BG61925B2 - Фактор, стимулиращ човешки гранулоцитни колонии - Google Patents

Description

(57) Факторът намира приложение в биотехнологиите и медицината като профилактично и лекарствено средство, по-специално при хемотерапевтиката. Той се използва за засилване биофилактичната способност на гостоприемника при опортюнистични инфекции, причинени от високо резистентни на лекарства микроорганизми, в резултат на което се подобрява фагоцитното и бактерицидното действие на левкоцитите чрез спомагане растежа и диференциацията при узряване на неутрофилните и макрофагните клетки. Изобретението се отнася също и до ген, кодиращ полипептид, имащ активността на стимулиращия колонии фактор (CSF), до рекомбинантен вектор, включващ този ген, до трансформант, съдържащ вектора, до полипептид или глиикопротеин с CSF активност, продуциран от посочения трансформант, както и до предпазващ от инфекции агент, който съдържа CSF като ефективна съставна част.

претенции, 17 фигури (0&)ФАКТОР, СТИМУЛИРАЩ ЧОВЕШКИ ГРАНУЛОЦИТНИ КОЛОНИИ

Настоящето изобретение се отнася до фактор, стимулиращ човешки гранулоцитни колонии. По-точно, настоящето изобретение се отнася до ген кодираш полипептид, притежаващ активността на стимулиращия колонии фактор (тук по-нататък съкратено се отбелязва като CSF)*който е специфичният стимулиращ фактор, необходим за главната цел - образуване на колонии от човешки гранулоцитни клетки. Настоящето изобретение, също така, се отнася до рекомбинантен вектор, включващ посочения ген, трансформант, съдържащ посочения вектор, полипептид или гликопротеин, притежаващ CSF активност, като произведен от посочения трансформант, и един предпазващ от инфекции агент, който съдържа CSF като една ефективна съставна част.

Когато се култивират клетки от костен мозък като клетки миши и бъбречни или зародишни клетки по метода на двуслоен мек агар, като клетките от костен мозък са в горния слой, а клетките от бъбрек или от зародиш са в долния слой, част от клетките в горния слой прораства и се диференциира до образуване на колонии от неутрофилни гранулоцити (по-нататък разглеждани просто като гранулоцити), или моноцитни макрофаги.

Наблюденията са довели до предположението за наличието in vivo на фактори, които спомагат образуването на колонии [Pluznik and Sach, J. Cell. Comp. Physiol., 66, 319 (1965); and Bradley and Metcalf, Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci., 44, 287 (1966)].

Тези фактори, които колективно се отнасят към CSF са известни като продуцирани от клетки, такива като Т-клетки, моноцитни макрофаги, фибробласти и ендотелни клетки, които обикновено се широко разпространени in vivo. В подкласовете на CSF се включват : гранулоцит-моноцитни макрофаги CSF (съкратено като GM-CSF), които действат върху стволовите клетки на гранулоцити или моноцитни макрофаги по такъв начин, че те стимулират растежд на такива стволови клетки и индуцират тяхната диференциация до образуване на колонии от гранулоцити или моноцитни макрофаги; моноцитен макрофаг CSF (съкратено М-CSF), който е предимно способен да образува колонии от макроцитни макрофаги; мултипотентен CSF (съкратено като мулти-CSF), който действа върху по-малко дифиринциирани мултипотентни стволови клетки; и гранулоцити CSF (съкратено каτο G-CSF) от типа

-3' разглеждан в настоящето изобретение, който главно е способен да образува гранулоцитни колонии. Напоследък се поддържа мнението, че степените на диференциация на клетките мишени се различават помежду си за отделните подкласове CSF [Asano, Taisha-Metabolism and Disease, 22, 249 (1985); and Yunis et al., Growth and Maturation Factors; edited by Guroff, John Wiley & Sons, NY, vol. 1, 209 (11983)].

Много съобщения върху човешки CSF бяха публикувани, поточно, CSF, получен от нормални човешки тъкани и CSF, получен от човешки туморни клетки [виж например Stanley et al., Fed. Proc., 35, 2272 (1975); Burgess et al., Blood, 49, 573 (1977); Shah et al., Blood, 50, 811 (1977); Fojo et al., Biochem., 17, 3109 (1978); Okabe et al., Cancer Res., 38, 5910 (1978); Asano et al., Blood, 49, 845 (1977); Golde et al., Blood, 57, 1321 (1981 ); Wu et al., J. Biol. Chem., 254, 6226 (1979); and Dipersio et al., Blood, 56, 717 (1980)].

Обаче, тези видове от човешки CSF не са в напълно чиста форма и много от тях са останали непознати от гледна точка на полезността и ефективността на човешкия CSDF като фармацевтичен агент.

Последните постижения в хемотерапевтиката в областта на инфекциозни заболявания са били толкова значителни, че стана възможно да се победят известните микроорганизми, продуциращи силни токсини, притежаващи специфична патогенност. От друга страна, в следствие напредъка на медицината и нарастване популацията от възрастни хора, броят на рисковите гос-

-4-

топриемници с намалена биофилактична способност нараства, и опортюнистичните инфекции от патогенни микроорганизми, които

имат слаба

патогенност, но които са толерантни на лекарства

и дезинфектанти, предизвиква нови проблеми в областта на

клиниката.	Опортюнистични инфекциозни заболявания се предиз-
викват от	високо резистентни на лекарства бактерии или фун-
ги, които	не могат да бъдат победени от много от обикновен-

ните антибиотици, и тези заболявания се третирет за предпочитане чрез прилагане на комбинации от конвенционални хемотерапевтици и лекарства, които засилват биофилактичната способност на гостоприемника. За съжаление, все още не са намерени такива засилващи лекарства.

Гостоприемниците притежават няколко биофилактични способности, и в по-ранния париод на инфекциите фагоцитното и бактерицидно действия на левкоцитите биха били едни от найвлияещите фактори, така че се предполага, че лекарствата ще

са окажат

ефективни при лечение на инфекции, ако те са в

състояние да повишат способността на гостоприемника да се предпази сам от инфекции, спомагайки растежа и диференциацията при узряване на неутрофили и макрофаги.

Много	усилия бяха направени с цел да се достигне широ-
ко мащабно	получаване на чист човешки CSF, но не се стигна
до успехи.	При обстоятелства, настоящетите изобретатели,

установяавт клетъчен щам, CHU-1, притежаващ една висока спо-

собност за	продуциране на човешки G-CSF, и добра способност
за растеж,	от туморни клетки на пациенти с рак на устната

кухина (този щам е депоЗиранг.С.К.С.М. под номер I- 5·

315) и първи успяват да изолират от супернатантата от културата на този клетъчен щам, чист човешки CSF, който е способен да спомогне образуването на колонии от човешки неутрофили [Japanese Patent Application No. 153275/1984 = EP-A0169566].

Настоящите изобретатели изследват предпазния ефект на този човешки G-CSF срещу микробиални инфекции, като използуват животински инфекциозни модели, и намират че човешкия GCSF е ефективен като терапевтик срещу инфекциозни заболявания, тъй като той е способен да индуцира ясно изразено зреене на неутрофили in vivo, и, следователно показва способността да предпазва гостоприемниците от инфекции.

След това, изобретателите установяват клетъчен щам CHU2, който също е произведен от рак в устната кухина на пациент (този щам е депозиран в C.N.C.M. под No 1-415) и успешно изолират от супернатантата от култура на този клетъчен щам ft чиста форма на G-CSF, която е напълно идентична с този, производен на CHU-1.

Обаче, хомогенен G-CSF трябва да се получи в голямо количество по метода на клетъчно култивиране, при което G-CSF се изолира от супернатантата от култура на кой да е клетъчен щам, защото G-CSF може единствено да се получи в ниски концентрации, и се изискват сложни процедури на пречистване, за да се получат следи от G-CSF от голям обем културална течност. Ето защо, твърде желателно е да се достигне масова продукция от G-CSF чрез рекомбинантна ДНК-технология.

Международна патентна заявка W0-A-87 /01152, публи- 6кувана на 26.02.1987 и притежаваща най-ранна приоритетна дата от 23.08.1985, се отнася до производтството на фактор, стимулиращ човешки плурипотентни гранулоцитни колонии, чрез рекомбинантна ДНК-технолотия.

Една от целите на настоящето изобретение е да осигури ген, кодиращ полипептид, притежаващ активността на човешки G-CSF.

Друга цел на настоящето изобретение е да осигури рекомбинантен вектор, включващ посочения ген.

Още една цел на настоящето изобретение е да осигури трансформант, който се произвежда чрез трансформиране на гостоприемника със споменатия рекомбинантен вектор, и полипептид, или гликопротеин, който се произвежда от споменатия тр ансформант.

Следваща цел на настоящето изобретение е да осигури един предпазващ от инфекции агент, който съдържа човешки GCSF като ефективна съставна част.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фиг. 1. показва амино киселинните последователности и нуклеотидните последователности от три различни проби, IWQ, А и LC;

Фиг. 2. показва нуклеотидната последователност на pHCS -1 инсърт.

Фиг. 3. (А) показва нуклеотидната последователност на сДНК инсърта в pBRG4;

Фиг. 3. (В) (I) показва амино киселинната последова- 7телност на човешки G-CSF предшественик като изхождащ от pBRG4 сДНК.

Фиг .

3 (В) (II) показва амино киселинната последова-

телност на човешки матуритетен G-CSF като изхождащ от pBRG4 сДНК;

Фиг .	4 (А) показва нуклеотидната последователност на
сДНК	инсърта в pBRV2;
Фиг .	4 (В) (I) показва амино киселинната последова-

телност на човешки G-CSF предшественик, като изхождащ от pBRV2 сДНК;

Фиг .

4 (В)(11) показва амино киселинната последова-

телност на човешки матуритетен G-CSF като изхождаш от pBRV2 сДНК;

Фиг .

5. показва сайтовете за разцепване на рестрик-

ционните ензими, производни на pBRG4 или pBRV2 човешки

G-CSF сДНК.

Фиг .

б. частично представя процеса за получаване

на вектор, съдържащ tac промотор (+VSE линия).

Фиг	7. представя процеса за получаване на век-
тор,	съдържащ Р(_ промотор (+VSE линия);
Фиг .	8. представя процеса за получаване на век-
тор,	съдържащ trp промотор (+VSE линия);
Фиг .	9. частично представя процеса за получаване

на вектор, съдържащ tac промотор (-VSE линия).

Фиг .	10. представя процеса за получаване на век-
тор,	съдържащ PL промотор (-VSE линия);
Фиг .	11. представя процеса за получаване на век-

-βτορ, съдържащ trp промотор (-VSE линия);

Фиг. 12. показва схематично структурата на pHGA41O;

Фиг. 13. представя процеса за конструиране на един експресионен рекомбинантен вектор pTN-G4;

Фиг. 14. а/ и Ь/ показват два процеса за конструиране на pHGG4-dhfr;

Фиг. 15. показва схематично структурата на pHGV2;

Фиг. 16. представя процеса за конструиране на един експресионен рекомбинантен вектор pTN-V2; и Фиг. 17. а/ и Ь/ показват два процеса за конструиране на един експресионен рекомбинантен вектор pHGV2-dhfr;

Генът, кодиращ за полипептида, притежаващ активността на човешки G-CSF, съгласно настоящето изобретение, е ДНК (сДНК), която е комплементарна на информационната РНК (тРНК), която се получава като 15-17 S фракция чрез центрофугиране в захарозен плътностен градиент.

Авторите на настоящето изобретение, получават две линии от тази сДНК.

сДНК от едната линия притежава целия или част от гена, кодиращ полипептида I или II, показан на фиг. 3- (В)* Поспециално, тази сДНК има нуклеотидната последователност, изобразена чрез ATG при 32-34 нуклеотидни позиции от 5’-края [виж фигура 3. (А)] и ССС при 650-652 нуклеотидни позиции, или чрез АСС при 122-124 позиции и ССС при 650-652 позиции. Алтернативно, сДНК има нуклеотидната последователност, показана на фигура 3 (А) или част от нея. сДНК от тази линия, тук по-нататък, се означава като сДНК (+VSE).

-9сДНК от другата линия притежава целия или част от гена, кодиращ полипетид I или II, показан на фигура 4 (В). По-точно тази сДНК притежава нуклеотидната последователност, изобразена чрез ATG при 51-32 нуклеотидни позиции от 5’-края [виж фигура 4 (А)], и ССС при 640-642 нуклеотидни позиции, или чрез АСС при 121-123 позиции и ССС при 640-642 позиции. Алтернативно, тази сДНК може да притежава нуклеотидната последователност, показана на фигура 4 (А), или част от нея. сДНК от тази линия по-нататък в това описание се отболява като сДНК (-VSE).

Генът, съгласно настоящето изобретение, може да бъде получен, като най-напред се приготви G-CSF кодирана шРНК от животински клетки на бозайник или други клетки гостоприемници, притежаващи способността да произвеждат полипептид, притежаващ G-CSF активност, като след това споменатата шРНК се конвентира в дву-верижна сДНК чрез кой да е от известните методи.

Клетката от бозайник, която може да бъде използувана като източник за доставяне на шРНК, е човешки клетъчен щам, изолиран от рак на устната кухина CHU-2 (депозиран β Collection Nationale de Cultures de Microorganisms, или C.N.C.M., под No 1-483). Трябва, обаче, да се разбира, че вместо такива туморни клетъчни шамове, могат да се използуват клетки, които могат да се отделят от бозайници или всякакви други установени клетъчни щамове. Получаването на шРНК може да се осъществи чрез един от методите, които вече са били предложени за клониране на гени от някои други

-юфизиологично активни протеини : например, цялата РНК, найнапред се получава чрез обработване със сърфактант и фенол в присъствие на инхибитор на рибонуклеаза, като ванадил-рибонуклеозиден комплекс [виж Berger and Birkenmeier, Biochemistry, 18, 5143 (1979)] или чрез центрофугиране в плътностен градиент на CsCl, следващ^, обработка с гуанидин тиоцианат [виж Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294 (1979)], след това поли(А⁺) РНК (тРНК) се получа^З. чрез подлагане на цялата РНК на групова (batch) адсорбция или афинитетна колонна хроматография върху олиго(dT)-целулоза, или U-Sepharose като за носител се използува Sepharose 2В. Поли(А⁺ ) РНК може да бъде фракционирана чрез съответния подходящ метод, като центрофугиране в плътностен градиент на захароза. Способността на така получената РНК да кодира полипептид, притежаващ G-CSF активността, може да се потвърди чрез няколко метода; например, тРНК се транслира в протеин и се изследват нейните физиологични активност; алтернативно, определя се идентичността на този протеин с помощта на едно анти-G-CSF антитяло. По-точно, тРНК се инжектира в ооцити на Xenopus laevis за осъществяване на транслацията [виж Gurdon et al., Nature, 233, 177 (1972)], или може да се осъществят транслационни реакции със заешки ретикулоцити, или пшенични зародиши [Schleif and Wensink, Practical Methods in Molecular

Biology,

Springer-Verlag, NY (1981)]; G-CSF активността може да се изследва чрез прилагане на метода за култивиране върху мек агар, като се използуват клетки от костен мозък, като, техниките за осъществяване на този метод вече бяха разгледани [Metcalf, Hemopoietic Colonies, SpringerVerlag, Berlin, Heidlberg, NY (1977)].

Едноверижна сДНК се синтезира с така получената тРНК, която се използува като матрица; дву-верижна сДНК се синтезира от тази едноверижна сДНК; а двойно-верижната сДНК се инсерира в един подходящ ДНК-ов вектор, за да образува рекомбинантен плазмид. Този рекомбинантен плазмид може. да се използува за трансформиране на подходящ гостоприемник, наречен Escherichia coli, така че да се получи група от ДНК в трансформантите (тук по-нататък се разглежда като сДНК банка) .

Дву-верижна сДНК може да се получи от тРНК, чрез един от следните два метода : тРНК се обработва с обратна транскриптаза с олиго (dT), която е комплементарна на поли (А)веригата на 5’-край, използуван като праймер; или се синтезира един олигонуклеотид, който съответствува на част от амино киселинната последователност на G-CSF протеина, а сДНК, която е комплементарна на тРНК, се синтезира чрез об- ! работване с обратна транскриптаза, като синтезираният олигонуклеотид се използува като праймер. Дву-верижната сДНК може също така да се получи чрез следните методи: тРНК се разгражда и се отстранява чрез обработка с някаква основа, и получената едноверижна сДНК се обработва най-напред с обратна транскриптаза, или ДНК полимераза I (например Klenow фрагмент ), след това със S1 нуклеаза; алтернативно, тРНК може директно да се обработи с RN-аза Н, и ДНК полимераза j (например E.coli полимераза I). За повече информация виж Ма- ί niatis et al., Molecular Cloning , Cold Spring Harbor Laboratory (1982); и Gubler and Hoffman, Gene, 25, 265 (1985).

Така получената дву-верижна сДНК се инсерира в подходящ вектор, като например един от ЕК-тип плазмидни вектори, означен с pSCIOl, pDF41, CoIE1, pMB9 , pBR522, pBR527 и pACYCI, или един от фаговите вектори, означени с jigt, Ac, 4gt10 и /igtwes, и, следователно, рекомбинантният вектор се използува за трансформиране на щама Е. Coll (например Х1776, НВ1О1, DH1 или СбОО), така, че да се получи сДНК банка, (виж например Molecular Cloning, ibid. ).

Дву-верижната сДНК може да се присъедини към вектор чрез следната процедура : краят на сДНК се снабдява със способен за присъединяване край чрез прикрепване на подходящ химически синтезиран ДНК фрагмент; а ДНК-ов вектор, който е бил разцепен с рестрикционен ензим, се присъединява към споменатата сДНК чрез обработка с ДНК лигаза от Т4 фаг в присъствие на АТР. Алтернативно, dC, dG-вериги (или dT, dA-вериги) се прикрепват, респективно към двуверижната сДНК и към ДНК-овия вектор, който е бил разцепен с рестрикционен ензим, а разтвор, съдържащ двете ДНК се нагрява (Molecular Cloning, ibid.).

Клетката гостоприемник може да бъде трансформирана от така получената рекомбинантна ДНК чрез кой да е от познатите методи. Ако клетката гостопримник е Е. coll, методът, даден подробно от Hanahan [J. Mol. Biol., 166, 557 (1985)] може да се използува, като рекомбинантната ДНК се добавя към компетентна клетка, приготвена в присъствие на CaCl , MgCl или

43RbCl .

Скрининг на клетките, приютяващи желания ген, можа да се осъществи чрез няколко метода, които включват : плюс-минус метода, използуван при клонирането на интерферон сДНК [Taniguchi et al., Proc. Jpn. Acad., 55, Ser. Β., 464 (1979)], метод на хибридизационно-транслационно изследване [Nagata et al., Nature, 284, 516 (1980)], и метод на хибридизация на колонии или плаки, използуваш една олигонуклеотидна натриЦЗ > която се синтезира химически на базата на амино киселинната последователност на протеина, притежаващ активност на човешки G-CSF [Wallace et al., Nucleic Acids Res., 9, 879 (1981)].

Фрагментът, съдържащ така клонирания ген, кодиращ полипептида, притежаващ активността на човешки G-CSF, може да се вкара повторно (ре-инсерира) в подходящ ДНК-ов вектор с цел да се трансформират други прокариотни или еукариотни клеткигостоприемници. Като се въвежда подходящ промотор и асоциирана с експресията последователност във вектора, генът може да се експресира в една индивидуална клетка-гостоприемник.

Примерните прокариотни клетки-гостоприемници включват Escherichia coli, Bacillus subtilis и Bacillus TT-giunophilus. Представляващият интерес ген може да се експресира в тези клетки-гостоприемници, като ги трансформира с репликон (например плазмиден вектор, съдържащ начално регулаторна последователност), който произлиза от съвместими с гостоприемника видова. Желаният вектор е такъв, който притежава последователност, способна да осигури трансформираната клетки със сеΉ лективност за експресирния признък (фенотип).

Например, Е. coll може да бъде трансформирана с pBR522, който е вектор, способен на репликация в Е. coll [виж Bolivar, Gene, 2., 95 (1975)]· Този вектор съдържа и двата гена за резистентност на ампицилин и тетрациклин, и всеки един от признаците може да се използува за идентифициране на трансформираната клетка. Примерите за промотор, който е необходим за генетична експресия в прокариотни гостоприемници, включват промотора на ^-лактамазния ген [Chang et al., Nature, 275, 615 (1978)], лактозен промотор [виж Goedell et al., Nature 281, 544 (1979)] и триптофанов промотор [виж Goedell et al., Nucleic Acid Res., 8, 4057 (1980)]. Всеки един от тези промотори може да се използува за получаването на полипептиди, притежаващи активността на човбшки G-CSF, съгласно настоящето изобретение.

Еукариотен микроорганизъм, такъв като Saccharomyces cerevisiae, би могъл да се използува като клетка гостоприемник и да бъде трансформиран чрез вектор, такъв като плазмид YRp7 [виж Stinchcomb et al., Nature, 282, 59 (1979)]· Този плазмид притежава TRPI-ген като селекционен маркер за дрождев щам, който не притежава способността да произвежда триптофан, така че трансформантите могат да се селекционират чрез осъществяване на растеж в отсъствие на триптофан. Примерите за промотори, които могат да се използуват за генна експресия включват промотор на гена за кисела фосфатаза [Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80, 1 (1985)] и промотор на гена за алкохол дехидрогеназа [Valen- 46zuela et al., Nature 298, 547 (1982)].

Клетката-гостоприемник може също така да произлиза от клетки на бозайник, такива като COS клетки, клетки от яйчник на китайски хамстер (СНО), С-127 клетки и Hela клетки. Един илюстративен вектор, който може да се използува за трансформиране на тези клетки е pSV2-gpt [виж Mulligan and Berg; Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 78, 2072 (1981)]. Векторите, използувани за трансформиране на тези клетки, съдържат начало, селекционен маркер, промотор, предшествуващ по позиция гена, който требва да бъде експресиран, РНК-прикрепящ сайт, сигнал за полиаденилация и т.н.

Илюстративните промотори, който могат да се използуват за генна експресия в клетки от бозайник, включват промотори от ретровирус, полиома вирус, аденовирус, simian вирус 40 (SV40) и т.н. Ако се използува промотора от SV40, желаната генна експресия лесно да се постигне, съгласно метода на Mulligan et al., описан в Nature, 277, 108 (1979).

Илюстративните начала, които могат да бъдат използувани, включват произхождащи от SV40, полиома вирус, алено вирус, говежди папиломен вируус (BPV) и т.н. начала. Илюстративните селекционни маркери, които могат да бъдат използувани, включват фосфотрансфераза АРН (5* ) II, или 1(пео) ген, тимидин киназа (ТК) ген, Е. coll ксантин-гуанин фосфорибозил транасферазен (Ecogpt)ген, дихидрофолат редуктазен (DHFR) ген, т.н.

С цел да се получат полипептиди, притежаващи активността на човешки G-CSF, от гореизброените системи гостоприΊέ· емник-вектор, може да се използува следната процедура : кодиращият за пептида ген, имащ активността на човешки G-CSF, се инсерира на подходящия сайт в един от споменатите по-горе вектори; клетката-гостоприемник се трансформира с получената рекомбинантна ДНК; и получените трансформанти се култивират. Желаният полипептид, може да бъде изолиран и пречистен от клетъчната или културална среда чрез коя дя е от известните техники.

Еукариотните гени, най-общо, се довеждат до изявяване на полиморфизъм, както е известно в случая с гена на човешки интерферон [виж Nishi et al., J. Biochem., 97, 153 (1985)], и този феномен може да причини заместването на една или повече амино киселини, или промяна в нуклеотидната последователност, но не и промяна в амино киселинната последователност въобще.

G-CSF активността може да се притежава, също така, и от полипептид, на който липсва една или няколко от амино киV селините в амино киселинната последователност, показана на Фиг. 3 (В), или който притежава такива амино киселини, добавени към него, или полипептид, който притежава една или няколко от тези амино киселини, заместени от една или повече амино киселини. Известно е, също така, че полипептид, получен чрез превръщане на всеки от цистеиновите кодони на гена на човешки интерлевкин-2 (IL-2) в серинов кодон, притежава активността на интерлевкин-2 [Wang et al.. Science, 224, 1431 (1984)]. Ето защо, доколкото полипептидите, било естествено съществуващите в природата, или химически синтезира~π· ните, притежават активността на човешки G-CSF, всички гени кодиращи за тези полипептиди се включват в обхвата на настоящето изобретение.

По-долу са скицирани процесите за получаване гена, съгласно настоящето изобретение, кодиращ за полипептид, притежаващ активност на човешки G-CSF рекомбинантен вектор, носещ споменатия ген, и трансформант, съдържащ този ракомбинантен вектор, и полипептид или гликопротеин, притежаващ активност на човешки G-CSF, експресиран в този трансформант.

( 1 ) ПРИГОТВЯНЕ НА МАТРИЦА

Хомогенен човешки CSF протеин се пречиства от супернатантата на културД от туморна клетъчна линия CHU-2, и се определя неговата амино киселинна последователносот от N-края. Получени са фрагменти чрез разграждане с бромциан и обработка с трипсин, и амино киселинните последователности на тези фрагменти също се определят [пример 3 (i), (ii), (iii)].

От определените амино киселинни последователности се синтезират три нуклеотидни матрици, (A), (LC), (IWQ), притежаващи последователностите, показани на фиг. 1 (пример 4). Матрица (А) е от смесен тип, съставен от 14 последователни нуклеотида. Матрица (IWQ) се състои от 30 последователни нуклеотида с дезоксинозин, и е матрица от типа, използуван при клониране на гена на човешки холецистокинин [Takahashi et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 1931 (1985)]. Матрица (LC) e 24 нуклеотидна матрица, която се синтезира от нуклеотиди при 32-39 позиции от N-края нй амино киселинната после дователност, показани, в пример 5 (i), на базата на нуклеотиднатсг последователност, показана на фигура 3.

Химичен синтез на нуклеотиди може да се осъществи, като се приложи усъвършенствувания фосфотриестерен метод към твърдо-фазовия метод, и който е преразгледан от Narang [Tetrahedron, 39, 3-22 (1983.)

Примерите, основаващи се на амино киселинните последователности при позиции, различни от тези в посочените по-горе матрици, също могат да бъдат използувани.

(2) КОНСТРУИРАНЕ НА сДНК БАНКА

CHU-2 клетките се хомогенизират, след добавяне на разтвор на гуанидин тиоцианат, и цялата РНК се получава чрез центрофугиране в плътностен градиент на CsCl.

Поли(А⁺) РНК се изолира от цялата РНК чрез колонна хроматография върху олиго (dT)-целулоза. След това, едноверижната сДНК се синтезира с обратна транскиптаза, и се добавят РН-аза Ни Е. coll ДНК полимераза I, до получаване на двуверижна сДНК. Една dC-верига се прикрепва към получената двуверижна сДНК, която се съединява с вектор pBR322, към който се прикрепва една dG-верига при Pst I сайт на разцепване. Получената рекомбинантна ДНК се използува за трансформиране на щам Х1776 Е. coll, и се създава сДНК банка на рВН322-линията (пример 5 и б).

По подобен начин, двуверижната сДНК се присъединява към -//gt1O вектора чрез EcoRI линкер, и се създава сДНК банка на //-фаговата линия (пример 7).

5 (3 ) СКРИНИНГ

Рекомбинанти, произхождащи от сДНК банката на pBR322линията се фиксират върху филтърна хартия Whatmann 541, и посредством колонна хибридизация с Р-белязана матрица (IWQ), може да се селекционира единичен клон. По-нататъшно изследване посредством метода на Southern blott [Southern, J. Mol. Biol., 98, 503 (1975)] показва, че този клон също хибри^изира с матрица (А). Нуклеотидната последователност на този клон се определя последством дидезокси метод (Sanger, Science, 214, 1205 (1981).

Нуклеотидната последователност на полученият сДНК инсърт е показана на фигура 2, от коятО може да се види, че този инсърт се състои от 308 двойки бази, включващи матрици (IWQ) и (А), и притежава отворена четяща рамка, кодираща за 83 амино киселини, съдържащи амино киселинната последователност, показана в пример 3 (ill). рВН322-производният плазмид, съдържащ тези 308 двойки бази, тук по-нататък се отбелязва като pHCS-1 (пример 8).

ДНК фрагментът, съдържащ 308-те двойки бази, получен от pHCS-1 се бележи с изотоп чрез nick транслационния метод (виж Molecular Cloning, ibid.), и заедно с фрагмента, използуван като матрица, се скринира у/gt1О-производната сДНК банка чрез хибридизация на плаки [Benton and Davis, Science, 196, 180 (1977)], до получаване на пет клона. Нуклеотидната последователност на клона, за който се смята че съдържа сДНК, се определя по същия метод, който е описан по-горе [фиг. 3 (А)].

- 20Както е показано на фиг. 3 (А), този сДНК инсърт има единична ш роко отворена четяща рамка.

Амино киселинната последователност, кодирана от тази сДНК, може да се изведе, както е показано на фиг. 3 (А).

Сравнението с N-крайната амино киселинна последователност на G-CSF протеина, показана в пример 3 (i), разкрива, че тази сДНК съдържа нуклеотидна последователност, която отговаря и на двете - на единичен пептид, кодиран от 90 двойки бази, започващ с ATG-последователност при 32-34 нуклеотидни позиции от 5’-края, и завършващ с GCC последователност при 119-121 позиции, и на зрял G-CSF полипептид, кодиран от 531 двойки бази, започващи с АСС последователността при 122-124 позиции, и завършващ със ССС последователността при 650-652 позиции. Следователно, полипептидът от амино киселинната последователност I, показана на фиг. 3 (В), е съставен от 207 амино киселини, и неговото молекулно тегло се изчислява на 22292.67 далтона. Полипептидът от амино киселинната последователност II е съставен от 177 амино киселини, и неговото молекулно тегло се изчислява на 18986.74 далтона (пример 9).

Би трябвало да се отбележи, че ATG при 32-34 позиции, или при 68-70 позиции също така може да се разглежда като сайт за иницииране на протеина на щам Escherichia coli Х1776, включващ pBR322, който е имал тази ДНК (+VSE) в EcoRI сайт на разцепване, е депониран в Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology (FERM BP-954).

Фиг. 5 показва сайтовете за разцепване на рестрикционният ензим на гена .

Тази сДНК се свързва към pBR327 [Soberon et al., Gene, 9, 287 (1980)] при EcoRI сайта, и полученият плазмид, тук по-нататък се отбелязва като pBRG4.

Така полученият pBRG4 се обработва с рестрикционен ензим, EcoRI, за да се получи ДНК-фрагмент, свързващ сДНК с около 1500 двойки бази. Този фрагмент се бележи с изотоп, като се използува nick-транслационният метод (виж Molecular Cloning ibid), и с този изотопно белязан ДНК-фрагмент, използуван като матрица, се скринира //gt10-производната сДНК банка, още веднъж, чрез хибридизация на плаки (Benton and Davis, ibid.). При тази хибридизация на плаки се приготвят два листа от нитроцелулозна филтърна хартия с фиксирана ДНК от /1 -фага; единият от тези листа се използува за споменатата па-горе хибридизация на плаки, а другия лист се подлага на хибридизация на плаки с преди това описаната матрица (LC). Селекционират се фагите, които дават положителна реак-

ция за	двете матрици. Селекционира се клон, който съдържа
цялата	дължина на сДНК и нуклеотидната последователнонст
на сДНК	инсърта, както е определен по дидезокси метода,U е
показан	на фигура 4 (А).

Тази сДНК има единична широко отворена четяща рамка и амино киселинната последователност, която ще бъде кодирана от тази сДНК, се извежда както е показано на фигура 4 (А).

Сравнението с N-крайната амино киселинна последователност на G-CSF протеина, показано в пример 3 (i) разкрива, че тази сДНК съдържа нуклеотидна последователност, която съот- 12 ветствува и на двете - на сигналния пептид, кодиран от 90 двойки бази, започващ с ATG последователността при 31-55 нуклеотидни позиции от 5’-края, и завършващ с GCC-последователността при 118-120 позиции, и зрял G-CSF полипептид, кодиран от 522 двойки бази, започващ с АСС-последователността при 121-123 позиции, и завършващ с ССС последователността при 640-642 позиции. Следователно, полипептидът от амино киселинната последователност I, показан на фигура 4 (В), е съставен от 204 амино киселини, и неговото молекулно тегло е изчислено на 21977.35 далтона. ПолипепТЦльт от амино киселинната последователност II е съставен от 174 амино киселини, и неговото молекулно тегло е изчислено на 18671.42 далтона (пример 10).

Би трябвало да се отбележи, че ATG при 58-60 позиции, или при 67-69 позиции, също може да се разглежда като сайт за иницииране на протеина.

Escherichia coli щам Х1776, съдържащ pBR522, който притежава тази сДНК (-VSE) в EcoRI сайта на разцепване, е депониран в Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial Science and Technology (FERM BP-955).

Фигура 5 показва сайтове за разцепване на рестрикционния ензим на гена. Тази сДНК се присъединява към pBR327 при EcoRI сайта, за да образува плазмид, който тук по-нататък се отбелязва като pBRV2.

(4) КОНСТРУИРАНЕ НА РЕКОМБИНАНТЕН ВЕКТОР ЗА

ЕКСПРЕСИЯ В E.coli (A) +VSE линия рекомбинантен вектор

От така получения pBRG4 плазмид, пример 9, сДНК фрагмент на G-CSF полипептида се изрязва с рестрикционен ензим и се конструира рекомбинантен вектор, чрез един от следните методи :

(i) използващ един хибридизационен синтетичен линкер, фрагментът се лигира с фрагмент, получен от tac промотор-съдържащия рКК223-5 (Pharmacia Fine Chemicals) (пример 11 и фигура 6 ).

(ii) три фрагмента, получени от Р промотор, съдържащ pPL-ламбда (Pharmacia Fine Chemicals), се ЛВГИрат С 6ДИН хибридизационен синтетичен линкер и продуктът от свързването и сДНК фрагмента, се подлагат на процедури на повторно получаване до конструиране на рекомбинантен вектор (пример 12, фигура 7 ); или (ill ) като се използва един хибридизационен синтетичен линкер, фрагментът се свързва с фрагмента, получен от trp промотор-съдържащ pOYI плазмид (пример 13 и фигура 8).

(B) -VSE линия рекомбинантен вектор

По същия начин, както е описано по-горе, три рекомбинантни вектора се конструират, като се използува плазмид pBRV2 (пример 10), както е показано в пример 18 и фигури 9, 10, 11.

(5) ПОЛУЧАВАНЕ НА Е. coli ТРАНСФОРМАНТИ, КУЛТИВИРАНЕТО

И ЕКСПРЕСИЯТА ИМ

Като се използуват три рекомбинантни вектора от всяка една от +VSE и -VSE линиите, Е. coli шам DHI, No 4830, или JM 105 се трансформира посредством процедурата с калциев хлорид, или рубидиев хлорид, описана в Molecular Cloning, ibid, (примери 11, 12, 13 и 18). Всеки от получените трансформамнти се култивира в съдържаща ампицилин среда Luria, като индукцията след това се провежда, както е нужно за да се осъществи експресията (пример 14 и 19).

(6) Получаване и пречистване на G-CSF полипептид от

E.coli и неговия аминокиселинен анализ

Културалният разтвор на трансформантите се центрофугира, за да се получи клетъчна утайка. Събраните клетки се обработват с лизозим и след лизис чрез циклично замразяване и затопляне, се получава супернатантата. Алтернативно, клетките се обработват с гуанидин хлорид, центрофугират се и се извлича супернатантата.

Супернатантата се подлага на гел-филтрация, върху една колона Ultrogel АСА 54 (LKB), и активните фракции се концентрират посредством една ултрафилтрционна апаратура.

След това, един воден разтвор на трифлуороцетна киселина, съдържащ n-пропанол, се добавя към концентрата и след като се остави в лед, сместа се центрофугира и се адсорбира върху обратно-фазова колона С18. След елюиране, фракциите се проверяват за тяхната активност. Активните фракции се събират и подлагат на същите процедури на пречистване, както са описани по-горе. Пречистените фракции се подлагат на сушене чрез замразяване (лиофилизация), и прахообразният продукт се

разтваря и

се подлага на високо ефективна течна хроматогра-

фия, базирана на молекулни размери. Получените полипептиди се

подлагат на	SDS полиакрил-амидна гел електрофореза, и се
потвърждава	Единична ивица за желания G-CSF полипептид
(примери 25	и 29). Така полученият полипептид, показал

човешки G-CSF полипептид, се ан&Лизира посредством един метод за аминокиселинен анализ с Hitachi 835 Automatic Amino

Acid Analyzer (Hitachi, Ltd. ). За анализиране на N-крайните аминокиселини са използувани газово-фазов секвенатор ( за Edman-разпадане), апаратура за високо ефективна течна хроматография и колона U1trasphere-ODS (примери 17 и 20 ).

(7) Конструиране на рекомбинантни вектори за животински клетки

Рекомбинантни вектори (производни на BPV ), за употреба със CCIL27 и Н1НЗТЗ-клетки като животински клетки-госТОприемници се конструират за всяка една от +VSE и -VSE линиите. Рекомбинантни вектори (производни на dhfr) за използуване с НО-клетки, също така са създадени за всяка една от +VSE и -VSE линиите.По-нататък, ’ създаване на рекомбинантни вектори за използуване със CI27 и СНО-клетки, е изложено схематично, и за повече подробности, ще се направят доклади за съответните работни примери.

'26(А) Конструиране на рекомбинантни вектори на +VSE линията

Фрагментът ДНК (+VSE), получен по ( 5) ,М вмъква във вектор ,dKCR, за да се получи плазмид pHGA410(пример 21 и фигура 12) , който се смила частично с EcoRI, последвано от обработка с ДНК полимераза1 (фрагмент на Klenow ), за да се създадат слепващи краища. Линкер Hindlll се прикрепя към ДНК, която след това се обработва с Hindlll и Т ДНК лигаза. Обработената ДНК се използува за трансформиране на E.coli щам DHI, като се използува процедурата с рубидиев хлорид (виж Molecular Cloning, ibid. ). Полученият плазмид е наречен pHGA41O(H)(фигура 23).

pHGA41O(H) се обработва със Sall , и след като се създадат леп/иви краища, той се обработва с Hindlll още веднъж, и Hindlll-Sall-фрагментът се възстановява. Плазмид pdPV-1, притежаващ трансформиран фрагмент от говежди папилома-вирус, се обработва с Kindlll и Pvull, и по-широкият ДНК-фрагмент се отделя и се прибавя към отделно приготвения Kindlll-Sallфрагмент. Обединените фрагменти се използуват за трансформиране на E.coli щам DHI, за получаване на плазмид, pTN-G4, който притежава pHGA41О-производната CSF-сДНК (фигура 13 и пример 22).

И единият, и другият от плазмидите, pHGA41O, или pHGA410(H), в комбинация с плазмид pAdD26SVpA, се използува за създаване на pHGG4-dhfr, който е рекомбинантен вектор (+VSE) за употреба със СНО-клетки ( фигура 14а и в и пример 24).

(В) Конструиране на рекомбинантни вектори на -VSE линията

Фрагментът cHHK(-VSE), получен в (3), се вмъква във вектор pdCR, за образуване на плазмид pKGV2 (пример 27), който се смила частично с EcoRI, последвано от обработка с ДНК полимераза1 (фрагмент на Klenow), за създаване на лепливи краища. Линкер Hindlll се прикрепва към ДНК, която се обработва след това с Hindlll и Т4ДНК-лигаза.Обработената ДНК се използува за трансформация на E.coli щам DHI, посредством процедурата с рубидиев хлорид (виж Molecular Cloning, ibid.). Полученият плазмид е наречен pHGV2(H) (фигура 16).

pHGV2(H) се обработва със SA11 и, след като се създадат лепливи краища, той се обработва с Kindill още веднъж, и Hindlll-Sall-фрагментът се извлича.Плазмид pdBPV-1, притежаващ трансформиран фрагмент от говежди папилома-вирус, се обработва с Kindi11 и Pvull и по-широкият ДНК-фрагмент се отделя, и се прибавя към отделно полученият Hindlll-Sallфрагмент. Обединените фрагменти се използуват за трансформация на E.coli щам DHI, за получаване на /7/Дзмид pTN-V2, който притежава рНСУ2-производната CSF-ДНК (фигура 26 и пример 28 ).

Посредством подобни процедури било единият или другият плазмид, pHGV22 или pHGV2(H), в комбинация с плазмид pAdD26SVpA, се използуват за конструиране на pHGV2-dhfr, който е рекомбинантен вектор (-VSE), за употреба със СНОклетки (фигури 17а и в и пример 30).

~ζβ(8) Експресия в животински клетки

Експресия на животински клетки е описано тук по-надолу, с миши С127 клетки, взети като пример. За повече подробности, виж съответните работни примери.

Плазмид pTN-G4 или pTN-V2 се обработва с BamHI.Обработеният плазмид се използува за трансфорация на клетки CI27 (предварително прорастнали чраз култивиране), като се използува процедурата с калциев фосфат. Трансформираните ΚΛβΤΚΜ се култивират, селекционират се клонове, притежаващи висока степен на pCSF-продуктивност.Гликопротеините, съдържащи експресирания G-CSF се извличат и се пречистват от културалната течнст на трансформираните клетки, и се установява, че притежават активност на човешки G-CSF. Наличието на желания гликопротеин също така се потвърждава, чрез анализ на аминокиселинното и захарно съдържание на пробата.

За анализиране на въглехидратното съдържание, пробата CSF, използувана за аминокиселинния анализ, се подлага на определяне на амино захари по метода на Elson-Margan, определяне на неутрална захар по методО. с орцинол сулфат или определяне на сианова киселина по тиобарбитуратнИЯ метОД · Процедурите за всяко едно определян? са показани в Tohshitsu no KagakuChemistry of Saccharides”(Part2 of two parts)”, Chapter 15, Vol. 4 of A course in Biochemical Experiments, published by Tokyo Kagaku Dojin . Превръщането на измерените стойности в тегловни проценти показва, че въглехидратното съдържание на получения G-CSF се разпределя между

1-2 тегловни в зависимост от типа на

- 29 клетките-гостоприемници, експресионните вектори и условията на култивиране.

Настоящето изобретение също така осигурява един предпазващ от инфекции агент, съдържащ човешки G-CSF като една ефективна съставна част.

Човешкият G-CSF, който е една ефективна съставна чйст на предпазващия от инфекция агент, може да бъде получен посредством ген-рекомбинантните техники, описани в предхождащите страници. Алтернативно, той може ДО. бъде получен от клетка, продуцираща човешки CSF(CHU-1 или CHU-2), съгласно метода, описан в Japanese Patent Application No. 155275/1984, или чрез култивиране, в присъствие или отсъствие на митоген, хибрид ома, която е продукт на клетъчна фузия на клетките, произвеждащи G-CSF, и само-пролифериращи малигнени туморни клетки.

Всички човешки G-CSF, които са получени по методите, описани по-горе, се включват в обхвата на настоящето изобретение .

Съдържащият човешки G-CSF разтвор, който се получава, може по-нататък да бъде пречистен и концентриран по коя да е от известните и познати техники, както се изисква, след това се запазва в замразено състояние. Алтернативно, той може да се пази след като бъде дехидратиран посредством такива начини, като изсушаване при замразяване или изсушаване под вакуум. По желание, човешкият G-CSF може да се разтвори в подходящ буферен разтвор, след това се приготвя в инжекционна форма, като разтворът се филтрува асептично през съответната

-30подходяща среда, като

Предпазващият от например Millipore филтър.

инфекции агент , съгласно настоящето изобретение, може да съдържа фармацевтично приемлив носител или Αΰδςίβκα дотвратяващ , или някакъв необходим стабилизатор, или пре адсорбция агент, за да осигури фармацевтичен препарат, който е подходящ за приложение върху хора или жи вотни.

дозирането и честотата на прилагането на човешки G-CSF, намиращ се в предпазващия от инфекции агент, съгласно настоящето изобретение, може правилно да се определи, като се има предвид сериозността на заболяването на пациента, но обикновено препарат, съдържащ 0.1-500^ , за предпочитане 5-100 , от човешки G-CSF на възрастен, може да се прилага от една до седем дози в течение на едноседмичен курс. Трябва обаче, да се отбележи, че настоящето изобретение не се ограничава по никакъв начин от съдържанието на човешки G-CSF.

Предпазващия от инфекции агент, съгласно настоящето изобретение, съдържащ човешки G-CSF, като една активна съставна част, може да се използува ефективно срещу различни инфекциозни микроорганизми, което може да се илюстрира? но без да се ограничава? CM следното : грам-положителни коки, такива като Staphylococcus и Streptococcus; грам-отрицателни анаеробни факултативни микроорганизми, включително ентеробактерии такива като Escherichia, Serratia и Klebsiella, и Hemophilus; грам-отрицателни аеробни микроорганизми, като Pseudomonas и Alcaligenes; грам-отрицателни анаеробни микроорганизми, такива като Bacteroides; фунги, такива, като

Candida и Aspergillus; и вътреклетъчни паразитни микроорганизми, такива като Listeria. Предпазващият от инфекции агент, съгласно настоящето изобретение, показва отлични ефекти срещу инфекции, предизвикани от единични видове от тези микроорганизми, или срещу смесени инфекции, предизвикани от повече от един вид от такива микроорганизми.

ПРИМЕРИ

Преди настоящето изобретение да бъде описано с погол£ми подробности, отнасящи се до работните примери, следните справочни примери са осигурени, с цел да се илюстрират методите за изследване на CSF активността, изолирането на човбшки G-CSF от CHU-1, и физико-химичните свойства, на изолирания човешки G-CSF.

СРАВНИТЕЛЕН ПРИМЕР 1: Изследване на CSF-активност

В настоящето изобретение са използувани следните методи за определяне на CSF-активността (тук по-долу съкратено като CSA)

CSA-изследв ане (а) С клетки от човешки костен мозък :

Проведено е култивиране на еднослоен мек агар, съгласно метода на Bradley, Т. R. and Metcalf, D. (Aust. J. Exp. Biol. Med. Sci.,44, 287-300,1966). По-точно, 0.2 серум от говежди зародиш, 0.1 тб от пробата, 0.1 неадхерентна клетъчна суспензия от човешки костен мозък (1-2 хЮ*

- 5-ядрени клетки, 0.2 hit модифицирана културална среда на Мс

Coy ’ s 5А, и 0.4 tYil съдържаща 75¼ arap модифицирана културална среда на McCoy’s 5А се смесват, изливат се в пластмасов съд за тъканна култура (55 , коагулира се и се култивира при влажност.

След десет дни се преброяват образуваните колонии (една колония се състои най-малко от 50 клетки ), и CSA се определя, като за единица се взима активността, необходима за образу ването на една колония.

(b) С клетки от миши костен мозък

Конски серум (0.4 ),0.1 П)1 от пробата, 0.1 клетъчна суспензия от СЗН/Не (женски) ядрени клетки ) и 0.4 тб от миши костен мозък (0.5-1x10 ⁴ модифицирана културална среда на McCoy’s 5А, съдържаща 0.75¼ агар, се смесват, изливат се пластмасов съд за тъканна култура (35/77W ), коагулира се и се култивира в продължение на 5 дена, при

37^СС в 5¼ CO -> j

95¼ въздух и при 100¼ влажност. Преброяват се образуваните колонии (една колония се състои най-малко от клетки ), и

CSA се определя, като за единица се взима ахтивността за образуване на една колония.

Модифицираната културална среда на McCoy* s

5А, използувана във всеки един от двата метода (а) и (Ъ), и неадхерентната клетъчна суспензия от човешки костен мозък, използувана в (а), се приготвят чрез следващите процедури :

•34

Модифицирана културална среда на McCoy’s 5А (двойно концентрирана )

Дванадесет грама от културална среда на McCoy's 5А (Gibco), 2.55 от MEM аминокиселинно-витаминна среда (Nissui

Seiyaku Co.,Ltd. ), 2.18 (/ от натриев бикарбонат и 50,000 единици от калиев пеницилин G се разтварят двукратно в 500 Дестилирана вода и разтворът се филтрира асептично през филтър Millipore (0. 22_? т);

Клетъчна суспензия от човешки костен мозък

Течност от костен мозък, получена от здрав човек чрез стернална пункция, се разрежда 5-кратно с RPMI1640 културален разтвор, се нанася върху културален разтвор Ficoll-Paque (Pharmacia Fine Chemicals), и се центруфугира при 25 С. Интерфациалният (граничният) клетъчен слой (специфично тегло < 1.077 ) се извлича. Клетките се измиват, довеждат се до концентрация 5x10 ⁶ клетки / γγ$ ^с RPMI1640 културален разтвор, съдържащ 20^ серум на говежди зародиш, налива се в 25 ст ³ пластмасова колба за тъканна култура и се инкубира в продължение на 50 /776/7 в СО^ инкубатор. Неадхерентните клетки се извличат от супернатантата, измиват се в пластмасова колба (25 От ) и се инкубират в продължение на 2 часа и половина. Неадхерентните клетки от супернатантата се събират и се използуват при опитите.

- яСРАВНИТЕЛЕН ПРИМЕР 2 : Изолиране на човешки G-CSF

Човешки G-CSF се изолира и пречиства от супернатантата на култура от клетки, продуциращи човешки G-CSF, CHU-1 [С. IV. С. м. номер 1-315), чрез проце дурипи? , описани в

Пример 2, който следва.

Така полученият човешки G-CSF притежава следните физико-химични свойства.

I) Молекулно тегло: са. 19,000 + 1,000, като е измерено чрез SDS-полиакриламидна гел електрофореза.

II) Изоелектрична точка: Притежаващ най-много една от трите изоелектрични точки А, В и С, отбелязани в следващата таблица 1.

ТАБЛИЦА 1

ИзОвЛвктрична точка (pl)

	В присъствие на 4М	В отсъствие на карбамид
А	5.7 + 0.1	5.5 + 0.1
В	6.0 + 0.1	5.8 + 0.1
С	6.3 + 0.1	6.1 + 0.1

- A-

III) УВ абсорбция: Максимална абсорбция при 280 nni и минимална при 250 пт .

IV) Аминокиселинната последователност на 21-Т£ остатък! от N-края е_;както следва :

Η N	- Thr	- Pro	- Leu - Gly -	Pro - Ala -	Ser - Ser -
	(Ίΰΐ
Leu	- Pro	- Gin	- (Ser) - Phe	- Leu - Leu	- Lys - X -
		(20)
Leu	- Glu	- X -	Vai -
V)	Аминокиселинен състав : виж следващата	таблица 11

ТАБЛИЦА 11

амино киселина	намерено	предсказан брой амино
	( wmol )	киселинни остатъци
		(стойности закръглени до
		цели числа в скобите)
Asp (Asp + Asn)	3.54	4.5 (4)
Thr	4.58	5.5 (6)
Ser	10.64	12.9 (13)
Glu (Glu + Gin)	22.31	27.0 (27)
Pro	8.30	10.1 (10)
Gly	10.60	12.8 (13)
Ala	14.85	18.0 (18)
1/2 Cys	2.59	3.1 ( 5)
Vai	6.16	7.5 ( 7)
Met	2.26	2.7 ( 3)
He	3.29	4.0 ( 4)

-

(продължение )
Leu	27.24	33.0 (33)
Туг	2.60	3.1 ( 3)
Phe	5.08	6.1 ( 6)
Lys	3.68	4.5 ( 4)
His	3.93	4.8 ( 5)
Trp	1.61	1.9( 2)
Arg	4.29	5.2 ( 5)

общо (166)

Изчислено молекулно тегло (без съдържание на въглехидрати

166-те остатъка).

17,961

ПРИМЕР 2 : Създаване на CHU-2

Тумор от пациент с рак Wii устната кухина, в който се наблюдава явно увеличаване броя на неутрофилите, се трансплантира в nu/nu мишка. Около 10 дена след трансплантирането, увеличаването на теглото на тумора и на неутрофилите е явно. Дванадесет дни след трансплантацията, туморът се изважда асептично, нарязва се на кубчета от по 1 - 2 mtn* и се култивира по следния начин.

Десет до петнадесет кубчета от тумора се поставят в 50 (Υΐβ пластмасова центрофужна епруветка. След добавяне на 5 тб разтвор на трипсин (съдържащ 0.25% трипсин и 0.02%

- 37ЕДТА), епруветката се разклаща в продължение на 10 mir? в топла баня при 57^0 и супернатантата се отлива. Добавят се други 5 от същия разтвор на трипсин и усвояването на трипсина се провежда при разбъркване, в продължение на 45 /77//7 , при 57 С. Супернатантата от клетъчната суспенсия се извлича, и се съхранява в лед, след като трипсинът е бил инактивиран чрез добавяне на 1 серум на говежди зародиш.

След като тези процедури се повторят оше веднаж, клетъчната суспензия се извлича, комбинира се с получената преди това суспензия, и се центрофугира при 15,000 об/И7/М , в продължение на 10 ПНП , за да се получи клетъчна утайка.Утайката се промива двукратно с F-10, СТр/ЬрмиЩ 10% серум от говежди зародиш, и след това се поставя в пластмасова културална колба (25 Cm? ), за /7СМучаване на клетъчна концентрация от 5x10 клетки/колба. След инкубиране в продължение на една нощ в СО^ инкубатор (5¾ С0-, и 100¾ влажност), с един F-10 културален разтвор, съдържащ 10¾ серум от говежди зародиш, супернатантата се отстранява,заедно с неадхерентните клетки, културата остава още , заедно с добавка на свежа културална среда.Шест дни след започването на култивирането, колбата се запълва с клетки, и културалната среда се замества от свежа такава. На следващия ден културалната среда се отстранява, и колбата се пълни с 2 m3 от едно анти мише еритроцитно антитяло (Cappel), разредено 5-кратно с RPMI 1640, и 2 гпС комплемент от морско свинче (Kyokuto Seiyaku Co., Ltd.), разреден 2.5 пъти с RPMI 1640. След инкубиране в продължение на 20 МНП при 57 С, културата се промива дву-36 кратно с F-1O, съдържащ 10% серум от говежди зародиш, и фибробластите, поризводни на nu/nu мишки се отстраняват. След това се прибавя F-10 културална среда, съдържаща 10% серум от говежди зародишни култивирането се провежда за повече от два дена. След това същите клетки се извличат и се подлагат на клониране чрез метода на пределното разреждане.

Получените 11 клона се изследват за тяхната CSF активност, и един клон (CHU-2) показва активност около 10 пъти по-висока отколкото тази на другите клонове.

ПРИМЕР 2 : Изолиране на CSF

Установените в пример 1 клетки, прорастват в много плътна популация в две културални колби (150cm * ) . Клетките се извличат, суспендират се в 500 тР F-10 културал//& среда, съдържаща 10 % серум от говежди зародиш, прехвърлят се в стъклени въртящи се колби (облодънни колби) от 1580 cm (Belсо), и се култивират при въртене при 0.5 об/Wi/? . Когато се прецени, че клетките са прораснали в напълно плътна популация върху вътрешната стена на въртящата се колба, културалният разтвор се замества с несъдържащ серум RPMI 1640. След като културата стане 4 дневна, супернатантата на културата се извлича и култивирането продължава, след като се добавя F-10, съдържаща 10 % серум от говежди зародиш. След като стане три дневна култура, к^лтуралната среда отново се замества с несъдържаща серум RPMI 1640 и супернатантата на културата се извлича 4 дни по-късно. Чрез повтарян/? на тези процедури, всяка седмица, от всяка колба се получават по 500

-39 /??/ от несъдържаща серум супернатанта от културата. В допълнение , този метод позволява, супернатантата на културата да се извлича, като клетките се поддържат на един значително дълъг период.

Проба, състоящата се от 5.000 fl'd- от супернатантата от получената култура се смесва с 0.01% Tween 20 и се концентрира около 1000 пъти чрез ултрафилтрация с Hollow Fiber DC4 и Amicon РМ-10 (Amicon). Концентрата се пречиства чрез следващите етапи.

(i) Порция ) от концентрираната супернатантата на културата се подлага на гел-филтрация на Ultrogel АсА54 колона (4.6 х 90 cm*”; LKB) при изходен поток от около 50 т ок с 0.01 М ТРИС-НС1 буфер (pH 7.4), съдържащ 0.15 М NaCl и 0.01% Tween 20 (Nakai Kagaku Co., Ltd.). Колоната се калибрира с говежди серумен албумин (Молекулно тегло 67,000), овоалбумин (Молекулно тегло 45,000) и цитохрам С (Молекулно тегло 12,400). След завършване на гел-филтрацията, 0.1 тб от всяка фракция се разрежда 10-кратно, и се скринира зО. активните фракции, по горе описания метод за CSA-изследване (Ь). При фракциите за Ve = 400 - 700 се установява, че показват макрофагова-доминантна CSA, докато фракциите за Ve = 800 - 1200 ήΐβ показват гранулоцитно-доминантна CSA. Ето защо, по-късните фракции се събират и концентрират до обем от приблизително 5 тб на апаратура за ултрафилтрация с РМ-10 (Amicon) (ii) Към концентрираните фракции се добавя един воден разтвор на 0.156 трифлуороцетна киселина, съдържащ 30% п-про-40' пан (за определяне на амино киселинна последователност; доставен от Tokyo Kasei К. К.). След като сместта се остави да престои в лед в продължение на около 15 , утайката се отстранява чрез центрофугиране, в продължение на 10 при 15,000 об/гО/П . Супернатантата се абсорбира върхуу/-Вопdapak С18-колона х 30 cm за полупроизводствени цели Waters), калибрирана с воден разтвор, съдържащ п-пропанол и трифлуороцетна киселина.Колоната се елюира непрекъснато с воден разтвор на 0.1% трифлуороцетна киселина, който съдържа n-пропанол, притежаващ линеен концентрационен градиент от 30 - 60%. Използува се апаратура за високо-ефективна течна хроматография Hitachi Model 685-50 (Hitachi, Ltd .), и детектор, Hitachi Model 638-41 (Hitachi, Ltd.jn за едновременно определяне абсорбцията при 220 пт и при

280 пт . След елюиране, 10ул I от всяка една от фракциите се разрежда 100-кратно, и се скринира за активни фракции по горе описания метод за CSA-изследване (Ъ). При пиковете, елюирани с 40% n-пропанол, се установява, че притежават CSA активност, така че те се събират, хроматографират се отново при следните условия, и се изследват за CSA по същия метод. И отново CSA-активност се наблюдава при пиковете с 40¾ ппропанол. Ето защо, тези пикове се събират (4 фракции = 4 47^ ), и се лиофилизират.

(iii) Лиофилизираният прахообразен продукт се разтваря в 200 воден разтвор на 0.1% флуороцетна киселина, съдържащ 40% n-пропанол, и разтворът се подлага на високоефективна течна хроматография на TSK-G 3000 SW-колона (Тоуо _4<Soda Manufacturing Co., Ltd. ; 7.5/??/?? x 60 c·;¹) със същия воден разтвор, при изходен поток 0.4/77^ Imin и фракциите се взимат ПО 4-милилитр(2 нй порции с фракционен колектор, FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemicals). Всяка една от взетите фракции се проверява за нейната CSA посредством същия метод, както е Описан по-горе, и се наблюдава активност във фракциите за време на задържане 37-38 min (отговарящо на Молекулно тегло приблизително 2x10 ). Активните фракции се извличат и се пречистват на една аналитична уч-Bondapak С18-колона (4.6 09/7^x30 cw ).Главните пикове се извличат и се лиофилизират. Получената проба се изследва по метода за CSA-изследване (а);установява се, че има активността на човешки G-CSF.

ПРИМЕР 3 : Определяне на аминокиселинна последователност (1) Определяне на N-крайна аминокиселинна последователност

Пробата се подлага на Edman-разграждане с газово-фазов секвенатор (Applied Biosystems ) и получената РТН аминокиселина се анализира чрез рутинни процедури, с апаратура за високо-ефективна течна хроматография (Beckman Instruments), и Ultrasphare-ODS-колона (Beckman Instruments). Колоната (5

L ду ;4.6 mm x 250 r?) се калибрира c изходен буфер [воден разтвор, съдържащ 15/гМ натриево-ацетатен буфер (pH 4.5 ) и

Λ

40% ацетонитрил ] и се инжектира с пробата (разтворена в 20С от изходния буфер ).Осъществява се разделяне чрез изократно елюиране с изходния буфер. Изходният поток е 1.4 '4^Wit! nun и температурата на колоната се поддържа на 40 С.

Откриването на РТН амино киселината се извършва, като се използуват абсорбциите в UV-областта, при 269 ПгГ? и 320и/?1 . Стандартни проби от РТН амино киселина (Sigma) в порции от по 2 птоЗ , се разреждат в същия ред, за да се определи тяхното време на задържане, което се сравнява с това на пробата, която трябва да се изследва. В резултата,/^ установява? че пробата има следната аминокиселинна последователност от 40-те остатъка на N-края:

Η N-	-- Thr po; - Pro	- Pro	- Leu	- Gly -	Pro	- Ala	- Ser	- Ser
Leu	- Gin	- Ser	- Phe -	Leu	- Leu	- Lys	- Cys
		{.20)
Leu	- Glu	- Gin	- Vai	- Arg -	Lys	- lie	- Gin	- Gly
			(301
Asp	- Gly	- Ala	- Ala	- Leu -	Gin	- Glu	- Lys	- Leu
		(40)
Cys	- Ala	- Thr	- Tyr	- Lys -

(ii) Разлагане с бромциан

Пробата се разтваря в 70^ мравчена киселина. Към разтвора се прибавят 200 еквивалентни части от бромциан, който е пречистен чрез сублимация. Сместа се оставя за една нощ при 57^е С, за да се извърши реакция. Реакционният продукт се лиофилизира и фракционира чрез 8/ТХ(НРН) U TSK G5OOOSW-KonoHa (Toyo Soda Manufactoring Co.,Ltd. ), за да се получат четири пика. Пиковете се назовават CN-1 , CN-2, CN-5 и CN-4, по низходящия ред на молекулното тегло. Първите два пика (CN-1 и CN-2) имат по-добри полета и техните аминокиселинни последователности се анализират с автоматичен газово-фазов

- 43' секвенатор (Applied Biosystems), при същите условия, които се използуват в (i).

В резултат,^ установява, че CN-1 е пептид от N-края на G-CSF протеина, a CN-2 има следната аминокиселинна последователност

Pro	- Ala	- Phe	- Ala -	Ser	- Ala -	Phe
Gin	- Arg	- Arg	- Ala -	Gly	- Gly -	Vai
Leu	- Vai	- Ala	- Ser -	His	- Leu -	Gin

(iii) Разлагане с трипсин

Пробата се разтваря в 0.1 М Tris-HCl буфер (pH 7.4), съдържащ 8М карбамид,И разтворът се смесва с 0.1М Tris-HCl буфер (pH 7.4), съдържащ 0.1% 2-меркаптоетанол, за да се обезпечи крайна концентрация на карбамид ОТ2М. Добавя се ТРСК-обработен трипсин (Sigma), така че съотношението на пробата към ензима да е 50 : 1. Сместа се държи в продължение на 4 часа при 25 С, и след добавяне на еквивалентно количество ТРСК-обработен трипсин, сместа се държи в продължение _ 0 на още 16 часа при 25 С.След това реакционният продукт се подлага на високо-скоростна обратно-фазова колонна хроматография на колона С8 (Yamamura Kagaku К. К. ), като елюирането се провежда с 0.1% TFA, съдържащ n-пропанол, имащ линеен градиент на плътност от 5-60%. Докато няколко пика се получават, като се измери абсорбцията при 280 ηщ , главният пик се анализира за неговите аминокиселинни последователности посредством автоматичен газово-фазов секвенатор

-44* (Applied Biosystems), при същите условия, които са използувани в (i). В резултат, установява се, че главния пик е пептид, притежаващ следната последователност, която съдържа част от CN-2 фрагмента, показан в (ii):

Gin	- Leu	- Asp -	Val	- Ala	- Asp -	Phe	- Ala	- Thr
Thr	- He	- Trp -	Gin	- Gin	- Met -	Glu	- Glu	- Leu
Gly	- Met	- Ala -	Pro	- Ala	- Leu -	Gin	- Pro	- Thr
Gin	- Gly	- Ala -	Met	- Pro	- Ala -	Phe	- Ala	- Ser

ПРИМЕР 4: Получаване на ДНК матрица (i) Синтез на матрица (IWQ)

Тридесет последователни нуклеотида (виж фигура 1) се получават на базата на последователност от 10 аминокиселини (ile-Trp-Gln-Met-Glu-Glu-Leu-Gly-Met ) , включена вътре в аминокиселинната последователност , получена в пример 3 (iii). Необходимо е да се направи едно пояснение относно означаването на нуклеотидите, показани на фигура 1;например, нуклеотидът на. 9-та позиция от 5’края, е една еквимоларна смес от dA и dG. Изходните нуклеотиди са в повечето случаи димери, но мононуклеотиди също така се получават, според нуждите. Колона, оборудвана със стъклен филтър, се пълни с 20 и

от изходна нуклеотидна смола, Ap-d(G)(Yamasa Shoyu Co., Ltd.). След повторно промиване с метиленов хлорид, 4-4’-диметокситритилдйдп! група се елиминира чрез обработване с разтвор на метиленов хлорид, съдържащ 3% трихлороцетна киη селина. След това колоната се промива няколко пъти с 1пА

-Λ5· метиленов хлорид.След като колоната се промие с пиридинов анхидрид, за да измести разтворителя, добавят се 20 φώ от

дин, и вътрешността на колоната се изсушава с вакуумна помпа. След това се добавят 20 тй от 2, 4, 6-триметилбензолсулфонил-З-нитротриазолид (MSNT of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) и 0.2 пиридинов анхидрид, и съдържанието на колоната се измества от газ азот. Нуклеотидната смола се кондензира с димера, като се оставят да реагират в продъл жение на

Men при стайна температура, с разклащане от време на време. След завършване на реакцията колоната се промива с пиридин и нереагиралите ОН-групи се ацетилират с разтвор на пиридин, съдържащ излишък от оцетен анхидрид, и

4-диметиламинопиридин. След като се промие колоната с пиридин, следните димери или мономери се кондензират в реда, в който са написани, като се повтарят описаните по-горе процедури: (DMTr)lp(NHR₃ ), (DMTr)GpGp(NHR₃ ), DMTr)Lp(NHR₃ ) , и еквимоларна смес от (DMTr)СрТр(NHR₃) и (DMTr)ТрТр(NHR^), една еквимоларна смес от (DMTr)АрАр(NHRj) и (DMTr)ApGp(NHR_}), една еквимоларна смес от (DMTr)ApGp(NHR₄ )и (DMTr)GpGp(NHR,), ( DMTr )GpAp(NHRj), (DMTr )TpGp(NHR^ ) , една еквимоларна смес от (DMTr )АрАр(NHR₃) и (DMTr)GpAp(NHR₃ ) , (DMTr)CpAp(NHR₃ ) , една еквимоларна смес от (DMTr)АрАр(NHR_? ) и (DMTr)ApGp(NHR^ ), (DMTr )GpCp(NHRз ), (DMTr)TpGp(NHR₃ ), ( DMTr)lp( NHR₃ ) и ( DMTr )ApTp(NHR₃), като всички тези нуклеотиди могат да се доставят от Nippon Zeon, с изключение на (DMTr)lp(NHR^ ),

-46' който се доставя от Yamasa Shoyu Co.,Ltd. След завършване на реакцията във финалния етап, смолата се промива последователно с пиридин, метиленов хлорид и етер, без ацетилиране, и след .7 rrl това се изсушава. Изсушената смола се суспендира в от смес на пиридин (0.5(Τΐί ), вода (0.2 ) и диоксан ( 1 ), съдържаща 1М тетраметилгуанидин и 1MoZ

-пиколиннощ при алдоксим. Суспензията се оставя да престои цяла 'У стайна температура, и се концентрира до 100-200ус^ във вакуум. Концентратът се смесва с малко количество (1-2 капки)

2-5 пЛ пиридин и концентрирана амонячна вода и сместа се загрява при

55°С в продължение на 6 часа. След екстракция с етилацетат водният слой се отделя и се концентрира във вакуум. Концентратът се разтваря в разтвор на 50mМ триетилов амониев ацетат (рН7.0), и разтворът се подлага на хромато графия на колона С-18 (1.0 х 15 сю; Waters), като елюирането се провежда с ацетонитрил (линеен градиент на плътност от 10 до 50, в разтвор на 50 тМ триетиламониев ацетат (рН7.0).

Пиковата фракция, елюирана при ацетонитрилна концентрация от около 2556, се концентрира във вакуум.

Към концентрата се добавя 80¾ оцетна киселина и сместа се оставя да престои в продължение на 50 (ΎΗ/Ί при стайна температура. След следваща екстракция с етилацетат водният слой се отделя и се концентрира под вакуум. Полученият кон центрат, след това се пречиства чрез високо ефективна течна хроматеграфия на колона С-18 (от Senshu Kagaku К. К.; SSC0DS-171; χ 200ίηΓΠ ). Елуирането са провежда с ацетонитрил (10-20¾ линеен плътностен градиент), в разтвор на 50/И М три-4 7етил амониев ацетат (pH 7.0). Добивът на синтетичната ДНК е не по-нисък от 10 А 2^0 единици.

Анализът по метода на секвениране на Maxam-Gilbert [Meth. Enzym., 65 499 (1980)] показва, че полученият олигонуклеотид притежава нуклеотидната последователност, показана на фигура 1.

(ii) Синтезиране на матрица (А)

Четиринадесет последователни нуклеотида (виж фигура 1) се получават на базата на последователност от 5 аминокиселини (Met-Pro-Ala-Phe-Ala), включени в амино киселинната последователност, получена в пример 3 (iii).

Процедурите на синтеза са подобни на тези, използувани

при приготвянето

на матрица (IWQ), и следните нуклеотиди се

кондензират до нуклеотидна смола, Ap-d(T) (Yamasa Shoyu Co.,

Ltd.) в реда, в	който са написани : (DMTr)СрАр(NHR3 ),
(DMTr)GpGp(NHR,),	една еквимоларна смес от (DMTr)СрАр(NHR^),
(DMTr)CpTp(NHR,),	(DMTr)CpGp(NHR?), и (DMTr)СрСр(NHR^ ) , една
еквимоларна смес	от (DMTr)ApGp(NHR, ), (DMTr)TpGp(NHR$ ),
(DMTr)GpGp(NHR?)	и (DMTr)CpGp(NHR^), (DMTr)ApAp(NHR^ ) , една
еквимоларна смес	от (DMTr)CpAp(NHR) и (DMTr)CpGp(NHR^), и

( DMTr )Gp(NHR^ ) , като всички нуклеотиди се доставят от Nippon Zeon. Добивът на синтетична ДНК е от около 10 A~_6t? единици. Анализът по методът на секвениране на Maxam-Gilbert показва, че полученият олигонуклеотид притежава нуклеотидната последователност, показана на фигура 1.

(ill) Синтезиране на матрица (LC)

Автоматично синтезиране на ДНК се осъществява с ДНК синтезатор, Model 380А of Applied Biosystems. Тази техника, базирана на принцините, описани от Caruthers et al. [J. Am. Chem. Soc., 103, 3185 (1981)], по принцип се разглежда като процедура на фосфоамидиране.

Фосфоамидираната форма на (DMTr)-dT, предварително активирана с тетразол, се кондензира до dG-S ( S: носител ), където 5’-диметокситритилна група (DMTr) се деблокира.

След това, нереагиралите хидроксилни групи се ацетилират и оксидират с йод, в присъствие на вода, до образуване на фосфорилна група. След като се деблокира DMTr-групата, кондензирането се повтаря па същия начин, докато се синтезират 24-те нуклеотида, имащи последователността, показана на фигура 1. Тези нуклеотиди се отделят от носителя, деблокират се и се пречистват чрез обратно-фазова високо ефективна течна хроматография на колона С-18 (Senshu Kagaku Co., Ltd.; SSC-ODS-272).

ПРИМЕР 5: Култивиране на CHU-2 клетки и получаване на тРНК (1 ) Култивиране и отделяне на CHU-2 клетки

Създадените CHU-2 клетки СЕ култивират в много плътна популация в две културални колби (150 ctn^), отделят се, суспендират се в 500 RPMI-1640 културална среда, съдържаща 10% серум от говежди зародиш, прехвърлят се в стъклена ротационна облодънна колба от 1580 cm³ (Belco) и се култивират

-i$ при въртене, в продължение на 4 дни при 0.5 об/пиП . Когато се прецени, че клетките са прорасли в много плътна популация върху вътрешната стена на ротационната колба, културалната течност се отстранява от ротацинната колба, която е била заредена със 100 предварително загрят (57 С) физиологичен с

разтвор, съдържащ 0.02% EDTA. След загряване при 57 С в продължение на 2 ПКП , клетките се отделят от вътрешната стена ИЛ колбата чрез пипетиране. Получената клетъчна суспенсия се центрофугира при 1500 o6/mi)1 , в продължение на 10 tncti дО получаване на клетъчна утайка. Клетките се суспендират повторно в 5 ml EDTA-несъдържащ физиологичен разтвор. Суспенсията се центрофугира при 1500 об/min , в продължение на 10 min , до получаване на клетъчна утайка (влажно тегло около

0.8). Така получените клетки се замразяват и се съхраняват при -80 С, докато бъдат подложени на процедури за екстрахиране на РНК.

(2) Пречистване на тРНК

Изолирането на тРНК от получените CHU-2 клетки в 1) се осъществява посредством процедурите, които по същество са същите, както описаните в Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor, page 196, 1982. Замръзените CHU-2 клетки (влажно тегло 5.8^ ), се суспендират в 20 разтвор на 6М гуанидин [бМгуанидин изотиоцианат, 5 тМ натриев цитрат (pH 7.0), 0.1М -меркаптоетанол и 0.5% натриев саркозил сулфат], и суспенсията се размесва добре на Vortex в продължение на 2-5 W/7) . Сместта се подлага на 10 циклично

всмукване и впръскване със спринцовка ( оЬви 20 ml ), оборудвана с игла 18G. Около 6 от вискозния гуанидинов разтвор, съдържащ разрушените клетки се разстилат върху 6милилитров слой от 5.7 М CsCl в 0.1 М EDTA (pH 7.5) в Beckman SW40 Ti полиаломерна центрофужна епруветка, по такъв начин, че епруветката да се напълни. Приготвят се 4 центрофужни епруветки чрез процедурата, описана по-горе, и се центрофугират при 30000 об/ГШП , в продължение на 15 часа, о

при 20 С. Получената утайка се промива трикратно с малки количества 70% етанол.

Утайките, получени от съответните епрув£/Т)х2/ се обединяват, разтварят се в 550 вода и се обработват до достигане на концентрация на NaCl 0.2 М. След обработване с смес от фенол и хлороформ, и само с хлороформ, се прибавят

2.5 обема от етанол за утаяване на общата РНК (около 10.1 от общата РНК се получават от 3.8^ влажни клетки).

Поли (А⁺ )РНК се пречиства от общата РНК чрез следните процедури на афинитетна хроматография, като се използува предимството от прикрепянето на поли (А )-веригата на 3’края на шРНК. Осъществява се адсорбция на общата РНК върху олиго(dT)-целулоза (тип 7 на P-L Biochemicals), чрез пропускане през една олиго(dT)-целулозна колона, в буфер-носител [съдържащ 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 М NaCl, 1 mM EDTA, и 0.1% SDS разтвор], след като разтворът се загрее при 65 С, в продължение на 5 И7/И . Колоната се калибрира със същия буфер-носител. Елюирането на поли(А^) РНК се осъществява с ТЕ разтвор [съдържащ 10mМ TRIS-HCL (pH 7.5) и 1WM EDTA]-55

Неадсорбираният елюент се пропуска отново през колоната и елюатът, получен чрез повтаряне на същите процедури, се смесва с първата фракция елюат. В резултат получават се 400^,^ от поли (А’¹’) РНК.

Така получената тРНК се фракционира по размер, чрез фракциониране НИ плътностен градиент на захароза, съгласно процедурите, описани в лабораторното ръководство на Schleif and Wensink, Practical Metods in Molecular Biology, Springer-Verlag, New york, Heidelberg, Berlin (1981).

По-точно казано, 5-25¼ плътностен градиент на захароза се създава в Backman SW40 Ti -центрофужна епруветка. Приготвят се два захарозни разтвора, като се разтвори 5¼ и 25¼ RNаза, несъдържаща захароза (Schwarz/Mann), в разтвор, съдържащ 0.1 М NaCl, 10mM Tris-HCl(pH7.5), 1 тМ EDTA и 0.5¼ SDS.

Осемстотин микрограма от тРНК [поли(А⁺) РНК], приготвена по вече описания метод, се разтваря в 200-500разтвор ТЕ. Разтворът се загрява при 65 С в продължение на 5 /?7//7 и след като бъде охладен, той се поставя към разтворите за плътностен градиент на захароза, които се центрофугират при 50,000 об/тт , в продължение на 20 часа. Събират се фракциите, всяка една от по 0.5 гп/ , и се измерва тяхната абсорбция при 260 ПП?. Размерите на фракционираните РНК се определят на базата на позициите на стандартните РНК (рибозомни РНК, 28S, 18S и 5S). В същото време, G-CSF-активността на всяка фракция се изпробва с ооцити на Xenopus Laevis, чрез следните се преработва процедури. Най-напред в един воден разтвор, тРНК от всяка фракция имащ концентрация

- 52 взимат се ооцити от Xenopus (на възраст около една голина), и разтворът на тРНК се инжектира по такъв начин, че 50 тРНК да се инжектира в един ооцит; след това такива ооцити се поставят във всяка една от 96-те микротитърни ямки;

ооцитите се култивират в продължение на 48 часа, при стайна температура,в 100 yi

0.82 mM MgSO. ; 33 тМ Ca(NO,); 0.41 тМ СаС1_ ; τ 3 2.

(рН 7.6); пеницилин, IQmtj/β', и стрептомицин на културата се извлича, среда на Barth [88 mM NaCl; 1 тМ КС1;

2.4 mM NaHCOj ;

7.5 mM TRIS-HC1 сулфат, 10 ]; супернатантата концентрира се и се пречиства до степен, подходяща за изследване на G-CSF-активност.

Установява се, че G-CSF-активността е налице в 15-17S фракциите.

ПРИМЕР 6: Синтезиране на сДНК (Конструиране на банка сДНК pBR-линия )

От получената в Пример 6 поли (А*) РНК се синтезира сДНК по метода на Land et al. [Nucleic Acids Res., 9, 2251 (1981)], както е модифициран от метода на Gubler und Hoffman [Gene, 25, 263 (1983)].

пълва c ( 500mM

200 IT, M (1) Синтезиране на едноверижна сДНК

Една епруветка на Eppendorf ( оСвМ 1.5 >T)t ) се нареагентите в следния ред: 80у^’ от реакционен буфер КС1, 50 mM MgClg, 250 mM Tris-HCl, pH 8.3); 20^6 дитиотреитол, 32 ja Е от 12.5 ШМ dNTP (съдържащ 12.5 '53 ГнМ от всеки един ³ⁱP-dCTP (РВ 10205

P-L Biochemicals; ), и 20буЙ1? ционният разтвор

mtn min от dATP, dGTP, dCTP и dTTP), 10/4^ от-\of Amerscham), 52^41^

500^4 П/mi ), 20 у* 6 от олиго( dT ) _иЛ-,у>( на от поли(А^) РНК (2.1

Общо 400_от реаксе

С, продължение на 5 , и след това р

се нагрява при 42 С, продължение на 5

Към загрятия разтвор се добавят

120 единици от обратна транскриптаза (Takara Shuzo Co., Ltd.). След реагиране в продължение на още 2 часа при 42 С, се добавят 2.^6 от RN-аза инхибитор (Bethesda Research Laboratories), 20 ТЕ-разтвор, 16^//^ от 100 натриев пирофосфат и 48 единици (4 Л ) от обратна транскриптаза, и реакцията се про✓ о вежда при 46 С, в продължение на 2 часа. Реакцията се спира, като се добавя 0.5 М EDTA (8yzZ? ) и 10% SDS (8у*Ф ). Чрез следващата обработка с фенол/хлороформ, и утаяване с етанол (двукратно), се получава едноверижна сДНК.

(2) Прикрепяне на dC-верига към едноверижна сДНК

Едноверижната сДНК, получена в 1), се разтваря в дистилирана вода.

Към разтвора се добавят 60у* от носещ dC-верига буфер [400 ΓηМ калиев какодилат, 50r?lM TRIS-HC1 (pH 6.9), 4 ГИ М дитиотреитол, 1 п?М СоС1^ и 1 Д»М dCTP] , и сместа >

се загрява при 57 С, в продължение на 5 тс/Ί. Към реакционния разтвор се добавят крайна трансфераза (27 единици/уч^; P-L Biochemicals ), и сместа се загрява при 57 С, в продължение на 2.5 IplKl · След обработка с фенол/хлороформ (еднократно), и утаяване с етанол (двукратно), завършващата с dC сДНК се разтваря

NaCl.

54'

ТЕ-раз тв op, съдържащ 1 Ο гн М

Синтез на двуверижна сДНК

40у>5 разтвор на ДНК, приготвена във 2), се прибаолиго (dG)^ нагрява при 65 С, о

това при 42 С, в продължение о

твор се поддържа при 0 С, като в това бавят 80 j$ (5)

Към вят 4y.f^ сместа се (200 $ /mtf; P-L Biochemicals) в продължение на 5 П11П , на 50 mtn . Реакционният време към него се след разпри20 mM MgCl^, mM (NH^J^SO^., и 500 mM КС1] , 4 mM dNTP (съдържащ по

Π) М от всеки един от dATP, NAD, 21Qja^ дистилирана вода, (Takara Shuzo Co., Ltd. ), kara Shuzo Ci.,Ltd. ) и 15yt*<f буфер [100 mM TRIS-HC1 (pH 7.5),

E. coli ДНК лигаза (Tazo Co., Ltd. ) и сместа продължение на 1 час. След и реакцията се осъществява dCTP, dGTP и dTTP), 60 и £ β/7

20y-f< Е. coli-ДНК полимераза

Е. coli RN-аза Н (Takara Shuсе оставя да реагира при 12 С, в това се добавят 4 ftllf dNTP (4/<6.

<3 / при 25 С, в продължение на 1 час.

Посредством следващо обработване с фенолхлороформ и утаяване с етанол (еднократно), се получават около дву-верижна сДНК. Тази двуверижна сДНК се разтваря в ТЕ-разтвор и се подлага на гел електрофореза в 1.2% агароза. Фрагменти, отговарящи по размери на приблизително 560 двойки бази до 2 кЬ, се абсорбират върху Watman DE81, и около 0.2^н/ двуверижна сДНК се извлич<Я чрез елюиране.

'55(4) Прикрепване на dC-верига към двуверижна сДНК сДНК, получена в 3) се разтваря в 4Су^ като се добавят 8буфер, добавящ идентифициран в 2), сместа се нагрява о . Р

С в продължение на 2 ПНП . Следва добавяне на 16 ) и сместа се оставя да

Двув ерижната разтвор ТЕ. След опашка, от типа,

вършваща трансфераза (27 ед о

агира при 37 С, в продължение на 3 mtrt dCпри зареСлед това, реакционният разтвор незабавно спира, като се добавя 1 υ

се охлажда до ОС, и реакцията се

0.5 М EDTA. След обработка с фес етанол, получената утайка нол/хлороформ и утаяване суспендира в 1 Сразтвор ТЕ.

се (5) Конструиране на банка сДНК pBR-линия

Четири микролитра търговски олиго (dG)-onaiuaT pBR 322 В е th г s cl a. H.necri’ck иц?с ία-tor векторУи 2 jaT двуверижна сДНК с dC-опашка, получена в 4), се подлагат на термична обработка в разтвор ТЕ, съдържащ 75 <^0.1 М NaCl. Термичната обработка се състои от три степени: нагряване при 65 °С в продължение на 5 минути, следващо а нагряване при 40 С, в продължение на 2 часа, последвано от охлаждане до стайна температура.

Съгласно метода, описан в лабораторното ръководство на Maniatis et al. [Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, p, 249 ff. (1982)] (други рутинни техники също биха могли да се използуват тук ), получават се компетентни клетки от Е. coli щам X1776, и се трансформират с термично обработения плазмид, за да се получат трансформанти.

- 56ПРИМЕР 7 : Синтез на сДНК (Конструиране на фагова банка) (1) Синтез на едноверижна сДНК от заСъгласно процедурите.изложени в пример 5, 3.8^ мразени CHU-2 клетки се пречистват двукратно върху една оли го (dT)-целулозна колона, и след това се обработват, до получаване на 400иа поли (А*) РНК.

р ±

Разтвор ТЕ (10 уЦС ), съдържащ 12 поли (А ) РНК, разтворена в него, се поставя в епруветка, съдържаща 10φ<^

D (Sigma). След това, епруветката се напълва с следния ред : 20yxtf обратно-транскриптазен буфер [250 mM TRIS-HC1 (pH 8.3);40 тМ MgCl^ ; 250 тМ KCl;20^(f 5 тМ dNTP, актиномицин реагенти, в (съдържащ по 5 λΤϊΜ от всеки един от dATP, dGTP, dCTP ²⁰ 5 олиго( dT ) yj.? - (0.2/Я', P-L BiochemiулС 1 Μ дитиотреитол; 2RNasin(30 единици/ обратна транскриптаза (10 единиСо. , Ltd. ); уЯ от P-dATP( 10 вода. Реакционният разтвор, ύ

държи при 42 С, в продължение и dTTP);

cals); 1 yxt?

л.);Ргоше§а Biotech );10д8 ци/уИ ;Seikagaku Kogyo yCi; Amerscham); и 16 общо обем от 10Оу·*^ , се , имащ на 2

EDTA часа, и реакцията се прекратява, като се добавят 0.5 М (5 ) и 20% SDS (1 ). Чрез следваща обработка с фенол/хлороформ (100 jJ!

се получават около 4у$ ), и утаяване с етанол (двукратно), едноверижна сДНК.

(2) Синтезиране на двуверижна сДНК

Получената в 1 ) сДНК се разтваря в 29 разтвор ТЕ, и

- 57реакционният разтвор се приготвя, като се добавят следните реагенти, в реда на написването : 25у mM MgCl^, от 5 /ЛМ dNTP; 1 . Оу/ / (10у β ); 0.2

Takara Suzo Co., Ltd.

[400 illM Hepes (pH 7.6); и 270 jv) M KC1J; 10уЯ

1.0 У от 1 - ^3Z -P-dATP лигаза (60 единици//^ ;

полимеразен буфер , 63 тМ ^-меркаптоетанол, от 15 )??М ^-NAD; от Е. coli ДНК ) ; 5.0от

Е. coli ДНК -полимераза 1 (New England Biolabs; 10 единици 0.1 У от RN-аза Н (60 единици^^ ; Takara shuzo Co.,

Ltd. ); и

Реакционният дестилирана вода.

на 1 час, оставя

разтвор се инкубира при 14^0 в продължение се да достигне до стайна температура, и се допълнително. След това реакцията се 0.5 М EDTA (5) и 20% SDS ( 1 и се извършва обработка с фенол/хлороформ, и утаяване етанол. Получената ДНК се разтваря в mMEDTA, реакционният разтвор се получава, посредством добавяне на yU£ буферuaKlenow [500 mM Tris-HCl (рН8.0) и мМ dNTP, и 4уМ $ вода. След добавяната лимераза (фрагмент на Klenow; Takara Shuzo инкубира още един час спира, като се добавя ), tn М MgCl^ ], ня 1 у/2 ДНК-поСо., Ltd. ), реρ акционният разтвор се инкубира при Зб С, в продължение на 15 /77 2/7

Инкубираният реакционен разтвор се разтваря в

М EDTA добавят 0.5 се спира, като се

20% SDS (). Чрез следваща c етанол, се получават около 8 разтвор ТЕ, и реакцията (5^/ ) и хлороформ, и утаяване обработка с фенол/ двуверижна сДНК.

(5)

Метилиране на двуверижна сДНК.

долен разтвор ( ЗОу/> ) на двуверижна сДНК, синте2), се смесва с метилиращ буфер [500 тМ (pH 8.0); 50 mM EDTA], 20у/ зирана в

TRIS-HC1 от разтвор SAM [800 (SAM); 50 шМу^-меркаптовтанол], Към^сместа се добавя 15yU^. EcoRI метилаза ум З-аденозил-Е-метилметионин и 100 вода. ------(New England Biolabs;), за да се доведе реакционния разтвор /’ о общо до 20(уД обем. След инкубиране при 37 С, в продължение на 2 часа,провеждат се обработки с фенол и етер, и утаяване с етанол, за получаване на ДНК.

(4)

Добавяне на EcoRI линкер

Към добавят 1 (10 шег;

1оо тм обем на 0.7ja( Ltd. ), ] около 1.2 от метилираната двуверижна ДНК, се . 5уИ<^? лигаза буфер [250 WM TRIS-HC1 (pH 7.5) и 100 ], 0.5уи^ предварително фосфорилиран EcoRI линкер Takara Shuzo Co., Ltd. ), 1.5y/(f 10П7М ATP, 1.5

H ^0, за да се доведе общият 15y4<f. След като се добавят Т^ ДНК лигаза (3.4 единици/yb/? ; Takara Shuzo Co., реакцията се извършва в продължение на една нощ, при дитиотрейтол

реакционния разтвор о

С. След при 65 С, това лигазата се инактивира посредством загряване в продължение на 10 ьпгп . Реакционният разтвор до общ обем 50уЧ , като се добавят 100 мМ TRISНС1 (pH 7.5), 5 mM MgCl^, , 50 тМ NaCl и 100/1^/т? желатин. Следва добавяне на EcoRI (3.5/^ ; 10 единици/^^ ) и реако цията се извършва при 37 С, в продължение на 2 часа. След това се добавят 2.5у(^ 0.5 М EDTA и 0.5уЬ| се довежда

20% SDS, следва обработка с фенол/хлороформ, и утаяване с етанол, така че да се получи ДНК-το. След това, нереагиралият EcoRI линкер се отстранява, посредством гел-филтрация на ultrogel АсА34 (LKB), или агарозна-гел електрофореза, така че да се получи около O.5-O.7ytJ двуверижна сДНК с прибавен линкер.

(5) Прикрепяне на двуверижна сДНК към/lgtlO вектор

Двуверижната сДНК с прибавен линкер се смессва с 2.4 _//gt10 вектор, предварително обработен с Cloning system), 1 . 4уц/? лигаза буфер (250тМ mM MgCl^ ), и 6.5/^ дестилирана вода, и сместа се загрява о

при 42 С, в продължение на 15 rvtn . След това мМ ATP, 1/4^ 0.1 М дитиотреитол и

EcoRI (Vector

TRIS-HC1 и 100 добавят 1 за, за да се доведе общият реагира през цялата нощ, при обем до 1 о

С.

се

оставя да

ДНК лига(6) Въвеждане in vitro

Около една трета от рекомбинантните ДНК, получени в

5), се въвеждат с един in vitro въвеждащ кит (Promega Biotech), за получаване на фагови плаки

ПРИМЕР 8 : Скриниране на банка pBR-линия с матрица (IWQ)

Хартия Whatman 541 се поставя в агарова среда за прорао стване на колонии, и се оставя да стои при 37 С, в продължение на 2 часа. След това филтърната хартия се обработва поTaub and Tompson [Anal . Bioсредством следващия метод на chem. 126, 222 (1982)].

Колониите, трансферирани върху хартията 541 след това прорастват в една агарова среда, съдържаща хлорамфеникол (250), в продължение на една нощ, при 37 С.

Хартията 541 се извлича и се оставя на стайна температура, в продължение на 3 min , върху един друг лист фил търна хартия, която е напоена с разтвор на 0.5 N NaOH. Тази процедура се повтаря два пъти. Два еднакви цикъла се провеждат в продължение на 3 min , като се използува разтвор на , ч ⁰

0.5 М TRIS-HC1 (pH 8). При 4 С се провеждат обработки с раз твор на 0.05 М TRIS-HC1 (pH 8), в продължение на 3 ГП1П с 1.5 тр /т£ разтвор на лизозим, [съдържащ 0.05 М TRIS-HC1 (рн 8)] и 25¾ захароза, в продължение на 10 тип ; след тоо ва, при 37 С, се провежда обработка с разтвор на 1 х SSC (0.15 М NaCl и 0.015 М натриев цитрат), в продължение на 2 min и с 1 х SSC-разтвор

стайна

Н, в продължение на 30 min съдържаш

протеиназ

ра се обработва с 1 х SSC-разтвор, в продължение на 2 men и с 95¾ етанолов разтвор-в продължение на 2 тнп . Пос ледният етап се повтаря два пъти. След това хартията 541 се изсушава.

фенол ·

Изсушената хартия 541 се потапя в смес от 25: 24:4 хлороформ * изоамилалкохол [калибриран със 100 М

TRIS-HC1 (pH

8.5), 100 тм

NaCl и 10 фМ EDTA], в продължение на 30 гтп при стайна температура. След това, подобни процедури се повтарят три пъти с 5 х SSC-разтвор, в продължение на 3 т)П след това два пъти с 95¾ етанолов разт-6'1вор, в продължение на 3 hiin . След това филтърната хартия се изсушава.

Матрицата (IWQ) се маркира с Р, съгласно рутинните процедури (виж Mflecular Cloning), и се извършва хибридизация на колонии, по метода на Wallace et al.(Nucleic Acids Res., 9, 879 (1981)]. Провежда се предварителна хибридизация при 65^с С, в продължение на 4 часа, в буфер за предварителна хибридизация, съдържащ 6 х NET [0.9 М NaCl; 0.09 М TRIS-HC1 (pH 7.5); и 6rpM EDTA] , 5 х Denhardt-разтвор, 0.1% SDS и 0.1 денатурирана ДНК (телешки тимус). След това, хибридизацията се провежда цяла нощ, при φβ °C, в хибридизационен буфер (за неговите съставки виж по-горе), съдържащ 4x10⁶ cptri/rn? от белязаната с изотопи матрица (IWQ). След пълно Завършване на реакцията, хартията 541 се промива двукратно със 6 х SSC-разтвор (съдържащ 0.1% SDS), в продължение на 30 min , при стайна температура, след това се промива двул/и кратноф^в продължение на 1.5 WZ/1 · След това, промитата хартия 541 се подлага на авторадиография.

Плазмидът се отделя ОТ позитивни клонове, и се подлага на Southern blotting с матрицата (IWQ). Провеждат се хибридизация и авторадиография, при същите условия, каквито са описани по-горе.

Също така, провежда се Southern blotting с матрица (А). Като се използува хибридизационен буфер, който има формулата, показана по-горе, хибридизацията се провежда най-наО пред при 49 С, в продължение на 1 час. След като стигне 39 щ по-нататък хибридизацията се продължава при същата —fa A. ' температура, в продължение на 1 час. След завършване на реакцията, нитроцелулозният филтър се измива двукратно с 0.1¾ SDS, съдържаш 6 х SSC, в продължение на 30 mtn при с стайна температура, след това се промива при 39 С, в продължение на 3 Ипгн . Промитата хартия се подлага на авторадиография.

В резултат,СР установява , че единичния клон е позитивен* Нуклеотидното секвениране по дидеокси метода показва, че този клон притежава ДНК, съставена от 308 двойки бази, съдържащи части от двете матрици; матрица (IWQ) и матрица (А). рВИ322-производният плазмид, съдържащ този инсърт, се нарича pHCS-1.

ПРИМЕР 9 : Скриниране на банка 4-фагова линия с производна на pHCS-1 ДНК-матрица lACirofio, хибридизация се провежда по метода на Benton and Davis [Science, 196, 180 (1977)]. Полученият в пример 8 pHCS-1 се обработва със Sau3A и EcoRI, за да се получи ДНК фрагмент от около 600 двойки бази. Този ДНК-фрагмент се бележи с изотоп, посредством nick -транслация, СЪЗласно рутинни процедури. Нитроцелулозен филтър (S&S) се поставя в дгарова среда за прорастване на фагови плаки, за да се трансферират фагите върху филтъра. След като се денатурира фаговата ДНК с 0.5М NaOH, филтърната хартия се обработва по следните процедури : обработка с 0.1 М NaOH и 1.5 М NaCl, в продължение на 20 6’ две обработки с 0.5 М TRIS-HC1

- 63(рН 7.5) и 1.5М NaCl, в продължение на 20 5 : и на края, обработка със 120 шМ NaCl, 15 «ν М натриев нитрат, 13 тМ КН РО и 1 ггМ EDTA (pH 7.2), в продължение на 20 5.

о

След това филтърът се изсушава и се нагрява при 80 С, в продължение на 2 часа, за имобилизирането на ДНК. Провежда ύ

се предварителна хибридизация при 42 С, в буфер за предварителна хибридизация, съдържащ 5 х SSC, 5 х Denhardt-ов разтвор, 50 mH фосфатен буфер, 50% формамид, 0.25 денатурирана ДНК (ДНК от сперма на сьомга) и 0.1% SDS .

с

След това се провежда хибридизация при 42 С, в продължение на 20 часа, в хибридизационен буфер, съдържащ 4 х 10^'срт//??/’ матрица pHCS-1, която е белязана с изотоп, посредством nickтранслация. Този хибридизационен буфер представлява смес от 5 х SSS , 5 х Denhardt-ов разтвор, 20 тМ фосфатен буфер (pH 6.0), 50% формамид, 0.1% SDS, 10% декстран-сулфат и 0.1 rr^ / rnf денатурирана ДНК (ДНК от сперма на сьомга).

Хибридизираният нитроцелулозен филтър се промива в продължение на 20 min с 2 х SSC, съдържащ 0.1 SDS, при стайна температура, след това, в продължение на 30 тгИ с 0.1 х SSC, съдържащ 0.1% SDS, при 4+°С, и накрая, в продължение на 10 , с 0.1 х SSC, при стайна температура. След това се провежда детекция, посредством авторадиография.

В резултат, се получават пет позитивни клона (G1-G5). Клонът, съдържащ full length сДНК, се изследва за неговата ДНК нуклеотидна последователност, по ,ДЦД£Зокси метода, и се идентифицира нуклеотидната последователност, показана на фигура 3 (А). Тази сДНК се изрязва от вектор y/gt10, и се съе динява с pBR327 [Soberon et dl., Gene, 9, 287 (1980)], при EcoRI края, за да се образува плазмид, който би трябвало да се получи в широк обхват.Този плазмид се нарича pBRG-4.

ПРИМЕР 10 : Скрининг на банка от //-фагова линия с pBRG4-производна ДНК матрица, и с матрица (LC)

Осъществява се хибридизация на плаки, съгласно метода на Benton and Davis (виж Science, ibid. ), използуван в пример 9. Нитроцелулозен филтър (S&S) се поставя в агарова среда за прорастване на фагови плаки, за да се трансферират фагите върху филтъра. След като се денатурира фаговата ДНК с 0.5 М NaOH, филтърът се обработва посредством следните процедури : обработване С 0.1 М NaOH и 1.5 М NaCl, в продължение на 20 £ следват две обработки с 0.5 М

TRIS-KC1	(pH 7.5), и	1.5 М NQC1,	в продължение	на	205;
	и на края,	обработване със	1 20 т М	NaCl,	15	m м
натриев	цитрат, 13 тМ	КНД РО^ и 1	тм EDTA	(pH 7	2),	в

продължение на 20 5- След това филтърът се изсушава, и се нагрява при 80 С, в продължение на 2 часа, за да се имобилизира ДНК. Два листа от един и същи филтър се пригот^Г по начина, описан по-горе, и се подлагат на скриниране с рВИС4-производната ДНК матрица, и с матрицата (LC).

Провежда се скриниране с ДНК-матрицата, производна на pBRG4, по следващите процедури. pBRG4 се обработва с EcoRI, за да се получи фрагмент ДНК, от около 1500 двойки бази. Този фрагмент-ДНК се маркира с изотоп, посредством nick транслация, съгласно рутинни процедури. Единият от двата нитроцелулозни филтъра се подлага на предварителна хибридизация в _ж ΰ продължение на една нощ, при 42 С, в буфер за предварителна хибридизация, съдържащ 5 х SSC, 5 х Denhardt-ов разтвор, 50 ΠΐΜ фосфатен буфер, 50% формамид, 0.25^/mf от денатурирана ДНК (ДНК от сперма на сьомга) и 0.1% SDS. След това, филтърът се подлага на хибридизация при 42 С, в продължение на 20 часа, в хибридизационен буфер, съдържащ маркираната с изотоп ДНК-матрица (около 1 х ), от около 1500 двойки бази. Хибридизационният буфер представлява смес от 5 х SSC, 5 х Denhardt-ов разтвор, 20 rn М фосфатен буфер (pH 6), 50% формамид, 0.1% SDS, 10% декстран сулфат, и 0.1 /т? от денатурирана ДНК(ДНК от сперма на сьомга). Хибридизираният нитроцелулозен филтър се промива в продължение на 20 тШ с 2 х SSC, съдържащ 0.1% SDS, на стайна температура, след това, в продължение на 30 тгУ) , с 0.1 х SSC, съдържащ 0.1% ν

SDS, при 44 С, и накрая, в продължение на 10 ГПШ , с 0.1 х SSC, на стайна температура. След това се провежда детекция посредством авторадиография.

Скриниране с матрицата (LC) се осъществява посредством следните процедури. Другият филтър се обработва предварително о

с 3 х SSC, съдържащ 0.1% SDS, при 65 С, в продължение на 2 часа. След това, се провежда предварителна хибридизация, при 65^С, в продължение на 2 часа, в разтвор, съдържащ 6 х NET, 1 х Denhardt-ов разтвор, и 100денатурирана ДНК (ДНК от сперма на сьомга). След това се провежда хибридизация, в

-ес продължение на една нощ, при 63 С, в хибридизационен буфер, съдържаш белязаната с изотоп матрица (LC) (2 х1О срт/л?£). Този хибридизационен буфер представлява също смес от 6 х NET, 1 х Denhardt-ов разтвор, и 1ООуЧ $/ ml денатурирана ДНК (ДНК от сперма на сьомга). Хибридизираният нитроцелулозен филтър се промива трикратно (всяко промиване трае по 20 минути) с 6 х SSC, съдържащ 0.156 SDS, на стайна температура, след това се промива с 6 х SSC, съдържащ 0.1% SDS, при 63 С, в продължение на 2 минути.

Филтърът се изсушава, и се провежда детекция, посредством авторадиография.

При описаното по-горе скриниране се селекционират клонове, които са позитивни към двете матрици, и клонът, който съдържа full-lenght сДНК, се изследва за неговата нуклеотидна последователлност, посредством .^ИД^Зокси метода. Установява се, че има нуклеотидната последователност, показана на фигура 4(A). Тази сДНК се изрязва от Jgt1О-вектора, и се съединява с pBR327 при EcoRI-края, за получаване на плазмид pBRV2.

ПРИМЕР 11 :Конструиране и трансформиране на E.coli рекомбинантен вектор (+VSE) (като се използува tac промотор-съдържащ вектор) (1) Конструиране на рекомбинантен вектор (i) Получаване на вектора

Пет микрограма tac промотор-съдържащ вектор рКК223-3

(Pharmacia) се обработва с 8 единици от EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd. ), в продължение на 2 часа, при 37^<?С, в реакционен разтвор (40 mM TRIS-HC1 , 7 тМ MgCl^ , 100 тМ NaCl , и мМ 2-меркаптоетанол).

След това се добавят 3 алкална фосфатаза

Shuzo Co., Ltd. ), и обработката се провежда при (Takara

60*С, в продължение на 30 минути. Извлича се фрагмент ДНК, посредст вом три обработки с фенол, една обработка с етер и утаяване с етанол, като всичките се провеждат съгласно рутинни процедури.

Извлеченият ДНК-фрагмент се разтваря в 50 смес, съставена от 50 пгМ TRIS-HC1, 5 mM MgCl^, 10 тМ DTT, и по 1 тМ от dATP, dCTP, dGTP и dTTP. След прибавянето на ЪЕ. coli ДНК полимеразаТ-фрагмент на Klenow (Takara Shuzo Co., Ltd. ), реакцията се провежда при 14 С, в продължение на 2 часа, за да се създадат тъпи краища.

(ii) Получаване на синтетичен линкер

Три микрограма от олигонуклеотиди, притежаващи последо вателностите от синтетични линкери, CGAAT-GACCCCCCTGGGCC и о

40t

CAGGGGGGTCATTCG, се фосфорилират, посредством реакция в (съдържащ 50 т М TRIS-HOI^”I 0 mM реакционен разтвор,

2меркаптоетанол, и 1 глМ

АТР), при 37°С, в продължение на минути, в присъствие на единици Т^. полинуклеотид киназа.

фосфорилираните олигонеклеотиди (0.2^<^)

Всеки един от фосфорилираните олигонеклеотиди (0.2^^) се разтваря в 20^и^ 100 п)М NaCL-съдържащ ТЕ-разтвор [10 шМ TRIS-HC1 (pH 8.0) и о

mM EDTA]. След обработване при 65 С, в ~ΰδ продължение на 10 минути, олигонуклеотидите претърпяват термична обработка, чрез бавно охлаждане до стайна температура.

(iii) Получаване на G-CSF сДНК фрагмент

Шестдесет микрограма от получения в пример 9 pBRG4, съдържат посочената на фигура 5(A) сДНК, се обработва със 100 единици рестрикционен ензим Apal (New England Biolabs), и 50 φ единици Dral (Takara ShuzoCo., Ltd. ), при 37 C, в продължение на 5 часа, в 200у^ реакционен разтвор, съставен от 6 ПлМ TRIS-HC1, 6 mM MgCl^ и 6 тМ 2-меркаптоетанол. Извличат се около 2уиApal-Dral-фрагмент (приблизително 590 двойки бази), посредством 1.2% агароза-гел електрофореза.

(iv) Свързване на фрагменти

Около 0.1 (i ) до (iii),

, получени в вързване (66 л?М TRIS-HC1, 6.6 mM MgCl^ , 10 mM DTT и 1 тМ АТР). След доба вяне на 175 единици Т^. ДНК лигаза, разтворът се оставя през о

една цяла нощ, при 4 С, за да се получи рекомбинантен вектор ( фигура 6).

(2) Трансформиране

Като се използуват 20jaI от реакциои;?# разтвор, съдържащ рекомбинантния вектор, получен в (iv), Е. coli щам JM105 се трансформира посредством процедурата с рубидиев хлорид (виж Т. Maniatis et al., Molecular Cloning, p. 252 (1982)]. Плазмидът се отделя от една колония резистентна на ампицилин култура от трансформантите, и се обработва с рестрикционни ензими, BamHl, Accll и Apal, за да се потвърди, че това са действително желаните трансформанти.

ПРИМЕР 12 : Конструиране и трансформиране на Е. coli рекомбинантен вектор (+VSE), (като се използува PL промотор-съдържащ вектор) (1) Конструиране на рекомбинантен вектор (i) Получаване на вектора

Сто микрограма PL промотор-съдържащ вектор pPL-ламбда (Pharmaciа) се обработва в продължение на една нощ, при 37 С, с 50 единици рестрикционен ензим BamHl в 100/4^ реакционен разтвор [10 mM TRIS-HC1 (pH 7.6), 7 тМ MgClg , 100 тМ NaCl, и 10 тМ DTT].

Като се подложи реакционния разтвор на 1% агароза-гел електрофореза, се извличат около 49^^ един приблизително

4-кЪ фрагмент, и около 11yU^ един приблизително 1.2-кЬ фрагмент.

Фрагментът от около 4-кЪ се разтваря в 100^^ ТЕ-буфер (за неговия състав виж по-горе), и се дефосфорилира с алкална фосфатаза (Takara Shuzo Co., Ltd. ), при 60 С, в продъл жение на 60 минути.

Другият фрагмент, от около 1.2 кЬ, се разтваря в 20у*^ буфер (10 mM TRIS-HC1, 10 тМ MgCl^, 6 тМ КС1 и 1 тМ DTT), и се обработва в продължение на една нощ с 20 единици рестрикΰ ционен ензим Mboll (New England Biolabs), при 37 C.

-ΊΟПосредством 4¾ полиакриламид-гел електрофореза, се извличат около 0.$ BamHl-Mboll фрагмент (приблизително 200 двойки бази), и около 1.9у$ Mboll-BamHl фрагмент (приблизително 310 двойки бази).

(ii) Получаване на синтетичен линкер

Олигонуклеотидите, които имат последователностите от синтетични линкери, TAAGGAGAATTCATCGAT и TCGATGAAATTCTCCTTAG, се фосфорилират, и претърпяват термична обработка, както е в (И) на пример 11, така че да се получи синтетичен S/D линкер.

(iii) Получаване на експресионен вектор

Една десета от микрограма от приблизително 4-кЬ фрагмент, 0.05 от всеки един от двата фрагмента - BamHlMboll фрагмента, притежаващ областта ОдРд , и Mboll-BamHl фрагмента, притежават областта tL* [трите фрагмента се приготовляват в (1)1, и0.1^ от термично обработения синте тичен S/D линкер, приготвен ; продължение на една нощ, при твор (ббгГМ TRIS-HC1, 6.6 тМ в присъствие на 175 единици Ltd. ). Двадесет микролитра ι зуват за трансформиране на {Ц), се оставят да реагират в « р

С, в 40 иС реакционен разMgCl^ , 10 mM DTT, и 1 тМ АТР ), Т^.ДНК лигаза (Takara Shuzo Co. , т реакционния разтвор се изполЕ. coli щам N99C1⁺ (Pharmacia), посредством процедурата с калциев хлорид (виж Molecular Clo ning, ibid.).

Трансформантите се култивират, и плазмидът се извлича

-liот културата на тяхните резистентни на ампицилин колонии. Въздействието върху плазмида с рестрикционен ензим, EcoRI, BamHI и Smal показва, че това е желаният плазмид.

Два микрограма от плазмида реагират с рестрикционен ено зим Clal (New England Biolabs), при 37 C, в продължение на 2 часа, в 20 буфер (10 М Tris-HCl, 6 mM MgCl^ , и 50 тМ

NaCl). След това ензимът се инактивира , посредством нагряс ване при 65 С, в продължение на 10 минути.

Един микролитър от реакционния разтвор се оставя да реагира в продължение на една нощ, при 12 С, със 174 единици ДНК лигаза (Takara Shuzo Co., Ltd. ), в свързващ разтвор, имащ описания по-горе състав. След това реакционният разтвор се използува за трансформиране на Е. coli щам N99cl^ (Pharmacia). Плазмидът се извлича от културата на ампицилин-резистентните колонии на трансформантите, и се третира с EciRI и BamHI, за да се потвърди, че този плазмид е именно очакваният .

(iv) Получаване на G-CSF експресиращ рекомбинантен вектор и трансформанти

Експресионният плазмид, получен в (iii) се обработва с рестрикционен ензим Clal. След като се създаде тъп край, плазмидът се обработва тогава както в пример II, за да се получи рекомбинантен вентор, включващ сДНК фрагмент на G-CSF, Този вектор се използува за трансформиране на Е. coli щам N4850 (Pharmacia), посредством процедурите с калциев двухлорид, описани в Molecular Cloning (ibid. ). Идентифици-Τ'). r <

рането на желаните трансформанти се осъществява, както е в пример11 (фигура 7).

ПРИМЕР 13 : Конструиране и трансформиране на Е. coli рекомбинантен вектор (+VSE), (като се използува trp промотор-съдържащ вектор) ( 1 )Конструиране на рекомбинантен вектор (1) Получаване на вектор

Получава се плазмид ρΟΥΙ, посредством вмъкване на триптофанОбпромотор съдържащ Hpall-TaqI фрагмент (приблизително 330 двойки бази), в pBR322 на Clal края. Десет микрограма от този плазмид се обработват със 7 единици рестрикционен ензим

Clal и 8	о единици Pvull, при 57 С, в продължение на 3 часа,
в 30	реакционен разтвор, съставен от 10 WM TRIS-HC1, 6

mM MgCl^ и 50 mM NaCl.

След това се добавят 2Ja^ алкална фосфатаза (Takara

Shuzo Co., Ltd. ), и реакцията се извършва при 60° С, в продължение на 1 час.

От реакционния разтвор се извлича ДНК-фрагмент (приблизително 2.5 ) от около 2.6 кЬ, посредством 1% агароза-гел електрофореза.

(ii) Получаване на синтетичен линкер

Олигонуклеотиди, притежаващи последователностите от синтетични линкери, CGCGAATGACCCCCCTGGGCC и CAGGGGGGTCATTCG, се фосфорилират, и претърпяват термична обработка, както в

-Ί5(ii) на пример 11, така че да се получи синтетичен линкер.

(iii) Получаване на рекомбинантен вектор

Около

от вектор-фрагмента, получен в (1) около 1

G-CSF синтетичния линкер, получен в сДНК фрагмента, получен в (iii) (ii), и около 1от на пример 11, се оставят да реагират със 175 единици Т^ДНК лигаза, в продължение на една нощ, при 12°С, в 20^1 свързващ разтвор, имащ формулата, описана в пример 11, 1) (iv), така че да се получи рекомбинантен вектор (фигура 8).

(2) Трансформиране

Двадесет микролитра от реакционния разтвор, получен в (iii) се използуват за трансформиране на Е. coli DHI, посредством процедурата с рубидиев хлорид, описана в Molecular Cloning, ibid.

Както в пример 11, плазмидът се извлича от резистентните на ампицилин колонии на трансформантите, и обработка на този плазмид с рестрикционни ензими, Apal, Dral, Nrul и PstI показва, че се получават желаните трансформанти.

ПРИМЕР 14 : Култивиране на трансформанти (1) Култивиране на трансформантите (с tac), получени в пример 11

Трансформантите се култивират в продължение на една нощ, при 37^0, и 1 от културата се прибавя към среда Lu-н-

нето се провежда в продължение на 2-3 часа при 37 С.Куло тивирането се продължава при 37 С, в продължение на 2-4 часа, след добавянето на изопропил- D-тиогалактоза, до достигане на крайна концентрация 2 №М.

(2) Култивиране на трансформантите (с Р(_ ), получени в пример 12

Трансформантите се култивират в продължение на нощ, при 28° С, и 1 от културата се добавя към 100 4 да Luria, съдържаща 25, или 50уЩ/ / int то се провежда в продължение на около една среампицилин. Култивиранео часа при 28 С.

при

Култивирането продължава още 2 ( 3) Култивиране на трансформанти в пример 13 часа при 42^₽0.

(с trp).получени

Трансформантите се култивират в продължение на една нощ 37 ° С и

W/f от културата се прибавя към 100и1^ среда

0.5% глюкоза, 0.5% Casamino asids (Difco) и ампицилин. Провежда се култивиране в продължение на 4-6 часа,

М9, съдържаща или о

при 37 С. След като се добавят

3-^ -индолакрилова дължава 4-8 часа при киселина (IAA), култивирането

С.

се проПРИМЕР 15 :Получаване и пречистване на G-CSF полипептид от Е. coli

- Ί-5(1 ) Получаване

Трите вида култури на трансформанти от пример 14 се подлагат на следващите процедури

Културата (100 nrf ) се центрофугира, за да се получи кле тъчна утайка, която се суспендира в 5 w/ смес от 20 r77M TRISНС1 (pH 7.5) и ЗОГмМ NaCl.

След това, 0.2 М фенилметилсулфонил флуорид, 0.2 М EDTA и лизозим се добавят концентрации респективно 1 щМ, 10 г>?М и 0.2 и суспензията се оставя в продължение на 50 минути при О^С.

Клетките се лизират, посредством три цикъла замразяване/затопляне , последвано ^о^/о^имсст, от разрушаване с ултразвук. Лизатът се центрофугира, за да се получи супернатантата. Алтернативно, лизатът се обработва с 8 М гуанидин хидрохлорид, така че неговата крайна концентрация да бъде 6 М гуанидин хидрохлорид, последвано от центрофугиране при 50,000 об/минута, в продължение на 5 часа, и извличане на супернатантата.

(2) Пречистване (i) Супернатантата, получена в 1), се подлага на гелL филтрация на Ultrogel АсА54-колона (4.6 спп х 90 срц ; LKB), при изходен поток от около 50 Ш i/k , с 0.01 М TRIS-HCl-буфер (pH 7.4), съдържащ 0.15 М NaCl и 0.01% Tween 20 (Nakai

Kagaku Co., Ltd.).

Фракциите, които показват активност при анализ посредством метода за CSA-изследване (Ь), (описано преди това в

ΤοΑ ), се селекционират и концентрират до обем от приблизително 5 ml, с една апаратура за ултрафилтруване, рМ-1О (Amicon).

(ii) Към концентрираната фракция се добавя п-пропанол (в степен, достатъчна за аминокиселинно секвениране;Tokyo Kasei Co.,Ltd.), и трифлуороцетна киселина, и сместа се обработва по такъв начин, че крайните концентрации на п-пропанола и на трифлуороцетната киселина да бъдат съответно 30% и 0.1%. Обработената смес се оставя в лед в продължение на 15 минути, и се центрофугира при 15 000 об/минута, в продължение на 10 минути, за да се отдели утайката. Супернатантата се адсорбира наy*-Bondapak С18 колона (за полузаводски цели; Watwrs; 8 .фФ χ 30 с.Ф ), която се калибрира с един воден разтвор, съдържащ n-пропанол (виж по-горе), и трифлуороцетна киселина. Колоната се елюира непрекъснато с един воден разтвор на 0.1% трифлуороцетна киселина, съдържащ n-пропанол с линеен плътностен градиент от 30-60%. Адсорбцията при 220 пф и 280 ИФ се измерва едновременно, като се използуват Hitachi Model 685-50 (апаратура на Hitachi, Ltd. за високо ефективна течна хроматография), и Hitachi Model 638-41 (детектор на

Hitachi, Ltd. ). След елюирането, 1 аликвоти от всяка фракция се разраждат 100-кратно, и разражданията се скринират за активни фракции по метода за CSA-изследване (Ь). Активност се наблюдава при пиковете, които се елюират при 40% n-пропанол. Тези пикове се комбинират, и се хроматографират повторно, при същите условия, както по-горе, и фракциите се изследват за тяхната активност, по метод (Ъ). Отново се усптановява активност при пиковете за 40% п-пропанол. Тези активни пикове се събират (четири фракции = 4 и/⁷) и се лиофилизират.

(ii) Лиофилизираният прах се разтваря разтвор на 0.1% трифлуороцетна киселина, съдържащ 40% п-пропанол, и разтворът се подлага на високо-ефективна течна хроматография на Т8К-С30008¥-колона (7.5 0 х 60 cw; Toyo Soda Manufacturing Co.,Ltd. ). Елюирането се провежда при изходен поток от 0.4 m^/минута, с воден разтвор на 0.1% трифлуороцетна киселина, съдържащ 40%-пропанол, и се взимат 0.4 фракции с фракционен колектор, FRAC-100 (Pharmacia Fine Chemicals). Фракциите се изследват за тяхната CSA, както е описано п$-горе, и се взимат активните фракции.По-нататък те се пречистват на аналитична^-Bondapak С18 -колона (4.6 ГПГП х 30 cm), и главният пик се извлича и лиофилизира.

Така полученият протеин се обработва с 2-меркаптоетанол и се подлага на SDS-полиакриламидна гел-електрофореза(15-0%) (15 nN , 6 часа). След оцветяване с Coomassie Blue, желаният G-CSF полипептид може да се идентифицира като единична ивица.

ПРИМЕР 16 : Изследване на G-CSF-активност (+VSE)

Пробата CSF, получена в пример 15, се изследва съгласно метода за CSF-изследване (а), описан преди тов иЗОдрйтЕЦЦб · Резултатите са показани в таблица 1.

-ΊβТАБЛИЦА 1

	Човешки неутрофилни колонии (колонии/петри)
Пречистен човешки G-CSF (20 ^ )	73
CSF-проба, получена в пример 15 (50 nJ? )	68
празна	0

ПРИМЕР 17 : Амино киселинен анализ (+VSE) (1) Анализ на амино киселинен състав

Пречистената в пример 15 проба CSF, се хидролизира чрез рутинни процедури, и аминокиселинният състав на протеиновата част от хидролизата се анализира по метод за аминокиселинен анализ, посредством автоматичен аминокиселинен анализатор, Hitachi 835 (Hitachi Ltd.). Резултатите са показани на таблица 2. Хидролизата се провежда при следните уссловия :

(i) 6 N НС1, 110 С, 24 часа във вДкуум.

(ii) 4 N метансулфонова киселина + 0.2% 3-(2-амино етил)индол, 110 С, 24 часа, 48 часа, 72 часа, във вакуум.

-70'

Пробата се разтваря в разтвор (1.5 м£), съдържащ 40% ппропанол и 0.1% трифлуороцетна киселина. Аликвоти от по 0.1 )т9 всяка, се изсушават със сух газ азот, и след добавяне на реагентите, изброени в (1), или(11), контейнерите се запечатват под вакуум, и след това се провежда хидролиза на съдържанието .

Всяка от стойностите, показани на таблица 2 е средната от четири измервания, 24 часова стойност за (1), и 24, 48 и 72 часови стойности за (11), с изключение на съдържанията на Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Val, Il и Trp, които се изчисляват по следния метод (виж Tampaku Kagaku (Protein Chemistry ) II, A Course in Biochemical Experiments, Tokyo Kagaku Dohj in ) :

- 3a Thr, Ser, 1/2 Cys и Met, кривата на зависимостта от времето за 24, 48 и 72-часовите стойности за (ii) се екстраполира за нула часове.

-За Val и II, се използува 72-часовата стойност за(И).

-За Тгр се използуват осреднените 24, 48 и 72 часови стойности.

ТАБЛИЦА 2 (ДАННИ ОТ АМИНОКИСЕЛИНЕН АНАЛИЗ)

Амино киселини	tneY %
Asp ( Asp + Asn)	2.5
Thr	4.0

-зо~

Ser	8.5
Glu	15.2
Pro	7.3
Gly	7.9
Ala	10.7
1/2 Cys	2.8
Val	4.5
Met	2.0
He	2.3
Leu	18.3
Tyr	1 .7
Phe	3.4
Lys	2.3
His	2.8
Trp	1 . 1
Arg	2.9

(2) Анализиране на N-крайни амино киселини

Пробата се подлага на Edmar?-разпадане, посредством газово-фазов секвенатор (Applied Biosystems), и получената РТН амино кисеелина се анализират посредством рутинни процедури, с апаратура за високо ефективна течна хроматография (Beckman Instruments), и U1trasphere-ODS колона (Beckman Instruments). След като колоната .6 mr?) х 250 mzn ) се калибрира с начален буфер [един воден разтвор, съдържащ 15п?М натриево ацетатен буфер (pH 4.5), и 40% ацетонитрил], проба-81.та (като се разтваря в 20начален буфер) се инжектира и се осъществява разделяне, посредством изократно елюиране с начален буфер. По време на тези операции изходният поток се поддържа на 1 . 4 т/’/ min и температурата на колоната - на о

С.Детекцията на РТН амино киселината се реализира, като се използува абсорбцията в ултравиолетовата област при 269 Пт и 320 пт . Стандартни проби (всяка по 2 Πτηΰΐ ⁴ от

РТН амино киселина (Sigma) се разделят на една и съща линия, за да се определи тяхното време на задържане, което се сравнява с това на пробата, с цел да се идентифицират N-крайните амино киселини. В резултат, откриват се РТН-метионин и РТНтреонин.

ПРИМЕР 18 : Конструиране на Е. coli рекомбинантен вектор (-VSE), и трансформиране (1) Използуване на tac-промотор съдържащ вектор

Повтарят се процедурите от пример 11, с изключение на това, че pBRG4, приготвен в пример 9, който съдържа сДНК, показана на фигура 3(A)[виж (iii) на пример 11], се замества от pBRV2, приготвен в пример 10, който съдържа сДНК, показана на фигура 4(A). Както и в пример 11, получените трансформанти се проверяват, както и желаните такива (фигура 9).

(2) Използуване на PL-промотор-съдържащ вектор

Процедурите от пример 12 се повтарят, като се използува

-&2сДНК (-VSE), и получените трансформанти се проверяват, както желаните такива (фигура 10).

(3) Използуване на trp-промотор-съдържащ вектор

Процедурите от пример 13 се повтарят, като се използува сДНК (-VSE), и получените трансформанти се проверяват, както желаните такива (фигура 11).

ПРИМЕР 19 : Изследване на G-CSF активност (-VSE)

Трите вида трансформанти, получени в пример 18 се култивират по метода, описан в пример 14. От култивираните Е. coli клетки, се извличат G-CSF полипептиди, и се пречистват, по метода, описан в пример 15, по който човешкият G-CSF полипептид се получава като единична ивица.

Така получената CSF проба се изследва по метода за изследване на CSF активност (а), описан преди това в TQ&Q изобретение. Резултатите са показани в таблица 3.

ТАБЛИЦА 3
	Човешки неутрофилни колонии (холонии/петри)
Пречистен човешки G-CSF (20 иу )	73

- ¢3. Ki-

CSF проба, получена в пример 19 (50 nJ )	73
празна	0

ll РИМЕР 20 : Амино киселинен анализ (-VSE) ( 1) Анализ на аминокиселинния състав

Амино киселинният състав на CSF пробата, пречистена в пример 19, се анализира по метода, описан в 1) на пример 17. Резултатите са показани на таблица 4.

ТАБЛИЦА 4 (Данни от амино киселинен анализ)

Амино киселини	met %
Asp (Asp + Asn)	2.3
Thr	4.0
Ser	8.1
Glu (Glu + Gin)	15-0
Pro	7.5
Gly	8.1
Ala	11.0
1/2 Cys	2.9

-Г.' Д^,ЛХ<· м й € '

Vai	4.1
Met	2.0
He	2.2
Leu	18,8
Tyr	1 .7
Phe	3.4
Lys	2.5
His	2.7
Trp	1 . 1
Arg	2.8

(2) Анализ на N-крайни амино киселини

Пробата се подлага на анализ на N-крайните амино киселини, съгласно метода, описан в 2) на пример 17. В резултат, се откриват РТН-метионен, и РТН- треонин.

ПРИМЕР 21 : Получаване на pHGA41O вектор (за използуванес животински клетки, + VSf линия)

Полученият в пример 9 EcoRI фрагмент, който притежава показаната на фигура 5(A) сДНК,Се обработва с рестрикционен о ензим, Dral, при 37 С, в продължение на 2 часа, след което следва обработване с Klenow фрагмент на ДНК полимераза I (Takara Shuzo Co., Ltd. ), за да се сьздадат тъпи краища. Един микрограм Bglll линкер (8merq Takara Shuzo Co., Ltd. ), се фосфорилира c ATP, и се присъединява към около ^от_ делно получена смес от ДНК фрагменти. Съединените фрагменти се обработват с рестрикционен ензим, Bglll, и се подлагат на агарозна-гел електрофореза. След това се извлича само найширокият ДНК фрагмент.

Този ДНК фрагмент е еквивалентен на около 710 двойки бази, съдържащ човешки G-CSF полипептид кодиращ участък (виж фигура 5)· Ьвктор pdKCR [Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad Sci., USA, 81, 5086 (1984)] се обработва c ^стрикционен инзим BamHI, и след това е дефосфорилира с алкално фосфатаза (Takara Shuzo Co., Ltd). Полученият ДНК вектор се присъединява към 710 Ьр сДНК фрагмент^. , в присъствие на Т ДНК лигаза (Takara Shuzo Co., Ltd), така че да се получи pHGA410 (фигура 12). Както е показано на фигура 12, този плазмид съдържа промотор SV40 ранен ген, начало на репликация от SV40, част от заешки -глобинов ген, начало на репликация на pBR522 и произхождащ от pBR322 лактамазен ген (Ашр^г), като човешкия G-CSF ген е свързан пониско от промотора на SV40 ранния ген.

ПРИМЕР 22: Конструиране на рекомбинантен вектор (+VSE) за използуване при Трансформация на С127 клетки (1) Конструиране на pHGA410 (Н)

Двадесет микрограма от плазмид pHGS410 (фигура 12), приготвен в Пример 21 , се разтварят в реакционна смес състояща се от 50 тМ Tris-HCl (pH 7.5), 7 n’M MgCl^ , 100 mM NaCl, '867 mM 2-меркаптоетанол и 0.01% говежди серумен албумин (BSA).

Прибавя се рестрикционен ензим, EcoRI (10-15 единици; Takara

Shuzo Co., Ltd.) и реакционната смес се довежда до 37 С за около 50 минути, за да се постигне частично смилане с EcoRI.

След това, ДНК фрагмента се подлага на двукратна обработка със смес 1:1 от фенол/хлороформ, еднократна обработка с етер, и преципитация с етанол.

Полученият ДНК фрагмент се разтваря в твор, състоящ се от 50 n>M Tris-HCl, mM MgCl^ раз10 л?М DTT и по 1 гцМ ат $^еки от следните dATP, dCTP, dGTP и dTTP. След като се прибавят

от полимераза (Takara Shuzo ο

при 14 С в продължение фрагмента на Klenow от Е. coli ДНК Co., Ltd), разтворът се инкубира на 2 часа, за да се получат тъпи краища.

Чрез последваща гел електрофореза в 0.8% агароза, се получават 6 от ДНК

Пет микрограма фрагмент, с дължина около 5.8 кб.

от получения ДНК фрагмент се разтваTris-HCl като се

Ltd.) и рят отново в 50

реакционна (pH 7.6), 10 мм MgClg , смес, състояща се от 50 мМ мМ DTT и 1 мМ АТР. След прибавят 2 Hindlll единици Т4 ДНК лигаза (Takara Shuzo Co., Ltd), линкер (Takara Shuzo Co.,

100 реакцията се продължава през нощта, при 4 С.

това се осъществяват обработки с фенол и етер и с етанол. Преципитатът се разтваря в 30 jd разтвор, състоящ се от 10 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 7 мМ MgCl^ и о мМ NaCl, като разтвора се инкубира при 37 С в продължение

След преципитация на 3 часа, в присъствие на 10 единици Hindlll. След повторна

-&?обработка с ТДНК лигаза, получената ДНК се използува за трансформиране на Е. coll, щам DHI по метода на рубидиев хлорид (виж Molecular Cloning, ibid.). От ампицилин-резистентните (Amp ) колонии на трансформантите се селекционират клетки, съдържащи плазмид, идентичен на рНСА41О, с изключение на това, че Hindlll е инсериран на EcoRI сайта. Така полученият плазмид се нарича pHGA41O (Н) (фигура 13).

(2) Конструиране на експресионен рекомбинантен вектор pTN-G4

Двадесет микрограма от така полученият pHGA41O (Н), се разтварят в 50 реакционна смес състояща се от 10 мМ

Tris-HCl (pH 7.5), 7 мМ MgCl^, 175 mM NaCl, 0.2 мМ EDTA, 7 мМ 2-меркаптоетанол и 0.01% говежди серумен албумин. След като се прибавят 20 единици Sall (Takara Shuzo Co., Ltd),

J на уцасс. с-лед oSPtxSoria*e с И Угасваме С етянел.

_______________________________U.OHT» ίΌ,ΠΜ реакционната смес се инкубира приг14^<7С в продължение на около 2 часа, в присъствие на фрагнет на Klenow от ДНК полимераза (Takara Shuzo Co., Ltd.), така че да се получат тъпи краища. Без да се подлага на агарозна гел електрофореза за получаването на ДНК, реакционната смес моментално се подлага на преципитация с етанол. Полученият ДНК фрагмент се обработва с Hindlll и се получават 5J/j Hindlll-Sall фрагмент (около 2.7 кб), чрез гел електрофореза в 1% агароза. В отделен етап, плазмид pdBPV-I, съдържащ говежди папилома вирус (BPV) [този плазмид е любезно предоставен на Dr. Howley и се описва в Sarver, N, Sbyrne, J.C. & Howley, P.M., Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA, 79, 7147-7151 (1982)], се обработва c

- bbHindlll и PvuII, както е описано от Nagata et al., [Fukunaga, Sokawa и Nagata, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5086-5090 (1984), за получаване на ДНК фрагмент с дължина 8.4 кб. Този 8,4 кб ДНК фрагмент и отделно получения HindiIl-Sall ДНК фрагмент (около 2.7 кб) се лигират с Т ДНК лигаза. Продукта от лигирането се използува за трансформиране на E.coli щам DHI по метода на рубидиевия хлорид, описан в Molecular Cloning, ibid. Селекционират се колонии от Е. coll, съдържащи плазмид, притежаващ pHGA41О-производна G-CSF сДНК. Плазмидът се нарича pTN-G4 (фигура 15).

ПРИМЕР 25 Трансформация на С127 клетки и G-CSF експресията им (+VSE)

Преди да бъде използуван за трансформиране на миши С127 клетки, полученият в Пример 22 pTN-G4 се обработва с рестрикционен ензим BamHI. Двадесет микрограма ат плазмид pTNG4 се разтварят в 100 реакционна смес [10 мМ Tris-HCl (pH 8.0), 7 мМ MgCl^, 100 мМ NaCl, 2 мМ 2-меркаптоетанол и 0.01% BSA] и се третират с 20 единици BamHI (Takara Shuzo

Co., Ltd), c последващи обработки с фенол и етер и преципитация с етанол.

Мишите С127 клетки прорастват върху Dulbecco’s ми нималма основна хранителна среда, родишен серум (Gibco). Растящите съдържаща 10% говежди завърху петрита (5 сг') С127 клетки се трансформират с по 10на петри от отделно приготвената ДНК, по калциево фосфатния метод [виж Haynes, J. &

- 8^CJWeissmann, C., Nucleic Acids Res., 11, 687-706 (1983)]. След <5 обработване c глицерол, клетките се инкубират при 37 С в продължение на 12 часа.

Инкубираните клетки се прехвърлят на три свежи петрита (5 с<п ), а средата се подменя два пъти в седмицата. След 16тия ден, огнищата (колониите) се прехвърлят в свежи петрита и се подлагат на серийно култивиране върху Dulbecco’s минималма ос цОбий. хранителна среда, съдържаща 10¾ говежди зародишен серум (Gibco), така че да се селекционират клони, притежаващи висока степен на G-CSF продукция. Тези клонове продуцират G-CSF в степен приблизително 1 /1. Освен С127 клетките, могат да се използуват и NIH3T3 клетки като клетки-г остоприемници .

ПРИМЕР 24 : Експресия на G-CSF в СНО клетки (+VSE) (1) Конструиране на pHGG4-dhfг

Двадесет микрограма от плазмид pHGA410, получен в Пример 21 , се разтварят в 100реакционна смес, съдържаща 10 мМ Tris-HCl (pH 7.5), 7 мМ MgCl^ , 175 мМ NaCl, 0.2 мМ 2-меркаптоетанол и 0.01¾ BSA. Реакцията се осъществява в продъло жение на цялата нощ при 37 С в присъствие на 20 единици рестрикционен ензим Sall (Takara Shuzo Co., Ltd), c последващи обработки c фенол и етер, и преципитация с етанол.

Преципитата на ДНК се разтваря в 100 Ja$ реакционна смес, съставена от 50 мМ Tris-HCl, 5 мМ MgCl^, 10 мМ DTT и по 1 мМ от всеки dATP, dCTP, dGTP и dTTP и реакцията се про- 90вежда при 44 С в продължение на 2 часа, в присъствие на

Klenow фрагмент от Е. coli ДНК полимераза (1 ; Такага

Shuzo Co., Ltd), с последващи обработки с фенол и етер, и преципитация с етанол.

EcoRI линкер се прикрепя към ДНК-το в преципитата посредством следващите процедури: ДНК-το се разтваря в 5С

реакционна смес, съставена от 50 мМ Tris-HCl (pH 7.4), 10 мМ DTT, 0.5 мМ спермидин, 2 мМ АТР, 2 мМ хексамин-кобалтов хлорид и 20 UQ /BSA. Зеакцията се провежда при 4 С, в про дължение на 12-16 часа, в присъствие на EcoRI линкер (Такага Shuzo Co., Ltd), и 200 единици Т у. ДНК лигаза (Такага Shuzo Co., Ltd). След обработване с фенол, промиване с етер и преципитация с етанол, като всичко това се провежда по рутинни процедури, ДНК-преципитата частично се смила с EcoRI и се получава 3 UO ДНК фрагмент с дължинана около 2.7 кб, по средством тел електрофореза в 1¾ агароза.

Плазмид pAdD26SVpA [Kaufman, R. G. & Sharp, P. A., Mol. Cell Biol., 2, 1303-1319 (1982)] се обработва c EcoRI и се дефосфорилира като са обработва с бактериална алкална фосфа таза (ВАР). По-точно 20 от pAdD26SVpA и 20 единици от

EcoRI се прибавят към реакционна смес [50 мМ Tris-HCl (pH

7.5), 7 мМ MgCl^, 100 мМ NaCl, 7 мМ 2-меркаптоетанол и 0.01¾ о

BSA] и реакцията се провежда при 37 С, в продължение на 10 часа. След това се прибавят 5 единици ВАР към реакционната смес, и реакцията се провежда при 68^С в продължение на 30 минути. След обработка с фенол, EcoRI фрагментът от pAdD26SVpA се получава чрез електрофореза като добивът е

-9iприблизително 5Ja^,

Фрагментът с около 2.7 кб дължина и pAdD26SVpA, всеки от които тежи О.5у<у претърпяват термична обработка. Полученият плазмид се използува за трансформиране на Е. coli щам DHI по метода на рубидиев хлорид, и се селекционират колониите, включващи pHGG4-dhfr плазмида. Полученият плазмид се нарича pHGG4-dhfr (фигура 14а).

Алтернативната процедура е както следва: плазмид pHGG4 се обработва със Sall и се смила частично с EcoRI, без да се прикрепва никакъв EcoRI линкер. Получава се ДНК фрагмент с около 2.7 кб дължина и се обработва с Klenow фрагмент от Е. coli ДНК полимераза, за да се създадат тъпи крайно.. Един EcoRI фрагмент, притежаващ тъпи краища, се получава от pAdD26SVpA, както е описано по-горе. EcoRI фзрагментът и отделно полученият фрагмент (около 2.7 кб) се обработват с Т< ДНК лигаза, за да се получи pHGG4-dhfr.

pHGA41O (Н), получен в Пример 22, се обработва с рестрикционни ензими, Hindlll и Sall, както е описано в 2) на Пример 22, и Hindlll-Sall фрагментът се присъединява към ТЬ/7И9| край на EcoRI фрагментът на pAdD26SVpA, опикан погоре. Този метод може да се използува за поолучаване на pHGG4-dhfr (фигура 14Ь).

(2) Трансформиране и експресия

СНО клетки (щам dhfг; предоставени с любезното съгласие на Dr. L. Chasin of Columbia University) се култивират и прорастват в алфа-минимална основна хранителна среда, съдър'92· жаща 10% телешки серум ( 2 -MEN към който е прибавен аденозин, дезоксиаденозин и тимидин) в петрита (9 с Nunc). Култивираните клетки се трансформират посредством процедурата с калциев фосфат [Wigler et al., Cell, 14, 725 (1978)] по следния начин.

ДНК-носител (телешка тимусна ДНК) се прибавя в подходящо количество към 1 ), и сместа се разтваря в 575 прибавят 125 У М СаС1^.

върху лед в продължение на 5 плазмид pHGG4-dhfг, изготвен в

ТЕ разтвор след което се

След като разтвора се изстуди минути се прибавят 500

от 2 х HBS (50 мМ Hepes, 280 мМ NaCl и 1.5 мМ фосфатен буфер) към разтвора. След като отново се изстуди върху лед, разтвора се смесва с 1 mt от културата на СНО клетки, пре хвърля се в петрита и се инкубира в продължение на 9 часа в

СО^ инкубатор.

Следва промиване, прибавяне на 20% глицерол-съдържащ TBS (Tris-буферен физиологичен разтвор), и повторно промиване, след което се прибавя не селективна среда ( -MEN среда, описана по-горе, с изключение на това, че са прибавени нуклеотиди). След дву-дневно инкубиране, 10-кратно разреждане на културата се прехвърля в селективна хранителна среда (без добавка на нуклеотиди). Култивирането продължава, като хранителната среда се подменя със свежа селективна среда на всеки два дена, а получените огнища се селекционират и се прехвърлят в нови петрита, където клетките прорастват в присъствие на 0.02^метотрексат (МТХ), след което се клонират чрез растеж в присъствие на 0.1 ja М МТХ.

- 93 Трансформирането на СНО клетките може, също така, да се извърши чрез К05,транстформация с pHGG4 и pAdD26SVpA [виж

Scahill et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80,.4654-4658 (1985)].

Рекомбинантен вектор,конструиран по метода, използуващ полицистронен ген, също може да с§ използува за трансформиране на СНО клетки. Пример за този алтернативен метод е следния: pAdD26SVpA се третира с Pstl и получените два фрагмента се прикрепят към сДНК фрагмента на pBRG4-npoизводния CSF, така че да се конструира рекомбинантен вектор, където адено-вирусния промотор, CSF сДНК, DHFR и поли(А) сайта от SV-40 са инсерирани в посочената последователност. Този рекомбинантен вектор се използува за трансформиране на СНО клетки.

ПРИМЕР 25: Изследване на G-CSF активност (+VSE)

Супернатантите от култури на С127 и СНО келтки, които се получават в пример 25 и 24, съответно, се довеждат до pH 4 с 1 N оцетна киселина. След прибавяне на равен обем τιпропанол, полученият преципитат се отделя чрез центрофугиколма ₀ .

ране. Супернатантата се пропуска през отворена^ 1 х 2 сп? ), заредена с С8 обратно-фазов носител (Yama-mura Kagaku К. К.), а елуирането се провежда с 50% n-пропанол. Глягата се разрежда двукратно с вода и се подлага на обратно-фазово високо ефективна течна хроматография върху YMC-C8 колона (Yamamura Kagaku К. К.), последвана от ^Л/^иране с п-пропа'94нол (30-60% линеен плътностен градиент), съдържащ 0.1% TFA. Фракциите, които се елдоират при концентрация на п-пропанола около 40%, се събират, лиофилизират и се разтварят в 0.1 М глицинов буфер (pH 9). В резултат на тези процедури, човешкия G-CSF в С127 и СНО клетките се концентрира около 20 пъти.

Като контрола, клетките се трансформират с човешки несъдържащи сДНК G-CSF плазмиди и супернатантите на тяхните култури се концентрират, в съответствие с горе описаните процедури. Човешки G-CSF активностите на пробите, се изследват по метода за изследване на човешки G-CSF активност (а), описан по-рано в настоящето описание. Ако ефективността на експресия е достатъ/нс висока, супернатантите на културите могат директно* изследвани, без да се концентрират. Резултатите са ооосшени в таблица 5, където данните се основават на концентрирани проби.

ТАБЛИЦА 5

Изследване активността на човешки G-CSF

	Човешки неутрофилни колонии (колонии/петри)
Пречистен човешки G-CSF	(20 )	96

♦ и и ЧКултура от С127 клетки, трансформирани с pdBPV-1 (концентрирана 20 пъти)

BPV

Култура от ЗТ5 клетки, трансформирани с pdBPV-1 (концентрирана 20 пъти)

Култура от 0127 клетки, трансформирани с pTNG4 (концентрирана 20 пъти) dhf г

Култура от ЗТЗ клетки, трансформирани с pTNG4 (концентрирана 20 пъти)

Култура от СНО клетки, трансформирани с pAdD26SVpA (концентрирана 20 пъти

Култура от СНО клетки, трансформирани с pHGG4-dhf*r (концентрирана 20 пъти)

110

-АПРИМЕР 26: Амино киселинен анализ и въглехидратен анализ ( + VSE) (1) Анализ на амино киселинния състав Необработената CSF проба, приготвена в пример 25, се пречиства, в съответствие с процедурите, описани в пример 2 (ill). ПречистенатаCSF проба се хидролиза/# по рутинни процедури, а протеиновата част от хидролизата се проверява за не говия амино киселиннен състав чрез специален метод за амино киселинен анализ с Hitachi 835 автоматичен амино киселинен анализатор (Hitachi, Ltd.). Резултатите са показани на таб лица 6. Хидролизата се провежда при следните условия:

(i) 6 N НС1, 110*С, 24 часа, под вакуум (ii) 4 N метансулфонова киселина + 0.2% 3-(2-аминоо етил)индол, 110 С, часа, 48 часа, 72 часа, под вакуум, разтваря в разтвор ( 1 .5 ml ), съдържащ 40%

Пробата се

0.1% трифлуороцетна киселина. Аликвотни части, n-пропанол и всяка тежаща по 0.1 ml, се изсушават със сух азот газ и след прибавяне на реагентите, изброени в (1) и (ii), контейнерите се запечатват под вакуум, след което се хидролизира съдържанието .

Всяка от стойностите, показана на таблица 6, е средна от четири измервания, 24 часова стойност за (1) и 24, 48 и 72 часови стойности за (ii), с изключение на това, че съдържанието на Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Vai, He и Trp се изчисляват по следните методи (виж Tampaku Kagaku (Protein Chemistry) II, A Course in Biochemical Experin?W^5 , Tokyo

- g?Kagaku Dohjin) :

- 3a Thr, Ser, 1/2 Cys и Met, профила на зависимостта от времето на 24 , 48 и 72 часовите стойности за (ii) се екстраполират за нула часа.

- За Vai и Не, се използува 72 часовата стойност за (ϋ).

- За Тгр се използува средното от стойностите за 24, и 72 часовите стойности за (ii).

ТАБЛИЦА 6

Данни от амино киселинния анализ

Амино киселини	rr\Y %
Asp ( Asp + Asn )	2.5
Thr	3.9
Ser	8.5
Glu ( Glu + Gin )	15.5
Pro	7.4
Gly	7.8
Ala	10.8
1/2 Cys	2.8
Vai	4.5
Met	1 .7
lie	2.3
Leu	18.6
Tyr	1 .7

~

Phe	3.4
Lys	2.3
His	2.8
Trp	1 . 1
Arg	2.8

(2) Въглехидратен анализ

Вътрешен Стандарт (25 ПпЯ инозитол) се прибавя към

200 пй от пречистената CSF проба, използувана ό амино киселинния състав 1). След танол, (500 μβ ), съдържащ 1 .5 ' Ό твяват при 90 С в продължение на прибавяне на при анализа на разтвор на меНС1, реакциите се осъщесчаса в N^- пречистени, заТворени епруветки. След отваряне на епруветката се прибавя сребърен карбонат то. След това се (Ag^COj), за неутрализиране на съдържание прибавят анхидрид на оцетната киселисе разклаща определено време. След това, на и епруветката епруветката се остЯ^ да пренощува на тъмно при стайна температура. Горният слой се поставя в опитна епруветка и се изсушава с газ азот. Прибавя се метанол към преципитата и сместа се промива и леко се центрофугира. Горният слой се поставя в същата опитна епруветка и се изсушава. След приба-

TMS реагент (5:1:1 смес на пиридин, хекса метил дисилазан и триметил-хлоросилан), реакцията се провежда при 40 С в продължение на 20 минути, а реакционният продукт се съхранява при дълбоко замръзяване. Приготвя се стандарт чрез комбиниране на 25 ГНТ)(Я инозитол с по 50 от

- gg галактоза (Gal), N-ацетил галактозамин (Gal NAc ), сиалова киселина и всеки друг подходящ реагент.

Така приготвените проби се подлагат на газово хроматографски анализ, при следните условия :

Условия на анализа

Колона:	2% 0V - 17 VINport HP, 60 - 80 ямки, 3 /71 стъкло 0 о
Температура:	нагряване от 110 до 250 С при о , покачване 4 С/ mitt Z
Налягане на газа	(N^) носител: изходно 1.2 - 1.6 К^/сп? крайно 2 - 2.5 /сгп%
Чувствителност:	103 М Л обхват, 0.1 - 0.4 V
Налягане:	Н^ , 0.8 /с въздух, 0.8 XG /сит? у
Обем на пробата:	2.5 - 3.0jd
Като резултат	от анализа се идентифицират галактоза,
N-ацетил галактозамин	и сиалова киселина в CSF пробата, съг-

ласно настоящето изобретение.

ПРИМЕР 27 : Приготвяне на pHGV2 вектор (за употреба с животински клетки, -VSE линия)

EcoRl фрагмента, приготвен в пример 10, който притежава сДНК, показана на фигура 4(A), се третира с рестрикции онен ензим, Dral, при 57 С в продължение на 2 часа, след ко

-ήΰΟ ' ето се третира с фрагмента на Klenow от ДНК поли-мераза I (Takara Shuzo Co., Ltd.), за да се създадат тъпи краища. Един микрограм Bglll линкер (8-мер, Takara Shuzo Co., Ltd.) се фосфорилира с ATP и се прибавя към около 1у<^от получената отделно смес на ДНК фрагменти. Прибавените фрагменти се обработват с рестрикционен ензим, Bglll и се подлагат на агарозна гел електрофореза. След това се събира само най-големия ДНК фрагмент.

Този ДНК фрагмент е еквивалентен на около 710 двойки бази, съдържащ G-CSF полипептид кодиращ участък (виж фигура 5). Вектор pdKCR [Fukunaga et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 5086 (1984)] се обработва c рестрикционен ензим,

BamHI, след което се дефосфорилира с алкална фосфатаза (Takara Shuzo Co., Ltd.). Полученият ДНК-ов вектор се прибавя към 710-Ър сДНК фрагмент, в присъствие на Т^ ДНК лигаза (Takara Shuzo Co., Ltd.), така че да произведе pHGV2 (фигура 15). Както е показано на фигура 15, този плазмид съдържа промотора от SV40 ранния ген, началото на репликация от SV40, част от заешкия β -глобинов ген, началото на репликация на pBR322 и pBR522-npoH3Bодния ^-лактамазен ген (Αιηρζζ като гена за човешки G-CSF е свързан по-долу от промотора на SV40 ронния ген.

ПРИМЕР 28: Конструиране на рекомбинантен вектор (-VSE) за употреба при трансформирането на С127 клетки •4С1· (1) Конструиране на pHGV2(H)

20от плазмид pHGV2 (фигура 15), приготвен в пример 27, се обработва по процедурите, описани в 1) в Пример 22, така че да се приготви плазмид, наречен pHGV2(H).

(2) Конструиране на експресионен рекомбинантен вектор pTN-V2 описани в

Като се използуват 20 pHGV2(H), процедурите,

Пример 22 се повтарят, за селекционирне на Е. coli ,KQ7t? д? полуца&й плазмид, притежаваш рНСУ2-производна G-CSF плазмид се нарича pTN-V2 (фиг. 16).

сДНК. Този

ПРИМЕР 29: Трансформиране на С127 клетки и тяхната експресия (-VSE) pTN-V2, получен в Пример 28, се обработват с рестрикционен ензим, BamHI, преди да се използува за трансформиране на миши 0127 клетки.

Миши C127I клетки се трансформират с така приготвената ДНК, за да се експресира G-CSF (виж Пример 23) и се селекционират клонове притежаващи високо ниво на G-CSF продукция. Тези клонове продуцират G-CSF в количество приблизително 1 //Освен C127I клетките, могат също така да се използуват NIH3T3 клетки като клетки-гостоприемници.

ПРИМЕР 30: Експресия на G-CSF в СНО клетки (-VSE) '/)0Л ( 1 ) Конструиране на pHGV2-dhfr

ДНК фрагмент от около 2.7 kb дължина се приготвя от 20 у^ от плазмид pHGV2 (Пример 27), чрез процедурите, описани в 1 ) в Пример 24. Този фрагмент (0.5) и EcoRI фрагмента на pAdD26SVpA (0.5yt^ ) се обработват термично. Полученият плазмид се използува за трансформиране на Е. coll щам DHI чрез процедурата на рубидиев хлорид, а клоновете, съдържащи плазмид pHGV2-dhfr се селекционират. Полученият плазмид се нарича pHGV2-dhfr (фиг. 17а).

Алтернативната процедура е както следва: плазмид pHGV2 се обработва със Sall и частично се смила с EcoRI, без да е прикрепен какъвто и да е EcoRI линкер. ДНК фрагмент от около 2.7 kb дължина се отделя и се обработва с фрагмента на Klenow от Е. coli ДНК полимераза, за да създаде тъпи краища. EcoRI фрагмент с тъпи краища се приготвя от pAdD26SVpA, както е описано по-гора. EcoRI фрагмента и приготвения отделно фрагмент ( около 2.7 kb) се обработват с ДНК лигаза, за получаване на pHGV2-dhfr.

pHGV2(H), приготвен в пример 28, се обработва с рестрикционни ензими, Hindlll и Sall, както е описано в 2) в Пример 28, и Hindlll-Sall фрагмента се прибавя към завършващия с тъп край EcoRI фрагмент на pAdD26SVpA, описан по-горе. Методът може също така да се използува за приготвяне на pHGG4-dhfr (фиг. 17Ь).

( 2) Трансформиране и експресия

СНО клетките, са трансформирани с плазмид pHGV2

-ЛОУ dhfг, за G-CSF експресия, в съответствие с процедурите, описани в 2) в Пример 24.

Трансформацията на СНО клетки може, също така, да се осъществи чрез котрансформация с pHGV2 и pAdD26SVpA [виж Scahill et al., Proc. Natl. Acaad. Sci., USA, 80, 4654-4658 (1983)].

Рекомбинантен вектор, конструиран по метода, използуващ полицистронен ген, също може да бъде използуван за трансформиране на СНО клетки. Пример за този алтернативен метод е както следва: pAdD26SVpA се обработва с PstI и получените два фрагмента се прикрепят към рВИУ2-производния CSF сДНК фрагмент, така че да бъде конструиран рекомбинантен вектор,при който да са инсерирани, в дадения ред, адено вирусен промотор, CSF сДНК, DHFR и поли(А) сайта на SV40. Този рекомбинантен вектор се използува за трансформиране на СНО клетки.

ПРИМЕР 31: Изследване на G-CSF активност (-VSE)

По описаните в пример 25 процедури, се получава човешки G-CSF от супернатантата от култури на С127 клетки и СНО клетки, които са били получени в Примери 29 и 30, съответно. Активността за човешки G-CSF на всяка от получените проби се изследва както в пример 25. Резултатите са показани на таблица 7.

- Л</~

ТАБЛИЦА 7

Изследване на човешка G-CSF активност

	Човешки неутрофилни колонии (колонии/петри)
Пречистен чевешки G-CSF (20 пд ) <7	96
	Култура от С127 клетки, транс формирани с pdBPV-1 (концентрирани 20 пъти)		0
BPV	Култура от ЗТЗ клетки, трансформирани с pdBPV-1 (концентрирани 20 пъти)	0
Култура от С127 клетки, транс формирани с pTN-V2 (концентрирани 20 пъти)		107
	Култура от ЗТЗ клетки, трансформирани с pTN-V2 (концентриран 20 пъти	105
	Култура СНО клетки, трансформирани с pAdD26SVpA	0

(концентрирана 20 пъти) dhfr

Култура СНО клетки, трансформирани с pHGV2-dhfr

ПРИМЕР 32: Амино киселинен анализ и въглехидратен анализ (-VSE) (1 ) Анализ на амино киселинния състав

Необработената CSF проба, получена в Пример 31, се пречиства в съответствие с процедурите, описани в Пример 2 (iii). Пречистената CSF проба се подлага на анализ на аминокиселинния състав чрез процедурите, описани в 1) в Пример

26. Резултатите са показани на таблица 8.

ТАБЛИЦА 8

Данни от амино киселинния анализ

Амино киселини	%
Asp (Asp + Asn)	2.3
Thr	4.0
Ser	8.1
Glu (Glu + Gin)	15.1
Pro	7.5
Gly	8.0

яс 6 -

Ala	10.9
1/2 Cys	2.8
Vai	5.9
Met	1 .7
He	2.5
Leu	18.9
Tyr	1 .7
Phe	3.5
Lys	2.5
His	2.9
Trp	1 .2
Arg	2.9

(2) Анализ на въглехидратния състав

Пречистената CSF проба, използувана при анализа на амино киселинния състав в 1), също така се подлага на анализ на нейния въглехидратен състав, чрез същите процедури и при същите условия, като тези описани във 2) в Пример 26. В резултат на този анализ се проверява присъствието на галактоза, N-ацетил галактозамин и сиалова киселина в CSF пробата, съгласно настоящето изобретение.

ПРИМЕР 53 : Предпазващ ефект на G-CSF срещу микробиални инфекции

1. Предпазване от инфекции с Pseudomonas aeruginosa

I ec/Twb пет

Прилага се интраперитониално Endoxan (търговско име на Shionogi & Co., Ltd) при 8-9 седмични ICR мишки (мъжки

35.3 + 1.38 г. телесно тегло) при доза 200 ιη^ / ♦ След това мишките се разделят на три групи: две групи се подлагат на подкожни инжекции (всеки по 0.1 mt доза), при 24 часови ин тервали, c разтворител [1% пропанол и 0.5% (r*w/0&?4) миши се румен албумин във физиологичен разтвор], съдържаш човешки GCSF (25,000 или 50,000 единици/мишка), докато на третата група се прилага едиинствено разтворителю, в съответствие със същата схема. Три часа след последното инжектиране, миш ките от всяка група се инфектират с Pseudomonas aeruginosa

GNB-139 чрез подкожно инжектиране (3.9 х 10 CFU/мишка). Двадесет и един часа след инфектирането, на първите две групи се прилага ново подкожно инжектиране с разтворител, съдържащ човешки G-CSF (25.000 или 50,000 единици/мишка), докато на третата група се прилага единствено разтворител.

Предпазващия ефект на човешки G-CSF се проверява като се преброява броя на живите мишки, десет дена след инфек тирането .

Изготвяне на клетъчна суспенсия

Pseudomonas aeruginisa GNB-139 се култивира цяла нощ о .

при 37 С в течна хранителна среда за сърдечна инфузия (търговско име на Difco). Културата се суспендира във физиоло гичен разтвор.

Tub “

2. Предпазване от инфекции с Candida

Интраперитонеално се прилага Endoxan (търговско име на Shiinigi & Co., Ltd) на 8-седмични мкшки ICR (мъжки; 40.5 + 1.60 телесно тегло) при доза 200 /K(j . След това мишките се разделят нан две групи: едната група се подлага на подкожно инжектиране (всеки по 0.1 m3 доза), през 24 часови интервали, с разтворител [1% пропанол и 10% (т/об) миши ICR серум във физиологичен разтвор], съдържащ човешки G-CSF (50,000 единици/мишка), докато втората група се третират единствено с разтворител, в съответствие със същата схема. Четири часа след последното инжектиране, мишките от всяка група се инфектират с Candida albicans U-50-1 (щам, изолиран от урина на И£/>кемични пациенти; любезно предоставени от Bacteriological Laboratories, Tohoku University, School of Medicine), чрез интравенозно инжектиране (5.6 x IO^CFU/мишка). Предпазният ефект на човешки G-CSF се проверява чрез преброяване на броя живи мишки, десет дена след инфектирането .

Приготвяне на клетъчна суспенсия

Candida albicans U-50-1 се култивира цяла нощ при о разбъркване на 57 С в екстракт от дрожди, съдържащ хранителна среда на Сабуро (2% декстроза от Junsei Pure Chemicals Co., Ltd.; 10% триптоказ-пептон, търговско име на BBL; 5% дрождев екстракт от Difco; pH 5-6). Културата двукратно се промива с физиологичен разтвор и се суспендира във физиоло-/loQгичен разтвор.

3. Предпазване от инфекции с вътреклетъчно паразитираша Listeria

Интраперитонбално се прилага Endoxan (търговско наименование на Shionogi & Co., Ltd.) на 7 седмични ICR мишки (мъжки; 34.7 + 1.24 телесно тегло) в доза от 200 /п^/к^. След това мишките се разделят на две групи: едната група се третира чрез подкожно инжектиране (на всяка по 0.1 mH доза), на 24 чосови интервали, с разтворител [1¾ пропанол и 10¾ (т/об) миши ICR серум във физиологичен разтвор], съдържащ човешки G-CSF (50.000 единици/миишка ), докато на другата група се прилага единствено разтворителя, в съответствие със същата схема. Четири часа сле^ последното инжектиране, мишките от всяка група се инфектират с Listeria monocytogenes 46 (любезно предоставена от Microbiological Laboratory, Tohoku University, School of Medecine) чрез интравенозно инжектиране на 1.0 х 10? CFU/мишка. Предпазния ефект на човешки G-CSF се проверява като се преброява броя на живите мишки 12 дена след инфектирането.

Приготвяне на клетъчна суспенсия

Listeria monocytogenes 46 се култивира в продължение о на една нощ при постоянно разбъркване, при 37 С в течна хранителна среда за мозъчно-сърдечна инфузия (търговско наименование на Difco). Културата се суспендира във ^зиологичен разтвор.

-Ηΐΰ

Резултати (1) Предпазен ефект на нативен човешки G-CSF

Тестове 1, 2 и 3 се провеждат с човешки G-CSF, получен от CHU-1 и който е описан в Сравнителен Пример 2. Резултатите са показани на таблиции 9, 10 и 11.

ТАБЛИЦА 9

Ефект срещу Pseudomonas aeruginosa

група	CSF концентрация (единици/мишка/ден)	Живи мишки/ тестирани мишки
разтворител	0	0/11
CSF-съдържащ разтворител	25,000	6/10
CSF-съдържащ разтворител	50,000	8/1 1

- Al l ·

ТАБЛИЦА 10

Ефект срещу Candida albicans

група	CSF концентрация (единици/мишка/ден)	Живи мишки/ тестирани мишки
разтворител	0	0/10
CSF-съдържащ	50.ООО	10/10
разтворител

ТАБЛИЦА 11

Ефект срещу Listeria monocytogenes

група	CSF концентрация (единица/мишка/ден)	Живи мишки/ тестирани мишки
Разтворител	0	0/10
CSF-съдържащ разтворител	50.000	10/10

(2) Предпазен ефект на човешки G-CSF, получен от рекомбинантни трансформанти

1) Тестове 1, 2 и 3 се осъществяват с Е. coli G-CSF (-VSE) полипептид, получен в Пример 15. Резултатите са показани на Таблици 12, 13 и 14.

ТАБЛИЦА 12

Ефект срещу Pseudomonas aeruginosa

група	CSF концентрация (единици/мишка/ден)	Живи мишки/ тестирани мишки
Разтворител	0	0/10
CSF-съдържащ разтворител	25.000	6/10
CSF-съдържащ разтворител	50.000	8/10

ТАБЛИЦА 13

Ефект срещу Candida albicans

група	CSF концентрация (единиции/мишка/ден)	----------- Живи мишки/ тестирани мишки ί
Разтворител	0	0/10
^Е-съдържащ разтворител	50.000	10/10

ТАБЛИЦА 14

Ефект срещу Listeria monocytogenes

група	CSF концентрация (единици/мишка/ден)	Живи мишки/ тестирани мишки! I
Разтворител	0	0/10
CSF-съдържащ разтворител	50.000	10/10 ) ----------------i

ii) Тест 1 се осъществява с Е. coll G-CSF (-VSE) полипептид, получен в Пример 19. Резултатите са

показани на Таблица 15.

ТАБЛИЦА 15

Ефект срещу Pseudomonas aeruginosa

група	CSF концентрация (единици/мишка/ден)	Живи тестирани	мишки мишки
Разтворител	0	0/10
CSF-съдържащ	25.000		6/10
разтворител
CSF-съдържащ	50.000		8/10
|разтворител

iii) Тест 1 се осъществява с проба от произхождащ от СНО клетки, пречистен човешки G-CSF (+VSE),която е същата, като тази, използувана за анализа на амино киселинния състав в Пример 26. Резултатите са показани на Таблица 16.

- .-1 ь -

ТАБЛИЦА 16

Ефект срещу Psedomonas aeruginosa

група	CSF концентрация (единици/мишка/ден)	Живи тестирани	мишки мишки
Разтворител	0	0/10
CSF-съдържащ	25.000		9/10
разтворител
CSF-съдържащ	50.000		10/10
разтворител

Съществено с щите резултати се постигат, когато Тест се провежда с проба от произхождащ от С127 клетки, пречистен човешки G-CSF, който е същия като този, използуван при анализа на амино киселинния състав в Пример 26.

iv) Тест 1 се провежда с проба, на произхождащ от СНО клетки, пречистен човешки G-CSF (-VSE), който е същия като този, използуван при анализа на амино киселинния състав в Пример 32. Резултатите са показани в Таблица 17.

ЯЖ

ТАБЛИЦА 17

Ефект срещу Pseudomonas aeruginosa

група	CSF концентрация (единици/мишка/ден)	Живи мишки/ тестирани мишки
Разтворител	0	0/10
CSF-съдържащ разтворител	25.000	9/Ю
CSF-съдържащ разтворител	50.000	10/10

Съществено същите резултати се постигат, когато Тест се осъществява с проба от произхождащ от С127 клетки, пречистен човешки G-CSF, който е същия като тОзи, използуван при анализа на амино киселинния състав в Пример 32.

ПРИМЕР 34

Лиофилизирана автентична проба от чоовешки G-CSF, приготвена както в Пример 2, се разтваря в разтвор за инжектиране и се разделя на инжекции, всяка от които да съдържа желаната доза единици.

_ /117ПРИМЕР 35

Лиофилизирана автентична проба от Е. coli човешки GCSF полипептид, приготвен както в Пример 15, се разтваря в разтвор за инжектиране, като се разделя на инжекции, всяка от които съдържа желаната доза единици.

Claims (7)

1. ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

   Претенции за следните страни членки : ВЕ,СН, LI, DE,

   FR, GB, IT, NL, SE

   1. сДНК последователност, кодираща за следната амино киселинна последователност:

   -ЗО Met Ala Gly Pro Ala Thr Gin Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gin Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gin Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Glu Gin Val Arg Lys He Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Glu Lys Leu (Val Ser Glu) Cys 'гл Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly He Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly lie Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr He Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr + -(/4 Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin Pro

   (където m е 0 или 1) ,,_;. .йц^якажах^,'^'^ .МФаВаЙй^йк^&г», <.;.
2. 2. сДНК последователност, съгласно претенция 1, притежаваща следната нуклеотидна последователност:

   ATG GCT GGA CCT GCC ACC CAG AGC CCC ATG AAG CTG ATG GCC CTG CAG CTG CTG CTG TGG CAC AGT GCA CTC TGG ACA GTG CAG GAA GCC ACC CCC CTG GGC CCT GCC AGC TCC CTG CCC CAG AGC TTC CTG СТС AAG TGC TTA GAG CAA GTG AGG AAG ATC CAG GGC GAT GGC GCA GCG CTC CAG GAG AAG CTG (GTG ACT GAG) tV TGT 1 GCC ACC TAC AAG CTG TGC CAC CCC CAG CAG CTG GTG CTG CTC GGA CAC TCT CTG GGC ATC CCC TGG GCT CCC CTG AGC AGC TGC CCC AGC CAG GCC CTG CAG CTG GCA GGC TGC TTG AGC CAA CTC CAT AGC GGC CTT TTC CTC TAC CAG GGG CTC CTG CAG GCC CTG GAA GGG ATC TCC CCC GAG TAG GGT CCC ACC TGG GAC ACA CTG CAG CTG GAC GTC GCC GAC TTT GCC ACC ACC ATC AGG CAG CAG ATG CAA CAA CTG GGA ATG GCC CCT GCC CTG CAG CCC ACC CAG GGT GCC ATG CCG GCC TTC GCC TCT GCT TTC CAG CGC CGG GCA GGA GGG GTC CTG GTT GCC TCC CAT CTG CAG AGC TTC CTG GAG GTG CTG TAC CGC GTT CTA CGC CAC CTT GCC CAG CCC

   (където m е 0 или 1 )
3. 3. Рекомбинантен вектор, съдържащ ДНК последователност, съгласно претенция 1 или 2.
4. 4. ТранСформант, съдържащ рекомбинантен вектор, съ- гласно претенция 3.
5. 5. Метод за производство на протеин, включващ култивиране на трансформанта, съгласно претенция 4, при подходящи условия, и получаване на посочения протеин.
6. 6. Протеин, притежаващ следната амино киселинна последователност :

   -30 Met Ala Gly Pro Ala Thr Gin Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gin Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Vai Gin Glu Ala Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Gin Gin Vai Arg Lys He Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Gin Lys Leu (Vai Ser Glu) Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Vai Leu Leu Gly His Ser Leu Gly lie Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly He Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Vai Ala Asp Phe Ala Thr Thr lie Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Vai Leu Vai Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Vai + 41½ Ser Tyr Arg Vai Leu Arg His Leu Ala Gin Pro

   (където m е 0 или 1 )

   Ί. Фактор стимулиращ човешки гранулоцитни колонии , притежаващ следната амино киселинна последователност :

   +1

   Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gin Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu Gin Gin Val Arg Lys He Gin Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gin Gin Lys Leu Val Ser Glu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu Gly His Ser Leu Gly lie Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser Gin Ala Leu Gin Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gin Leu His Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gin Gly Leu Leu Gin Ala Leu Glu Gly He Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gin Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala Thr Thr He Trp Gin Gin Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu Gin Pro Thr Gin Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gin Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gin Ser Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gin

   + 171

   Pro
7. 8. Средство за предпазване от инфекции съгласно претенция 7, характеризиращо се с това, че като активна съставка съдържа фактор, стимулиращ човешки гранулоцитни колонии.