RU2014084C1 - Способ получения вирионной герпетической вакцины - Google Patents
Способ получения вирионной герпетической вакциныInfo
- Publication number
- RU2014084C1 RU2014084C1 SU5020401A RU2014084C1 RU 2014084 C1 RU2014084 C1 RU 2014084C1 SU 5020401 A SU5020401 A SU 5020401A RU 2014084 C1 RU2014084 C1 RU 2014084C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cells
- hours
- monolayer
- medium
- virus
- Prior art date
Links
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Использование: медицина, вирусология. Сущность изобретения: для культивирования клеток и выращивания вирусов при изготовлении герпетической вакцины используют микроноситель, выполненный в виде микрочастиц с размером 100 - 1300 мкм, преимущественно, в виде пористых микрочастиц асимметричной произвольной формы с размером 100 - 800 мкм на основе денатурированного коллагена. Микроноситель перемешивают в ростовой среде со скоростью 5 - 60 об/ мин и поддерживают в ней во взвешенном состоянии. Определены конкретные режимы культивирования клеток, выращивания и инактивации вирусов для получения вирионной инактивированной вакцины против вирусов простого герпеса 1 и 2 типов. 3 з.п. ф - лы.
Description
Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для производства вирионных инактивированных герпетических вакцин и диагностических препаратов.
Известен способ получения субъединичной герпетической вакцины, заключающийся в том, что в роллерной бутыле на ее стеклянной поверхности в постоянно перемешиваемой среде Игла с 10% сывороткой эмбрионов телят выращивают монослой клеток MRC5. Клеточный монослой инфицируют вирусом простого герпеса (ВПГ-1), штамм Troisbell, с дозой 5,0 БОЕ/кл и после 24 ч инкубации при 37оС проводят получение вирусного антигена, на основе которого готовят вакцину против простого вируса герпеса ВПГ-1 (см. патент США N 4816250, кл. 424-89, 1989).
В этом способе клетки и вирусы выращивают на поверхности роллерной бутыли, являющейся стационарным макроносителем. Ограниченная удельная поверхность макроносителя не обеспечивает достаточно больших урожаев клеток и вируса, что снижает эффективность процесса культивирования вируса этим способом и делает его технологически невыгодным при промышленном производстве вакцинных препаратов.
Известен способ культивирования клеток для получения вирусных препаратов на микроносителях, представляющих собой множество сферических микрочастиц (см. проспект фирмы "Pharmacia" "Microcarrier cell culture. Principles, methods", 1986, с. 26-31).
Культивирование клеток на сферических микрочастицах значительно повышает удельную поверхность взаимодействия клеток с носителем, что увеличивает эффективность этого процесса, особенно, когда в процессе выращивания микрочастицы поддерживают в ростовой среде во взвешенном состоянии, как это имеет место в способе, описанном в Crepsi С., Immamura T. et al. "Biotechnol. Bioeng. ", 1981, v. 23, 12, 2673. Однако не известен положительный результат применения этого способа для получения герпетических вакцин. До настоящего времени во всех известных способах получения герпетических вакцин клетки и вирусы выращивались на стационарном макроносителе в роллерных бутылях.
Известен способ изготовления инактивированной вирионной герпетической вакцины "Lupidon H" (из ВПГ-I) и "Lupidon G" (из ВПГ-2), в котором вирусы выращивают на куриных эмбрионах (см. Scriba M. ж. "Med. Microbiol. Immunol. ", 1982, v. 171, р. 33-42). Выращивание вирусов простого герпеса 1 и 2 типов на куриных эмбрионах нетехнологично и потому не получило распространения. Кроме того, вакцина, полученная этим способом, содержит следы куриных белков, которые могут вызывать аллергические осложнения у вакцинированных людей.
Известен способ изготовления инактивированной вирионной герпетической вакцины, созданной в научной лаборатории фирмы "Еli-Lilly" (Индианаполис, США) из ВПГ-1, выращенного в роллерных бутылях на стационарных носителях в культуре первичных почек кролика (см. Wise T.G. et al "I. Infect. Dis.", 1977, v. 136, р. 706-711).
Из-за технических трудностей получения большого количества антигена этим способом фирма прекратила выпуск вакцины.
За прототип принят способ изготовления инактивированной вирионной герпетической вакцины из вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, выращенных на поверхности роллерных сосудов, являющейся стационарным макроносителем, на культуре почек кролика (см. Андонов П. и др. "Вопросы вирусологии, 1979, N 6, с. 665-671). Поскольку в этом способе клетки и вирусы выращивают на стационарном макроносителе при постоянном перемешивании ростовой среды, то ему присущи те же недостатки, что и вышеописанным способом (ссылки 1, 5), а именно недостаточно высокий урожай вирусов и низкая производительность процесса выращивания, что делает невыгодным крупномасштабное, промышленное производство вакцины.
Задачей, на которую направлено заявляемое изобретение, является создание высокотехнологичного и высокопроизводительного способа получения герпетической вирионной инактивированной вакцины, пригодного для промышленного крупномасштабного ее производства.
Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения вирионной герпетической вакцины, заключающемся в образовании монослоя чувствительных клеток на носителе, помещенном в перемешиваемую ростовую среду, выращивании вируса, предварительно адаптированного к данной клеточной культуре, путем внесения инфицирующего материала, адсорбции вирусов на клетках, инкубировании инфицированных клеток в среде поддержки, сборе, очистки и инактивации вируса, смешивании его с адъювантом и лиофилизации, согласно изобретению в качестве носителя используют микрочастицы с размером 100-1300 мкм и концентрацией в ростовой среде 3,0-5,0 мг/мл, которые в процессе образования монослоя клеток и выращивания вируса поддерживают в среде во взвешенном состоянии путем перемешивания среды со скоростью 5-60 об/мин, при этом образование монослоя клеток ведут в течение 48,0-72,0 ч и перед постоянным перемешиванием осуществляют для прикрепления клеток к носителю периодическое их перемешивание в течение 1,0-2,0 мин первые 4,0-20,0 ч с интервалами 30-50 мин, а при выращивании вируса инфицированный материал вносят в дозе 0,05-0,1 БОЕ/кл, адсорбцию вирусов на клетках ведут в течение 1,0-2,0 ч, инкубирование инфицированных клеток проводят в течение 24,0-72,0 ч.
Использование в качестве носителя микрочастиц с размером 100-1300 мкм и концентрацией в ростовой среде 3,0-5,0 мг/мл, а также поддерживание их в процессе образования монослоя клеток и выращивания вирусов во взвешенном состоянии путем перемешивания среды со скоростью 5-60 об/мин, позволяет повысить урожайность вирусов за счет значительного увеличения поверхности контакта для роста монослоя клеток и репродуцировать их в более высоких титрах - 6,5-10,0 lg ТЦД50 вместо 4,5-5,0 lg ТЦД50 при применении стационарного макроносителя в известных методах выращивания вирусов. Особенно высокоэффективным является способ получения вакцины, при котором микроносители представляют собой пористые частицы асимметричной произвольной формы с размером от 100-800 мкм, изготовленные на основе денатурированного коллагена (желатины) с размером пор 50-80 мкм. Использование таких частиц обеспечивает высокую удельную поверхность, что позволяет резко увеличить выход клеточной биомассы. Оригинальная их структура обеспечивает существенное уменьшение механического повреждения клеток и вирусов при перемешивании за счет возможности применения низких скоростей перемешивания порядка 5-20 об/мин. Также упрощаются и ускоряются процессы снятия клеток с вирусами.
Подбор конкретных режимов образования монослоя клеток и выращивания вирусов позволил применить микроносители различных типов при изготовлении именно вирионной герпетической вакцины.
Двухэтапная инактивация вирусов формалином: в течение 68,0-76,0 ч при 37оС и в течение 7 сут при 4оС при соотношении объемов 1:2000 формалина и вируссодержащей суспензии, полученной в результате замораживания-оттаивания клеток, позволяет сохранить антигенность препарата, ее стабильность при надежном обезвреживании инфекционности вируса. Кроме того, установлено, что герпетическая вакцина, полученная заявляемым способом, обладает более высокой иммуногенностью за счет меньшего механического повреждения вирусов, что увеличивает ее клиническую эффективность по сравнению с герпетическими вакцинами, полученными известными способами, иммуногенность которых на 1,5 lg меньше, чем у вакцины, полученной известным способом.
Возможность осуществления изобретения приведена на примере изготовления герпетической вакцины с инактивированными штаммами двух вирусов простого герпеса: УС(ВПГ-1) и ВН(ВПГ-2), адаптированных серийным пассированием к культуре первичных клеток фибробластов куриного эмбриона (ККЭ). В качестве клеток могут быть также использованы перевиваемые линии клеток почек зеленой мартышки - Vero и 4647.
Суспензию диспергированных клеток вносят в культуральные емкости биореактора в конечной концентрации (1,0- 1,5)˙106 кл/мл для ККЭ и (0,2-0,8)˙106 кл/мл для линий Vero и 4647.
В качестве микроносителей могут быть использованы микроносители отечественного производства: Цитолар-2-денатурированный коллаген с размером частиц 140±30 мкм, Цитопол - синтетический полимер (поливиниловый спирт с желатиновым покрытием) с размером частиц до 200 мкм, и Цитогель - пористые микрочастицы асимметричной произвольной формы размером 100-800 мкм на основе денатурированного коллагена с размером пор 50-80 мкм. В качестве микроносителя могут быть использованы также микроносители зарубежного производства - Цитодекс-3, представляющий собой гранулы геля поперечно сшитого декстрана, покрытого коллагеном с размером частиц 133-1215 мкм. Концентрация микрочастиц носителя составляет 3,0-5,0 мг/мл.
Для культивирования клеток ККЭ используют ростовую среду 199 с 0,5% раствора гидролизата лактальбумина, содержащую до 10% прогретой сыворотки крупного рогатого скота (СКРС). Для клеток 4647 используют среду Игла с 7% СКРС с глутомином (1,2 мг/мл) и НЕРЕS (10 мМ). В среду добавляют антибиотики линкомицин (100 мкг/мл) или гентамицина сульфат в конечной концентрации, не превышающей 40 мкг/мл.
В биореакторы объемом 200-1500 мл загружают микроноситель и питательную среду. Для прикрепления клеток на микроносителе на начальном этапе культивирования используют среду в объеме 25% от конечного объема, периодически помешивания после засева клеток в течение 1,0-2,0 мин с интервалом 30-50 мин в течение первых 4-6 ч для Цитогеля и в течение первых 16-20 ч для остальных носителей. После завершения процесса прикрепления клеток к микрочастицам носителя объем среды доводят до конечного и обеспечивают постоянное перемешивание среды в реакторе, например, мешалками со скоростью 5-20 об/мин для Цитогеля и со скоростью 40-60 об/мин для остальных микроносителей в течение 48-72 ч для поддерживания микрочастиц в среде во взвешенном состоянии. В течение этого времени клетки активно размножаются на микроносителе и образуют монослой. Причем индекс пролиферации для клеток Vero на Цитогеле составил 10,0 lg ТЦД50, на Цитоларе - 2-8,0 lg ТЦД50, на Цитодексе - 3-9,0 lg ТЦД50, а для клеток ККЭ на Цитогеле составил 6,6 lg ТЦД50, на Цитоларе - 2-3,9 lg ТЦД50, на Цитодексе - 3-4,0 lg ТЦД50. После образования монослоя клеток питательную среду роста удаляют, а микроносители с клетками оставляют в реакторе и вносят инфицирующий материал либо штамм УС (ВПГ-1), либо штамм ВН (ВПГ-2) в объеме 1/3-1/4 от объема среды роста в дозе 0,05-0,1 БОЕ/кл. Адсорбцию вирусов на клетках проводят при 37оС в режиме постоянного перемешивания микрочастиц в течение 1,5±0,5 ч. После чего жидкость с неадсорбированным вирусом сливают и сосуды заполняют поддерживающей средой. Инкубирование инфицированных клеток проводят в течение 24-72 ч до развития ЦПД в клетках на 80-90%. Далее осуществляют слив вируссодержащей жидкости, замораживание ее при минус 20оС для разрушения клеток и оттаивание. Затем в нее вносят формалин в конечной концентрации 1:2000. Инактивацию вируса формалином проводят двухэтапно в течение 68,0-76,0 ч при 37оС и в течение 7 сут при 4оС, что позволяет сохранить антигенность препарата.
Затем проводят осветление материала при низкоскоростном центрифугировании, получая полуфабрикат моновакцины. После контроля на стерильность и иммуногенность производят сведение моновакцин в дивакцинную серию, добавление сахарозно-желатинного стабилизатора, розлив вакцины по ампулам и лиофилизацию, в результате которой продлевается срок годности вакцины до 2 лет.
Ниже приводится характеристика герпетической дивакцины, полученной заявляемым способом:
Объем вакцины в ампуле 0,3 мл; количество белка - не более 500 мкг/мл (предел 2000 мкг/мл); белок сыворотки крупного рогатого скота - не более 0,5 мкг/мл; концентрация остаточного формалина - не более 0,045; содержание стабилизатора: сахарозы - не более 7,5%, желатозы не более 1%; остаточная влажность - не более 2,5%; рН 7,5 ±0,2; препарат стерилен; препарат специфически безвреден; препарат не токсичен; препарат способен индуцировать синтез вируснейтрализующих антител у животных. Индекс нейтрализации ВПГ-1 (шт. УС) - 3,0 lg ТЦД50/мл ВПГ-2 (шт. ВН) - 1,75 lg ТЦД50/мл.
Объем вакцины в ампуле 0,3 мл; количество белка - не более 500 мкг/мл (предел 2000 мкг/мл); белок сыворотки крупного рогатого скота - не более 0,5 мкг/мл; концентрация остаточного формалина - не более 0,045; содержание стабилизатора: сахарозы - не более 7,5%, желатозы не более 1%; остаточная влажность - не более 2,5%; рН 7,5 ±0,2; препарат стерилен; препарат специфически безвреден; препарат не токсичен; препарат способен индуцировать синтез вируснейтрализующих антител у животных. Индекс нейтрализации ВПГ-1 (шт. УС) - 3,0 lg ТЦД50/мл ВПГ-2 (шт. ВН) - 1,75 lg ТЦД50/мл.
Claims (4)
1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРИОННОЙ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ВАКЦИНЫ, включающий образование монослоя чувствительных клеток на носителе, находящемся в перемешиваемой ростовой среде, инфицирование монослоя, адсорбцию вирусов на клетках, инкубирование инфицированных клеток в среде поддержки, сбор, очистку и инактивацию вируса с последующим смешиванием его с адъювантом и лиофилизацией, отличающийся тем, что в качестве носителя используют микрочастицы с размером 100 - 1300 мкм и с концентрацией 3,0 - 5,0 мг/мл, перемешивание среды ведут со скоростью 5 - 60 об/мин, при этом для образования монослоя клетки культивируют в течение 48 - 72 ч, причем в интервале от 4 до 20 ч среду перемешивают периодически через 30 - 50 мин в течение 1 - 2 мин, инфицирование монослоя осуществляют в дозе 0,05 - 0,1 БОЕ/кл, адсорбцию проводят в течение 1 - 2 ч, а инкубирование - в течение 24 - 72 ч.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что микрочастицы носителя изготовлены из пористого материала на основе денатурированного коллагена с размером по 50 - 80 мкч и имеют произвольную асимметричную форму с размером 100 - 800 мкм.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для инактивации используют вирус, полученный в результате замораживания и последующего оттаивания клеток, а инактивацию осуществляют формалином в два этапа - вначале в течение 68 - 76 ч при 37oС и затем в течение 7 сут при 4oС при соотношении объемов формалина и вируса 1 : 2000.
4. Способ по п.2, отличающийся тем, что культивирование на пористых частицах проводят со скоростью перемешивания 5 - 20 об/мин.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5020401 RU2014084C1 (ru) | 1991-12-28 | 1991-12-28 | Способ получения вирионной герпетической вакцины |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU5020401 RU2014084C1 (ru) | 1991-12-28 | 1991-12-28 | Способ получения вирионной герпетической вакцины |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014084C1 true RU2014084C1 (ru) | 1994-06-15 |
Family
ID=21593516
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU5020401 RU2014084C1 (ru) | 1991-12-28 | 1991-12-28 | Способ получения вирионной герпетической вакцины |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2014084C1 (ru) |
-
1991
- 1991-12-28 RU SU5020401 patent/RU2014084C1/ru active
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2002338666B2 (en) | Multiplication of viruses in a cell culture | |
JP5264812B2 (ja) | Mdck細胞懸濁培養物において薬物または診断剤の活性成分を生成する方法 | |
US6194210B1 (en) | Hepatitis A virus culture process | |
US4024020A (en) | Method of cell culture on polyacrylonitrile surface | |
CN101352570A (zh) | 二倍体细胞狂犬疫苗及纯化狂犬疫苗的制备方法 | |
CN114276981B (zh) | 一种适应猪流行性腹泻病毒的Vero-E6悬浮细胞株sVero-E6及其应用 | |
JP2024071406A (ja) | ベロ細胞培養用低血清培地組成物およびその利用 | |
US4169761A (en) | Process for the cultivation of viruses | |
US3935066A (en) | Cell lines | |
RU2082757C1 (ru) | Субстрат для культивирования флавивирусов или ареновирусов на основе культуры клеток и способ получения антигена флавивируса или ареновируса | |
US5719051A (en) | Perfusion system and a method for the large scale production of virus or virus antigen | |
RU2014084C1 (ru) | Способ получения вирионной герпетической вакцины | |
JPS62500351A (ja) | 微粒子担体からの足場依存性細胞の分離 | |
CN102115728B (zh) | 无血清动物细胞培养基干粉、液体培养基及其制备方法 | |
WO2004110484A1 (fr) | Procede de production d'un vaccin vivant de culture contre le virus de la grippe | |
WO1985005375A1 (en) | Methods for culturing diploid cells on cellulose fibers | |
GB2104081A (en) | Production of plasminogen activator | |
RU2142816C1 (ru) | Способ получения антигерпетической вакцины и лекарственная форма на ее основе | |
RU2201958C2 (ru) | Сухая стерильная малосывороточная питательная среда для культивирования клеток млекопитающих | |
CN114306587B (zh) | 一种低血清乙型脑炎灭活疫苗的制备方法及乙型脑炎灭活疫苗 | |
RU2053297C1 (ru) | Способ культивирования вируса кори | |
SU1317021A1 (ru) | Штамм диплоидных клеток кожи и мышц эмбриона человека,используемый дл культивировани вирусов | |
Tatiana et al. | Primary cell culture. Cell culture | |
Hayle | Culture of respiratory syncytial virus infected diploid bovine nasal mucosa cells on cytodex 3 microcarriers | |
SU770195A1 (ru) | Способ культивировани вирусов |