determinados tecidos, tal como folhas, raízes, sementes, fibras, vasos do xilema, traqueídeos, ou esclerênquima. Tais promotores são referidos como "preferidos do tecido". Promotores que iniciam a transcrição apenas em determinados tecidos são referidos como "específicos do tecido". Um promotor "específico do tipo celular impulsiona principal mente a expressão em determinados tipos celulares em um ou mais órgãos, por exemplo, células vasculares em raízes ou folhas. Um promotor "induzível" pode ser um promotor que pode estar sob controle ambiental. Exemplos de condições ambientais que podem iniciar a transcrição por promotores induzíveis incluem condições anaeróbicas e a presença de luz. Promotores Específicos do tecido, preferidos do tecido, específicos do tipo celular, e induzíveis constituem a classe de promotores "não constitutivos". Um promotor "constitutivo" é um promotor que pode ser ativo sob a maioria das condições ambientais ou na maioria dos tipos de tecido ou celulares.
[00126] Qualquer promotor induzível pode ser usado em algumas modalidades da invenção. Veja Ward et ai (1993) Plant Mol. Biol. 22:361-366. Com um promotor induzível, a taxa de transcrição aumenta em resposta a um agente de indução. Promotores induzíveis exemplares incluem, porém não estão limitados a: promotores do sistema ACEI que responde ao cobre; gene In2 de milho que responde aos protetores herbicidas de benzenossulfonamida; Repressor Tet de Tn10; e o promotor induzível de um gene de hormônio esteroide, a atividade transcricional do qual pode ser induzida por um hormônio glicocorticosteroide (Schena et ai (1991) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10421-10425).
[00127] Promotores constitutivos exemplares incluem, porém não estão limitados a: Promotores de viroses de planta, tal como o promotor 35S do Vírus Mosaico da Couve-flor (CaMV); promotores de genes de actina do arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de histona de milho H3; e o promotor ALS, Xba1/Ncol fragmento 5' para o gene estrutural Brassica napus ALS3 (ou uma sequência de nucleotídeo similar ao referido fragmento de Xba1/Ncol) (Patente dos Estados Unidos No. 5.659.026).
[00128] Adicionalmente, qualquer promotor específico do tecido ou preferido do tecido pode ser utilizado em algumas modalidades da invenção. Plantas transformadas com uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de codificação operavelmente ligada a um promotor específico do tecido podem produzir o produto da sequência de codificação exclusivamente, ou preferencialmente, em um tecido específico. Promotores exemplares específicos do tecido ou preferidos do tecido incluem, porém não estão limitados a: um promotor preferido da semente, tal como aquele do gene faseolina; um promotor específico da filha e induzido por luz, tal como aquele de cab ou rubisco; um promotor específico de antera, tal como aquele de LAT52-, um promotor específico de pólen, tal como aquele de Zm13; e um promotor preferido de microsporo, tal como aquele de apg.
[00129] Planta de Soja: Como usado aqui, o termo "planta de soja" refere-se a uma planta da espécie Glycina; por exemplo, Glycine max.
[00130] Transformação: Como usado aqui, o termo "transformação" ou "transdução" refere-se à transferência de uma ou mais molécula(s) de ácido nucleico em uma célula. Uma célula é "transformada" por uma molécula de ácido nucleico transduzida na célula quando a molécula de ácido nucleico torna-se estavelmente replicada pela célula, ou por incorporação da molécula de ácido nucleico no genoma celular, ou por replicação epissômica. Como usado aqui, o termo "transformação" abrange todas as técnicas pelas quais uma molécula de ácido nucleico pode ser introduzida em tal célula. Exemplos incluem, porém não estão limitados a: transfecção com vetores virais; transformação com vetores de plasmídeo; eletroporação (Fromm et al. (1986) Nature 319:791-793); lipofecção (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7417); microinjeção (Mueller et ai (1978) Cell 15:579-585); Transferência mediada por agrobactéria (Fraley et ai (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-4807); captação direta de DNA; e bombardeio por microprojetil (Klein et ai (1987) Nature 327:70).
[00131] Transgene: uma sequência de ácido nucleico exógena. Em alguns exemplos, um transgene pode ser uma sequência que codifica um ou ambas as fitas de uma molécula de dsRNA que compreende uma sequência de nucleotídeo que é complementar a uma molécula de ácido nucleico encontrada em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. Em outros exemplos, um transgene pode ser uma sequência de ácido nucleico antissentido, em que a expressão da sequência de ácido nucleico antissentido inibe a expressão de uma sequência de ácido nucleico alvo. Em ainda outros exemplos, um transgene pode ser uma sequência de gene (por exemplo, um gene de resistência ao herbicida), um gene codificando um composto industrialmente ou farmaceuticamente útil, ou um gene codificando uma característica agrícola desejável. Nestes e outros exemplos, um transgene pode conter sequências regulatórias operavelmente ligadas a uma sequência de codificação do transgene (por exemplo, um promotor).
[00132] Vetor: uma molécula de ácido nucleico quando introduzida em uma célula, por exemplo, para produzir uma célula transformada. Um vetor pode incluir sequências de ácido nucleico que o permitem replicar-se na célula hospedeira, tal como uma origem de replicação. Exemplos de vetores incluem, porém não estão limitados a: um plasmídeo; cosmídeo; bacteriófago; ou vírus que transporta DNA exógeno em uma célula. Um vector pode também ser uma molécula de RNA. Um vetor pode também incluir um ou mais genes, sequências antissentido, e/ou genes marcadores selecionáveis e outros elementos genéticos conhecidos na técnica. Um vetor pode transduzir, transformar, ou infectar uma célula, desse modo causando a célula expressar as moléculas de ácido nucleico e/ou proteínas codificadas pelo vetor. Um vetor opcional mente inclui materiais para ajudar na obtenção da entrada da molécula de ácido nucleico na célula (por exemplo, uma lipossoma, revestimento da proteína, etc.).
[00133] Produção: uma produção estabilizada de cerca de 100% ou mais com relação à produção de variedades de checagem na mesma localização de crescimento ao mesmo tempo e sob as mesmas condições. Em modalidades particulares, "produção melhorada" ou "melhorando a produção" significa um cultivar tendo uma produção estabilizada de 105% a 115% ou maior, com relação à produção de variedades de checagem na mesma localização de crescimento contendo densidades significantes de pestes de coleópteros e/ou hemípteros que são nocivos àquela colheita crescendo ao mesmo tempo e sob as mesmas condições.
[00134] A menos que especificamente indicado ou implicado, os termos "um, uma, uns, umas (a)", "um, uma, uns, umas (an)", e "o, a, os, as (the)" significam "pelo menos um" como usado aqui.
[00135] A menos que de outro modo especificamente explicado, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado como comumente entendido por aqueles versados na técnica à qual esta invenção pertence. Definições de termos comuns em biologia molecular podem ser encontradas, por exemplo, em Lewin’s Genes X. Jones & Bartlett Publishers, 2009 (ISBN 10 0763766321); Krebs et ai (eds.), o Encvclopedia of Molecular Bioloav. Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); e Meyers R.A. (ed.), Molecular Bioloav e Biotechnoloav: A Comprehensive Desk Reference. VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8). Todas as percentagens são em peso e todas as proporções de mistura de solvente são em volume, a menos que mencionado de outro modo. Todas as temperaturas são em graus Celsius. IV. Moléculas de Ácido Nucleico Compreendendo uma Sequência de Peste de Coleópteros e/ou Hemípteros A. Visão Geral [00136] São descritas aqui moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros. Moléculas de ácido nucleico descritas incluem sequências alvo (por exemplo, genes nativos, e sequências de não codificação), dsRNAs, siRNAs, hpRNAs, shRNA, e miRNAs. Por exemplo, moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA são descritas em algumas modalidades que podem ser especificamente complementares ao todo ou parte de uma ou mais sequências de ácido nucleico nativas em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. Nestas e outras modalidades, a(s) sequência(s) de ácido nucleico nativa(s) podem ser um ou mais gene(s) alvo, o produto do qual pode ser, por exemplo, e sem limitação: envolvido em um processo metabólico; envolvido em um processo reprodutivo; ou envolvido em desenvolvimento larval/ninfa. Moléculas de ácido nucleico descritas aqui, quando introduzidas em uma célula compreendendo pelo menos uma sequência de ácido nucleico nativa, à qual as moléculas de ácido nucleico são especificamente complementares, podem iniciar RNAi na célula, e consequentemente reduzir ou eliminar a expressão da(s) sequência(s) de ácido nucleico nativa(s). Em alguns exemplos, redução ou eliminação da expressão de um gene alvo por uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência especificamente complementar a ela pode ser letal em pestes de coleópteros e/ou hemípteros, ou resultar em crescimento e/ou reprodução reduzido(s).
[00137] Em algumas modalidades, pelo menos um gene alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero pode ser selecionado, em que o gene alvo compreende uma sequência de nucleotídeo compreendendo rpL40 (SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89). Em exemplos particulares, um gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros é selecionado, em que o gene alvo compreende uma nova sequência de nucleotídeo compreendendo rpL40 ( SEQ ID NOs: 1,3, 5, ou 89).
[00138] Em algumas modalidades, um gene alvo pode ser uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85% idêntica (por exemplo, cerca de 90%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica) à sequência de aminoácido de um produto de proteína de rpL40 ( SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89). Um gene alvo pode ser qualquer sequência de ácido nucleico em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero, a inibição pós-translacional da qual tem um efeito prejudicial sobre a peste de coleópteros e/ou hemípteros, ou fornece um benefício protetor contra a peste de coleópteros e/ou hemípteros para a planta. Em exemplos particulares, um gene alvo é uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica um polipeptídeo compreendendo um sequência de aminoácido contígua que é pelo menos 85% idêntica, cerca de 90% idêntica, cerca de 95% idêntica, cerca de 96% idêntica, cerca de 97% idêntica, cerca de 98% idêntica, cerca de 99% idêntica, cerca de 100% idêntica, ou 100% idêntica à sequência de aminoácido de um produto de proteína de nova sequência de nucleotídeo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89.
[00139] São fornecidas de acordo com a invenção sequências de nucleotídeo, a expressão das quais resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar ao todo ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por uma sequência de codificação em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. Em algumas modalidades, após ingestão da molécula de RNA expressa por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, sub-regulação da sequência de codificação em células da peste de coleópteros e/ou hemípteros pode ser obtida. Em modalidades particulares, sub-regulação da sequência de codificação em células da peste de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar em um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação, e/ou reprodução da peste de coleópteros e/ou hemípteros.
[00140] Em algumas modalidades, sequências alvo incluem sequências de RNA de não codificação transcritas, tal como 5'UTRs; 3'UTRs; sequências líder emendadas; sequências íntron; sequências íntron (por exemplo, 5'UTR RNA subsequentemente modificadas em trans emenda); sequências donatron (por exemplo, RNA de não codificação requerido para fornecer sequências doadoras para trans emenda); e outro RNA transcrito de não codificação de peste alvo de genes de coleópteros e/ou hemípteros. Tais sequências podem ser derivadas de ambos os genes monocistrônicos e policistrônicos.
[00141] Desse modo, são também descritas aqui moléculas de iRNA em conexão com algumas modalidades (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar ao todo ou parte de uma sequência alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. Em algumas modalidades uma molécula de iRNA pode compreender sequência(s) de nucleotídeo que são complementares a todo ou parte de uma pluralidade de sequências alvo; por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, ou mais sequências alvo. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA pode ser produzida in vitro, ou in vivo por um organismo geneticamente modificado, tal como uma planta ou bactéria. São também descritas sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de shRNA, moléculas de miRNA e/ou moléculas de hpRNA que são especificamente complementares a toda ou parte de uma sequência alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. São também descritos constructos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares. Alvos hospedeiros transformados podem expressar níveis efetivos de moléculas de dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e/ou hpRNA dos constructos de DNA recombinante. Portanto, é também descrito um vetor de transformação de planta compreendendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo operavelmente ligada a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal, em que expressão da(s) sequência(s) de nucleotide resulta em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero.
[00142] Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico úteis para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros podem incluir: toda ou parte de uma sequência nativa de ácido nucleico isolada de Diabrotica ou um hemíptero compreendendo rpL40 ( SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89); sequências de nucleotídeo que quando expressas resultam em uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma molécula de RNA nativa que é codificada por rpL40 ( SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89); moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNAs, siRNAs, shRNA, miRNAs e hpRNAs) que compreendem pelo menos uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar ao todo ou parte de rpL40 ( SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89); sequências de cDNA que podem ser usadas para a produção de moléculas de dsRNA, moléculas de siRNA, moléculas de shRNA, moléculas de miRNA e/ou hpRNA que são especificamente complementares ao todo ou parte de rpL40 (S SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89); e constructos de DNA recombinante para uso na obtenção de transformação estável de alvos hospedeiros particulares, em que um alvo hospedeiro transformado compreende uma ou mais das moléculas acima citadas de ácido nucleico. B. Moléculas de ácido nucleico [00143] A presente invenção fornece, entre outras coisas, moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA e hpRNA) que inibem expressão de gene alvo em uma célula, tecido, ou órgão de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros; e moléculas de DNA capazes de ser expressas como uma molécula de iRNA em uma célula ou micro-organismo para inibir expressão de gene alvo em uma célula, tecido, ou órgão de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros.
[00144] Algumas modalidades da invenção fornecem uma molécula de ácido nucleico isolado compreendendo pelo menos uma (por exemplo, um, dois, três, ou mais) sequência(s) de nucleotídeo selecionada(s) do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; SEQ ID NO:89; o complemento de SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos (por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 ou mais nucleotídeos contíguos) de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; uma sequência de codificação nativa de um organismo de coleóptero ou hemíptero (por exemplo, WCR e BSB) compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo de coleótero ou hemíptero compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; uma sequência de não codificação nativa de um organismo de coleótero ou hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo de coleótero ou hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo de coleótero ou hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo de coleótero ou hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo o todo ou parte de qualquer de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo de coleótero ou hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo de coleótero ou hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89. Em modalidades particulares, contato com ou captação por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros da sequência de ácido nucleico isolado inibe o crescimento, desenvolvimento, reprodução e/ou alimentação da peste de coleópteros e/ou hemípteros.
[00145] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender pelo menos uma(s) (por exemplo, um, dois, três, ou mais) sequência(s) de DNA capaz(es) de ser(em) expressa(s) como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão de gene alvo em uma célula, tecido, ou órgão de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Tal(is) sequência(s) de DNA podem ser operavelmente ligadas a uma sequência promotora que funciona em uma célula compreendendo a molécula de DNA para iniciar ou realçar a transcrição do RNA codificado capaz de formar uma molécula de dsRNA. Em uma modalidade, a pelo menos uma (por exemplo, uma, dois, três, ou mais) sequências de DNA podem ser derivadas de um polinucleotídeo selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 1, 3, 5, e 89. Derivados de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89 incluem fragmentos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89. Em algumas modalidades, tal fragmento pode compreender, por exemplo, pelo menos cerca de 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, ou um complemento das mesmas. Desse modo, tal fragmento pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, ou um complemento das mesmas. Nestas e outras modalidades, tal fragmento pode compreender, por exemplo, mais do que cerca de 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, ou um complemento das mesmas. Desse modo, um fragmento de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89 pode compreender, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, cerca de 25, (por exemplo, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, e 29), cerca de 30, cerca de 40, (por exemplo, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, e 45), cerca de 50, cerca de 60, cerca de 70, cerca de 80, cerca de 90, cerca de 100, cerca de 110, cerca de 120, cerca de 130, cerca de 140, cerca de 150, cerca de 160, cerca de 170, cerca de 180, cerca de 190, cerca de 200 ou mais nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1,3,5, ou 89, ou um complemento das mesmas.
[00146] Algumas modalidades compreendem introduzir moléculas de dsRNA parcial- ou totalmente estabilizadas em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros para inibir expressão de um gene alvo em uma célula, tecido, ou órgão da peste de coleópteros e/ou hemípteros. Quando expressas como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) e apreendidas por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, sequências de ácido nucleico compreendendo um ou mais fragmentos de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89 podem causar um ou mais dentre morte, inibição de crescimento, mudança em relação de sexo, redução em tamanho de ninhada, cessação de infecção, e/ou cessação de alimentação por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo incluindo cerca de 15 a cerca de 300 ou cerca de 19 a cerca de 300 nucleotídeos que são substancialmente homólogos a uma sequência alvo de gene de peste de coleópteros e/ou hemípteros e compreendendo um ou mais fragmentos de uma sequência de nucleotídeo compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89 é fornecida. Expressão de tal molécula de dsRNA pode, por exemplo, levar à mortalidade e/ou inibição de crescimento em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero que apreende a molécula de dsRNA.
[00147] Em determinadas modalidades, moléculas de dsRNA fornecidas pela invenção compreendem sequências de nucleotídeo complementares a um gene alvo compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89 e/ou sequências de nucleotídeo complementares a um fragmento de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, a inibição de cujo gene alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero resulta na redução ou remoção de um agente de sequência de proteína ou nucleotídeo que é essencial para o crescimento, desenvolvimento, ou outra função biológica de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Uma sequência de nucleotídeo selecionada pode exibir de cerca de 80% a cerca de 100% de identidade de sequência para as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeo mencionada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, ou o complemento de qualquer das anteriormente mencionadas. Por exemplo, uma sequência de nucleotídeo selecionada pode exibir cerca de 81%; cerca de 82%; cerca de 83%; cerca de 84%; cerca de 85%; cerca de 86%; cerca de 87%; cerca de 88%; cerca de 89%; cerca de 90%; cerca de 91%; cerca de 92%; cerca de 93%; cerca de 94% cerca de 95%; cerca de 96%; cerca de 97%; cerca de 98%; cerca de 98.5%; cerca de 99%; cerca de 99.5%; ou cerca de 100% de identidade de sequência para as SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, um fragmento contíguo da sequência de nucleotídeo mencionada nas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, ou o complemento de qualquer das anteriormente mencionadas.
[00148] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo(s) selecionado(s) do grupo que consiste em: SEQ ID NO:98; o complemento de SEQ ID NO:98; SEQ ID NO:99; o complemento de SEQ ID NO:99; SEQ ID NO:100; o complemento de SEQ ID NO: 100; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 98-100 (por exemplo, SEQ ID NOs: 101-107); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 98-100; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 101-107; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 101-107; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 101-107; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 101-107.
[00149] Em outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção pode compreender pelo menos um (por exemplo, um, dois, três, ou mais) polinucleotídeo(s) selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO:108; o complemento de SEQ ID NO:108; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 108 (por exemplo, SEQ ID NOs: 109-110); o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO: 108; um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero (por exemplo, BSB) compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 109-110; o complemento de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 109-110; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 109-110; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de um polinucleotídeo de codificação nativo de um organismo hemíptero compreendendo qualquer de SEQ ID NOs: 109-110.
[00150] Em algumas modalidades, uma molécula de DNA capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA em uma célula ou microorganismo para inibir a expressão de gene alvo pode compreender uma sequência de único nucleotídeo que é especificamente complementar a toda ou parte de uma sequência nativa de ácido nucleico encontrada em uma ou mais espécies de peste de coleópteros e/ou hemípteros alvo, ou a molécula de DNA pode ser construída como uma quimera de uma pluralidade de tais sequências especificamente complementares.
[00151] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode compreender uma primeira e uma segunda sequência de nucleotídeo separada por uma "sequência espaçadora". Uma sequência espaçadora pode ser uma região compreendendo qualquer sequência de nucleotídeos que facilita a formação de estrutura secundária entre a primeira e segunda sequências de nucleotídeo, onde isto é desejado. Em uma modalidade, a sequência espaçadora é parte de uma sequência de codificação senso ou antissenso para mRNA. A sequência espaçadora pode alternativamente compreender qualquer combinação de nucleotídeos ou homólogos dos mesmos, que são capazes de ser covalentemente ligadas a uma molécula de ácido nucleico.
[00152] Por exemplo, em algumas modalidades, a molécula de DNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo codificando para uma ou mais diferentes moléculas de RNA, em que cada uma das diferentes moléculas de RNA compreende uma primeira sequência de nucleotídeo e uma segunda sequência de nucleotídeo, em que a primeira e segunda sequências de nucleotídeo são complementares uma à outra. A primeira e segunda sequências de nucleotídeo podem ser conectadas em uma molécula de RNA por uma sequência espaçadora. A sequência espaçadora pode constituir parte da primeira sequência de nucleotídeo ou a segunda sequência de nucleotídeo. A expressão de uma molécula de RNA compreendendo a primeira e segunda sequências de nucleotídeo pode levar à formação de uma molécula de dsRNA da presente invenção, por pareamento de base específica da primeira e segunda sequências de nucleotídeo. A primeira sequência de nucleotídeo ou a segunda sequência de nucleotídeo pode ser substancialmente idêntica a uma sequência de ácido nucleico nativo para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um gene alvo, ou sequência de não codificação transcrita), um derivado da mesma, ou uma sequência complementar a ela.
[00153] Moléculas de ácido nucleico de dsRNA compreendem fitas duplas de sequências de ribonucleotídeo polimerizadas, e podem incluir modificações a ou a estrutura principal fosfato-açúcar ou o núcleos ideo. Modificações em estrutura de RNA podem ser adaptadas para permitir inibição específica. Em uma modalidade, moléculas de dsRNA podem ser modificadas por meio de um processo enzimático ubíquo de modo que as moléculas de siRNA possam ser geradas. Este processo enzimático pode utilizar uma enzima RNAse III, tal como DICER em eucariotas, in vitro ou in vivo. Veja Elbashir et al. (2001) Nature 411:494-498; e Hamilton e Baulcombe (1999) Science 286(5441):950-952. DICER ou enzimas de RNAse III funcionalmente equivalentes clivam fitas de dsRNA maiores e/ou moléculas de hpRNA em oligonucleotídeos menores (por exemplo, siRNAs), cada uma das quais é de cerca de 19 a 25 nucleotídeos de comprimento. As moléculas de siRNA produzidas por estas enzimas têm 2 a 3 projeções de nucleotídeo 3', e terminações de fosfato 5' e hidroxila 3'. As moléculas de siRNA geradas por enzimas RN Ase III são desenroladas e separadas em RNA de fita simples na célula. As moléculas de siRNA então hibridizam especificamente com sequências de RNA transcritas de um gene alvo, e ambas as moléculas de RNA são subsequentemente degradadas por um mecanismo e degradação de RNA celular inerente. Este processo pode resultar na degradação efetiva ou remoção da sequência de RNA codificada pelo gene alvo no organismo alvo. O resultado é o silenciamento pós-transcricional do gene alvejado. Em algumas modalidades, moléculas de siRNA produzidas por enzimas RNAse III endógenas de moléculas de ácido nucleico heterólogas podem eficientemente mediar a sub-regulação de genes alvo em pestes de coleópteros e/ou hemípteros.
[00154] Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode incluir pelo menos uma sequência de nucleotídeo de ocorrência não natural que pode ser transcrita em uma molécula de RNA de fita simples capaz de formar uma molécula de dsRNA in vivo por meio de hibridização intermolecular. Tais sequências de dsRNA tipicamente se auto-agrupam, e podem ser fornecidasna fonte de nutrição de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros para obter a inibição pós-translacional de um gene alvo. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico da invenção pode compreender duas diferentes sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural, cada uma das quais é especificamente complementar a um diferente gene alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. Quando tal molécula de ácido nucleico é fornecida como uma molécula de dsRNA para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, a molécula de dsRNA inibe a expressão de pelo menos dois genes alvo diferentes em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. C. Obtenção de moléculas de ácido nucleico [00155] Uma variedade de sequências nativas em pestes de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada como sequências alvo para o projeto de moléculas de ácido nucleico da invenção, tal como iRNAs e moléculas de DNA codificando iRNAs. Seleção de sequências nativas não é, entretanto, um processo direto. Apenas um pequeno número de sequências nativas em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros serão alvos efetivos. Por exemplo, não pode ser predito com certeza se uma sequência nativa particular pode ser efetivamente sub-regulada por moléculas de ácido nucleico da invenção, ou se sub-regulação de uma sequência nativa particular terá um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação, e/ou reprodução da peste de coleópteros e/ou hemípteros. A vasta maioria de peste nativa de sequências de coleópteros e/ou hemípteros, tal como ESTs isolados delas (por exemplo, como listado na Patente dos Estados Unidos No. 7.612.194 e Patente dos Estados Unidos. No. 7.943.819), não tem um efeito prejudicial sobre o crescimento, viabilidade, proliferação, e/ou reprodução da peste de coleópteros e/ou hemípteros, tal como WCR,NCR, SCR, BSB, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Chinavia hilare, Euschistus servus, Dichelops melacandesse modo, Dichelops furcatus, Edessa meditabunda, Thyanta perditor, Chinavia marginatum, Horcias nobilellus, Taedia stigmosa, Dysdercus peruvianus, Neomegalotomus parvus, Leptoglossus zonatus,Niesthrea sidae, Lygus hesperus, e Lygus lineolaris.
[00156] Nem é previsível que das sequências nativas que podem ter um efeito prejudicial sobre uma peste de coleópteros e/ou hemípteros são capazes de ser usadas em técnicas recombinantes para expressar moléculas de ácido nucleico complementares a tais sequências nativas em uma planta hospedeira e fornecendo o efeito prejudicial sobre a peste de coleópteros e/ou hemípteros em alimentação sem causar dano à planta hospedeira.
[00157] Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico da invenção (por exemplo, moléculas de dsRNA a ser fornecidas na planta hospedeira de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros) são selecionadas para alvejar sequências de cDNA que codificam proteínas ou partes de proteínas essenciais para a sobrevivência de peste de coleópteros e/ou hemípteros, tal como sequências de aminoácido envolvidas em séries de reação bioquímicas metabólicas ou catabólicas, divisão celular, reprodução, metabolismo de energia, digestão, reconhecimento de planta hospedeira, e similares. Como descrito aqui, a ingestão de composições por um organismo alvo contendo um ou mais dsRNAs, pelo menos um segmento do qual é especificamente complementar a pelo menos um segmento substancialmente idêntico de RNA produzido nas células do organismo da peste alvo, pode resultar na morte ou outra inibição do alvo. Uma sequência de nucleotídeo, ou DNA ou RNA, derivado de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros pode ser usada para construir células vegetais resistentes à infestação pelas pestes de coleópteros e/ou hemípteros. A planta hospedeira da peste de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, Z. mays ou G. max), por exemplo, pode ser transformada para conter uma ou mais das sequências de nucleotídeo derivadas de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros como fornecido aqui. A sequência de nucleotídeo transformada no hospedeiro pode codificar um ou mais RNAs que formam-se em uma sequência de dsRNA nas células ou fluidos biológicos dentro do hospedeiro transformado, desse modo tornando o dsRNA disponível se/quando a peste de coleópteros e/ou hemípteros forma uma ligação nutricional com o hospedeiro transgênico. Isto pode resulta na supressão de expressão de um ou mais genes nas células da peste de coleópteros e/ou hemípteros, e finalmente morte ou inibição de seu crescimento ou desenvolvimento.
[00158] Desse modo, em algumas modalidades, um gene é alvejado, que é essencialmente envolvido no crescimento, desenvolvimento e reprodução de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Outros genes alvo para uso na presente invenção podem incluir, por exemplo, aqueles que desempenham importantes papéis em viabilidade, movimento, migração, crescimento, desenvolvimento, infectividade, estabelecimento de sítios de alimentação e reprodução de peste de coleópteros e/ou hemípteros. Um gene alvo pode, portanto, ser um gene de manutenção ou um fator de transcrição. Adicionalmente, uma peste nativa de sequência de nucleotídeo de coleópteros e/ou hemípteros para uso na presente invenção pode também ser derivada de um homólogo (por exemplo, um ortólogo), de um gene de planta, viral, bacteriano ou de inseto, a função do qual é conhecida por aqueles versados na técnica, e a sequência de nucleotídeo do qual é especificamente hibridizável com um gene alvo no genoma da peste alvo de coleópteros e/ou hemípteros. Método de identificação de um homólogo de um gene com uma sequência de nucleotídeo conhecida por hibridização são conhecidos por aqueles versados na técnica.
[00159] Em algumas modalidades, a invenção fornece métodos para obter uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo para produzir uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA). Tal modalidade compreende: (a) analisar um ou mais gene(s) alvo para sua expressão, função, e fenótipo na supressão degene mediada por dsRNA em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero; (b) sondar uma biblioteca de cDNA ou gDNA com uma sonda compreendendo toda ou uma porção de uma sequência de nucleotídeo ou um homólogo da mesma de uma peste alvejada de coleópteros e/ou hemípteros que apresenta um fenótipo de crescimento ou desenvolvimento alterado (por exemplo, reduzido) em uma análise de supressão mediada por dsRNA; (c) identificar um clone de DNA que especificamente hibridiza com a sonda; (d) isolar o clone de DNA identificado na etapa (b); (e) sequenciar o fragmento de cDNA ou gDNA que compreende o clone isolado na etapa (d), em que a molécula de ácido nucleico sequenciada compreende todo ou uma porção substancial da sequência de RNA ou um homólogo da mesma; e (f) quimicamente sintetizar toda ou uma porção substancial de uma sequência gene, ou um siRNA ou miRNA ou shRNA ou hpRNAor mRNA ou dsRNA.
[00160] Em outras modalidades, um método para obter um fragmento de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo para produzir uma porção substancial de uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) inclui: (a) sintetizarpmeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo especificamente complementares a uma porção de uma sequência de nucleotídeo nativa de uma peste alvejada de coleópteros e/ou hemípteros; e (b) amplificar uma inserção de cDNA ou gDNA presente em um vetor de clonagem usando primeiro e segundo iniciadores de oligonucleotídeo de etapa (a), em que a molécula de ácido nucleico amplificada compreende uma porção substancial de uma molécula de siRNA ou shRNA ou miRNA ou hpRNA ou mRNA ou dsRNA.
[00161] Ácidos nucleicos da invenção podem ser isolados, amplificados, ou produzidos por diversos métodos. Por exemplo, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, shRNA, miRNA, e hpRNA) pode ser obtida por amplificação de PCR de uma sequência de ácido nucleico alvo (por exemplo, um gene alvo ou um sequência alvo de não codificação transcrita) derivada de uma biblioteca de gDNA ou cDNA, ou porções da mesma. DNA ou RNA podem ser extraídos de um organismo alvo, e bibliotecas de ácido nucleico podem ser preparadas deles usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Bibliotecas de gDNA ou cDNA geradas de um organismo alvo podem ser usadas para amplificação de PCR e sequenciamento de genes alvo. Um produto PCR confirmado pode ser usado como um padrão para transcrição in vitro para gerar RNA senso e antissenso com promotores mínimos. Alternativamente, moléculas de ácido nucleico podem ser sintetizadas por qualquer de diversas técnicas (Veja, por exemplo, Ozaki et ai (1992) Nucleic Acids Research, 20: 5205-5214; e Agrawal et a/.(1990) Nucleic Acids Research, 18: 5419-5423), incluindo uso de um sintetizador de DNA automatizado (por exemplo, um P.E. Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.) modelo 392 ou 394 DNA/RNA Synthesizer), usando químicas padrão, tal como química de fosforamidito. Veja, por exemplo, Beaucage et ai (1992) Tetrahedron, 48: 2223-2311; Patente dos Estados Unidos Nos. 4.415.732, 4.458.066, 4.725.677, 4.973.679, e 4.980.460. Químicas alternativas que resultam em grupos de estrutura principal não naturais, tal como fosforotioato, fosforamidato, e similares, podem também ser empregados.
[00162] Uma molécula de RNA, dsRNA, si RNA, mi RNA, shRNA, ou hpRNA da presente invenção pode ser produzida quimicamente ou enzimaticamente por alguém versado na técnica por meio de reações manuais ou automatizadas, ou in vivo em uma célula compreendendo uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência codificando a molécula de RNA, dsRNA, si RNA, mi RNA, shRNA, ou hpRNA. RNA pode também ser produzido por síntese orgânica parcial ou total - qualquer ribonucleotídeo modificado pode ser introduzido por síntese enzimática ou orgânica in vitro. Uma molécula de RNA pode ser sintetizada por uma RNA polimerase celular ou um bacteriófago RNA polimerase (por exemplo, T3 RNA polimerase, T7 RNA polimerase, e SP6 RNA polimerase). Constructos de expressão úteis para a clonagem e expressão de sequências de nucleotídeo são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.593.874, 5.693.512, 5.698.425, 5.712.135, 5.789.214, e 5.804.693. Moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser purificadas antes da introdução em uma célula. Por exemplo, moléculas de RNA podem ser purificadas de uma mistura por extração com um solvente ou resina, precipitação, eletroforese, cromatografia, ou uma combinação dos mesmos. Alternativamente, moléculas de RNA que são sintetizadas quimicamente ou por síntese enzimática in vitro podem ser usadas sem nenhuma ou um mínimo de purificação, por exemplo, para evitar perdas devido ao processamento de amostra. As moléculas de RNA podem ser secadas para armazenagem ou dissolvidas em uma solução aquosa. A solução pode conter tampões ou sais para promover recozimento, e/ou estabilização de fitas duplas de molécula de dsRNA.
[00163] Em modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser formada por uma fita de RNA auto complementar simples ou de fita dupla de RNA complementares. Moléculas de dsRNA podem ser sintetizadas in vivo ou in vitro. Uma RNA polimerase endógena da célula pode mediar a transcrição de um ou dois frilamentos de RNA in vivo, ou RNA polimerase clonada pode ser usada para mediar a transcrição in vivo ou in vitro. Inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros pode ser alvejada pelo hospedeiro por transcrição específica em um órgão, tecido, ou tipo celular do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico do tecido); estimulação de uma condição ambiental no hospedeiro (por exemplo, usando um promotor induzível que é responsivo à infecção, estresse, temperatura, e/ou indutores químicos); e/ou transcrição de constructo em uma estágio de desenvolvimento ou idade do hospedeiro (por exemplo, usando um promotor específico do estágio de desenvolvimento). Fitas de RNA que formam uma molécula de dsRNA, seja transcrita in vitro ou in vivo, podem ou não ser poliadenilados, e podem ou não serem capazes de ser transladados em um polipeptídeo por um aparelho translacional da célula. D. Vetores Recombinantes e Transformação de Célula Hospedeira [00164] Em algumas modalidades, a invenção também fornece uma molécula de DNA para introdução em uma célula (por exemplo, uma célula bacteriana, uma célula de levedura, ou uma célula vegetal), em que a molécula de DNA compreende uma sequência de nucleotídeo que, na expressão para RNA e ingestão por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, obtém a supressão de um gene alvo em uma célula, tecido, ou órgão da peste de coleópteros e/ou hemípteros. Desse modo, algumas modalidades fornecem uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de ácido nucleico capaz de ser expressa como uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) em uma célula vegetal para inibir a expressão de gene alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. A fim de iniciar ou realçar a expressão, tais moléculas de ácido nucleico recombinantes podem compreender uma ou mais sequências regulatórias, cujas sequências regulatórias podem ser operavelmente ligadas à sequência de ácido nucleico capaz de ser expressa como um iRNA. Métodos para expressar uma molécula de supressão de gene em plantas são conhecidos, e podem ser usados para expressar uma sequência de nucleotídeo da presente invenção.
Veja, por exemplo, Publicação PCT Internacional No. WO06/073727; e Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2006/0200878 Al).
[00165] Em modalidades específicas, uma molécula de DNA recombinante da invenção pode compreender uma sequência de ácido nucleico codificando uma molécula de dsRNA. Tais moléculas de DNA recombinantes podem codificar moléculas de dsRNA capazes de inibir a expressão de gene(s) alvo endógeno(s) em uma célula de peste de coleóptero e/ou hemíptero na ingestão. Em muitas modalidades, um RNA transcrito pode forma uma molécula de dsRNA que pode ser fornecida em uma forma estabilizada; por exemplo, como uma estrutura tipo grampo de cabelo e tronco e alça.
[00166] Nestas e outras modalidades, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada por transcrição de uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga a uma sequência de nucleotídeo que consiste em SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3, o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1,3, ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 19 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5.
[00167] Em outras modalidades, uma fita de uma molécula de dsRNA pode ser formada por transcrição de uma sequência de nucleotídeo que é substancial mente homóloga a uma sequência de nucleotídeo consistindo em SEQ ID NO:89; o complemento de SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89.
[00168] Em modalidades particulares, uma molécula de DNA recombinante codificando uma molécula de dsRNA pode compreender pelo menos dois segmenos de sequência de nucleotídeo em uma sequência transcrita, tais sequências dispostas de modo que a sequência transcrita compreenda uma primeira segmento de sequência de nucleotídeo em uma orientação senso, e um segunda segmento de sequência de nucleotídeo (compreendendo o complemento do primeiro segmento de sequência de nucleotídeo) está em uma orientação antissenso, relativa a pelo menos um promotor, em que o segmento de sequência de nucleotídeo senso e o segmento de sequência de nucleoídeo antissenso são ligados ou conectados por um segmento de sequência espaçadora de cerca de cinco (~5) a cerca de um mil (~1000) nucleotídeos. O segmento de sequência espaçadora pode formar uma alça entre os segmentos de sequência senso e antissenso. O segmento de sequência de nucleotídeo senso ou o segmento de sequência de nucleotídeo antissenso pode ser substancialmente homólogo à sequência de nucleotídeo de um gene alvo (por exemplo, um gene compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89) ou fragmento do mesmo. Em algumas modalidades, entretanto, uma molécula de DNA recombinante pode codificar uma molécula de dsRNA sem uma sequência espaçadora. Em modalidades, uma sequência de codificação senso e uma sequência de codificação antissenso podem ser de comprimentos diferentes.
[00169] Sequências identificadas como tendo um efeito prejudicial sobre pestes de coleópteros e/ou hemípteros ou um efeito protetor da planta com respeito a pestes de coleópteros e/ou hemípteros podem ser facilmente incorporadas em moléculas de dsRNA expressas por meio da criação de cassetes de expressão apropriados em uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. Por exemplo, tais sequências podem ser expressas como um grampo de cabelo com estrutura tronco e alça tomando um primeiro segmento correspondente a uma sequência de gene alvo (por exemplo, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 89, e fragmentos do mesmo); ligando esta sequência a uma região espaçadora de segundo segmento que não é homóloga ou complementar ao primeiro segmento; e ligando esta a um terceiro segmento, em que pelo menos uma porção do terceiro segmento é substancialmente complementar ao primeiro segmento. Tal constructo forma uma estrutura tronco e alça por pareamento de base intramolecular do primeiro segmento com o terceiro segmento, em que a estrutura alça forma e compreende o segundo segmento. Veja, por exemplo, Publicação de Patente dos Estados Unidos Nos. 2002/0048814 e 2003/0018993; e Publicação PCT Internacional Nos. W094/01550 e W098/05770. Uma molécula de dsRNA pode ser gerada, por exemplo, na forma de uma estrutura de fita dupla, tal como uma estrutura tronco-alça (por exemplo, grampo de cabelo), por meio da qual a produção de siRNA alvejada para uma sequência de peste nativa de coleópteros e/ou hemípteros é realçada por coexpressão de um fragmento do gene alvejado, por exemplo, em um cassete expressível de planta adicional, que leva à produção de siRNA realçada, ou reduz a metilação para prevenir o silenciamento de gene transcricional do promotor tipo grampo de cabelo de dsRNA.
[00170] Modalidades da invenção incluem introdução de uma molécula de ácido nucleico recombinante da presente invenção em uma planta (isto é, transformação) para obter níveis de expressão inibitórios de peste de coleópteros e/ou hemípteros de uma ou mais moléculas de iRNA. Uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser um vetor, tal como um plasmídeo linear ou um circular fechado. O sistema vetor pode ser um único vetor ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma de um hospedeiro. Além disso, um vetor pode ser um vetor de expressão. Sequências de ácido nucleico da invenção podem, por exemplo, ser adequadamente inseridas em um vetor sob o controle de um promotor adequado que funciona em um ou mais hospedeiros para impulsionar a expressão de uma sequência de codificação ligada ou outra sequência de DNA. Muitos vetores estão disponíveis para este propósito, e a seleção do vetor apropriado dependerá principal mente do tamanho do ácido nucleico a ser inserido no vetor e a célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componentes, dependendo de sua função (por exemplo, amplificação de DNA ou expressão de DNA) e a célula hospedeira particular com a qual é compatível.
[00171] Para conferir resistência à peste de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta transgênica, um DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrito em uma molécula de iRNA (por exemplo, uma molécula de RNA que forma uma molécula de dsRNA) dentro dos tecidos ou fluidos da planta recombinante. Uma molécula de iRNA pode compreender uma sequência de nucleotídeo que é substancialmente homóloga e especificamente hibridizável a uma correspondente sequência de nucleotídeo transcrita em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros que pode causar dano às espécies de planta hospedeira. Uma peste de coleópteros e/ou hemípteros pode contatar a molécula de iRNA que é transcrita em células da planta hospedeira transgênica, por exemplo, ingerindo células ou fluidos da planta hospedeira transgênica que compreendem a molécula de iRNA. Desse modo, a expressão de um gene alvo é suprimida pela molécula de iRNA em pestes de coleópteros e/ou hemípteros que infestam a planta hospedeira transgênica. Em algumas modalidades, a supressão de expressão do gene alvo na peste alvo de coleópteros e/ou hemípteros pode resultar em uma planta sendo resistente ao ataque pela peste.
[00172] A fim de possibilitar a liberação de moléculas de iRNA para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros em uma ligação nutricional com uma célula vegetal que foi transformada com uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção, expressão (isto é, transcrição) de moléculas de iRNA em uma célula vegetal é requerida. Desse modo, uma molécula de ácido nucleico recombinante pode compreender uma sequência de nucleotídeo da invenção operavelmente ligada a uma ou mais sequências regulatórias, tal como uma sequência promotora heteróloga que funciona em uma célula hospedeira, tal como uma célula bacteriana em que a molécula de ácido nucleico deve ser amplificada, e uma célula vegetal em que a molécula de ácido nucleico deve ser expressa.
[00173] Promotores adequados para uso em moléculas de ácido nucleico da invenção incluem aqueles que são induzíveis, virais, sintéticos, ou constitutivos, todos os quais são bem conhecidos na técnica. Exemplos não limitantes descrevendo tais promotores incluem as Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.437.217 (promotor RS81 do milho); 5.641.876 (promotor de actina do arroz); 6.426.446 (promotor RS324 do milho); 6.429.362 (promotor PR-1 do milho); 6.232.526 (promotor A3 do milho); 6.177.611 (promotores do milho constitutivos); 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196 (promotor CaMV 35S); 6.433.252 (promotor de oleosina L3 do milho); 6.429.357 (promotor de actina 2 do arroz, e íntron de actina 2 do arroz); 6.294.714 (promotores induzíveis por luz); 6.140.078 (promotores induzíveis por sal); 6.252.138 (promotores induzíveis por patógeno); 6.175.060 (promotores induzíveis por deficiência de fósforo); 6.388.170 (promotores bidirecionais); 6.635.806 (promotor gama-coixina); e Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2009/757.089 (promotor de cloroplasto aldolase do milho). Promotores adicionais incluem o promotor de nopalina sintase (NOS) (Ebert et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(16): 5745-5749) e os promotores de octopina sintase (OCS) (que são transportados em plasmídeos indutores de tumor de Agrobacterium tumefaciens)’, os promotores de caulimovirus tal como o promotor 19S do vírus mosaico da couve-flor (CaMV) (Lawton et al. (1987) Plant Mol. Biol. 9:315-324); o promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; o promotor 35 S do vírus mosaico do figwort (Walker et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84(19): 6624-6628); o promotor de sacarose sintase (Yang e Russell (1990) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 4144-4148); o promotor complexo do gene R (Chandler et al. (1989) Plant Cell 1:1175-1183); o promotor de gene de proteína de ligação de clorofila a/b; CaMV35S (Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.322.938, 5.352.605, 5.359.142, e 5.530.196); FMV35S (Patente dos Estados Unidos Nos. 5.378.619 e 6.051.753); um promotor PC1SV (Patente dos Estados Unidos No. 5.850.019); o promotor SCP1 (Patente dos Estados Unidos No. 6.677.503); e promotores AGRtu.nos (GenBank™ Acessão No. V00087; Depicker et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-187).
[00174] Em modalidades particulares, moléculas de ácido nucleico da invenção compreendem um promotor específico do tecido, tal como um promotor específico da raiz. Promotores específicos da raiz impulsionam a expressão de sequências de codificação operavelmente ligadas exclusivamente ou preferencialmente em tecido de raiz. Exemplos de promotores específicos da raiz são conhecidos na técnica. Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.110.732; 5.459.252 e 5.837.848; e Opperman et al. (1994) Science 263:221-3; e Hirel etal. (1992) Plant Mol. Biol. 20:207-18. Em algumas modalidades, uma sequência de nucleotídeo ou fragmento para controle de peste de coleópteros e/ou hemípteros de acordo com a invenção pode ser clonada entre dois promotores específicos da raiz orientados em direções transcricionais opostas com relação à sequência ou fragmento de nucleotídeo, e que são operáveis em uma célula vegetal transgênica e expressos ali para produzir moléculas de RNA em uma célula vegetal transgênica que subsequentemente pode formar moléculas de dsRNA, como descrito, supra. As moléculas de iRNA expressas em tecidos de planta podem ser ingeridas por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros de modo que a supressão de expressão de gene alvo seja obtida.
[00175] Sequências regulatórias adicionais que podem opcionalmente ser operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse incluem 5'UTRs que funcionam como uma sequência líder de translação localizada entre uma sequência promotora e uma sequência de codificação. A sequência líder de translação está presente no mRNA totalmente processado, e pode afetar o processamento da transcrição primária, e/ou estabilidade do RNA. Exemplos de sequências líder de translação incluem líderes de proteína de choque térmico do milho e petúnia (Patente dos Estados Unidos No. 5.362.865), Líderes de proteína de revestimento de vírus da planta, lideres da planta rubisco, e outros. Veja, por exemplo, Turner e Foster (1995) Molecular Biotech. 3(3):225-36. Exemplos não limitantes de 5'UTRs incluem GmHsp (Patente dos Estados Unidos No. 5.659.122); PhDnaK (Patente dos Estados Unidos No. 5.362.865);
AtAntl; TEV (Carrington e Freed (1990) J. Virol. 64:1590-7); e AGRtunos (GenBank™ Acessão No. V00087; e Bevan et ai (1983) Nature 304:184-7).
[00176] Sequências regulatórias adicionais que podem opcionalmente ser operavelmente ligadas a uma molécula de ácido nucleico de interesse também incluem sequências não transladadas 3', regiões de terminação de transcrição 3', ou regiões de poliadenilação. Estes são elementos genéticos localizados a jusante de uma sequência de nucleotídeo, e incluem polinucleotídeos que fornecem sinal de poliadenilação, e/ou outros sinais regulatórios capazes de afetar a transcrição ou o processamento de mRNA. O sinal de poliadenilação funciona em plantas para causar a adição de nucleotídeos poliadenilados à extremidade 3' do precursor de mRNA. A sequência de poliadenilação pode ser derivada de uma variedade de genes de planta, ou de genes T-DNA. Um exemplo não limitante de uma região de terminação de transcrição 3' é a região 3' de nopalina sintase (nos 3'; Fraley et ai (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:4803-7). Um example do uso of diferentes regiões não transladadas 3' é fornecido em Ingelbrecht et ai, (1989) Plant cells 1:671-80. Exemplos não limitantes de sinais de poliadenilação incluem um dentre um gene RbcS2 de Pisum sativum (Ps.RbcS2-E9; Coruzzi et ai (1984) EMBO J. 3:1671-9) e AGRtu.nos (GenBank™ Acessão No. E01312).
[00177] Algumas modalidades podem incluir um vetor de transformação de planta que compreende uma molécula de DNA isolada e purificada compreendendo pelo menos uma das sequências regulatórias acima descritas operativamente ligadas a uma ou mais sequências de nucleotídeo da presente invenção. Quando expressas, a uma ou mais sequências de nucleotídeo resulta em uma ou mais molécula(s) de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à toda ou parte de uma molécula de RNA nativa em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero. Desse modo, a(s) sequência(s) de nucleotídeo podem compreender um segmento codificando toda ou parte de uma sequência de ribonucleotídeo presente em uma peste alvejada de transcrição de RNA de coleópteros e/ou hemípteros, e pode compreender repetições invertidas de toda ou uma parte de uma peste alvejada de transcrição de coleópteros e/ou hemípteros. Um vetor de transformação de planta pode conter sequências especificamente complementares a mais de uma sequência alvo, desse modo permitindo a produção de mais de um dsRNA para inibir a expressão de dois ou mais genes em células de uma ou mais populações ou espécies de pestes alvo de coleópteros e/ou hemípteros. Segmentos de sequência de nucleotídeo especificamente complementar a sequências de nucleotídeo presentes em diferentes genes podem ser combinados em uma única molécula de ácido nucleico composta para expressão em uma planta transgênica. Tais segmentos podem ser contíguos ou separados por uma sequência espaçadora.
[00178] Em algumas modalidades, um plasmídeo da presente invenção já contendo pelo menos uma sequência de nucleotídeo da invenção pode ser modificado pela inserção sequencial de sequência(s) de nucleotídeo adicionais no mesmo plasmídeo, em que a(s) sequência(s) de nucleotídeo adicionais são operavelmente ligadas aos mesmos elementos regulatórios como o original por pelo menos uma sequência de nucleotídeo. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser designada para a inibição de múltiplos genes alvo. Em algumas modalidades, os múltiplos genes a ser inibidos podem ser obtidos da mesma espécie de peste de coleópteros e/ou hemípteros, que pode realçar a eficácia da molécula de ácido nucleico. Em outras modalidades, os genes podem ser derivados de diferentes pestes de coleópteros e/ou hemípteros, que podem ampliar a faixa de pestes de coleópteros e/ou hemípteros contra as quais o(s) agente(s) é/são efetivo(s). Quando múltiplos genes são alvejados para supressão ou uma combinação de expressão e supressão, um elemento de DNA policistrônico pode ser fabricado.
[00179] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode compreender um marcador selecionável que confere um fenótipo selecionável em uma célula transformada, tal como uma célula vegetal. Marcadores selecionáveis podem também ser usados para selecionar plantas ou células vegetais que compreendem uma molécula de ácido nucleico recombinante da invenção. O marcador pode codificar resistência biocida, resistência antibiótica (por exemplo, canamicina, Geneticina (G418), bleomicina, higromicina, etc.), ou tolerância a herbicida (por exemplo, glifosato, etc.). Exemplos de marcadores selecionáveis incluem, porém não estão limitados a: um gene neo que codifica para resistência à canamicina e pode ser selecionado para usar canamicina, G418, etc.] um gene bar que codifica para resistência a bialafos; um gene de EPSP sintase mutante que codifica resistência ao glifosato; um gene nitrilase que confere resistência ao bromoxinila; um gene de acetolactato sintase mutante (ALS) que confere tolerância ao imidazolinona ou sulfonilureia; e um gene DHFR resistente ao metotrexato. Múltiplos marcadores selecionáveis estão disponíveis, que conferem resistência a ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina, espectinomicina, rifampicina, estreptomicina e tetraciclina, e similares. Exemplos de tais marcadores selecionáveis são ilustrados em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.550.318; 5.633.435; 5.780.708 e 6.118.047.
[00180] Uma molécula de ácido nucleico recombinante ou vetor da presente invenção pode também incluir um marcador selecionável. Marcadores selecionáveis podem ser usados para monitorar a expressão. Marcadores selecionáveis exemplares incluem um gene de β-glucuronidase ou uidA (GUS) que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (Jefferson et ai (1987) Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405); um gene de locus R, que codifica um produto que regula a produção de pigmentos de antocianina (cor vermelha) em tecidos de planta (Dellaporta et a/.(1988) "Molecular cloning of the maize R-nj allele by transposon tagging with Ac." No 18th Stadler Genetics Svmposium. P. Gustafson e R. Appels, eds. (Nova Iorque: Plenum), pp. 263-82); um gene de β-lactamase (Sutcliffe et al.(1978) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 75:3737-41); um gene que codifica uma enzima para a qual vários substratos cromogênicos são conhecidos (por exemplo, PADAC, uma cefalosporina cromogênica); um gene de luciferase (Ow et a/.(1986) Science 234:856-9); um gene xylE que codifica um catecol dioxigenase que pode converter catecóis cromogênicos (Zukowski et ai (1983) Gene 46(2-3): 247-55); um gene de amilase (Ikatu et ai (1990) Bio/Technol. 8:241-2); um gene tirosinase que codifica uma enzima capaz de oxidar tirosina em DOPA e dopaquinona que, por sua vez, condensa-se em melanina (Katz et a/.(1983) J. Gen. Microbiol. 129:2703-14); e uma a-galactosidase.
[00181] Em algumas modalidades, moléculas de ácido nucleico recombinantes, como descrito, supra, podem ser usadas em métodos para a criação de plantas transgênicas e expressão de ácidos nucleicos heterólogos em plantas para preparar plantas transgênicas que exibem suscetibilidade reduzida a pestes de coleópteros e/ou hemípteros. Vetores de transformação de planta podem ser preparados, por exemplo, inserindo moléculas de ácido nucleico codificando moléculas de iRNA no vetores de transformação de planta e introduzindo estes em plantas.
[00182] Métodos adequados para transformação de células hospedeiras incluem qualquer método pelo qual o DNA pode ser introduzido em uma célula, tal como por transformação de protoplastos (Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 5.508.184), por captação de DNA mediada por dessecação/inibição (Veja, por exemplo, Potrykus et al. (1985) Mol. Gen. Genet. 199:183-8), por eletroporação (Veja, por exemplo, a Patente dos Estados Unidos No. 5.384.253), por agitação com fibras de carboneto de silício (Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.302.523 e 5.464.765), por transformação mediada por Agrobactéria (Veja, por exemplo, as Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.563.055, 5.591.616, 5.693.512, 5.824.877, 5.981.840; e 6,384,301) e por aceleração de Partículas revestidas por DNA (Veja, por exemplo, PatenteS dos Estados Unidos Nos. 5.015.580, 5.550.318, 5.538.880, 6.160.208, 6.399.861, e 6.403.865), etc. Técnicas que são particularmente úteis para transformar milho são descritas, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.591.616, 7.060.876 e 7.939.3281. Por meio da aplicação de técnicas tal como estas, as células de virtualmente qualquer espécie podem ser estavelmente transformadas. Em algumas modalidades, DNA de transformação é integrado no genoma da célula hospedeira. No caso de espécies multicelulares, células transgênicas podem ser regeneradas em um organismo transgênico. Qualquer destas técnicass podem ser usadas para produzir uma planta transgênica, por exemplo, compreendendo uma ou mais sequências de ácido nucleico codificando uma ou mais moléculas de iRNA no genoma da planta transgênica.
[00183] O método mais amplamente utilizado para introduzir um vetor de expressão em plantas é baseado no sistema de transformação natural de várias espécies de Agrobactéria. A. tumefaciens e A. rhizogenes são bactérias de solo patogênicas de planta que geneticamente transformam células vegetais. Os plasmídeos Ti e Ri de A. tumefaciens e A. rhizogenes, respectivamente, transportam genes responsáveis pela transformação genética da planta. Os plasmídeos Ti (indutores de tumor) contêm um grande segmento, conhecido como T-DNA, que é transferido para plantas transformadas. Outro segmento do plasmídeo Ti, a região Vir, é responsável pela transferência de T-DNA. A região de T-DNA é limitada por repetições terminais. Em vetores binários modificados, os genes indutores de tumor foram deletados, e as funções da região Vir são utilizadas para transferir DNA estranho limitado pelas sequências limítrofes de T-DNA. A região T- pode também conter um marcador selecionável para recuperação eficiente de células transgênicas e plantas, e um múltiplos sítios de clonagem para inserir sequências para transferência, tal como um ácido nucleico codificando dsRNA.
[00184] Desse modo, em algumas modalidades, um vetor de transformação de planta é derivado de um plasmídeo Ti de A. tumefaciens (Veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos Nos. 4.536.475, 4.693.977, 4.886.937, e 5.501.967; e Patente Européia No. EP 0 122 791) ou um plasmídeo Ri de A. rhizogenes. Vetores de transformação de planta adicionais incluem, por exemplo, e sem limitação, aqueles descritos por Herrera-Estrella et ai. (1983) Nature 303:209-13; Bevan et al. (1983) Nature 304:184-7; Klee et ai. (1985) Bio/Technol. 3:637-42; e na Patente Européia No. EP 0 120 516, e aqueles derivados de qualquer um dos anteriores. Outras bactérias tais como Sinorhizobium, Rhizobium, e Mesorhizobium que interagem com plantas naturalmente podem ser modificadas para mediar a transferência de gene para um número de diversas plantas. Estas bactérias simbióticas associadas à planta podem ser tornadas competentes para transferência de gene para aquisição de ambos um plasmídeo Ti desarmado e um vetor binário adequado.
[00185] Após fornecer DNA exógeno para células receptoras, células transformadas são geralmente identificadas para também cultura e regeneração de planta. A fim de melhorar a capacidade de identificar células transformadas, alguém pode desejar empregar um gene marcador selecionável ou avaliável, como previamente mencionado, com o vetor de transformação usado para gerar o transformante. No caso onde um marcador selecionável é usado, células transformadas são identificadas dentro da população de célula potencialmente transformada expondo as células a um agente ou agentes seletivo(s). No caso onde um marcador avaliável é usado, as células podem ser avaliadas quanto à característica de gene marcador desejada.
[00186] As células que sobrevivem à exposição ao agente seletivo, ou células que foram classificadas positivas em um ensaio de avaliação, podem ser cultivadas em meio que suporta a regeneração de plantas. Em algumas modalidades, qualquer meio de cultura de tecido de planta adequado (por exemplo, meios MS e N6) pode ser modificado incluindo outras substâncias, tal como reguladores de crescimento. O tecido pode ser mantido em um meio básico com reguladores de crescimento até tecido suficiente estar disponível para começar esforços de regeneração da planta, ou seguindo ciclos repetidos de seleção manual, até a morfologia do tecido estar adequada para a regeneração (por exemplo, tipicamente cerca de 2 semanas), então transferidas para meios que conduzem à formação de brotos. As culturas são transferidas periodicamente até suficiente formação de brotos ter ocorrido. Assim que os brotos são formados, elas são transferidas para meios que conduzem à formação de raiz. Assim que raízes suficientes são formadas, as plantas podem ser transferidas para o solo para outro crescimento e maturação.
[00187] Para confirmar a presença de uma molécula de ácido nucleico de interesse (por exemplo, uma sequência de DNA codificando uma ou mais moléculas de iRNA que inibem a expressão de gene alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero) na regeneração de plantas, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo: ensaios biológicos moleculares, tal como Manchamento do Sul e Norte, PCR, e sequenciamento de ácido nucleico; ensaios bioquímicos, tal como detectando a presença de um produto de proteína, por exemplo, por métodos imunológicos (ELISA e/ou imuno manchamentos) ou por função enzimática; ensaios de parte da planta, tal como ensaios de folha ou raiz; e análise do fenótipo da planta regenerada inteira.
[00188] Eventos de integração podem ser analisados, por exemplo, por amplificação por PCR usando, por exemplo, iniciadores de oligonucleotídeo específicos para uma molécula de ácido nucleico de interesse. Genotipagem de PCR é entendido incluir, porém não limitada à amplificação por reação de cadeia de polimerase (PCR) de DNA genômico derivado de tecido de calo de planta hospedeira isolado previsto conter uma molécula de ácido nucleico de interesse integrada no genoma, seguida por clonagem padrão e análise de sequência de produtos de amplificação de PCR. Métodos de genotipagem por PCR foram bem descritos (por exemplo, Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-53) e podem ser aplicados ao DNA genômico derivado de qualquer espécie de planta (por exemplo, Z. mays ou G. max) ou tipo de tecido, incluindo culturas celulares.
[00189] A planta transgênica formada usando métodos de transformação dependente de Agrobactéria tipicamente contém uma única sequência de DNA recombinante inserida no cromossoma. A única sequência de DNA recombinante é referida como um "evento transgênico" ou "evento de integração". Tais plantas transgênicas são hemizigotas para a sequência exógena inserida. Em algumas modalidades, uma planta transgênica homozigota com respeito a um transgene pode ser obtida por acasalamento sexual (autofecundação) uma planta transgênica segregante independente que contém uma única sequência de gene exógeno em si, por exemplo, uma T0, para produzir semente Ti. Um quarto da semente T-ι produzida será homozigoto com respeito ao transgene. A germinação da semente Ti resulta em plantas que podem ser testadas quanto à heterozigosidade, tipicamente usando um ensaio SNP ou um ensaio de amplificação térmica que permite a distinção entre heterozigotas e homozigotas (isto é, um ensaio de zigosidade).
[00190] Em modalidades particulares, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 ou mais diferentes moléculas de iRNA que têm um efeito inibitório de peste de coleópteros e/ou hemípteros são produzidas em uma célula vegetal. As moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) podem ser expressas de múltiplas sequências de ácido nucleico introduzidas em diferentes eventos de transformação, ou de uma única sequência de ácido nucleico introduzida em um único evento de transformação. Em algumas modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de um único promotor. Em outras modalidades, uma pluralidade de moléculas de iRNA é expressa sob o controle de múltiplos promotores. Moléculas moléculas de iRNA únicas podem ser expressas que compreendem múltiplas sequências de ácido nucleico que são cada uma homóloga a diferentes locus dentro de uma ou mais pestes de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, o locus definido pelas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89), ambos em diferentes populações da mesma espécie de peste de coleópteros e/ou hemípteros, ou em diferentes espécies de pestes de coleópteros e/ou hemípteros.
[00191] Além da transformação direta de uma planta com uma molécula de ácido nucleico recombinante, plantas transgênicas podem ser preparadas por cruzamento de uma primeira planta tendo pelo menos um evento transgênico com uma segunda planta sem tal evento. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico recombinante compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica uma molécula de iRNA pode ser introduzida em uma primeira linhagem de planta que é receptiva à transformação para produzir uma planta transgênica, cuja planta transgênica pode ser cruzada com uma segunda linhagem de planta para introgressar a sequência de nucleotídeo que codifica a molécula de iRNA na segunda linhagem de planta.
[00192] A invenção também inclui produtos de base contendo uma ou mais das sequências da presente invenção. Modalidades particulares incluem produtos de base produzidos de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais das sequências de nucleotídeo da presente invenção. Um produto básico contendo uma ou mais das sequências da presente invenção é pretendido incluir, porém não ser limitado a, farinhas, óleos, grãos inteiros ou esmagados ou sementes de uma planta, ou qualquer alimento ou produto de alimentação animal compreendendo qualquer farinha, óleo ou grão esmagado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante contendo uma ou mais do sequências da presente invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da presente invenção em uma ou mais mercadorias ou produtos de base contemplados aqui é evidência de facto de que a mercadoria ou produto de base é produzido de uma planta transgênica designada expressasr uma ou mais das sequências de nucleotídeos da presente invenção para o propósito de controle de pestes de planta de coleóptero e/ou hemíptero usando métodos de supressão de gene mediados por dsRNA.
[00193] Em alguns aspectos, sementes e produtos de base produzidos por plantas transgênicas derivadas de células vegetais transformadas são incluídos, nos quais as sementes ou produtos de base compreendem uma quantidade detectável de uma sequência de ácido nucleico da invenção. Em algumas modalidades, tais produtos de base podem ser produzidos, por exemplo, obtendo plantas transgênicas e preparando alimento ou alimentação deles. Produtos de base compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico da invenção incluem, por exemplo, e sem limitação: farinhas, óleos, grãos esmagados ou inteiros ou sementes de uma planta, e qualquer produto de alimento compreendendo qualquer farinha, óleo, grão esmagado ou inteiro de uma planta ou semente recombinante compreendendo uma ou mais das sequências de ácido nucleico da invenção. A detecção de uma ou mais das sequências da invenção em uma ou mais mercadorias ou produtos de base é evidência de facto de que a mercadoria ou produto de base é produzido de uma planta transgênica designada expressar uma ou mais de moléculas de iRNA da invenção para o propósito de controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros.
[00194] Em algumas modalidades, uma planta ou semente transgênica compreendendo uma molécula de ácido nucleico da invenção também pode compreender pelo menos um outro evento transgênico em seu genoma, incluindo sem limitação: um evento transgênico do qual é transcrita uma molécula de iRNA alvejando um locus em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero exceto aquele definido pelas SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89, tal como, por exemplo, um ou mais locus selecionados do grupo que consiste em Cafl-180 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2013/0097730), ROP (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/577,811), RNA polimerase 11 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133,214), RNA polimerase 11140 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/577.854), RNA polimerase 11215 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133.202), RNA polimerase II33 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133,210), nem (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/095487), Dre4 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/705,807), COPI alfa (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063,199), COPI beta (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063,203), COPI gama (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063,192), COPI delta (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063,216); um evento transgênico do qual é transcrita uma molécula de iRNA alvejando um gene em um organismo exceto uma peste de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um nematódeo parasítico da planta); um gene codificando uma proteína inseticida (por exemplo, uma proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, tal como, por exemplo, Cry34Ab1 (Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.127.180, 6.340.593, e 6.624.145), Cry35Ab1 (Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.083.499, 6.340.593, e 6.548.291), uma combinação "Cry34/35Ab1" em um único evento (por exemplo, evento de milho DAS-59122-7; Patente dos Estados Unidos No. 7.323.556), Cry3A (por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 7.230.167), Cry3B (por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 8.101.826), Cry6A (por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 6.831.062), e combinações dos mesmos (por exemplo, Pedido de Patente dos Estados Unidos Nos. 2013/0167268,2013/0167269, e 2013/0180016); Alcaligenes spp. (por exemplo, Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2014/0033361) ou Pseudomonas spp. (por exemplo, Publicação de Pedido PCT No. WO2015038734) proteína inseticida); um tolerância a gene herbicida (por exemplo, um gene fornecendo tolerância ao glifosato, glufosinato, dicamba ou 2,4-D (por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 7.838.733)); e um gene contribuindo para um fenótipo desejável na planta transgênica, tal como produção aumentada, metabolismo de ácido graxo alterado, ou restauração de esterilidade masculina citoplásmica. Em modalidades particulares, sequências codificando moléculas de iRNA da invenção podem ser combinadas com outro controle de inseto ou com características de resistência à doença em uma planta para obter as características desejadas para controle realçado de dano de inseto e doença de planta. A combinação de características de controle de inseto que empregam modos de ação distintos pode fornecer plantas transgênicas protegidas com superior durabilidade sobre plantas alojando uma única característica de controle, por exemplo, por causa da probabilidade reduzida de que a resistência à(s) característica(s) se desenvolverão no campo. V. Supressão de Gene Alvo em uma Peste de Coleóptero e/ou Hemíptero A. Visão Geral [00195] Em algumas modalidades da invenção, pelo menos uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, em que a molécula de ácido nucleico leva ao silenciamento de gene mediado por RNAi em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) pode ser fornecida para a peste de coleóptero e/ou hemíptero. Em algumas modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros contatando a molécula de ácido nucleico com a peste de coleópteros e/ou hemípteros. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida em um substrato de alimentação da peste de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo, uma composição nutricional. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico útil para o controle de pestes de coleópteros e/ou hemípteros pode ser fornecida por meio da ingestão de material de planta compreendendo a molécula de ácido nucleico que é ingerida pela peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em determinadas modalidades, a molécula de ácido nucleico está presente em material de planta por meio da expressão de uma sequência de ácido nucleico recombinante introduzida em um material de planta, por exemplo, por transformação de uma célula vegetal com um vetor compreendendo a sequência de ácido nucleico recombinante e regeneração de um material de planta ou planta inteira da célula vegetal transformada. B. Supressão de gene alvo mediada por RNAi [00196] Em modalidades, a invenção fornece moléculas de iRNA (por exemplo, dsRNA, siRNA, miRNA, shRNA, e hpRNA) que podem ser designadas alvejar sequências de nucleotídeo nativas essenciais (por exemplo, genes essenciais) no transcriptoma de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, WCR, NCR, MCR, BSB, Nezara viridula, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Acrosternum hilare, e Euschistus servus), por exemplo, designando uma molécula de iRNA que compreende pelo menos uma fita compreendendo uma sequência de nucleotídeo que é especificamente complementar à sequência alvo. A sequência de uma molécula de iRNA desse modo designada pode ser idêntica à sequência alvo, ou pode incorporar incompatibilidades que não impedem a hibridização específica entre a molécula de iRNA e sua sequência alvo.
[00197] Moléculas da invenção de iRNA podem ser usadas em métodos para a supressão de gene em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero, desse modo reduzindo o nível ou incidência de dano causado pela peste sobre uma planta (por exemplo, uma planta transformada protegida compreendendo uma molécula de iRNA). Como usado aqui o termo "supressão de gene" refere-se a qualquer um dos métodos bem conhecidos para reduzir os níveis de proteína produzidos como um resultado de transcrição de gene para mRNA e subsequente translação do mRNA, incluindo a redução da expressão de proteína de um gene ou uma sequência de codificação incluindo a inibição pós-translacional de expressão e supressão transcripcional. A inibição pós-transcripcional é mediada por homologia específica entre todo ou uma parte de um mRNA transcrito de um gene alvejado para supressão e a correspondente molécula de iRNA usada para a supressão. Adicional mente, inibição pós-transcripcional refere-se à redução da quantidade de mRNA substancial e mensurável disponível na célula para ligação por ribossomas.
[00198] Em modalidades em que uma molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA, a molécula de dsRNA pode ser clivada pela enzima, DICER, em moléculas de siRNA curtas (aproximadamente 20 nucleotídeos de comprimento). A molécula de siRNA de fita dupla gerada por atividade de DICER na molécula de dsRNA pode ser separada em dois siRNAs de fita simples; a "fita passageiro" e a "fita guia". A fita passageiro pode ser degradada, e a fita guia pode ser incorporada em RISC. Inibição pós-transcripcional ocorre por hibridização específica da fita guia com uma sequência especificamente complementar de uma molécula de mRNA, e subsequente divagem pela enzima, Argonaute (componente catalítico do complexo RISC).
[00199] Em modalidades da invenção, qualquer forma de molécula de iRNA pode ser usada. Aqueles versados na técnica entenderão que as moléculas de dsRNA tipicamente são mais estáveis do que são as moléculas de RNA de fita simples, durante a preparação e durante a etapa de fornecimentio da molécula de iRNA para uma célula, e são tipicamente também mais estáveis em uma célula. Desse modo, enquanto moléculas de siRNA e miRNA, por exemplo, podem ser igualmente efetivas em algumas modalidades, uma molécula de dsRNA pode ser escolhida, devido à sua estabilidade.
[00200] Em modalidades particulares, uma molécula de ácido nucleico é fornecida que compreende uma sequência de nucleotídeo, cuja sequência de nucleotídeo pode ser expressa in vitro para produzir uma molécula de iRNA que é substancialmente homóloga a uma molécula de ácido nucleico codificada por uma sequência de nucleotídeo dentro do genoma de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em determinadas modalidades, a molécula de iRNA transcrita in vitro pode ser uma molécula de dsRNA estabilizada que compreende um uma estrutura tronco-alça. Após uma peste de coleópteros e/ou hemípteros contatar a molécula de iRNA transcrita in vitro, inibição pós-transcricional de um gene alvo em a peste de coleópteros e/ou hemípteros (por exemplo, um gene essencial) pode ocorrer.
[00201] Em algumas modalidades da invenção, expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeo é usada em um método para inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma peste de coleóptero, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1,3, ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5. Em determinadas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer um dos anteriores pode ser usada. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente hibridiza para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste de coleóptero.
[00202] Em determinadas modalidades da invenção, expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeo é usada em um método para inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma peste de hemíptero, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 89; o complemento de SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89. Em determinadas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer um dos anteriores pode ser usada. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente hibridiza para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste de hemíptero.
[00203] Em algumas modalidades, expressão de pelo menos uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeo pode ser usada em um método para inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma peste de coleóptero, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3;o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica (por exemplo, WCR) compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo Diabrotica que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5. Em determinadas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer um dos anteriores pode ser usada. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente hibridiza para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste de coleóptero. Em exemplos particulares, tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5.
[00204] Em modalidades particulares da invenção, expressão de uma molécula de ácido nucleico compreendendo pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de nucleotídeo é usada em um método para inibição pós-transcricional de um gene alvo em uma peste de hemíptero, em que a sequência de nucleotídeo é selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:89; o complemento de SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo hemíptero compreendendo SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de não codificação nativa de um organismo hemíptero que é transcrita em uma molécula de RNA nativa compreendendo SEQ ID NO:89. Em determinadas modalidades, expressão de uma molécula de ácido nucleico que é pelo menos 80% idêntica (por exemplo, 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%, cerca de 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, e 100%) com qualquer um dos anteriores pode ser usada. Nestas e outras modalidades, uma molécula de ácido nucleico pode ser expressa que especificamente hibridiza para uma molécula de RNA presente em pelo menos uma célula de uma peste de hemíptero. Em exemplos particulares, tal molécula de ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeo compreendendo SEQ ID NO:89.
[00205] É um importante aspecto de algumas modalidades da invenção que o sistema de inibição pós-transcricional de RNAi é capaz de tolerar variações de sequência entre genes alvo que podem ser esperados, devido à mutação genética, polimorfismo de cepa, ou divergência evolucionária. A molécula de ácido nucleico introduzida pode não necessitar ser absolutamente homóloga a ou um produto de transcrição primária ou um mRNA totalmente processado de um gene alvo, contanto que a molécula de ácido nucleico introduzida seja especificamente hibridizável a ou um produto de transcrição primária ou um mRNA totalmente processado do gene alvo. Além disso, a molécula de ácido nucleico introduzida pode não ser necessário ser de tamanho natural, com relação a ou um produto de transcrição primária ou um mRNA totalmente processado do gene alvo.
[00206] Inibição de um gene alvo usando a tecnologia de iRNA da presente invenção é específica da sequência; isto é, sequências de nucleotídeo substancialmente homólogas à molécula de iRNA(s) são alvejadas para inibição genética. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo idêntica a uma porção de uma sequência de gene alvo pode ser usada para inibição. Nestas e outras modalidades, uma molécula de RNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo com uma ou mais inserção, deleção, e/ou mutações de ponto com relação a uma sequência de gene alvo pode ser usada. Em modalidades particulares, uma molécula de iRNA e uma porção de um gene alvo podem compartilhar, por exemplo, pelo menos de cerca de 80%, pelo menos de cerca de 81 %, pelo menos de cerca de 82%, pelo menos de cerca de 83%, pelo menos de cerca de 84%, pelo menos de cerca de 85%, pelo menos de cerca de 86%, pelo menos de cerca de 87%, pelo menos de cerca de 88%, pelo menos de cerca de 89%, pelo menos de cerca de 90%, pelo menos de cerca de 91%, pelo menos de cerca de 92%, pelo menos de cerca de 93%, pelo menos de cerca de 94%, pelo menos de cerca de 95%, pelo menos de cerca de 96%, pelo menos de cerca de 97%, pelo menos de cerca de 98%, pelo menos de cerca de 99%, pelo menos de cerca de 100%, e 100% de identidade de sequência. Alternativamente, a região dúplex de uma molécula de dsRNA pode ser especificamente hibridizável com uma porção de uma transcrição de gene alvo. Em moléculas especificamente hibridizáveis, uma sequência menor do que o tamanho natural exibindo uma maior homologia compensa para um sequência menos homóloga, maior. O comprimento da sequência de nucleotídeo de uma região dúplex de uma molécula de dsRNA que é idêntica a uma porção de uma transcrição de gene alvo pode ser pelo menos cerca de 15,16, 17,18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, ou pelo menos cerca de 1000 bases. Em algumas modalidades, uma sequência de mais de 15 a 100 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência de mais do que cerca de 200 a 300 nucleotídeos pode ser usada. Em modalidades particulares, uma sequência de mais do que cerca de 500 a 1000 nucleotídeos pode ser usada, dependendo do tamanho do gene alvo.
[00207] Em determinadas modalidades, expressão de um gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros pode ser inibida em pelo menos 10%; pelo menos 33%; pelo menos 50%; ou pelo menos 80% em uma célula de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, de modo que uma inibição significante ocorra. A inibição significante refere-se à inibição sobre um limiar que resulta em um fenótipo detectável (por exemplo, cessação de crescimento, cessação de alimentação, cessação de desenvolvimento, mortalidade induzida, etc.), ou um decréscimo detectável em RNA e/ou produto de gene que corresponde ao gene alvo que está sendo inibido. Embora em determinadas modalidades da invenção a inibição ocorra em substancialmente todas as células da peste de coleópteros e/ou hemípteros, em outras modalidades a inibição ocorre apenas em um subgrupo de células expressando os genes alvo.
[00208] Em algumas modalidades, supressão transcricional em uma célula é mediada pela presença de uma molécula de dsRNA exibindo substancial identidade de sequência para uma sequência de DNA promotora ou o complemento da mesma, para realizar o que é referido como "transsupressão de promotor". A supressão de gene pode ser efetiva contra genes alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero que pode ingerir ou contatar tais moléculas de dsRNA, por exemplo, ingerindo ou contatando material de planta contendo as moléculas de dsRNA. Moléculas de dsRNA para uso em transsupressão de promotor podem ser especificamente designadas para inibir ou suprimir a expressão de uma ou mais sequências homólogas ou complementares nas células da peste de coleópteros e/ou hemípteros. Supressão de gene pós-transcricional por RNA orientado antissensoo ou senso para regular a expressão de gene em células vegetais é descrita nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.107.065, 5.231.020, 5.283.184, e 5.759.829. C. Expressão de Moléculas de iRNA Fornecida para uma Peste de Coleópteros e/ou Hemípteros [00209] Expressão de moléculas de iRNA para inibição de gene mediada por RNAi em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero pode ser realizada em qualquer um de muitos formatos in vitro ou in vivo. As moléculas de iRNA podem então ser fornecidas para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, por exemplo, contatando as moléculas de iRNA com a peste, ou causando a peste ingerir ou de outro modo internalizar as moléculas de iRNA. Algumas modalidades da invenção incluem plantas hospedeiras transformadas de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, células vegetais transformada, e progênie de plantas transformadas. As células vegetais transformada e plantas transformadas podem ser construídas para expressar uma ou mais das moléculas de iRNA, por exemplo, sob o controle de um promotor heterólogo, para fornecer um efeito protetor de peste. Desse modo, quando uma planta transgênica ou célula vegetal é consumida por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros durante a alimentação, a peste pode ingerir moléculas de iRNA expressas nas plantas ou células transgênicas. As sequências de nucleotídeo da presente invenção podem também ser introduzidas em uma ampla variedade de hospedeiros de micro-organismo procariótico e eucariótico para produzir moléculas de iRNA. O termo "micro-organismo" inclui espécies procarióticas e eucarióticas, tal como bactérias e fungos.
[00210] Modulação de expressão de gene pode incluir parcial ou completa supressão de tal expressão. Em outra modalidade, um método para supressão de expressão de gene em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero compreende fornecer no tecido do hospedeiro da peste uma quantidade supressiva de gene de pelo menos uma molécula de dsRNA formada seguindo a transcrição de uma sequência de nucleotídeo como descrito aqui, pelo menos um segmento da qual é complementar a uma sequência de mRNA dentro das células da peste de coleópteros e/ou hemípteros. Uma molécula de dsRNA, incluindo sua forma modificada, tal como uma molécula de siRNA, miRNA, shRNA, ou hpRNA, ingerida por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros de acordo com a invenção, pode ser pelo menos de cerca de 80%, cerca de 81%, cerca de 82%, cerca de 83%, cerca de 84%, cerca de 85%, cerca de 86%, cerca de 87%, cerca de 88%,about 89%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99%, cerca de 100%, ou 100% idêntica a uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeo compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, 5, ou 89. Moléculas de ácido nucleico isoladas e substancialmente purificadas incluindo, porém não limitadas a, sequências de nucleotídeo de ocorrência não natural e constructos de DNA recombinante para fornecer moléculas de dsRNA da presente invenção, são, portanto, fornecidas, as quais suprimem ou inibem a expressão de uma sequência de codificação endógena ou uma sequência de codificação alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros quando introduzidas nela.
[00211] Modalidades particulares fornecem um sistema de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para a inibição pós-translacional de um ou mais gene(s) alvo em uma peste de coleóptero e/ou hemíptero e controle de uma população da peste de planta de coleóptero e/ou hemíptero. Em algumas modalidades, o sistema de liberação compreende a ingestão de uma célula vegetal transgênica hospedeira ou teor de célula hospedeira compreendendo moléculas de RNA transcrita na célula hospedeira. Nestas e outras modalidades, uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica é criada, que contém um constructo de DNA recombinante fornecendo uma molécula de dsRNA estabilizada da invenção. Células vegetais transgênicas e plantas transgênicas compreendendo sequências de ácido nucleico codificando uma particular molécula de iRNA podem ser produzidas empregando tecnologias de DNA recombinante (cujas tecnologias básicas são bem conhecidas na técnica) para construir um vetor de transformação de planta compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando uma molécula de iRNA da invenção (por exemplo, um molécula de dsRNA estabilizada); para transformar uma célula vegetal ou planta; e para gerar uma célula vegetal transgênica ou uma planta transgênica que contenha a molécula de iRNA transcrita.
[00212] Para conferir resistência à peste de coleópteros e/ou hemípteros a uma planta transgênica, uma molécula de DNA recombinante pode, por exemplo, ser transcrita em uma molécula de iRNA, tal como uma molécula de dsRNA, uma molécula de si RNA, uma molécula de miRNA, uma molécula de shRNA, ou uma molécula de hpRNA. Em algumas modalidades, uma molécula de RNA transcrita de uma molécula de DNA recombinante pode formar uma molécula de dsRNA dentro dois tecidos ou fluidos da planta recombinante. Tal molécula de dsRNA pode ser compreendida em parte de uma sequência de nucleotídeo que é idêntica a uma sequência de nucleotídeo correspondente transcrita de uma sequência de DNA em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros de um tipo que pode infestar a planta hospedeira. A expressão de um gene alvo dentro de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros é suprimida pela molécula de dsRNA ingerida, e a supressão de expressão do gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros resulta, por exemplo, na cessação de alimentação pela peste de coleópteros e/ou hemípteros, com um resultado final sendo, por exemplo, que a planta transgênica é protegida de outro dano por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Os efeitos modulatórios de moléculas de dsRNA foram mostrados ser aplicáveis a uma variedade de genes expressos em pestes, incluindo, por exemplo, genes endógenos responsáveis pelo metabolismo celular ou transformação celular, incluindo genes de manutençãso; fatores de transcrição; genes relacionados com a muda; e outros genes que codificam polipeptídeos envolvidos em metabolismo celular ou crescimento e desenvolvimento normais.
[00213] Para transcrição de um transgene in vivo ou um constructo de expressão, uma região regulatória (por exemplo, promotora, realçadora, silenciadora, e sinal de poliadenilação) podem ser usados em algumas modalidades para transcrever a fita (ou fitas) de RNA. Portanto, em algumas modalidades, como mencionado, supra, uma sequência de nucleotídeo para uso na produção de moléculas de iRNA pode ser operavelmente ligada a uma ou mais sequências funcionais promotoras em uma célula hospedeira de planta. O promotor pode ser um promotor endógeno, normalmente residente no genoma no hospedeiro. A sequência de nucleotídeo da presente invenção, sob o controle de uma sequência promotora operavelmente ligada, pode também ser flanqueada por sequências adicionais que vantajosamente afetam sua transcrição e/ou a estabilidade de uma transcrição resultante. Tais sequências podem ser localizadas a montante do promotor operavelmente ligado, a jusante da extremidade 3' do constructo de expressão, e pode ocorrer tanto a montante do promotor quanto a jusante da extremidade 3' do constructo de expressão.
[00214] Algumas modalidades fornecem métodos para reduzir o dano a uma planta hospedeira (por exemplo, uma planta de milho) causado por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros que se alimenta sobre a planta, em que o método compreende fornecer na planta hospedeira uma célula vegetal transformada expressando pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que a molécula de ácido nucleico(s) funciona sendo apreendida pela peste de coleópteros e/ou hemípteros para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da peste de coleópteros e/ou hemípteros, cuja inibição de expressão resulta em mortalidade, crescimento reduzido, e/ou reprodução reduzida da peste de coleópteros e/ou hemípteros, desse modo reduzindo o dano à planta hospedeira causado por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA. Nestas e outras modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA que cada uma compreende mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável a uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste de coleóptero e/ou hemíptero. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consiste(m) em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste de coleóptero e/ou hemíptero.
[00215] Em outras modalidades, um método para aumentar a produção de uma colheita de milho é fornecido, em que o método compreende introduzir em uma planta de milho pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção; cultivar a planta de milho para permitir a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo a sequência de ácido nucleico, em que a expressão de uma molécula de iRNA compreendendo o sequência de ácido nucleico inibe o crescimento da peste de coleópteros e/ou hemípteros e/ou dano da peste de coleópteros e/ou hemípteros, desse modo reduzindo ou eliminando uma perda de produção devido à infestação de peste de coleópteros e/ou hemípteros. Em algumas modalidades, a molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste de coleóptero e/ou hemíptero. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consistem em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste de coleóptero e/ou hemíptero.
[00216] Em algumas modalidades, um método para modular a expressão de um gene alvo em uma peste de coleópteros e/ou hemípteros é fornecida, o método compreendendo: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando pelo menos uma molécula de ácido nucleico da invenção, em que o sequência de nucleotídeo é operativamente ligada a um promotor e uma sequência de terminação de transcrição; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal incluindo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar células vegetais transformadas que tem integrado a molécula de ácido nucleico em seus genomas; avaliar as células vegetais transformadas quanto à expressão de uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada; selecionar uma célula vegetal transgênica que expressa a molécula de iRNA; e alimentar a célula vegetal transgênica selecionada para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. As plantas podem também ser regeneradas de células vegetais transformadas eue expressam uma molécula de iRNA codificada pela molécula de ácido nucleico integrada. Em algumas modalidades, o molécula de iRNA é uma molécula de dsRNA. Nestas e outras modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico compreendem moléculas de dsRNA em que cada uma compreende mais de uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste de coleóptero e/ou hemíptero. Em algumas modalidades, a(s) molécula(s) de ácido nucleico consistem em uma sequência de nucleotídeo que é especificamente hibridizável para uma molécula de ácido nucleico expressa em uma célula de peste de coleóptero e/ou hemíptero.
[00217] Moléculas de iRNA da invenção podem ser incorporadas nas sementes de uma espécie de planta (por exemplo, milho), ou como um produto de expressão de um gene recombinante incorporado em um genoma de uma célula vegetal, ou quando incorporado em um revestimento ou tratamento de semente que é aplicado à semente antes do plantio. Uma célula vegetal compreendendo um gene recombinante é considerada ser um evento transgênico. São também incluídos nas modalidades da invenção sistemas de liberação para a liberação de moléculas de iRNA para pestes de coleópteros e/ou hemípteros. Por exemplo, as moléculas de iRNA da invenção podem ser diretamente introduzidas nas células de uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. Métodos para introdução podem incluir mistura direta de iRNA com tecido de planta de um hospedeiro para uma peste de coleópteros e/ou hemípteros, bem como aplicação de composições compreendendo moléculas de iRNA da invenção ao tecido de planta hospedeira. Por exemplo, moléculas de iRNA podem ser vaporizadas sobre uma superfície de planta. Alternativamente, uma molécula de iRNA pode ser expressa por um micro-organismo, e o microorganismo pode ser aplicado sobre a superfície da planta, ou introduzido em uma raiz ou tronco por um método físico, tal como uma injeção. Como descrito, supra, uma planta transgênica pode também ser geneticamente construída para expressar pelo menos uma molécul de iRNA em uma quantidade suficiente para matar as pestes de coleópteros e/ou hemípteros conhecidas infestarem a planta. Moléculas de iRNA produzidas por síntese química ou enzimática podem também ser formuladas de uma maneira consistente com práticas agrícolas comuns, e usadas como produtos de vaporização para controlar dano à planta por uma peste de coleópteros e/ou hemípteros. As formulações podem incluir os espessantes apropriados e umectantes requeridos para cobertura foliar eficiente, bem como protetores de UV para proteger moléculas de iRNA (por exemplo, moléculas de dsRNA) de dano de UV. Tais aditivos são comumente usados na indústria bioinseticida, e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais aplicações podem ser combinadas com outras aplicações de inseticida de vaporização (biologicamente ou de outro modo baseados) para realçar a proteção de planta de pestes de coleópteros e/ou hemípteros.
[00218] Todas as referências, incluindo publicações, patentes, e pedidos de patente, citados aqui são pelo presente incorporados por referência na medida em que eles não são inconsistentes com os detalhes explícitos desta descrição, e são então incorporados na mesma extensão como se cada referência fosse individualmente e especificamente indicada para ser incorporada por referência e fossem mencionadas em sua íntegra aqui. As referências descritas aqui são fornecidas apenas para sua descrição antes da data de depósito do presente pedido. Nada aqui deve ser construído como uma admissão de que os inventores não são intitulados para antecipar tal descrição em virtude da invenção anterior.
[00219] Os seguintes exemplos são fornecidos para ilustrar determinadas características e/ou aspectos particulares. Estes exemplos não devem ser construídos para limitar a invenção às características ou aspectos particulares descritos. EXEMPLOS EXEMPLO 1 Bioensaios de Dieta de Inseto [00220] Preparação de amostra e bioensaios Diversas moléculas de dsRNA (incluindo aquelas que correspondem a rpL40-1 regí ( SEQ ID NO:9), rpL40-3 reg3 ( SEQ ID NO:10), rpL40-1ver1 ( SEQ ID NO:11), rpL40-1 ver2 ( SEQ ID NO:12), rpL40-1 ver3 ( SEQ ID NO:13), rpL40-1 ver4 ( SEQ ID NO:14), e rpL40-1 ver5 ( SEQ ID NO:15), foram sintetizadas e purificadas usando um MEGASCRIPT® RNAi kit ou HiScribe® T7 In vitro Transcription Kit. As moléculas purificadas de dsRNA foram preparadas em tampão TE, e todos os bioensaios continham um tratamento de controle consistindo neste tampão, que serviram como um checagem de base para mortalidade ou inibição de crescimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte). As concentrações de moléculas de dsRNA no tampão de bioensaio foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).
[00221] As amostras foram testadas para atividade de inseto em bioensaios conduzidos com larvas de inseto neonato em dieta de inseto artificial. Ovos WCR foram obtidos de CROP CHARACTERISTICS, INC. (Farmington, MN).
[00222] Os bioensaios foram conduzidos em bandejas de plástico de 128 cavidades especificamente designadas para bioensaios de inseto (C-D INTERNATIONAL, Pitman, NJ). Cada cavidade continha aproximadamente 1,0 mL de uma dieta artificial designada para crescimento de insetos coleópteros. Uma alíquota de 60 pL de amostra de dsRNA foi liberada por pipeta sobre a superfície de uma dieta de cada cavidade (40 pL/cm2). Concentrações de amostra de dsRNA foram calculadas como a quantidade de dsRNA por centímetro quadrado (ng/cm2) de área de superfície (1,5 cm2) na cavidade. As bandejas tratadas foram mantidas em um exaustor até o líquido em uma superfície de dieta evaporar ou ser absorvido na dieta.
[00223] Em algumas horas de eclosão, larvas individuais foram coletadas com uma escova de cabelo de camelo umidecido e depositadas sobre a dieta tratada (uma ou duas larvas por cavidade). As cavidades infestadas das bandejas de plástico de 128 cavidades foram então seladas com folhas adesivas de plástico transparente, e abertas para permitir permuta de gás. Bandejas de bioensaio foram mantidas sob condições ambientais controladas (28*0, -40% de Humidade Relativa, 16:8 (Luz:Escuro)) durante 9 dias, após cujo tempo o número total de insetos expostos a cada amostra, o número de insetos mortos, e o peso de insetos sobreviventes foram registrados. O percentual médio de mortalidade e inibição média de crescimento foram calculados para cada tratamento. Inibição de crescimento (Gl) foi calculada como segue: Gl = [1 — (TWIT/TNIT)/(TWIBC/TNIBC)] onde TWIT é o peso total de insetos vivos no tratamento; TNIT é o número total de insetos no tratamento; TWIBC é o peso total de insetos vivos na Checagem de Base (controle de tampão); e TNIBC é o número total de insetos na Checagem de Base (controle de tampão).
[00224] A análise estatística foi feita usando o software JMP™ (SAS, Cary, NC).
[00225] LC50 (Concentração Letal) é definida como a dosagem na qual 50% dos insetos de teste são mortos. Gl50 (Inibição de Crescimento) é definido como a dosagem na qual o crescimento médio (por exemplo, peso vivo) dos insetos de teste é 50% do valor médio observado em amostras de Checagem de Base.
[00226] Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de amostras particulares resultou em uma mortalidade surpreendente e inesperada e inibição do crescimento de larvas da raiz do milho. EXEMPLO 2 Identificação de Genes Alvo Candidatos [00227] Múltiplos estágios de desenvolvimento de WCR (Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram selecionados para análise de transcriptoma agrupado para fornecer sequências de gene alvo candidato para controle por tecnologia de resistência a inseto de planta transgênica de RNAi.
[00228] Em uma exemplificação, RNA total foi isolado de cerca de 0,9 gm de larvas de WCR de primeiro instar total; (4 a 5 dias pós-eclosão; mantidas a 16*0), e purificadas usando o seguinte método com base em fenol/TRI REAGENT® (MOLECULAR RESEARCH CENTER, Cincinnati, OH): [00229] Larvas foram homogeneizadas em temperatura ambiente em um homogeneizador de 15 mL com 10 mL de TRI REAGENT® até uma suspensão homogênea ser obtida. Após 5 min. de incubação em temperatura ambiente, 0 homogeneizado foi dispensado em tubos microcentrífugos de 1,5 mL (1 mL por tubo), 200 pL de clorofórmio foram adicionados, e a mistura foi vigorosamente agitada durante 15 segundos. Após permitir a extração para assentar em temperatura ambiente durante 10 min, as fases foram separadas por centrifugação a 12,000 x g a 4Τλ A fase superior (compreendendo cerca de 0,6 ml_) foi cuidadosamente transferida para outro tubo de 1,5 mL estéril, e um volume igual de temperatura ambiente isopropanol foi adicionado. Após incubação em temperatura ambiente durante 5 a 10 minutos, a mistura foi centrifugada 8 minutos a 12.000 x g (4°C ou 2510).
[00230] O sobrenadante foi cuidadosamente removido e descartado, e o pélete de RNA foi lavada duas vezes por agitação em vórtex com com 75% de etanol, com recuperação por centrifugação durante 5 minutos a 7,500 x g (4Ό ou 25*0) após ca da lavagem. O etanol foi cuidadosamente removido, o pélete foi deixado secar ao ar durante 3 a 5 minutos, e em seguida foi dissolvido em água estéril livre de nuclease. A concentração de RNA foi determinada medindo a absorvência (A) a 260 nm e 280 nm. Uma extração típica de cerca de 0,9 gm de larvas produziu mais de 1 mg de RNA total, com uma relação de A260/A280 de 1,9. O RNA desse modo extraído foi armazenado a -80“Ο até novamente processado.
[00231] A qualidade de RNA foi determinada conduzindo uma alíquota por meio de um gel de agarose a 1%. A solução de gel de agarose foi feita usando tampão autoclavado 10x T (EDTA de Tris-acetato; concentração de 1x é Tris-acetato a 0,04 M, EDTA a 1 mM (sal de sódio de ácido tetra-acético de etilenodiamina), pH 8,0) diluído com água tratada com DEPC (dietil pirocarbonato) em um recipiente autoclavado. 1x TAE foi usado como o tampão de execução. Antes do uso, o tanque de eletroforese e o pente formador de cavidade foram limpos com RNAseAway™ (INVITROGEN INC., Carlsbad, CA). Dois pL de amostra de RNA foram misturados com 8 pL de tampão TE (Tris HCI a 10 mM, pH 7,0; EDTA a 1 mM) e 10 pL de tampão de amostra de RNA (NOVAGEN® Catalog No 70606; EMD4 Bioscience, Gibbstown, NJ). A amostra foi aquecida a 70*C durante 3 min, resfriada para a temperatura ambiente, e 5 pL (contendo 1 pg a 2 pg de RNA) foram carregados por cavidade. Marcadores de peso molecular de RNA comercial mente disponíveis foram simultaneamente conduzidos em cavidades separadas para comparação do tamanho molecular. O gel foi conduzido a 60 volts durante 2 horas.
[00232] Uma biblioteca de cDNA normalizada foi preparada do RNA total larval por um provedor de serviço comercial (EUROFINS MWG Operon, Huntsville, AL), usando imprimação aleatória. A biblioteca de cDNA larval normalizada foi sequenciada em uma escala de 1/2 placa por GS FLX 454 Titanium™ serie química em EUROFINS MWG Operon, que resultou em mais de 600.000 leituras com um comprimento de leitura médio de 348 bp. 350.000 leituras foram agrupadas em mais de 50.000 contigs. Tanto as leituras não agrupadas quanto os contigs foram convertidos em bases de dados BLASTable usando o programa publicamente disponível, FORMATDB (disponível de NCBI).
[00233] Bibliotecas de RNA Total e cDNA normalizada foram similarmente preparadas de materiais colhidos em outros estágios de desenvolvimento de WCR. Uma biblioteca de transcriptoma agrupado para avaliação de gene alvo foi construída combinando-se membros de biblioteca de cDNA representando os vários estágios de desenvolvimento.
[00234] Genes candidato para alvejamento de RN Ai foram selecionados usando informação considerando efeitos de RNAi letal de genes particulares em outros insetos, tal como Drosophila e Tribolium. Estes genes foram hipotetizados ser essenciais para sobrevivência e crescimento em insetos de coleópteros. Homólogos de gene alvo selecionados foram identificados na base de dados de sequência de transcriptoma como descrito abaixo. Sequências de tamanho natural ou parciais dos genes alvo foram amplificados por PCR para preparar padrões para produção de RNA de fita dupla (dsRNA).
[00235] Pesquisas TBLASTN usando sequências de codificação de proteína candidatas foram conduzidas junto a bases de dados BLASTable contendo as leituras de sequência de Diabrotica não agrupadas ou os contigs agrupados. Hits significantes para uma sequência de Diabrotica (definida como melhor do que e'20 para homologias de contigs e melhor do que e'10 para homologias de leituras de sequência não agrupadas) foram confirmados usando BLASTX junto à base de dados não redundante de NCBI. Os resultados desta pesquisa BLASTX confirmaram que as sequências de gene candidato homólogas de Diabrotica identificadas na pesquisa de TBLASTN realmente compreendeu genes de Diabrotica, ou foram o melhor hit para a sequência de gene candidato não Diabrotica presente nas sequências de Diabrotica. Na maioria dos casos, genes candidato de Tribolium que foram anotados como codificando um proteína forneceram uma homologia de sequência não ambígua a uma sequência ou sequências nas sequências de transcriptoma de Diabrotica. Em alguns casos, ficou claro que alguns dos contigs de Diabrotica ou leituras de sequência não agrupadas selecionadas por homologia a um gene candidato não Diabrotica sobreposto, e que a montagem dos contigs não uniu estas sobreposições. Nesses casos, Sequencher™ v4.9 (GENE CODES CORPORATION, Ann Arbor, Ml) foi usado para montagem das sequências em contigs mais longios.
[00236] Um gene alvo candidato codificando DiabroticarpL40 ( SEQ ID NOs: 1,3, e 5) foi identificado como um gene que pode levar à mortalidade de peste de coleóptero, inibição de crescimento, inibição de desenvolvimento, ou inibição de reprodução em WCR.
[00237] A sequência de SEQ ID NOs: 1, 3, e 5 é nova. A sequência não é fornecida em bases de dados públicas e não é descrita no WO/2011/025860; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20070124836; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 20090306189; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. US20070050860; Pedido de Patente dos Estados Unidos No.20100192265; ou Patente dos Estados Unidos No. 7.612.194. A sequência DiabroticarpL40-1 ( SEQ ID NO:1) é um pouco relacionada com um fragmento de uma sequência de Aedes aegypti (Acessão GENBANK No. AF418984.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácido D/aòrof/caRPL40-1 ( SEQ ID NO:2) é uma proteína Drosophila melanogaster tendo Acessão GENBANK No. NP_476776.1 (100% similar; 100% idêntica na região de homologia). A sequência de DiabroticarpL40-2 ( SEQ ID NO:3) é um pouco relacionada com um fragmento de uma sequência de Dendroctonus ponderosae (Acessão GENBANK No. APGK01027402.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácido de DiabroticaRPL40-2 ( SEQ ID NO:4) é uma proteína Saccoglossus kowalevskii tendo Acessão GENBANK No. XP_006817704.1 (99% similar; 98% idêntica na região de homologia). A sequência de DiabroticarpL40-3 (SEQ ID NO:5) é um pouco relacionada com um fragmento curto de uma sequência de Phyllostachys edulis (Acessão GENBANK No. FP093773.1). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácido de DiabroticaRPL40-3 (SEQ ID NO:6) é uma proteína dGregarina niphandrodes tendo Acessão GENBANK No. XP 011128524.1 (96% similar; 88% idêntica na região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de aminoácido Diabrotica RPL40-3 (SEQ ID NO:7) é uma proteína de Gregarina niphandrodes tendo Acessão GENBANK No. XP_011128522.1 (51% similar; 35% idêntica na região de homologia). O homólogo mais próximo da sequência de amiocido de DiabroticaRPL40-3 (SEQ ID N0:8) é uma proteína de Gregarina niphandrodes tendo Acessão GENBANK No. XDR24359.1 (62% similar; 44% idêntica na região de homologia).
[00238] transgenes de dsRNA rpL40 podem ser combinados com outras moléculas de dsRNA para fornecer alvejamento de RNAi redundante e efeitos de RNAi sinérgico. Eventos de milho transgênico expressando dsRNA que alveja rpL40 são úteis para prevenir o dano de alimentação de raiz por larva da raiz do milho. Os transgenes de dsRNA rpL40 representam novos modos de ação para combinação com tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., ou Pseudomonas spp. em piramídeos de gene de controle de resistência a inseto para mitigar contra o desenvolvimento de populações de larvas de raiz resistentes a qualquer uma destas tecnologias de controle de larva da raiz.
[00239] Clones de tamanho natural e parciais de sequências de um gene candidato de Diabrotica, aqui referidos como rpL40, foram usados para gerar amplicons de PCR para síntese de dsRNA.
[00240] SEQ ID NO: 1 mostra uma sequência de DNA de 574 bp de DiabroticarpL40-1.
[00241] SEQ ID NO: 3 mostra uma sequência de DNA de 652bp de DiabroticarpL40-2.
[00242] SEQ ID NO: 5 mostra uma sequência de DNA de 4065 bp de DiabroticarpL40-3.
[00243] SEQ ID NO: 9 mostra uma sequência de DNA 306 bp de rpL40-1 regí.
[00244] SEQ ID NO: 10 mostra uma sequência de DNA de 361 bp de rpL40-3 reg3.
[00245] SEQ ID NO: 11 mostra uma sequência de DNA de 117 bp de rpL40-1v 1.
[00246] SEQ ID NO: 12 mostra uma sequência de DNA de 143 bp de rpL40-1v2.
[00247] SEQ ID NO: 13 mostra uma sequência de DNA de 141 bp de rpL40-1 v3.
[00248] SEQ ID NO: 14 mostra uma sequência de DNA de 130 bp de rpL40-1 v4.
[00249] SEQ ID NO: 15 mostra uma sequência de DNA de 165 bp de rpL40-1 v5. EXEMPLO 3 Amplificação de Genes Alvo para produzir dsRNA
[00250] Iniciadores foram designados para amplificar porções de regiões de codificação de cada gene alvo por PCR. Veja a Tabela 1. Onde apropriado, um promotor de sequência de fago T7 (TTAATACG ACT CACTATAGGG AG A; SEQ ID NO:16) foi incorporado nas extremidades 5' das fitas senso ou antissenso amplificadas. Veja a Tabela 1. O RNA total foi extraído de WCR, e cDNA primeira fita foi usada como um padrão para reações de PCR usando iniciadores opostos posicionados para amplificar toda ou parte da sequência de gene alvo nativo. dsRNA foi também amplificado de um clone de DNA compreendendo a região de codificação para uma proteína fluorescente amarela (YFP) ( SEQ ID NO:17; Shagin et ai (2004) Mol. Biol. Evol. 21(5):841-50).
Tabela 1. Iniciadores e Pares de Iniciador usados para amplificar porções de regiões de codificação de gene alvo exemplar de rpL40 e gene de controle negativo de YFP. EXEMPLO 4 Constructos de RNAi Preparação Padrão por PCR e síntese de dsRNA.
[00251] Uma estratégia usada para fornecer padrões específicos para produção de dsRNA rpL40 e YFP é mostrada na Figura 1. DNAs padrões pretendidos para uso em síntese de dsRNA rpL40 foram preparados por PCR usando os pares de iniciador na Tabela 1 e cDNA de primeira fita (como padrão de PCR preparado de RNA isolado de larvas de primeiro instar de WCR. Para cada região de gene alvo rpL40 e YFP selecionada, amplificações de PCR introduziram uma sequência promotora de T7 nas extremidades 5' das fitas senso e antissenso amplificadas (o segmento de YFP foi amplificado de um clone de DNA da região de codificação de YFP). Os produtos PCR tendo uma sequência de promotor T7 em suas extremidades 5’ de ambas as fitas senso e antissenso foram usadas como padrão de transcrição para a produção de dsRNA. Veja a Figura 1. As sequências dos padrões de dsRNA amplificados com os pares de iniciador particulares foram: SEQ ID NO:9 (rpL40-1 regí), SEQ ID NO:10 (rpL40-3 reg3), SEQ ID NO:11 (rpL40-1v 1), SEQ ID NO:12 (rpL40-1 v2), SEQ ID NO: 13 {rpL40-1 v3), SEQ ID NO: 14 (rpL40-1 v4), SEQ ID NO:15 (rpL40-1 v5), e YFP (SEQ ID NO:17). RNA de fita dupla para bioensaio de inseto foi sintetizada e purificada usando um kit AMBION®MEGASCRIPT® RNAi seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN) ou Kit HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis seguindo as instruções do fabricante (New England Biolabs). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).
Construção de vetores de transformação de planta [00252] Vetores de entrada alojando um constructo de gene alvo para formação de grampo de cabelo compreendendo segmentos de rpL40 (SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5) são agrupados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. Formação de grampo de cabelo intramolecular por transcrições primárias de RNA é facilitada por disposição (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias de um segmento de uma sequência de gene alvo rpL40 em orientação oposta uma à outra, os dois segmentos sendo separados por um polinucleotídeo ligante (por exemplo, uma alça (tal como SEQ ID NO:112) ou um íntron ST-LS1; Vancanneyt et al. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50). Desse modo, a transcrição de mRNA primária contém as duas sequências de segmento de gene rpL40 como grande repetições invertidas entre si, separadas por um sequência ligante. Uma cópia de um promotor (por exemplo ubiquitina 1 de milho, Patente dos Estados Unidos No. 5.510.474; 35S de Vírus Mosaico da Couve-Flor (CaMV); promotor de bacilliform badnavirus de cana de açúcar (ScBV); promotores de genes de actina de arroz; promotores de ubiquitina; pEMU; MAS; promotor de H3 histona de milho; promotor de ALS; promotor de gene faseolina; cab; rubisccr, LAT52-, Zm13\ e/ou apg) é usado para impulsionar a produção da transcrição de grampo de cabelo de mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' (por exemplo, um gene de peroxidase 5 de milho (ZmPerõ 3'UTR v2; Patente dos Estados Unidos 6.699.984), AtUbilO, AtEfl, ou StPinll) é usada para terminar a transcrição do gene de expressão de RNA tipo grampo de cabelo.
[00253] Um vetor de destinação binário compreende uma tolerância a gene herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (Patente dos Estados Unidos No. 7838733(B2), e Wright et al. (2010) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 107:20240-5) sob a regulação um promotor operáve planta (por exemplo, promotor bacilliform badnavirus de cana de açúcar (ScBV) (Schenk etal. (1999) Plant Mol. Biol. 39:1221-30) ou ZmUbil (Patente dos Estados Unidos 5.510.474)). Uma 5'UTR e ligante são posicionados entre a extremidade 3' do segmento promotor e o códon de partida da região de codificação de AAD-1. Um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de um gene de lipase de milho (ZmLip 3'UTR; Patente dos Estados Unidos 7.179.902) é usado para terminar a transcrição do mRNA de AAD-1.
[00254] Um vetor binário de controle negativo, que compreende um gene que expressa uma proteína YFP, é construída por meio de reações de recombinação padrão GATEWAY® com um vetor de destinação binária típica e vetor de entrada. O vetor de destinação binária compreende uma tolerância a gene herbicida (ariloxialcanoato dioxigenase; AAD-1 v3) (como acima) sob a regulação de expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de um gene de lipase de milho (ZmLip 3'UTR; como acima). Um vetor de entrada compreende uma região de codificação YFP sob o controle de expressão de um promotor de ubiquitina 1 de milho (como acima) e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de um gene de peroxidase 5 de milho (como acima). EXEMPLQ5 Avaliação de Genes Alvo Candidato [00255] dsRNA sintético designado para inibir sequências de gene alvo identificadas no EXEMPL02 causaram mortalidade e inibição de crescimento quando administradas a WCR em ensaios com base em dieta. rpL40 regí, rpL40 v2, rpL40 v3, e rpL40v4, foram observadas exibir a eficácia enormemente aumentada neste ensaio em outros dsRNAs avaliados.
[00256] Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão de preparações de dsRNA derivadas de rpL40 regí, rpL40 v1, rpL40 v2, rpL40 v3, rpL40 v4, e rpL40 v5 cada resultou em mortalidade e/ou inibição de crescimento de larvas da raiz do milho ocidental. A Tabela 2 e Tabela 3 mostra os resultados de bioensaios de alimentação com base em dieta de larvas WCR seguindo exposição 9 dias a estes dsRNAs, bem como os resultados obtidos com uma amostra de controle negativo de dsRNA preparada de uma região de codificação de proteína fluorescente amarela (YFP) ( SEQ ID NO:17).
Tabela 2. Resultados de ensaios de alimentação de dieta de dsRNA rpL40 obtidos com larvas da raiz do milho ocidental após 9 dias de alimentação. Análise ANOVA encontrou diferenças de significância em Mortalidade % Média e Inibição de Crescimento Percentual Médio (Gl).
As médias foram separadas usando o teste Tukey-Kramer. *SEM = Erro Padrão da Média. As letras entre parênteses designaram níveis estatísticos. Os níveis não conectados pela mesma letra são significantemente diferentes (P<0.05). **TE = Tris HCI (1 mM) mais tampão de EDTA (1 mM), pH 7,2. ***YFP = Proteína Fluorescente Amarela Tabela 3. Sumário de potência oral de dsRNA de rpL40 nas larvas de WCR (ng/cm2). Ό0257] Foi previamente sugerido que determinados genes de Diabrotica spp. podem ser explorado para o controle de inseto mediado por RNAi. Veja a Publicação de Patente dos Estados Unidos No. 2007/0124836, que descreve 906 sequências, e Patente dos Estados Unidos No. 7.612.194, que descreve 9.112 sequências. Entretanto, foi determinado que muitos genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto mediado por RNAi não são eficazes no controle de Diabrotica. Foi também determinado que sequências rpL40 regí, rpL40 v1, rpL40 v2, rpL40 v3, rpL40 v4, e rpL40 v5 cada fornece surpreendente e inesperado controle superior de Diabrotica, comparado a outros genes sugeridos ter utilidade para controle de inseto mediado por RNAi.
[00258] Por exemplo, Anexina, espectrina beta 2, e mtRP-L4 foram cada um sugerido na Patente dos Estados Unidos No. 7.612.194 ser eficazes em controle de inseto mediado por RNAi. SEQ ID NO:33 é a Sequência de DNA de Anexina região 1 (Reg 1), e SEQ ID NO:34 é a Sequência de DNA de Anexina região 2 (Reg 2). SEQ ID NO:35 é a Sequência de DNA de espectrina beta 2 região 1 (Reg 1), e SEQ ID NO:36 é a Sequência de DNA de espectrina beta 2 região 2 (Reg2). SEQ ID NO:37 é a Sequência de DNA de mtRP-L4 região 1 (Reg 1), e SEQ ID NO:38 é a Sequência de DNA de mtRP-L4 região 2 (Reg 2). Uma sequência de YFP (SEQ ID NO:17) foi também usada para produzir dsRNA como um controle negativo.
[00259] Cada uma das sequências acima mencionadas foi usada para produzir dsRNA pelos métodos de EXEMPLO 3. A estratégia usada para fornecer padrões específicos para a produção de dsRNA é mostrada na Figura 2. Padrões de DNAs pretendidos para uso em síntese de dsRNA foram preparados por PCR usando os pares de iniciador na Table 4 e (como padrão de PCR) cDNA de primeira fita preparado de RN A total isolado de larvas de primeiro instar de WCR. (YFP foi amplificado de um clone de DNA.) Para cada região de gene alvo selecionada, duas amplificações separadas de PCR foram realizadas. A primeira amplificação de PCR introduziu uma sequência promotora T7 na extremidade 5' das fitas senso amplificadas. A segunda reação incorporou a sequência promotora T7 nas extremidades 5' das fitas antissenso. Os dois fragmentos amplificados por PCR para cada região dos genes alvo foram então misturados em quantidades aproximadamente iguais, e a mistura foi usada como padrão de transcrição de podução de dsRNA. Veja a Figura 2. RNA de fita dupla foi sintetizado e purificado usando um kit AMBION® MEGAscript® RNAi seguindo as instruções do fabricante (INVITROGEN). As concentrações de dsRNAs foram medidas usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE), e os dsRNAs foram cada um testado pelos mesmos métodos de bioensaio com base em dieta descritos acima. A Tabela 4 lista as sequências de iniciadores usadas para produzir as moléculas YFP, Anexina Regí, Anexina Reg2, espectrina beta 2 Regí, espectrina beta 2 Reg2, mtRP-L4 Regí, e mtRP-L4 Reg2 de dsRNA. Sequências iniciadoras de YFP para uso no método representado na Figura 2 são também listadas na Tabela 4. A Tabela 5 apresenta os resultados de bioensaios de alimentação com base em dieta de larvas de WCR seguindo exposição de 9 dias a estas moléculas de dsRNA. Bioensaios replicados demonstraram que a ingestão destes dsRNAs resultou em nenhuma mortalidade ou inibição de crescimento de lasrvas da raiz do milho ocidental acima que foram observadas com amostras de controle de tampão TE, águar, ou proteína YFP.
Tabela 4. Iniciadores e Pares de Iniciador usados para amplificar porções de regiões de codificação de genes.
Tabela 5. Resultados de ensaios de alimentação de dieta obtidos com larvas da raiz do milho ocidental após 9 dias. *ΤΕ = Tris HCI (10 mM) mais tampão de EDTA (1 mM), pH 8. **YFP = Proteína Fluorescente Amarela EXEMPLO 6 Produção de Tecidos de Milho Transaênico Compreendendo dsRNAs Inseticidas [00260] Transformação mediada por Agrobactéria. Células de milho transgênico, tecidos, e plantas que produzem uma ou mais moléculas de dsRNA inseticida (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo rpL40-1( SEQ ID NO:1); rpL40-2 ( SEQ ID NO:3); rpL40-3 ( SEQ ID NO:5); rpL40-1 reg1( SEQ ID NO:9); rpL40-3 reg3 (SEQ ID NO:10); rpL40-1 v1 ( SEQ ID NO:11); rpL40-1 v2 ( SEQ ID NO:12); rpL40-1 v3 ( SEQ ID NO:13); rpL40-1 v4 ( SEQ ID NO:14); rpL40-1 v5 ( SEQ ID NO:15); BSB_rpL40 ( SEQ ID NO:89); BSB_rpL4 regí ( SEQ ID NO:91); ou BSB_rpL40 v1 ( SEQ ID NO:92) por meio da expressão de um gene quimérico estavelmente integrado a uma planta genoma foram produzidas seguindo transformação mediada por Agrobactéria. Métodos de transformação de milho empregando vetores de transformação superbinários ou binários são conhecidos na técnica, como descrito, por exemplo, em Patente dos Estados Unidos No. 8.304.604, que é incorporado por referência em sua íntegra. Tecidos transformados foram selecionados quanto à sua capacidade de se desenvolver em meio contendo Haloxifop e são analisados quanto à produção de dsRNA, como apropriado. Porções de tais culturas de tecido transformado podem ser usado para larva neonata das larvas da raiz do milho para bioensaio, essencialmente como descrito em EXEMPL01.
[00261] Iniciação de Cultura de Aqrobactéria. Estoques de Glicerol de células DAt13192 da cepa de Agrobactéria (WO 2012/016222A2) alojando um vetor de transformação binária descrito acima (EXEMPLO 4) foram riscados sobre pás de meio mínimo AB (Watson, et al., (1975) J. Bacteriol. 123:255-264) contendo antibióticos apropriados e foram cultivados a 20°C durante 3 dias. As culturas foram em seguida riscados sobre placas YEP (gm/L: extrato de levedura, 10; Peptona, 10; NaCI 5) contendo os mesmos antibióticos e foram incubadas a 20°C durante 1 dia.
[00262] Cultura de Agrobactéria. No dia de um experimento, uma solução estoque de Meio de Inoculação e acetosiringona foi preparada em um volume apropriado para o número de constructos no experimento e pipetada em um frasco de 250 mL, descartável, estéril. Meio de Inoculação (Frame et al. (2011) Genetic Transformtion Using Maize Immature Zygotic Embryos. IN Plant Embryo Culture Methods e Protocols: Methods in Molecular Biology. T. A. Thorpe e E. C. Yeung, (Eds), Springer Science e Business Media, LLC. pp 327-341) continha: 2,2 gm/L de sais de MS; 1X Vitaminas MS Modificadas por ISU (Frame et al., ibid.) 68,4 gm/L de sacarose; 36 gm/L de glucose; 115 mg/L de L-prolina; e 100 mg/L de mio-inositol; em pH 5,4.) Acetosiringona foi adicionado a um frasco contendo Meio de Inoculação a uma concentração final de 200 μΜ de uma solução estoque a 1 M em 100% de sulfóxido de dimetila e a solução foi cuidadosamente misturada.
[00263] Para cada constructo, 1 ou 2 alças de inoculação de Agrobactéria da placa YEP foram suspensas em 15 mL da solução estoque de Meio de Inoculação/acetosiringona em um tubo de centrífuga de 50 mL descartável, estéril, e a densidade ótica da solução a 550 nm (OD550) foi medida em um espectrofotômetro. A suspensão foi em seguida diluída em OD550 de 0,3 a 0,4 usando mistura de Meio de Inoculação/acetosiringona adicional. Um tubo de suspensão de Agrobactéria foi em seguida colocada horizontalmente em um conjunto agitador de plataforma a cerca de 75 rpm em temperatura ambiente e agitado durante 1 a 4 horas enquanto dissecação de embrião foi executada.
[00264] Esterilização de espiga e isolamento de embrião. Embriões imaturos de milho foram obtidos de plantas de linhagem B104 inata de Zea mays (Hallauer et al. (1997) Crop Science 37:1405-1406) cultivadas na estufa e auto ou sib polinada para produzir espigas. As espigas foram colhidas aproximadamente 10 a 12 dias após polinização. No dia experimental, espigas descascadas foram esterilizadas na superfície por imersão em uma solução a 20% de clareamento comercial (ULTRA CLOROX® Germicidal Bleach, 6,15% de hipoclorito de sódio; com duas gotas de TWEEN 20) e agitadas durante 20 a 30 minutos, seguido por três enxágues em água desionizada estéril em uma coifa de fluxo laminar. Embriões zigóticos imaturos (1,8 a 2,2 mm long) foram assepticamente dissecados de cada espiga e aleatoriamente distribuídos em tubos microcentrífugos contendo 2,0 mL de uma suspensão de células de Agrobactéria apropriadas em líquido de Meio de Inoculação com 200 μΜ de acetosiringona, em que 2 pL de 10% de tensoativo de BREAK-THRU® S233 (EVONIK INDUSTRIES; Essen, Germany) foi adicionado. Para um dado conjunto de experimentos, embriões de espigas agrupadas foram usados para cada transformação.
[00265] Co-cultivacão de Agrobactéria. Após isolação, os embriões foram colocados em uma plataforma rocker durante 5 minutos. Os conteúdos do tubo foram em seguida despejados em uma placa de Meio de Co-cultivação, que continha 4,33 gm/L de sais de MS; 1X Vitaminas MS Modificadas por ISU; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH (ácido 3,6-dicloro-o-anísico ou ácido 3,6-dicloro-2-metoxibenzóico); 100 mg/L de meio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgN03; 200 μΜ de acetosiringona em DMSO; e 3 gm/L de GELZAN™, em pH 5,8. A suspensão de Agrobactéria líquida foi removida com uma pipeta de transferência descartável, e estéril. Os embriões foram em seguida orientados com o escutelo virado para cima usando fórceps estéril com o auxílio de um microscópio. A placa foi fechada, selada com fita médica 3M™ MICROPORE™, e colocada em uma incubadora a 25Ό com luz contínua a aproximadamente 60 pmol m'2s"1 de Radiação Fotossinteticamente Ativa (PAR).
[00266] Seleção de Calo e Regeneração de Eventos Transaênicos-Após o período de Co-Cultivação, embriões foram transferidos para Meio de Repouso, que foi composto de 4,33 gm/L de sais de MS; 1X Vitaminas MS Modificadas por ISU; 30 gm/L de sacarose; 700 mg/L de L-prolina; 3,3 mg/L de Dicamba em KOH; 100 mg/L de mio-inositol; 100 mg/L de Hidrolisado Enzimático de Caseína; 15 mg/L de AgN03; 0,5 gm/L de MES monoidrato de ácido (2-(N-morfolino)etanossulfônico; PHYTOTECHNOLOGIES LABR.; Lenexa, KS); 250 mg/L de Carbenicilina; e 2,3 gm/L de GELZAN™; em pH 5,8. Não mais do que 36 embriões foram movidos para cada placa. As placas foram colocadas em uma caixa de plástico transparente e incubadas a 27Ό com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m'2s'1 de PAR durante 7 a 10 dias. Embriões com calos foram em seguida transferidos (<18/placa) para Meio de Seleção I, que era composto de Meio de Repouso (acima) com 100 nM R-Haloxifop ácido (0.0362 mg/L; para seleção de calos alojando o gene AAD-1). As placas foram devolvidas para as caixas transparentes e incubadas a 27C com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m'2s'1 de PAR durante 7 dias. Embriões com calos foram em seguida (<12/placa) para Meio de Seleção II, que era composto de Meio de Repouso (acima) com 500 nM de R-Haloxifop ácido (0.181 mg/L). As placas foram devolvidas para as caixas transparentes e incubadas a 27“C com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m'2s'1 de PAR durante 14 dias. Esta etapa de seleção permitiu calos transgênicos também se proliferarem e se diferenciarem.
[00267] Proliferando, calos embriogênicos foram transferidos (<9/placa) para Meio de Pré-Regeneração. Meio de Pré-Regeneração continha 4,33 gm/L de sais de MS; 1X Vitaminas MS Modificadas por ISU; 45 gm/L de sacarose; 350 mg/L de L-prolina; 100 mg/L de mio-inositol; 50 mg/L de Hidrolisados Enzimáticos de Caseína; 1,0 mg/L de AgN03; 0,25 gm/L de MES; 0,5 mg/L de ácido naftalonoacético em NaOH; 2,5 mg/L de ácido abscísico em etanol; 1 mg/L de 6-benzilaminopurina; 250 mg/L de Carbenicilina; 2,5 gm/L de GELZAN™; e 0,181 mg/L de Haloxifop ácido; em pH 5,8. As placas foram armazenadas em caixas transparentes e incubadas a 27Ό com luz contínua a aproximadamente 50 pmol m"2s"1 de PAR durante 7 dias. Regenerando, calos foram em seguida transferidos (<6/placa) para Meio de Regeneração em PHYTATRAYS™ (SIGMA-ALDRICH) e incubadas a 28*C com 16 horas de luz/8 horas de escuro por dia (em aproximadamente 160 pmol m"2s"1 de PAR) durante 14 dias ou até brotos e raízes desenvolverem-se. Meio de Regeneração continha 4,33 gm/L de sais de MS; 1X Vitaminas MS Modificadas por ISU; 60 gm/L de sacarose; 100 mg/L de mio-inositol; 125 mg/L de Carbenicilina; 3 gm/L de goma GELLAN™; e 0,181 mg/L de R-Haloxifop ácido; em pH 5,8. Pequenos brotos com raízes primárias foram em seguida isoladas e transferidas para Meio de Prolongamento sem seleção. Meio de Prolongamento continha 4,33 gm/L de sais de MS; 1X Vitaminas MS Modificadas por ISU; 30 gm/L de sacarose; e 3,5 de gm/L GELRITE™: em pH 5,8.
[00268] Brotos de plantas transformadas selecionados quanto à sua capacidade de se desenvolver em meio contendo Haloxifop foram transplantados de PHYTATRAYS™ para pequenos potes preenchidos com meio de crescimento (PROMIX BX; PREMIER TECH HORTICULTURE), cobertos com copos ou HUMI-DOMES (ARCO PLASTICS), e em seguida endurecido em uma câmara de crescimento CONVIRON (27Ό de dia^O de noite, Fotoperíodo de 16 horas, 50 a 70% de RH, 200 pmol m'2s'1 de PAR). Em alguns casos, mudas transgênicas putativas foram analisadas quanto ao número de cópia relativo ao transgene por ensaio de PCR de tempo real quantitativo usando iniciadores designados para detectar o gene herbicida de tolerância a AAD1 integrado no genoma do milho. Além disso, ensaios de qPCR foram usados para detectar a presença de sequência ligante/ou alvo em transformantes putativos. Mudas transformadas selecionadas foram em seguida movidas para uma estufa para novo crescimento e teste.
[00269] Transferência e estabilidade de plantas de Tn na estufa para bioensaios e produção de sementes. Quando plantas alcançaram a etapa V3-V4, elas foram transplantadas em mistura de solo IE CUSTOM BLEND (PROFILE/METRO MIX 160) e desenvolvidas para floração na estufa (Tipo de Exposição à Luz: Foto ou Assimilação; Limite de Alta Luz: 1200 PAR; tempo diário de 16 horas; 27Ό de dia^lC de noite).
[00270] Plantas para serem usadas para bioensaios de insetos foram transplantadas de pequenos potes para TINUS™ 350-4ROOTRAINERS® (SPENCER-LEMAIRE INDUSTRIES, Acheson, Alberta, Canadá) (uma planta por evento perROOTRAINER®). Aproximadamente quatro dias após transplante para ROOTRAINERS®, plantas foram infestadas para bioensaios.
[00271] Plantas da geração T-i foram obtidas polinizando a seda de plantas transgênicas de T0 com pólen coletado de plantas de linhagem Β104 inata de nata não transgênica ou outros doadores de pólen apropriados, e plantando as sementes resultantes. Cruzamentos recíprocos foram realizados quando possível. EXEMPLO 7 Análises Moleculares de Tecidos de Milho Transaênico [00272] Análises Moleculares (por exemplo RT-qPCR) de tecidos de milho foram realizadas em amostras de folhas coletadas de plantas de crescimento em estufa nos mesmos dias que o dano de alimentação de raiz é avaliado.
[00273] Resultados dos ensaios de RT-qPCR para o Per5 3'UTR foram usados para validar expressão dos transgenes. Resultados de ensaios RT-qPCR para sequência ligante (que é essencial para a formação de moléculas tipo grampo de cabelo de dsRNA) em RNAs expresso foram usados para validar a presença de transcrições de grampo de cabelo. Níveis de expressão de RNA do transgene foram medidos quanto aos níveis de RNA de um gene de milho endógeno.
[00274] Análises de DNA qPCR para detectar uma porção do AAD1 codificando região no DNA genômico foram usadas para estimar número de cópia de inserção de transgene. Amostras para estas análises foram coletadas de plantas cultivadas em câmaras ambientais. Resultados foram comparados aos resultados de DNA qPCR de ensaios designados para detectar uma porção de um gene nativo de cópia única, e eventos simples (tendo uma ou duas cópias de transgenes rpL40) foram avançado para estudos adicionais na estufa.
[00275] Adicionalmente, ensaios qPCR designados para detectar uma porção do gene de resistência a espectinomicina (SpecR; alojado nos plasmídeos de vetor binário fora do T-DNA) foram usados para determinar se as plantas transgênicas continham sequências de estrutura principal de plasmídeo integrado estranho.
[00276] Nível de expressão da transcrição de RNA: aPCR alvo. Eventos de células com calos ou plantas transgênicas foram analisados por PCR de tempo real quantitativo (qPCR) da sequência alvo para determinar o nível de expressão relativo da transcrição grampo de cabelo de tamanho natural, quando comparado ao nível de transcrição de um gene de milho interno ( SEQ ID NO:67; Acessão GENBANK No. BT069734), que codifica uma proteína tipo TIP41 (isto é, um milho homólogo de Acessão GENBANK No. AT4G34270; tendo um escore tBLASTX de 74% de identidade). RNA foi isolado usando um Norgen BioTek Total RNA Isolation Kit (Norgen, Thorold, ΟΝ). O RNA total foi submetido à um tratamento On Column DNasel de acordo com o protocolo sugerido pelo kit. O RNA foi em seguida quantificado em um espectômetro NANODROP 8000 (THERMO SCIENTIFIC) e concentração foi normalizada para 50ng/pL. cDNA de primeira fita foi preparado usando um HIGH CAPACITY cDNA SYNTHESIS KIT (INVITROGEN) em um volume de reação de 10 pL com 5 pL RNA desnaturado, substancialmente de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante. O protocolo foi modificado levemente para incluir a adição de 10 pL de 100 pM oligonucleotídeo T20VN (IDT) ( SEQ ID NO:68; TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN, em que V é A, C, ou G, e N é A, C, G, ou T/U) no tubo de 1 mL de mistura estoque de iniciador aleatória, a fim de preparar um estoque de trabalho de iniciadores aleatórios combinados e oligo dT.
[00277] Seguindo sínteses de cDNA, amostras foram diluídas 1:3 com água livre de nuclease, e armazenadas a -20^ até serem avaliadas.
[00278] Ensaios de PCR de tempo real separados para o gene alvo e transcrição de tipo TIP41 foram realizados em um LIGHTCYCLER™ 480 (ROCHE DIAGNOSTICS, Indianapólis, IN) em 10 pL de volumes de reação. Para o ensaio do gene alvo, reações foram realizadas com Iniciadores rpl40 (F) (SEQ ID NO:69) e rpl40(R) ( SEQ ID NO:70), e uma sonda IDT Custom Oligo rab5 PRB Set1, rotulado com FAM e duplamente saciado com saciadores Zen e lowa Black (SEQ ID NO:111). Para o ensaio de gene de referência tipo TIP41, iniciadores TIPmxF ( SEQ ID NO:71) e TIPmxR ( SEQ ID NO:72), e sonda HXTIP (SEQ ID NO:73) rotulados com HEX (hexaclorofluoresceína) foram usados.
[00279] Todos os ensaios incluíram controles negativos de nenhum padrão (apenas mistura). Para as curvas padrões, um intervalo (água em cavidade de fonte) foi também incluído na placa fonte para checar a contaminação cruzada de amostra. Sequências iniciadoras e de sonda são estabelecidas na Tabela 6. Fórmulas de componentes de reação para detecção das várias transcrições são divulgadas na Tabela 7, e condições de reações de PCR são resumidas na Tabela 8. A quantidade fluorescente de FAM (6-Carboxi Fluorescein Amidite) foi excitada a 465 nm e fluorescência foi medida a 510 nm; o valor correspondente para a quantidade fluorescente de HEX (hexaclorofluoresceína) foram 533 nm e 580 nm.
Tabela 6. Sequências de oligonucleotídeos para análises moleculares de níveis de transcrição em milho transgênico. *proteína tipo TIP41.
Tabela 7. Fórmulas de reação de PCR para detecção de transcrição.
Tabela 8. Condições de termociclizador para RNA qPCR.
[00280] Dados foram analisados usando LIGHTCYCLER™ Software v1.5 por quantificação relativa usando um segundo algoritmo máximo derivado para cálculo de valores de Cq de acordo com recomendações dos fornecedores. Para análises de expressão, valores de expressão foram calculados usando o método AACt (isto é, 2-(Cq TARGET - Cq REF)), que se baseia na comparação de diferenças de valores de Cq entre dois alvos, com o valor de base 2 sendo selecionado sob a admissão de que, para reações PCR otimizadas, o produto duplica-se a cada ciclo.
[00281] Tamanho e integridade da transcrição: Northern Blot Assav. Em alguns casos, caracterização molecular adicional das plantas transgênicas é obtida pelo uso de Análise de Northern Blot (mancha de RNA) para determinar o tamanho molecular do RNA tipo grampo de cabelo rpL40 em plantas transgênicas expressando um dsRNA rpL40.
[00282] Todos os materiais e equipamentos são tratados com RNAZAP (AMBION/INVITROGEN) antes de usar. Amostras de tecido (100 mg a 500 mg) são coletadas em tubos SAFELOCKEPPENDORF de 2 mL, interrompidas com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIAMANUFACTURING, Visalia, CA) com três contas de tungstênio em 1 mL de TRIZOL (INVITROGEN) durante 5 minutos, em seguida incubadas em temperatura ambiente (TA) durante 10 minutos. Opcionalmente, as amostras são centrifugadas durante 10 minutos a 4Ό em 11,000 rpm e o sobrenadante é transferido para um tubo fresco SAFELOCKEPPENDORF de 2 mL. Após 200 pL de clorofórmio ser adicionado ao homogeneizado, o tubo é misturado por inversão durante 2 a 5 minutos, incubado em TA durante 10 minutos, e centrifugado a 12,000 x g durante 15 minutos a 4*0. A fase superior é transferida para um tubo estéril de 1,5 mL EPPENDORF, 600 pL de isopropanol a 100% são adicionados, seguido por incubação em TA durante 10 minutos a 2 horas, e em seguida centrifugados a 12,000 x g durante 10 minutos a 4o a 25*C. O sobrenadante é descartado e o pélete de RNA é lavado duas vezes com 1 mL de etanol a 70%, com centrifugação a 7,500 x g durante 10 minutos a 4Ό a 25Ό entre banhos. O etanol é descartado e o pélete é brevemente secado ao ar durante 3 a 5 minutos antes de ser resuspenso em 50 pL de água livre de nuclease.
[00283] RNA total é quantificado usando o NANODROP8000® (THERMO-FISHER) e amostras são normalizadas para 5 pg/10 pL. 10 pL de glioxal (AMBION/INVITROGEN) são em seguida adicionados em cada amostra. Cinco a 14 ng de mistura marcadora padrão DIG RNA (ROCHE APPLIED SCIENCE, Indianapólis, IN) são dispensados e adicionados em um volume igual de glioxal. Amostras e marcadores de RNAs são desnaturados a 50Ό durante 45 minutos e armazenadas sobre gelo até carregamento em um gel de agarose SEAKEMGOLD a 1,25% (LONZA, Allendale, NJ) em tampão de execução de 10 X glioxal NORTHERN MAX (AMBION/INVITROGEN). RNAs são separados por eletroforese a 65 volts/30 mA durante 2 horas e 15 minutos.
[00284] Após eletroforese, o gel é enxaguado em 2X SSC durante 5 minutos e imageado com uma estação GEL DOC (BIORAD, Hercules, CA), em seguida o RNA é passivamente transferido para uma membrana de nylon (MILLIPORE) durante a noite a TA, usando 10X SSC como o tampão de transferência (20X SSC consiste em cloreto de sódio a 3 M e 300 mM de citrato de trisódio, pH 7,0). Após a transferência, a membrana é enxaguada em 2X SSC durante 5 minutos, o RNA é reticulado por UV para a membrana (AGILENT/STRATAGENE), e a membrana é deixada secar em TA por até 2 dias.
[00285] A membrana é pré-hibridizada em tampão ULTRAHYB (AMBION/INVITROGEN) durante 1 a 2 horas. A sonda consiste em um produto amplificado de PCR contendo a sequência de interesse, rotulado com digoxigenina por meio de um procedimento ROCHE APPLIED SCIENCE DIG. Hibridização em tampão recomendado é durante a noite em uma temperatura de 60Ό em tubos de hibridização. Após hibridização, a mancha é submetida a lavagens DIG, envolvida, exposta à película durante 1 a 30 minutos, em seguida a película é desenvolvida, todos por métodos recomendados pelo fornecedor do kit DIG.
[00286] Determinação de número de cópia de Transaene. Pedaço de folha de milho aproximadamente equivalentes a 2 punções de folhas foram coletadas em placas de coleção 96 cavidades (QIAGEN). Rompimento de tecido foi realizado com um pulverizador de tecido KLECKO™ (GARCIA MANUFACTURING, Visalia, CA) em tampão de lise BIOSPRINT96 AP1 (fornecido com um BIOSPRINT96 PLANT KIT; QIAGEN) com uma conta de aço inoxidável. Após maceração de tecido, DNA genômico (gDNA) foi isolado em formato alta produtividade usando um BIOSPRINT96 PLANT KIT e um robô de extração BIOSPRINT96. DNA genômico foi diluído 1:3 DNA:água antes de estabelecer a reação qPCR.
[00287] Análises de gPCR. Detecção de transgene por ensaio de sonda de hidrólise foi realizada por PCR de tempo real usando sistema LIGHTCYCLER®480. Oligonucleotídeos usados em ensaios de sonda de hidrólise para detectar o gene alvo, a sequência ligante (por exemplo, o loop), ou para detectar uma porção do SpecRgene (isto é o gene de resistência a espectinomicina suportado nos plasmídeos de vetor binário; SEQ ID NO:74; SPC1 oligonucleotídeos na Tabela 9), foram designados usando LIGHTCYCLER® PROBE DESIGN SOFTWARE 2.0. Além disso, oligonucleotídeos usados ensaios de sonda de hidrólise para detectar um segmento do AAD-1 tolerância a herbicida gene (SEQ ID NO:75; GAAD1 oligonucleotídeos na Tabela 9) foram designados usando software PRIMER EXPRESS (APPLIED BIOSYSTEMS).Tabela 9 mostra as sequências do iniciadores e sondas. Ensaios foram multiplexados com reagentes para um gene cromossômico de milho endógeno (Invertase (SEQ ID NO:76; Acessão GENBANK No: U16123; referido aqui como IVR1), que serviu como uma sequência de referência interna para assegurar que gDNA estava presente em cada ensaio. Para amplificação, LIGHTCYCLER®480 PROBES MASTER mix (ROCHE APPLIED SCIENCE) foi preparado em 1x concentração final em um 10 pL de reação multiplexa de volume contendo 0,4 μΜ de cada iniciador e 0,2 pM de cada sonda (Tabela 10). Uma reação de amplificação de duas etapas foi realizada como delineado na Tabela 11. Ativação de fluoroforo e emissão para sondas rotuladas por FAM e HEX foram como descrito acima; conjugados de CY5 foram excitados maximamente a 650 nm e fluorescência máxima a 670 nm.
[00288] Escores de Cp (o ponto no qual o sinal de fluorescência cruza o limiar de base) foram determinados dados de PCR de tempo real usando o algoritmo de pontos de ajuste (LIGHTCYCLER® SOFTWARE release 1,5) e o módulo de quantidade relativa (com base no método MCt). Os dados foram manipulados como descrito previamente (acima; RNA qPCR).
Tabela 9. Sequências de iniciadores e sondas (com conjugado fluorescente) para determinação de número de cópia de gene e detecção de estrutura principal de plasmídeo de vetor binário. CY5 = Cianina-5 Tabela 10. Componentes de Reação para análises de número de cópia de gene e detecção de estrutura principal de plasmídeo. *ΝΑ = Não Aplicável **ND = Não Determinado Tabela 11. Condições de Termociclizador para qPCR de DNA EXEMPLO 8 Bioensaio de Milho Transaênico [00289] Bioensaios de Inseto In vitro. Bioatividade de dsRNA da invençção objeto produzida em células vegetais é demonstrada por métodos de bioensaio. Veja, por exemplo, Baum et al. (2007) Nat. Biotechnol. 25(11):1322-1326. Alguém é capaz de demonstrar a eficácia, por exemplo, alimentando vários tecidos de planta ou pedaços de tecido derivados de uma planta produzindo um dsRNA inseticida para alvejar insetos em um ambiente de alimentação controlada. Alternativamente, extratos são preparados de vários tecidos de planta derivados de uma planta que produz o dsRNA inseticida e os ácidos nucleicos extraídos são dispensados no topo de dietas artificiais para bioensaios como previamente descrito aqui. Os resultados de tais ensaios de alimentação são comparados a bioensaios similarmente conduzidos que empregam tecidos de plantas hospedeiras de tais ensaios de alimentação são comparados a bioensaios similarmente conduzidos que empregam tecidos de controle apropriados de plantas hospedeiras que não produzem um dsRNA inseticida, ou a outras amostras de controle.
[00290] Bioensaios de Inseto com Eventos de Milho Transaênico. Duas larvas da raiz do milho ocidental (1 a 3 dias de idade) eclodidas de ovos lavados são selecionadas e colocadas em cada cavidade da bandeja de bioensaio. As cavidades são então cobertas com uma cobertura de aba "PULL N’ PEEL" (BIO-CV-16, BIO-SERV) e colocadas em uma incubadora a 280 com um ciclo de 18 hr/6 hr de luz/escuro. Nove dias depois a infestação inicial, as larvas são avaliadas quanto à mortalidade, que é calculada como a percentagem de insetor mortos do número total de insetos em cada tratamento. As amostras de inseto são congeladas a -200 durante dois dias, em seguida as larvas de inseto de cada tratamento são agrupadas e pesadas. O percentual de inibição de crescimento é calculado como o peso médio dos tratamentos experimentais divididos pela média do peso médio de dois tratamentos de cavidade de controle. Os dados são expressos como uma Inibição de Crescimento Percentual (dos Controles Negativos). Pesos médios que excederam o peso mormalizados para zero.
[00291] Bioensaios de Inseto na Estufa. Ovos de larva da raiz do milho ocidental (WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte) foram recebidas no solo de CROP CHARACTERISTICS (Farmington, MN). Ovos de WCR foram incubados a 280 durante 10 a 11 dias. Os ovos foram lavados do solo, colocados em uma solução de ágar a 0,15%, e a concentração foi ajustada para aproximadamente 75 a 100 ovos por alíquota de 0,25 ml_. Uma placa de escotilha foi fixada em uma placa de Petri com uma alíquota de suspensão de ovo para monitorar as taxas de eclosão.
[00292] O solo em torno das plantas de milho cultivadas em ROOTRAINERS® foi infestado com 150 a 200 ovos de WCR. Os insetos foram deixados alimentar-se durante 2 semanas, tempo após o qual uma "Classificação de Raiz" foi dada a cada planta. Uma Escala Nó-Lesão foi utilizada para classificação essencialmente de acordo com Oleson et ai (2005, J. Econ. Entomol. 98:1-8). Plantas que passaram por este bioensaio fom transplantadas para potes de 5 galões para produção de semente. As plantas foram tratadas com inseticida para impedir outro dano de larva de raiz e liberação de inseto nas estufas. As plantas foram polinadas manualmente para produção de semente. As sementes produzidas por estas plantas foram salvas para avaliação no Ti e subsequentes gerações de plantas.
[00293] Plantas de controle negativo transgênicas foram geradas por transformação com vetores alojando genes designados para produzir uma Proteína Fluorescente Amarela (YFP). Os bioensaios foram conduzidos com controles negativos incluídos em cada grupo de materiais de planta.
Tabela 12. Classificação de Dano à Raiz com base no bioensaio de estufa e resultados de nível de expressão de transcrição relativa de plantas de milho expressando rp!40 e plantas de controle de YFP. 00294] A medição de dsRNA com relação ao gene de referência endógeno (proteína tipo TIP-41) varia de 0,063 a 5,205. As classificações de raiz não foram significantemente diferentes de controles de YFP. Os níveis de expressão relativos destes constructos podem ser insuficientes para fornecer proteção à raiz. EXEMPLO 9 Zea mavs Transaênico Compreendendo Sequências de Peste de Coleóptero [00295] Dez a 20 plantas Zea mays T0 transgênicas são geradas como descrito no EXEMPLO 6. Mais 10 a 20 linhagens independentes de TiZea mays expressando dsRNA tipo grampo de cabelo para um constructo de RNAi são obteníveis para desafio de larva da raiz do milho. dsRNA tipo grampo de cabelo pode ser derivado compreendendo toda ou parte de SEQ ID NOs: 1, 3, e 5. dsRNAs tipo grampo de cabelo adicionais podem ser derivados, por exemplo, de sequências de peste de coleóptero tais como, por exemplo, Caf1-180 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0174258), VatpaseC (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0174259), Rho1 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0174260), VatpaseH (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2012/0198586), PPI-87B (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2013/0091600), RPA70 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2013/0091601), RPS6 (Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2013/0097730), ROP (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/577.811), RNA polimerase 11140 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/577.854), RNA polimerase 11 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133.214), RNA polimerase 11-215 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133.202), RNA polimerase 33 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/133.210), nem (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/095487), Dre4 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 14/705.807), COPI alfa (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063.199), COPI beta (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063.203), COPI gama (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063.192), ou COPI delta (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/063.216), spt5 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/168.613), e spt6 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 62/168.606). Estes são confirmados por meio de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular.
[00296] Preparações de RNA total de linhagens T-i independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para se ligar no ligante do cassete de expressão tipo grampo de cabelo em cada um dos constructos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado requerido para a produção de siRNA em planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA gampo de cabelo em cada planta Zea mays transgênica. Processamento do grampo de cabelo de dsRNA dos genes alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de mancha de RNA.
[00297] Além disso, moléculas de RNAi tendo sequências de incompatibilidade com mais do que 80% de identidade de sequência para genes alvo afetam as larvas da raiz do milho de um modo similar àquele mostrado com moléculas de RNAi tendo 100% de identidade de sequência para os genes alvo. O pareamento de sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA tipo grampo de cabelo no mesmo constructo de RNAi libera siRNAs processados de planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de alimentação de peste de coleópteros.
[00298] Liberação em planta de dsRNA, siRNA ou miRNA correspondendo aos genes alvo e a subsequente captação por peste de coleópteros através da alimentação resulta em sub-regulação dos genes alvo em uma peste de coleóptero através do silenciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento, e reprodução da peste de coleóptero é afetado, e no caso de pelo menos um WCR, NCR, SCR, MCR, D. balteata LeConte, D. u. tenella, e D. u. undecimpunctata Mannerheim, leva à falência de bem sucedidamente infestar, alimentar-se, desenvolver-se, e/ou reproduzir-se, ou leva à morte da peste de coleóptero. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então usadas para controlar peste de coleópteros.
[00299] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transaênicas e Zea mavs não transformadas. Genes alvo de peste de coleóptero ou sequências selecionadas para criar dsRNA tipo grampo de cabelo não têm nenhuma similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecido. Portanto, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por constructos alvejando estes genes ou sequências de peste de coleóptero tenha qualquer efeito prejudicial sobre plantas transgênicas. Entretanto, características de desenvolvimento e morfológicas de linhagens transgênicas são comparadas com plantas não transformadas, bem como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene de expressão de grampo de cabelo. Raiz de planta, broto, folhagem e características de reprodução são comparadas. Características de broto de planta tal como altura, número e tamanho de folhas, tempo de floração, tamanho do floral e aparência são registradas. Em geral, não existe nenhuma diferença mnorfológica observável entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas alvo de iRNA quando cultivadas in vitro e em solo na estufa. EXEMPLQ10 Zea mavs transaênico compreendendo uma sequência de peste de coleóptero e constructos adicionais de RNAi [00300] Uma planta Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo, exceto uma peste de coleóptero é secundariamente transformada por meio de metodologias de Agrobactéria ou WHISKERS™ (veja Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas inseticidas de dsRNA (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5). Vetores de plasmídeo de transformação de planta preparados essencial mente como descrito no EXEMPLO 4 são liberados por meio de métodos de transformação mediada por agrobactéria ou WHISKERS™ em células de suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos de uma planta transgênica Hi II ou B104 Zea mays compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo exceto uma peste de coleóptero. EXEMPLO 11 Transaenic Zea mavs Compreendendo um constructo de RNAi e Sequências de Controle de Peste de coleóptero Adicionais [00301] Uma planta Zea mays transgênica compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja um organismo de peste de coleóptero (por exemplo, pelo menos uma molécula de dsRNA incluindo uma molécula de dsRNA alvejando um gene compreendendo SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5) é secundariamente transformada por meio de metodologias de agrobactéria ou WHISKERS™ (veja Petolino e Arnold (2009) Methods Mol. Biol. 526:59-67) para produzir uma ou mais moléculas de proteína inseticida, por exemplo, proteínas inseticidas Cry3 ou Cry34/Cry35Ab1. Vetores de plasmídeo de transformação de planta preparados essencialmente como descrito in EXEMPLO 4 são liberados por meio de métodos de transformação mediados por Agrobactéria ou WHISKERS™ em células de suspensão de milho ou embriões de milho imaturos obtidos de uma planta transgênica B104 Zea mays compreendendo uma sequência de codificação heteróloga em seu genoma que é transcrita em uma molécula de iRNA que alveja uma peste de organismo de coleóptero. Planta duplamente transformadas são obtidas que produzem moléculas de iRNA e proteínas inseticidas para controle de peste de coleópteros. EXEMPLO 12 Mortalidade de Perceveio-fedorento Marrom Neotropical (Euschistus heros) seguindo iniecão de RNAi de roL40 [00302] Colônia de Perceveio-fedorento Marrom Neotropical (BSB: Euschistus heros). BSB foram criados em uma incubadora a 27Ό, a 65% de umidade relativa, com ciclo de 16:8 horas luz:escuro. Um grama de ovos coletados durante 2 a 3 dias foram semeados em recipientes de 5L com discos de papel filtro na base; os recipientes foram cobertos com malha #18 para ventilação. Cada recipiente de criação produziu aproximadamente 300 a 400 BSB adultos. Em todos os estágios, os insetos foram alimentados com feijões verdes frescos três vezes por semana, um sachê de mistura de semente que continha sementes de girassol, sojas, e amendoins (3:1:1 por relação de peso) foi substituído uma vez por semana. Agua foi suplementada em frasconetes com tampões de algodão como pavios. Após as duas semanas iniciais, os insetos foram transferidos sobre novo recipiente uma vez por semana.
[00303] Dieta artificial BSB. Dieta artificial BSB preparada como segue (usada dentro de duas semanas de preparação). Feijões verdes liofilizados foram misturados em um pó fino em um misturador MAGIC BULLET® enquanto os amendoins brutos (orgânicos) foram misturados em um misturador MAGIC BULLET®. Os ingrediente secos misturados foram combinados (percentagens de peso: feijos verdes, 35%; amendoins, 35%; sacarose, 5%; complexo de Vitamina (por exemplo mistura de vitamina Vanderzant para insetos, SIGMA-ALDRICH, Catálogo No. V1007), 0,9%); em um grande misturador MAGIC BULLET®, que foi tampado e bem agitado para misturar os ingredientes. Os ingredientes secos misturados foram em seguida adicionados a uma tigela de mistura. Em um recipiente separado, água e agente antifúngico benomil (50 ppm; 25 pL de uma solução a 20,000 ppm/50 mL de solução de dieta) foram bem misturados e em seguida adicionados à mistura de ingrediente seco. Todos os ingredientes foram misturados manualmente até a solução ser totalmente misturada. A dieta foi modelada em tamanhos desejados, envolta frouxamente em folha fina de alumínio, aquecida durante 4 horas a 60Ό, em seguida resfriada e armazenada a 4Ό.
[00304] Montagem de transcriptoma de BSB. Seis estágios de desenvolvimento de BSB foram selecionados para separação de biblioteca de mRNA. RNA total foi extraído de insetos congelados a -70Ό e homogeneizado em 10 volumes de Tampão de Lise/Ligação em Lysing MATRIX em tubos de 2 mL (MP BIOMEDICALS, Santa Ana, CA) em um Instrumento FastPrep®-24 (MP BIOMEDICALS). mRNA total foi extraído usando um mirVana™ miRNA Isolation Kit (AMBION; INVITROGEN) de acordo com o protocolo do fabricante. Sequenciamento de RNA usando um illumina® HiSeq™ system (San Diego, CA) forneceu sequências de gene alvo candidatas para uso em tecnologia de controle de inseto de RNAi. HiSeq™ gerou um total de cerca de 378 milhões de leituras para as seis amostras. As leituras foram agrupadas individualmente para cada amostra usando o software TRINITY assembler (Grabherr et al. (2011) Nature Biotech. 29:644-652). A transcrições agrupadas foram combinadas para gerar um transcriptoma agrupado. Este transcriptoma agrupado de BSB contém 378.457 sequências.
[00305] Identificação de ortóloao de BSB roL40. Uma pesquisa tBLASTn do transcriptoma agrupado de BSB foi realizada usando como a isoforma de proteína DrosophilarpL40 sequências A e B: Acessão GENBANK Nos. NP_476776 e NP_001260018. BSB rpL40 ( SEQ ID NO:89) foi identificado como um produto de gene alto candidato de Euschistus heros com sequência de peptídeo predita SEQ ID NO:90.
[00306] Preparação Padrão e Síntese de dsRNA. cDNA foi preparado de RNA de BSB total extraído de um único inseto adulto jovem (cerca de 90 mg) usando Reagente TRIzol® (LIFE TECHNOLOGIES). O inseto foi homogeneizado em temperatura ambiente em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL com 200 pL de TRIzol® usando um pilão de pélete (FISHERBRAND Catálogo No. 12-141-363) e Pestle Motor Mixer (COLE-PARMER, Vernon Hills, IL). Após a homogeneização, um adicional de 800 pL de TRIzol® foi adicionado, o homogeneizado foi agitado em vórtex, e em seguida incubado em temperatura ambiente durante cinco minutos. Resíduos celulares foram removidos por centrifugação e o sobrenadante foi transferido para um novo tubo. Seguindo o protocolo de extração TRIzol® recomendado pelo fabricande para 1 mL de TRIzol®, o pélete de RNA foi secado em temperatura ambiente e ressuspenso em 200 pL de Tampão de Tris de um GFX PCR DNA AND GEL EXTRACTION KIT (lllustra™; GE HEALTHCARE LIFE SCIENCES) usando Tampão de Eluição Tipo 4 (isto é Tris-HCI a 10 mM, pH 8,0). Concentração de RNA foi determinada usando um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 (THERMO SCIENTIFIC, Wilmington, DE).
[00307] Amplificação de cDNA. cDNA foi transcrito reverso de 5 pg de padrão de RNA total de BSB e iniciador oligo dT usando um SUPERSCRIPT III FIRST-STRAND SYNTHESIS SYSTEM™ para RT-PCR (INVITROGEN), seguindo o protocolo recomendado pelo fornecedor. O volume final da reação de transcrição foi trazido para 100 pL com água livre de nuclease.
[00308] Iniciadores BSB_rpL40-1-For (SEQ ID NO:93) e BSB_rpL40-í-Rev (SEQ ID NO:94) foram usados para amplificar BSB_rpL40 região 1, também referido como padrão BSB_rpL40reg1. 0 padrão de DNA foi amplificado por PCR touch-down (temperatura de recozimento reduzida de 60Ό para 50“Ο em um decrés cimo de 1 IC/ciclo) com 1 pL de cDNA (acima) como o padrão. Um fragmento compreendendo um segmento de 410 bp de BSB_rpL40 regí ( SEQ ID NO:91) foi gerado durante 35 ciclos de PCR. O procedimento acima foi também usado para amplificar um padrão de controle negativo de 301 bp YFPv2 ( SEQ ID NO:95) usando os iniciadores YFPv2-F (SEQ ID NO:96) e YFPv2-R ( SEQ ID NO:97). Os iniciadores BSB_rpL40 e YFPv2 continham um promotor de sequência de fago T7 ( SEQ ID NO: 16) em suas extremidades 5', e desse modo possibilitaram o uso dos fragmentos de YFPv2 e BSB_rpL40 DNA para a transcrição de dsRNA.
[00309] Síntese de dsRNA. dsRNA foi sintetizado usando 2 pl_ de produto de PCR (acima) como o padrão com um MEGAscript™ RNAi kit (AMBION) usado de acordo com as instruções do fabricante. (Veja a FIGURA 1). dsRNA foi quantificado em um espectrofotômetro NANODROP™ 8000 e diluído para 500 ng/pL em Tampão 0,1X TE livre de nuclease (1 mM de Tris HCL, 0,1 mM de EDTA, pH 7,4).
[00310] Iniecão de dsRNA em BSB hemoceol. BSB foi criado em um feijão verde e dieta de semente, como a colônia, em uma incubadora a 27Ό a 65% de umidade relativa e fotoperíodo de 16:8 horas de luz:escuro. Ninfas de segundo instar (cada uma pesando 1 a 1,5 mg) foram suavemente manipuladas com uma pequena escova para impedir lesão e foram colocadas em uma placa de Petri sobre gelo para resfriar e imobilizar os insetos. Cada inseto foi injetado com 55,2 nL de uma solução de 500 ng/pL de dsRNA (isto é 27,6 ng de dsRNA; dosagem de 18,4 a 27,6 pg/g de peso corporal). As injeções foram realizadas usando um Injetor NANOJECT™ II (DRUMMOND SCIENTIFIC, Broomhall, PA) equipado com uma agulha de injeção puxada de capilar de vidro Drummond 3,5 polegadas #3-000~203-G/X. A ponta da agulha foi quebrada e o capilar foi enchido com óleo mineral leve, em seguida enchido com 2 a 3 pL de dsRNA. dsRNA foi injetado no abdômen das ninfas (10 insetos injetados por dsRNA por experiência), e as experiências foram repetidas em três dias diferentes. Os insetos injetados (5 por cavidade) foram transferidos para bandejas de 32 cavidades (Bandeja de Criação Bio-RT-32; BIO-SERV, Frenchtown, NJ) contendo um pélete de dieta BSB artificial e cobertos com abas Pull-N- Peel™ (BIO-CV-4; BIO-SERV). A umidade foi fornecida por meio de 1,25 mL de água em um tubo microcentrífugo de 1,5 mL com um pavio de algodão. As bandejas foram incubadas a 26,5°C, 60% de umidade e fotoperíodo de 16: 8 horas de luz:escuro. As contagens de viabilidade e pesos foram feitas no dia 7 após as injeções.
[00311] Iniecões identificaram BSB roL40 como um alvo de dsRNA letal. dsRNA que alveja segmento de região de codificação de YFP, YFPv2 foi usado como um controle negativo em experimentos de injeção BSB. Como sumariado na Tabela 13, 27,6 ng de BSB_rpL40 regí dsRNA injetados no hemoceol de ninfas de BSB de segundo instar produziram alta mortalidade em sete dias. A mortalidade causada por dsRNA de BSB_rpL40 regí foi significantemente diferente daquela observada com a mesma quantidade de dsRNA de YFPv2 injetada (controle negativo), com p = 0,00263 (teste t de Student). Tabela 13 Resultados de injeção de dsRNA de BSB_rpL40 regí no hemoceol de ninfas de segundo instar de Percevejo-fedorento Marrom sete dias após a injeção. * Dez injetos injetados por experiência para cada dsRNA. tSEM- Erro Padrão da Média EXEMPLO 13 Zea mavs transaênica Compreendendo Sequências de Peste de Hemíptero [00312] Dez a 20 plantas de T0Zea mays transgênicas alojando vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NOs: 89, 91, e/ou 92 são geradas como descrito no EXEMPLO 7. Mais 10 a 20 linhagens independentes de T^ea mays expressando dsRNA tipo grampo de cabelo para um constructo de RNAi são obtidas para desafio de BSB. dsRNA tipo grampo de cabelo pode ser derivado como mencionado nas SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:92, ou de outro modo também compreendendo SEQ ID NO: 89. Estas são confirmadas por meio de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. Preparações de RNA Total de linhagens Ti independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para se ligar no ligante do cassete de expressão grampo de cabelo em cada um dos constructos de RN Ai. Além disso, iniciadores específicos para cada gene alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar á produção do mRNA pré-processado para produção de siRNA em planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA tipo grampo de cabelo em cada planta Zea mays transgênica. Processamento do dsRNA tipo grampo de cabelo dos genes alvo no siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado nas linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de manchamento de RNA.
[00313] Além disso, moléculas de RNAi tendo sequências de incompatibilidade com mais do que 80% de identidade de sequência para os genes alvo afetam as larvas da raiz do milho de um modo similar àquele observado com moléculas de RNAi tendo 100% de identidade de sequência para os genes alvo. O pareamento de sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA tipo grampo de cabelo no mesmo constructo de RNAi libera siRNAs processados pela planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de pestes de hemípteros de alimentação.
[00314] A liberação em planta de dsRNA, siRNA, shRNA, ou miRNA correspondentes aos genes alvo e a subsequente captação por pestes de hemípteros através da alimentação resulta em sub-regulação dos genes alvo em uma peste de hemíptero por meio do silenciamento de gene mediado por RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento, e reprodução de uma peste de hemíptero são afetados, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus servus deixa de bem sucedidamente infestar, alimentar-se, desenvolver-se, e/ou reproduzir-se, ou leva à morte da peste de hemíptero. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi é então usada para controlar pestes de hemípteros.
[00315] Comparação Fenotípica de Linhagens de RNAi transaênicas e Zea mavs não transformada. Genes de peste de hemíptero alvo ou sequências selecionadas para criar dsRNA tipo grampo de cabelo não têm nenhuma similaridade com qualquer sequência de gene de planta conhecido. Portanto, não se espera que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) RNAi por constructos alvejando estes genes ou sequências de peste de hemíptero tenham qualquer efeito prejudicial sobre plantas transgênicas. Entretanto, desenvolvimento e características morfológicas de linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como aquelas de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene expressando grampo de cabelo. Raiz, broto, folhagem e características de reprodução de planta são comparados. Não existe nenhuma diferença observável em tamanho de raiz e padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. Características de broto de planta tal como altura, números e tamanhos de folha, tempo de floração, tamanho de floral e aparência são similares. Em geral, não existe nenhuma diferença morfológica observável entre linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas alvo de iRNA quando cultivadas in vitro e em solo em uma estufa. EXEMPLO 14 Glicina max Transaênica Compreendendo Sequências de Peste de Hemíptero [00316] Dez a 20 plantas transgênicas T0Glicina alojando vetores de expressão para ácidos nucleicos compreendendo SEQ ID NOs: 89, 91 e/ou 92 são geradas como é conhecido na técnica, incluindo por exemplo, por transformação mediada por agrobactéria, como segue. Sementes de soja madura (Glycine max) são esterilizadas durante a noite com gás de cloro durante dezesseis horas. Após esterilização com gás de cloro, as sementes são colocadas em um recipiente aberto em uma coifa de fluxo para LAMINAR™ para dissipar o gás de cloro. Em seguida, as sementes esterilizadas são embebidas com H20 estéril durante dezesseis horas no escuro usando uma caixa preta a 24V.
[00317] Preparação de soias de semente dividida. A semente de soja dividida compreendendo uma porção de uma preparação requerida pelo protocolo de eixo embriônico de material de semente de soja que é cortado longitudinalmente, usando uma lâmina #10 afixada a um bisturi, ao longo do hilo da semente para separar e remover o revestimento da semente, e para dividir a semente em duas seções de cotilédone. Atenção cuidadosa é tomada para parcialmente remover o eixo embriônico, em que cerca de 1/2 - 1/3 do eixo do embrião permanece ligado à extremidade nodal do cotilédone.
[00318] Inoculacão. As sementes de soja divididas compreendendo uma porção parcial do eixo embriônico são então imersas durante cerca de 30 minutos em uma solução de Agrobacterium tumefaciens (por exemplo, cepa EHA 101 ou EHA 105) contendo plasmídeo binário compreendendo SEQ ID NOs: 89, 91 e/ou 92. A solução de Agrobacterium tumefaciens é diluída para uma concentração final de λ=0,6 OD65o antes de imergir os cotilédones compreendendo o eixo do embrião.
[00319] Co-cultivacão- Após a inoculação, a semende de soja dividida é deixada co-cultivar com a cepa Agrobacterium tumefaciens durante 5 dias em meio de co-cultivação (Wang, Kan. Agrobacterium Protocols. 2. 1. New Jersey: Humana Press, 2006. Print.) em uma placa de Petri coberta com um pedaço de papel filtro.
[00320] Indução de Broto. Após 5 dias de co-cultivação, as sementes de soja divididas são lavadas em meio de Indução de Broto líquido (SI) consistindo em sais B5, vitaminas B5, 28 mg/L Ferrous, 38 mg/L Na2EDTA, 30 g/L sacarose, 0,6 g/L de MES, 1,11 mg/L de BAP, 100 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima, e 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7). As sementes de soja divididas são então cultivadas em meio de Intução de Broto I (SI I) consistindo em sais B5, vitaminas B5, 7 g/L de ágar nobre, 28 mg/L de Ferrous, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose, 0,6 g/L MES, 1,11 mg/L BAP, 50 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina (pH 5,7), com o lado plano do cotilédone virado para cima, e a extremidade nodal do cotilédone embebido no meio. Após 2 semanas de cultura, o explantes da semente de soja dividida transformada são transferidas para o meio de Indução de Broto II (SI II) contendo meio SI I suplementado com 6 mg/L de glufosinato (LIBERTY®).
[00321] Alongamento de Broto. Após 2 semanas de cultura em meio SI II, os cotilédones são removidos dos explantes e uma almofada de broto flush contendo o eixo embriônico é excisada fazendo um corte na base do cotilédone. A almofada de broto isolado do cotilédone é transferida para meio de Alongamento de Broto (SE). O meio SE consiste em sais de MS, 28 mg/L de Ferrous, 38 mg/L de Na2EDTA, 30 g/L de sacarose e 0,6 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de ácido L-piroglutâmico, 0,1 mg/L de IAA, 0,5 mg/L de GA3, 1 mg/L de zeatina ribosídeo, 50 mg/L de TIMENTIN™, 200 mg/L de cefotaxima, 50 mg/L de vancomicina, 6 mg/L de glufosinato, 7 g/L de ágar nobre, (pH 5,7). As culturas são transferidas para meio SE fresco a cada 2 semanas. As culturas são desenvolvidas em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24Ό com um fotoperíodo 18 h em uma intensidade de luz de 80-90 pmol/m2seg.
[00322] Enraizamento. Raízes alongadas que se desenvolveram da almofada de broto de cotilédone são isoladas por corte do broto alongado na base da almofada de broto de cotilédone, e imergindo o broto alongado em 1 mg/L de IBA (ácido 3-butírico de indol) durante 1 a 3 minutos para promover enraizamento. Em seguida, os brotos alongados são transferidos para o meio de enraizamento (sais de MS, vitaminas B5, 28 mg/L de Ferrous, 38 mg/L Na2EDTA, 20 g/L de sacarose e 0,59 g/L de MES, 50 mg/L de asparagina, 100 mg/L de L-ácido piroglutâmico 7 g/L de ágar nobre, pH 5,6) em bandejas de phyta.
[00323] Cultivacão. Seguindo a cultura em uma câmara de crescimento CONVIRON™ a 24*0, fotoperíodo de 18 horas, durante 1 a 2 semanas, os brotos que desenvolveram raízes são transferidos para uma mistura de terra em um copo sundae coberto e colocados em uma câmara de crescimento CONVIRON™ (modelos CMP4030 e CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) sob condições diárias longas (16 horas de luz / 8 horas de escuro) em uma intensidade de luz de 120-150 pmol/m2 seg sob temperatura constante (22Ό) e umidade (40-50%) para aclimatização de mudas. As mudas enraizadas são aclimatadas em copos sundae durante diversas semanas antes de elas serem transferidas para a estufa para outra aclimatização e estabelecimento de plantas de soja transgênicas robustas.
[00324] Outras linhagens independentes de 10-20 T^GIycine max expressando dsRNA tipo grampo de cabelo para um constructo de RNAi são obtidas para desafio de BSB. dsRNA tipo grampo de cabelo pode ser derivado como mencionado nas SEQ ID NOs: 91-92, ou de outro modo também compreendendo a SEQ ID NO:89. Estas são confirmadas por meio de RT-PCR ou outros métodos de análise molecular. Preparações de RNA total de linhagens T-ι independentes selecionadas são opcionalmente usadas para RT-PCR com iniciadores designados para se ligar no ligante do cassete de expressão grampo de cabelo em cada um dos constructos de RNAi. Além disso, iniciadores específicos para cada gene alvo em um constructo de RNAi são opcionalmente usados para amplificar e confirmar a produção do mRNA pré-processado para produção de siRNA em planta. A amplificação das faixas desejadas para cada gene alvo confirma a expressão do RNA tipo grampo de cabelo em cada planta de Glycine max transgênica. Processamento do dsRNA tipo grampo de cabelo dos genes alvo em siRNA é subsequentemente opcionalmente confirmado em linhagens transgênicas independentes usando hibridizações de mancha de RNA.
[00325] Além disso, moléculas de RNAi tendo sequências de incompatibilidade com mais do que 80% de identidade de sequência para genes alvo afetam as larvas da raiz do milho de um modo similar àquele observado com ass moléculas de RNAi tendo 100% de identidade de sequência para os genes alvo. O pareamento de sequência de incompatibilidade com sequências nativas para formar um dsRNA tipo grampo de cabelo no mesmo constructo de RNAi libera siRNAs processados pela planta capazes de afetar o crescimento, desenvolvimento e viabilidade de pestes de hemípteros de alimentação.
[00326] Liberação em planta de dsRNA, siRNA, shRNA, ou miRNA correspondente a genes alvo e a subsequente captação por pestes de hemípteros por meio da alimentação resulta em sub-regulação dos genes alvo em uma peste de hemíptero por meio de silenciamento de gene mediado pelo RNA. Quando a função de um gene alvo é importante em um ou mais estágios de desenvolvimento, o crescimento, desenvolvimento, e reprodução de uma peste de hemíptero são afetados, e no caso de pelo menos um de Euschistus heros, Piezodorus guildinii, Halyomorpha halys, Nezara viridula, Acrosternum hilare, e Euschistus servus deixa de bem sucedidamente infestar, alimentar-se, desenvolver-se, e/ou reproduzir-se, ou levar à morte da peste de hemíptero. A escolha de genes alvo e a aplicação bem sucedida de RNAi são então usadas para controlar pestes de hemípteros.
[00327] Comparação fenotípica de linhagens de RNAi transgênico e genes alvo de peste de hemíptero de Glycine max não transformada ou sequências selecionadas para criar dsRNA tipo grampo de cabelo não têm nenhuma similaridade a qualquer sequência de gene de planta conhecido. Portanto, não é esperado que a produção ou a ativação de RNAi (sistêmico) por constructos alvejando estes genes de peste de hemíptero ou sequências terão efeito prejudicial sobre as plantas transgênicas. Entretanto, desenvolvimento e características morfológicas de linhagens transgênicas são comparados com plantas não transformadas, bem como aqueles de linhagens transgênicas transformadas com um vetor "vazio" não tendo nenhum gene expressando grampo de cabelo. Raiz, broto, folhagem e características de reprodução da planta são comparados. Não existe nenhuma diferença observável em comprimento da raiz e padrões de crescimento de plantas transgênicas e não transformadas. Características de broto de planta, tal como altura, número e tamanho das folhas, tempo de floração, tamanho do floral e aparência são similares. Em geral, não existe nenhuma diferença morfológica entre as linhagens transgênicas e aquelas sem expressão de moléculas alvo de iRNA quando cultivadas in vitro e em terra na estufa. EXEMPLO 15 Bioensaios de E. heros em dieta artificial [00328] Em ensaios de alimentação de dsRNA em dieta artificial, bandejas de 32 cavidades são fixadas com um pélete de ~18 mg de dieta artificial e água, como para os experimentos de injeção (EXEMPLO 12). dsRNA em uma concentração de 200 ng/μΙ é adicionado à amostra de pélete alimentar e água, 100 pl a cada uma das duas cavidades. Cinco ninfas de E. heros de segundo instar são introduzidas em cada cavidade. Amostras de água e dsRNA que alveja a transcrição de YFP são usadas como controles negativos. Os experimentos são repetidos em três dias diferentes. Os insetos sobreviventes são pesados e as taxas de mortalidade são determinadas após 8 dias de tratamento. EXEMPLO 16 Arabidoosis thaliana Transaênico Compreendendo Sequências de Peste de Hemíptero [00329] Vetores de transformação de Arabidopsis contendo um constructo de gene alvo para formação de grampo de cabelo compreendendo segmentos de rpL40 ( SEQ ID NO:89) são gerados usando métodos moleculares padrão similares ao EXEMPLO 4. Transformação de Arabidopsis é realizada usando procedimento com base em agrobactéria padrão. Sementes T<\ são selecionadas com marcador selecionável com tolerância ao glifosinato. Plantas de Arabidopsis transgênica T^ são geradas e plantas homozigotas de única cópia T2 são geradas para estudos de inseto. Bioensaios são realizados em plantas Arabidopsis em crescimento com inflorescências. Cinco a dez insetos são colocados sobre cada planta e monitorados quanto à sobrevivência dentro de 14 dias.
[00330] Construção de vetores de transformação de Arabidoosis. Clones de entrada com base em um vetor de entrada alojando um constructo de gene alvo para formação de grampo de cabelo compreendendo um segmento de rpL40 (SEQ ID NO:89) são agrupados usando uma combinação de fragmentos quimicamente sintetizados (DNA2.0, Menlo Park, CA) e métodos de clonagem molecular padrão. Formação de grampo de cabelo intramolecular por transcrições primárias de RNA é facilitada por disposição (dentro de uma única unidade de transcrição) de duas cópias de um segmento de gene alvo em orientações opostas, os dois segmentos sendo separados por uma sequência ligante (por exemplo, uma alça (tal como SEQ ID NO:112) ou um íntron ST-LS1 (Vancanneyt etal. (1990) Mol. Gen. Genet. 220(2):245-50)). Desse modo, a transcrição de mRNA primária contém duas sequências de segmento de gene rpL40 como grandes repetições invertidas entre si, separadas pela sequência ligante. Uma cópia de um promotor de ubiquitina 10 de Arabidopsis thaliana (Callis et al. (1990) J. Biological Chem. 265:12486-12493) é usada para impulsionar a produção da transcrição grampo de cabelo de mRNA primário, e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de Estrutura de Leitura Aberta 23 de Agrobacterium tumefaciens (AtuORF23 3' UTR v1; Patente dos Estados Unidos No. 5.428.147) é usada para terminar a transcrição do gene expressando RNA tipo grampo de cabelo.
[00331] O clone grampo de cabelo em um vetor de entrada acima é usado em reação de recombinação padrão GATEWAY® com um vetor de destinação binário típico para produzir vetores de transformação de expressão de RNA tipo grampo de cabelo para transformação de Arabidopsis mediada por agrobactéria.
[00332] O vetor de destinação binário compreende uma tolerância a gene herbicida, DSM-2v2 (Pedido de Patente dos Estados Unidos No. 2011/0107455), sob a regulação de um promotor de vírus mosaico de veia Cassava (CsVMV Promotor v2, Patente dos Estados Unidos No. US 7601885; Verdaguer et al, (1996) Plant Molecular Biology, 31:1129-1139). Um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' de Estrutura 1 de Leitura Aberta de Agrobacterium tumefaciens (AtuORFI 3' UTR v6; Huang et al, (1990) J. Bacteriol, 172:1814-1822) é usado para terminar a transcrição do mRNA de DSM2v2.
[00333] Um constructo binária de controle negativo, que compreende um gene que expressa um RNA tipo grampo de cabelo de YFP, é construída por meio de reações de recombinação padrão GATEWAY® com um vetor de destinação binário típico e vetor de entrada. Um constructo de entrada compreende uma sequência tipo grampo de cabelo de YFP (hpYFP v2-1, SEQ ID NO:89) sob o controle de expressão de um promotor de Ubiquitina 10 de Arabidopsis (como acima) e um fragmento compreendendo uma região não transladada 3' ORF23 de Agrobacterium tumefaciens (como acima).
[00334] Produção de Arabidopsis transaênico compreendendo RNAs tipo grampo de cabelo inseticida: transformação mediada por Agrobacterium. Plasmídeos binários contendo sequências de grampos de cabelo são eletroporados em cepa de Agrobacterium GV3101 (pMP90RK). Os clones de Agrobacterium recombinantes são confirmados por análise de restrição das preparações de plasmídeos das colônias de Agrobacterium recombinantes. Um kit máximo de plasmídeo Qiagen (Qiagen, Cat# 12162) é empregado para extrair os plasmídeos de culturas de Agrobacterium após o protocolo de fabricação recomendado.
[00335] Transformação de Arabidopsis e Seleção de Ti. De doze a quinze plantas de Arabidopse (c.v. Columbia) são cultivadas em potes de 4" em uma estufa com intensidade de luz de 250 pmol/m2, 25“0, e 18:6 horas de condições luz:escuro. Os troncos de flor primários são aparados uma semana antes da transformação. Os inóculos de Agrobactéria são preparados incubando-se 10 pl de estoque de glicerol de Agrobactéria recombinante em 100 ml de caldo LB (Sigma L3022) + 100 mg/L de Espectinomicina + 50 mg/L de Kanamicina a 28*C e estimulando a 225 rpm durante 72 horas. As células de Agrobactéria são colhidas e suspensas em 5% de sacarose + 0,04% de Silwet-L77 (Sementes de Lehle Cat # VIS-02) +10 pg/L de solução de benzamino purino (BA) a OD60o 0,8~1,0 antes do mergulho floral. As partes acima do solo de uma planta são imersas na solução de Agrobactéria durante 5-10 minutos, com agitação suave. As plantas são em seguida transferidas à estufa para o crescimento normal com fertilização e rega regular até as sementes se fixarem. EXEMPLO 17 Desenvolvimento e bioensaios de Arabidoosis transaênico.
[00336] Seleção de T^Arabidoosis transformado com constructos de RNAi tipo grampo de cabelo. Até 200 mg de sementes T^ de cada transformação é estratificada em 0,1% de solução de agarose. As sementes são plantadas em bandejas de germinação (10,5" x 21" x 1"; T.O. Plastics Inc., Clearwater, MN.) com meios #5 sunshine. Os transformantes são selecionados para tolerância a Ignite® (glufosinato) a 280 g/ha em 6 e 9 dias após o plantio. Os eventos selecionados são transplantados em potes de 4" diâmetro. A análise de cópia de inserção é realizada em uma semana de transplantagem por meio de hidrólise de PCR em tempo real quantitativa (qPCR) usando Roche LightCycler480. Os iniciadores de PCR e as sondas de hidrólise são designados contra o marcador de DSM2v2 selecionável usando o LightCycler Probe Design Software 2.0 (Roche). As plantas são mantidas a 24Ό, com um fotoperíodo de 16:8 hora luz:escuro sob luzes fluorescentes e incandescentes em intensidade de 100-150 mE/m2xs.
[00337] E. Bioensaio de alimentação de planta heros. Eventos de pelo menos quatro cópias baixas (1-2 inserções), quatro cópias médias (2-3 inserções), e quatro cópias altas (£4 inserções) são selecionados para cada constructo. As plantas são desenvolvidas em um estágio de floração (plantas contendo flores e síliques). A superfície do solo é coberta com ~ 50 ml de volume de areia branca para facilitar a identificação de inseto. De cinco a dez ninfas de E. heros de 2a instar são introduzidas em cada planta. As plantas são cobertas com tubos plásticos que têm 3" de diâmetro, 16" de altura, e com espessura de parede de 0,03" (Item N° 484485, Visipack Fenton MO); os tubos são cobertos com malha de náilon para isolar os insetos. As plantas são mantidas sob temperatura normal, condições de luz e rega em um CONVIRON. Em 14 dias, os insetos são coletados e pesados; a porcentagem de mortalidade bem como a inibição de crescimento (1 - tratamento de peso/controle de peso) são calculadas. As plantas expressando grampo de cabelo YFP são empregadas como controles.
[00338] Geração de semente de ToArabidoosis e bioensaios de lo. As sementes de T2 são produzidas de eventos de cópia baixa selecionados (1-2 inserções) para cada constructo. As plantas (homozigotas e/ou heterozigotas) são submetidas ao bioensaio de alimentação de E. heros, como acima descrito. A semente T3 é colhida de homozigotas e armazenada para futura análise. EXEMPLO 18 Transformação de Espécie de colheita adicional [00339] O algodão é transformado com rpL40 (com ou sem um peptídeo de trânsito de cloroplasto) para fornecer o controle de insetos hemipteranos utilizando-se um método conhecido por aqueles versados na técnica, por exemplo, substancialmente as mesmas técnicas previamente descritas no EXEMPLO 14 da Patente dos Estados Unidos 7.838.733, ou Exemplo 12 da Publicação de Patente Internacional PCT N° WO 2007/053482. EXEMPLO 19 RpL40 dsRNA na Gestão do inseto [00340] Os transgenes de RpL40 dsRNA são combinados com outras moléculas de dsRNA em plantas transgênicas para fornecer RNAi redundante alvejante e os efeitos de RNAi sinergísticos. As plantas transgênicas incluindo, por exemplo, e sem limitação, milho, soja, e algodão expressando dsRNA que alvejam rpL40 são úteis para prevenir o dano de alimentação por insetos coleopteranos e hemipteranos. Os transgenes RpL40 dsRNA são também combinados em plantas com tecnologia de proteína inseticida de Bacillus thuringiensis para representar novos métodos de ação em piramídeos de gene de controle de resistência de inseto. Quando combinado com outras moléculas de dsRNA que alvejam as pestes de inseto, e/ou com proteína inseticida de Bacillus thuringiensis, em plantas transgênicas, um efeito de inseticida sinergístico é observado o qual também mitiga o desenvolvimento das populações de inseto resistentes.
[00341] Ao mesmo tempo que a presente invenção pode ser suscetível a várias modificações e formas alternativas, as modalidades específicas foram descritas, como forma de exemplo, em detalhes aqui. Entretanto, deve ser entendido que não se pretende que a presente invenção seja limitada às formas particulares descritas. De preferência, a presente invenção deve abranger todas as modificações, equivalentes, e alternativas dentro do escopo da presente invenção como definido pelas seguintes reivindicações anexas e seus equivalentes legais.
REIVINDICAÇÕES

Claims (60)

1. Ácido nucleico isolado, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um polinucleotídeo operavelmente ligado a um promotor heterólogo, em que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NOs: 11-15; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NOs: 11-15; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NOs: 11-15; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO:9 ou SEQ ID NOs: 11-15; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO: 10; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO: 10; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO: 10; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NO:10; SEQ ID NO:89; o complemento de SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:89; uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo SEQ ID NO:91 ou SEQ ID NO:92; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo SEQ ID NO:91 ou SEQ ID NO:92; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo SEQ ID NO:91 ou SEQ ID NO:92; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Euschistus compreendendo SEQ ID NO:91 ou SEQ ID NO:92.
2. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:3; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15.
3. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é selecionado dentre o grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, e os complementos de qualquer dos anteriores.
4. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o organismo é selecionado dentre o grupo que consiste em D. v.virgifera LeConte; D. barberi Smith e Lawrence; D. u. howardr, D. v. zeae\ D. balteata LeConte; D. u. tenella; D. speciosa Germar; D. u. undecimpunctata Mannerheim.; Euschistus heros (Fabr.) (Neotropical Percevejo Fedorento Marrom); Nezara viridula (L.) (Percevejo Fedorento Verde do Sul); Piezodorus guildinii (Westwood) (Percevejo Fedorento de Faixa Vermelha); Halyomorpha halys (Stâl) (Percevejo Fedorento Marmorizado Marrom); Chinavia hilare (Say) (Percevejo Fedorento Verde); Euschistus servus (Say) (Percevejo Fedorento Marrom); Dichelops melacanthus (Dallas); Dichelops furcatus (F.); Edessa meditabunda (F.); Thyanta perditor (F.) (Percevejo Fedorento de Ombro Vermelho Neotropical); Chinavia marginatum (Palisot de Beauvois); Horcias nobilellus (Berg) (Percevejo do Algodão); Taedia stigmosa (Berg); Dysdercus peruvianus (Guérin-Méneville)] Neomegalotomus parvus (Westwood); Leptoglossus zonatus (Dallas); Niesthrea sidae (F.); Lygus hesperus (Knight) (Percevejo de Planta Manchado Ocidental); e Lygus lineolaris (Palisot de Beauvois).
5. Vetor de transformação da planta, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
6. Molécula de ácido ribonucleico (RNA), caracterizada pelo fato de que é transcrita do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
7. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla, caracterizada pelo fato de que é produzida a partir da expressão do polinucleotídeo como definido na reivindicação 1.
8. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que contatando a sequência de polinucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero inibe a expressão de uma sequência de nucleotídeo endógena especificamente complementar ao polinucleotídeo.
9. Molécula de ácido ribonucleico de fita dupla, de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que o contato da referida molécula de ribonucleotídeo com um inseto coleóptero ou hemíptero mata ou inibe o crescimento, a viabilidade, e/ou a alimentação do inseto.
10. RNA de fita dupla, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que compreende um primeiro, um segundo e um terceiro segmento de RNA, em que o primeiro segmento de RNA compreende o polinucleotídeo, em que o terceiro segmento de RNA é ligado ao primeiro segmento de RNA pela segunda sequência de polinucleotídeo, e em que o terceiro segmento de RNA é substancialmente o complemento reverso do primeiro segmento de RNA, tal que o primeiro e o terceiro segmentos de RNAs hibridizam quando transcritos em um ácido ribonucleico para formar o RNA de fita dupla.
11. RNA, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que é selecionado do grupo que consiste em uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla e uma molécula de ácido ribonucleico de fita simples entre cerca de 15 e cerca de 30 nucleotídeos de comprimento.
12. Vetor de transformação da planta, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1, em que o promotor heterólogo é funcional em uma célula vegetal.
13. Célula, caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1.
14. Célula, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é uma célula procariótica.
15. Célula, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que é uma célula eucariótica.
16. Célula, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que é uma célula vegetal.
17. Planta, caracterizada pelo fato de que é transformada com o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 1.
18. Semente da planta, como definida na reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende o polinucleotídeo.
19. Produto de base produzido da planta, como definida na reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que compreende uma quantidade detectável do polinucleotídeo.
20. Planta, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla.
21. Célula, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que é uma célula de milho, célula de soja, ou célula de algodão.
22. Planta, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que é uma planta de milho, uma planta de soja, ou uma planta de algodão.
23. Planta, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um polinucleotídeo é expresso na planta como uma molécula de ácido ribonucleico, e a molécula de ácido ribonucleico inibe a expressão de um polinucleotídeo endógeno que é especificamente complementar ao pelo menos um polinucleotídeo quando um inseto coleóptero ou hemíptero ingere uma parte da planta.
24. Polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também compreende pelo menos um polinucleotídeo adicional que codifica uma molécula de RNA que inibe a expressão de um gene endógeno de inseto.
25. Vetor de transformação da planta, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo, como definido na reivindicação 24, em que o(s) polinucleotídeo(s) adicional(is) é(são) cada um operavelmente ligado(s) a um promotor heterólogo funcional em uma célula vegetal.
26. Método para controlar uma população de peste de coleóptero ou hemíptero, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer um agente que compreende um molécula de ácido ribonucleico (RNA) que funciona em contato com a peste para inibir uma função biológica dentro da peste, em que o RNA é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste em qualquer um de SEQ ID NOs: 98-110; o complemento de qualquer um de SEQ ID NOs: 98-110; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 98-110; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 98-110; uma transcrição de qualquer um de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92; o complemento de uma transcrição de qualquer um de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer um de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de qualquer um de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 9-15, 89, e 91-92.
27. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o RNA do agente é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste em SEQ ID NOs: 98-100; o complemento de SEQ ID NO:98-100; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N0:98-100; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID N0:98-100; uma transcrição de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; o complemento de uma transcrição de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de SEQ ID NOs: 1, 3, ou 5.
28. Método, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o agente é uma molécula de RNA de fita dupla.
29. Método para controlar uma população de peste de coleóptero, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona em contato com a peste de coleóptero para inibir uma função biológica dentro da peste de coleóptero, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que exibe de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência a de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 98-107, e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizada para a segunda sequência de polinucleotídeo.
30. Método para controlar uma população de peste de hemíptero, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer um agente compreendendo uma primeira e uma segunda sequência de polinucleotídeo que funciona em contato com a peste de hemíptero para inibir uma função biológica dentro da peste de hemíptero, em que a primeira sequência de polinucleotídeo compreende uma região que exibe de cerca de 90% a cerca de 100% de identidade de sequência a de cerca de 15 a cerca de 30 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 108-110, e em que a primeira sequência de polinucleotídeo é especificamente hibridizada para a segunda sequência de polinucleotídeo.
31. Método para controlar uma população de peste de coleóptero, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer em um planta hospedeira de uma peste de coleóptero uma célula vegetal transformada compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 2, em que o polinucleotídeo é expresso para produzir uma molécula de ácido ribonucleico que funciona em contato com uma peste de coleóptero pertencente à população para inibir a expressão de uma sequência alvo dentro da peste de coleóptero e resulta em crescimento diminuído e/ou sobrevivência da peste de coleóptero ou população de peste, relativa à reprodução da mesma espécie de peste em uma planta da mesma espécie de planta hospedeira que não compreende o polinucleotídeo.
32. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a molécula de ácido ribonucleico é uma molécula de ácido ribonucleico de fita dupla.
33. Método, de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que a população de peste de coleóptero é reduzida com relação a uma população da mesma espécie de peste infestando uma planta hospedeira da mesma espécie de planta hospedeira que não tem a célula vegetal transformada.
34. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que a população de peste de coleóptero é reduzida com relação a uma população de peste de coleóptero infestando uma planta hospedeira da mesma espécie que não tem a célula vegetal transformada.
35. Método de controle de infestação de peste de coleóptero em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende fornecer na dieta de uma peste de coleóptero um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 98-107; o complemento de qualquer um de SEQ ID NOs: 98- 107; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 98-107; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 98-107; uma transcrição de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:5; o complemento de uma transcrição de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:5; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:5.
36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a dieta compreende uma célula vegetal transformada para expressar o polinucleotídeo.
37. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável é compreendido em uma molécula de RNA de fita dupla.
38. Método de controle de infestação de peste de hemíptero em uma planta, caracterizado pelo fato de que compreende contatar uma peste de hemíptero com um ácido ribonucleico (RNA) que é especificamente hibridizável com um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NOs: 108-110; o complemento de qualquer um de SEQ ID NOs: 108- 110; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 108-110; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de qualquer um de SEQ ID NOs: 108-110; uma transcrição de SEQ ID NO:89; o complemento de uma transcrição de SEQ ID NO:89; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de SEQ ID NO:89; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma transcrição de SEQ ID NO:89.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o contato da peste de hemíptero com o RNA compreende vaporizar a planta com uma composição compreendendo o RNA.
40. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o RNA especificamente hibridizável é compreendido em uma molécula de RNA de fita dupla.
41. Método para melhorar a produção de uma colheita, caracterizado pelo fato de que compreende: introduzir o ácido nucleico como definido na reivindicação 1 em uma planta de colheita para produzir uma planta de colheita transgênica; e cultivar a planta de colheita para permitir a expressão do pelo menos um polinucleotídeo; em que expressão do pelo menos um polinucleotídeo inibe a reprodução ou crescimento de peste de inseto e perda de produção devido à infestação de peste de inseto, em que a planta de colheita é milho, soja, ou algodão.
42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma peste de inseto que contatou uma porção da planta de colheita.
43. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é selecionado do grupo que consiste em SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, e os complementos de qualquer um dos anteriores.
44. Método, de acordo com a reivindicação 43, caracterizado pelo fato de que a expressão do pelo menos um polinucleotídeo produz uma molécula de RNA que suprime pelo menos um primeiro gene alvo em uma peste de inseto coleóptero que contatou uma porção da planta de milho.
45. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo o ácido nucleico como definido na reivindicação 1; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar células vegetais transformadas que tem integrado o pelo menos um polinucleotídeo em seus genomas; avaliar as células vegetais transformadas quanto à expressão de uma molécula de ácido ribonucleico (RNA) codificada por pelo menos um polinucleotídeo; e selecionar uma célula vegetal que expressa o RNA.
46. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que o vetor compreende um polinucleotídeo selecionado dentre o grupo que consiste em: SEQ ID NO:1; o complemento de SEQ ID NO:1; SEQ ID NO:3; o complemento de SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:5; o complemento de SEQ ID NO:5; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:5; o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, ou SEQ ID NO:5; uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15; o complemento de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15; um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15; e o complemento de um fragmento de pelo menos 15 nucleotídeos contíguos de uma sequência de codificação nativa de um organismo Diabrotica compreendendo qualquer um de SEQ ID NOs: 9-15.
47. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a molécula de RNA é uma molécula de RNA de fita dupla.
48. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma peste de coleóptero, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 46; e regenerar uma planta transgênica da célula vegetal transgênica, em que a expressão da molécula de ácido ribonucleico codificada por pelo menos um polinucleotídeo é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma peste de coleóptero que contata a planta transformada.
49. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um método de fornecer proteção contra peste de coleóptero a uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar células vegetais transformadas que têm integrado o método para fornecer proteção contra peste de coleóptero a uma planta em seus genomas; avaliar as células vegetais transformadas quanto à expressão de um método para inibir a expressão de um essencial gene em uma peste de coleóptero; e selecionar uma célula vegetal que expressa o método para inibir a expressão de um gene essencial em uma peste de coleóptero.
50. Método para a produção de uma planta transgênica protegida contra uma peste de coleóptero, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 49; e regenerar uma planta transgênica da célula vegetal transgênica, em que a expressão do método para inibição da expressão de um gene essencial em uma peste de coleóptero é suficiente para modular a expressão de um gene alvo em uma peste de coleóptero que contata a planta transformada.
51. Método para produzir uma célula vegetal transgênica, caracterizado pelo fato de que compreende: transformar uma célula vegetal com um vetor compreendendo um método para fornecer proteção contra peste de hemíptero a uma planta; cultivar a célula vegetal transformada sob condições suficientes para permitir o desenvolvimento de uma cultura de célula vegetal compreendendo uma pluralidade de células vegetais transformadas; selecionar células vegetais transformadas que têm integrado o método para fornecer proteção contra peste de hemíptero a uma planta em seus genomas; avaliar as células vegetais transformadas quanto à expressão de um método para inibir a expressão de um essencial gene em uma peste de hemíptero; e selecionar uma célula vegetal que expressa o método para inibir a expressão de um essencial gene em uma peste de hemíptero.
52. Método para produzir uma planta transgênica protegida contra uma peste de hemíptero, caracterizado pelo fato de que compreende: fornecer a célula vegetal transgênica produzida pelo método como definido na reivindicação 51; e regenerar uma planta transgênica da célula vegetal transgênica, em que expressão do método para inibir a expressão de um gene essencial em uma peste de hemíptero é suficiente para modular a expressão de um gene-alvo em uma peste de hemíptero que contata a planta transformada.
53. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que também compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., ou Pseudomonas spp.
54. Ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado dentre um grupo compreendendo Cry1B, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e Cyt2C.
55. Célula, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., ou Pseudomonas spp.
56. Célula, de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Cry1B, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e Cyt2C.
57. Planta, de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., ou Pseudomonas spp.
58. Planta, de acordo com a reivindicação 57, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Cry1B, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e Cyt2C.
59. Método, de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a célula vegetal transformada compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de Bacillus thuringiensis, Alcaligenes spp., ou Pseudomonas spp.
60. Método, de acordo com a reivindicação 59, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo codifica um polipeptídeo de B. thuringiensis que é selecionado de um grupo compreendendo Cry1B, Cryll, Cry2A, Cry3, Cry7A, Cry8, Cry9D, Cry14, Cry18, Cry22, Cry23, Cry34, Cry35, Cry36, Cry37, Cry43, Cry55, Cyt1A, e Cyt2C.
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