JPS6078577A - 乳酸菌培養物の高収量製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、共生的培養によりラクトバチルス・アシドフ
ィルスとラクトバチルス・ザリパリウスとの乳酸菌培養
物を高収率でＩ！！造する方法に関する。

乳酸菌は菌形態と醗酵形式によって分類学上はストレプ
トコッカス（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　）　、　−
Ｊ！シｙｊｒフッカス（ＰｅｄｉｏＣｏｃｃｕｓ＋　）
　、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ　）　
、ラクトバチルスおよびピフイドノ臂りテリウム（旧ｆ
ｉｄｏｂａｃｔｏｒｉｕｍ　）に分けられる。これらの
乳酸菌は、農産物や食品からヒトや動物の体まで自然界
にムく分布している。ストレプトコッカスは、ヒトや動
物の病原菌として、又あるＷ４１１Ｋは粘膜の常在菌と
して重要で、さらに・アル菌種は乳製品のヌタータと１
．て食品加工の分野で利用されている。ペジオコツカス
やロイコノストックは、はとんどが醗酵に関連Ｌ７た菌
で動物の生体とけ関係が少ない。ラクトバチルスとビフ
ィドバクテリウムは、乳Ｗ！菌の代表的なもので醗酵食
品から口腔、腸管、膣まで広く分布（−１、医学微生物
学の分野では、とれらの菌は口腔、腸、膣内の正常菌叢
と１．てヒトや動物の健康維持との関係で重要視さｉｔ
ている。

管に、ラクトバチルスはグラム陽性通性嫌気性無芽胞桿
菌で、菌種によってけ球桿菌状、直桿菌状、わん曲状、
コリネバクテリウム状、糸状などの形態を呈するが、ビ
フィドバクテリウムのようにはなはだしい分岐を示すこ
とはない、Ｑラクトバチルスは、大部分運動性はなく、
通常カタラーゼ陰性、好気的東件によシ嫌気的、又は微
好気的条件によく発育し、糖分解性が強い。耐酸性で…
５．０で発育する。最終ｐＴＴけ３．５〜４．０である
。ｌラチンを分解せずインドールおよび硫化水素を産生
じない。

一方、鳥類ならびに動物由来のラクトバチルスは、消化
管、粘膜上皮細胞に強く付着するという点で他の腸内菌
とは弄なる。さらに特徴的なことは、ラクトバチルスが
粘膜上皮細胞に付着する時には厳し２い種特異性が認め
られる（　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｌｔ
ｙ　１２．１７３．１９７５　）。

たとえば、ニワトリから分離されたラクトバチルスは、
ニワトＩＪの上皮細胞には付着するが種の異かるラット
の上皮細胞には付着しない。逆に、ラットから分離され
たラクトバチルスは、ラットの上皮細胞には付着するが
ニワ）　ＩＪの上皮細胞には付着しない。ヒトあるいけ
ブタから分離されたラクトバチルスは、種の異なるニワ
トリ、ブタのいずれの上皮細胞にも付着しない。ラクト
／クチシスの種特異性は無菌（腸内菌叢不在）ヒナを用
いた実験でも証明されている（　Ｊｐｎ、　Ｊ、　Ｍｔ
ｃｒｏｂｉｏｌ。

１５．５３１．’　ｌ’？７１　）。

ニワトリを手でつかむ、ワクチン接種、デビーク、移動
、過密、中抜き、給水、絶食、温度σ）急変なトｌｄス
トレスの代表例てらる。野外にＶ通に存在しているこの
ようなストレスは、ニワトリの免疫機能に悪影響を及は
すことがすでに明らかにされている。ワクチン接種をす
る前にニワトリが高温にさらされると、抗体産生が阻官
される（Ｐｏｕｌｔ、　ＳｃＡ、５４．２１０１．１９
７５　）。又、ワクチン接種後抗体価が安定したエワ）
　ＩＪを高温に短時間さらすと、抗体価が急激に低下す
る（　Ｐｏｕｌｔ、５ｒ−ｔ、　４９．２０２．１９７
０．　ｐｏｕｌｔ、　８ｃｉ、　４７．２６４．１９６
８）。

絶食と給水を行つ一ニワトリでは、牌臓の抗体産生細胞
数は著しく少なく、血中食細胞の食菌能も低下し−ｒい
る（　Ａｖｉａｎ　Ｄｉｇ、　２５．２１４．１９１’
ｉｌ）。

最近、ニワＭ＋の細胞性免疫能に及ばず高温ならびに低
源ストレスの影響が調べＩ−、１１，た結果、これラノ
ストレスによって細胞性免疫能も低下することが実証さ
れた（　Ａｍ、　Ｊ、　Ｖｅｔ、　Ｒｏｓ、　４２．２
９４゜１９８１　）。

ところで、健康な動物の消化管に棲む一群の細菌は正常
腸内菌叢（腸内フローラ）といい、その中には、定住菌
と飼料と共に島内に侵入するが住みつくことのできない
通過菌がある。光間は、ニワ）　ＩＪの消化雷名部位の
菌叢を検索（−１盲腸内菌叢は他の部位とは全く異方る
菌叢を示１ことを明らかにした（鶏病研究会報１３．１
１３．１９７７　）。すなわち、味のう、胃、小腸では
ラクトバチルスが最優勢菌叢を構成ｌ、でいて、それら
の閃は消化管粘膜の上皮細胞に強く付着し、病原菌も含
めて外来菌の経口的侵入に対応し２でいる一一方、盲腸
内では各稲の個性嫌気性菌が著しく増殖１．ていて、こ
れらの菌によって最優勢菌叢が構成されている。

これらの傾向は、ブタの場合も全く同様である（日本獣
医師会誌旦、　＋ｑｑ、　１９７８　）。

ところで、ストレスとニワトリの腸内菌叢との関係につ
いでは不明な点が多いため、われわわは、環境制御’ｌ
装置（トキワ科学器械ＴＶＣ−１型）を利用して、飼育
環境温度と腸内菌叢との関係について詳細に検討した（
第９０回日本獣医学会講演要旨集１０９頁）。まず、２
５°Ｃで飼育したヒナを４０’Ｃ（Ａ群）、３８°Ｃ（
Ｂ群）、３３°Ｃ（０群）にそれぞれ設定した環境制御
装置の中に２日間入ノ１１．２５°Ｃに戻して５日後再
び２日間それぞれの温度にばくろし、２５°Ｃに戻して
５日間飼育し７た。腸内菌叢の倹索刺料は、それぞれ温
度が変化する時点で採をした。

ストレスの程度は副腎の組織切片標本の病理変化をもと
に判宇した。その結果１強いストレスはＡ群に認められ
、Ｂ群では弱く、０群では正常であった。一方、顕著な
腸内菌叢の変動はストレスの最も強かったＡ群の小腸部
位に限局して観察された。すなわち、大腸呵（Ｅ、　ｃ
ｏｌｉ　）　、ストレプトコッカス、　スタフィロコッ
カス（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏ−ｃｃｕｓ　）の異常増殖
と最優勢菌である２クト・々チルスの減少あるいは消失
が昭められた０　偏性Ｉｓ気性菌の変動は観察されなか
った。　ストレスの弱かったＢ群ではラクトバチルスの
変動を除いてＡ群のそれに類似していた。又、絶食、結
水ストレスｔ−与すること罠よってラクトバチルスが消
化管からはとんど検出されなくなったヒナに１０Ｉ０個
の病原大腸菌（０２血清型）を軽口接種［７たところ、
接種した５０ｑ６のヒナに心のり炎、気のう炎、肝包膜
炎が観察され、多量の接種菌が肝、血液・肺、心のうか
ら回収され典型的な大腸菌症が再現され念（未発表）。

しかしながら、正常腸内菌叢を構成しているヒナに病原
大腸菌を経口接種しても発病に至らず、いずれの組織か
らも接種菌社回収されなかった。

仁のように、ストレスはニワトリの免疫機能に障害を与
える以外Ｋ、生体防御に関与する正常腸内菌叢にも悪影
響を及ぼしている。

Ｗａｔｋｆｎｓ　ラは、無菌ヒナを用いてり、アシドフ
（ル、Ｘによる病原大腸菌の腸内増殖阻止について検討
したところ、Ｌ、アンドフィルスの投与によって病原大
腸菌の腸内増殖とそれによる死亡率を有意にコントロー
ルすることが可能なことと明らかにした（　Ｐｏｕｌｔ
　８ｃｔ、　５ｇ、　１１２１．１９７９　）。

最近、柴谷らはラクトバチルス・アシドフィルス（以下
、Ｌ、アシドフィルスと略す）とラクトバチルス・サリ
パリウス（以下、Ｌ、サリパリウスと略す）からなる凍
結乾燥物をヒナに投与し、育成率ならびに爽質臓器から
の大腸菌分離率に及ばず影響を調べた（第９４回日本獣
医学会講演要旨集１２８頁）。

供試ヒナはＡ群５　、９００羽、Ｂ群７．０００羽を用
いた０投与菌は光間によって分離、同定されたニワトリ
由来り、アシドフィルス■型菌とり、サリパリウスＩＶ
ａ型菌（われわれが本試験に用いた菌株）とのおのおの
の凍結乾燥菌を混合したものである。

Ｉバイアルの凍乾菌は約ｔ　、ｏｏｏ羽のビナが３時間
以内に飲むように溶解し、餌付時、デビークおよびワク
チン接種後ｔｔＣそれぞれ１回投力した。その結果・ラ
フトノ（チルスを投与することによりヒナの発育は促進
し、死亡率はＡ群、Ｂ群ともに顕著に低下した０又１肝
、肺、牌ならびに腎Ｒｍ織からの大腸菌の分離車はラク
トバチルスを投与することによシ有意に低下した（Ｐ＜
０．０５〜０．０　＋　）０一方、０１．０２　および
０７８血消型病原大腸菌の試験管内増殖能に及はすラク
トバチルス添加の影響を検討した（第９４回日本獣医学
会講演要旨集＋２８ｉ）、Ｌ、アシドフィルスが添加さ
れた時には、培養４８時間目から各血清型のレベルを越
えて病原大腸菌の増殖抑制が観察され、Ｌ、アシドフィ
ルスとり、サリパリクスの２菌種が同時に病原大腸菌の
培地に添加された時には、その病原大腸菌の増殖抑制効
果はさらに大きく、しかも、培養早期から観察さｉまた
っこれに反し、Ｌ、ザリパリウス単独が添加された時に
は、どの血清型の大腸菌にも増殖抑制は観察されなかっ
た。

ＬｕｒｏｕＲｓｅ　はニワトリにり、アシドプイルス添
加飼料を寿えたところ、抗生物質と同程度の効果を認め
た（　Ｌｅ８Ｉｎｄ　ｄｅ　Ｉ’Ｂ１１ｎ、　Ａｎｉｍ
、　２１２＋　１５＋＋ｑｑａ　）。Ｔｏｒｔｕｅｒｏ
　／ｄ、ふ化直後から５日間ドアシトフィルスの凍結乾
燥物を飲水に溶解して与えたところ、９日齢で盲腸のり
、アシドフィルス菌数が著しく増加し増体重と飼料要求
率が抗生物質と同程度に改善されることを報告した（　
ＰｏｕｌｔＳｃｉ、５２，１９７．　１９７３　）。

同様に、子ブタでもＬ、アシドフィルスを与えることに
よって腸灸の発生が漸次減少し、腸内にも、アンドフィ
ルスが優勢菌として残ることが明らかにされている（　
Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ＼’Ｃｔ、、　１８．、’２８７゜
１（？６５　）。又、Ｋｉｎｇ　け肥ｉ［ＫｉＬ、丁う
・ドフイルヌを離乳抜５日間投与（７たところ、増体重
ならびに飼料要求率が有意に改善さｉ］−ることを報告
；。

たＣ　ＶｅＬｅｒｉｎａｒｆ、ｎ　５．２７３．　Ｉ’
？ＦＪ　）　、　Ｍｉｔｃｈｅ１１トＫｅｎＷＯｒｔｈ
ｙ　＃：ｔストレグトコツカス・フエＳ／ウム（５ｔｒ
ｅｐｔｎ＋１ｏｃｃｕｓ　ｆａｅｃｔｕｍ　）とラクト
バチルス・ブルガリウｘ　（Ｌ、　ｂｕｌｇａｒｉｕｓ
　）　の培養上清に抗−大腸菌活性を認め、Ｌ、プルガ
リウムとストレグトコツカＸ−７エカーリス（５ｔｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃｕｓｆａ＋＋ｃａｌｉｓ　）　の培養液
成分中Ｆτ病原大腸菌のエンテロトキシン（ｅｎｔｅｒ
ｏｔｏｘｉｎ　）　′ｊｆＣ中和する物質Ｃ）あること
を見出し、病原大腸菌を人工感染させた早期離乳豚にラ
クトバチルス・プルが１１カス（Ｌ。

ｂｔ＋１ｇａｒｉＣｏｓ　）　の培養液を与えた場合、
増体重、育成出、致死までの日数にいずれも良い効果が
あつたことを報告している（　Ｊ、　Ａｐｐｌ、　Ｔ３
ａｃｔ、ｅｒｉｏｌ。

４１．１６３．１９７６　）。

以上の成績は、いずれも正常腸内菌叢としてのラクトバ
チルスの有用性を示すものでおる〇わが国でけ、こｉｔ
ｔでに、家禽ならびにニワトリの飼料要求率の向上１発
育の促進、予防又は治療の目的から飼料中に大量の抗菌
性物質が添加されてきた。しか（、なから、いくつかの
抗生物質は、宿主の蛋白質乃°らびに免疫グロブリンの
合成を障害１．・′・ニーの結果、ワクチンの免疫応答
を低下させたり、宿主の防御にかかわりを持つ腸内菌叢
にも悪影響を及ホ１１、そのため、自発性（日和見）感
染が成立し７やすくなると考えらｉする。

１９８１年４月、飼料の安全性確保および品質の改善を
図るため薬事法が改正され、従来、動物の発育促進剤と
して使用＃れできた抗菌性物質の飼１）　ヘ（２）添加
が厳しく規制穴れるようになった。

これに伴って抗菌性物質に代わるものとしてラクトバチ
ルスなどの生菌剤、例えば、Ｌ、７シドフ（Ａ、　スｊ
　リなる乳酸菌培養物が飼料添加あるいは動物ｍ治療薬
としてにわかに注目され市販されるに至った。

そのようなラクトバチルス生菌剤の製造は、所望の乳酸
菌菌株を常法で培養することによって行なわれる。しか
しながら、乳酸菌としてり、アシドフィルスを培養する
場合に多くのビタミン類を含まない安価で単純な組成の
培地を利用して培養すると、培地の単位容量当たりに高
い菌数のＬ・アシドフィルスを含む培養物を得ることは
困難であることが見出されている。

本発明者らは、この問題を解決するためニワトリやブタ
の消化管内でり１丁シトフィルスとり。

サリパリクスが共生関係にあることに着目し、二’７）
りの腸管から分離したし、アシドフィルスとＬ　ザリパ
リウスとを共生的に混合培養すると・菌の増殖を奏して
菌量を増収できると予懇し試験によって両穏の乳酸函菌
株の共生的培養によって種す有利な効果が得られること
をａｊ認１．た。そ１゜て、こｉｔＫ基づいて本発明を
完成（〜た。

すなわち、本発明の要旨となるところは、乳酸菌によっ
て利用されろ炭素源と窒棄源とを含む培地中でり、アシ
ドフィルスとり、サリバリウスとを共生的に混合培養し
、これにより■７．アシドフィルスの増殖を促進させる
ことを特徴とするり。

アシドフィルスとり、ザリバリウスを含む乳酸菌培養物
の高蚊がＩｌｌ造法である。

従来、高い菌量でり、アシドフィルスを含む乳酸菌培養
物を得ろためには、培養中に培地内にぎクミン類又はこ
れと均等的な物質１例えば高価な肝Ｉ！＠抽出液を存在
することが必要と考えられｒいたが、本発明の方法では
、そのような多量のビタミン類を培地中に存在させなく
て済み、安価に目的の乳酸菌培養物を製造できる。

本発明の方法においては、所要の炭ｆ源、窒素源と無機
塙とを含む培地にり、アシドフィルスとり、サリパリウ
スとを同時接種１７．３６〜３８°Ｃで静置培養Ｌ７．
培養液中に必、要な菌をのＬ　、アシドフィルスが増殖
するま千培養を紗ける。培養終了後は、所望ならば、こ
れら乳酸菌の生存１．、た状態で適当な手段により培養
液ｔ−濃縮又は完全脱水。

例えば凍結乾燥１．て、乳酸菌を含む濃厚菌液又は乾燥
粉末の形の所望の乳酸菌培養物を収得することができる
。

本発明の方法を夷抱するに当って、乳酸菌を培養するに
用いる栄養源としては、細菌の栄養源として公知のもの
を適宜使用できる。例えば、市販されているグリセリン
、　グルコース、　ラクトース、　シュクロース、　デ
ンプン、　マルトース、ａｔ蜜などの炭水化物、脂肪か
とを炭素源として・また、市販されているペプトン、　
肉エキス、　コーンスティーグリ力、　綿実粉、　落花
生粉、　大豆粉、　コーングルテンミール、魚粉＠　ｐ
母エキス、Ｎ−Ｚアミン、　カゼイン。

硝酸ナトリウム、　硝酸アンモニウム、　硫酸アンモニ
ウムなどを窒素源として、食塩、　燐酸基。

ｔｊｔｅカルシウム、　硫酸マグネシウムなどを無機の
栄養源としてそれぞれ使用できる。その他必要に応じて
微量の金屈頃を添加する。これらのもσ〕は、乳酸菌が
利用し、また、本物質の生産を妨害しないものであｉｌ
、ばよい。公知の細菌の培養材料はすべて使用できる。

Ｌ、アシドフィルスの接種量とし・サリパリクスの接種
量との比率は約１：０．５乃至０．５：ｌの範囲である
ことができ、好ましくは約１：１である。

本ｎ明の方法で使用できるり、アシドフィルスの一例は
ニワトリ由来のり、アミドフィルス■型であり、Ｌ、サ
リパリウスの一例鉱ニワトリ由来ノＬ　、　サＩＪ　ハ
ＩＪウスｌＶａ型であり、本発明者らは、これらの菌株
を１９８０年光岡知光間士から分与された。これらの菌
株は昭和５８年１０月１日に微工研（工業技術院微生物
工業技術研究所）に、夫々に微工研菌寄第７２９０号及
「第７２８９号として寄託された。

本発明の方法で使用できるニワトリ由来り、アシドフィ
ルス■型（ｒｇａＭＰ−７２９０）とり、−ｔｌ−Ｉ７
パリウスｌＶａ型（ＦＥＲＭＰ−７２ｇｑ　）の菌学的
性状は以下の通シである（　ｚｂｔ　ｆ　Ｂａｋｔ、　
Ｉ　Ｏｒｉｇ、２１０゜３２−５１．１９６９　）。

菌落の性状：Ｌ、アシドフィルスは正円１表面・ｌ？Ｉ
ｌ様とも粗精であり、ＢＬ寒天平板上で灰褐色、中心凸
状の集落をつくる。

Ｌ、ザリパリウスは正円１表面、ｒＲ縁とも平滑。

ＢＬ寒天平板上では乳褐色で半円状に***し、中心部茶
褐色である。

菌］’ＥｄｉＪｌ：Ｌ、アシドフィルスは太さが比較的
均−力桿菌、単在、又は短連鎖状に１列し、束状に塊を
つくる場合もある。

Ｌ、サリバリウスはダラム陽性、短桿菌あるいは球桿菌
で短連鎖１〜たり糀棒状を呈する。

１５°Ｃでの発育；両菌種とも１５″Ｃで発育しない。

運動性；・　両菌種とも運動性はない。

乳酸の旋光性：Ｌ、アンドフィルス１ｊＤＴ、ｆ、Ｌ、
ザリパリウスのそれけＬ（＋）である。

牛乳凝固＝Ｌ、アシドフィルスは陰性、Ｌ、ザリパリウ
ヌは陽性である＠ クエン酸塩からのガス産生能：両菌種とも陰性である。

す／が酸塩からのガス産生能：Ｌ、アシＩ゛フィルスｔ
ｊｌ性、Ｌ、サリパリウスは陽性である。

単糖種の分解能：両菌種ともアラビノース。

キシロース、　ラムノース、　リ？−スを分解しない。

二糖種の分解能：Ｌ、アンドフィルスはサッカロース、
　マルトース、　セロビオース、　ラクトース、　メリ
ビメースを分解するが、トレハロースを分解しない。

Ｌ、サリパリウスはサッカロース、　マルトース、　ラ
クトース、　メリピオースを分解するが、セロビオース
とトレハロースを分ｓしない。

三糖種の分解能：Ｌ、アンドフィルスはラフィノースと
メレチトースを分解する。

Ｌ、サリバリウスはラフィノースを分解するが、メｖチ
トーｘを分解しない。

多糖種の分解能：Ｌ、アシドフィルスはデキストリンと
スターチを分解するが、Ｌ、ザリパリウスはこれらを分
解しない。

多価アルプール類：Ｌ、アシドフィルスはマンニットと
ンルビットを分解しないが、Ｌ、サリパリウスはこれら
を分解する。

ｒＲ１体：・　Ｌ、アシドフィルスはエスクリン。

→ノ・ワシノ、　アミグダリンを分解するが、α−メチ
ルグルコシドの分解は士である。

Ｌ、サリパリウスはエスクリンとサリシンヲ分解するが
、アミダダリンとα−メチルグルコシドを分ｗＩｔ〜な
い。

次に、本発明の方法を実飽例、比較例及び参考例につい
て具体的に説明する。これらの例で用いる各種の培地の
組成及び調製法を先づ説明する。

Ｃイｌ　ＢＬ寒天培地 このＲＬＱ天培地は、ラクトバチルスの集落ヲ釣閑した
り、菌数の測定に用いられる。

培地組成： ラプーレムコ（Ｌａｂ　−１’ｅｍＣｏ）牛肉エキス（
Ｏｘｏｌｄ　）−−−−３，Ｏｆ ！ロチオース・イブトン（Ｐｒｏｔｅｏｓｏ　ｐｅｐｔ
ｏ−ｎｅ　）　ｇ　３　（Ｄｉｆｃｏ）　−−−−１０
，０１Ｆトリプデイケース（Ｔｒｙｐｔｔｃ柿ｅ）　（
ＢＢＬ）−−−−５，Ｏｆ フイトン（Ｐｈｙｔｏｎｅ）　（ＲＢＬ）−−−−３，
０ｔイースト・エキストラクト（Ｙｅａｓｔ・ｅｘｔｒ
ａｃｔ）（Ｄｉｆｃｏ）　５．Ｏｆ 肝臓抽出液（ビタミン顔合ｔｒ）（注１）−−−−１５
０，／ ブドウ糖　−−−−１０，０ｆ ｉ［溶性デンプン　０．５２ ？ＦｆｆＡ　（注２）−−−−１０−Ｏｍ！溶液Ｂ　（
注５＞　ｓ、ｏイ ツイーン８０（表面活性剤）　−−−−＋、ＯＶ寒　天
（り１ｆｃｏｌ　−−−−１５，ＯｆＬ−システイノ膓
ｅ切　−−−０，５Ｆつ、血液　−−−〜　５０　ｍｐ 蒸留水　−−−−１６５ｍ＋！ ｐｌ＋　７．２ （注１）’肝臓末（ｉｌｊ’）ｌｏｆｔ１７０−のＮｐ
水で５０〜６０−’Ｃのウォーターバスで約１時間浸出
！また後、Ｉｏｎ”Ｃ１５分加熱し、Ｆ紙で濾過。ｐＴ
＋を７．２に修正Ｌ−にもの。

（注２　）：　ＩＣＩＴ　ＰＩ’＋　２５　ｆとに、Ｆ
ＴＰ０４２５　Ｆと２゛４ を′ｎＩ製水２５０ｄに消録１，７たもの。

（注５１　：　ＭｇＳＯ４＋７Ｈ，０１ｏ　ｆ　、　Ｆ
ｐＲＯ４−７Ｈ，ＯＯ，５ｆ　、　Ｎａｐ／　０．５　
ｆ　、　ＭｎＳＯ４０，：ｔ３７　ｆ　を精製水２５０
ｍｇに溶解したもの。

このＢＬ寒天培ｔｌ！１　’７−”調贋りけ、つ１向液
以外の成分を加熱して溶解しｐＴ（を修正、１１５８Ｃ
２０分間滅菌後５０°Ｃに冷却（７ウマ向＃を無菌的に
加え、シャーレに分注して平板とずろことにより行わり
。

る。

（ｏｌ　Ｒｒｉｇｇｓ　１ｉｖｅｒ　ｂｒｏｔ、ｈこの
培地は、ラクトバチルスの増殖用として用いられ、従来
慣用されるビタミン類（肝臓抽出液の形で使用される）
を含む高価々培地の代表例であるＯ 培地＃ｌｌｌ成： トートジー−ス浸出液　（注４） −−−−４００〒− ネメベデトノ　（Ｄｉｆｃｏ、）　−−−−１５，Ｏｆ
イースト・エキストラクト　（Ｄｊｆｃｎ）−−−−６
，０ｆ 肝１匹抽出液　−−−−７５彎ｌ ブドウ糖　−−−−’２０．ＯＦ 可溶１生デンデノ　−一−−０，５Ｇ’食ｊｆｉ　−−
−−５，０Ｆ ツイーン８０　−−−−　１．０ｆ Ｌ−システィーン塩酸堪　−−−−０，２Ｆ精製水　−
−−−５２５ゴ ｐ？？　−−−−６，８ （ｉ７Ｉ）：）マドジュース（デル千ンテ）に等量のｎ
Ｉｌ！１１７ｋを加え、時々攪拌しｈｔｚら１時間半加
熱［・た後１ｐ紙で濾過。Ｉｎ　’Ｓ　ＮｉＯ■Ｔ　ｆ
　ｐＴ７７．Ｑに修正し、たもの。

←う　ＬＢ培地（仮称） 仁の培地は、本発明の方法で用（・・るのに好苦しいも
のであ一］で、高価なビタミン類を含址斤い安価な合成
培地の代を例である、こｈはラクトバチルスの増殖用培
すＩ（１，と；−て適する。

培地Ｍ３Ｆｉ！、； イースト・エキストラクト　〜−−−ｌｆ４．０　ＩＰ
々グトン　−−−−１０，（ｌ　ｆ ブドウ糖　−−−−１０，Ｏｆ 酢酸ナトリウム　−−−−１５，Ｏｆ システイノ塩酸廖　−−−−＋、ｏｐ ツイーンｇｏ　−−−−＋、ｏｆ 精製水　−−−−１，０００ｒｒｔｅ ｐＴ（６、５ この培地の調製は常法で必要＋１ｊｉ分を混合し滅菌し
−ｒ行われる。

実綿例１ 前記のＢＬ寒天培地平板に一次培養したし・アシドフィ
ルス■型又はり、ザリパリウスＩＶ　ａ　型の集落をそ
れぞれ１個釣菌し、前記のＢｒｉｇｇＦＩｌｉｖｅｒｂ
ｒｏｔｈ　（従来用いむ−れたビタミン類を含む高価、
複雑な組成の培地の例）にそれぞれ接種し、３６〜３８
°Ｃで１８時間培養した。このよ°２にして３代継代し
たり、アシドフィルス■型の培養菌液とＬ・サリ″リウ
スｌＶａ型の培養菌液を種菌として用い、増殖用として
５ｔのＢｒ１ｇｇ５１ｉｖｅｒ　ｂｒｏｔｈにそれぞれ
２％の接種量で両者を同時接種し３６〜３８°Ｃで培養
した。静置培養開始後６，９゜＋２．１５．１８．２１
．２４時間目に培養菌液を採取し菌数の測定を行った。

実験は３回実抱した◎その結果を第１表に示す。比較例
として、上記の２種の乳酸菌菌株の一方のみ、すなわち
り。

アシドフィルス■型のみを同一条件で単独に培養して、
同様に菌数を測定した。その結果も第１着に示す。Ｌ、
アシドフィルスの増殖ｈＬ、ｖリパリウスＩ％’ａ型と
の同時接種により多少とも促進される傾向が認められた
。

なお、記１表の実験１，２．３の結果は添何図面の第１
図、第２図、第３図におのおのに図表的に表わした。

なお、上記の参考例及び後記の突怖例において、菌数の
測定方法は次のように１．た。すなわち、培養菌液１ｄ
を９−の希釈液（下記の組成をもつ）で希釈［７て１０
　希釈液を作す、順次１０倍階段希釈液を作り、培養液
に含まれる菌数に応じて適当な３〜４段階の希釈液の０
．０５＊ｅを表面をよく乾燥させたＢＬ寒天培地平板の
１／３〜１／４区画にピペットで滴下し、コンラジ棒で
一様に塗布する。

接種の完了した平板は、ただちに蓋の方を上にして嫌気
ジャー（ヒラヤマ製作所）に収め、その上にアルマイト
シャーレヲ載セる。スチールクール（グレードＯ）をＩ
Ｏｒ程度に切りとり酸性硫酸鋼に浸した後、手で水をし
ぼり、はぐ］−てからすぐアルマイトシャーレの上にの
せ、ジャー中を炭酸ガスで満たす。３７８Ｃで４８時間
前後培養した後菌数を測定する。

塗体希釈液の１成： ＫＨ２ＰＯ４−−一−４，５８’ Ｎａ２ＨＰ０４−−−−　６．０　？ システィン塩酸塩　−−−−０，５ｆ ツイ一ンｇｏ−−−−　０．５Ｆ 寒天　−（’１．５１Ｆ 精製水　−−一−１，０００ｍｌ 各成分を加熱して水に溶かし、試験管に９−ずつ分注し
ブチルゴム栓をして１２１℃１５分間滅閉して用いる。

実雄ｆ１１２ 前記のＢＬ寒天培地平板に発育させたし、アシドフィル
ス■型又はり、ザリパリウスＩＶａ型の集落をそｉｔぞ
れ１個釣菌し、前記のＬＢ　ｂｒｏｔｈ　（仮称、多く
のビタミン類を含まない安価で単純な耕成の培地）に接
種し３６〜３８ｎＣで１８時間培養した。このようにし
て３代継代したし、アンドフィルス■型の培養菌液とり
、すＩＪ’　／々リウスＩＶａ型の培養菌渣とを増殖用
の５ｔのＬＢ　ｂｒｏ　ｔｈ　におのおの２悌の接種量
で両者を同時に接ｆｉ　Ｌ　３６〜３８°Ｃで培養した
。静置培養開始後６・　９・　１２・＋５．１１　２１
．２４時間目に培養菌液を採ルし菌数の測定を行なった
。実験は３回行なった口その結果を第２表に示す。比較
例として、一方の菌株のみ、すなわち、Ｌ、アシドフィ
ルス■型のみを単独に培養して同様に菌数を測定した。

その結果も第２表に示す。Ｌ、アシドフィルス■型の増
殖けり、サリパリウスＩＶａ型との同時接種によって顕
著に促進された。

なお、第２表の実験１，２．３の結果は第４図、＃￥５
図、第６図におのおのに図表的に表わした口参考例 上記の実株例によって本発明の方法で得られた乳酸菌培
養物を凍結乾燥（７て得られた乳酸菌生菌剤における菌
の安定性を次のようにして試験した。

すなわち、実施例２の混合培養法によって得られたり、
アシドフィルスとり、サリパリクスを含む培養液から菌
体を連続遠心法によって集菌したその援、後述の組成の
凍結乾燥保護剤と混和し、凍゛乾用バイアルに４．０−
ずつ分注し常法に従つ“て凍結乾燥した。５０ツトの試
作品について＋４〜＋１０°Ｃ保存下でのり、アシドフ
ィルスの安定性を検討した。＋４〜十＋ｏ″ｃの冷暗所
に少なくとも１２ケ月間保存した後に各バイアル中の■
・、アシドフィルスの生存菌数を測定し、次の第３表の
結１ｔ（ｌた。Ｌ、アシドフィルスの菌数は低下せず。

本発明による共生的混合培養法によって得られた凍乾乳
酸菌生菌剤製品の安定性が奥証された。

第３表 なお、上記の保護剤の組成は次の通りである０グルタミ
ン酸ナトリクム　−−−−’５０．Ｏｆ可溶性デングン
　−−−−５０，（’）　ｆシヨ糖　−−−−５０，Ｏ
ｆ システィン壊酸塩　−−−−２０，Ｏｆリ　ジ　ンＨ翼
　酸塩　−−−−２ｏ、ｏ　タチオ尿素　−−−−１０
，Ｏｆ ｆ１ｔ製水−−−−＋、ｏｏｏ　、ｐ。

〆薯　−−−−６，５

【図面の簡単な説明】

第１図、８３２図、第３図は、実皓例１における第１表
のおのおのの５ｉｌｌ！Ｗ／！結果の図ト図を示す。 第４図、第５図、第６Ｍは、実施例２における第２表の
おのおのの実計結果の図表図である。 第１〜第６図において、縦軸はり、アシドフィルスの菌
数（Ｌｏｇ、　ＩＱ　／　ｍｌ　ｊ＠養液）を示し、ｔ
ＩＩＩ軸は培讐時間（時間）を表わす。白丸を結ぶ曲線
はり。 アシドフィルスを嘔独培養した場合（比較ｆｌＩ）を示
し、黒丸を結ぶ曲線は本発明によりり、サリパリウスと
共生的混合培養した場合（実ｍｆ１１）を示す。 培養時間 培養時間 培養時間 培養時間 培養時間 培養開間

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 乳酸菌によって利用される炭素源と窒素源とを含む培地
   中でラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａ
   ｅｉｌｌｕｓ　ｎｃｉｄｏｐｈｉｕｓ　）　とラクトバ
   チルス・サリパリウス（Ｌ＋ｘｃｔｏｈａｃｔｌｌｕｓ
   　５ａｌｉｖａｒｉｕ＊’）とを共生的に＃ｆ養し、こ
   れによりラクトバチルス°アシドフィルスの増殖を促進
   させることを特徴トスるラクトバチルス・アシドフィル
   ストラクトバチルス・サリパリクスを含む乳酸菌培養物
   の高収量製造法。