<Desc/Clms Page number 1>
Culture de virus.
La présente invention concerne la culture de virus, plus particulièrement dans les cellules d'une culture tissulaire.
La culture de virus est importante tant pour la production de vaccins que pour la recherche radical et vétérinaire. Lr pré- sence de cellules vivantes est essentielle pour la prolifération et les virus se multiplieront en général librement dans les cellules d'une culture tissulaire. Toutefois, dans les cultures de virus à grande échelle, il est souvent difficile déporter les quantités recuises de cellules vivantes appropriées.
Par exemple, le virus de la fièvre aphteuse est cultivé couramment pour la production tle vaccins dans des milieux constituéspar les tissus de .ceins de porc ou de veau. Etant donné que les cellules vivantes ne survivait que pendant quelques générations, le procédé est laborieux et nécessite
<Desc/Clms Page number 2>
constamment de nouvelles cultures de tissus de reins fraie. Cela constitue un inconvénient à cause de la variabilité des cultures issues d'animaux différents et à cause du risque de contamination par les bactéries et les virus des animaux.
Pour remplacer les préparations de cellules de tissus fraie pour la culture des virus, on a essayé d'établir des lignées de cel- Iules qui peuvent être cultivées et repiquées pour constituer une source standard de cellules convenant pour la croissance des virus* Il existe diverses lignées de cellules, mais on ne dispose pas de système de culture satisfaisant pour la reproduction de certains virus, par exemrle, du virus de la fièvre aphteuse. La difficulté principale réside dans le fait que les cellules changent souvent de caractère après un certain temps de culture et deviennent impropre* à la croissance des virus.
On a découvert à présent une nouvelle lignée de cellules qui peut être cultivée et repiquée pendant de nombreux mois sans manifester de modification sensible de caractère. En outre, les cel- lules de cette nouvelle lignée se multiplient plus rapidement oue ne le font d'habitude .Le! autres cellules. On a découvert également nue la nouvelle lignée de cellules entretient facilement la croissance de divers virus et, pouvant être cultivée et repiquée continuelle- ment et conservée, si nécessaire, à des températures inférieures à 0 C, elle constitue une source appropriée de cellules pour la cul- ture de virus.
La nouvelle lignée de cellules est une lignée de fibrocytes de rein de jeunes hamsters dorés et est appelée BHK 21. L'idiogramme des cellules semble être le même que celui rencontré dans les cultu- res primaires de rein de hamsters. Les cellules sont fibroblastiques et croissent en couche monocellulaire avec une tendance bien marquée à s'orienter parallèlement. Flles se développent rapidement et se di- visent à peu près toutes les douze heures, et ces caractéristiques ont été conservées pendant plusieurs mois de culture. Cette propriété les distingue d'autres lignées de cellules.
<Desc/Clms Page number 3>
La nouvelle lignée de cellules a été développée à partir d'une culture de cellules de rein de jeunes hamsters préparée comme
EMI3.1
décrit par Stoker et Macpherson, Virology, .., pages 359-370. Des lots de cellules ont été propagés en traitant par de la trypsine les couches monocellula1rs avant quelles ne deviennent complètement 1 contluentes et en opérant le repi("u8f:e avec un dixième ou un vingtiè- me de la suspension de cellules. Cela nécessite un reiouage tous les' ! ou 5 Jours. Le milieu de culture utilisé consiste en 10;ti de sérum i non chauffé de veau et de 10 de bouillon de tryptose phosphate trai- té en autoclave dans le milieu de base d'Eagle porte au double de la : concentration normale en acides aminés et en vitamines.
A une seule exception près, les lots de cellules cessent de se développer après ;
EMI3.2
quelques repiquages, cette exception étant la lignée de cellules BHK ; 21. Celle-ci provient de cultures de la suspension originale de cel- lules de rein conservées en croissance logarithmique nendant 30 jours.
Les cellules sont traitées ensuite par de la trypsine, remises en !
EMI3.3
suspension dans un milieu contenant 20 de séruin de veau et 5 de glycérol et refroidies à -'70pC. Apres 6 jours de conservation à cette ' température, les cellules sont isolées en les réchauffant rapidement
EMI3.4
à 37OCe Les cellules sont ensuite utilisées pendant 35 jours encore, après quoi elles croissent rapidement et elles ont une vitesse moyen- ne de doublement de 12 heures et un pouvoir de recouvrement de 2 à 10%. Par la suite, les cellules ne changent pas de caractère et con- servent leur vitesse de croissance logarithmique.
On a également découvert que la lignée de cellules BHK 21 est modifiée par le virus du polyome, Les cellules modifiées peuvent. être obtenues à partir de cellules de lignée BHK 21 en leur inoculant le virus du polyome. Une semaine après, il est possible de déceler des cellules modifiées parmi les cellules normales et ces cellules
EMI3.5
modifiées sont séparées et purifiées par rep1cluay,e..
Les cellules de lignée BHK 21 et des cellules de cette même lignée qui ont été modifiées par l'action du virus du polyome, sont cultivées sur un milieu nutritif. Lo système de culture comprend
<Desc/Clms Page number 4>
donc les cellules de cette lignée dans un milieu nutritif approprié qui contient habituellement des acides aminés, des vitamines, des hydrates de carbone et des sels. En outre, des antibiotiques sont avantageusenent ajoutés pour empêcher l'envahissement de la culture par des bactéries et des cryptogames. Il est commode d'utiliser à cette fin le milieu de base d'Eagle additionné de 10% de tryptose phosphate (Difco) et de 10% ae sérum de veau.
Suivant la présente invention, dans un procédé de culture d'un virus, on inocule le virus à un système comprenant des cellules de la ligne cellulaire BHK 21 ou des cellules de la ligne BHK 21 modifiées par l'action du virus du polyome, et des agents nutritifs en ouantités suffisantes afin de maintenir en vie les cellules pour la culture du virus.
Les cellules peuvent être cultivées d'une façon appropriée quelconque dans de l'air contenant 5% d'anhydride carbonique, par exemple en recourant à une culture stationnaire ou tournante ou agi- tée.
Le milieu nutritif utilisé pour la croissance de certains virus peut être avantageusement le même que celui décrit plus haut pour la culture de la lignée de cellules. Toutefois, la croissance satisfaisante d'autres virus peut exiger un milieu nutritif modifié.
L'invention s'applique en particulier à la culture de vi- rus aui sont importants en médecine humaine et vétérinaire. Ainsi, le virus de la fièvre aphteuse, le virus du trachome et le virus herpétique peuvent tre cultivés avantageusement par le procédé de l'invention, et on a réalisé également la culture du virus de la maladie de Newcastle et du virus de la peste aviaire, ainsi que des virus de la grippe et d'arbovirus, par exemple le virus de la dengue.
La culture du virus de la fièvre aphteuse est spécialement impor- tante et on a montré maintenant que la production à grande échelle de vaccins contre cette maladie utilisant la technique de cultures en suspension est réalisable en pratiaue.
Il est relativement facile pour le virologiste d'établir
<Desc/Clms Page number 5>
Si les cellules BHK 21 conviennent pour un virus donné. En utilisant les conditions de culture, par exemple le pH et la température em- ployés normalement pour le virus dans d'autres systèmes de cellules, la viabilité de la nouvelle lignée cellulaire est déterminée facile- ment un certain temps après l'inoculation, temps qui varie d'un virus à l'autre, en mesurant le rendement en virus et en examinant les cellules pour déterminer l'effet cytopathique caractéristique qui est indicatif de la croissance du virus; les cellules s'arron- dissent, deviennent granuleuses et se détachent de la surface de verre sur laquelle elles ont formé une couche unique.
Les cellules utilisées aux fins de l'invention proviennent de préférence, mais non nécessairement, du même clone.
Pour préparer les vaccins correspondants à partir des vi- rus cultivés suivant l'invention, il est nécessaire de traiter les virus par des procédés connus.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
EXEMPLE 1.-
Des cellules BHK 21 dans un milieu de culture consistant en 10% de sérum non chauffé de veau et en 10% de bouillon de trypto- se phosphate traité en autoclave, dans le milieu de base d'Eagle porté au double de la concentration normale en acides aminés et en vitamines sont inoculées avec une souche 997 (type C) du virus de la ! fièvre aphteuse après 204 passages dans des cultures de cellules de rein de porc. Le virus croît dans la lignée cellulaire, le titre @ viral étant de 107,0.
EXEMPLE 2.-
On répète deux fois le procédé de l'exemple 1 en utilisant des souches différentes de virus de la fièvre aphteuse , Les souches utilisées sont (1) la souche RV 11 (type SAT 1 - virus modifié) qui a été transplantée 34 fois sur des souris adultes et 2 fois sur des souris non sevrées et (2) la souche RV 11 (virus du bétail) oui a été transplantée 25 fois sur du bétail (filtrat conservé). Les deux souches se développent dans les lignées de cellules et les titres
<Desc/Clms Page number 6>
viraux sont respectivement de 107,8 et de 106,5.
EXEMPLE 3.
Lorsque des cellules BHK 21 sont inoculées avec le virus HFEM de l'herpès simplex, puis incubées à 37 C dans le milieu décrit dans l'exemple 1, le virus accuse une croissance de plusieurs ordres de grandeurs en quelques jours en provoquant une dégénérescence si- multanée des cellules.
EXEMPLE 4.-
Des cellules BHK 21 en suspension dans un milieu de culture consistant en sérum physiologique de Hank, en hydrolysat de lactalbumine, en sérum humain (10%) et en sérum de veau (10%)sont mélangées avec la souche de T'ang (TESS) du virus de trachome égale- ment en suspension dans un milieu analogue, et le mélange 'est agité doucement pendant heure à 37 C, Les cellules sont séparées de la suspension par 10 minutes de centrifugation à 850 tours/minute, puis remises en suspension dans un milieu neuf, sédimentées sur un couvre-objet et incubées pendant 24 heures à 37 C. La croissance du virus peut être alors constatée.
EXEMPLE 5.-
Des cellules BHK 21 sont cultivées à monocouches dans des boites de Pétri dans le milieu décrit dans l'exemple 1. Lorsque la culture de cellules est devenue juste confluente et avant d'avoir atteint l'âge de 4 jours, le milieu est lavé avec du sérum normal qui ne contient pas de sérum animal. Le virus de la maladie de Newcastle adapté sur oeuf est inoculé en petites quantités aux monocouches lavées de cellules BHK 21, en accordant 30 minutes pour l'adsorption du virus et les cellules sont ensuite recouvertes de milieu nutritif.
L'incubation entre 35 et 38 C a pour effet une croissance du virus qui est comparable à sa croissance naturelle dans l'embryon de pou- let et la destruction de la monocouche dans les deux jours. L'effet est transmissible dans les cellules BHK 21.
EXEMPLE 6.-
En appliquant le procédé décrit dans l'exemple t à la
<Desc/Clms Page number 7>
culture du virus de la peste aviaire, une croissance importante du virus se produit et la monocouche de cellules BHK 21 est détruite.: L'effet est transmissible dans les cellules PHK 21.
EXEMPLE 7.-
Des cellules BHK 21 qu'on, a fait croître comme dans l'exem- ple 5 sont inoculées avec de petites doses de la souche neuropatho- ; gène (NWS) du virus A de la grippe. La couche de cellules est dé- truite et il se forme un virus NWS parfaitement infectieux. L'effet est transmissible dans les oréparations de cellules BHX 21.
EXEMPLE 8.-
On procède suivant l'exemple 5, mais les cellules BHK 21 sont infectées par de grosses quantités, par exemple 10 à 100 par- ticules par cellule, d'une souche non neuropathogène du virus A de la grippe. Après 18 heures d'incubation à 37 C, il se forme de grandes quantités d'hémagglutinine de virus non infectieux et de l'antigène soluble de virus qui sont intéressants pour l'immunisa- tion expérimentale et pour des tests sérologiques. Les cellules BHK .
21 sont détruites, mais l'effet ne peut être transmis d'une prépara- tion de cellules BHK 21 à une autre.
EXEMPLE 9 . -
Une souche de- cellules BHK 21 de même clone (clone n 13) qui a subi 110 oassages en monocouche est mise en suspension dans 200 cm3 d'un milieu de culture constitué par le milieu de base d'Eagle porté au double de la concentration normale en acides ami- nés et en vitamines et par 10% de sérum bovin passé au filtre de Seitz et par 10% de bouillon de tryptose phosphate, et contenant de la pénicilline (100 unités/cm3), de la streptomycine (100 unités/cm), de la mycostatine (25 unités/cm3) et de la néomycine (70 unités/cm3).
La suspension est introduite dans un récipient cylindrique en Pyrex d'un diamètre de 7,6 cm et d'une hauteur de 25,4. cm, comportant deux admissions en verre à l'extrémité supérieure.
On prépare une série de tels systèmes, chaque récipient étant agité par des barreaux magnétiques revêtus de Téflon entraînas
<Desc/Clms Page number 8>
à 335 tours/minute par des aimants extérieurs mus mécaniquement. Les récipients sont maintenus au bain-matie à 37 C. Ils sont bouchés à l'émeri après l'ensemencement et on faère pas.
Pour éviter l'agglomération des cellules et la croissance sur les parois des récipients, les cellules sont collectées toutes les 24 heures, remises en suspension dans un mélange versène-trypsine (0,01%) pendant 1 heure, puis introduites dans un milieu neuf. Après une période initiale, il se produit une croissance régulière et il se forme 2 - 3,6 x 108,0 cellules par 48 heures.
Une nouvelle propagation peut être exécutée dans des réci- pients de 5 litres munis de dispositifs de réglage du pli et d'aéra- tion, L'aération à l'aide d'un mélange air/C02 suffisante à mainte- nir le pH à 7,0 - 7,2 s'est avérée appropriée. En choisissant soi- gueusement les conditions de culture, la croissance du virus de la fièvre aphteuse et d'autres virus dans une culture de cellules en suspension est également possible.
EXEMPLE 10.-
Une culture en couche monocellulaire de 4 jours de la sou- che BHK 21 (clone 13) dans un flacon de Roux, à savoir environ 108 cellules, est inoculée avec 1,0 car d'une suspension de virus de la fièvre aphteuse du type SAT 2 ayant un titre ID50/cm3 chez la sou- ris de 107,0.. Après 1 heure d'absorption du virus à 37 C, la cultu- re est lavée 5fois avec du sérum physiologique tamponné au phospha- te, puis additionnée de 80 car de milieu d'Eagle modifié et de 10% de bouillon de tryptose phosphate. Après 22 heures d'incubation, le fluide est recueilli et les débris cellulaires sont éliminés par centrifugation. Au liquide surnageant, on ajoute un volume égal de glycérol et la préparation de vaccin est conservée à -20 C.
Les tata d'inocuité et de pouvoir immunogène du vaccin chez le bétail donnent des résultats comparables à ceux obtenus avec un vaccin de tissus de souris.
Des cellules BHK 21 sont déposées en Angleterre à la "Medical Research Council's Division or Immunological Products
<Desc/Clms Page number 9>
Contrôla Hampstead, Londres, et sont disponibles également au Wistar Institute, Philadelphie, Etats-Unis d'Amérique.
REVENDICATIONS.
1.- Utilisation de cellules de la lignée de fibrocytes de ; rein de jeunes hamsters dorés, appelée BHK 21, ou des mêmes cellules modifiées par le virus du polyome pour la culture de virus suscep- bibles de se multiplier dans les cellules.
2. - Procédé de culture d'un virus du groupe formé par le virus de la fièvre aphteuse, du virus de la maladie de Newcastle, du virus de la peste aviaire, d'arbovirus, du virus d'herpes simplex, du. virus du trachome et de virus de la grippe dans une culture tissu- laire, caractérisé en ce que les cellules-hôtes utilisées sont des cellules de la lignée de fibrocytes de rein de jeunes hamsters dorés, appelée BHK 21, ou des mêmes cellules modifiées par le virus du poly- ome.