BR0015102B1 - Uso de sobrenadante de cultura de bactéria de ácido lático ou bifidobacterium e composição alimentícia ou farmacêutica compreendendo o referido sobrenadante - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE SO- BRENADANTE DE CULTURA DE BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁTICO OU Bl- FIDOBACTERIUM E COMPOSIÇÃO ALIMENTÍCEA OU FARMACÊUTICA COMPREENDENDO O REFERIDO SOBRENADANTE”. A presente invenção refere-se a bactérias de ácido lático capa- zes de prevenirem colonização de células intestinais por Giardia intestinalis, ou a um seu sobrenadante de cultura, respectivamente, para uso no trata- mento e/ou profilaxia de distúrbios associados com a colonização do intesti- no por Giardia intestinalis. A presente invenção também pertence a cepas de Bifídobacterium tendo as características acima e ao uso de bactérias de áci- do lático para a preparação de um veículo ingerível.tal como uma composi- ção farmacêutica ou alimentícea, para o tratamento e/ou profilaxia de uma infestação do intestino por Giardia intestinalis.

Giardia intestinalis é um protozoário flagelado que com infesta- ção de um intestino de indivíduo pode efetuar distúrbios tais como dores ab- dominais, fezes soltas ou mesmo severa diarréia. Seu ciclo de vida tem dois estágios, cistos e trofozoíta, cujas formas diferentes permitem o microorga- nismo sobreviver em diferentes e mesmo adversos ambientes.

Cistos são formas ovóides e quadrinucleadas, dormentes, res- ponsáveis pela transmissão de giardíase. Após ingestão de cistos por um indivíduo, excistação é disparada através de exposição a ácido gástrico e/ou enzimas digestivas. O parasita assim emergindo, chamado trofozoíta, é bi- nucleado e de forma de meia - pêra tendo um tamanho ao redor de 10pm com um lado anterior amplo e um estreito lado posterior. O lado ventral é grandemente coberto pelo disco ventral que é julgado pelo menos em parte responsável por uma ligação da trofozoíta à superfície intestinal.

Após excistação trofozoítas podem persistir no intestino delgado do indivíduo infectado por um longo tempo totalizando mesmo anos. Se tro- fozoítas são transportadas à jusante pelo fluxo de fluido intestinal elas no- vamente começam a encistar para adaptação a um novo ambiente.

Cistos são excretados com as fezes e podem superar uma vari- edade de extremas condições ambientais, incluindo diferente temperatura, pH e condições de tonicidade. Um indivíduo infectado pode secretar cerca de 9x108 cistos por dia, com doses tão baixas como 10 cistos provados se- rem suficientes para produção de infecção em um outro indivíduo. Transmis- são de Giardia Intestinalis pode ser realizada através de uma variedade de diferentes maneiras com as principais rotas de transmissão sendo transporte na água e transporte em alimentos. Difusão pessoa para pessoa é suportada por alguma supervisão e erupções nosocomiais. Em adição, animais selva- gens são verificados serem reservatórios infecciosos de Giardia Intestinalis e podem contribuir para uma difusão do patógeno.

Giardíase, como outras doenças intestinais, é mais severa em bebês e crianças. Infecção é normalmente associada com diarréia e má ab- sorção resultando em um crescimento e desenvolvimento prejudicados da criança e pode eventualmente também conduzir à morte de recém - nasci- dos.

Cerca de metade de pessoas infectadas são, entretanto, assin- tomáticas e contribuem para a difusão do patógeno, uma vez que devido à ausência de quaisquer sintomas perceptíveis nenhum regime correspon- dente é aplicado.

Através de um grande esforço científico investido sobre a inves- tigação de patogênese de Giardia Intestinalis de giardíase não pode ser ex- plicada por meio de um simples fator de virulência sozinho e nenhum com- posto tóxico foi ainda isolado. A aparência em microscópio de luz de um intestino colonizado por Giardia foi verificada ser antes variável, variando de uma estrutura de mucosa normal a uma atrofia vilosa subtotal. Resultados de investigações de microscopia eletrônica revelaram mudanças ultra - estruturais tais como en- curtamento e interrupção de microvilli (Chávez et al., Experimental Parasitol. 80(1995), 133-138).

Tais anormalidades estruturais foram verificadas serem acom- panhadas por uma redução em atividades de lactase, sucrase e maltase na membrana microvilosa assim como um prejudicado transporte intestinal (Bu- ret et al., Gastroenterology 103 (1992), 506-513; Roberts-Thomson et al., Gastroenterology, 71 (1976), 57-61).

Em adição às duas formas ilustradas acima Giardia Intestinalis desenvolveu uma estrutura de superfície extremamente alterável e desen- volveu uma família de proteínas protetoras que cobrem todas as superfícies expostas (Aley et al., Infect. Agents Dis. 4 (1995), 161-166; Müller, et al., In- fect. Immun. 64 (1996), 1385-1390; Nash et al., J. Euk. Microbiol. 42 (1995), 604-609). Estas proteínas de superfície variáveis (VSPs) protegem trofozoí- tas de ambos fatores, imunológicos e ambientais, de modo que Giardia pode evitar as defesas do hospedeiro e pode sobreviver em um ambiente alta- mente degradante tal como o predominante no trato intestinal de mamíferos.

Uma modificação nas VSPs ocorre em cada cerca de 6a a 13a geração tor- nando difícil ou aproximadamente impossível para o sistema imuno de hos- pedeiro desenvolver uma resposta específica contra o patógeno. Tensão imuno e ambiental pode selecionar diferentes fenótipos de VSP. Além disso, comutação de antígeno de VSPs após excistação também foi reportada (Gi- llin et al., Annu. Rev. Microbiol. 50 (1996), 679-705).

Giardíase humana está associada com um aumento no número de lâmina própria e linfócitos intra-epiteliais sugerindo que ativação de célu- la-T pode ser responsável por dano microviloso. Entretanto, imunossupres- são induzida em camundongos resultou em um efeito mais profundo sobre enzimas associadas com microvilosidade como comparado a animais não- imunossuprimidos, indicando que durante uma infecção por Giardia Intesti- nalis dano epitelial não parece ser dependente de função imunossozinha.

Uma terapia comum de giardíase é a administração de antibióti- cos, tais como aqueles pertencendo à classe de nitroimidazóis. Ainda, em áreas endêmicas a resposta a terapia foi mostrada ser antes incosistente (Katelaris et al., Pharmacol. Ther. 8(1994), 187-192). Além disso, devido à destruição pelo menos em parte da microflora natural do intestino, a admi- nistração de tais antibióticos é sempre acompanhada por efeitos colaterais tais como estendida diarréia ou mesmo uma expandida infestação do intesti- no por outros microorganismos prejudiciais, tal como levedura.

Portanto, existe uma necessidade de opções adicionais para tratamento de giardíase ou meios para prevenir infestação de um indivíduo pelo patógeno. O problema da presente invenção por isso reside no provimento de meios adicionais para o tratamento ou profilaxia de uma infestação por Giardia Intestinalis.

Este problema foi resolvido através de provimento de um sobre- nadante de cultura de uma bactéria de ácido lático ou um Bifidobacterium capaz de prevenir adesão de Giardia Intestinalis a células intestinais para a preparação de um veículo que pode ser ingerido para o tratamento e/ou pro- filaxia de distúrbios associados com a colonização do intestino por Giardia Intestinalis.

De acordo com uma modalidade preferida a presente invenção provê novas bactérias de ácido lático e Bifidobactéria, respectivamente, ca- pazes de prevenirem adesão de Giardia Intestinalis a células intestinais, que são selecionadas do grupo consistindo em NCC 90 (1-2332), NCC 189 (I- 2333) ou NCC 200 (I-2334). Estes microorganismos foram depositados de acordo com o Tratado de Budapeste com um Institute Pasteur em 30 de no- vembro de 1999 e receberam os números de depósito mencionados acima. A presente invenção pertence também a composições alimentíceas e farma- cêuticas contendo tais microorganismos.

Os microorganismos podem ser incluídos no veículo em uma quantidade de cerca de 106 a cerca de 1012 pfu (unidades de formação de placa). Eles podem ser incluídos como estão ou opcionalmente após essen- cialmente purificando-se os mesmos a partir do meio de cultura. Alternativa- mente, o sobrenadante de uma cultura de tais microorganismos pode ser incluído no veículo, o qual antes de sua inclusão pode preferivelmente ser concentrado por meios bem conhecidos na técnica. O veículo ingerível pode ser uma composição alimentícea ou farmacêutica tal como leite, iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, pro- dutos fermentados baseados em leite, sorvetes, produtos à base de cereais fermentados, pulverizados à base de leite, fórmulas infantis, ou qualquer tipo de alimento de animais domésticos. Tais veículos podem, por exemplo, ser facilmente fabricados através do uso de microorganismos tendo as corres- pondentes características para fermentação dos próprios materiais de parti- da. Alternativamente, os microorganismos ou um seu sobrenadante de cultu- ra opcionalmente concentrado podem ser adicionados ao respectivo veículo na forma líquida ou seca.

Uma composição farmacêutica, tal como um tablete, uma sus- pensão bacterial líquida, um suplemento oral úmido ou seco, uma alimenta- ção de tubo úmida ou seca pode ser preparada usando-se técnicas padrões enquanto incluindo os microorganismos e/ou um seu sobrenadante de cultu- ra opcionalmente concentrado no veículo. Dependendo do modo de admi- nistração a pessoa versada selecionará a formulação julgada apropriada.

Nas figuras, A Fig. 1 mostra adesão de cepa Portland-1 a células Caco-2 quando 105 trofozoítas/cm2 foram adicionadas; A Fig. 2 mostra os resultados de ensaios de adesão realizados com células HT-29 não-diferenciadas; A Fig. 3 mostra uma micrografia de varredura eletrônica de cepa UNO ligada a células Caco-2 diferenciadas; A Fig. 4 mostra o dano microviloso na borda escova de célula epitelial por Giardia Intestinalis-, A Fig. 5A mostra os resultados de coincubação de giardias, bactéria de ácido lático e células Caco-2; A Fig. 5B mostra os resultados de pré-incubação de monocama- das de Caco-2 com bactéria de ácido lático; A Fig. 6A mostra os resultados de um experimento de adesão, onde Portland-1 e WB foram contactados com um sobrenadante neutraliza- do da bactéria de ácido lático da presente invenção; A Fig. 6B mostra os resultados de um experimento de adesão, onde WB e CIDCA foram contactados com um sobrenadante neutralizado da bactéria de ácido lático da presente invenção; A Fig. 7A mostra os resultados obtidos através de incubação de cepa WB com sobrenadantes ácidos (pH 4) (DMEM : sobrenadante = 1:1) durante 1 hora; A Fig. 7B mostra que neutralização de sobrenadantes (pH 7) abole efeito inibidor; A Fig. 8A mostra os resultados obtidos por incubação de cepa WB com sobrenadantes de cepa La10 ajustados para diferente pH; A Fig. 8B mostra os resultados de diluição de sobrenadantes ácidos com MRS; A Fig. 9 mostra uma análise citométrica baixa de suspensões de cepa WB 1 incubada durante 1 hora a 37° com MRS acidulado para pH 5 (DMEM : MRS = 1:1); A Fig. 10 mostra os resultados de uma inoculação de parasitas pré-incubados em pH 4 ou 7 em meio TYI-S-33 com 1OOpCi de 3H adenina.

Durante a condução dos estudos da presente invenção os in- ventores fizerama hipótese de que uma abordagem ecológica no tratamento e/ou prevenção de giardíase pode ser uma colonização do intestino com bactérias que sejam capazes de antagonizar com o parasita.

Ligação de iroíozoítas de Giardia Intestinalis a células epiteliais é julgada ser uma etapa chave para infecção em humanos e animais. Embo- ra os mecanismos para adesão de Giardia não sejam inteiramente entendi- dos, evidência suporta o disco ventral, elementos contráteis de trofozoíta, forças hidrodinâmicas e mecânicas e ligação mediada por lectina estarem envolvidas.

Levando-se em conta que ácido lático é um importante fator em ciclo de vida de Giardia a interação entre Giardia intestinalis e bactérias de ácido lático foi estudada usando-se células semelhantes a enterócitos em cultura.

Para este fim, as seguintes cepas de parasitas microbiais e mei- os de cultura foram usados: Cepas microbiais: Cepas bacteriais La1 (Lactobacillus johnsonii){\-1225) e La10 (Lactobacillus acidophilus)(\-2332) foram de Nestec collection (Lausanne, Switzerland). Cepas CIDCA 536 (Bifidobacterium bifidum) e CIDCA 538 (S/- fidobacterium infantis) foram da coleção de Centro de Investigación y Desar- rollo en Criotecnología de Alimentos (Universidad Nacional de LaPlata, Ar- gentina) e foram depositadas de acordo com o Tratado de Budapeste rece- bendo os números de depósitos 12333 e i-2334, respectivamente.

Giardia Intestinalis cepa Portland-1 (ATCC 30888), UNO/04/87/1 (ATCC 50184), New Orleans-1 (ATCC 50137) e WB (ATCC 30957) foram adquiridas de American Type Culture Collection (Rockville, USA).

Bactérias foram desenvolvidas por 24 horas a 37°C em caldo MRS suplementado com 0,05% cloridrato de cisteína (Sigma). Incubações foram realizadas sob condições anaeróbicas (BBL GasPak Plus).

Protozoários foram crescidos em meio TYI-S-33 modificado de Keister contendo (por litro): digestão de caseína (Difco), 20g; extrato de le- vedura (BBL), 10g; dextrose (Merck), 10g; bile bovina (Difco), 0,75g; NaCI (Merck), 2g; L-cisteína. HCI (Sigma), 2g; sal de sódio de ácido ascórbico (Fluka), 0,2g; K2HP04 (Merck), 1g; KH2P04 (Merck), 0,6g; citrato férrico de amônio (sigma), 22,8mg; soro bovino adulto (Sigma), 100ml; penicilina / streptomicina (Qibcc, 1000 iU/ml, IGOOpg/mi), 15ml. Soro de cavalo (Gibco) ao invés de soro bovino também foi ensaiado. O pH foi ajustado para 6,9 com NaOH 1N antes de esterilização em filtro (tamanho de poro de 0,22pm).

Meio modificado de Keister suplementado com soro de cavalo 10% não su- porta crescimento de cepa Portland-1 embora incubação fôsse estendida durante 11 dias e à despeito do fato de que trofozoítas estavam inicialmente ligadas às paredes de tubo. Durante os primeiros 5 dias de incubação, uma alta proporção de parasitas móveis foi observada. Após este tempo aglutina- ção de trofozoítas e uma dramática diminuição de células viáveis foram ob- servadas. Adição de soro bovino (10%) a estas células danificadas permitiu crescimento após 24 horas. Para aumentar a superfície disponível para liga- ção de Giardia, garrafas de cultura de tecido de 25cm2 foram usadas (gar- rafas plásticas). Meio de cultura foi adicionado até o gargalo de garrafa para manter condições anaeróbicas. Este procedimento resultou em rendimentos de cerca de 107 trofozoítas / garrafa dentro de 2-3 dias de incubação e para- sitas formaram uma monocamada confluente sobre as paredes de garrafa.

Subculturas foram feitas através de resfriamento de culturas em um banho de gelo (5-10 minutos) para destacar trofozoítas aderentes e ino- culando 0,2ml da resultante suspensão em meio fresco. Incubações foram realizadas a 37°C por 72 horas e diferentes receptores (vidro ou plástico) foram usados.

Estocaqem de cepas de Giardia Intestinalis: Trofozoítas foram destacadas como indicado acima e suspensas em meio TYI-S-33. Solução crioprotetora concentrada duas vezes (DMSO, sucrose) preparada em meio TYI-S-33, foi adicionada à suspensão em três alíquotas iguais em intervalos de 2 minutos. Concentrações finais de crio- protetores foram 12% (v/v) DMSO, 4% (peso / volume) sucrose. Suspensões (cerca de 1x106 trofozoítas/ml) foram deixadas equilibrar durante 20 minutos em temperatura ambiente antes de início do ciclo de resfriamento.

Frascos foram termicamente isolados com poliestireno (espessu- ra de parede de 4cm) e colocados a -80°C.

Reativação de trofozoítas congeladas: Frascos foram descongelados em um banho de água a 37°C e imediatamente inoculados em meio TYI-S-33 em uma razão de suspensão de parasitas / meio fresco = 0,5/7. Culturas foram incubadas a 37°C no escuro. A presente invenção será agora descrita por meio de exemplos.

Como um modelo para células intestinais foram usadas as linhas de células Caco-2 e HT29. Adesão às ditas células semelhantes a enteróci- tos foi testada como se segue: Exemplo 1: Radiorrotulação de trofozoítas Parasitas foram inoculados em TYI-S-33 e 2,6 a 7,1pCi/ml de tanto 2-3H adenina (21 Ci/mmol, 1mCi/ml, Amersham Life Science) como metil-3H timidina (2 Ci/mmol, 1 mCi/ml, Amersham Life Science) foram adici- onadas. Incubações foram realizadas a 37°C por 48-72 horas.

Crescimento de trofozoítas com 7,1pCi/ml de tanto 3H-adenina como 3H-timidina rendeu razões DPM/parasita muito diferentes (Tabela 1).

Embora concentração de timidina fôsse maior comparada àquela de adeni- na, incorporação foi muito baixa com o resultado de 0,08 e 2,8 DPM/parasita sendo obtidos, respectivamente.

Tabela 1 Incorporação de 3H por Giardia cepa Portland-1 adicionando 7μ0ί/ιηΙ de bases rádiorrotuladas A Tabela 2 mostra os resultados da incorporação de adenina por cepas de Giardia Intestinalis. Rádio - rotulação apropriada foi obtida através do uso de concentrações de adenina tão baixas como 2,5 μΟ'ι/ιτιΙ. Nestas condições, DPM/parasita variou de 0,3 para cepa Portland-1 a 1,6 para cepa UNO.

Tabela 2 Incorporação de 2-3H adenina por diferentes cepas de Giardia Resultados são médias de pelo menos duas determinações Exemplo 2: Cultivo de células Células Caco-2 foram crescidas em DMEM suplementado com aminoácidos não-essenciais, penicilina (12IU/ml), streptomicina (12pg/ml), gentamicina (47μ9/ηιΙ) e soro de bezerro fetal inativado (20% v/v). Monoca- madas foram preparadas em placas de cultura de tecido de 6 cavidades através de semeadura de 2x105 células por cavidade. Incubações foram rea- lizadas a 37°C em uma atmosfera de 10% C02 / 90% ar. O meio de cultura foi trocada cada 2o dia. Ensaios de adesão foram realizados com células entre passagens 49 e 51 e somente monocamadas em estágio de pós- confluência posterior (pelo menos duas semanas em cultura). Células HT-29 não-diferenciadas (American Type Culture Co- liection, Rockville, MD) foram crescidas em DMEM contendo 4,5 g/l glucose (Seromed, Biochrom KG, Berlin, Germany)suplementado com Glutamax 1 (0,01% v/v; L-alanil-L glutamina 200mM, GIBCO, Basel, Switzerland), gen- tamicina (0,57 mg/ml, GIBCO, Basel, Switzerland) e soro de bezerro fetal (10% v/v, GIBCO, Basel, Switzerland). Células foram usadas na passagem 52.

Exemplo 3: Ensaios de adesão Quando monocamadas confluentes de trofozoítas foram obtidas, o meio de cultura foi descartado, assim eliminando quaisquer parasitas não ligados a uma superfície. Parasitas ligados foram colhidos como descrito e lavados 3 vezes com DMEM (Gibco) contendo cisteína HCI 11,4mM. Dilui- ções (1:2) de parasitas em paraformaldeído 1% foram enumeradas em um hematocitômetro.

Trofozoítas rádio - rotuladas suspensas em DMEM-CYS (DMEM + cisteína HCI 11,4mM) foram adicionadas a monocamadas de células Caco-2 e incubadas por 1 hora a 37°C em uma atmosfera de 5% C02 / 95% ar. Monocamadas foram então lavadas 3 vezes com DMEM-CYS a 37°C para destacar trofozoítas não-ligadas.

Após lavagem, 1 ml de NaOH 1N foi adicionado por cavidade e as placas foram incubadas por 1 hora em temperatura ambiente. Lisatos de células foram colocados em frascos de cintilação e ainda uma lavagem das cavidades com PBS foi realizada. Radioatividade foi medida com um conta- dor-β (RackBeta Spectral, LKB, Wallac).

Exemplo 4: Ensaios de pré-incubação Culturas bacteriais foram lavadas três vezes com PBS. Suspen- sões, que foram ajustadas para 1x108 CFU/ml em DMEM, foram adicionadas a monocamadas de Caco-2 e placas foram incubadas por 1 hora em 37°C.

Após adesão das suspensões bacteriais trofozoítas rádio - rotuladas, ajus- tadas para 1x105 parasitas/ml, foram adicionadas. Ensaios de adesão foram realizados como indicado acima.

Exemplo 5: Ensaios de incubação Alíquotas de 1ml de suspensões de parasitas contendo 1x105 Giardia rádio- rotulada por ml foram misturadas com 1ml de suspensões bacteriais (1x108 CFU/ml) em placas de cultura de tecido de 6 cavidades contendo monocamadas de Caco-2. Ensaio de adesão foi realizado como indicado acima.

Exemplo 6: ação de sobrenadantes de bactérias de ácido lático sobre ade- são de Giardia Intestinalis Culturas de bactérias de ácido lático foram centrifugadas a 900g durante 15 minutos e sobrenadantes foram neutralizados (pH 6,9 —7,4) com NaOH 4N. 1ml de uma suspensão contendo 105 trofozoítas rádio - rotula- das/ml em DMEM-CYS foram misturadas com 1ml de sobrenadante neutrali- zado em placas de cultura de tecido de 6 cavidades contendo monocamadas de Caco-2. Ensaios de adesão foram realizados como indicado acima. Apro- priados controles com MRS ou MRS acidulado para pH 4,5 com ácido lático e então neutralizado para pH 7 foram incluídos nos ensaios.

Ensaios de pré-incubação foram realizados através de incuba- ção de suspensões de parasitas (DMEM-cys) com um igual volume de so- brenadaníe por i hora a 37°C. Em uma outra série de experimentos, para- sitas foram suspensos em sobrenadantes puros ou sobrenadantes diluídos com MRS. Após incubação, giardias foram suspensas em DMEM e adicio- nadas a células Caco-2.

Avaliação de crescimento foi realizada através de incubação de parasitas em meio TYI-S-33 com 100pCi de 3H-adenina em 40ml de cultura.

Análises citométricas de fluxo foram feitas usando-se uma luz de excitação azul - verde (FACScan™).

Exemplo 7: Microscopia de varredura eletrônica Células Caco-2 foram crescidas sobre lâminas de vidro redon- das (diâmetro de 10mm) em placas de cultura de tecido de 24 cavidades e adesão de trofozoítas foi feita como indicado. Espécimes foram fixados atra- vés da adição de glutaraldeído 2,5% em PBS por 16 horas a 4°C. Pós- fixação foi realizada com tetróxido de ósmio 2% em temperatura ambiente por 2 horas e então esfregaços foram desidratados em uma série graduada de soluções de etanol (soluções de etanol em água de 30, 50, 70, 90, 100%). Finalmente, amostras foram secas ao ponto crítico usando-se CO2, revestidas com ouro e examinadas usando-se um Philips SEM 505 em uma voltagem de excitação de 30KV.

Exemplo 8: Adesão de trofozoítas de Giardia Intestinalis a células Caco-2 Um total de 105 trofozoítas foram adicionadas a uma cultura de Caco-2 preparada como detalhado no Exemplo 2. Os resultados dos ensaios de adesão são mostrados na Fig. 1. Adesões ao redor de 5% foram obtidas à despeito da idade das monocamadas. Ligação a superfícies plásticas foi muito alta (21,8 ± 2,4%).

Os resultados de ensaios de adesão realizados com células HT- 29 não-diferenciadas são mostrados na Fig. 2. Valores de 7,0±1,2% e 5,5±0,6% foram obtidos para cepas Portland-1 e WB, respectivamente.

Micrografia de varredura eletrônica de cepa UNO ligada a célu- las Caco-2 diferenciadas é mostrada na Fig. 3. Maioria de trofozoítas de Gi- ardia estão situadas com o lado ventral ligado à monocamada. Alguns para- sitas também foram vistos com sua superfície dorsal fazendo face a células Caco-2 (seta). Como pode ser claramente derivado da Fig. 4, ligação de trofozoítas produz uma impressão sobre a borda escova de células seme- lhantes a enterócito.

Co-incubação de giardias, bactérias de ácido lático e células Caco-2 não altera ligação (Fig. 5A). Além disso, pré-incubação de monoca- madas de Caco-2 com bactérias de ácido lático não interfere com adesão de parasita (Fig. 5B).

Exemplo 9: Influência de sobrenadantes de culturas de bactérias de ácido lático sobre adesão de Giardia Intestinalis a células Caco-2 Co-incubação das cepas Portland-1 e WB com sobrenadantes neutralizados das bactérias de ácido lático para serem usadas de acordo com a presente invenção produziu uma redução de adesão a células Caco-2 variando de 19% (cepa La1) a 40% (cepa La10) para cepa Portland-1 (Fig. 6A). Para cepa WB, valores variaram de 20% para cepa CIDCA 536 a 40% para cepa La10 (Fig. 6B). Embora diferenças entre as cepas não possam ser estabelecidas, cepa La10 mostrou significante diferenças comparadas ao controle MRS para ambas, a cepa Portland-1 (P = 0,06) e a cepa WB (P = 0,04).

Levando em conta que a faixa de pH compatível com os experi- mentos de co-incubação com células Caco-2 é estreita, ensaios foram reali- zados através de pré-incubação de parasitas com sobrenadantes e então através de re-suspensão dos mesmos em DMEM-cisteína antes de ensaios de adesão. Incubação de cepa WB com sobrenadantes ácidos (pH 4)(DMEM : sobrenadante =1:1) durante 1 hora produziu uma redução de adesão de 15% para MRS a cerca de 3% para todas as cepas sob estudo (Fig. 7A).

Neutralização de sobrenadantes (pH 7) eliminou o efeito inibidor e um au- mento em adesão foi verificado (Fig. 7B).

Os resultados obtidos por incubação de cepa WB com sobrena- dantes de cepa La10 ajustada para diferente pH são mostrados na Fig. 8A.

Nenhuma diferença como comparado ao controle MRS em pH 4 e 5 foi veri- ficada mas adesão foi verificada ser maior em pH de 6 e 7.

Diluição de sobrenadantres ácidos com MRS produziu um au- mento em pH e adesão foi reduzida com sobrenadantes diluídos 1/8 (con- centração relativa 0,125, pH 4,07, Figura 8B).

Análises citométricas de fluxo de suspensões de cepa WB 1 in- cubadas por 1 hora a 37°C com MRS acidulado para pH 5 (DMEM : MRS = 1:1) mostraram diferenças em tamanho (FSC) e complexidade citoplásmica (SSC)(Fig. 9). Inoculação de parasitas pré-incubados em pH 4 ou 7 em meio TYI-S-33 com 100pCi de 3H adenina mostrou diferenças em incorporação (Fig. 10). Baixa incorporação de adenina foi detectada em pH 4 após 28 ho- ras de incubação em ambos, amostras de sobrenadantes e MRS. Embora alguns parasitas fossem ligados às paredes de garrafa, eles não eram mó- veis. Caldo MRS, acidulado para pH 4,05 e neutralizado, mostrou valores de DPM representando menos que 20% do controle. Para sobrenadantes neu- tralizados de cepa La10 valores foram ao redor de 80% do controle e dife- renças foram significantes em nível 0,09. Grandes agregados de parasitas foram verificados em pH 7 em ambos, MRS e sobrenadantes.

Os resultados para adesão de Giardia a diferentes linhas de cé- lulas (Fig. 1 e 2) sugerem que ligação não-específica parece ser uma im- portante característica deste sistema, uma vez que nenhuma diferença si- gnificante foi verificada entre células diferenciadas (Caco-2 com diferentes tempos em cultura) e células não-diferenciadas (HT-29). Além disso, adesão a superfícies plásticas foi muito alta. Adesão de trofozoítas a monocamadas de Caco-2 obviamente produziu dano microviloso (Fig.4).

Experimentos de exclusão de parasitas com uma etapa de lava- gem após adesão bacterial conduziram a um dano da monocamada resul- tando em valores de exclusão que não pareceram ser autênticos. O grau de dano dependeu da solução de lavagem variando de dissipação de microvilo- sidade com DMEM-cys (microscopia de varredura eletrônica) a desligamento de célula com PBS. Levando-se em conta as verificações acima, foram reali- zados ensaios, onde monocamadas foram pré-incubadas com bactérias suspensas em DMEM-cys mas sem uma etapa de lavagem anterior à adição dos parasitas. Uma outra série de experimentos foi realizada através de co- incubação de parasitas e bactérias com células Caco-2. Os resultados obti- dos (Fig. 5) são compatíveis com ligação “ativa” de trofozoítas mediada por mobilidade de flagelos e elementos contráteis. Bactérias de ácido lático, não sendo móveis, não podem competir com parasitas para ligação.

Com relação a ação de sobrenadantes de culturas de bactérias de ácido lático, eles foram mostrados inibirem adesão de Giardia. Sem estar preso a qualquer teoria é julgado que este efeito inibidor pode ser atribuído principalmente a particulares ácidos orgânicos secretados pelas bactérias de ácido lático.

Uma pré-incubação de parasitas com MRS acidulado com ácido lático mostrou dramáticas alterações em tamanho celular e complexidade citoplasmática e adesão a células Caco-2 foi reduzida para os sobrenadan- tes e controles MRS. Nestas condições, a viabilidade de parasitas é alta- mente afetada, como é mostrado em experimentos onde parasitas tratados são inoculados em TYI-S-33 fresco.

Após contato com lactato em pH 4 crescimento de parasitas es- sencialmente interrompeu-se embora alguns parasitas fossem capaz de li- gação às paredes de garrafa. Pareceu que sob estas condições ácido lático é letal para Giardia. Em pH 7, o efeito inibidor de lactato ainda está presente e diferenças entre MRS acidulado e sobrenadante de cepa La10 podem ser explicadas assumindo-se diferenças em concentração de lactato devido às diferenças em capacidade de tampão entre MRS fresco e sobrenadantes gastos.

Agregados de Giardia foram formados durante pré-incubação de parasitas com sobrenadantes e eles podem responder pelos altos valores de adesão encontrados em pH 6 e 7 (Figura 8). Como estabelecido antes, os principais mecanismos para adesão de Giardia requerem viabilidade de pa- rasita, embora adesão de protozoários mortos possa ser mostrada após tra- tamento de trofozoítas com sobrenadantes em pH 4. Estes parasitas não foram capazes de multiplicarem-se e assim não serão efetivos em produção de parasitose. Além disso, sobrenadantes neutralizados de culturas de bac- térias de ácido lático retardaram crescimento de Giardia e produziram agre- gados incapazes de ligação.

Em vista dos resultados experimentais acima torna-se claro que as bactérias de ácido lático para serem usadas de acordo com a presente invenção podem ser aplicadas com successo para o tratamento ou profilaxia de giardíase.

Claims (8)

1. Uso de um sobrenadante de cultura de uma bactéria de ácido lático ou uma Bifidobacterium capaz de prevenir a adesão de Giardia intesti- nalis a células intestinais, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um veículo que pode ser ingerido para o tratamento e/ou profilaxia de distúr- bios associados com a colonização do intestino por Giardia intestinalis.

2. Uso de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o veículo que pode ser ingerido é uma composição alimentícia ou uma composição farmacêutica.

3. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a composição alimentícia é selecionada a partir do grupo compreen- dendo: leite, iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, produtos fermenta- dos à base de leite, sorvetes, produtos baseados em cereal fermentado, pul- verizados baseados em leite, fórmulas infantis ou alimento para animal do- méstico.

4. Uso de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que a composição farmacêutica está na forma de um comprimido, sus- pensão bacterial líquida, suplemento oral seco, suplemento oral úmido, ali- mentação em tubo seca ou uma alimentação em tubo úmida.

5. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a bactéria de ácido lático ou Bifidobactéria é selecionada a partir do grupo compreendendo NCC533 (1-1225), NCC90 (I- 2332), NCC 189 (I-2333), NCC 200 (I-2334).

6. Composição alimentícia ou farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um sobrenadante de uma bactéria de ácido lático, como definido na reivindicação 1.

7. Composição de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que é leite, iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, produtos fermentados a base de leite, sorvetes, produtos a base de cereal fermenta- do, pulverizados a base de leite, fórmulas infantis ou alimento de animal do- méstico, ou está em forma de um comprimido, uma suspensão bacterial lí- quida, um suplemento oral seco, um suplemento oral úmido, um alimento em tubo seca ou uma alimentação em tubo úmida.

8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracteri- zada pelo fato de que a bactéria de ácido lático ou Bifidobactéria é selecio- nada a partir do grupo compreendendo NCC533 (1-1225), NCC90 (I-2332),NCC 189 (I-2333), NCC 200 (I-2334).