KR960000394B1

KR960000394B1 - 백혈구 감소증 치료제의 제조방법

Info

Publication number: KR960000394B1
Application number: KR1019860008292A
Authority: KR
Inventors: 마사히꼬 다무라; 히또시 노무라; 구니히로 하또리; 마사요시 오노
Original assignee: 쥬우가이세이야꾸 가부시끼가이샤; 우에노 기미오
Priority date: 1985-10-04
Filing date: 1986-10-02
Publication date: 1996-01-06
Also published as: AU6312186A; EP0217404A3; ES2055684T5; AU596997B2; JPH0618778B2; DE3683430D1; NO863918L; ES2055684T3; FI863971A0; FI863971A; KR870003792A; EP0217404B1; JPS62174026A; NO863918D0; EP0217404A2; DK471386D0; DK471386A; DK172204B1; AU596997C; HK65693A

Abstract

내용 없음.

Description

백혈구 감소증 치료제의 제조방법

제1도는 세가지 서로 다른 탑침, IWQ, A 및 LC의 서열을 나타낸다.

제2도는 pBRG4의 cDNA 삽입물의 염기서열을 나타낸다.

제3도는 pBRV2의 cDNA 삽입물의 염기서열을 나타낸다.

제4도는 발현용 재조합 벡터 pTN-G4의 제작과정을 나타낸다.

제5도는 pHGG4-dhfr 제작과정을 나타낸다.

제6도는 발현용 재조합 벡터 pTN-V2의 제작과정을 나타낸다.

제7도는 발현용 재조합 pHGV2-dhfr제작과정을 나타낸다.

본 발명은 인체 과립구 콜로니 자극인자(이하 인체 G-CSF라 한다)를 유효성분으로 하는 백혈구 감소증 치료제에 관한 것이다.

종래의 2층 연한천 배양법을 이용하여 상층에 표적세포로서 골수세포를, 하층에 신장세포나 태아세포를 넣어서 배양하면 상층의 세포의 일부가 증식분화하여 호중구(好中球)계 과립구(이하 과립구(granulocyte)라 한다)나, 단구 대식세포 콜로니가 형성된다. 이 발견으로 생체내에 콜로니 형성을 촉진하는 인자가 존재 한다는 것을 알 수 있게 되었다(Pluznik & Sach ; J. Cell. Comp. Physiol., 66권 319면(1965), Bradley & Metcalf ; Aust. J. Exp. Biol.Med. Sci., 44권 287면 (1966).

CSF라 총칭되는 이 인자는 정상적으로 널리 생체내에 분포하는 세포, 예를들면 T세포, 단구 대식세포, 섬유아세포, 내피세포등으로부터 생산되는 것으로 알려져 었다. CSF에는 과립구·단구 대식세포의 간(幹)세포에 작용하여 그 증식을 자극하고 분화를 유도하여 연한천중에서 과립구나 단구 대식세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 과립구-단구 대식세포 CSF(GM-CSF라 한다), 주로 단구 대식세포의 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 단구 대식세포 CSF(GM-CSF라 한다), 보다 미분화한 다능성 간세포에 작용하는 다능성 CSF(multi-CSF라 한다), 또는 본 발명과 같은 주로 과립구계 콜로니를 형성시키는 작용을 갖는 과립구 CSF(G-CSF라 한다) 등의 아류가 존재하며, 각각의 아류에 의하여 표적세포의 분화단계도 다르다[Asano; 대사-Metabolism and Disease, 22권 249면(1085), Yunis등 ; “Growth and Maturation Factors”, edited by Guroff, John Wiley & Sons, NY, 1권, 209면(1983)].

인체 CSF에 관하여는 이제까지 인체 정상조직 유래의 CSF나 인체 종양 세포유래의 CSF에 대하여 다수 보고 되어 있다.(예를들면 Stanley등 Fed. Proc. 35 2272(1975), Burgess등 Blood 49 573(1977), Shah등 Blood 50 811(1977), Fojo등 Biochem, 17 3109(1978), Okabe등 Cancer Res 38 3910(1978), Asano등 Blood 49 845(1977), Golde등 Blood 57 1321(1981), Wu등 j. Biol. Chem 254 6226(1979), Dipersio등 Blood 56 717(1980) 등을 참조)

그러나 이들 인체 CSF는 완전히 정제된 것은 아니며, 따라서 인체 CSF의 의약으로서의 유용성 또는 유효성에 대하여는 아직 불명한 상태였다.

정상인의 말초 백혈구수는 1㎣당 4000∼9000개이지만(다까가오등, 임상검사 12권 12호 906∼910면, 1968년을 참조), 여러 가지의 원인으로 말초 백혈구수가 4000개 이하로 저하될 때가 있는데, 이와같은 상태를 통상 백혈구 감소증이라 칭하고 있다.

백혈구 감소증은 각종 백혈구가 똑같이 감소하는 경우도 있으나, 통상은 어느 1종의 백혈구의 감소에 기인하며, 감소를 나타내는 백혈구의 종류에 따라서 호중구 감소증(neutropenia), 호산구 감소증(eosinopenia), 임파구 감소증 (lymphop enia)과 같이 분류되는 경우도 있다.

그러나 임상적으로는 백혈구 감소증의 태반이 호중구 감소에 기인하고 있다.

호중구의 감소는 1)골수에 있어서의 호중구 생성의 저하, 2) 말초에서의 소비·파괴의 항진의 2개의 원인에 의하여 일어나며, 이를 유발하는 많은 원인 질환 내지 병태(원인불명의 본체성의 것, 방사선조사, 여러 가지의 혈액질환에 수반하여 나타나는 것등, 상세한 것은 진단과 치료 70권 7호 24∼31면, 1982년을 참조)가 알려져 있으나, 호중구 감소의 대부분은 여러 가지의 약제의 투여에 기인하여 발생하고 있으며, 특히 호중구 절대수가 150㎣ 이하인 소위 무과립구증(agranulocytosis)(예를들면, 고미네 고호하꾸 : 혈액병학, 227면, 849면, 1981년을 참조)을 야기할 가능성을 갖는 약제기인성의 호중구 감소는 임상적으로 중요한 문제로 되어 있다.

호중구 감소를 가져오는 약제로서는, 사이클로포스퍼미드 등의 알킬화제, 시토신아라비노시드 등의 대사 길항제, 다우놀비신 등의 항암성 항생물질등과 같은 범혈구 감소증(pancytopenia)을 가져오는 종류 또는 설파제, 아미노필린 등의 해열진통 진정제, 항경련제, 클로람페니콜 등의 항생물질, 항갑상선제등과 같은, 소위 약물과민증에 의한 호중구 감소를 가져오는 종류가 있다(상세한 것은 진단과 치료 70권 7호 24∼31면, 1981년을 참조).

한편, 호중구를 증가시키는 약물로서는 세파란틴, 아데닌제, L-시틸렌, 파로틴, 리보핵산 분해물등이 있는데, 이들의 약제는 효과가 충분하지 못하든가 아니면 고빈도의 부작용의 발현등으로 유효하지 못하다.

또 증가회복되는 호중구는 본래의 기능을 갖고 있는 정도로 충분히 성숙한 형태의 것이 아니면, 예를들면 식기능이 빈약한 경우에 생체의 정상적인 유지에 필요한 방어기능을 다하지 못하게 될 가능성이 있다.

따라서 충분히 서술한 형태를 갖는 호중구의 증가작용을 갖고, 또한 부작용이 적은 약제의 등장이 기대되어 왔다.

이와같은 상황에서 본 출원인은 구강저암환자의 종양세포로부터 극히 높은 인체 G-CSF 생산성능을 갖고 그리고 양호한 증식능을 나타내는 세포주 CHU-1(C. N. C. M. 수탁번호 “I-315“한국과학 기술원에서 수탁 거부 했음)을 수립하여, 이 세포주의 배양상청으로부터 인체 호중구의 콜로니 형성 촉진 활성을 나타내는 순수한 인체 G-CSF의 단리에 처음 성공하였다(일본 특원소 59-153273호). 이어서 본 출원인은 동일하게 인체 구강저암 유래의 세포주 CHU-2(C. N. C. M. 수탁번호 “I-483“한국과학 기술원에서 수탁 거부 했음)를 수립하여, 이 세포주의 배양상청으로부터 CHU-1유래의 것과 완전히 같은 G-CSF의 단리에 성공하였다.

또한 본 출원인은 이들 세포배양법보다도 고농도의 G-CSF를 얻을 수 있고 복잡한 정제과정을 필요로 하지 않는 재조합 DNA 기술에 의한 G-CSF의 제조방법에 대하여 예의 연구를 거듭한 결과, 결국 이 기술에 의하여 균일한 인체 G-CSF를 대량으로 취득하는데 성공하였다(일본 특원소 60-269455호, 동 특원소 60-269456호, 동 특원소 60-270838호, 동 특원소 60-270839호).

상기한 성과를 기초로 하여 본 발명자들은 정상 동물 및 호중구 감소 상태의 동물 모델에 상기 인체 G-CSF룰 투여했을 때, 정상 동물에 있어서는 상당한 호구증가작용이 나타내고 또 호중구 감소 상태의 동물 모델에 있어서는 상당한 호중구 감소 저지작용이 나타나며, 또한 증가한 호중구가 충분히 성숙한 형태를 가져, 인체 G-CSF가 백혈구 감소증 치료약으로서 유효함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 신규한 백혈구 감소증 치료제의 제공에 관한 것이다.

즉, 본 발명은 인체 G-CSF를 유효성분으로 하는 백혈구 감소증 치료제에 관한 것이다.

다음에 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 백혈구 감소증 치료제의 유효성분인 인체 G-CSF로는 백혈구 감소증 치료제용으로서 순도로 정제된 인체 G-CSF이면 모두 사용할 수 있는데, 인체 G-CSF 생산 세포를 배양한 배양 상층액으로부터 단리하여 얻어지는 것 및 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드를 코오딩하는 유전자를 도입한 재조합 벡터에 의하여 숙주를 형질 전환하여서 얻어지는 형질 전환체가 생산하는 인체 G-CSF 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 당단백질이 바람직하다.

구체적으로는 다음 (1) 및(2)로 나타내는 인체 G-CSF가 특히 바람직하게 사용된다.

(1) 다음의 이화학적성질을 갖는 인체 G-CSF

① 분자량 : 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기영동법에 의해 측정했을 때 약 19,000±1,000.

② 등전점 : PI-5.5±0.1, PI=5.8±0.1, PI=6.1±0.1의 3개의 등전점중 적어도 하나를 갖는다.

③ 자외부흡수 : 280nm에 극대흡수를 갖고, 250nm에 극소치를 갖는다.

④ N말단으로부터 21잔기째까지의 아미노산 배열이 다음과 같다.

H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-Pro-

Gln-Ser-Phe-Leu-Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-Gln-Val

(2) 하기의 아미노산서열 또는 그 일부로 나타내는 인체 과립구 콜로니 자극 인자 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 이와 당쇄부를 갖는 당단백질을 함유하는 인체 G-CSF.

(단 m은 0 또는 1을 나타내며, n은 0 또는 1을 나타낸다.)

상기 인체 G-CSF는 예를들면, 후술하는 참고예에 나타낸 방법에 의하여 제조할 수가 있다. 즉 상기 (1)의 인체 G-CSF는 참고예 1∼2에 의하여, 또 (2)의 인체 G-CSF는 참고예 4∼11에 나타낸 방법에 의하여 얻을 수가 있다.

그리고 이들 방법의 상세한 제조 조건에 대하여는 본 출원인이 앞서 출원한 일본 특원소 59-153272호, 동 특원소 60-269455호, 동 특원소 60-270838호, 동 특원소 60-270839호의 각 명세서를 참조할 수 있다.

또 기타의 방법으로서 G-CSF 생산 세포와 자기 증식능을 갖는 악성 종양세포를 세포 융합하여 얻어지는 하이브리도마를 유사분열물질의 존재 또는 비존재하에서 배양함으로써 얻을 수도 있다.

이들 방법에서 얻는 인체 G-CSF는 모수 본 발명에 포함된다.

얻어진 인체 G-CSF 함유액은 필요에 따라서 공지의 수단으로 더 정제, 농축한 후 동결 보존하던지 아니면 동결건조, 진공건조증의 수단에 의하여 수분을 제거하여 보존할 수가 있다. 또 소망에 따라서 인체 G-CSF을 적당한 완충액에 용해한 후 밀리포아 필터등으로 무균여과하여 주사제로 만들 수도 있다.

또한 본 발명의 백혈구 감소증 치료제는 사람 또는 동물의 약용에 적합한 의약제제로 만들기 위하여 필요한 제약담체나 부형제, 나아가 안정화제, 흡착방지제를 포함할 수도 있다.

본 발명의 백혈구 감소증 치료제에 포함되는 인체 G-CSF의 투여량, 투여회수는 대상 질환환자의 병상을 배려하여 결정할 수 있는데, 통상 성인 1인당 0.1∼500㎍, 바람직하기는 0.5∼200㎍의 인체 G-CSF를 포함하는 제제를 1주간에 1∼7회 투여할 수가 있다. 그러나 본 발명은 인체 G-CSF의 함유량에 따라서 한정되는 것은 아니다.

다음에 참고예, 실시예를 들어서 본 발명을 설명하는데 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1 :]

CSF 활성의 측정방법.

본 발명에서 사용된 CSF 활성(이하 CSA라 한다)의 측정방법은 다음과 같다.

[CSA의 측정방법]

(a) 인체 골수세포를 사용하는 경우 :

Bradley T. R., Metcalf D. 등의 방법(Aust. J. exp. Biol. med. Sci. 44권 287∼300면, 1966년)에 준하여 단층 연한천 배양법에 의하여 행하였다. 즉 소태아혈청 0.2㎖, 피검검체 0.1㎖, 사람골수 비부착성 세포 부유액 0.1㎖(1~2×10⁵유핵세포), 변형 McCoy′s 5A, 한천을 0.75% 함유하는 변형 McCoy′s 5A 배양액 0.4㎖을 혼합하여 직경 35㎜의 조직배양 플라스틱 디쉬에 넣고 굳힌 다음, 37℃, 5% 탄산가스/95% 공기, 100% 습도의 조건으로 배양을 행하고, 10일 후에 형성된 콜로니수(50개 이상의 세포로써된 집락을 1콜로니로 한다)를 1단위(Unit)로서 CSA를 구했다.

(b) 생쥐 골수세포를 사용하는 경우 :

말혈청 0.4㎖, 피검검체 0.1㎖, C3H/He(암컷) 생쥐의 골수세포 부유액 0.1㎖(0.5∼1×10⁵유핵세포), 한천을 0.75% 포함하는 변형 McCoy′s 5A 배양액 0.4㎖을 혼합하여 직경 35㎜의 조직배양 플라스틱 디쉬에 넣고 굳힌 다음, 37℃, 5% 탄산가스/95% 공기, 100% 습도조건하에서 5일간 배양하고, 형성된 콜로니수(50개 이상의 세포로써된 집락을 1콜로니로 한다)를 세어 1개의 콜로니를 형성하는 활성을 1단위(Unit)로서 CSA를 구하였다.

그리고 상기 (a), (b)의 방법에서 사용한 변형 McCoy′s 5A 배양액 및 (a)에서 사용한 인체 골수 비부착성 세포부유액은 다음과 같이하여 만들었다.

「변형 McCoy′s 5A 배양액(2배 농도)」

McCoy′s 5A 배양액(GIBCO 사제) 12g, MEM 아미노산 비타민 배지(일수제약사제) 2.55g, 중탄산나트륨 2.18g, 페니실린 G 칼륨 50,000단위를 2회 증류수 500㎖에 용해한 후, 0.22㎛의 밀리포아 필터로 여과 멸균을 행하였다.

「인체 골수 비부착성 세포부유액」

건강한 보통 사람의 흉골을 천자하여 얻은 골수액을 RPMI 1640 배양액으로 5배 희석하여 Ficol-Paque액(파마시아제)에 중층하고, 400×g, 30분, 25℃로 원심분리하여 계면의 세포층(비중＜1.077)을 회수한다. 이 세포를 세정한 후 20% 소태아혈청을 포함하는 RPMI 1640 배양액으로 5×10⁶Cell/ml의 농도로 조정하고, 25㎠의 조직배양용 플라스틱 플라스크에 넣고, 탄산가스 배양기로 30분간 배양한 후, 상층액의 비부착성 세포를 회수하고, 재차 25㎠ 플라스틱 플라스크에 넣고, 2시간 30분간 배양한 후, 상층액의 비부착성 세포를 수집하여 사용하였다.

[참고예 2 :]

인체 G-CSF의 단리.

①「CHU-2」의 수립

잘 알려진 호중구의 증대가 나타난 구강저암환자의 종양을 nu/nu 생쥐에 이식하였다. 이 종양은 이식후 약 10일후에 잘 알려진 종양의 증대와 호중구의 증대가 나타났다. 이 종양을 이식 12일 후에 무균적으로 적출하고, 1∼2mm³각으로 세절하여 이를 다음과 같이 배양하였다.

상기 세절한 종양과 10∼15편을 50㎖ 플라스틱 원심관에 넣고, 5㎖의 트립신용액(트립신 0.25%, EDTA 0.02% 함유)을 가하고, 37℃의 온도중에서 10분간 진탕한 후 상층액을 버리고 재차 동 트립신 용액 5㎖을 가하고, 37℃에서 15분간 교반하면서 트립신소화를 행하였다. 상층액의 세포부유액을 회수하고, 소태아혈청을 1㎖ 가하여 트립신의 작용을 멈춘다음 얼음속에 보존하였다.

이상의 조작을 재차 행하여 세포부유액을 회수하고, 전회분과 합하여 1500r.p .m., 10분간의 원심에 의하여 세포펠렛을 얻었다. 이 세포펠렛을 소태아혈청을 10% 함유하는 F-10으로 2회 세정한 후 25㎠의 플라스틱 배양 플라스크에 세포농도 5×10⁶개/플라스크로 되도록 하여 심었다. 소태아혈청을 10% 함유하는 F-10 배양약을 사용하고, 탄산가스 배양기(탄산가스 농도 5%, 습도 100%)속에서 밤새 배양한 후, 상층액을 비부착세포와 함께 제거하고 새로운 배양액을 가하여 배양을 계속하였다. 배양개시후 6일째에 세포가 가득히 증식하였으므로 이시점에서 배양액을 새로운 것으로 바꾸었다. 다음날, 이 배양액을 버리고 RPMI 1640으로 5배 희석한 항생쥐 적혈구항체(Ca ppel 사제) 2㎖와 함께 RPMI 1640으로 2.5배 희석한 모르모트보체(극동제약사제) 2㎖을 가하고, 37℃에서 20분간 배양하였다.

배양 종료후 소태아혈청을 10% 함유하는 F-10 으로 2회 세정하여 nu/nu 생쥐 유래의 섬유 아세포를 제거하고 계속하여 소태아혈처을 10%함유하는 F-10배양액을 가하고 다시 2일간 배양을 행한 후 세포의 일부를 취출하여 한계희석법에 의하여 콜로닝을 행하였다.

얻어진 11개의 클로닝에 대하여 CSF 활성을 조사한 결고, 다른것 보다도 약10배 높은 활성을 나타내는 클론(CHU-2)이 얻어졌음을 알수 있었다.

② 인체 G-CSF의 단리

상기와 같이하여 수립된 세포가 완전히 기밀하게 증식한 150cm2의 배양 플라스크 2본으로부터 세포를 회수하고 이를 소태야혈청을 10% 함유하는 F-10 배양액 500㎖에 부유한 후 1580㎠의 유리로된 로울러병(Belco 사제)에 옮기고 0.5r.p.m의 속도로 회전배양을 행하였다.

세포가 로울러병의 내벽에 완전히 기밀하게 증식한 시점에서 배양액을 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640으로 교환하고 4일간 배양한 후 배양상층액을 회수하고, 소태아혈청을 10% 함유하는 F-10을 가하고 배양을 속행한다. 3일간 배양한 후 다시 혈청을 함유하지 않은 RPMI 1640으로 액을 바꾸고 4일후에 배양 상층액을 회수하였다.

이하 같은 조작을 반복함으로써 매주 1병으로부터 500㎖씩의 혈청을 함유하지 않은 배양 상층액을 얻고, 뿐만 아니라 이 방법에 의하여 상당히 장기간에 걸쳐서 세포를 유지하여 배양 상층액을 회수할 수가 있었다.

얻어진 배양 상층액 5ℓ를 1배치로 하여 이에 0.01% 트윈 20을 첨가한 후 Hollow Fiber DC-4 및 Amicon Pm-10(아미콘사제)을 사용한 한외여과법에 의하여 약 1000배로 농축한 후 이를 다음의 순서로 정제하였다.

(ⅰ)직경 4.6㎝, 길이 90㎝의 Ultrogel AcA 54 칼럼(LKB 사제)을 사용하고 0.15M NaCl 및 0.01% 트윈 20(반정화학사제)을 함유하는 0.01M 트리스염산 완충액 (pH 7.4)을 사용하여 상기의 농축 배양 상층액 5㎖를 유속 약 50㎖/시간으로 겔여과 하였다. 그리고 칼럼은 미리 소혈청 알부민(분자량 67,000), 난알부민(분자량 45,000(, 시토크롬 (분자량 12,400)를 이용하여 켈리브레이션을 행하였다. 겔여과 종료후 각 분획으로부터 0.1㎖씩을 채취하여 10배로 희한 후 전술한 「CSA의 측벙방법(b)」에 의하여 활성을 나타낸 분획을 조사하였다. 이 결과 먼저 Ve=400∼700㎖의 분획이 대식세포 우위의 CSA를 나타내고, Ve=800∼1200㎖의 분획이 과립구 우위의 CSA를 나타내는 것이 확인되었으므로, 후자의 분획을 수집하여 PM-10(아미콘사제)을 사용하는 한외여과기에 의하여 약 5㎖로 농축하였다.

(ⅱ)상기 농축 분획에 n-프로판올(도오꼬오가세이사제, 아미노산 서열결정용)을 30% 함유하는 0.1% 트리플루오로초산수용액을 첨가하고 얼음속에 15분정도 방치한 후 1500r.p.m., 10분의 원심에 의하여 침전을 제거하였다. 이어서 앞서의 n-프로판올 및 트리플루오로초산을 함유하는 수용액으로 평형화한 μBondapak C 18 칼럼 (Waters 사제, 세미분취용, 8㎜×30㎝)에 흡착시킨 후 30∼60%의 직선 농도 구배의 n-프로판올을 함유하는 0.1% 트리플루오로초산수용액으로 순차 용출하였다. 고속액체 크로마토장치로는 히다찌 685-50형을, 검출은 히다찌 638-41형 검출기(모두 히다찌 제작소제)를 사용하여 220nm와 280nm의 흡수를 동시에 측정하였다. 용출후, 각 분획으로 10㎕을 분취 100배 희석한 후, 전술의 「CSA의 측정법(b)」에 의하여 활성을 나타내는 분획을 조사하였다.

이 결과 n-프로판올 40%에 의해 용출되는 피크에 활성이 나타났으므로, 이 피크를 수집하여 재차 같은 조건으로 재 크로마토그래피하여 상기와 같은 방법으로 CSA을 조사한 결과, 역시 n-프로판올 40%의 위치의 피크에 활성이 나타났으므로 이 피크를 수집하여(4분획-4㎖)동결건조하였다.

(ⅲ)상기 동결건조 분말을 n-프로판올을 40% 함유하는 0.1% 트리플루오로초산수용액 200㎕에 용해하고 TSK-G3000SW 칼럼(동양조달사제, 7.5㎜×60㎝)을 사용한 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 걸었다. 용출은 동 수용액에 의하여 0.4㎖씩 분취하였다. 분취한 각 분획에 대하여 CSA를 전기와 같이하여 조사한 결과, 유지시간이 37∼38분의 분획(분자량 약 20,000에 상당)에 활성이 나타났으므로 이 분획을 회수하고 또한 분석용 μ Bondapak C 18 칼럼(46㎜×30㎝)에 의한 정제를 실시한 후, 주 피크를 회수하고 동결 건조하였다. 얻어진 표품에 대하여 전술위「CSA의 측정방법(a)」에 의하여 검정한 결과, 인체 G-CSF 활성을 갖는 것을 확인 하였다.

[참고예 3 :]

이화학적성질의 확인

상기와 같이하여 얻어진 인체 G-CSF의 이화학적성질을 다음의 방법에 의하여 확인하였다.

(i)분자량

도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)에 의하여 행하였다.

전기 영동장치는 PROTEANTM 16㎝(바이오래드사제), 겔은 T-15%, C=2,6%의 폴리아크릴아미드 슬랩 겔(140㎜×160㎜×1.5㎜) 및 농축 겔(T=3%, C =20%)을 사용하였다. 시료는 미리 0.64M2-메르캅트에탄올에 도데실황산나트륨을 농도가 2%로 되도록 가한 용액중에서 3분간 끓여서 변성시킨 것을 4㎍ 사용하였다.

30mA 정전류로 4시간 전기영동한 후, 겔을 취출하고 이어서 0.25% 콤마시브릴리안트블루 R250(시그마사제)에 의한 염색에 의하여 밴드를 검출하였다.

분자량 표식자로서는 포스포릴라제 B(Phosphorylase B ; 분자량 92,500), 소혈청 알부민(BAS, 67,000), 난알부민(OVA, 45,000), 카르보닉안히드라제 (Carboni c Anhydrase, 31,000), 콩 트립신 억제제(Soyean Tryphsin Inhibitor, 21,500), 리소자임(Lysozyme, 14,000)을 같이 처리하여 사용하였다. 이 결과 분자량 19,000의 단일밴드가 나타났다.

이들 결과로부터 본 발명의 인체 G-CSF의 분자량은 19,000±1,000이라고 생각된다.

(ⅱ)등전점

플럿벳형 등전점 전기영동장치 -3000(파마시아사제)을 사용하였다.

pH 4∼6.5의 Pharmalute(파마시아사제)을 함유하는 폴리아크릴아미드겔 (T=5%, C=3%, 115㎜×230㎜)을 이용하여 30W 정전력(최대전압 2000V)로 2시간 동안 영동으르 행한 후, 30% 메탄올/10% 트리클로로초산/35% 설포살리실산에 의하여 고정하고 이어서 쿰마시브릴리안트블루 R-250 염색을 행하였다.

등전점 표식자로서 Low pI Kit pH 2.5∼6.5(파마시아사제)을 사용하였다.

pH 4∼6.5의 사이에서 분리를 검토한 결과 pI=5.52, 5.80, 6.13의 3본의 밴드가 나타났다.

이중 pI=5.52 및 5.80의 2본의 밴드가 주된 성분이었다. 별도와 같이하여 당해 CSF의 등전점을 5회 측정한 결과 그 값은 그 pI=5.5±0.1, 5.8±0.1, 6.1±0.1이었다.

(ⅲ)자외부흡수

시료를 n-프로판올을 40% 함유하는 0.1% 트리플루오로초산을 레퍼렌스 (feference)로 하고, 분광 광도계를 사용하여 자외부흡수를 조조한 결과, 280nm에 극대흡수, 250nm에 극소치를 나타냈다.

(ⅳ)아미노산 서열의 결정

① N 말단 아미노산 서열의 결정

시료를 기상식 시퀀서(Applied Biosystems 사제)를 사용하여 에드만(Edma n) 분해하고, 얻어진 PTH 아미노산을 고속 액체 크로마토그래피장치(백만·인스톨먼트사제) 및 Ultrasphere-ODS 칼럼(백만·인스톨먼트사제)을 사용하고, 상법에 의하여 분석하였다. 칼럼(5㎛, 직경 4.6㎜, 길이 250㎜)을 개시완충액(15mM 초산나트륨 완충액 pH 4.5, 40% 아세토니트릴을 함유하는 수용액)으로써 평평화한 후, 검체(20㎕의 개시완충액으로 용해)를 주입하여 개시완충액에 의한 이소크러틱용출에 의하여 분리를 행하였다.

유속은 1.4㎖/분, 칼럼 온도는 40℃ 유지하였다. PTH 아미노산의 검출은 269nm와 320nm의 자외부흡수를 이용하였다. 미리 표준 PTH 아미노산(시그마사제) 각 2n mol을 동일한계로 분리하여 유지시간을 결정하고, 피검검체의 유지시간으로부터 행하였다.

이결과, N말단으로부터 40잔기째까지의 아미노산 서열은 다음과 같이 결정된다.

H2N-Thr-Pro-Leu-Gly-

Pro-Ala-Ser-Ser-Leu-

Pro-GIn-Ser-Phe-Len-

Leu-Lys-Cys-Leu-Glu-

Gln-Val-Arg-Lys-Ile-

Gln-Gly-Asp-Gly-Ala-

Ala-Leu-Gln-Glu-Lys-

Leu-Cys-Ala-Thr-Tyr-

Lys-

② 브로모시안 분해

시료를 70% 개미산에 용해하고, 승화정제한 브로모시안 200당량을 가하고, 37℃에서 밤새 반응시켰다. 다음에 반응물을 동결 건조후 TSK G3000SW 클럼(동양조달사제)을 사용한 HPLC로 분획하여 4개의 피크를 얻었다. 피크를 분자량이 큰 순으로 CN-1, CN-2, CN-3, CN-4로 명명하고, 수율이 좋은 CN-1, CN-2에 대하여 아미노산 서열을 자동 기상식 시퀀서(Applied Biosystems 사제)를 사용하여 ①과 같은 조건으로 분석하였다.

그결과 CN-1은 G-CSF 단백의 N말단으로부터의 펩티드임을 확인하였다. 또한 CN-2는 다음의 아미노산 서열을 갖고 있었다.

Pro-Ala-Pha-Ala-Ser-

Ala-Phe-Gln-Arg-Arg-

Ala-Gly-Gly-Val-Len-

Val-Ala-Ser-His-Leu-

Gln-

③ 트립신 분해

시료를 8M 요소를 함유하는 0.1M 트리스 염산 완충액(pH 7.4)에 용해하고, 0.1% 2-메르캅트에탄올을 함유하는 0.1M 트리스 염산 완충액(pH 7.4)을 가하고 최종적으로 2의 요소로 되도록 조정하였다.

이어서 시료와효소가 50:1로 되도록 TPCK 처리 트립신(시그마사제 상품명)을 가하고, 25℃에서 16시간 동안 반응시켰다.

반응후 반응물을 C8 칼럼(야마무라화학사제)을 사용하고 고속 역상 칼럼 크로마토그래피하였다. 용출은 0.1% TFA을 함유하는 n-프로판올을 사용하여, n-프로판올 농도가 5%∼60%에서 직선이 되도록 하여 행하였다. 280㎚의 자외부흡수를 측정하여 얻어진 피크중 피크에 대하여 ①과 같은 조건하에 자동 기상식시퀀서(Applide Biosystems 사제)를 사용하여 아미노산서열을 분석하였다. 그 결과 주 피크는 ②의 CN-2 단편의 1부를 함유하는 다음의 서열을 갖는 펩티드임이 확인되었다.

Gln-Len-Asp-Val-Ala-

Asp-Phe-Ala-Thr-Thr-

Ile-Trp-Gln-Gln-Met-

Glu-Glu-Len-Gly-Met-

Ala-Pro-Ala-Leu-Gln-

Pro-Thr-Gln-Gly-Ala-

Met-Pro-Ala-Phe-Ala-

Ser-

(V)단백질부분으 아미노산조성

시료를 상법에 의하여 가수분해하고, 그 단백부분의 아미노산 조성을 히다찌 835 아미노산 자동분석장치(히다찌제작소제)를 사용하여 특종 아미노산 분석법에 의하여 분석하였다. 이 결과를 표 1에 나타내었다.

그리고 가수분해 조건은 다음과 같다.

① 6NHCl, 110℃, 24시간 진공중

② 4N 메탄설폰산+0.2% 3-(2-아미노에틸)인돌, 110℃, 24시간, 48시간, 72시간, 진공중

시료는 40% n-프로판올과 0.1% 트리플루오로 초산을 함유하는 용액(1.5㎖)에 용해한 후 각각 0.1㎖을 취하여 건조 질소가스에 의하여 건조시킨 후, ①또는 ②의 시약을 가하고 진공봉관하여 가수분해 하였다.

표중 실측치는 ①의 24시간치와 ②의 24, 49, 72시간치의 합계 4회의 평균치아다. 단 Thr, Ser, 1/2 Cys, Met, Val, Ile 및 Trp는 다음의 방법에 의하여 산출하였다[생화학실험 강좌, 단백질화학 II(동 경화학동인출판)을 참조].

·Thr, Ser, 1/2Cys, Met는 ②의 24, 48, 72시간치의 경시변화를 취하고 영시간에 보외하였다.

·Val, Ile은 ②의 72시간치.

·Trp는 ②의 24, 48, 72시간치의 평균치.

표중의 아미노산 잔기수는 Leu을 33개로 가정하여 산출한 예측치이다. 일반식으로 상기와 같은 보정이 필요한 아미노산은 가수분해시에 일부 또는 상당한 부분이 파괴되든지, 아니면 가수분해를 받기 어려운 것이며, 또한 Pro은 발색율이 낮은 등으로 인하여 이들 아미노산의 실측치(n mol), 즉 이로부터 산출되는 잔기수는 실제보다도 낮은 값을 나타내는 경향이 있다(예, 전술의 생화학실험강좌 참조).

[표 1]

산출분자량(166 잔기로서 당은 산출하고 있지 않다) 17961

[참고예 4 :]

탐침의 제조.

참고예 2의 (iv)에 의하여 결정한 아미노산 서열중에서 도면 1에 나타낸 서열에 대응하는 3종류의 누클레오티드탐침(A), 탐침(LC) 및 탐침(IWQ)을 합성하였다. 탐침(A)는 연속한 14개의 누클레오티드로 이루어진 혼합형 탐침이다.

탐침(IWQ)는 인체 콜리시스토키닌 유전자의 클론화에서 사용된 것과 같은 [Takahashi등 ; Proc. natl. Acad. Sci., USA, 82권 1931면 (1985)] 디옥시이노신을 사용한 30개의 연속한 누클레오티드이다.

탐침(LC)는 참고예 3(iv)-①에 나타낸 아미노산 서열의 N 말단으로부터 32∼39번에 상당한 부분을, 도면에 2에 나타낸 염기서열을 기초로하여 합성한 24개의 누클레오티드로써된 탐침이다.

누클레오티드의 화학합성은 개량형 포스포트리에스테르법을 고상법에 적용하여 행할 수 있으며, Narang의 총설에 기술되어 있다(Tetrahedron 39권 3∼22면 (198 3)].

사용하는 탐침은 본 발명에서 사용한 탐침 이외의 위치의 아미노산서열에 의한 것이어도 무방하다.

[참고예 5 :]

cDNA 도서관의 구축.

CHU-2 세포에 구아니딘티오시아네이트 용액을 가하고 균등질화하고 CsCl 밀도구배원심법에 의하여 전 RNA을 얻었다.

이전 RNA로부터 올리고(dT) 셀룰로스 칼럼에 의하여 폴리(A+)RNA을 선별한 후, 역전사효소에 의하여 1본쇄 cDNA을 합성하고, RBaseH 및 이. 콜리 DNA 폴리머라제 I을 가하여 2본쇄 cDNA을 얻었다.

얻어진 2본쇄 cDNA에 dC쇄를 부가하고, pst I 절단부위에 dG쇄를 부가한 pBR322 벡터와 연결하여서, 대장균 X1776주를 형질전환시켜 pBR322계 cDNA 도서관을 구축하였다.

동일하게 EcoR I 링커를 사용하여 2본쇄 cDNA을 λgt10 벡터와 연결하고, λ파아지계 cDNA 도서관을 구축하였다.

[참고예 6 :]

선별.

다음의 방법에 의하여 cDNA(+VSE) 및 cDNA(-VSE)의 2계열의 cDNA를 얻었다.

pBR322계 cDNA 도서관 유래의 제조합체를 화트만 541 여지에 고정하고, 32P로 방사표지한 탐침(IWQ)을 사용하여 콜로니 혼성을 행한 결과, 1개의 코론이 선별되었다. 이 클론을 서던 블롯팅법(Southern ; J. Mol. Biol. 98권 503면 (1975)을 사용하여 다시 상세히 검토한 결과, 탐침(A)와도 혼성화 하였다.

이 콜론의 염기서열을 디데옥시법(Sanger ; Science 214권 1205면 (1981))에 의하여 결정하였다.

얻어진 cDNA 삽입물은 탐침(IWQ) 및 탐침(A)을 함유한 308 염기쌍으로 되고, 참고예 3(iv)-③에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 83개의 아미노산을 코오딩하는 오픈리딩프레임을 갖고 있음을 확인하였다.

이 308 염기대를 함유한 pBR322 유래의 플라스미드를 이하 pHCS-1이라 한다.

pHCS-1로부터 얻어지는 308 염기쌍을 함유한 DNA 단편을 니크트랜스레이션법(전기 Molecular Cloning을 참조)에 의하여 방사표지하고, 이를 탐침으로 하여 λgt10 유래의 cDNA 도서관을 플라크 혼성화(Benton과 Davis ; Science 196권 180면(1977))에 의하여 선별하여 5개의 클론을 얻어 cDNA를 함유한다고 생각되는 클론에 대하여 그 염기서열을 전술과 같은 방법에 의하여 결정하였다(도면 2).

도면 2에 나타낸 바와같이, 이 cDNA 삽입물은 하나의 큰 오픈리딩 프레임을 갖는다.

이 cDNA에 의하여 코오딩되는 아미노산 서열을 도면 2에 나타낸 바와같이 연역할 수 있다. 이 계열의 cDNA을 cDNA(+VSE)라 한다.

참고예 3(iv)-①에 나타나 있는 G-CSF 단백의 N 말단 아미노산 서열과의 비교에 의하여, 본 cDNA가 5′-말단으로부터 32∼34 누클레오티드위의 ATG 서열로부터 시작하여 119∼121 위의 GCC 서열에서 끝나는 90 염기쌍에 의하여 코오딩되는 시그널펩티드 및 122∼124 위의 ACC 서열로부터 시작하여 650∼652 위의 CCC 서열에서 끝나는 531 염기쌍에 의하여 코오딩되는 성숙 G-CSF 폴리펩티드에 상당한 염기 서열을 함유하고 있음을 확인하였다. 전기 시그널펩티드 및 성숙 G-CSF 폴리펩티드로써된 전구체 폴리펩티드는 207개의 아미노산으로 이루어져 있으며 그 분자량은 22292.67달톤으로 계산되었다. 성숙 G-CSF 폴리펩티드는 177개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 그 분자량은 18986.74달톤이었다.

단 단백질의 개시부위에 관하여는 32∼34 위 또는 68∼70 위의 ATG도 같이 생각할 수 있다. EcoR I 절단부위에 이 cDNA(+VSE)를 삽입한, pBR322을 유지하는 에스케리치아. 콜리(e. coli) X1776R-1 주는 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 기탁되어 있다(FERM BP-954 KFCC-10319).

또 이 cDNA와 pBR322[Soberon등 ; Gene 9권 287면 (1980)]이 EcoR I 부위에서 결합한 플라스미드를 pBRG4라 한다.

이와같이 하여서 얻어진 PBRG4를 제한 효소 EcoR I으로 처리하여 얻어지는 약 1500 염기쌍의 cDNA을 포함한 DNA 단편을 니크트랜스 레이션법(전기의 Molecula r cloning을 참고)에 의하여 방사표지하고, 이를 탑침으로 이용하여 다시 λGT10 유래의 cDNA 도서관을 플라크 혼성화(전기 Benton과 Dacis의 문헌참조)에 의하여 선별하였다. 이때, 동시에 λ 파아지 dna를 고정한 니트로셀룰로스여지를 2매 작성해 놓고, 앞서 설명한 탐침(LC)에 의하여 같은 플라크 혼성화를 행하여 양 탐침에 의하여 양성으로 되는 파아지를 선별하였다. 완전한 길이로 인정되는 콜론을 선별하여 디데옥시법을 사용하여 cDNA 삽입물의 염기 서열을 결정한 결과 도면 3에 나타낸 바와 같았다.

이 cDNA는 하나의 큰 오프리딩 프레임을 갖고, 코오딩되는 아미노산 서열은 도면 3에 나타낸 바와같이 연역할 수 있다. 이 계열의 cDNA을 cDNA(-VSE)라 한다.

참고예 3(iv)-①에 나타낸 G-CSF 단백의 N말단 아미노산 서열과의 비교에 의하여, 본 cDNA가 5′-말단으로부터 31∼33 누클레오티드위의 ATG 서열로부터 시작하여 118∼120 위의 GCC 서열에서 끝나는 90 염기쌍에 의하여 코오딩되는 시그널펩티드 및 121∼123 위의 ACC 서열로부터 시작하여 640∼642의 CCC 서열에서 끝나는 522 염기쌍에 의하여 코오딩되는 성숙 G-CSF 폴리펩티드에 상당한 염기 서열을 함유하고 있음을 확인하였다. 전기 시그널펩티드 및 성숙 G-CSF폴리펩탑침이드로써된 전구체 폴리펩티드는 204개의 아미노산으로 이루어져 있으며 그 분자량은 21977.35달톤으로 계산되었다. 성숙 G-CSF 폴리펩티드는 174개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 그 분자량은 18671.42달톤이었다.

단 단백질의 개시부위에 관하여는 31∼33 위 이외에 58∼60 위 또는 67~69위의ATG도 같이 생각할 수 있다. EcoR I 절단부위에 이 cDNA(-VSE)를 삽입한, pBR327을 유지하는 에스케리치아. 콜리(E. coli) X1776R-2 주는 공업기술원 미생물 공업기술 연구소에 기탁되어 있다(FERM BP-955 KFCC-10320).

또 이 cDNA와 pBR327이 EcoR I 부위에서 결합한 플라스미드를 pBRG2라 한다.

[참고예 7 :]

대장균용 재조합 벡터의 구추.

(A)+VSE계 재조합 백터.

이와같이 하여 얻어진 pBRG4 플라스미드로부터 G-CSF 폴리펩티드의 cDNA 단편을 제조한효소에 의하여 절취하고 이와

① tac 프로모터를 함유하는 pKK223-3(파마시아사제)로부터 제조한 단편과 아닐링한 합성 링커를 연결하여 재조합 벡터를 구측하던지,

② PL 프로모터를 함유하는 pPL-람다(파마시아사제)로부터 제조한 3종의 단편과 아닐링한 합성 링커를 연결하고 재조정하여 재조합 벡터를 구축하던지 또는

③ trp 프로모터 함유 pOYI 플라스미드로부터 제조한 단편과 아닐링한 합성 링커를 연결하여 재조합 벡터를 구축한다.

(B) -VSE계 재조합 벡터.

pBRV2 플라스미드를 사용하여 동일하게 3종의 재조합 벡터를 구축한다.

[참고예 8 :]

대장균을 숙주로 하는 형질전환체의 제조와 배양, 발견.

다음에 상기 +VSE계 및 -VSE계에 대한 각각 3종의 재조합 벡터를 사용하여 전기의 Molecular Cloning에 기재되어 있는 염화칼슘법 또는 염화루비듐법에 의하여, 각가 이. 콜리 DH 1주, 이.콜리 N 4830주 또는 이. 콜리 JM 105주를 형질전환 시켰다.

얻어진 형질전환주를 암피실린 함유 루리아(Luria) 배지에서 먼저 배양하고 이어서 필요에 따라 적의 유도하고, 배양을 행하여 형질 발현시켰다.

[참고예 9 :]

대장균으로부터의 G-CSF 폴리펩티드의 회수정제 및 아미노산 분석.

형질전환주의 배양액을 원심하여 집균한 후, 리소자임 처리하고 동결-용해를 반복하여 용균시켜서 상등액을 얻던지 염산구아니딘 처리후 원심에 의하여 상등액을 얻었다.

이를 Ultrogel ACA54 칼럼(LKB 사제)에 의하여 겔 여과하고 할성분획을 한외여과기로 농축하였다.

다음에 n-프로판올을 함유한 트리플루오로초산 수용액을 첨가하고, 빙중방치, 원심분리하여 역상 C18 칼럼에 흡착, 용출조작을 실시한다. 용출후 각 분획의 활성을 조사하고 활성 피크를 수집하여 재차 같은 정제조작을 행한 후 동결 건조하였다. 이 동결 건조 분말을 용해하고, 고속분자체 크로마토그래피함으로써 취득한 폴리펩티드를 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동함으로써 목적하는 G-CSF 폴리펩티드를 나타내는 단일의 밴드를 확인하였다.

이와같이 하여서 얻어진 폴리펩티드는 안체 G-CSF 활성을 나타냈다. 또한 얻어진 G-CSF 폴리펩티드의 아미노산 조성 분석은, 히다찌 835 아미노산 자동분석장치 (히다찌제작소제)를 사용하고 특수 아미노산 분석법에 의하여 분석하였다. 또 N 말단 아미노산 분석은 기상식시퀀서를 사용하여 에드만 분해하고 고속액체 크로마토그래피 및 Ultrasphere-ODS 칼럼을 사용하여 행하였다.

[참고에 10 :]

동물세포용 재조합 벡터의 구축.

숙주세포로서 C127 세포, NIH3T3 세포를 사용할 경우의 재조합 벡터(BPV 유래) 및 CHO 세포를 사용할 경우의 재조합 벡터-(dhfr 유래)의 구축을 +VSE계, -VSE계에 대하여 각각 행하였다. 여기서는 C127 세포 및 CHO 세포용 재조합 벡터의 구축에 대하여 기재하는데, 상세하게는 일본 특원소 60-269456호, 동 특원소 60-270839호를 참조하면 된다.

(A)+VSE계 재조합 벡터의 구축

상기 참고예 6에서 얻어진 cDNA(+VSE) 단편을 벡터 pdKCR에 도입하여 pHGA410 플라스미드를 만든 후, 이를 EcoR I에 의하여 부분 소화하고, 말단을 블런트 말단(blunt end)으로 한다. 이 DNA에 HindⅢ링커를 부가하고, 이어서 HindⅢ 처리를 하고 T4DNA 리가제로 처리한 후 염화루비듐법(전기 Molecular Clining 참조)을 사용하여 이.콜리 DHI 주를 형질전환 시켰다. 얻어진 플라스미드를 pHGA410(H)라 명명한다(도면 4).

pHGA410(H)을 Sal I로 처리하고 이이허서 말단을 블런트 말단화 한 후 재차 HindⅢ로 처리하여 HindⅢ-sal I 단편을 회수하는 한편, 소유두종 윌스의 형질전환 단편을 갖는 pdBPV-1 플라스미드를 HindⅢ, pvuⅡ로 처리하여 큰쪽의 DNA 단편을 분리하고, 이와 상기의 HindⅢ-sal I 단편을 결합한다. 이를 상요하여 이.콜리 DHI 주를 형질전환하여 pHGV2 유래의 CSF-cDNA를 갖는 플라스미드, pTN-G4를 얻었다(도면 4).

한편, pHGA410 플라스미드나 pHGA410(H) 플라스미드와 pAdD26SVpA 플라스미드를 사용하여 CHO 세포용 재조합 벡터(+VSE)인 pHGG4-dhfr을 구축하였다 (도면 5).

(B)-VSE계 재조합 벡터의 구축

상기 참고예 6에서 얻어진 cDNA(-VSE) 단편을 벡터 pdKCR에 도입하여 pHGV2 플라스미드를 만든 후, 이를 EcoR I으로 부분소화하여 말단을 블런트 말단으로 한다. 이 DNA에 hINDⅢ 링커를 부가하고, 이어서 HindⅢ 처리를 하고 T4DNA 리가제 처리한 후, 염화루비듐법(전기 Molecular Cloning 참조)을 사용하여 이.콜리 DHI 주를 형질전환 시켰다. 얻어진 플라스미드를 pHGV2(H)라 명명한다(도면 6).

pHGV2(H)를 Sal I로 처리하고 이어서 말단을 블런트 말단화한 후 재차 HindⅢ로 처리하고 HindⅢ-Sal I 단편을 회수하는 한편, 소유두종 윌스의 형질전환 단편을 갖는 pdBPV-1 플라스미드를 HindⅢ, pvuⅡ로 처리하여 큰쪽의 DNA 단편을 분리하여 앞서의 HindⅢ-Sal I 단편과 결합한다. 이를 사용하여 이.콜리 DHI 주를 형질전환 시킴으로써 pHGV2 유래의 CSF-cDNA을 갖는 플라스미드, pTN-V2를 얻었다(도면 6).

+VSE에서와 같이 pHGV2 플라스미드나 pHGV2(H) 플라스미드와 pAdD26SVpA 플라스미드를 사용하여 CHO 세포용 재조합 벡터(-VSE)인 pHGV2-dhfr을 구측하였다(도면 7).

[참고예 11 :]

동물세포에 의한 형질발현

여기서는

①생쥐 C127 세포에 의한 +VSE계의 형질전환 및 ② CHO 세포에 의한 -VSE계의 형질발현을 예로하여 설명한다.

①C127 세포에 의한 +VSE계의 형질발현 :

참고예 10(A)에서 얻은 pTN-G4를 C127 세포에 의해 형질전환시키기 전에 제한효소 BamH I로 처리한다. 즉, pTN-G4 플라스미드 20㎍을 10mM Tris-HCl(pH 8.0), 7mM MgCl2, 100mM NaCl, 2mM 2-메르캅토에탄올, 0.01%/BSA 100㎕에 용해시키고, BamH I(다끼라주조사제) 20단위로 처리하고 페놀처리, 에테르처리, 에탄올침전을 행하였다.

생쥐 C127 세포는 10% 소태아혈청(GIBCO)을 함유하는 둘베코 최소 필수 배지중에서 증식시킨다. 경 5㎝의 플레이트에 증식시킨 C127 세포에 플레이트 당 상기 조제 DNA를 10㎍의 비율로 인산-칼슘법[Haynes, J & Weissmann, C(1983), Nucleic Acid Res. 11권 687∼706 참조]에 따라 형질전환 시키고, 글리세롤 처리한 후, 12시간 동안 37℃로 배양하였다.

다음에 이 세포를 3매의 새로운 경 5㎝ 플레이트에 옮기고, 1주간 2회의 비율로 배지 교환 하였다. 16일째에 Foci(집괴)를 형성한 부분을 각각 새로운 플레이트에 옮기고, 상술한 배지에서 계대 배양하여 G-CSF 생산능이 높은 클론을 선별하였다. 그 결과 1㎎/ℓ의 레벨의 G-CSF 생산이 있었다.

②CHO 세포에 의한 -VSE계의 형질발현 :

CHO 세포(dhfr주, 콜롬비어대학 Dr. I. Chasin으로부터 입수)을 9㎝ 경의 플레이트(Nunc 사제)중에서 10% 송아지 혈청을 함유하는 α 최소 필수 배지(α-mMEM, 아데노신, 데옥시아데노신, 티미딘 첨가)로 배양증식하고, 이를 인산-칼슘법(Wigler등, Cell 14권 725면(1978))에 의하여 형질전환 시켰다.

즉 참고예 10(B)에서 제조한 pHGV2-dhfr플라스미드 1㎍에 캐리어 DNA(송아지흉선 DNA)을 적량가 하고, TE 용액 375㎕에 용해하고 1M CaCl2 125㎕을 가한다. 3∼5분 빙상에서 냉각하고 500㎕의 2×HBS(50mM Hepes, 280mM NaCl, 1.5mM 인산완충액)를 가하고 재차 빙냉 후 상기의 CHO 세포 배양액 1㎖와 혼합하고, 프레이트에 옮기고 CO2 배양기속에서 9시간 동안 배양하였다.

그리고 세정하고 20% 글리세롤 함유 TBS(Tris-buffered saline) 첨가하고, 재차 세정한 후 비선택배지(전기 α-MEM 배지, 누클레오시드 첨가)를 첨가하고 2일간 배양하여 선택 배지에서 1 : 10으로 세포를 분할하였다. 이어서 2일마다 선택배지(누클레오시드 무첨가)를 이용하여 배지교환을 행하면서 배양을 속행하여 생긴 집괴를 선별하에 새로운 플레이트에 옮겼다.

새로운 플레이트에서는 0.2μM 메토트랙세이트(MTX) 존재하에서 증식하고 재차 0.1μM MTX 존재하에서 증식시켜서 클로닝을 행하였다.

그리고 CHO 세포의 형질전환은 CHO 세포에 대하여 pHGV2와 PAdD26SVpA을 동시 형질전환(cotransformation)시킴으로써 행할 수가 있다[Scahill등 ; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80권 4654∼4658(1983) 참조].

또 소위 폴리시스트로닉유전자를 사용하는 방법으로는 재조합 벡터를 구축하고 이를 사용하여 CHO 세포를 형질전환 시킬 수가 있다. 예를들면 pAdD26SVpA을 Pst I 처리하고 2개의 단편을 회수하여 이들과 pBRV2 유래의 CSF cDNA 단편을 결합시킴으로써 아데노일 프로모터, CSF cDNA, DHFR, SV40의 폴리 A 부위의 순서로 배열한 재조합 벡터를 구축하고 CHO 세포에 넣음으로써 실시할 수 있다.

[참고예 12 :]

발현물질의 G-CSF 활성의 검정(+VSE 및 -VSE).

전기 참고예에서 얻어진 C127 세포 및 CHO 세포의 상등액을 1N 초산에 의하여 pH 4로 조정하고, 등용량의 n-프로판올을 가한 후, 생긴 침전을 원심제거하고 C8 역상계 담체(야마무라화학사제)로 충전한 오픈 칼럼(1ψ×2㎝)에 통하고, 50% n-프로판올로 용출시켰다. 용출액을 물로 2배로 희석한 후, YMC-C8 칼럼(야마무라화학사제)을 사용한 역상 고속액체 크로마토그래피[0.1% TFA을 함유하는 30∼60%의 직선농도구배의 n-프로판올로 용출]하였다.

n-프로판올 농도가 40% 부근인 위치에서 용출시키는 분획을 분취한 후, 동결 건조하여 0.1M 글리신 환충액(pH 9)에 용해시켰다. 이와같은 과정을 거침으로써 인체 G-CSF는 C127 세포 및 CHO 세포 상등액으로부터 약 20배로 농축하였다.

대조로서 전술의 방법에 따라서 인체 G-CSF cDNA을 함유하지 않는 플라스미드로 세포로 형질전환한 후 2배양 상등액을 농축하였다. 얻어진 표품에 대하여 참고예 1에 기재된 「인체 G-CSA의 측정방법(a)」에 의한 방법으로써 인체 G-CSF 활성을 검정하였다.

그리고 발현효율이 충분히 높은 경우에는 배양 상등액을 직접 검정하여도 무방하다. 여기서는 농축한 예에 대하여 결과를 나태냈다. 그 결과는 표 2와 같았다.

[표 2]

[참고예 13 :]

아미노산 분석 및 당 분석(+VSE 및 -VSE)

1)아미노산 조성의 분석

참고예 12에서 얻은 조 CSF 시료를 다시 참고예 2②-(iii)의 방법에 따라서 정제하고, 참고예 2-②-(V)의 방법에 의하여 분석하였다. 이 결과를 표 3-①(+VSE) 및 표 3-②(-VSE)에 나타냈다. 그리고 가수분해 조건이외에는, 모두 참고예 2-②-(V)와 동일 조건으로 행하였다.

[표 3a]

[표 3b]

2)당조성분석

상기 아미노산 조성분석에서 사용한 정제 CSF시료 200ng에 내부표준으로서 이노시톨 25n mol을 가한후, 1.5N HCl을 함유하는 메탄올 용액(500㎕)을 가하고 질소 가스로 치환한 봉관중에서, 90℃에서 4시간 동안 반응시켰다. 개관 후 탄산은 (Ag₂C O₃)을 가하여 중화한 후, 무수 초산 50㎕을 가하고 진탕 후, 실온의 암소에서 밤새 방치하였다.

상층을 시료 튜브에 넣고, 질소 가스로 건조시켰다. 침전에 메탄올을 가하고 세정 후 가볍게 원심분리하고, 상등액을 같은 시료 튜브에 가하여 건조하였다.

이에 50㎕의 TMS 화시약(피리딘 : 헥사메틸디시라잔 : 트리메틸클로로실란=5 : 1 : 1로 혼합한 것)을 가하고 40℃에서 20분 반응시킨 후, 딥 프리저(Deep Freezer)에 보존하였다. 그리고 표준으로서 갈락토스(Gal), N-아세틸갈락토사민(Gal NAC), 시알산 각 50n mol 및 이노시톨 25n mol을 사용하여 같은 조작을 행하였다.

이 시료에 대하여 다음에 나타낸 조건으로 가스 크로마토분석을 행하였다.

(분석조건)

칼럼 : 2% 0V-17VINport HP 60∼80

메쉬, 3m, 유리

온도 : 110℃∼250℃까지 4℃/분으로 상승

캐리어 가스 : 최초는 1.2∼1.6Kg/㎠

(질소압) 종료시는 2∼2.5Kg/㎠

감도 : 103MΩ 범위 0.1∼0.4V

압력 : 수소가스 0.8Kg/㎠

공기 0.8Kg/㎠

시료량 : 2.5∼3.0㎕

분석의 결과, 본 발명의 CSF로부터 갈락토스, N-아세틸 갈락토사민 및 시알산이 확인되었다.

3)당 함유분석

아미노산 분석에 사용한 CSF 시료를 사용하여 엘손-몰간법에 의한 아미노 당정량, 올시놀황산법에 의한 중성당의 정량 또는 티오발비툴법에 의한 시알산의 정량을 각각 실시하였다. 정량방법은 생화학 실험 강좌 제4권 「당질의 화학(하권)」(도오꼬 화학동인)의 13장에 기재되어 있다. 각 정량치로부터 중량%을 환산한 결과, 숙주세포, 발현벡터 및 배양조건 등의 차이에 따라서, 얻어진 G-CSF의 당 함량은 1∼20 (중량%)의 범위에 분포해 있었다.

[참고예 14 :]

본 발명의 인체 G-CSF에 의한 호중구증가 작용

8주령의 숫컷 C57BL/6N계 생쥐 40마리를 20마리씩 2군으로 나누고, 일방의 군(대조군)에는 최종 농도 10%의 동계 생쥐 혈청을 함유하는 생리 식염수 용액 0.1㎖을, 또 다른 일방의 군(CSF 투여군)에는 최종농도 1%의 n-프로판올, 최종농도 10%의 동계 생쥐 혈청 및 참고예 2에서 얻은 인체 G-CSF 2.5㎍을 함유하는 생리식염수용액 0.1㎖을 채혈하기까지 1일 1회 피하 투여하였다.

투여 개시 후 2, 5, 8, 11, 14일째에 각각의 군으로부터 생쥐를 4마리씩 무작위 추출하여, 안와정맥으로부터 채혈하여 마이크로 셀 카운터 CC180형(동아사제 상품명)으로 백혈구수를 카운트함과 동시에, 혈액의 도말표본을 작성하고, 김사(Giemsa)염색법에 의하여 염색한 후, 현미경하에서 백혈구 200개중의 호중구의 비율을 측정하였다.

각군의 호중구 수는 다음의 계산식에 의하여 산출하였다.

1㎣당의 백혈구수×백혈구중의 호중구의 비율-1㎣중의 호중구수

또 무처리의 동계 생쥐(4마리)에 대하여 같이 처리하고, 0일의 값으로 하였다. 결과를 표 4에 나타낸다. 그리고, 인체 G-CSF을 참고예 13 C127 세포 유래의 +VSE 및 CHO 세포유래의 -VSE에서 사용한 아미노산 분석용 정제시료로 바꾸어, 상기와 같은 시험을 행한 결과, 같은 결과가 얻어짐이 확인되었다.

[표 4]

(평균±표준오차) ** P＜0.01,

*** P＜0.001

[참고예 15 :]

본 발명의 인체 G-CSF에 의한 백혈구 감소저지효과

8주령의 숫컷 ICR계 생쥐 32마리에 사이크로 포스퍼미드(이하 CP라 한다)를 1마리당 200㎎/㎏의 비율로 복강내 투여한 후, 16마리씩 2군으로 나누고, 일방의 군(대조군)에는, 최종 농도 1%의 n-프로판올 및 최종 농도 10%의 동계 생쥐 혈청을 함유하는 생리식염수용액 0.1㎖을, 또 다른 일방의 군(CSF 투여군)에는 최종농도 1%의 n-프로판올, 최종농도 10%의 동계 생쥐 혈청 및 참고예 2에서 얻은 인체 G-CSF 2.5㎍을 함유하는 생리식염수용액 0.1㎖을 각각 다음날부터 1일 1회 피하 투여하였다.

CP 투여 후 2, 4, 5, 7일째에 각각의 군으로부터 4마리씩 생쥐를 무작위 추출하여, 안와정맥으로부터 채혈하여 마이크로 셀 카운터 CC180형(동아사제 상품명)에 의하여 백혈구수를 카운트함과 동시에 혈액의 도말 표본을 작성하고, 감사 염색법에 의하여 염색한 후, 현미경하에서 백혈구 200개중의 호중구의 비율을 측정하였다.

각군의 호중구 수는 다음의 계산식에 의하여 산출하였다.

1㎣당의 백혈구수×백혈구중의 호중구의 비율=1㎣중의 호중구수

또 동시에 염색된 호중구를 형태학적으로 분류하여, 가장 성숙한 호중구인 분엽핵구가 차지하는 비율을 구하였다.

CP 무처리의 동계 생쥐(4마리)에 대하여 동일하게 처리하여, CP 투여전의 값으로 하였다. 결과를 표 5에 나타낸다. 또 참고예 13(C127세포 유래의 +VSE 및 CHO 세포 유래의 -VSE)의 아미노산 분석에 사용한 정제 인체 G-CSF 시료를 사용하여, 상기와 같은 시험을 행하여 본 결과, 본 시험과 같은 결과가 얻었음이 확인되었다.

[표 5]

(평균±표준오차) **P＜0.01 ***P＜0.001

표 4에 나타낸 바와 같이, 정상 동물에 있어서, 대조군에서는 호중구수의 증가가 나타나지 않는데 비하여, CSF 투여군에서는 CSF 투여 개시 후 2일재부터 상당한 호중구이 증가가 나타났으며, 이 호중구의 증가는 CSF를 투여하는한 점증적으로 계속되었다. 또 호중구 감소 상태 모델에 있어서는, 표 5에 나타낸 바와 같이, 대조군에서는 CP 투여 후 5일째까지 호중구 감소의 상태가 계속되는데 비하여, CSF 투여군에서는 CP 투여 후의 7일간의 호중구수는 CP 투여 전의 값과 동등하든지 그 이상의 값을 나타냈다.

또 말초 호중구의 절대수 뿐만 아니라, 그 성숙도에 있어서도 인체 G-CSF 투여에 의하여 개선이 나타났다. 또한 말초 백혈구수에 대하여도 감소의 정도가 완화되었다.

[참고예 16 :]

인체 G-CSF에 의한 백혈구 감소증 모델에 대한 효과

36마리의 C57 BL/6N 생쥐(숫컷 8주령)에 200㎎/㎏의 비율로 사이크로포스퍼미드(CP)를 복강내 투여하였다. 4일 후, 4마리를 무작위 선출하여, 안와정맥으로부터 채혈하여, 말초 백혈구수 및 말초 호중구수가 충분히 감소해 있음을 확인한 후, 남은 생쥐를 2군으로 나누어, 다음날부터 일방의 군(대조군)에는, 최종농도 1%의 n-프로판올 및 최종농도 10%의 동계 생쥐 혈청을 함유하는 생리식염수용액 0.1㎖을, 또 다른 일방의 군(CSF 투여군)에는 최종농도 1%의 n-프로판올, 최종농도 10%의 동계 생쥐 혈청 및 참고예 2에서 얻은 인체 G-CSF 2.5㎍을 함유하는 생리식염수용액 0.1㎖을 각각 다음날부터 1일 1회 피하 투여하였다.

소정의 날에 각군으로부터 4마리 생쥐를 무작위 선출하여, 안와정맥으로부터 채혈하고, 말초 백혈구수 및 말초 호중구수를 구하였다. 이 실험에 있어서, 투여는 모두 오전 9시에, 채혈은 오후 3시에 행하였다. 채혈한 혈액중의 백혈구수의 계측, 백혈구의 분류, 말초 호중구수의 산출은 참고예 15와 동일하게 행하였다.

CP무처리의 동계 생쥐(4마리)에 대하여 동일하게 처리하여, CP 투여 전의 값으로 하였다.

이 실험에 있어서, 생쥐로부터의 채혈은 한번만 하였다.

본 실험 결과를 표-6에 나타낸다, 또 참고예 13(C127 세포 유래의 +VSE 및 CHO 세포 유래의 -VSE)에서 아미노산 분석에 사용한 정제된 인체 G-CSF 시료를 사용하여, 상기와 동일한 시험을 행한 결과, 본 시험과 같은 결과가 얻어졌다.

[표 6]

(평균±표준오차) *** P＜0.001

상기 결과로부터 인체 G-CSF를 투여함으로써 백혈구수 및 호중구수의 감소상태로부터의 회복이 확실하게 속진되었음을 알 수 있다.

그리고 전술한 바와 같이, 이상의 결과는 인체 G-CSF가 그 생산 세포의 배양 상등액으로부터 얻어진 G-CSF인 경우에도 같은 결과가 얻어짐이 확인되어 있다.

이들의 결과로부터 본 발명의 인체 G-CSF는 백혈구 감소증의 치료약으로서 유효함을 알 수 있다.

또 이 실험 조건하에 있어, 독성은 나타나지 않았다.

[실시예 1]

참고예 2의 방법에 의하여 얻어진 인체 G-CSF 함유 분획을 무균 처리한 후 -20℃에서 동결시킨 동결물을 사용하여 주사제를 만들었다.

[실시예 2]

참고예 12에서 얻은 C127 세포 유래의 +VSE계 인체 G-CSF을 다시 참고예 2-②-(iii)의 정제방법에 의하여 정제하고, 이를 무균 조작에 의하여 10㎖ 바이알병에 5㎖ 충정하고, -20℃에서 동결 건조한 후, 고무마개로 막은 동결 건조물으르 사용하여 주사체를 만들었다.

[실시예 3]

참고예 12에서 얻은 CHO 세포 유래의 -VSE계 인체 G-CSF을 다시 참고예 2-②-(iii)의 정제방법에 의하여 정제하고, 이를 무균 조작에 의하여 10㎖ 바이알병에 5㎖ 충정하고, -20℃에서 동결 건조한 후, 고무마개로 막은 동결 건조물으르 사용하여 주사체를 만들었다.

이상과 같이 본 발명은 종전에 입수가 극히 곤란하였던 인체 G-CSF을 대량으로 그리고 고품질로 취득가능하게한 성과를 기초로 하여 이루어진 것으로서, 본 발명의 백혈구 감소증 치료제는 충분히 성숙한 형태를 갖는 호중구의 증가작용,, 및 호중구 감소 저지작용을 갖고, 부작용도 적은 백혈구 감소증 치료제로서 유용한 것이다.

Claims

하기의 이화학적 성질을 갖는 인체 과립구 콜로니 자극 인자를 유효 성분으로 하는 백혈구 감소증 치료제의 제조방법

[이화학적 성질]

①분자량 : 도데실 황산나트륨-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의한 측정으로 19,000±1000의 분자량을 갖는다.

②등전점 : pI=5.5±0.1, pI-5.8±0.1, pI=6.1±0.1의 3개의 등전점중 적어도 하나를 갖는다.

③자외부흡수 : 280㎚에서 극대 흡수를 갖고, 250㎚에서 극소치를 갖는다.
제1항에 있어서, 인체 과립구 콜로니 자극인자 활성을 갖는 폴리펩티드가 다음의 아미노산 서열 또는 그 일부로 나타내지는 백혈구 감소증 치료제의 제조방법 :

(단 m은 0 또는 1이고, n은 0또는 1이다).