CN109602900A - 鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品 - Google Patents

鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品 Download PDF

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Abstract

本发明公开了鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品。本发明将鸡胚成纤维细胞细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞；本发明进一步提供了一种制备鸡马立克氏病病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)将所述适应无血清培养基呈悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的细胞接种鸡马立克氏病病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，(3)将病毒液离心；将沉淀细胞裂解、过滤、冷冻干燥，即得。本发明制备方法所制备的活疫苗安全性好，具有良好的免疫保护效力；有效降低了污染风险和生产成本，缩短了疫苗的生产时间，便于进行扩大生产规模。

Description

鸡马立克氏病毒活疫苗的制备方法及其产品
技术领域
本发明涉及鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备方法及其产品，尤其涉及采用无血清悬浮培养技术制备鸡马立克氏病病毒活疫苗的方法以及得到的鸡马立克氏病病毒活疫苗产品，属于鸡马立克氏病病毒活疫苗活疫苗的制备领域。
背景技术
马立克氏病(MD)是由疱疹病毒科细胞结合性(CA)马立克氏病病毒(MDV)引起鸡淋巴组织增生性肿瘤的一种高度接触性传染病。随着养鸡业的集约化程度的提高，该病带来的危害也在日益增大，防治不当将引起鸡群死亡、生产性能下降或产品质量降低，同时还能因其严重的免疫抑制作用而减弱其它疫苗的预防效果。因此马立克氏病的预防成为养鸡业的重中之重。MD是目前唯一能用疫苗进行预防的鸡肿瘤病。对于MD预防和控制，疫苗的使用是目前以及将来唯一的预防或控制途径。
DF-1细胞起源于鸡胚成纤维细胞，现已经成为一种成熟的传代细胞系。DF-1细胞体外培养具有很强的增殖能力，其细胞的密度能够超过CEF4倍以上。DF-1细胞是逆转录酶阴性、非致瘤性的细胞。DF-1细胞系是经美国食品与药物管理局(FDA)授权的全球商业化细胞系，目前已被广泛应用于禽类病毒的增殖、重组蛋白的表达、肿瘤病毒的研究及动物和人类疫苗的生产。
传统的DF-1培养大多采用血清贴壁的方式，该培养方式工艺复杂，占地面积大，需大量人工操作并且在培养过程中需要添加血清，增加了被外源病毒、支原体等污染的可能性，而且不同批次间的血清差异也会导致产品质量难以控制，同时也加大了下游分离纯化的难度。与血清贴壁培养技术相比，无血清悬浮培养技术无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，降低了污染风险和生产成本，缩短了生产时间。由于无血清悬浮培养技术不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。因此，无血清悬浮培养技术是细胞工业化生产疫苗的必然趋势。
因此，将DF-1细胞进行全悬浮驯化培养获得适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的细胞以及将其应用于鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备，对于降低鸡马立克氏病毒活疫苗的生产成本和污染风险、进行规模化生产等均具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞；
本发明的目的之二是应用所驯化获得的适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞细胞(DF-1细胞)制备鸡马立克氏病病毒活疫苗，该制备方法采用悬浮培养技术降低鸡马立克氏病病毒活疫苗的生产成本和污染风险，能够进行规模化工业生产。
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明将传代鸡胚成纤维细胞(DF-1细胞)经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得一株适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞，该细胞被命名为DF-1-XF。
本发明首先采用逐步降低血清的方法驯化DF-1细胞以适应低浓度血清培养：本发明将含10％新生牛血清的MEM培养液中稳定生长的DF-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×105cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中；经过数代后，DF-1细胞在含5％新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养；以同样的方法使DF-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。随着血清使用浓度的降低，DF-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。DF-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，仅有个别细胞呈现出稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，DF-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮DF-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明DF-1细胞已经适应了无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态；本发明经贴壁培养阶段的低血清驯化过程和无血清培养基悬浮驯化过程获得的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1细胞命名为DF-1-XF细胞。
本发明将驯化培养获得适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞提交到专利认可的机构进行保藏，其保藏编号是：CGMCCNo.16295，分类命名是：适应全悬浮生长的传代鸡胚成纤维细胞；保藏日期是：2018年9月6日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理中心普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明进一步的应用所述的适应无血清培养基且呈单细胞悬浮生长状态的DF-1-XF细胞制备鸡马立克氏病病毒活疫苗，包括：
(1)将DF-1-XF细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；(2)向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡马立克氏病毒进行病毒增殖培养后收获病毒液，(3)将收获的病毒液离心，弃去上清，向沉淀细胞加入稳定剂后进行裂解，过滤，冷冻干燥，即得鸡马立克氏病毒活疫苗。
本发明将DF-1-XF细胞分别以初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml和0.75×106cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，每隔24小时取样计数，结果表明细胞初始接种密度为0.75×106cells/ml，培养48小时细胞密度可达3.0×106cells/ml以上，适合大生产需求；因此，步骤(1)将DF-1-XF细胞按照0.75×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；另外，步骤(1)中所述的细胞悬浮增殖培养条件还包括：pH值、溶氧、温度和搅拌转速等条件，这些参数均可以采用常规的细胞悬浮培养的参数进行培养，作为参考，所述pH可以控制为7.2、溶氧值可以控制(DO)为50％、培养温度可以控制为37℃、搅拌转速可以控制为50--500r/min。
本发明在血清浓度为1％、细胞初始接种密度0.75×106个/ml、pH为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃的条件下，将DF-1-XF细胞分别以60r/min、80r/min、100r/min和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行DF-1细胞悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。结果发现，当搅拌转速为100r/min时，细胞增殖最快，48小时细胞密度可达3.2×106cells/ml；因此在步骤(1)中进行细胞悬浮增殖培养时，所采用的搅拌转速优选为100r/min。
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养36小时、48小时和60小时按2v/v％接种鸡马立克氏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适接毒剂量。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。
本发明进一步发现，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡马立克氏病毒的接毒时间对于病毒的增殖培养效果的影响较大：
本发明将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养24小时、36小时、48小时和60小时按每毫升2×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后48小时取样测定病毒含量。结果表明，细胞培养36h后接种鸡马立克氏病毒，病毒滴度可达10.6×106PFU/ml。因此，步骤(2)中优选将DF-1-XF细胞悬浮增殖培养36小时接种鸡马立克氏病毒。
本发明进一步发现，向悬浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡马立克氏病毒的接毒剂量以及收获病毒液的时间对于鸡马立克氏病毒的增殖培养效果的影响也非常显著：
本发明将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养36小时后，分别以以每毫升2×103PFU、5×103PFU、10×103PFU、15×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后48小时取样测定病毒含量。结果表明，接毒剂量为每毫升5×103PFU，接毒后48小时病毒毒价可达12.7×106PFU/ml。因此，步骤(2)优选浮增殖培养后的DF-1-XF细胞接种鸡马立克氏病毒的最佳接毒剂量为每毫升5×103PFU。
本发明将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养36小时后，以每毫升5×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后每个12小时取样测定病毒含量。结果表明，接毒后48小时病毒毒价可达12.8×106PFU/ml；因此，步骤(2)中所述的收毒最佳时间为接毒后48小时。
步骤(3)中所述的离心优选在2000r/min的条件下离心10min；所述的裂解方法优选采用超声波裂解器进行裂解的方法。
本发明鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备方法采用无血清悬浮培养技术，与血清贴壁培养技术相比，本发明制备方法无需昂贵的微载体，省去了消化收获细胞的操作，显著降低了污染风险和生产成本，有效缩短了生产时间；不需要贴附基质，可节约设备空间，提高设备利用率，便于扩大生产规模。本发明制备方法所制备的鸡马立克氏病病毒活疫苗安全性好；免疫保护效力检验的实验结果表明，所制备的鸡马立克氏病病毒活疫苗对于鸡只具有良好的免疫保护效力。
附图说明
图1DF-1细胞驯化过程中的细胞形态变化；A:悬浮培养初期；B:悬浮培养后期。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1适应无血清培养基且呈悬浮生长状态的DF-1细胞的驯化培养
采用逐步降低血清的方法驯化DF-1细胞以适应低浓度血清培养。将含10％新生牛血清的MEM培养液中稳定生长的DF-1细胞长至对数生长中期时，更换为含5％新生牛血清的MEM培养液，待细胞长至80％～90％的汇合度时，胰蛋白酶消化细胞，以细胞密度为2.0×105cells/ml传代于含5％新生牛血清的MEM培养液中。经过数代后，DF-1细胞在含5％新生牛血清的MEM培养液中的存活率维持在90％以上，并保持较快生长速率，作进一步降低血清驯化培养。以同样的方法使DF-1细胞逐步适应含1％新生牛血清的MEM培养条件。将适应了1％新生牛血清培养条件的DF-1细胞在细胞三角瓶中进行悬浮培养驯化适应。细胞培养液为上海源培DF-1无血清培养基，细胞初始接种密度为1.0×106cells/ml，转速设置为160r/min，置于5％CO2培养箱中进行悬浮培养。
随着血清使用浓度的降低，DF-1细胞贴壁生长的形态逐步发生改变，最终经无血清驯化适应后细胞呈现出单细胞悬浮生长状态。DF-1细胞从血清浓度10％降到5％，细胞未出现肉眼可见的形态差异，没有表现出不适应。当血清浓度降低至1％时，细胞生长速度减慢，经过传代后，细胞适应了血清浓度为1％的营养条件，生长速度恢复，但细胞形态出现变圆的趋势，各别细胞呈现出稍稍悬浮生长的状态。被动悬浮培养适应，DF-1细胞呈现出细胞悬浮生长的形态，但细胞结团现象严重，个别细胞团较大。在悬浮培养驯化后期，悬浮DF-1细胞呈现较好的单细胞悬浮生长状态，细胞呈圆球形，结团现象较少，胞体大小基本一致，生长速度正常，说明DF-1细胞已经适应了无血清悬浮状态生长，将其命名为DF-1-XF细胞。
实施例2鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮培养，培养时间为36小时；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为100r/min；
(2)向悬浮增殖培养36小时的DF-1-XF细胞按照每毫升5×103PFU的接种剂量接种鸡马立克氏病病毒CVI988株进行病毒增殖培养；接种48小时后收获病毒液；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为120r/min；经检测，病毒毒价为12.8×106PFU/ml。
(3)将收获的病毒液2000r/min离心10min，弃去上清，沉淀细胞加入适量稳定剂，用超声波裂解器进行裂解，经纱布过滤，分装，每羽份应≥2000PFU；分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡马立克氏病病毒活疫苗。
实施例3鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.3×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为60r/min；
(2)向悬浮增殖培养72小时的DF-1-XF细胞按照每毫升2×103PFU的接种剂量接种鸡马立克氏病病毒CVI988株进行病毒增殖培养；接种72小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为9.8×106PFU/ml；
(3)将收获的培养液2000r/min离心10min，弃去上清，沉淀细胞加入适量稳定剂，用超声波裂解器进行裂解，经纱布过滤，分装，每羽份应≥2000PFU；分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡马立克氏病病毒活疫苗。
实施例4鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为120r/min；
(2)向悬浮增殖培养24小时的DF-1-XF细胞按照每毫升10×103PFU的接种剂量接种接种鸡马立克氏病病毒CVI988株进行病毒增殖培养；接种24小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为8.7×106PFU/ml；
(3)将收获的培养液2000r/min离心10min，弃去上清，沉淀细胞加入适量稳定剂，用超声波裂解器进行裂解，经纱布过滤，分装，每羽份应≥2000PFU；分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡马立克氏病病毒活疫苗。
实施例5鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备
(1)将实施例1所驯化培养获得的DF-1-XF细胞按照0.5×106cells/ml为细胞初始接种密度接种到7L生物反应器中进行细胞悬浮增殖培养；其它悬浮培养条件如下：pH控制为7.2、溶氧(DO)控制为50％、温度控制为37℃、搅拌转速控制为120r/min；
(2)向悬浮增殖培养48小时的DF-1-XF细胞按照每毫升15×103PFU的接种剂量接种接种鸡马立克氏病病毒CVI988株进行病毒增殖培养；接种60小时后收获病毒液；经检测，病毒毒价为9.3×106PFU/ml；
(3)将收获的培养液2000r/min离心10min，弃去上清，沉淀细胞加入适量稳定剂，用超声波裂解器进行裂解，经纱布过滤，分装，每羽份应≥2000PFU；分装后迅速进行冷冻真空干燥，得到鸡马立克氏病病毒活疫苗。
试验例1鸡马立克氏病病毒活疫苗的制备工艺参数优化试验
1.试验方法
1.1细胞悬浮培养条件的优化
1.1.1细胞初始接种密度的优化
将DF-1-XF细胞分别以0.3×106个/ml、0.5×106个/ml和0.75×106个/ml三个初始密度接种于生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。其它悬浮培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速为100r/min。
1.1.2搅拌转速的优化
将DF-1-XF细胞分别以60r/min、80r/min、100r/min和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行DF-1细胞悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。其它悬浮培养条件：血清浓度为1％、细胞初始接种密度0.75×106个/ml、pH为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃。
1.2病毒悬浮培养参数优化
1.2.1接毒时间的优化
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养24、36、48和60小时按每毫升2×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后48小时取样测定病毒含量，以确定最适接毒时间。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。
1.2.2接毒剂量的优化
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养36小时后，分别以每毫升接种2×103PFU、5×103PFU、8×103PFU、10×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后48小时取样测定病毒含量，以确定最适接毒剂量。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。
1.2.3收毒时间的优化
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养36小时后，以每毫升接种5×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，培养过程中每隔24小时取样，测定病毒含量，以确定最适收毒时间。其他培养条件：pH控制为7.2、溶氧(DO)为50％、温度37℃、搅拌转速设置为100r/min。
2.试验结果
2.1细胞初始接种密度优化结果
将DF-1-XF细胞分别以初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml和0.75×106cells/ml接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养，每隔24小时取样计数，结果表明细胞初始接种密度为0.75×106cells/ml，培养48小时细胞密度可3.0×106cells/ml以上，适合大生产需求，结果见表1。因此选择0.75×106cells/ml为细胞初始接种密度。
表1不同细胞接种密度与悬浮细胞生长速度的关系
2.2搅拌转速的优化结果
将DF-1-XF细胞分别以60r/min、80r/min、100r/min和120r/min四个搅拌转速，接种于7L生物反应器中进行悬浮培养，培养过程中每隔24小时取样计细胞数。结果表明当搅拌转速为100r/min时，细胞增殖最快，48小时细胞密度为3.2×106cells/ml，结果见表2。因此选择搅拌转速100r/min。
表2不同搅拌转速与悬浮细胞生长速度的关系
2.3接毒时间的优化结果
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的初始密度接种于生物反应器中，分别于细胞培养24小时、36小时、48小时和60小时按每毫升2×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后48小时取样测定病毒含量。结果表明，细胞培养36h后接种鸡马立克氏病毒，病毒滴度最高可达10.6×106PFU/ml，结果见表3。因此选择最佳接毒时间为细胞培养36h。
表3不同接毒时间对病毒含量的影响
2.4接毒剂量的优化结果
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养36小时后，分别以以每毫升2×103PFU、5×103PFU、10×103PFU、15×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后48小时取样测定病毒含量。结果表明，接毒剂量为每毫升5×103PFU，接毒后48小时病毒毒价最高可达12.7×106PFU/ml，结果见表4。因此选择最佳接毒剂量为每毫升5×103PFU。
表4不同接毒剂量对病毒含量的影响
2.5收毒时间的优化结果
将DF-1-XF细胞以0.75×106个/ml的密度接种于7L生物反应器中，细胞培养36小时后，以每毫升5×103PFU的接毒量接种鸡马立克氏病毒，接毒后每个12小时取样测定病毒含量。结果表明，接毒后48小时病毒毒价最高可达12.8×106PFU/ml，结果见表5。因此选择最佳收毒时间为接毒后48小时。
表5不同收毒时间对病毒含量的影响
试验例2鸡马立克氏病病毒活疫苗的安全性试验
用1-3日龄SPF雏鸡20只，分成2组。免疫组10只，各肌肉或皮下注射疫苗(实施例1所制备的活疫苗)0.2ml(含10个使用剂量)，对照组10只，不接种病毒，14日后免疫组与对照组均健活，无特异性死亡。试验结果证明，本发明方法所制备的鸡马立克氏病病毒活疫苗具有良好的安全性。

Claims (10)

1.一种制备鸡马立克氏病毒活疫苗的方法，其特征在于，包括：(1)将鸡胚成纤维细胞经过驯化培养得到的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞；(2)将步骤(1)驯化培养得到的细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中进行细胞悬浮增殖培养；(3)向悬浮增殖培养后的细胞接种鸡马立克氏病病毒进行病毒增殖培养；收获病毒液，(4)将收获的病毒液离心；取沉淀细胞裂解、过滤，冷冻干燥，即得鸡马立克氏病病毒活疫苗。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述的适应无血清培养基、呈单细胞悬浮生长状态的传代鸡胚成纤维细胞的微生物保藏编号是：CGMCC No.16295。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中将细胞按照初始密度为0.3×106cells/ml、0.5×106cells/ml或0.75×106cells/ml的接种密度接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养；优选的，步骤(1)中将细胞按照初始密度为0.75×106cells/ml的接种密度接种于细胞培养瓶中进行悬浮培养。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中将经过驯化培养得到的传代鸡胚成纤维细胞接种到生物反应器或细胞培养瓶中在搅拌的条件下进行细胞悬浮增殖培养；其中，所采用的搅拌转速为50-500r/min；优选为60-120r/min；最优选为100r/min。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的细胞悬浮增殖培养的条件还包括：pH值为7.2、溶氧值为50％、培养温度为37℃。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中向悬浮增殖培养24-60小时后的细胞接种鸡马立克氏病毒进行病毒增殖培养；优选的，步骤(2)中向悬浮增殖培养36小时的细胞接种鸡马立克氏病毒进行病毒增殖培养。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，以每毫升接种2×103PFU、5×103PFU、8×103PFU或10×103PFU的接毒量向细胞接种鸡马立克氏病毒；优选的，以每毫升接种5×103PFU的接毒量向细胞接种鸡马立克氏病毒。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的病毒增殖培养条件还包括：pH值为7.2、溶氧为50％、温度37℃、搅拌转速为100r/min。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中病毒增殖培养24-72小时收获病毒液；优选的，步骤(2)中病毒增殖培养48小时收获病毒液。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的离心在转速为2000r/min的条件下离心10min；所述的裂解采用超声进行裂解。
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