CN103007264A - b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用。所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗包括b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物，pH 7.2-7.5。本发明在b型流感嗜血杆菌多糖蛋白结合物进行纯化的过程中采用TRIS-HCl缓冲液体系，不仅能够显著地提高多糖蛋白结合物纯化过程的回收率，而且可增加后续工序产品的稳定性，维持产品的pH值在中性范围内，避免因为pH值的变化导致产品的质量的潜在变化。
Description
技术领域
本发明涉及流感嗜血杆菌疫苗，尤其涉及b型流感嗜血杆菌结合疫苗及其应用。
背景技术
流感嗜血杆菌根据荚膜的性质分为a，b，c，d，e，f型及不可分型，其中b型流感嗜血杆菌的侵袭力最强。由b型流感嗜血杆菌（Hib）引起的化脓性脑膜炎、肺炎、关节炎、会厌炎等疾病，已成为全球一个重要的公共卫生问题。而研制成功的Hib多糖疫苗及Hib结合疫苗，可有效预防由b型流感嗜血杆菌引起的感染。对于5对以下儿童，尤其是2周岁以下的婴幼儿，Hib多糖疫苗的保护效果不佳。
对于主要抗原是荚膜多糖的菌株而言，结合疫苗是目前改善多糖疫苗免疫原性的优良方法。蛋白载体具有T细胞依赖的特性，在荚膜多糖特异性抗原上加上蛋白载体可将非T细胞依赖性的多糖抗原转变为T细胞依赖性抗原，激发机体的T辅助细胞产生的一系列的免疫增强效应。对于免疫***尚未发育成熟的婴幼儿，尤其是2周岁以下的婴幼儿而言，结合疫苗大大增强了其免疫效果。
现有技术广泛采用溴化氰活化，己二酰肼衍生，并在碳二亚胺存在下，与蛋白载体例如破伤风类毒素进行结合制备Hib结合疫苗，获得多糖蛋白结合物。
多糖蛋白结合物溶液是一个十分复杂的混合物体系，结合物中残留未结合的多糖和载体蛋白质等。在对多糖蛋白结合物进行纯化的过程中，多采用0.2mol/L的氯化钠溶液作为流动相。但是，采用0.2mol/L的氯化钠溶液作为流动相，多糖蛋白结合物回收率低。而且多糖蛋白结合物的纯化采用0.2mol/L的氯化钠溶液，不利于后续工序包括分装后产品的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供b型流感嗜血杆菌结合疫苗，用于提高多糖蛋白结合物的稳定性。
本发明另一目的是提供b型流感嗜血杆菌结合疫苗的剂型。
本发明再一目的是提供疫苗在制备预防由b型流感嗜血杆菌感染导致的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎感染性疾病的药物中的应用。
本发明所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗，包括如下组分和含量：
b型流感嗜血杆菌多糖 20-30μg/ml；
破伤风类毒素 40-100μg/ml；
pH 7.2-7.5。
所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其制备方法包括以下步骤：
1）制备b型流感嗜血杆菌多糖；
2）制备b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物混合液；
3）纯化：以TRIS-HCl缓冲液作为流动相，用层析法纯化步骤2）中的混合液，得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液。
其中，所述TRIS-HCl缓冲液，浓度为20-100mmol/L，pH值为7.2-7.5，优选所述TRIS-HCl缓冲液浓度为20-50mmol/L。
具体地，步骤如下：
1）发酵培养b型流感嗜血杆菌：采用b型流感嗜血杆菌生产用菌株，菌株复壮、培养、发酵，发酵液通过甲醛杀菌后收获培养物；
2）制备b型流感嗜血杆菌多糖：收集的培养物经过离心去除菌体，加入沉淀剂沉淀上清液中的多糖，经过研磨、乙醇沉淀去除核酸，并经过冷酚溶液抽提去除杂蛋白，并通过超滤方法去除残留小分子物质，通过乙醇沉淀制备精制多糖；
3）制备b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物：精制多糖经过溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亚胺作用下与破伤风类毒素结合；
4）以TRIS-HCl缓冲液作为流动相，用层析法纯化制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液。
本发明所述疫苗还包括赋形剂，所述赋形剂为TRIS-HCl缓冲液和氯化钠或TRIS-HCl缓冲液和乳糖。
其中，所述TRIS-HCl缓冲液浓度为8-12mmol/L、氯化钠7.5-9.5mg/ml、乳糖20-30mg/ml。
本发明还提供含有上述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的制剂，包括液体剂和冻干制剂。
本发明所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的液体剂的组分为b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、TRIS-HCl缓冲液和氯化钠组成，其中，各组分的浓度为：
b型流感嗜血杆菌多糖 20-30μg/ml；
破伤风类毒素 40-100μg/ml；
TRIS-HCl缓冲液 8-12mmol/L；
氯化钠 7.5-9.5mg/ml。
上述b型流感嗜血杆菌结合疫苗液体剂的制备方法，包括如下步骤：
1）制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗；
2）半成品配制及分装：步骤1）中加入TRIS-HCl缓冲液，氯化钠溶液稀释，余量为注射用水，进行分装。
本发明所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的冻干制剂的组分为b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物、TRIS-HCl缓冲液和乳糖，其中，各组分的浓度为：
b型流感嗜血杆菌多糖 20-30μg/ml；
破伤风类毒素 40-100μg/ml；
TRIS-HCl缓冲液 8-12mmol/L；
乳糖 20-30mg/ml。
上述b型流感嗜血杆菌结合疫苗的冻干剂型的制备方法，包括如下步骤：
1）制备b型流感嗜血杆菌结合疫苗；
2）半成品配制及分装：步骤1）中加入TRIS-HCl缓冲液，氯化钠溶液稀释，余量为注射用水，进行分装；
3）冻干：-50~-40℃预冻3-4h，然后在真空度5~15Pa下，温度缓慢升温至-20℃±2℃，温度维持5~7h，再阶梯式升温至30℃，温度维持6~8h，冻干结束。
所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗可预防由b型流感嗜血杆菌感染导致的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎等感染性疾病。
本发明有益效果：在多糖蛋白结合物进行纯化的过程中采用缓冲液体系TRIS-HCl缓冲液体系，不仅能够显著地提高多糖蛋白结合物纯化过程的回收率，而且可增加后续工序产品的稳定性，维持产品的pH值在中性范围内，避免因为pH值的变化导致产品的质量的潜在变化。
概念的阐释：
多糖含量：b型流感嗜血杆菌结合疫苗的抗原为b型流感嗜血杆菌的荚膜多糖，抗原含量以多糖的含量进行表征，无论是在原液制备还是在半成品配制过程中。
多糖蛋白结合物混合液：指在进行多糖与蛋白结合试验后尚未经过柱层析进行分离，包含有多糖与蛋白结合物大分子及未结合的多糖、蛋白小分子物质。
多糖回收率：本专利中多糖回收率指的是：在进行多糖与蛋白结合后回收的符合《中华人民共和国药典》三部（2010年版）“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”规程规定的原液质量的Hib结合物原液中多糖质量与多糖投料量的比值。
高分子结合物：多糖蛋白结合物的混合物已经过柱层析纯化收集的大分子物质。
高分子结合物含量：是在经过柱层析纯化后收集的大分子物质中，按照《中华人民共和国药典》三部（2010年版）中高分子结合物含量测定方法测得的以百分数表示的大分子含量。
Kd＜0.2的回收率：指采用排阻色谱进行测定结合物分子的分配系数时，以Kd＜0.2峰面积与总峰面积的比值。
效力试验：用以表征Hib结合疫苗在动物体内产生抗体的水平。按照《中华人民共和国药典》三部（2010年版）中效力试验方法检测.以高于阴性对照组小鼠血清的Cutoff值的百分比表示。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液的制备
1）采用《中华人民共和国药典》三部（2010年版）中“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”规程规定的菌种培养、发酵及精制多糖制备工艺步骤，制备b型流感嗜血杆菌精制多糖。采用b型流感嗜血杆菌生产用菌株（MH200201，北京民海生物科技有限公司自主分离），菌株复壮、培养、发酵，发酵液通过甲醛杀菌后收获培养物；
2）收集的培养物经过离心去除菌体，加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）沉淀上清液中的多糖，离心收集多糖，经过研磨、乙醇沉淀去除核酸，并经过冷酚溶液抽提去除杂蛋白，并通过超滤方法去除残留小分子物质，通过乙醇沉淀制备精制多糖；
3）精制多糖经过溴化氰活化、己二酰肼衍生、在碳二亚胺作用下与破伤风类毒素结合，多糖与破伤风类毒素的质量比为1:1，制得b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物混合液；参考杨耀、黄镇等人发表的《b型流感嗜血杆菌多糖结合疫苗的研制》（中国生物制品学杂志，2002，Vol.15,No.3）；
4）混合液分别用0.02mol/L的TRIS-HCl缓冲液、pH7.2-7.5，0.2mol/L的氯化钠溶液作为流动相，按不高于层析柱体积10%的上样量上样，两种介质的上样量相同。收集V0附近的洗脱液，除菌过滤。
表1同一批结合物不同纯化介质的检定结果
| 0.2mol/L氯化钠溶液 | 0.02mol/LTRIS-HCl缓冲液 | |
| 多糖含量 | 66μg/ml | 136μg/ml |
| 多糖回收率 | 2.3% | 7.1% |
实施例2 b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液的制备
方法步骤同实施例1，不同之处在于使用的TRIS-HCl缓冲液的浓度为0.05mol/L。
表2同一批结合物不同纯化介质的检定结果
| 0.2mol/L氯化钠溶液 | 0.05mol/LTRIS-HCl缓冲液 | |
| 多糖含量 | 82.5μg/ml | 246μg/ml |
| 多糖回收率 | 4.7% | 13.2% |
实施例3b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液的制备
方法步骤同实施例1，不同之处在于使用0.1mol/L的TRIS-HCl缓冲液平衡。
表3同一批结合物不同纯化介质的检定结果
| 0.2mol/L氯化钠溶液 | 0.1mol/L TRIS-HCl缓冲液 | |
| 多糖含量 | 117μg/ml | 289μg/ml |
| 多糖回收率 | 5.5% | 12.4% |
结果显示：同样的结合物采用TRIS-HCl缓冲液作为流动相，回收率要远远高于采用0.2mol/L的氯化钠溶液作为流动相，前者的回收率是后者的2倍多。
实施例4 液体制剂的制备
采用实施例1中Tris-HCl缓冲体系制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，CPS-CTB偶联物按多糖含量计算，按照终浓度为25μg/ml进行稀释，加入0.5mol/L的TRIS-HCl缓冲液（pH值为7.3）使其终浓度为10mmol/L，加入8.5%的氯化钠溶液使其终浓度为0.85%（8.5mg/ml），稀释配制分装。破伤风类毒素终浓度为70μg/ml。
表4液体制剂的配制
| 组分 | 原浓度 | 用量 | 终浓度 |
| Hib结合疫苗原液 | 136μg/ml | 919.1ml | 25μg/ml |
| TRIS-HCl缓冲液 | 500mmol/L | 63.2ml | 10mmol/L |
| 氯化钠溶液 | 8.5% | 500ml | 0.85% |
| 注射用水 | // | 3517.7ml | // |
| 半成品量 | // | 5000ml | // |
实施例5液体制剂的制备
采用实施例1中Tris-HCl缓冲体系制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，CPS-CTB偶联物按多糖含量计算，按照终浓度为20μg/ml进行稀释，加入2.5mol/L的TRIS-HCl缓冲液（pH值为7.3）使其终浓度为8mmol/L，加入7.5%的氯化钠溶液使其终浓度为0.75%（7.5mg/ml），稀释配制分装。各组分用量如下表所示：破伤风类毒素终浓度为56μg/ml。
表5液体制剂的配制
| 组分 | 原浓度 | 用量 | 终浓度 |
| Hib结合疫苗原液 | 136μg/ml | 735.3ml | 20μg/ml |
| TRIS-HCl缓冲液 | 2500mmol/L | 10.1ml | 8mmol/L |
| 氯化钠溶液 | 7.5% | 500ml | 0.75% |
| 注射用水 | // | 3754.6 | // |
| 半成品量 | // | 5000ml | // |
实施例6液体制剂的制备
采用实施例1中Tris-HCl缓冲体系制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗原液，CPS-CTB偶联物按多糖含量计算，按照终浓度为30μg/ml进行稀释，加入5mol/L的TRIS-HCl缓冲液（pH值为7.3）使其终浓度为12mmol/L，加入7.5%的氯化钠溶液使其终浓度为0.95%（9.5mg/ml），稀释配制分装。破伤风类毒素终浓度为84μg/ml。各组分用量如下表所示：
表6液体制剂的配制
| 组分 | 原浓度 | 用量 | 终浓度 |
| Hib结合疫苗原液 | 136μg/ml | 1102.9ml | 30μg/ml |
| TRIS-HCl缓冲液 | 5000mmol/L | 7.6ml | 12mmol/L |
| 氯化钠溶液 | 9.5% | 500ml | 0.95% |
| 注射用水 | // | 3389.5ml | // |
| 半成品量 | // | 5000ml | // |
实施例7液体制剂的稳定性
采用实施例4制备的液体制剂标记为A；直接采用0.2mol/L的氯化钠溶液作为流动相纯化制备的结合物原液，加入氯化钠溶液使氯化钠终浓度为8.5g/L，制备的Hib结合疫苗标记为B。制备的产品在37℃放置。其7天及14天的加速稳定性的试验结果如下：
表6-1 液体b型流感嗜血杆菌结合疫苗稳定性试验-理化指标的检定
表6-2液体b型流感嗜血杆菌结合疫苗稳定性试验-效力试验结果
同样方法检测实施例5、6制备的液体制剂，结果一致。
实施例8冻干制剂的制备
将实施例1中采用Tris-HCl缓冲体系制备的结合疫苗原液，按照终浓度为25μg/ml进行稀释，加入2.5mol/L的TRIS-HCl缓冲液（pH值为7.3）使其终浓度为10mmol/L，加入10%的乳糖溶液使其终浓度为2.5%（25mg/ml），稀释配制分装。破伤风类毒素终浓度为70μg/ml。各组分用量如下表所示：
表7各组分用量
| 组分 | 原浓度 | 用量 | 终浓度 |
| Hib结合疫苗原液 | 136μg/ml | 919.1ml | 25μg/ml |
| TRIS-HCl缓冲液 | 2500mmol/L | 12.6ml | 10mmol/L |
| 乳糖溶液 | 10% | 1250ml | 2.5% |
| 注射用水 | // | 2818.3ml | // |
| 半成品量 | // | 5000ml | // |
每支分装0.6ml,放入冻干机内冻干。
冻干过程：-45℃预冻3-4h，然后在真空度10Pa，控制温度使之缓慢升温至-20℃±2℃，温度维持6h，再阶梯式升温至30℃，温度维持6h，冻干结束。
实施例9冻干制剂的制备
将实施例2中采用Tris-HCl缓冲体系制备的结合疫苗原液，按照终浓度为20μg/ml进行稀释，加入5.0mol/L的TRIS-HCl缓冲液（pH值为7.3）使其终浓度为8mmol/L，加入10%的乳糖溶液使其终浓度为2.0%（20mg/ml），稀释配制分装。破伤风类毒素终浓度为40μg/ml。各组分用量如下表所示：
表8各组分用量
| 组分 | 原浓度 | 用量 | 终浓度 |
| Hib结合疫苗原液 | 246μg/ml | 406.5ml | 20μg/ml |
| TRIS-HCl缓冲液 | 5000mmol/L | 3.9ml | 8mmol/L |
| 乳糖溶液 | 10% | 1000ml | 2.0% |
| 注射用水 | // | 3589.6ml | // |
| 半成品量 | // | 5000ml | // |
采用与实施例8相同的方法进行分装及冻干。
实施例10冻干制剂的制备
将实施例3中采用Tris-HCl缓冲体系制备的结合疫苗原液，按照终浓度为30μg/ml进行稀释，加入0.5mol/L的TRIS-HCl缓冲液（pH值为7.3）使其终浓度为12mmol/L，加入10%的乳糖溶液使其终浓度为3.0%（30mg/ml），稀释配制分装。破伤风类毒素终浓度为100μg/ml。各组分用量如下表所示：
表9各组分用量
| 组分 | 原浓度 | 用量 | 终浓度 |
| Hib结合疫苗原液 | 289μg/ml | 519.0ml | 30μg/ml |
| TRIS-HCl缓冲液 | 500mmol/L | 16.2ml | 12mmol/L |
| 乳糖溶液 | 10% | 1500ml | 3.0% |
| 注射用水 | // | 2964.8ml | // |
| 半成品量 | // | 5000ml | // |
采用与实施例8相同的方法进行分装及冻干。
实施例11冻干制剂的稳定性
采用实施例8制备的冻干Hib结合疫苗进行样品稳定性试验。将制品于37℃放置7天、14天、21天及28天进行加速稳定性试验。其7天及14天的加速稳定性的试验结果如下：
表10冻干Hib结合疫苗的稳定性试验-理化指标的检定结果
表11冻干Hib结合疫苗的稳定性试验-效力试验的检定结果
| 项目 | 0天 | 37℃,7天 | 37℃,14天 | 37℃,21天 | 37℃,28天 |
| 效力试验 | 100% | 100% | 95% | 95% | 90% |
同样方法检测实施例9、10制备的冻干制剂，结果一致。
实施例12联合疫苗的制备
1、吸附无细胞百白破疫苗（即无细胞百日咳疫苗（AcP）、精制白喉类毒素（DT）及破伤风类毒素（TT））按《中国药典》（2010版）要求制备，与实施例8中Tris-HCl缓冲体系制备的b型流感嗜血杆菌结合疫苗（冻干制剂）组合成为无细胞百白破b型流感嗜血杆菌杆菌联合疫苗。无细胞百白破疫苗为0.5ml/支，注射时用无细胞百白破疫苗充分溶解b型流感嗜血杆菌结合疫苗，并充分摇匀，肌肉注射。
2、联合疫苗的效价检测：
1）无细胞百日咳、白喉、破伤风效价测定：均按照《中国药典》三部（2005版）要求进行。试验组为无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗，参比组为无细胞百白破疫苗。
2）Hib效价测定：将NIH小鼠随机分为3组，每组10只。试验组每只小鼠皮下注射无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗；参比组注射b型流感嗜血杆菌结合疫苗（冻干制剂）；对照组注射0.85%NaCl溶液。
注射方法及检测方法均按照《中国药典》（2010版）“b型流感嗜血杆菌结合疫苗”效力试验方法进行。以高于阴性对照组小鼠血清的Cutoff值的百分比表示。
检测结果如表12所示。
表12不同实验组的效力检测结果
根据上述结果，无细胞百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗中，无细胞百白破疫苗的效价、Hib结合疫苗的效价均不低于2010版《中国药典》标准。制备为联合疫苗后，无细胞百白破疫苗、Hib结合疫苗的效价间并无显著影响。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，包括如下组分和含量：
b型流感嗜血杆菌多糖 20-30μg/ml；
破伤风类毒素 40-100μg/ml；
pH值7.2-7.5。
2.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
1）制备b型流感嗜血杆菌多糖；
2）制备b型流感嗜血杆菌多糖-破伤风类毒素结合物混合液；
3）纯化：以TRIS-HCl缓冲液作为流动相，用层析法纯化步骤2）中的混合液，得到b型流感嗜血杆菌结合疫苗。
3.根据权利要求2所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl缓冲液，浓度为20-100mmol/L，pH值为7.2-7.5。
4.根据权利要求3所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl缓冲液浓度为20-50mmol/L。
5.根据权利要求1所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，还包括赋形剂。
6.根据权利要求5所述的b型流感嗜血杆菌结合疫苗，其特征在于，所述赋形剂为TRIS-HCl缓冲液和氯化钠；
或TRIS-HCl缓冲液和乳糖。
7.根据权利要求6所述的结合疫苗，其特征在于，所述TRIS-HCl缓冲液浓度为8-12mmol/L、氯化钠浓度为7.5-9.5mg/ml、乳糖浓度为20-30mg/ml。
8.根据权利要求1-7任一项所述的结合疫苗，其特征在于，所述结合疫苗进一步制备得到百白破b型流感嗜血杆菌联合疫苗。
9.权利要求1-8任一项所述b型流感嗜血杆菌结合疫苗在制备用于预防由b型流感嗜血杆菌感染导致的脑膜炎、肺炎、败血症、蜂窝组织炎、关节炎、会厌炎感染性疾病的药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130403 |