BE1022256B1

BE1022256B1 - Nouveau procede

Info

Publication number: BE1022256B1
Application number: BE2014/0418A
Authority: BE
Inventors: Clèmentine Mascaux
Original assignee: Glaxosmithkline Biologicals S.A.
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2016-03-04
Also published as: EP3004886A1; CA2913025A1; ES2775209T3; EP3004886B1; BR112015030346A2; US20160131652A1; CN105247369A; US10060928B2; JP2016520842A; GB201310151D0; WO2014195387A1

Abstract

La présente invention propose des procédés de détermination de la teneur en endotoxine d'un sel d'aluminium pour une utilisation en médecine, comprenant les étapes suivantes : a. le mélange de sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b. la séparation du sel d'aluminium de 1'endotoxine ; et c. la mesure de la quantité d'endotoxine.

Description

NOUVEAU PROCEDE

Domaine de l'invention '

La présente invention propose un procédé de détermination de la teneur en endotoxine dans une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine, en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans des vaccins.

Contexte de l'invention

Une analyse (LAL) des pyrogènes ou des endotoxines est requise pour les médicaments parentéraux. Les dosages classiques des endotoxines ne peuvent pas être utilisés pour tester la teneur en endotoxine des sels d'aluminium. Le contrôle d'endotoxine ajouté au produit n'est pas récupéré à cause de sa propriété d'interaction avec le sel d'aluminium. Les critères de validité des dosages nécessitent la récupération et la capacité de mesurer l'endotoxine contrôle dans des concentrations d'aluminium en masse. Etant donné cette interaction, il est généralement considéré que les tests classiques pour les endotoxines sont inappropriés pour l'analyse d'endotoxine dans des adjuvants à base de sels d'aluminium. Le seul test approprié pour la détermination d'endotoxine est le test des pyrogènes du lapin qui implique l'injection du sel d'aluminium chez des lapins. Des procédés améliorés sont nécessaires. Résumé de l'invention

La présente invention propose des procédés pour quantifier de manière exacte l'endotoxine dans une préparation de sel d'aluminium. L'invention propose des procédés pour la détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a) le mélange du sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b) la séparation du sel d'aluminium de l'endotoxine ; et c) la mesure de la quantité d'endotoxine. L'invention propose en outre des procédés de fabrication d'un tampon de désorption pour une utilisation dans un procédé de détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a) le mélange d'une base telle que définie ici, d'un agent chélateur de métaux tel que défini ici et d'eau ; éventuellement b) l'agitation du mélange (en particulier pendant un temps égal ou supérieur à 30 secondes, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 minutes) ; et éventuellement c) l'incubation du mélange pendant un temps égal ou supérieur à 5, 10, 15, 20, 25, ou 30 minutes.

Description détaillée

La présente invention propose un procédé de détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a) le mélange du sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b) la séparation du sel d'aluminium de l'endotoxine ; et c) la mesure de la quantité d'endotoxine.

La présente invention propose un procédé de détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a) le mélange du sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b) la centrifugation du mélange, séparant de cette manière le sel d'aluminium de l'endotoxine ; et c) la mesure de la teneur en endotoxine du surnageant.

La présente invention propose en outre un procédé de détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a) le mélange du sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b) la centrifugation du mélange, séparant de cette manière le sel d'aluminium de l'endotoxine ; c) le transfert du surnageant dans un réceptacle apyrogène ; et d) la mesure de la teneur en endotoxine dudit surnageant.

Le terme « endotoxine » est utilisé ici pour signifier celle définie dans la Pharmacopée Européenne 5.1.10, c'est-à-dire que cette endotoxine est considérée comme consistant en lipopolysaccharides (LPS) et/ou en lipo-oligosaccharides (LOS) dérivés de bactéries à Gram négatif.

Après l'étape de mélange et avant l'étape de séparation/ centrifugation, la préparation de sel d'aluminium et le tampon de désorption peuvent être incubés afin d'assurer que toute endotoxine liée au sel d'aluminium soit désorbée. Par conséquent, il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels le mélange sel d'aluminium et tampon de désorption est incubé pendant un temps supérieur à 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 heures. Dans un mode de réalisation particulier, la période d'incubation est inférieure à 96 ou 72 heures, c'est-à-dire que la période d'incubation se situe entre 1 et 96 heures, 5 et 72 heures, 10 et 48 heures, 15 et 36 heures, ou entre 20 et 28 heures. Dans un mode de réalisation particulier, le mélange n'est pas agité durant la période d'incubation.

La préparation de sel d'aluminium et le tampon de désorption sont mélangés de manière appropriée dans un rapport entre 1/9 et 9/1, par exemple 2/8, 3/7, 4/6, 5/5, 6/4, 7/2 ou 8/2. Dans des modes de réalisation particuliers, la préparation de sel d'aluminium et le tampon de désorption sont mélangés dans un rapport entre 3/7, 4/6, 5/5, 6/4, 7/3, en particulier 4/6, 5/5 et 6/4.

Les procédés de l'invention peuvent être réalisés à toute température qui permet la désorption de l'endotoxine à partir du sel d'aluminium. De manière appropriée, il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels ladite incubation est réalisée à une température entre 10 °C et 70 °C, par exemple entre 20 °C et 65 °C, 20 °C et 60 °C, 15 °C et 30 °C, entre 17 °C et 28 °C, entre 19 °C et 26 °C, entre 21 °C et 23 °C, ou environ à la température ambiante (environ 22 °C).

Les procédés de l'invention peuvent comprendre une étape d'agitation du mélange du sel d'aluminium et du tampon de désorption afin d'assurer que le tampon de désorption soit mélangé avec la composition d'aluminium. De manière appropriée, il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels le mélange du sel d'aluminium et du tampon de désorption est agité après l'étape a) pendant plus de 30 secondes, 40 secondes, 50 secondes, 1 minute, 1 minute 30 secondes ou 2 minutes.

Tout tampon qui facilite la désorption de l'endotoxine peut être utilisé dans les procédés de l'invention. Les tampons de désorption appropriés pour une utilisation dans les présents procédés peuvent être déterminés par exposition d'un tampon candidat à un sel d'aluminium comprenant une quantité connue d'endotoxine (par exemple 20 UE/ml), incubation pendant approximativement 24 heures +/- 4 heures à température ambiante, centrifugation à 10 000 tr/min +/- 1000 tr/min pendant 10 minutes +/- 1 min et ensuite réalisation d'un test LAL sur le surnageant. Un tampon qui désorbe entre 50 et 200 % de l'endotoxine est considéré comme un tampon de désorption approprié.

Il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels ledit tampon de désorption comprend un sel et un agent chélateur de métaux. Les sels appropriés sont bien connus de l'homme du métier et comprennent, mais sans y être limités, le Na2HP04- Le Na2HP04 est généralement utilisé dans une quantité entre 15 % et 25 %, par exemple environ 18 %, par exemple 17,8 %, EDTA 0,224 %, pH 8,0.

Dans certains modes de réalisation, en particulier dans lesquels les procédés de l'invention sont utilisés pour déterminer la teneur en endotoxine d'un hydroxyde d'aluminium, le tampon de désorption peut comprendre un autre sel, par exemple, le NaCl. Lorsque du NaCl est utilisé, le tampon de désorption comprend généralement entre 5 et 250 mM de NaCl.

Les agents chélateurs de métaux appropriés sont bien connus de l'homme du métier et comprennent, mais sans y être limités, 1'EDTA (acide éthylène-diamine-tétra-acétique) . L'EDTA est généralement utilisé dans une quantité entre 0,2 et 0,3 %, par exemple environ 0,22 %, par exemple 0,224 %.

Le tampon de désorption peut être à tout pH qui facilite la désorption de l'endotoxine à partir du sel d'aluminium. Dans un mode de réalisation, le tampon de désorption de l'invention a un pH supérieur à 5,5, en particulier lorsque le tampon de désorption est utilisé pour désorber l'endotoxine à partir de phosphate d'aluminium. Il est proposé un procédé de l'invention dans lequel ledit tampon de désorption est à un pH entre environ pH 7 et pH 9. Dans un mode de réalisation particulier, il est proposé un tampon de désorption qui est à un pH d'environ pH 8 (par exemple à un pH entre 7,5 et 8,5).

Dans un mode de réalisation, le tampon de désorption de l'invention a un pH supérieur à pH 9,5, en particulier lorsque le tampon de désorption est utilisé pour désorber l'endotoxine à partir d'hydroxyde d'aluminium. Il est proposé un procédé de l'invention dans lequel ledit tampon de désorption est à un pH entre environ pH 9,5 et pH 10,5. Dans un mode de réalisation particulier, il est proposé un tampon de désorption qui est à un pH d'environ pH 10. Dans un mode de réalisation particulier, le pH est inférieur à pH 10,5.

Le tampon de désorption peut être à toute température qui empêche la précipitation d'un ou de plusieurs des composants du tampon, en particulier lorsqu'il est stocké concentré, par exemple concentré entre 1,5 et 2 fois. De manière appropriée, il est proposé un procédé de l'invention dans lequel ledit tampon de désorption est stocké à une température entre environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C.

Le tampon de désorption est idéalement dépourvu d'endotoxine, de manière appropriée il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels le tampon de désorption est pratiquement dépourvu d'endotoxine, c'est-à-dire qu'aucune endotoxine ne peut être détectée en utilisant une technique quelconque connue de l'homme du métier. L'endotoxine est désorbée à partir du sel d'aluminium et de manière appropriée séparée afin de permettre l'analyse de la teneur en endotoxine. La séparation peut être réalisée en utilisant tout procédé connu de l'homme du métier. De manière appropriée, il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels le mélange est centrifugé à une force requise pour transformer en culot le sel d'aluminium et maintenir l'endotoxine dans le surnageant. En particulier, il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels le mélange du tampon de désorption et du sel d'aluminium est centrifugé à une vitesse entre 1000 et 1500 x g, par exemple approximativement 1118 x g.

La teneur en endotoxine désorbée peut être mesurée selon tout test disponible pour l'homme du métier pour la mesure de l'endotoxine. En particulier, il est proposé des procédés de l'invention dans lesquels la teneur en endotoxine est mesurée. En particulier, il est proposé des procédés dans l'invention dans lesquels la teneur en endotoxine est quantifiée. Les procédés disponibles et connus de l'homme du métier comprennent, mais sans y être limités, le test LAL (lysat d'amoebocyte de limule) , le test d'activation des monocytes ou le procédé EndoLISA. En particulier, l'endotoxine est quantifiée dans les procédés de l'invention par le test LAL (en particulier par un procédé cinétique chromogénique).

Les procédés de l'invention peuvent être utilisés pour déterminer la teneur en endotoxine de tout sel d'aluminium pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin. Les adjuvants à base de sel d'aluminium appropriés sont bien connus de l'homme du métier et comprennent, mais sans y être limités, le phosphate d'aluminium, 1'hydroxyde d'aluminium ou l'une de leurs combinaisons. Les adjuvants à base de sel d'aluminium comprennent, mais sans y être limités, Rehydragel™ HS, Alhydrogel™ 85, Rehydragel™ PM, Rehydragel™ AB, Rehydragel™ HPA,

Rehydragel™ LV, Alhydrogel™ ou 1 ' une de leurs combinaisons. En particulier, les procédés de l'invention sont utilisés pour déterminer la teneur en endotoxine dans Adjuphos, Rehydragel™ HS (3 % d'hydroxyde d'aluminium dans de l'eau [General Chemical]) ou Alhydrogel™ 85 (Brenntag BioSector [Danemark] ) .

En particulier, les procédés de l'invention sont utilisés pour déterminer la teneur en endotoxine des sels d'aluminium qui présentent une capacité d'adsorption de protéines entre 2.5 et 3,5, 2,6 et 3,4, 2,7 et 3,3 ou 2,9 et 3,2, 2,5 et 3,7, 2.6 et 3,6, 2,7 et 3,5, ou 2,8 et 3,4 de protéine (BSA)/ml de sel d'aluminium. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, les procédés de l'invention sont utilisés pour déterminer la teneur en endotoxine d'un sel d'aluminium avec la capacité d'adsorption de protéines entre 2,9 et 3,2 mg de BSA/mg de sel d'aluminium. La capacité d'absorption de protéines du sel d'aluminium peut être mesurée par tout moyen connu de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la capacité d'adsorption de protéines du sel d'aluminium est mesurée en utilisant le procédé tel que décrit dans l'exemple 1 du document WO 2012/136823 (qui utilise de la BSA) ou ses variations.

Les procédés de l'invention sont utilisés pour déterminer la teneur en endotoxine de sels d'aluminium décrits ici (c'est-à-dire ayant la capacité d'adsorption de protéines décrite ici) qui ont une taille de cristal entre 2,8 et 5,7 nm mesurée par diffraction aux rayons X, par exemple 2,9 à 5.6 nm, 2,8 à 3,5 nm, 2,9 à 3,4 nm ou 3,4 à 5,6 nm ou 3,3 et 5.7 nm mesurée par diffraction aux rayons X. La diffraction aux rayons X est bien connue de l'homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la taille du cristal est mesurée en utilisant le procédé décrit dans l'exemple 1 du document WO 2012/136823 ou ses variations.

Les procédés de l'invention sont particulièrement utiles dans des tests de contrôle de qualité. Le terme test de « contrôle de qualité » est utilisé ici pour signifier le contrôle de qualité (QC) ou un ensemble de procédures visant à assurer qu'un produit fabriqué ou qu'un service effectué adhère à un ensemble défini de critères de qualité ou satisfait les exigences du fabricant. Par conséquent, les procédés de l'invention sont appropriés pour une utilisation dans un test de contrôle de qualité.

Dans un mode de réalisation particulier, les procédés de l'invention décrits ici sont utilisés pour tester la préparation de sel d'aluminium avant la formulation du sel d'aluminium avec d'autres composants du vaccin. Dans un autre mode de réalisation, les procédés de l'invention décrits ici sont utilisés pour tester la préparation de sel d'aluminium après la formulation du sel d'aluminium avec les autres composants du vaccin (par exemple, des antigènes particuliers). Dans un autre mode de réalisation, les procédés de l'invention décrits ici sont utilisés pour tester la préparation de sel d'aluminium pour la teneur en endotoxine à la fois avant et après la formulation de la préparation de sel d'aluminium avec les autres composants du vaccin (par exemple, des antigènes, en particulier ceux décrits ici).

Les procédés de l'invention peuvent impliquer : l'extraction d'un échantillon à partir d'un volume en vrac de sel d'aluminium ; l'analyse de l'échantillon par les procédés définis ici ; et ensuite si l'échantillon passe le test, l'adsorption d'un ou de plusieurs antigènes (en particulier ceux décrits ici) sur ledit sel d'aluminium ; et éventuellement la combinaison dudit sel d'aluminium avec un ou plusieurs autres antigènes (en particulier ceux décrits ici).

Les sels d'aluminium de l'invention peuvent être formulés avec des antigènes avant et/ou après l'analyse de la teneur en endotoxine.

Les antigènes qui peuvent être formulés avec le sel d'aluminium de l'invention comprennent, mais sans y être limités, l'anatoxine tétanique (TT), l'anatoxine diphtérique (DT), l'antigène de surface de l'hépatite B, le poliovirus inactivé (IPV), la pertactine, avec 1'hémagglutinine filamenteuse (FHA), l'anatoxine pertussique et/ou le polysaccharide de Haemophilus influenzae type B (Hib) [en particulier, le saccharide capsulaire polyribosyl-ribitol-phosphate (PRP) de H. influenzae type B), le papillomavirus humain (par exemple, des particules pseudovirales issues des HPV 6, 11, 16, 18 ou l'une de leurs combinaisons), des polysaccharides dérivés de Streptococcus pneumoniae conjugués à une protéine de transport, par exemple TT, DT et/ou CRM197.

Les anatoxines tétaniques (TT) et leurs procédés de préparation sont bien connus dans l'art. Les TT peuvent être produites par purification de la toxine à partir d'une culture de Clostridium tetani suivie d'une détoxification chimique, mais elle est fabriquée en variante par purification d'un analogue recombinant, ou génétiquement détoxifié, de la toxine (par exemple, comme il est décrit dans le document EP 209281). Un procédé préféré de détoxification est le suivant. Après la fermentation, le bouillon est filtré sur un filtre de 0,1 à 0,3 pm en présence de Diatomite en tant qu'auxiliaire de filtration. La récolte est clarifiée à travers un filtre de 0,22 pm, concentrée et diafiltrée sur des membranes en feuilles plates de 30 kD contre 10 volumes de tampon phosphate (20 mM - pH 7,3). La toxine diafiltrée est ensuite détoxifiée pendant 4 semaines à 37 °C dans les conditions suivantes : formaldéhyde 20 mM - lysine 3 mM - phosphate de potassium 100 mM - pH initial de 7,3 - 500 Lf/ml. L'anatoxine résultante est purifiée par fractionnement avec du sulfate d'ammonium, concentrée et diafiltrée (30 kD) contre de l'eau pour injection pour éliminer le sulfate d'ammonium. Du NaCl est ajouté jusqu'à une concentration finale de 0,9 %, le pH est ajusté à 7,3 et l'anatoxine purifiée est stérilisée par filtration.

Toute anatoxine tétanique peut être utilisée. « Anatoxine tétanique » peut englober des fragments immunogènes de la protéine pleine longueur (par exemple, le fragment C - voir le document EP 478602). L'anatoxine tétanique de l'invention est généralement adsorbée sur un sel d'aluminium. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le sel d'aluminium est 1'hydroxyde d'aluminium. Dans un autre mode de réalisation, l'anatoxine tétanique de l'invention peut être adsorbée sur un sel d'aluminium tel que le phosphate d'aluminium. Dans un autre mode de réalisation, l'anatoxine tétanique peut être adsorbée sur un mélange à la fois d'hydroxyde d'aluminium et de phosphate d'aluminium.

Des procédés d'adsorption de protéines comprenant des anatoxines tétaniques sur des sels d'aluminium sont bien connus de l'homme du métier (par exemple, la préparation de vaccins est décrite de manière générale dans Vaccine Design "The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press New York).

Les anatoxines diphtériques (DT) et leurs procédés de préparation sont bien documentés. Toute anatoxine diphtérique ‘ appropriée peut être formulée avec le sel d'aluminium décrit ici après ou avant l'analyse de l'endotoxine. Par exemple, la DT peut être produite par purification de la toxine à partir d'une culture de Corynebacterium diphtheriae suivie d'une détoxification chimique, mais elle est fabriquée en variante par purification d'un analogue recombinant, ou génétiquement détoxifié de la toxine (par exemple, CRM197, ou d'autres mutants tels · que décrits dans les documents US 4 709 017, US 5 843 711, US 5 601 827, et US 5 917 017). Un procédé préféré de détoxification est le suivant. Après la fermentation, l'anatoxine diphtérique est récoltée par TFF sur filtre de 0,45 μιη, clarifiée à travers un filtre de 0,22 pm, concentrée et diafiltrée sur des membranes en feuilles plates de 10 kD contre 10 volumes de tampon phosphate (20 mM - pH 7,2). La toxine diafiltrée est ensuite détoxifiée pendant 6 semaines à 37 °C dans les conditions suivantes : formaldéhyde 50 mM - lysine 25 mM - phosphate de potassium 50 mM - pH initial de 7,2 - 300 Lf/ml. L'anatoxine résultante est purifiée par fractionnement avec du sulfate d'ammonium, concentrée et diafiltrée (30 kD) contre de l'eau pour injection pour éliminer le sulfate d'ammonium. Du NaCl est ajouté jusqu'à une concentration finale de 0,9 %, le pH est ajusté à 7,3 et l'anatoxine diphtérique purifiée est stérilisée par filtration.

Le vaccin antipoliomyélitique inactivé (IPV) peut comprendre l'IPV type 1 ou l'IPV type 2 ou l'IPV type 3, ou l'IPV types 1 et 2, ou l'IPV types 1 et 3, ou l'IPV types 2 et 3, ou l'IPV types 1, 2 et 3.

Les procédés de préparation de poliovirus inactivés (IPV) sont bien connus dans l'art. Dans un mode de réalisation, l'IPV devra comprendre les types 1, 2 et 3 comme il est courant dans l'art des vaccins, et ce peut être le vaccin contre la polio Salk qui est inactivé avec du formaldéhyde (voir par exemple, Sutter et al., 2000, Pediatr. Clin. North Am. 47: 287 ; Zimmerman & Spann 1999, Am Fam Physician 59: 113 ; Salk et al., 1954, Official Monthly Publication of the American Public Health Association 44(5): 563 ; Hennesen, 1981, Develop. Biol. Standard 47: 139 ; Budowsky, 1991, Adv. Virus Res. 39: 255) . En variante, l'IPV peut être fabriqué en utilisant des souches de Sabin (Sabin-IPV ; Kersten et al. (1999), Vaccine 17: 2059).

Dans un mode de réalisation, l'IPV n'est pas adsorbé (par exemple, avant le mélange avec d'autres composants). Dans un autre mode de réalisation, le (s) composant (s) IPV de l'invention peut/peuvent être adsorbé(s) sur un sel d'aluminium tel que 1'hydroxyde d'aluminium (par exemple, avant ou après le mélange avec les autres composants). Dans un autre mode de réalisation, le (s) composant (s) IPV de l'invention peut/peuvent être adsorbé(s) sur un sel d'aluminium tel que le phosphate d'aluminium. Dans un autre mode de réalisation, le (s) composant(s) IPV de l'invention peut/peuvent être adsorbé (s) sur un mélange à la fois d'hydroxyde d'aluminium et de phosphate d'aluminium. En cas d'adsorption, un ou plusieurs composants IPV peuvent être adsorbés séparément ou conjointement sous la forme d'un mélange. Dans un autre mode de réalisation, l'IPV est adsorbé sur un sel/particule d'aluminium comme il est décrit ici.

La pertactine (l'antigène pertussique de 69 kDa) est une protéine de la membrane externe qui est stable à la chaleur et qui peut être préparée par des procédés connus dans l'art (voir le document EP 0162639) . La pertactine est éventuellement adsorbée sur une particule de sel d'aluminium. Dans un mode de réalisation de l'invention, la pertactine est adsorbée sur de 1 ' hydroxyde d'aluminium. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la pertactine est adsorbée sur un sel d'aluminium comme il est décrit ici. L'hémagglutinine filamenteuse (FHA) peut être préparée dans des procédés bien connus dans l'art (voir les procédés décrits et référencés dans le document WO 1990/013313 (US 7 479 283)) . La FHA est éventuellement adsorbée sur une particule de sel d'aluminium. Dans un mode de réalisation de l'invention, la FHA est adsorbée sur de 1 ' hydroxyde d'aluminium. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la FHA est adsorbée sur un sel d'aluminium comme il est décrit ici.

Des procédés de production d'anatoxine pertussique sont bien connus de l'homme du métier. La toxine pertussique peut être détoxifiée par un procédé bien connu de traitement au formaldéhyde ou au moyen de mutations (dérivé PT) . Il a été découvert que des substitutions de résidus au sein de la sous-unité Si de la protéine se traduisent par une protéine qui conserve les propriétés immunologiques et protectrices de la toxine pertussique, mais avec une toxicité réduite ou pas de toxicité (EP 322533). Les mutations détoxifiantes discutées dans les revendications du document EP322533 sont des exemples des mutants PT détoxifiés de la présente invention. L'anatoxine pertussique est éventuellement adsorbée sur une particule de sel d'aluminium. Dans un mode de réalisation de l'invention, l'anatoxine pertussique est adsorbée sur de 1'hydroxyde d'aluminium. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, l'anatoxine pertussique est adsorbée sur un sel d'aluminium comme il est décrit ici.

Le saccharide capsulaire polyribosyl-ribitol-phosphate (PRP) de Haemophilus influenzae type b peut être conjugué à une protéine de transport. Le saccharide est un polymère de ribose, ribitol et phosphate. L'antigène Hib peut être éventuellement adsorbé sur du phosphate d'aluminium comme il est décrit dans le document WO 97/00697, ou il peut être non adsorbé comme il est décrit dans le document WO 02/00249 ou il peut ne pas avoir subi de traitement spécifique d'adsorption.

Par antigène « non adsorbé sur un sel d'aluminium d'adjuvant » (« non adsorbé ») ici, il est signifié par exemple qu'une étape expresse ou dédiée d'adsorption pour l'antigène sur du sel d'aluminium d'adjuvant frais n'est pas impliquée dans le procédé de formulation de la composition.

Le Hib peut être conjugué à tout support qui peut fournir au moins un épitope T-auxiliaire, et ce peut être l'anatoxine tétanique, l'anatoxine diphtérique, CRM-197 (mutants de la toxine diphtérique) ou la protéine D de H. influenzae non typable (EP 0594610) .

Dans un autre mode de réalisation, il est proposé un procédé de l'invention comprenant en outre l'étape de formulation de la composition immunogène avec un antigène de surface de l'hépatite B.

La préparation de l'antigène de surface de l'hépatite B (Ag HBs) est bien documentée. Voir par exemple, Hartford et al., 1983, Develop. Biol. Standard 54: 125 ; Gregg et ai., 1987, Biotechnology 5: 479 ; EP 0226846 ; EP 0299108. Il peut être préparé comme suit. Un procédé implique la purification de l'antigène sous une forme particulaire à partir du plasma de porteurs chroniques de l'hépatite B, car de grandes quantités d'Ag HBs sont synthétisées dans le foie et libérées dans la circulation sanguine durant une infection par le VHB.

Un autre procédé implique l'expression de la protéine par des procédés d'ADN recombinant. L'Ag HBs peut être préparé par expression dans la levure Saccharomyces cerevisiae, Pichia, des cellules d'insectes (par exemple, Hi5) ou des cellules de mammifères. L'Ag HBs peut être inséré dans un plasmide, et son expression à partir du plasmide peut être contrôlée par un promoteur tel que le promoteur « GAPDH » (à partir du gène de la glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase). La levure peut être cultivée dans un milieu synthétique. L'Ag HBs peut être ensuite purifié par un procédé impliquant des étapes telles . qu'une précipitation, une chromatographie avec échange d'ions, et une ultrafiltration. Après la purification, l'Ag HBs peut être soumis à une dialyse (par exemple, avec de la cystéine) . L'Ag HBs peut être utilisé sous une forme particulaire.

Telle qu'utilisée ici, l'expression « antigène de surface de l'hépatite B » ou « Ag HBs » comprend tout antigène Ag HBs ou l'un de ses fragments affichant l'antigénicité de l'antigène de surface du VHB. Il faudra comprendre qu'en plus de la séquence de 226 acides aminés de l'antigène S Ag HBs (voir Tiollais et al., 1985, Nature 317: 489 et les références dedans), 1'Ag HBs tel que décrit ici peut, si c'est souhaité, contenir la totalité ou une partie de la séquence pré-S telle que décrite dans les références ci-dessus et dans le document EP 0278940. En particulier, 1'Ag HBs peut comprendre un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés comprenant les résidus 133 à 145 suivis des résidus 175 à 400 de la protéine L de l'Ag HBs par rapport au cadre de lecture ouvert sur un virus de l'hépatite B de sérotype ad (ce polypeptide est appelé L* ; voir le document EP 0414374) . L'Ag HBs dans la portée de l'invention peut également comprendre le polypeptide préSl-préS2-S décrit dans le document EP 0198474 (Endotronics) ou ses analogues tels que ceux décrits dans le document EP 0304578 (McCormick and Jones). L'Ag HBs tel qu'utilisé ici peut également se rapporter à des mutants, par exemple le « mutant d'échappement » décrit dans le document WO 91/14703 ou EP 0511855A1, spécialement l'Ag HBs dans lequel la substitution d'acide aminé au niveau de la position 145 est une arginine à partir d'une glycine. L'Ag HBs peut être sous la forme de particules. Les particules peuvent comprendre par exemple la protéine S seule ou elles peuvent être des particules composites, par exemple L*, S) où L* est comme il est défini ci-dessus et S indique la protéine S de l'Ag HBs. Ladite particule est de manière avantageuse sous la forme dans laquelle elle est exprimée dans la levure.

Dans un mode de réalisation, l'Ag HBs est l'antigène utilisé dans Engerix B™ (GlaxoSmithKline Biologicals S.A.), qui est en outre décrit dans le document WO 93/24148. L'antigène de surface de l'hépatite B peut être éventuellement adsorbé sur un sel d'aluminium, en particulier le phosphate d'aluminium, ce qui peut être réalisé avant le mélange avec les autres composants (décrit dans le document WO 93/24148) . Le composant de l'hépatite B devra être pratiquement dépourvu de thiomersal (le procédé de préparation de l'Ag HBs sans thiomersal a été publié antérieurement dans le document EP 1307473).

La présente invention propose en outre des procédés de fabrication d'un tampon de désorption pour une utilisation dans un procédé de détermination de l'endotoxine d'un sel d'aluminium comprenant les étapes suivantes : a) le mélange d'un ou de plusieurs sels tels que définis ici, d'un agent chélateur de métaux tel que défini ici et d'eau ; éventuellement b) l'agitation du mélange (en particulier pendant un temps égal ou supérieur à 30 secondes, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 minutes) ; et éventuellement c) l'incubation du mélange pendant un temps égal ou supérieur à 5, 10, 15, 20, 25, ou 30 minutes.

La présente invention propose en outre des procédés de fabrication d'un tampon de désorption pour une utilisation dans un procédé de détermination de l'endotoxine d'un sel d'aluminium comprenant les étapes suivantes : a) le mélange d'un sel, d'un agent chélateur de métaux et d'eau ; éventuellement b) l'agitation du mélange combinée à des périodes d'incubation à 37 °C + /- 1 °C (pour dissoudre) ; et éventuellement c) l'addition d'un acide ou d'une base pour fixer le pH ; d) l'addition d'eau pour atteindre le volume final de la préparation ; éventuellement e) le stockage à 37 °C +/- 1 °C.

Les étapes a) et b) peuvent être réalisées plus d'une fois, il est proposé des procédés de fabrication d'un tampon de désorption tel que défini ici dans lesquels les étapes b) et/ou c) sont répétées 1 ou 2 fois ou plus.

Il est proposé des procédés de fabrication d'un tampon de désorption tel que défini dans lesquels l'eau est pratiquement dépourvue d'endotoxine.

Il est proposé des procédés de fabrication d'un tampon de désorption tel que défini dans lesquels l'eau de l'étape a) est préchauffée à environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C (± 1 °C).

Il est proposé des procédés de fabrication d'un tampon de désorption tel que défini dans lesquels le pH est ajusté entre 7 et 9, en particulier environ pH 8. Tout acide peut être utilisé pour ajuster ce pH tout en n'affectant pas la capacité du tampon de désorption à désorber l'endotoxine à partir du sel d'aluminium. En particulier, du HCl peut être utilisé pour ajuster le pH dans la fabrication de tampons de désorption décrits ici. En particulier, le pH est ajusté lorsque le tampon est à environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C (± 1 °C) . Toute base ou tout acide approprié peut être utilisé pour ajuster ce pH tout en n'affectant pas la capacité du tampon de désorption à désorber l'endotoxine à partir du sel d'aluminium.

Il est proposé des procédés de fabrication d'un tampon de désorption tel que défini comprenant en outre l'étape d) de stockage du tampon de désorption à environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C (± 1 °C).

Les termes « comprenant », « comprennent » et « comprend » ici sont prévus par les inventeurs comme étant éventuellement substituables par les termes « étant constitué de », « sont constitués de » et « est constitué de », respectivement, dans tous les cas.

Le terme « environ » utilisé ici est censé signifier la quantité ± 10 %.

Exemples 1. Préparation du tampon de désorption

Afin de fabriquer 100 ml de tampon de désorption, 17,8 g de Na2HP04, 0,224 g d'EDTA et 90 ml d'eau apyrogène (si possible préchauffée dans un incubateur à 37 °C) ont été déposés dans un récipient apyrogène Nunc de 250 ml.

Le sel et 1 ' EDTA ont été dissous par agitation pendant 15 min sur une table d'agitation, chauffage pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C ± 1 °C et répétition de l'agitation et du chauffage jusqu'à la dissolution totale.

Pour ajuster le pH, 3 ml de HCl IN ont été ajoutés, le pH est mesuré et ajusté à pH 8,0 avec du HCl IN si nécessaire. Le volume est complété à 100 ml avec de l'eau apyrogène. L'absence d'endotoxine a été déterminée par une analyse LAL à une dilution au 1/100. Le tampon de désorption a été stocké à 37 °C ± 1 °C. 2. Détermination de l'endotoxine

Afin de déterminer la teneur en endotoxine d'un échantillon d'aluminium (4 ml), du tampon de désorption (6 ml) a été ajouté à l'échantillon de sel d'aluminium. Le mélange a été agité pendant 1 minute et ensuite incubé à température ambiante pendant 24 heures.

Après l'incubation, le mélange est agité lentement par retournement du tube 5 fois. Un échantillon (1,5 ml) est prélevé et transféré dans un tube Eppendorf de 2 ml. Le mélange a été centrifugé à 10 000 tr/min pendant 10 minutes. Le surnageant a été ensuite transféré dans un tube apyrogène. La teneur en endotoxine a été ensuite quantifiée en utilisant le test LAL par le procédé cinétique chromogénique à une dilution au 1/50.

Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a. le mélange du sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b. la séparation du sel d'aluminium de l'endotoxine ; et c. la mesure de la quantité d'endotoxine.
2. Procédé de détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a. le mélange du sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b. la centrifugation du mélange, séparant de cette manière le sel d'aluminium de l'endotoxine ; et c. la mesure de la teneur en endotoxine du surnageant.
3. Procédé de détermination de la teneur en endotoxine d'une préparation de sel d'aluminium pour une utilisation en médecine (en particulier pour une utilisation en tant qu'adjuvant dans un vaccin), comprenant les étapes suivantes : a. le mélange du sel d'aluminium avec un tampon de désorption, désorbant de cette manière toute endotoxine à partir du sel d'aluminium ; b. la centrifugation du mélange, séparant de cette manière le sel d'aluminium de l'endotoxine ; c. le transfert du surnageant dans un réceptacle apyrogène ; et d. la mesure de la teneur en endotoxine dudit surnageant.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lëquel la préparation de sel d'aluminium et le tampon de désorption sont mélangés dans un rapport entre 1/9 et 9/1, par exemple 2/8, 3/7, 4/6, 5/5, 6/4, 7/2 ou 8/2 (en particulier entre 3/7, 4/6, 5/5, 6/4 7/3, en particulier 4/6, 5/5 et 6/4).
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le mélange est incubé (en particulier sans agitation) après le mélange et avant la séparation (en particulier une centrifugation) (en particulier pendant un temps supérieur à 1, 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 ou 24 heures, en particulier inférieur à 96 ou 72 heures, par exemple la période d'incubation se situe entre 1 et 96 heures, 5 et 72 heures, 10 et 48 heures, 15 et 36 heures, ou entre 20 et 28 heures).
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ladite incubation (en particulier pour une utilisation dans des procédés de détermination de l'endotoxine de phosphate d'aluminium) est réalisée à température ambiante (environ 22 °C) .
7. Procédé selon la revendication 5, dans lequel ladite incubation (en particulier pour une utilisation dans des procédés de détermination de l'endotoxine d'hydroxyde d'aluminium) est réalisée à une température supérieure à 30 °C, 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le mélange est agité après l'étape a) pendant plus de 30 secondes, 40 secondes, 50 secondes, 1 minute, 1 minute 30 secondes ou 2 minutes.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit tampon de désorption comprend un sel (en particulier le Na2HP04 [en particulier entre 15 et 20 %] ) et un agent chélateur de métaux (en particulier l'EDTA [en particulier entre 0,2 et 0,3 %] ) .
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes (en particulier celui pour une utilisation dans des procédés de détermination de l'endotoxine d'hydroxyde d'aluminium), dans lequel le tampon de désorption comprend un autre sel (en particulier le NaCl).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit tampon de désorption (en particulier celui pour une utilisation dans des procédés de détermination de l'endotoxine de phosphate d'aluminium) a un pH égal ou supérieur à pH 5,5, par exemple entre environ pH 7 et pH 9.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit tampon de désorption (en particulier celui pour une utilisation dans des procédés de détermination de l'endotoxine d'hydroxyde d'aluminium) a un pH égal ou supérieur à pH 9,5, par exemple entre environ pH 9,5 et pH 10,5.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit tampon de désorption est à une température entre environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit tampon de désorption est à une température supérieure à 35 °C, 40 °C, 45 °C, 50 °C, 55 °C, 60 °C ou 65 °C.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le tampon de désorption est pratiquement dépourvu d'endotoxine et/ou est stérile.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le mélanqe est centrifugé à une vitesse entre 100 et 1500 x g.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel la teneur en endotoxine est mesurée/quantifiée par le test LAL (lysat d'amœbocyte de limule).
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le sel d'aluminium est le phosphate d'aluminium, 1'hydroxyde d'aluminium ou l'une de leurs combinaisons.
19. Test de contrôle de qualité comprenant le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 18.
20. Procédé de fabrication d'un tampon de désorption pour une utilisation dans un procédé de détermination de l'endotoxine d'un sel d'aluminium comprenant les étapes suivantes : a. le mélange d'une base (en particulier le Na2HP04) , d'un agent chélateur de métaux (en particulier l'EDTA) et d'eau ; éventuellement b. l'agitation du mélange (en particulier pendant un temps égal ou supérieur à 30 secondes, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 minutes) ; et éventuellement c. l'incubation du mélange pendant un temps égal ou supérieur à 5, 10, 15, 20, 25 ou 30 minutes.
21. Procédé de fabrication d'un tampon de désorption pour une utilisation dans un procédé de détermination de l'endotoxine d'un sel d'aluminium comprenant les étapes suivantes : a. le mélange d'un sel, d'un agent chélateur de métaux et d'eau ; éventuellement b. l'agitation du mélange combinée à des périodes d'incubation à 37 °C +/- 1 °C (pour dissoudre) ; éventuellement c. l'addition d'un acide ou d'une base pour fixer le pH ; éventuellement d. l'addition d'eau pour atteindre le volume final de la préparation ; et éventuellement e. le stockage à 37 °C +/- 1 °C.
22. Procédé selon la revendication 20, dans lequel les étapes b) et/ou c) sont répétées 1 ou 2 fois ou plus.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, dans lequel l'eau est pratiquement dépourvue d'endotoxine.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 23, dans lequel l'eau de l'étape a) est préchauffée à environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C (± 1 °C).
25. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 24, dans lequel le pH est ajusté entre 7 et 9, en particulier environ pH 8 ou entre 9,5 et 10,5.
26. Procédé selon la revendication 25, dans lequel le pH est ajusté lorsque le tampon est à une température d'environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C (± 1 °C) .
27. Procédé selon l'une quelconque des revendications 20 à 26, comprenant en outre l'étape d) de stockage du tampon de désorption à environ 30 °C et 45 °C, 35 °C et 40 °C, 36 °C et 38 °C, ou environ 37 °C (± 1 °C).
28. Procédé selon la revendication 17 dans lequel la teneur en endotoxine est mesurée/quantifiée par le procédé cinétique chromogenique.