JPS5978122A - コロニ−刺激因子の製造法 - Google Patents
コロニ−刺激因子の製造法Info
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- JPS5978122A JPS5978122A JP57188793A JP18879382A JPS5978122A JP S5978122 A JPS5978122 A JP S5978122A JP 57188793 A JP57188793 A JP 57188793A JP 18879382 A JP18879382 A JP 18879382A JP S5978122 A JPS5978122 A JP S5978122A
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- human
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- cell
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、一般的によく知られているヒト顆粒球減少症
の治療用医薬として有用な物質、すなわち、顆粒球系幹
細胞に直接作用して該幹細胞の分化増殖を促進する物質
として知られるコロニー刺激因子(以下、C3Fと略記
する。)を製造する方法に関する。
の治療用医薬として有用な物質、すなわち、顆粒球系幹
細胞に直接作用して該幹細胞の分化増殖を促進する物質
として知られるコロニー刺激因子(以下、C3Fと略記
する。)を製造する方法に関する。
顆粒球、単球及びマクロファージの造血発生学的機序に
於て、生体内のC3Fがこれ等の細胞の母細胞である幹
細胞に作用し、その***・増殖と分化を誘導することか
ら、C8Fがとの機序の中で、中心的な役割を担ってい
ることは広く知られていた( Pluznik、 D、
H,等J、 Ce11. Cramp。
於て、生体内のC3Fがこれ等の細胞の母細胞である幹
細胞に作用し、その***・増殖と分化を誘導することか
ら、C8Fがとの機序の中で、中心的な役割を担ってい
ることは広く知られていた( Pluznik、 D、
H,等J、 Ce11. Cramp。
Ph5ioly、 66 、 319 (1965)
、Bradley+T、 R,等J、 Exp、 Bi
ol、 Med、 Sci、、 44 +287(1
966))。
、Bradley+T、 R,等J、 Exp、 Bi
ol、 Med、 Sci、、 44 +287(1
966))。
そしてこのような生物学的活性を有するC5Fは顆粒球
減少症治療用の医薬としての有用性が期待されていた(
高久史麿 日本臨床 36巻7号2701頁(1978
))。
減少症治療用の医薬としての有用性が期待されていた(
高久史麿 日本臨床 36巻7号2701頁(1978
))。
このような生体内のC3Fは末梢血単球やリンパ球のほ
か、尿、血清、牌、腎、肺、顎下腺、腹膜、胎盤からも
採取されており、精製された七いわれるものも分子量は
1.300からas、oootこわたり、種々のC3F
の存在が推定されている。
か、尿、血清、牌、腎、肺、顎下腺、腹膜、胎盤からも
採取されており、精製された七いわれるものも分子量は
1.300からas、oootこわたり、種々のC3F
の存在が推定されている。
さらに、C8Fの作用もマクロファージ系に作用するも
の、好中球に作用するもの、両者eこ作用するものなど
順粒球産生糸においても多様である事、又各細胞及び臓
器等から得られるC5F量は微量で、大量に製造する事
が困難であり、あるいはまた医薬診断薬に供し得る品質
を備えたC3Fを製造する事は困難であった。
の、好中球に作用するもの、両者eこ作用するものなど
順粒球産生糸においても多様である事、又各細胞及び臓
器等から得られるC5F量は微量で、大量に製造する事
が困難であり、あるいはまた医薬診断薬に供し得る品質
を備えたC3Fを製造する事は困難であった。
これ等C5Fの造血系に及ぼす効果の他に、本発明者等
は、最近Tリンパ球由来のC5Fが免疫賦活作用の引金
tこなる事を初めて発見した。
は、最近Tリンパ球由来のC5Fが免疫賦活作用の引金
tこなる事を初めて発見した。
即ち、抗腫瘍性免疫賦活剤の免疫作用機作を研究してい
く中で、このような免疫活性物質1こより刺激されたT
リッツ球はC3Fを産生じ、このCSFがマクロファー
ジに作用し、リンパ球活性化因子産生増強をひき起す事
、このリンパ球活性化因子が腫瘍ニ対するエフェクター
前駆細胞を成熟化させ、エフェクター細胞として腫瘍を
攻撃し、癌を退縮せしめるという一連の機構を明らかに
した(秋田等、蛋白質・核酸・酵素 26巻3号、20
8頁(1981))。
く中で、このような免疫活性物質1こより刺激されたT
リッツ球はC3Fを産生じ、このCSFがマクロファー
ジに作用し、リンパ球活性化因子産生増強をひき起す事
、このリンパ球活性化因子が腫瘍ニ対するエフェクター
前駆細胞を成熟化させ、エフェクター細胞として腫瘍を
攻撃し、癌を退縮せしめるという一連の機構を明らかに
した(秋田等、蛋白質・核酸・酵素 26巻3号、20
8頁(1981))。
このような免疫活性を有するC5Fは顆粒球減少症治療
用医薬としての有用性のみならず、制癌物質としての効
果も期待される( E、 J、 Wing etal+
J、clin、Invest、、 69+ 270
(1982))。
用医薬としての有用性のみならず、制癌物質としての効
果も期待される( E、 J、 Wing etal+
J、clin、Invest、、 69+ 270
(1982))。
また、例えば骨髄性白血病患者の骨髄細胞中のC3F反
応細胞数を計測する事により、予後の診断を可能ならこ
とがらC5Fは診断薬としての応用も考えられる。
応細胞数を計測する事により、予後の診断を可能ならこ
とがらC5Fは診断薬としての応用も考えられる。
従前、リンパ球由来C3FCついてはヒト末梢血由来リ
ンパ球をレクチンであるPHA、PWMで刺激培養しそ
の培養土清音こC5F活性が検出される事は刈られてい
る( M、 J、 C11ne et at、。
ンパ球をレクチンであるPHA、PWMで刺激培養しそ
の培養土清音こC5F活性が検出される事は刈られてい
る( M、 J、 C11ne et at、。
Nature、 4 B + 703 (1974
) )。 しかし七〇〇SF産生量は多くの他のリンホ
カインと同様極微量である。そこで、本発明者は、新た
にC3Fを大itこ産生させる方法としてT細胞として
細胞培養法で増殖可能なヒトTリンパ球由来細細胞株で
あるTリンパ腫細胞、T白血病細胞、T細胞融合株、あ
るいはヒト末梢血由来1972球のC3F産生能を検討
した所、レクチン刺激1こより細胞数に応じて産生増強
が認められる事を見出した。因みVここれらのレクチン
はC3Fi生に要求される濃度領域ではC3F含有培地
に可溶性である。
) )。 しかし七〇〇SF産生量は多くの他のリンホ
カインと同様極微量である。そこで、本発明者は、新た
にC3Fを大itこ産生させる方法としてT細胞として
細胞培養法で増殖可能なヒトTリンパ球由来細細胞株で
あるTリンパ腫細胞、T白血病細胞、T細胞融合株、あ
るいはヒト末梢血由来1972球のC3F産生能を検討
した所、レクチン刺激1こより細胞数に応じて産生増強
が認められる事を見出した。因みVここれらのレクチン
はC3Fi生に要求される濃度領域ではC3F含有培地
に可溶性である。
しかしながらこれ等のレクチンは生体に対しては種々の
副作用を有し、C3Fを特1こ医薬品としての用途Fこ
用いる場合には培養上清中のC5Fを精製する工程で、
これらのレクチンを充分に分11G、除去する操作が必
須となるが、有効な分離除去方法がきわめて項雑であり
、実用性に欠ける。又、他の用途、例えば診断薬または
研究用試薬として用いる場合に、筒便にはC5Fを含有
する培養上清もしくはその濃縮物を直接に利用する場合
があるが、C5F含有液にレクチンが混在する場合tこ
け、これ等の目的に適切に利用する事が困難な場合があ
る。またヒト末梢血リンパ球rこ対する刺激剤としてレ
クチンを使用する場合に培地中tこ産生 5− される物質は単にC3Fにとどまらず、例えばインター
フェロン、マクロファージ活性化因子、インターロイキ
ン2など多種多様のいわゆるリンホカインの混合物であ
り、C5F精製の原料として使用するには以後の精製過
程が繁雑になる。
副作用を有し、C3Fを特1こ医薬品としての用途Fこ
用いる場合には培養上清中のC5Fを精製する工程で、
これらのレクチンを充分に分11G、除去する操作が必
須となるが、有効な分離除去方法がきわめて項雑であり
、実用性に欠ける。又、他の用途、例えば診断薬または
研究用試薬として用いる場合に、筒便にはC5Fを含有
する培養上清もしくはその濃縮物を直接に利用する場合
があるが、C5F含有液にレクチンが混在する場合tこ
け、これ等の目的に適切に利用する事が困難な場合があ
る。またヒト末梢血リンパ球rこ対する刺激剤としてレ
クチンを使用する場合に培地中tこ産生 5− される物質は単にC3Fにとどまらず、例えばインター
フェロン、マクロファージ活性化因子、インターロイキ
ン2など多種多様のいわゆるリンホカインの混合物であ
り、C5F精製の原料として使用するには以後の精製過
程が繁雑になる。
これ等の問題を解決するためtこ、本発明者は、マイト
ーゲン活性を有さす、従って、副生する他のリンホカイ
ンが少なく、繁雑なレクチン除去、分離操作な経ずとも
通常の蛋白精製法である塩析、限外濾過法等1こより容
易に培養上清より除去し得、かつ末梢リンパ球同様大量
生産tこ適したヒトTリンパ球由来細胞株よりC3Fを
産生じ得る刺激剤を見出すべく鋭意検討し、上記目的に
かなう物質として抗腫瘍活性などの免疫賦活作用を有す
る細菌菌体成分およびβ(1→3)グリコシド結合を有
する多糖体を見い出すことtこより本発明を完成し得た
。
ーゲン活性を有さす、従って、副生する他のリンホカイ
ンが少なく、繁雑なレクチン除去、分離操作な経ずとも
通常の蛋白精製法である塩析、限外濾過法等1こより容
易に培養上清より除去し得、かつ末梢リンパ球同様大量
生産tこ適したヒトTリンパ球由来細胞株よりC3Fを
産生じ得る刺激剤を見出すべく鋭意検討し、上記目的に
かなう物質として抗腫瘍活性などの免疫賦活作用を有す
る細菌菌体成分およびβ(1→3)グリコシド結合を有
する多糖体を見い出すことtこより本発明を完成し得た
。
即ち、本発明は、従来知られているレクチンとは異なる
免疫活性抗腫瘍剤などの免疫賦活作用を有する多糖体ま
たは細菌菌体成分を新しい刺激剤 6− としてヒトTリッツ球由来細胞を刺激培養し他のリンホ
カイン類の混入の少ないより選択的なC3F産生方法お
よび必要により培養液より刺激剤を含有しないC3Fを
効率的に回収する事の可能なヒ)C5Fの製造方法に関
する。
免疫活性抗腫瘍剤などの免疫賦活作用を有する多糖体ま
たは細菌菌体成分を新しい刺激剤 6− としてヒトTリッツ球由来細胞を刺激培養し他のリンホ
カイン類の混入の少ないより選択的なC3F産生方法お
よび必要により培養液より刺激剤を含有しないC3Fを
効率的に回収する事の可能なヒ)C5Fの製造方法に関
する。
次に本発明の方法の詳細について説明する。
本発明の目的物であるヒ)C3Fを製造するのに用いる
ヒ)C3F産生細胞としては、本分野に於てよく知られ
た方法で得られる正常ヒト末梢血子細胞の正常T細胞や
、C5F産生能を有するヒト悪性化細胞ジュルカット等
のヒトTリンパ腫またはヒ)T白血病細胞、そのクロー
ン化(亜株化)細胞、およびそれらと胸腺腫細胞との融
合細胞の如きT細胞由来の融合細胞株などが含まれる。
ヒ)C3F産生細胞としては、本分野に於てよく知られ
た方法で得られる正常ヒト末梢血子細胞の正常T細胞や
、C5F産生能を有するヒト悪性化細胞ジュルカット等
のヒトTリンパ腫またはヒ)T白血病細胞、そのクロー
ン化(亜株化)細胞、およびそれらと胸腺腫細胞との融
合細胞の如きT細胞由来の融合細胞株などが含まれる。
因みtこ上記融合細胞株は例えば通常知られている方法
で得られる。すなわち正常ヒト末梢血より分離したリン
パ球をPHAや結核菌体精製蛋白(PPD)で活性化し
、これをヒポキサンチン舎ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ(HPRTE、C,2・4・2・8)の欠損した
胸腺腫細胞とポリエチレングリコールの存在下で融合さ
せる。
で得られる。すなわち正常ヒト末梢血より分離したリン
パ球をPHAや結核菌体精製蛋白(PPD)で活性化し
、これをヒポキサンチン舎ホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ(HPRTE、C,2・4・2・8)の欠損した
胸腺腫細胞とポリエチレングリコールの存在下で融合さ
せる。
融合後tこヒポキサンチン・7ミノブテリン・チミジン
(HAT)選択培地中に生育した融合細胞株が現われ、
更にヒボキサンチン・チミジン(HT)培地中で培養す
る。このようにして得られる融合細胞株を例えばI X
1 G’個/dの濃度tこ調整し、24穴の組織培養
プレートに本発明の刺激剤の存在下で120時間培養し
、培養上清を採取し、本培養上清中のC3F産生能は次
に述べる方法?こより検定し、C8F産生能を有するヒ
)T細胞融合細胞株を得る。このように、このような融
合細胞株の作成方法は公知であり、これら細胞株は公知
の方法1こより容易に作成することが出来る。
(HAT)選択培地中に生育した融合細胞株が現われ、
更にヒボキサンチン・チミジン(HT)培地中で培養す
る。このようにして得られる融合細胞株を例えばI X
1 G’個/dの濃度tこ調整し、24穴の組織培養
プレートに本発明の刺激剤の存在下で120時間培養し
、培養上清を採取し、本培養上清中のC3F産生能は次
に述べる方法?こより検定し、C8F産生能を有するヒ
)T細胞融合細胞株を得る。このように、このような融
合細胞株の作成方法は公知であり、これら細胞株は公知
の方法1こより容易に作成することが出来る。
C5F活性を検定するには、例えば次のように行なう。
すなわち、a、smmプラスチック培養皿(ファルフン
製3001)の中に、I X 10’個−=rウス骨髄
fll胞液0.2 mt、 2.2 %メチルセルロー
ス(信越化学部)0.4m/lこ馬血清(フローラボラ
トリー製)0.2*/およびC3F試料0.2*/の計
1mlをとり、7日間、5%CO,ガス通気下37r加
湿培養器中で培養し、培養後、倒立顕微鏡下で20個以
上の細胞集塊を1コロニーとして、コロニー数を測定、
そのコロニー数をもってC3F活性を表わすことVこよ
り、C8F産生を検定する。
製3001)の中に、I X 10’個−=rウス骨髄
fll胞液0.2 mt、 2.2 %メチルセルロー
ス(信越化学部)0.4m/lこ馬血清(フローラボラ
トリー製)0.2*/およびC3F試料0.2*/の計
1mlをとり、7日間、5%CO,ガス通気下37r加
湿培養器中で培養し、培養後、倒立顕微鏡下で20個以
上の細胞集塊を1コロニーとして、コロニー数を測定、
そのコロニー数をもってC3F活性を表わすことVこよ
り、C8F産生を検定する。
融合細胞株クローンまたはTリンパ腫細胞、T白血病細
胞等のヒト悪性化子細胞の培養は次のようにして行える
。即ち、例えば融合細胞株り一一ンまたはヒト悪性化細
胞を初濃度1x lo’ /ytlとなる様に組織培養
培地に懸濁し、ファルコンフラスコ3024当り2.5
4ずつ分注し37CCて5%CO1インキュベーター中
で4〜6日間靜置装養する。又これ等の細胞はローラー
ボトルによる回転培養あるいは攪拌式培養槽でも培養可
能である。これ等の細胞の培養には通常の組織培養培地
を用いることが出来、本培地中には血清を含んでもよく
、又牛血清アルブミン等の哺乳動物由来のアルブミンを
含有しても、又アルブミンを含有しない合成培地を用い
ることもできる。
胞等のヒト悪性化子細胞の培養は次のようにして行える
。即ち、例えば融合細胞株り一一ンまたはヒト悪性化細
胞を初濃度1x lo’ /ytlとなる様に組織培養
培地に懸濁し、ファルコンフラスコ3024当り2.5
4ずつ分注し37CCて5%CO1インキュベーター中
で4〜6日間靜置装養する。又これ等の細胞はローラー
ボトルによる回転培養あるいは攪拌式培養槽でも培養可
能である。これ等の細胞の培養には通常の組織培養培地
を用いることが出来、本培地中には血清を含んでもよく
、又牛血清アルブミン等の哺乳動物由来のアルブミンを
含有しても、又アルブミンを含有しない合成培地を用い
ることもできる。
正常ヒト末梢血子細胞は、例えば末梢血をフィコールハ
イバーク(、密度1078)を使って、 9− 2200 rpm 15分間の遠沈条件で分離したリン
パ球のナイロンウールカラム通過画分として得られるも
のをC3F産生に用いるとよい。もちろん本分野でよく
知られる他の方法を用いることも出来る。
イバーク(、密度1078)を使って、 9− 2200 rpm 15分間の遠沈条件で分離したリン
パ球のナイロンウールカラム通過画分として得られるも
のをC3F産生に用いるとよい。もちろん本分野でよく
知られる他の方法を用いることも出来る。
ヒトC3Fを産生させるには例えば次のようにする。上
述の方法で得られた融合細胞株クローン、ヒト悪性化子
細胞、もしくはヒト正常末梢血子細胞を200 Orp
m 5分間遠沈後、前出同様の組織培養培地に懸濁し、
この懸濁液を24穴プレートの場合は細胞密度I X
10” 個/ meで各穴に1 meずつ、フラスコ(
ファルコン3024)の場合は細胞密度I X 10’
個/ ratで各フラスコtこ50yglずつ、ロー
ラボトル(ファルコン3027)の場合は初細胞密度4
X 10’個/ yxlで各ボトル1こ1000+w
tずつ分注し、刺激剤を適当の濃度となるように添加し
、前2者の場合は5 % Co、 インキュベーター
中で静置、後者の場合は密栓状態で回転(30rpm
)、37 Ctこて72時間培養する。
述の方法で得られた融合細胞株クローン、ヒト悪性化子
細胞、もしくはヒト正常末梢血子細胞を200 Orp
m 5分間遠沈後、前出同様の組織培養培地に懸濁し、
この懸濁液を24穴プレートの場合は細胞密度I X
10” 個/ meで各穴に1 meずつ、フラスコ(
ファルコン3024)の場合は細胞密度I X 10’
個/ ratで各フラスコtこ50yglずつ、ロー
ラボトル(ファルコン3027)の場合は初細胞密度4
X 10’個/ yxlで各ボトル1こ1000+w
tずつ分注し、刺激剤を適当の濃度となるように添加し
、前2者の場合は5 % Co、 インキュベーター
中で静置、後者の場合は密栓状態で回転(30rpm
)、37 Ctこて72時間培養する。
またC5Fを産生ずるには上述のフラスコを振盪−l
〇 − 培養したり攪拌培養槽を用いることも出来る。
〇 − 培養したり攪拌培養槽を用いることも出来る。
本発明になる刺激剤は免疫賦活作用を有する細菌菌体成
分およびβ−(1→3)グルコシド結合を有する多糖体
であるが、ストレプトコッカス・ビオジュネス(5tr
eptococcus pyogenes ) 細菌菌
体、同菌体の化学処理品として市販されているピシバニ
ール(中外製薬)、ノカルディアルブラ細胞壁骨格成分
及びしいたけより抽出精製されたグルコースのみから構
成される多糖体であるレンチナン等がある。
分およびβ−(1→3)グルコシド結合を有する多糖体
であるが、ストレプトコッカス・ビオジュネス(5tr
eptococcus pyogenes ) 細菌菌
体、同菌体の化学処理品として市販されているピシバニ
ール(中外製薬)、ノカルディアルブラ細胞壁骨格成分
及びしいたけより抽出精製されたグルコースのみから構
成される多糖体であるレンチナン等がある。
これら細菌菌体及び同菌体成分および高分子多糖は最適
の濃度tこおいてヒト末梢T1177球、ヒト悪性化子
細胞もしくはヒトTリンパ球由来融合細胞株を120時
間程度培養すると、上清中tこ可溶性レクチンConA
+PHAを用いた場合と同程度のC3Fを産生ずる。最
適濃度は予備実験により容易に見出し得る。
の濃度tこおいてヒト末梢T1177球、ヒト悪性化子
細胞もしくはヒトTリンパ球由来融合細胞株を120時
間程度培養すると、上清中tこ可溶性レクチンConA
+PHAを用いた場合と同程度のC3Fを産生ずる。最
適濃度は予備実験により容易に見出し得る。
こうして得られたヒ)C3Fは培養上清をそのままの形
で使用することも可能であるが、必要に応じて該培養上
清よりC5Fを単離精製して用いる。
で使用することも可能であるが、必要に応じて該培養上
清よりC5Fを単離精製して用いる。
単離精製法としては塩析、濃縮、ゲル濾過クロマトグラ
フィー、などの種々の方法を適宜組合わせて用いればよ
い。例えば、AMICON LIM −1Oにより限
外濾過濃縮(約70倍)する。この濃縮液を50〜70
Cの硫酸アンモニウム塩析を行い、得られた沈澱物をト
リス塩酸緩衝液pH7,4へ溶解し、同緩衝液に対して
透析する。透析した試料はトリス塩酸緩衝液で平衡化し
た5ephacryl S −200カラムによりゲル
濾過分画溶出を行い、OD ’J80及びC8F活性測
定1こよるC8F活性画分を集めコpジオニパツクにて
濃縮し、精製標品な得る。
フィー、などの種々の方法を適宜組合わせて用いればよ
い。例えば、AMICON LIM −1Oにより限
外濾過濃縮(約70倍)する。この濃縮液を50〜70
Cの硫酸アンモニウム塩析を行い、得られた沈澱物をト
リス塩酸緩衝液pH7,4へ溶解し、同緩衝液に対して
透析する。透析した試料はトリス塩酸緩衝液で平衡化し
た5ephacryl S −200カラムによりゲル
濾過分画溶出を行い、OD ’J80及びC8F活性測
定1こよるC8F活性画分を集めコpジオニパツクにて
濃縮し、精製標品な得る。
このようtこして得られたC3Fを含有する培養上清よ
り、精製して得られたC3Fは、いずれも分子量は約1
5,000ダルトンから45,000ダルトンの範囲に
あり、DNA、RNA分解酵素3711;’、2時間処
理で失活せず、トリプシン、キモトリプシン処理で失活
する。pH1−11で4C120時間安定で、室温では
安定であるが、65C,30分で失活し、C8Fとして
知られている公知の性質と同様の挙動を示した。
り、精製して得られたC3Fは、いずれも分子量は約1
5,000ダルトンから45,000ダルトンの範囲に
あり、DNA、RNA分解酵素3711;’、2時間処
理で失活せず、トリプシン、キモトリプシン処理で失活
する。pH1−11で4C120時間安定で、室温では
安定であるが、65C,30分で失活し、C8Fとして
知られている公知の性質と同様の挙動を示した。
以下実施例により本発明を更rこ説明する。
なお実施例記載以外の例えばヒトTリンパ腫細胞からも
本文記載の刺激剤1こよりC5Fが産生される事は自明
である。
本文記載の刺激剤1こよりC5Fが産生される事は自明
である。
実施例1 ヒト末梢血子細胞からのヒ) C3F産生ヒ
ト末梢血からフイフールハイパーク(密度1.078)
を使用し、2200 rpm 15分間の遠心条件でリ
ンパ球を分離し、そのナイロンカラム(和光製薬族)通
過画分を2.00 Orpm 5分間遠沈後分離したT
細胞を1チ牛脂児血清含有RPM11640培地に細胞
密度I X 10’ 個/ Ntになる様に懸濁液を
24穴プレートの各くぼみEZdずつ、分注しストレプ
トコッカス・ビオジュネス細菌菌体、ピシバニール、レ
ンチナン、C0nA(対照)、PHA(対照)、ノカル
ディア細胞壁骨格成分を添加し、37t?、51CO,
インキュベーター中で120時間静置培養した。培養終
了後遠心−13− 分離rこより細胞を除去した培養上清のC3Fを測定し
た。
ト末梢血からフイフールハイパーク(密度1.078)
を使用し、2200 rpm 15分間の遠心条件でリ
ンパ球を分離し、そのナイロンカラム(和光製薬族)通
過画分を2.00 Orpm 5分間遠沈後分離したT
細胞を1チ牛脂児血清含有RPM11640培地に細胞
密度I X 10’ 個/ Ntになる様に懸濁液を
24穴プレートの各くぼみEZdずつ、分注しストレプ
トコッカス・ビオジュネス細菌菌体、ピシバニール、レ
ンチナン、C0nA(対照)、PHA(対照)、ノカル
ディア細胞壁骨格成分を添加し、37t?、51CO,
インキュベーター中で120時間静置培養した。培養終
了後遠心−13− 分離rこより細胞を除去した培養上清のC3Fを測定し
た。
結果を表1に示す。
表 1
細菌菌体(lμf/ml)
ビシバニール(0,2KE /ml )
3 ルンチナン(100μf/ml)’
27ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μ
f/vtt) 23ConA (5μt /ml
) (対照)30PHA−P (35pf/m1)(
対照)34培地(RPM11640)(ブランク)
1上表にて、C8F産生量の単位は「フルニ
ー/シャーレ」である。
3 ルンチナン(100μf/ml)’
27ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μ
f/vtt) 23ConA (5μt /ml
) (対照)30PHA−P (35pf/m1)(
対照)34培地(RPM11640)(ブランク)
1上表にて、C8F産生量の単位は「フルニ
ー/シャーレ」である。
実施例2 融合細胞株からのヒ)C8Fの産生活性化剤
EPPDを使用して前述の方法で作成した融合細胞株ク
ローンの1種A15−0126−14− を細胞密度I X I O’ 個/dとなる様tこ5
%牛脂児血清含有RPM11640培地に懸濁し、24
穴プレートの各くぼみにこの懸濁液を2 mlずつ分注
し、ストレプトコツカフ。−ビオジュネス細菌菌体、ピ
シバニール、レンチナン、ノカルディア細胞壁骨格成分
、ConA (対照)を添加し、37C,54Co、
インキュベーター中で120時間静置培養した。培養
終了後遠心分#Itこより細胞を除去した培養上清のC
3Fを測定した。
EPPDを使用して前述の方法で作成した融合細胞株ク
ローンの1種A15−0126−14− を細胞密度I X I O’ 個/dとなる様tこ5
%牛脂児血清含有RPM11640培地に懸濁し、24
穴プレートの各くぼみにこの懸濁液を2 mlずつ分注
し、ストレプトコツカフ。−ビオジュネス細菌菌体、ピ
シバニール、レンチナン、ノカルディア細胞壁骨格成分
、ConA (対照)を添加し、37C,54Co、
インキュベーター中で120時間静置培養した。培養
終了後遠心分#Itこより細胞を除去した培養上清のC
3Fを測定した。
結果を表2に示す。C5F産生敵の単位は、表1のそれ
と同じである。
と同じである。
表 1
ピゾバニール(0,2KE /me )
43レンチナン(100μ?/1xl)
47ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μf
atal) 26ConA (5μy /lnl
) (対照)35培地(RPMI]640)(ブランク
) 0実施例3 ヒ)T細胞白血病細胞ジ
ュルカットからのC3F産生 ヒ)T細胞系白血病細胞ジュルカント細胞密度lXl0
’個/−となる様に1o%牛脂児血清含有RPM116
40培地に懸濁し、懸濁液をファルコンフラスコ302
4当り25m/ずつ分注し、菌体成分、レンチナンなど
およびConA (対照)と共Pこa7C,s%炭炭酸
ガスインキュベクター中4〜5日間培養た。培養後遠心
分離により細胞を除去した培養上清のC5Fを測定した
。
43レンチナン(100μ?/1xl)
47ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μf
atal) 26ConA (5μy /lnl
) (対照)35培地(RPMI]640)(ブランク
) 0実施例3 ヒ)T細胞白血病細胞ジ
ュルカットからのC3F産生 ヒ)T細胞系白血病細胞ジュルカント細胞密度lXl0
’個/−となる様に1o%牛脂児血清含有RPM116
40培地に懸濁し、懸濁液をファルコンフラスコ302
4当り25m/ずつ分注し、菌体成分、レンチナンなど
およびConA (対照)と共Pこa7C,s%炭炭酸
ガスインキュベクター中4〜5日間培養た。培養後遠心
分離により細胞を除去した培養上清のC5Fを測定した
。
結果を表3に示す。C3F産生量の単位は、表1のそれ
と同じである。
と同じである。
表 3
ピシバニール(0,2KE /rxl )
30レンチナン(100μt/at)
29ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μt
/ml) 22ConA(5μr/m/)
(’UQ?l−)
37培地(RPMI 1640 ) (ブランク)
O実施例4 ヒ)T細胞系白血病細胞ジュルカ
ットからのローラーボトルでのC5F産生 ヒ)T細胞系白血病細胞ジュルカットを初細胞密度がI
X 106個/ rJとなる様にtOqb牛脂児血清
含有RPM11640培地に懸濁し、この懸濁液ヲ10
00 mlはり込みrこてファルコンローラーボトル3
027で、密栓状態37C1回転数3゜rpmにて培養
した。
30レンチナン(100μt/at)
29ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μt
/ml) 22ConA(5μr/m/)
(’UQ?l−)
37培地(RPMI 1640 ) (ブランク)
O実施例4 ヒ)T細胞系白血病細胞ジュルカ
ットからのローラーボトルでのC5F産生 ヒ)T細胞系白血病細胞ジュルカットを初細胞密度がI
X 106個/ rJとなる様にtOqb牛脂児血清
含有RPM11640培地に懸濁し、この懸濁液ヲ10
00 mlはり込みrこてファルコンローラーボトル3
027で、密栓状態37C1回転数3゜rpmにて培養
した。
培養したジュルカット細胞を300Orpm5分間遠沈
後1%牛脂児血清含有RPM11640培地に細胞密度
4X10’個/−になる様に懸濁し、この懸濁液をいく
つかのファルコンローラーボトル30271こ100〇
−宛分注し、各ボトルtこ菌体成分、レンチナンなどお
よびC0nA(対照)を添加し、密栓状態37C,72
時間、回転数3゜rpmで培養した。
後1%牛脂児血清含有RPM11640培地に細胞密度
4X10’個/−になる様に懸濁し、この懸濁液をいく
つかのファルコンローラーボトル30271こ100〇
−宛分注し、各ボトルtこ菌体成分、レンチナンなどお
よびC0nA(対照)を添加し、密栓状態37C,72
時間、回転数3゜rpmで培養した。
結果を表4に示す。C3F産生量の単位は、表1のそれ
と同じである。
と同じである。
−17−
表 4
ビシバニール(o、zKE/肩l)
34レンチナン(100pf/wig)
37ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μf/l
/) 30ConA (5ut /ml )
33培地(RPMI 164
0 )(ブランク) l−18−
34レンチナン(100pf/wig)
37ノ力ルデイア細胞壁骨格成分(100μf/l
/) 30ConA (5ut /ml )
33培地(RPMI 164
0 )(ブランク) l−18−
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 fil ヒ)Tリッツ球由来細胞を免疫賦活作用を有
する多糖体または細菌菌体成分を刺激剤として含有する
培地中で培養することを特徴とするコロニー刺激因子の
製造法。 り2) ヒトTリンパ球由来細胞が、ヒト末梢血由来
Tリンパ球、Tリンパ腫細胞、T白血病細胞、またはT
細胞融合株である特許請求の範囲第1項記載の方法。 (Il+ 細菌菌体成分がストレプトコッカス・ビオ
ジュネス細菌菌体、ピシバニール、またはノカルディア
細胞壁骨格成分であり、多糖体がβ(l→3)グルコシ
ド結合な主鎖tこ含有するものである特許請求の範囲第
1項記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57188793A JPS5978122A (ja) | 1982-10-27 | 1982-10-27 | コロニ−刺激因子の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP57188793A JPS5978122A (ja) | 1982-10-27 | 1982-10-27 | コロニ−刺激因子の製造法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS5978122A true JPS5978122A (ja) | 1984-05-04 |
Family
ID=16229891
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP57188793A Pending JPS5978122A (ja) | 1982-10-27 | 1982-10-27 | コロニ−刺激因子の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5978122A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1986004605A1 (en) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
US4833127A (en) * | 1984-07-25 | 1989-05-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel CSF and method for obtaining the same |
EP0399777A2 (en) * | 1989-05-23 | 1990-11-28 | Chandra Choudhury | Hematopoietic growth factor derived from T lymphocytes and methods of use therefor |
US5532341A (en) * | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
WO1998058663A1 (de) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Mucos Pharma Gmbh & Co. | Beeinflussung von cytokinen durch proteolytische enzyme |
-
1982
- 1982-10-27 JP JP57188793A patent/JPS5978122A/ja active Pending
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4833127A (en) * | 1984-07-25 | 1989-05-23 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Novel CSF and method for obtaining the same |
WO1986004605A1 (en) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
US5532341A (en) * | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
EP0399777A2 (en) * | 1989-05-23 | 1990-11-28 | Chandra Choudhury | Hematopoietic growth factor derived from T lymphocytes and methods of use therefor |
WO1998058663A1 (de) * | 1997-06-20 | 1998-12-30 | Mucos Pharma Gmbh & Co. | Beeinflussung von cytokinen durch proteolytische enzyme |
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