JPS5978122A - コロニ−刺激因子の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般的によく知られているヒト顆粒球減少症
の治療用医薬として有用な物質、すなわち、顆粒球系幹
細胞に直接作用して該幹細胞の分化増殖を促進する物質
として知られるコロニー刺激因子（以下、Ｃ３Ｆと略記
する。）を製造する方法に関する。

顆粒球、単球及びマクロファージの造血発生学的機序に
於て、生体内のＣ３Ｆがこれ等の細胞の母細胞である幹
細胞に作用し、その***・増殖と分化を誘導することか
ら、Ｃ８Ｆがとの機序の中で、中心的な役割を担ってい
ることは広く知られていた（　Ｐｌｕｚｎｉｋ、　Ｄ、
　Ｈ，等Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｃｒａｍｐ。

Ｐｈ５ｉｏｌｙ、　　６６　、　３１９　（１９６５）
、Ｂｒａｄｌｅｙ＋Ｔ、　Ｒ，等Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉ
ｏｌ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、、　　４４　＋２８７（１
９６６））。

そしてこのような生物学的活性を有するＣ５Ｆは顆粒球
減少症治療用の医薬としての有用性が期待されていた（
高久史麿　日本臨床　３６巻７号２７０１頁（１９７８
））。

このような生体内のＣ３Ｆは末梢血単球やリンパ球のほ
か、尿、血清、牌、腎、肺、顎下腺、腹膜、胎盤からも
採取されており、精製された七いわれるものも分子量は
１．３００からａｓ、ｏｏｏｔこわたり、種々のＣ３Ｆ
の存在が推定されている。

さらに、Ｃ８Ｆの作用もマクロファージ系に作用するも
の、好中球に作用するもの、両者ｅこ作用するものなど
順粒球産生糸においても多様である事、又各細胞及び臓
器等から得られるＣ５Ｆ量は微量で、大量に製造する事
が困難であり、あるいはまた医薬診断薬に供し得る品質
を備えたＣ３Ｆを製造する事は困難であった。

これ等Ｃ５Ｆの造血系に及ぼす効果の他に、本発明者等
は、最近Ｔリンパ球由来のＣ５Ｆが免疫賦活作用の引金
ｔこなる事を初めて発見した。

即ち、抗腫瘍性免疫賦活剤の免疫作用機作を研究してい
く中で、このような免疫活性物質１こより刺激されたＴ
リッツ球はＣ３Ｆを産生じ、このＣＳＦがマクロファー
ジに作用し、リンパ球活性化因子産生増強をひき起す事
、このリンパ球活性化因子が腫瘍ニ対するエフェクター
前駆細胞を成熟化させ、エフェクター細胞として腫瘍を
攻撃し、癌を退縮せしめるという一連の機構を明らかに
した（秋田等、蛋白質・核酸・酵素　２６巻３号、２０
８頁（１９８１））。

このような免疫活性を有するＣ５Ｆは顆粒球減少症治療
用医薬としての有用性のみならず、制癌物質としての効
果も期待される（　Ｅ、　Ｊ、　Ｗｉｎｇ　ｅｔａｌ＋
Ｊ、ｃｌｉｎ、Ｉｎｖｅｓｔ、、　　６９＋　　２７０
（１９８２））。

また、例えば骨髄性白血病患者の骨髄細胞中のＣ３Ｆ反
応細胞数を計測する事により、予後の診断を可能ならこ
とがらＣ５Ｆは診断薬としての応用も考えられる。

従前、リンパ球由来Ｃ３ＦＣついてはヒト末梢血由来リ
ンパ球をレクチンであるＰＨＡ、ＰＷＭで刺激培養しそ
の培養土清音こＣ５Ｆ活性が検出される事は刈られてい
る（　Ｍ、　Ｊ、　Ｃ１１ｎｅ　ｅｔ　ａｔ、。

Ｎａｔｕｒｅ、　　４　Ｂ　＋　　７０３　（１９７４
）　）。　しかし七〇〇ＳＦ産生量は多くの他のリンホ
カインと同様極微量である。そこで、本発明者は、新た
にＣ３Ｆを大ｉｔこ産生させる方法としてＴ細胞として
細胞培養法で増殖可能なヒトＴリンパ球由来細細胞株で
あるＴリンパ腫細胞、Ｔ白血病細胞、Ｔ細胞融合株、あ
るいはヒト末梢血由来１９７２球のＣ３Ｆ産生能を検討
した所、レクチン刺激１こより細胞数に応じて産生増強
が認められる事を見出した。因みＶここれらのレクチン
はＣ３Ｆｉ生に要求される濃度領域ではＣ３Ｆ含有培地
に可溶性である。

しかしながらこれ等のレクチンは生体に対しては種々の
副作用を有し、Ｃ３Ｆを特１こ医薬品としての用途Ｆこ
用いる場合には培養上清中のＣ５Ｆを精製する工程で、
これらのレクチンを充分に分１１Ｇ、除去する操作が必
須となるが、有効な分離除去方法がきわめて項雑であり
、実用性に欠ける。又、他の用途、例えば診断薬または
研究用試薬として用いる場合に、筒便にはＣ５Ｆを含有
する培養上清もしくはその濃縮物を直接に利用する場合
があるが、Ｃ５Ｆ含有液にレクチンが混在する場合ｔこ
け、これ等の目的に適切に利用する事が困難な場合があ
る。またヒト末梢血リンパ球ｒこ対する刺激剤としてレ
クチンを使用する場合に培地中ｔこ産生　５− される物質は単にＣ３Ｆにとどまらず、例えばインター
フェロン、マクロファージ活性化因子、インターロイキ
ン２など多種多様のいわゆるリンホカインの混合物であ
り、Ｃ５Ｆ精製の原料として使用するには以後の精製過
程が繁雑になる。

これ等の問題を解決するためｔこ、本発明者は、マイト
ーゲン活性を有さす、従って、副生する他のリンホカイ
ンが少なく、繁雑なレクチン除去、分離操作な経ずとも
通常の蛋白精製法である塩析、限外濾過法等１こより容
易に培養上清より除去し得、かつ末梢リンパ球同様大量
生産ｔこ適したヒトＴリンパ球由来細胞株よりＣ３Ｆを
産生じ得る刺激剤を見出すべく鋭意検討し、上記目的に
かなう物質として抗腫瘍活性などの免疫賦活作用を有す
る細菌菌体成分およびβ（１→３）グリコシド結合を有
する多糖体を見い出すことｔこより本発明を完成し得た
。

即ち、本発明は、従来知られているレクチンとは異なる
免疫活性抗腫瘍剤などの免疫賦活作用を有する多糖体ま
たは細菌菌体成分を新しい刺激剤　６− としてヒトＴリッツ球由来細胞を刺激培養し他のリンホ
カイン類の混入の少ないより選択的なＣ３Ｆ産生方法お
よび必要により培養液より刺激剤を含有しないＣ３Ｆを
効率的に回収する事の可能なヒ）Ｃ５Ｆの製造方法に関
する。

次に本発明の方法の詳細について説明する。

本発明の目的物であるヒ）Ｃ３Ｆを製造するのに用いる
ヒ）Ｃ３Ｆ産生細胞としては、本分野に於てよく知られ
た方法で得られる正常ヒト末梢血子細胞の正常Ｔ細胞や
、Ｃ５Ｆ産生能を有するヒト悪性化細胞ジュルカット等
のヒトＴリンパ腫またはヒ）Ｔ白血病細胞、そのクロー
ン化（亜株化）細胞、およびそれらと胸腺腫細胞との融
合細胞の如きＴ細胞由来の融合細胞株などが含まれる。

因みｔこ上記融合細胞株は例えば通常知られている方法
で得られる。すなわち正常ヒト末梢血より分離したリン
パ球をＰＨＡや結核菌体精製蛋白（ＰＰＤ）で活性化し
、これをヒポキサンチン舎ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ＨＰＲＴＥ、Ｃ，２・４・２・８）の欠損した
胸腺腫細胞とポリエチレングリコールの存在下で融合さ
せる。

融合後ｔこヒポキサンチン・７ミノブテリン・チミジン
（ＨＡＴ）選択培地中に生育した融合細胞株が現われ、
更にヒボキサンチン・チミジン（ＨＴ）培地中で培養す
る。このようにして得られる融合細胞株を例えばＩ　Ｘ
　１　Ｇ’個／ｄの濃度ｔこ調整し、２４穴の組織培養
プレートに本発明の刺激剤の存在下で１２０時間培養し
、培養上清を採取し、本培養上清中のＣ３Ｆ産生能は次
に述べる方法？こより検定し、Ｃ８Ｆ産生能を有するヒ
）Ｔ細胞融合細胞株を得る。このように、このような融
合細胞株の作成方法は公知であり、これら細胞株は公知
の方法１こより容易に作成することが出来る。

Ｃ５Ｆ活性を検定するには、例えば次のように行なう。

すなわち、ａ、ｓｍｍプラスチック培養皿（ファルフン
製３００１）の中に、Ｉ　Ｘ　１０’個−＝ｒウス骨髄
ｆｌｌ胞液０．２　ｍｔ、　２．２　％メチルセルロー
ス（信越化学部）０．４ｍ／ｌこ馬血清（フローラボラ
トリー製）０．２＊／およびＣ３Ｆ試料０．２＊／の計
１ｍｌをとり、７日間、５％ＣＯ，ガス通気下３７ｒ加
湿培養器中で培養し、培養後、倒立顕微鏡下で２０個以
上の細胞集塊を１コロニーとして、コロニー数を測定、
そのコロニー数をもってＣ３Ｆ活性を表わすことＶこよ
り、Ｃ８Ｆ産生を検定する。

融合細胞株クローンまたはＴリンパ腫細胞、Ｔ白血病細
胞等のヒト悪性化子細胞の培養は次のようにして行える
。即ち、例えば融合細胞株り一一ンまたはヒト悪性化細
胞を初濃度１ｘ　ｌｏ’　／ｙｔｌとなる様に組織培養
培地に懸濁し、ファルコンフラスコ３０２４当り２．５
４ずつ分注し３７ＣＣて５％ＣＯ１インキュベーター中
で４〜６日間靜置装養する。又これ等の細胞はローラー
ボトルによる回転培養あるいは攪拌式培養槽でも培養可
能である。これ等の細胞の培養には通常の組織培養培地
を用いることが出来、本培地中には血清を含んでもよく
、又牛血清アルブミン等の哺乳動物由来のアルブミンを
含有しても、又アルブミンを含有しない合成培地を用い
ることもできる。

正常ヒト末梢血子細胞は、例えば末梢血をフィコールハ
イバーク（、密度１０７８）を使って、　９− ２２００　ｒｐｍ　１５分間の遠沈条件で分離したリン
パ球のナイロンウールカラム通過画分として得られるも
のをＣ３Ｆ産生に用いるとよい。もちろん本分野でよく
知られる他の方法を用いることも出来る。

ヒトＣ３Ｆを産生させるには例えば次のようにする。上
述の方法で得られた融合細胞株クローン、ヒト悪性化子
細胞、もしくはヒト正常末梢血子細胞を２００　Ｏｒｐ
ｍ　５分間遠沈後、前出同様の組織培養培地に懸濁し、
この懸濁液を２４穴プレートの場合は細胞密度Ｉ　Ｘ　
１０”　個／　ｍｅで各穴に１　ｍｅずつ、フラスコ（
ファルコン３０２４）の場合は細胞密度Ｉ　Ｘ　１０’
　個／　ｒａｔで各フラスコｔこ５０ｙｇｌずつ、ロー
ラボトル（ファルコン３０２７）の場合は初細胞密度４
　Ｘ　１０’個／　ｙｘｌで各ボトル１こ１０００＋ｗ
ｔずつ分注し、刺激剤を適当の濃度となるように添加し
、前２者の場合は５　％　Ｃｏ、　　インキュベーター
中で静置、後者の場合は密栓状態で回転（３０ｒｐｍ　
）、３７　Ｃｔこて７２時間培養する。

またＣ５Ｆを産生ずるには上述のフラスコを振盪−ｌ　
〇　− 培養したり攪拌培養槽を用いることも出来る。

本発明になる刺激剤は免疫賦活作用を有する細菌菌体成
分およびβ−（１→３）グルコシド結合を有する多糖体
であるが、ストレプトコッカス・ビオジュネス（５ｔｒ
ｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ　）　細菌菌
体、同菌体の化学処理品として市販されているピシバニ
ール（中外製薬）、ノカルディアルブラ細胞壁骨格成分
及びしいたけより抽出精製されたグルコースのみから構
成される多糖体であるレンチナン等がある。

これら細菌菌体及び同菌体成分および高分子多糖は最適
の濃度ｔこおいてヒト末梢Ｔ１１７７球、ヒト悪性化子
細胞もしくはヒトＴリンパ球由来融合細胞株を１２０時
間程度培養すると、上清中ｔこ可溶性レクチンＣｏｎＡ
＋ＰＨＡを用いた場合と同程度のＣ３Ｆを産生ずる。最
適濃度は予備実験により容易に見出し得る。

こうして得られたヒ）Ｃ３Ｆは培養上清をそのままの形
で使用することも可能であるが、必要に応じて該培養上
清よりＣ５Ｆを単離精製して用いる。

単離精製法としては塩析、濃縮、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、などの種々の方法を適宜組合わせて用いればよ
い。例えば、ＡＭＩＣＯＮ　　ＬＩＭ　−１Ｏにより限
外濾過濃縮（約７０倍）する。この濃縮液を５０〜７０
Ｃの硫酸アンモニウム塩析を行い、得られた沈澱物をト
リス塩酸緩衝液ｐＨ７，４へ溶解し、同緩衝液に対して
透析する。透析した試料はトリス塩酸緩衝液で平衡化し
た５ｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ　−２００カラムによりゲル
濾過分画溶出を行い、ＯＤ　’Ｊ８０及びＣ８Ｆ活性測
定１こよるＣ８Ｆ活性画分を集めコｐジオニパツクにて
濃縮し、精製標品な得る。

このようｔこして得られたＣ３Ｆを含有する培養上清よ
り、精製して得られたＣ３Ｆは、いずれも分子量は約１
５，０００ダルトンから４５，０００ダルトンの範囲に
あり、ＤＮＡ、ＲＮＡ分解酵素３７１１；’、２時間処
理で失活せず、トリプシン、キモトリプシン処理で失活
する。ｐＨ１−１１で４Ｃ１２０時間安定で、室温では
安定であるが、６５Ｃ，３０分で失活し、Ｃ８Ｆとして
知られている公知の性質と同様の挙動を示した。

以下実施例により本発明を更ｒこ説明する。

なお実施例記載以外の例えばヒトＴリンパ腫細胞からも
本文記載の刺激剤１こよりＣ５Ｆが産生される事は自明
である。

実施例１　ヒト末梢血子細胞からのヒ）　Ｃ３Ｆ産生ヒ
ト末梢血からフイフールハイパーク（密度１．０７８）
を使用し、２２００　ｒｐｍ　１５分間の遠心条件でリ
ンパ球を分離し、そのナイロンカラム（和光製薬族）通
過画分を２．００　Ｏｒｐｍ　５分間遠沈後分離したＴ
細胞を１チ牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地に細胞
密度Ｉ　Ｘ　１０’　　個／　Ｎｔになる様に懸濁液を
２４穴プレートの各くぼみＥＺｄずつ、分注しストレプ
トコッカス・ビオジュネス細菌菌体、ピシバニール、レ
ンチナン、Ｃ０ｎＡ（対照）、ＰＨＡ（対照）、ノカル
ディア細胞壁骨格成分を添加し、３７ｔ？、５１ＣＯ，
インキュベーター中で１２０時間静置培養した。培養終
了後遠心−１３− 分離ｒこより細胞を除去した培養上清のＣ３Ｆを測定し
た。

結果を表１に示す。

表　　　　　１ 細菌菌体（ｌμｆ／ｍｌ） ビシバニール（０，２ＫＥ　／ｍｌ　）　　　　　　　
　　　３　ルンチナン（１００μｆ／ｍｌ）’　　　　
　　　　　２７ノ力ルデイア細胞壁骨格成分（１００μ
ｆ／ｖｔｔ）　　　２３ＣｏｎＡ　（５μｔ　／ｍｌ　
）　　（対照）３０ＰＨＡ−Ｐ　（３５ｐｆ／ｍ１）（
対照）３４培地（ＲＰＭ１１６４０）（ブランク）　　
　　　　　１上表にて、Ｃ８Ｆ産生量の単位は「フルニ
ー／シャーレ」である。

実施例２　融合細胞株からのヒ）Ｃ８Ｆの産生活性化剤
ＥＰＰＤを使用して前述の方法で作成した融合細胞株ク
ローンの１種Ａ１５−０１２６−１４− を細胞密度Ｉ　Ｘ　Ｉ　Ｏ’　　個／ｄとなる様ｔこ５
％牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地に懸濁し、２４
穴プレートの各くぼみにこの懸濁液を２　ｍｌずつ分注
し、ストレプトコツカフ。−ビオジュネス細菌菌体、ピ
シバニール、レンチナン、ノカルディア細胞壁骨格成分
、ＣｏｎＡ　（対照）を添加し、３７Ｃ，５４Ｃｏ、　
　インキュベーター中で１２０時間静置培養した。培養
終了後遠心分＃Ｉｔこより細胞を除去した培養上清のＣ
３Ｆを測定した。

結果を表２に示す。Ｃ５Ｆ産生敵の単位は、表１のそれ
と同じである。

表　　　　１ ピゾバニール（０，２ＫＥ　／ｍｅ　）　　　　　　　
　　４３レンチナン（１００μ？／１ｘｌ）　　　　　
　　　　４７ノ力ルデイア細胞壁骨格成分（１００μｆ
ａｔａｌ）　　　２６ＣｏｎＡ　（５μｙ　／ｌｎｌ　
）　（対照）３５培地（ＲＰＭＩ］６４０）（ブランク
）　　　　　　　０実施例３　ヒ）Ｔ細胞白血病細胞ジ
ュルカットからのＣ３Ｆ産生 ヒ）Ｔ細胞系白血病細胞ジュルカント細胞密度ｌＸｌ０
’個／−となる様に１ｏ％牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６
４０培地に懸濁し、懸濁液をファルコンフラスコ３０２
４当り２５ｍ／ずつ分注し、菌体成分、レンチナンなど
およびＣｏｎＡ　（対照）と共Ｐこａ７Ｃ，ｓ％炭炭酸
ガスインキュベクター中４〜５日間培養た。培養後遠心
分離により細胞を除去した培養上清のＣ５Ｆを測定した
。

結果を表３に示す。Ｃ３Ｆ産生量の単位は、表１のそれ
と同じである。

表　　　　３ ピシバニール（０，２ＫＥ　／ｒｘｌ　）　　　　　　
　　　３０レンチナン（１００μｔ／ａｔ）　　　　　
　　　　２９ノ力ルデイア細胞壁骨格成分（１００μｔ
／ｍｌ）　　　　２２ＣｏｎＡ（５μｒ／ｍ／）　　　
　　（’ＵＱ？ｌ−）　　　　　　　　　　　　　　　
３７培地（ＲＰＭＩ　１６４０　）　（ブランク）　　
　　　　Ｏ実施例４　ヒ）Ｔ細胞系白血病細胞ジュルカ
ットからのローラーボトルでのＣ５Ｆ産生 ヒ）Ｔ細胞系白血病細胞ジュルカットを初細胞密度がＩ
　Ｘ　１０６個／　ｒＪとなる様にｔＯｑｂ牛脂児血清
含有ＲＰＭ１１６４０培地に懸濁し、この懸濁液ヲ１０
００　ｍｌはり込みｒこてファルコンローラーボトル３
０２７で、密栓状態３７Ｃ１回転数３゜ｒｐｍにて培養
した。

培養したジュルカット細胞を３００Ｏｒｐｍ５分間遠沈
後１％牛脂児血清含有ＲＰＭ１１６４０培地に細胞密度
４Ｘ１０’個／−になる様に懸濁し、この懸濁液をいく
つかのファルコンローラーボトル３０２７１こ１００〇
−宛分注し、各ボトルｔこ菌体成分、レンチナンなどお
よびＣ０ｎＡ（対照）を添加し、密栓状態３７Ｃ，７２
時間、回転数３゜ｒｐｍで培養した。

結果を表４に示す。Ｃ３Ｆ産生量の単位は、表１のそれ
と同じである。

−１７− 表　　　　４ ビシバニール（ｏ、ｚＫＥ／肩ｌ）　　　　　　　　　
３４レンチナン（１００ｐｆ／ｗｉｇ）　　　　　　　
　　３７ノ力ルデイア細胞壁骨格成分（１００μｆ／ｌ
／）　　　　３０ＣｏｎＡ　　（５ｕｔ　／ｍｌ　）　
　　　　　　　　　　　　３３培地（ＲＰＭＩ　１６４
０　）（ブランク）　　　　　　ｌ−１８−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 ｆｉｌ　　ヒ）Ｔリッツ球由来細胞を免疫賦活作用を有
   する多糖体または細菌菌体成分を刺激剤として含有する
   培地中で培養することを特徴とするコロニー刺激因子の
   製造法。 り２）　　ヒトＴリンパ球由来細胞が、ヒト末梢血由来
   Ｔリンパ球、Ｔリンパ腫細胞、Ｔ白血病細胞、またはＴ
   細胞融合株である特許請求の範囲第１項記載の方法。 （Ｉｌ＋　　細菌菌体成分がストレプトコッカス・ビオ
   ジュネス細菌菌体、ピシバニール、またはノカルディア
   細胞壁骨格成分であり、多糖体がβ（ｌ→３）グルコシ
   ド結合な主鎖ｔこ含有するものである特許請求の範囲第
   １項記載の方法。