DE69936733T2

DE69936733T2 - Vaskulärer endothelialer wachstumsfaktor x

Info

Publication number: DE69936733T2
Application number: DE69936733T
Authority: DE
Inventors: Robert Douglas Janssen Phar GORDON; Jorg Jurgen Janssen Phar SPRENGEL; Jeffrey Roland Janssen Phar YON; Josiena Johanna Huberdina Dijkmans; Anna Johnson & Jo 199 Grandview Road Skillman GOSIEWSKA; Sridevi N. Johnson & Jo 199 Grandview Road Skillman DHANARAJ; Jean Johnson & Jo 199 Grandview Road Skillman XU
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-21
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2019-12-22
Also published as: DK1141293T3; NZ512892A; WO2000037641A3; EP1141293A2; CA2356009A1; IL143832A0; ATE368739T1; AU2712400A; AU778412B2; EP1141293B1; WO2000037641A2; DE69936733D1; CA2356009C; ES2291047T3

Description

Die folgende Erfindung betrifft einen neuen vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) mit der hier verwendeten Bezeichnung "VEGF-X" sowie die Charakterisierung der Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen von VEGF-X.
Einleitung
Die Angiogenese beinhaltet die Bildung und Proliferation neuer Blutgefäße und stellt einen essentiellen physiologischen Vorgang für das normale Wachstum und die normale Entwicklung von Geweben beispielsweise bei der Embryonalentwicklung, Geweberegeneration und der Organ- und Gewebereparatur dar. Ebenso ist die Angiogenese am Wachstum menschlicher Krebserkrankungen beteiligt, die eine kontinuierliche Stimulierung des Wachstums von Blutgefäßen benötigen. Eine abnormale Angiogenese ist mit anderen Krankheiten, wie z.B. rheumatoider Arthritis, Psoriasis und diabetischer Retinopathie, assoziiert.
Kapillargefäße bestehen aus Endothelzellen, wie die zur Proliferation zur Bildung von Kapillarnetzwerken notwendigen genetischen Informationen tragen. Angiogene Moleküle, die diesen Vorgang starten können, sind bereits charakterisiert worden. Ein hochselektives Mitogen für vaskuläre Endothelzellen ist der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) (Ferrara et al., "Vascular Endothelial Growth Factor: Basic Biology and Clinical Implications". Regulation of angiogenesis, von I.D. Goldberg und E.M. Rosen 1997 Birkhauser Verlag Basel/Schweiz). VEGF ist ein wirksames vasoaktives Protein, das ein glykosyliertes kationisches 46–49 kd großes Dimer mit zwei 24 kd großen Untereinheiten umfaßt. Es wird durch Sulfhydrylreduktionsmittel inaktiviert und ist gegenüber saurem pH-Wert und Wärme resistent und bindet an immobilisiertes Heparin.
VEGF-A weist vier unterschiedliche Formen mit 121, 165, 189 bzw. 206 Aminosäuren aufgrund von alternativem Spleißen auf. VEGF121 und VEGF 165 sind löslich und zur Förderung der Angiogenese imstande, wohingegen VEGF 189 und VEGF206 an heparinhaltige Proteoglykane in der Zelloberfläche gebunden sind. Die zeitliche und räumliche Expression von VEGF wurde mit der physiologischen Proliferation der Blutgefäße korreliert (Gajdusek, C.M und Carbon, S.J., Cell Physiol., 139:570–579, (1989)); McNeil, P.L., Muthukrishnan, L., Warder, E., D'Amore, P.A., J. Cell. Biol., 109:811–822, (1989)). Seine hochaffinen Bindungsstellen werden lediglich auf Endothelzellen in Gewebeschnitten lokalisiert (Jakeman, L.B., et al., Clin. Invest. 89:244–253 (1989)). Der Wachstumsfaktor läßt sich aus Hypophysenzellen und mehreren Tumorzellinien isolieren und wurde mit gewissen menschlichen Gliomen in Verbindung gebracht (Plate, K.H. Nature 359:845–848, (1992)). Es konnte gezeigt werden, daß die Hemmung der VEGF-Funktion durch monoklonale anti-VEGF-Antikörper das Tumorwachstum in immungeschwächten Mäusen hemmt (Kim, K.J., Nature 362:841–844, (1993)).
VEGF-Proteine sind in den folgenden Patenten und Anmeldungen beschrieben, die hiermit in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen sind: EP-0,506,477 , WO-95/24473 , WO-98/28621 , WO-90/13649 , EP-0,476,983 , EP-0,550,296 , WO-90/13649 , WO-96/26736 , WO-96/27007 , WO-98/49300 , WO-98/36075 , WO-98/840124 , WO-90/11084 , WO-98/24811 , WO-98/10071 , WO-98/07832 , WO-98/02543 , WO-97/05250 , WO-91/02058 , WO-96/39421 , WO-96/39515 , WO-98/16551 .
Es wurde festgestellt, daß ein neues Mitglied der VEGF-Familie, das als VEGF-R in der EP 0,984,063 , als VEGF-D in der WO-98/07832 und als VEGF-X in der vorliegenden Anmeldung bezeichnet wird, potentiell signifikante Vorteile für die Behandlung von Tumoren und anderen durch unangemessene angiogene Aktivität vermittelten Leiden aufweist.
Kurze Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Anmeldung wird die Sequenz einer in der Sequenz von VEGF-X vorhandenen CUB-Domäne bereitgestellt, wobei die Domäne selbst die Angiogenese verhindert und zur Behandlung von mit unangemessener Vaskularisierung oder Angiogenese assoziierten Krankheiten verwendet wird.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Erfindung wurde in der für das Protein VEGF-X codierenden Sequenz eine CUB-Domäne identifiziert, die bislang noch nicht in Wachstumsfaktoren vom VEGF-Typ identifiziert wurden. Das VEGF-X-Protein kann daher einen doppelten Regulationseffekt ausüben, und zwar über die Wechselwirkung mit den VEGF-Tyrosinkinase-Rezeptoren oder mit Neuropilinrezeptoren, vermittelt durch die CUB-Domäne. Somit kann die für die CUB-Domäne codierende Sequenz in einem Expressionsvektor zur anschließenden Transformation einer Wirtszelle, eines Wirtsgewebes oder -organismus enthalten sein.
VEGF-X oder Fragmente davon können in der Lage sein, die Effekte von proangiogenen Wachstumsfaktoren, wie z.B. VEGF zu modulieren, wie in den in den Beispielen unten dargestellen Ergebnissen angedeutet, daß der N-terminale Teil des VEGF-X-Proteins, eine CUB-ähnliche Domäne, die VEGF-stimulierte Proliferation von HUVECs hemmen kann. VEGF-X oder Fragmente davon können daher bei der Therapie von Leiden, an denen eine unangemessene Angiogenese beteiligt ist, geeignet sein. Die Hemmung der angiogenen Aktivität von VEGF wurde mit der Hemmung des Tumorwachstums in mehreren Modellen in Verbindung gebracht, z.B. Kim, K.J. et al, Nature 362:841–844, (1993). Darüber hinaus würde man erwarten, daß zur Hemmung der Angiogenese fähige Mittel bei der Behandlung anderer angiogeneseabhängiger Krankheiten, wie z.B. Retinopathie, Osteoarthritis und Psoriasis, geeignet sind (Folkman, J., Nature Medicine 1:27–31, (1995).
Wie ausführlicher in den hier beschriebenen Beispielen nachgewiesen ist, wurde von den Erfindern der vorliegenden Anmeldung überraschenderweise nachgewiesen, daß die CUB-Domäne von VEGF-X in der Lage ist, die entweder durch VEGF oder bFGF induzierte Stimulierung der Proliferation von HUVECs zu hemmen. Die CUB-Domäne kann daher als Therapeutikum zur Hemmung der, Angiogenese sowie zur Behandlung eines mit unangemessener Vaskularisierung oder Angiogenese assoziierten Leidens genutzt werden.
Daher wurde gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt ein Verfahren zur Hemmung angiogener Aktivität und unangemessener Vaskularisierung, einschließlich der Bildung und Proliferation neuer Blutgefäße, des Wachstums und der Entwicklung von Geweben, Geweberegeneration sowie Organ- und Gewebereperatur, in einem Individuum bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren dem Individuum eine Menge eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von Position 40 bis 150 der in 10 dargestellten Sequenz oder eines für die erfindungsgemäße CUB-Domäne codierenden Nukleinsäuremoleküls in ausreichender Konzentration verabreicht, um die angiogene Aktivität zu verringern oder zu verhindern.
Ferner wird ebenso ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung einer Krankheit aus der Gruppe Krebs, rheumatoider Arthritis, Psoriasis und diabetische Retinopathie bereitgestellt, wobei man in dem Verfahren dem Individuum eine Menge eines Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von Position 40 bis 150 der in 10 dargestellten Sequenz oder eines für die erfindungsgemäße CUB-Domäne codierenden Nukleinsäuremoleküls in ausreichender Konzentration verabreicht, um die genannten Erkrankungen zu behandeln oder zu verhindern.
Die CUB-Domäne kann auch zur Identifizierung von Verbindungen verwendet werden, die die angiogene Aktivität, wie z.B. unangemessene Vaskularisierung, hemmen oder verstärken, und zwar in einem Verfahren, bei dem man eine einen VEGF-Rezeptor und/oder einen Rezeptor vom Typ Neuropilin 1 oder 2 exprimierende Zelle mit der Verbindung in Gegenwart eines erfindungsgemäßen VEGF-X-Proteins in Kontakt bringt und auf den Effekt der Verbindung bzw. der Zelle im Vergleich mit einer Zelle, die nicht mit der Verbindung in Kontakt gebracht wurde, beobachtet. Solche Verbindungen können dann je nach Gegebenheit zur Vorbeugung oder Hemmung angiogener Aktivität, um die hier beschriebenen Erkrankungen oder Leiden zu behandeln, oder in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet werden. Ein Antikörper gegen die CUB-Domäne kann auch bei der Identifizierung anderer Proteine mit den genannten Sequenzen geeignet sein.
Ebenso wird durch diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, wie z.B. ein Antisense-Molekül, bereitgestellt, das zur Hybridisierung an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle unter Bedingungen hoher Stringenz befähigt ist, wobei diese Bedingungen dem Fachmann allgemein bekannt sein dürften.
Die Stringenz der Hybridisierung, wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf Bedingungen, unter denen Polynukleinsäuren stabil sind. Die Stabilität von Hybriden spiegelt sich in der Schmelztemperatur (Tm) der Hybride wider. Tm läßt sich näherungsweise durch die Formel 81,5°C + 16,6 (log10[Na+] + 0,41 (%G&C) – 600/lausdrücken, wobei 1 die Länge der Hybride in Nukleotiden bedeutet. Tm nimmt ungefähr um 1–1,5°C pro 1% Abnahme der Sequenzhomologie ab.
Der Begriff "Stringenz" bezieht sich auf die Hybridisierungsbedingungen, bei denen eine einzelsträngige Nukleinsäure eine Verbindung mit einem komplementären Strang eingeht, wenn die Purin- oder Pyrimidinbasen darin mit ihrer entsprechenden Base über Wasserstoffbrückenbindung paaren. Hochstringente Bedingungen begünstigen eine homologe Basenpaarung, wohingegen niedrigstringente Bedingungen nichthomologe Basenpaarung begünstigen.
"Niedrigstringente" Bedingungen umfassen beispielsweise eine Temperatur von etwa 37°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 50% sowie eine mäßige bis niedrige Salz(SSC)-Konzentration, oder alternativ eine Temperatur von etwa 50°C oder weniger sowie eine mäßige bis hohe Salz(SSPE)-Konzentration, z.B. 1M NaCl.
"Hochstringente" Bedingungen umfassen beispielsweise eine Temperatur von etwa 42°C oder weniger, eine Formamidkonzentration von weniger als etwa 20% sowie eine geringe Salz(SSC)-Konzentration, oder alternativ eine Temperatur von etwa 65°C oder weniger sowie eine niedrige Salz(SSPE)-Konzentration. So umfassen hochstringente Bedingungen beispielsweise die Hybridisierung in 0,5 M NaHPO₄, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C (Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Bd. I, 1989; Green Inc. New York, unter 2.10.3).
"SSC" umfaßt eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 20X SSC-Stammlösung enthält 3M Natriumchlorid, 0,3M Natriumcitrat, pH 7,0.
"SSPE" umfaßt eine Hybridisierungs- und Waschlösung. Eine 1X SSPE-Lösung enthält 180 mM NaCl, 9 mM Na₂HPO₄ und 1 mM EDTA, pH 7,4.
Die zur Hybridisierung an erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle fähige Nukleinsäure weist im allgemeinen eine Homologie von wenigstens 70%, vorzugsweise wenigstens 80 oder 90% und stärker bevorzugt wenigstens 95% zu den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen auf.
Das zur Hybridisierung an die erfindungsgemäße Nukleinsäure fähige Antisense-Molekül kann als Sonde oder als Arzneimittel verwendet werden oder kann in einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür enthalten sein.
Der Begriff "homolog" beschreibt die Verwandtschaft zwischen unterschiedlichen Nukleinsäuremolekülen oder Aminosäuresequenzen, wobei die Sequenzen oder Moleküle über eine teilweise Identität oder Ähnlichkeit in einem oder mehreren Blöcken oder Bereichen innerhalb der Moleküle bzw. Sequenzen verwandt sind.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind ebenso von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen codierte Proteine oder Polypeptide oder ein funktionelles Äquivalent, Derivat oder biologisches Vorläufermolekül davon umfaßt.
Die erfindungsgemäßen DNA-Moleküle können vorteilhafterweise in einem geeigneten Expressionsvektor zur Expression einer davon codierten CUB-Domäne in einem geeigneten Wirt enthalten sein. Der Einbau klonierter DNA in einen geeigneten Expressionsvektor zur anschließenden Transformation der Zelle und anschließenden Selektion der transformierten Zellen ist dem Fachmann allgemein bekannt, und zwar wie bei Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press angegeben.
Ein erfindungsgemäßer Expressionsvektor enthält einen Vektor mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen, wie beispielsweise Promotorbereichen, die zur Herbeiführung der Expression der DNA-Fragmente fähig sind. Dabei bezieht sich der Begriff "in operativer Verknüpfung" auf eine Situation, in der die nebeneinandergestellten beschriebenen Komponenten in einer Beziehung zueinander stehen, die ihnen gestattet, in ihrer vorgesehenen Weise zu funktionieren. Derartige Vektoren können in eine geeignete Wirtszelle transformiert werden, um so für die Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptids zu sorgen. Somit wird in einem weiteren Aspekt der Erfindung ein Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Polypeptide bereitgestellt, bei dem man eine mit einem wie oben beschriebenen Expressionsvektor transformierte oder transfizierte Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert, so daß für die Expression einer für die Polypeptide codierenden Codiersequenz von dem Vektor gesorgt wird, und die exprimierten Polypeptide isoliert.
Bei den Vektoren kann es sich beispielsweise um Plasmid-, Virus- oder Phagenvektoren handeln, die mit einem Replikationsursprung und gegebenenfalls einem Promotor zur Expression des Nukleotids und gegebenenfalls einem Regulator des Promotors versehen sind.
Die Vektoren können einen oder mehrere selektionierbare Marker, wie zum Beispiel Ampicillinresistenz, enthalten.
Zu für die Expression benötigten regulatorischen Elementen gehören Promotorsequenzen zur Bindung von RNA-Polymerase sowie Transkriptionsstartsequenzen für die Ribosomenbindung. So kann beispielsweise ein bakterieller Expressionsvektor einen Promotor, wie etwa den lac-Promotor, sowie für den Translationsstart die Shine-Dalgarno-Sequenz und das Startcodon AUG enthalten. In ähnlicher Weise kann ein eukaryontischer Expressionsvektor einen heterologen oder homologen Promotor für RNA-Polymerase II, ein stromabwärts liegendes Polyadenylierungssignal, das Startcodon AUG sowie ein Terminationscodon zur Ablösung des Ribosoms enthalten. Solche Vektoren sind kommerziell erhältlich oder können aus den beschriebenen Sequenzen mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren zusammengesetzt werden.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle können in die beschriebenen Vektoren in einer Antisense-Orientierung inseriert werden, um so für die Produktion von Antisense-RNA zu sorgen. Antisense-RNA oder andere Antisense-Nukleinsäuren können mittels Synthese produziert werden.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung umfaßt eine definierte Nukleinsäure nicht nur die identische Nukleinsäure, sondern auch alle kleineren Basenvariationen, einschließlich insbesondere Substitutionen in Fällen, die aufgrund des degenerierten Codes bei konservativen Aminosäuresubstitutionen zu einem synonymen Codon (einem unterschiedlichen, den gleichen Aminosäurerest bezeichnenden Codon) führen. Der Begriff "Nukleinsäuresequenz" umfaßt ebenso die komplementäre Sequenz zu jeder gegebenen einzelsträngigen Sequenz hinsichtlich Basenvariationen.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso vorteilhafterweise Nukleinsäuresequenzen mit wenigstens ungefähr 10 zusammenhängenden Nukleotiden einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure und vorzugsweise mit 10 bis 50 Nukleotiden bereit, wobei die Nukleinsäuresequenzen noch stärker bevorzugt die in 26 dargestellten Sequenzen umfassen. Diese Sequenzen können vorteilhafterweise als Sonden oder Primer zum Start der Replikation oder dergleichen verwendet werden. Derartige Nukleinsäuresequenzen können nach im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken, wie beispielsweise mittels Rekombination oder Synthese, produziert werden. Ebenso können sie in diagnostischen Kits oder dergleichen zum Nachweis des Vorhandenseins einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure verwendet werden. Bei diesen Tests wird im allgemeinen die Sonde mit der Probe unter hybridisierenden Bedingungen in Kontakt gebracht und ein Nachweis auf das Vorhandensein irgendeiner Duplex- oder Triplexbildung zwischen der Sonde und irgendeiner Nukleinsäure in der Probe durchgeführt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können diese Sonden an einem festen Träger verankert sein. Vorzugsweise liegen sie dabei auf einem Array vor, so daß mehrere Sonden gleichzeitig an eine einzige biologische Probe hybridisieren können. Die Sonden können punktweise auf den Array aufgebracht oder in situ auf dem Array synthetisiert werden (siehe Lockhart et al., Nature Biotechnology, Bd. 14, Dezember 1996 "Expression monitoring by hybridisation to high density oligonucleotide arrays"). Ein einzelner Array kann mehr als 100, 500 oder sogar 1000 unterschiedliche Sonden an separaten Orten enthalten.
Die Nukleinsäuresequenzen können gemäß der vorliegenden Erfindung unter Verwendung solcher rekombinanten oder synthetischen Mittel, wie etwa beispielsweise unter Verwendung von PCR-Klonierungsmechanismen, produziert werden, bei denen im allgemeinen ein Primerpaar hergestellt wird, wobei die Primer eine Größe von ungefähr 10 bis 50 Nukleotiden zu einem Bereich des Gens, den man zu klonieren wünscht, aufweisen, die Primer mit mRNA, cDNA oder genomischer DNA aus einer menschlichen Zelle in Kontakt bringt, eine Polymerasekettenreaktion unter Bedingungen, die zur Amplifikation des gewünschten Bereichs führen, durchführt, den amplifizierten Bereich bzw. das amplifizierte Fragment isoliert und die amplifizierte DNA gewinnt. Im allgemeinen sind derartige Techniken im Fachgebiet gut bekannt und beispielsweise bei Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1989) beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Oligonukleotide können eine Anzeigemarkierung tragen. Zu geeigneten Markierungen gehören Radioisotope, wie z.B. ³²P oder ³⁵S, Enzymmarkierungen oder andere Proteinmarkierungen, wie etwa Biotin, oder Fluoreszenzmarker. Derartige Markierungen können an die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder Oligonukleotide angefügt werden und unter Verwendung bekannter Techniken per se nachgewiesen werden.
Vorteilhafterweise können menschliche Allelvarianten oder Polymorphismen des erfindungsgemäßen DNA-Moleküls identifiziert werden, indem beispielsweise cDNA oder genomische Bibliotheken aus einer Reihe von Individuen, beispielsweise aus unterschiedlichen Populationen, mit Sonden abgesucht werden. Weiterhin können erfindungsgemäße Nukleinsäuren und Sonden zur Sequenzierung genomischer DNA aus Patienten unter Verwendung von im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken, wie etwa des Dideoxykettenabbruchverfahrens nach Sanger, verwendet werden, wodurch vorteilhafterweise eine eventuelle Veranlagung eines Patienten für bestimmte mit einem erfindungsgemäßen Wachstumsfaktor assoziierte Erkrankungen festgestellt werden kann.
Das erfindungsgemäße Protein enthält alle möglichen durch das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül codierten Aminosäurevarianten, einschließlich eines durch das Molekül codierten und konservative Aminosäureänderungen aufweisenden Polypeptids. Konservative Aminosäuresubstitution bezieht sich auf einen Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren in einem wie in Tabelle 1 identifizierten Protein. Zu erfindungsgemäßen Proteinen oder Polypeptiden gehören ferner Varianten solcher Sequenzen, einschließlich natürlich vorkommender Allelvarianten, die weitgehend zu den Proteinen oder Polypeptiden homolog sind. In diesem Zusammenhang wird eine Sequenz als weitgehend homolog bezeichnet, die wenigstens 70%, vorzugsweise 80 oder 90% und vorzugsweise 95% Aminosäurehomologie mit den durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen codierten Proteinen oder Polypeptiden aufweist. Das erfindungsgemäße Protein kann dabei rekombinant, synthetisch oder natürlich vorkommend sein, ist jedoch vorzugsweise rekombinant.
Die Nukleinsäure bzw. das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung kann als Arzneimittel oder bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs oder anderen Krankheiten oder Leiden, die mit der Expression des VEGF-X-Proteins assoziiert sind, verwendet werden.
Vorteilhafterweise kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül oder das erfindungsgemäße Protein in einer pharmazeutischen Zusammensetzung zusammen mit einem pharmakologisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür bereitgestellt werden.
In einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird eine Wirtszelle oder ein Organismus, transformiert oder transfiziert mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor, bereitgestellt.
Gemäß einem weiteren erfindungsgemäßen Aspekt wird ebenso eine transgene Zelle, ein transgenes Gewebe oder ein transgener Organismus bereitgestellt, die bzw. das bzw. der ein zur Expression einer erfindungsgemäßen CUB-Proteindomäne fähiges Transgen umfaßt. Der Begriff "zur Expression fähiges Transgen", wie er hier verwendet wird, bedeutet eine geeignete Nukleinsäuresequenz, die zur Expression von Proteinen mit der gleichen Funktion und/oder Aktivität führt. Das Transgen kann beispielsweise aus menschlichen Zellen isolierte genomische Nukleinsäure oder synthetische Nukleinsäure, einschließlich in das Genom integrierter oder in einem extrachromosomalen Zustand befindlicher DNA, umfassen. Vorzugsweise umfaßt das Transgen die für die erfindungsgemäßen Proteine codierende Nukleinsäuresequenz, wie hier beschrieben.
Antikörper gegen das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung können vorteilhafterweise mit im Fachgebiet bekannten Techniken hergestellt werden. So können beispielsweise polyklonale Antikörper hergestellt werden, indem man ein Wirtstier, wie z.B. eine Maus oder ein Kaninchen, mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid oder einem Epitop davon inokuliert und Immunserum gewinnt. Monoklonale Antikörper können gemäß bekannten Techniken, wie beispielsweise von Kohler R. und Milstein C., Nature (1975) 256, 495–497 beschrieben, hergestellt werden. Vorteilhafterweise können derartige Antikörper in einem Kit zur Identifizierung eines CUB-Domänen-Polypeptids in einer Probe zusammen mit Mitteln zum Inkontaktbringen des Antikörpers mit der Probe enthalten sein.
Die Erfindung stellt ebenso ferner eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die den Antikörper zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerstoff, Verdünnungsmittel oder Hilfsmittel dafür umfaßt.
Proteine, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid Wechselwirken, können durch Untersuchen von Proteinwechselwirkungen unter Verwendung des zuerst von Chien et al., (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 9578–9582 vorgeschlagenen Zwei-Hybrid-Vektorsystems, identifiziert werden.
Diese Technik beruht auf der funktionellen Wiederherstellung eines Transkriptionsfaktors in vivo, wodurch ein Reportergen aktiviert wird. Insbesondere wird bei der Technik eine entsprechende Wirtszelle mit einem ein Reportergen unter der Kontrolle eines von einem Transkriptionsfaktor mit einer DNA-bindenden Domäne und einer aktivierenden Domäne regulierten Promotors umfassenden DNA-Konstrukt versehen, eine erste Hybrid-DNA-Sequenz, die für eine erste Fusion eines Fragments oder eine gesamte erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz sowie entweder die DNA-bindende Domäne oder die aktivierende Domäne des Transkriptionsfaktors codiert, in der Wirtszelle exprimiert, wenigstens eine zweite Hybrid-DNA-Sequenz, wie etwa eine Bibliothek oder dergleichen, die für mutmaßliche zu untersuchende Bindungsproteine zusammen mit der DNA-bindenden bzw. aktivierenden Domäne des Transkriptionsfaktors, die nicht in der ersten Fusion eingebaut ist, codiert, im Wirt exprimiert, eine eventuelle Bindung der zu untersuchenden Proteine mit einem erfindungsgemäßen Protein durch Durchführen eines Nachweises auf das Vorhandensein eines eventuellen Reportergenprodukts der Wirtszelle nachgewiesen und gegebenenfalls zweite Hybrid-DNA-Sequenzen, die für das Bindungsprotein codieren, isoliert.

Beispielsweise wird bei einer derartigen Technik das GAL4-Protein in Hefe genutzt. Bei GAL4 handelt es sich um einen Transkriptionsaktivator des Galactosestoffwechsels in der Hefe, der eine separate Domäne zur Bindung an Aktivatoren stromaufwärts der Galaktosestoffwechselgene ebenso wie eine proteinbindende Domäne aufweist. Nukleotidvektoren können konstruiert werden, von denen einer die für die DNA-bindende Domäne von GAL4 codierenden Nukleotidreste umfaßt. Diese Bindungsdomänenreste können an eine bekannte proteincodierende Sequenz, wie beispielsweise die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren fusioniert werden. Der andere Vektor umfaßt die für die proteinbindende Domäne von GAL4 codierenden Reste. Diese Reste werden an für ein Testprotein codierende Reste fusioniert. Eine eventuelle Wechselwirkung zwischen von der erfindungsgemäßen Nukleinsäure codierten Poylpeptiden und dem zu testenden Protein führt zur Transkriptionsaktivierung eines Reportermoleküls in einer Hefezelle mit GAL-4-Transkriptionsdefekt, in die die Vektoren transformiert wurden. Vorzugsweise wird ein Reportermolekül, wie z.B. β-Galactosidase bei Wiederherstellung der Transkription der Galaktosestoffwechselgene der Hefe aktiviert. Hinterlegte Plasmide

	Hinterlegungsdatum	Zugangs Nr.
Plasmid VEGFX/pCR2.1 1TOPO FL	1. März 1999	LMBP 3925
Plasmid VEGFX/pRSETB BD Aminosäuren G230-G345	1. März 1999	LMBP 3926
Plasmid VEGFX/pcR.2.1 FL Klon 9	20. Oktober 1999	LMBP 3977
Plasmid VEGF-X CUB PET22b	20. Dezember 1999	–

Die obigen Plasmide wurden bei den Belgian Coordinated Collections of Microorganisms (BCCM) am Laboratorium Voor Moleculaire Biologie-Plasmidencollectie (LMBP) B- 9000, Gent, Belgien gemäß den Bestimmungen des Budapester Vertrags vom 28. April 1977 hinterlegt.
Zum besseren Verständnis der Erfindung sei auf das beigefügte Beispiel, das rein beispielhafter Natur ist, sowie auf die beiliegenden Zeichnungen verwiesen, wobei:
1: eine in der Datenbank Incyte LifeSeq^TM identifizierte, für ein neuartiges VEGF-X-Protein codierende DNA-Sequenz darstellt.
2: eine Darstellung der Aminosäuresequenz der Nukleinsäuresequenz aus 1 repräsentiert.
3: zur Identifizierung des erfindungsgemäßen VEGF-X-Proteins benutzte PCR-Primersequenzen darstellt.
4: schematisch die räumlichen Beziehungen in der VEGF-X-Sequenz der unter Verwendung der PCR-Primersequenzen aus 3 identifizierten Klone darstellt.
5: die Nukleotidsequenzen der 5'-RACE-Primer, die zur Identifizierung des 5'-Endes des offenen Leserasters von VEGF-X verwendet wurden, darstellt.
6: eine aus dem RACE-Experiment erhaltene Sequenz darstellt.
7: die aus dem Absuchen der Datenbank LifeSeq^TM unter Verwendung der Sequenz in 6 erhaltenen Nukleotidsequenzen darstellt.
8: die zur Klonierung der gesamten codierenden Sequenz von VEGF-X verwendeten Primer darstellt.
9: die gesamte codierende Sequenz von VEGF-X darstellt.
10: die vorhergesagte Aminosäuresequenz der Nukleotidsequenz aus 9 darstellt.
11: eine vergleichende Gegenüberstellung der Sequenz aus 10 mit den Sequenzen von VEGF-A bis D darstellt.
12: Sequenzvarianten des erfindungsgemäßen VEGF-X-Proteins darstellt.
13: die zur E. coli-Expression von VEGF-X-Domänen sowie zur Expression der Vollängensequenz von VEGF-X in einem Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystem verwendeten Oligonukleotidprimer darstellt.
14: Nukleinsäuresequenzen von 18 aus einer BLAST-Suche der LifeSeq^TM-Datenbank erhaltenen menschlichen EST-Klonen, die zur Identifizierung der vollständigen für VEGF-X codierenden Sequenz verwendet wurden, zeigt.
15: die Nukleotidsequenzen von 50 aus der LifeSeq^TM-Datenbank erhaltenen menschlichen EST-Klonen zeigt.
16: als Primer zur Identifizierung der für VEGF-X codierenden Nukleotidsequenz benutzte Nukleotidsequenzen darstellt.
17: eine für ein erfindungsgemäßes VEGF-X-Teilprotein codierende Nukleotidsequenz darstellt.
18: eine für erfindungsgemäßes VEGF-X-Protein codierende Teilnukleotidsequenz darstellt.
19: eine zur Expression von VEGF-X in Säugerzellen verwendete DNA- bzw. Polypeptidsequenz darstellt. Die vorhergesagte VEGF-X-Signalsequenz ist in Kleinbuchstaben dargestellt. Das C-terminale V5-Epitop sowie His6-Sequenzen sind unterstrichen.
20: eine für die Baculovirus/Insektenzellen-Expression von VEGF-X verwendete DNA- bzw. Polypeptidsequenz darstellt. In der Polypeptidsequenz ist die Signalsequenz in Kleinbuchstaben gezeigt. Das an die vorhergesagte reife VEGF-X-Sequenz angefügte N-terminale Peptid-Tag ist unterstrichen.
21: eine zur Expression von VEGF-X in E. coli verwendete DNA- bzw. Polypeptidsequenz darstellt. Die aus der MBP-Fusion stammenden Polypeptidsequenzen bzw. die Sequenzen des His6-Tags am N- bzw. C-Terminus sind unterstrichen.
22: die Dimerisierung von VEGF-X über Disulfidverknüpfung darstellt. Proteinproben wurden mittels SDS-PAGE analysiert. Vor dem Auftragen auf das Gel wurden die Proben 5 Minuten in Probenpuffer in Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von Reduktionsmittel auf 95°C erhitzt. (A) Proben von der Expression eines Konstrukts mit C-terminalem V5/His6-Peptid-Tag in COS-Zellen. Bei der linken Abbildung handelt es sich um konditioniertes Gesamtmedium, bei der rechten um auf Nickel-Agaroseharz gereinigtes Material. Reduziertes Monomer und mutmaßliches disulfidverknüpftes, nichtreduziertes Dimer sind durch Pfeile angedeutet. Während der Aufreinigung scheint eine Proteolyse des Proteins stattzufinden. Die Gele wurden auf Nylonmembranen mittels Blotting übertragen, und Protein wurde mit einem monoklonalen Anti-V5-Antikörper nachgewiesen. (B) Proben von der Expression eines Maltosebindungsprotein/His6-Doppelfusionskonstrukts in E. coli. M bezeichnet die Molekulargewichtsmarker (Benchmark, LifeTechnologies). Das Gel wurde mit Coomassie Blue nach Standardverfahren angefärbt. Das Fusionsprotein weist ein scheinbares Molekulargewicht von 80 kDa auf.
23: die Glykosylierung von VEGF-X darstellt. VEGF-X wurde aus dem Kulturüberstand von mit dem pcDNA6/V5-His-Konstrukt transfizierten COS-Zellen aufgereinigt. Überstände wurden 72 h nach der Transfektion geerntet und an Nickelharz aufgereinigt. Die Proben wurden danach vor der SDS-PAGE und dem Blotting, wie in der Beschreibung zu 22 angegeben, mit EndoH (+) oder nicht (–) behandelt.
24: die zur Expression der VEGF-ähnlichen Domäne von VEGF-X in E. coli verwendete DNA- bzw. Polypeptidsequenz darstellt. Aus dem Vektor stammende Polypeptidsequenzen am N-Terminus des Proteins sind unterstrichen.
25: die Expression der VEGF-X-VEGF-Domäne in E. coli zeigt. Spur 1–10 μl Breitbandmarker (New England Biolabs), Spur 2–10 μl nichtreduzierte Probe, Spur 3–10 μl reduzierte Probe. Das reduzierte PDGF-Domäne-Protein (Spur 3) weist ein scheinbares Molekulargewicht von ungefähr 19 kDa auf SDS-PAGE auf.
26: eine für die Expression der CUB-ähnlichen Domäne von VEGF-X in E. coli verwendete DNA- bzw. Polypeptidsequenz darstellt. Die von dem vektorcodierten Signal stammende Polypeptidsequenz am N-Terminus und das eingeführte His6-Tag sind unterstrichen.
27: die Expression der VEGF-X-CUB-Domäne in E. coli zeigt. Das CUB-Domäne-Protein wurde an Nickelchelatharz aufgereinigt. Das Protein wandert auf SDS-PAGE bei ungefähr 23 kDa.
28: den Effekt von verkürztem VEGF-X (CUB-Domäne) auf die HUVEC-Proliferation darstellt. (A) HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) (eintägige Behandlung). (B) HUVEC-Zellen (24stündiges Hungern nach eintägiger Behandlung). (C) Effekt von VEGF-A₁₆₅ und der VEGF-X-CUB-Domäne auf die Proliferation von HUVEC-Zellen (zweitägige Behandlung).
29: die Gewebeverteilung von VEGF-X-mRNA, analysiert mittels Northern-Blotting und RT-PCR in (A) Normalgeweben und (B) Tumorgewebe und Zellinien zeigt.
30: die partielle Intron/Exon-Struktur des VEGF-X-Gens zeigt. (A) Genomische DNA-Sequenzen von 2 durch Sequenzieren bestimmten Exons; Exonsequenz in Großbuchstaben, Intronsequenz in Kleinbuchstaben. (B) zeigt die Lokalisierung von Spleißstellen innerhalb der VEGF-X-cDNA-Sequenz. Die Lokalisierung von mRNA-Spleißereignissen ist durch senkrechte Linien angedeutet. Die kryptische Spleißdonor/-akzeptor-Stelle bei nt. 998/999 (diagonale Linien) ergibt die Spleißvariantenformen von VEGF-X. Für den kursiv gezeigten Bereich sind keine Spleißstelleninformationen angegeben.
31: eine graphische Repräsentation des Effekts von FL-VEGF-X auf die HUVEC-Proliferation darstellt: (24 Stunden Serumentzug und anschließende eintägige Behandlung).
32: eine graphische Repräsentation des kombinierten Effekts von verkürztem VEGF-X (CUB-Domäne) und menschlichem rekombinantem VEGF₁₆₅ auf die HUVEC-Proliferation darstellt: (24 Stunden Serumentzug mit anschließender zweitägiger Behandlung).
33: eine graphische Repräsentation des kombinierten Effekts der CUB-Domäne und von menschlichem rekombinantem bFGF auf die HUVEC-Proliferation darstellt: (24 Stunden Serumentzug mit anschließender zweitägiger Behandlung).
34: eine graphische Repräsentation der Ergebnisse eines LDH-Assays zum Testen der Cytotoxizität der CUB-Domäne oder der CUB-Domäne mit rhVEGF₁₆₅ darstellt.
35: eine graphische Repräsentation der aus einem LDH-Assay zum Testen der Cytotoxizität der CUB-Domäne oder CUB-Domäne mit rh-bFGF erhaltenen Ergebnisse darstellt.
Eine BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul et al., 1990 J. Mol. Biol. 215, 403–410)-Suche wurde in der firmeneigenen menschlichen EST-Datenbank LifeSeq^TM (Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, Kalifornien, USA) durchgeführt. BLAST produziert vergleichende Gegenüberstellungen sowohl von Nukleotid- als auch Aminosäuresequenzen zur Bestimmung der Sequenzähnlichkeit. Aufgrund der lokalen Natur der Gegenüberstellungen eignet sich BLAST vor allem bei der Bestimmung genauer Übereinstimmungen oder bei der Identifizierung von Homologen. Zwar eignet es sich für Übereinstimmungen, die keine Lücken enthalten, doch ist es für die Durchführung einer motivartigen Suche ungeeignet. Die grundlegende Einheit der BLAST-Algorithmusausgabe ist das HSP (High-Scoring Segment Pair).
Achtzehn menschliche EST-Klone (14) mit starker Ähnlichkeit zu den zuvor identifizierten VEGF-Proteinen wurden identifiziert, wobei weitere fünfzig EST-Klone (15) unter Verwendung dieser Sequenzen als Abfragesequenzen identifiziert wurden, was uns gestattete, die mutmaßliche Sequenz für das neue VEGF-X-Protein abzuleiten. Die erhaltenen Sequenzen wurden mit bekannten Sequenzen verglichen, um Homologiebereiche zu bestimmen und die Sequenz als neuartiges VEGF-Typ-Protein zu identifizieren. Unter Verwendung der DNA-Sequenzinformationen in den Datenbanken waren wir in der Lage, geeignete Primer mit den in 3 dargestellten Sequenzen von VEGF-X 1–10 für die Verwendung in danach erfolgenden RACE-Experimenten zur Gewinnung der vollständigen DNA-Sequenz für das VEGF-X-Gen herzustellen.
Klonierung
Auf der Grundlage der VEGF-ähnlichen Domäne in existierenden VEGF-Sequenzen (VEGF-A, B, C und D) wurde ein Profil entwickelt. Dieses wurde zur Suche der öffentlichen Datenbanken sowie der Incyte LifeSeq^TM-Datenbank verwendet. In den öffentlichen Datenbanken wurden keine signifikanten neuen übereinstimmenden Sequenzen gefunden. Alle in der LifeSeq^TM-Datenbank gefundenen übereinstimmenden Sequenzen (1000) wurden unter Erhalt einer kleineren Zahl von Sequenzen (~30), die die bekannten VEGFs und einen potentiellen neuartigen VEGF enthielten, zusammengebaut (1 und 2). Diese Sequenz wurde VEGF-X genannt.
Zur Amplifikation der VEGF-X-Sequenz aus cDNA wurden Oligonukleotide konstruiert (3). Die in LifeSeq^TM gefundenen ESTs stammten aus einer Reihe von Geweben, mit einem leichten Übergewicht von Sequenzen aus Ovarien, Testis, Plazenta und Lunge (14 und 15). Dementsprechend wurden die Oligonukleotide zur Amplifikation von aus Lunge und Plazenta stammender cDNA verwendet. Bei den PCR-Produkten der ersten Runde wurde festgestellt, daß ihre Länge ~200 Bp größer als erwartet war, während nach einer zweiten Runde PCR-Amplifikation 3 Hauptspezies auftraten, deren kleinste die erwartete Größe aufwies. Diese Fragmente wurden kloniert und sequenziert. Das kleinste Fragment wies tatsächlich die ursprünglich aus der LifeSeq-Datenbank identifizierte Sequenz auf, während die anderen Insertionen enthielten (4).
Da die erste Amplifikationsrunde darauf schließen ließ, daß es sich bei der in cDNA aus Eierstock und Plazenta gefundenen Hauptspezies nicht um die ursprünglich in der LifeSeq^TM-Datenbank identifizierte Sequenz handelte, konzentrierten sich die Bemühungen statt dessen auf die mutmaßlichen Hauptspezies (es schien wahrscheinlich, daß die Klone 57, 25–27 und die 2,1 kB großen Klone 1–3 in 4 die Haupt-mRNA-Spezies repräsentierten). Die konzeptionelle Translation der DNA-Sequenzen dieser klonierten PCR-Fragmente deutete darauf hin, daß das komplette offene Leseraster in den Klonen bzw. in der Sequenz aus LifeSeq^TM nicht vorhanden war. Während alle Klone die gleiche Sequenz im Bereich des Translationsterminationscodons enthielten, was darauf hindeutete, daß das Ende des offenen Leserasters identifiziert worden war, war das 5'-Ende des offenen Leserasters nicht kloniert worden. Daher wurden 5'-RACE-Experimente durchgeführt, um den Beginn des Leserasters zu finden. Für RACE-Experimente konstruierte PCR-Primer sind in 5 dargestellt. RACE-PCR-Produkte wurden direkt sequenziert. Dabei konnte Sequenz vom 3'-Ende dieser RACE-Produkte, jedoch nicht vom 5'-Ende erhalten werden, und zwar wahrscheinlich deswegen, weil die Produkte nicht kloniert wurden und daher am 5'-Ende heterogen waren. Diese neue Sequenz wurde mit der existierenden klonierten Sequenz zusammengefügt, so daß die in 6 gezeigte Sequenz erhalten wurde. Das Absuchen der LifeSeq^TM-Datenbank mit dieser Sequenz identifiziert ESTs, die die Sequenz um weitere 140 Bp in 5'-Richtung und um weitere 160 Bp in 3'-Richtung verlängern (7). Dieses längere Contig wurde zur Konstruktion von Oligonukleotidprimern zur Amplifikation der gesamten codierenden Sequenz verwendet (diese Primersequenzen sind in 8 dargestellt). Die PCR wurde unter Verwendung der Primer 5'-1 und vegfX10 (um eine "Vollängen"-cDNA zu klonieren) sowie mit den Primern 5'-1 und vegfX6 (um den vollständigen codierenden Bereich zu klonieren, siehe 3 hinsichtlich der Sequenzen von vegfX10 und vegfX6) durchgeführt. Eine Reihe von Klonen wurde für das kürzere Fragment erhalten, von denen die Klone 4 und 7 keine PCR-Fehler enthalten (Sequenz der Klone 4 & 7 in 9). Für das längere Fragment wurde ein einzelner Klon erhalten (Klon 9), doch scheint diese Sequenz 2 PCR-Fehler zu enthalten.
Das vorhergesagte Polypeptid von diesen längeren Contigs ist in 10 dargestellt. Dabei wird vorhergesagt, daß die Aminosäuren 1–22 eine Signalsequenz codieren (von Heijne, 1986, Nucleic Acids Res. 14, 4683–4690). In 11 ist eine vergleichende Gegenüberstellung der Proteinsequenz mit den VEGFs A–D dargestellt. Der zu den anderen VEGFs homologe Bereich liegt nach dem C-Terminus des Proteins zu. Da erwartet wird, daß die VEGF-Homologiedomäne zur TGF-Beta-Superfamilie von Wachstumsfaktoren gehört und aus einem sowohl intra- als auch intermolekulare Disulfidbindungen enthaltenden Dimer besteht, konzentrierten sich die ersten Gegenüberstellungen auf die Cysteine. Allerdings läßt die Kartierung der Sequenz auf die bekannte Röntgenstruktur der VEGF-A-rezeptorbindenden Domäne (Muller et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci USA 94, 7192–7197) darauf schließen, daß die Gegenüberstellung in 11 plausibel ist, da die 4 zusätzlichen Cysteinreste im VEGF-Homologiebereich von VEGF-X (verglichen mit diesem Bereich von VEGF-A) Resten entsprechen, die in VEGF-A räumlich nahe beieinander liegen, und daher in der Lage sein könnten, Disulfidbindungen zu bilden.
Durch eine Suche der PFAM-Datenbank von Proteindomänen mit der Vollängen-Polypeptidsequenz aus 10 werden zwei Konsensusdomänensequenzen innerhalb des Polypeptids identifiziert. Die näher am C-Terminus liegende Domäne ist eine "VEGF"-Domäne: (alle bekannten VEGFs enthalten diese Domäne, und die Struktur dieses Bereichs von VEGF-A ist ähnlich zu der von PDGF). Darüber hinaus gibt es nach dem N-Terminus des Polypeptids zu eine CUB-Domäne (Aminosäuren ~40–150). Bei der CUB-Domäne handelt es sich um eine 100–110 Aminosäuren große extrazelluläre Domäne, die in einer Reihe von entwicklungsregulierten Proteinen angetroffen wird. Wird das Vollängenprotein zur Absuche der Proteindatenbanken mit dem BLAST-2-Algorithmus verwendet, so sind die Punktwerte für Übereinstimmungen mit CUB-Domänen enthaltenden Proteinen signifikanter als für solche mit den anderen VEGFs. Interessanterweise stehen die signifikantesten Übereinstimmungen mit den CUB-Domänen von Neuropilinen, wobei Neuropilin-1 kürzlich als ein Rezeptor einer der VEGF-A-Isoformen, VEGF-A₁₆₅ indentifiziert wurde, (Soker et al. (1998) Cell 92, 735–745).
Unter der Annahme, daß die durch PCR isolierten Sequenzvarianten (d.h. die kleineren PCR-Fragmente) die gleiche Translationsstartstelle wie die Vollängen sequenz verwenden, würde dies zur Produktion der in 12 dargestellten Proteinvarianten führen. Dabei kann signifikant sein, daß in beiden dieser Proteinvarianten die CUB-Domäne erhalten und die VEGF-ähnliche Domäne vollständig oder teilweise deletiert ist. Die Produktion dieser Sequenzvarianten läßt sich mit der Verwendung einer kryptischen Spleißdonor/-akzeptor-Stelle innerhalb der VEGF-X-Sequenz erklären (30B, zwischen nt. 998/999): dabei entsteht eine Variante durch Ausspleißen des Bereichs zwischen nt. 729–998 und die andere durch Ausspleißen des Bereichs zwischen nt. 999–1187.
Expression
Expressionskonstrukte in voller Länge
Säugerzellen
Der die vollständige CDS von VEGF-X (siehe 9) enthaltende Klon 4 wurde zur Erzeugung von Konstrukten zur Expression des Vollängenproteins verwendet. Die Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert und in den Vektor pCDNA6/V5-His kloniert, so daß ein C-terminales V5-Epitop-Tag und His₆-Tag angefügt wurden. Die DNA- bzw. Polypeptidsequenz in diesem Vektor ist in 19 dargestellt. Die transiente Expression in COS-Zellen mit anschließendem Western-Blotting und Nachweis über einen Anti-V5-mAk zeigt nur bei transfizierten Zellen die Sekretion eines Proteins von ~50K in das Medium (22A). Dieses Konstrukt läßt sich auch zur Erzeugung von VEGF-X exprimierenden stabilen CHO-Zellinien verwenden.
Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystem
Zur Expression im Baculovirus/Insektenzellen-System wurde die für die vorhergesagte reife VEGF-X-Polypeptidsequenz codierende DNA an eine für ein aus Melittin, einem sezernierten Insektenprotein, stammendes Signal codierende Sequenz fusioniert. Ebenso wurde zur Erleichterung der Aufreinigung ein N-terminales 6His-Tag angefügt. Die Insertion wurde anschließend in den Baculovirus-Expressionsvektor pFASTBAC kloniert. Die DNA- bzw. Polypeptidsequenz dieses Konstrukts ist in 20 dargestellt. Die Infektion von Trichoplusia ni Hi5-Zellen mit diesem rekombinanten Baculovirus führt zur Sekretion eines Proteins von ungefähr 45K in das Medium (Daten nicht gezeigt).
E. coli
Der codierende Bereich von VEGF-X wurde auf verschiedene Weisen zur Expression als sezerniertes Protein in E. coli kloniert. Ein besonders geeigneter Expressionsklon trägt eine N-terminale Fusion an das Maltosebindungsprotein aus E. coli (MBP – aus dem Expressionsvektor pMAL-p2, New England Biolabs) sowie eine C-terminale Fusion an ein 6His-Tag. Die DNA- bzw. Polypeptidsequenz dieses Vektors ist in 21 dargestellt. Die nacheinander erfolgende Aufreinigung von Zellfraktionen an Ni-NTA-Harz und Amyloseharz gestattet die Isolierung des exprimierten Proteins (siehe 22B).
Expression von Fragmenten VEGF
Die VEGF-Domäne von VEGF-X wurde in E. coli exprimiert. Es wurde bereits gezeigt, daß ähnliche Domänen aus VEGF-A (Christinger et al. (1996) PROTEINS: Structure, Function and Genetics 26, 353–357) und VEGF-D (Achen et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 95, 548–553) in der Lage sind, an die jeweiligen Rezeptoren zu binden. Die Expression dieser Domänen wurde unter Verwendung des Bakteriums E. coli durchgeführt. Darüber hinaus wurde das Vollängenprotein unter Verwendung des Baculovirus/Insektenzellen-Expressionssystems expri miert. Die für diese Experimente erhaltenen Oligonukleotidprimer sind in 13 dargestellt. Das Konstrukt steuerte die Expression im Bakteriencytoplasma, wobei wie erwartet das Protein in unlöslicher Form in Einschlußkörperchen produziert wurde (die für die Expression der PDGF-Domäne verwendete DNA- bzw. Polypeptidsequenz ist in 24 dargestellt). Die Einschlußkörperchen wurden gewaschen, mit Harnstoff solubilisiert, und das Protein wurde unter denaturierenden Bedingungen aufgereinigt, bevor die Rückfaltung mittels Dialyse zur Abtrennung des Harnstoffs erfolgte. Dabei wurde lösliches Protein erhalten, wobei es jedoch nur wenige Hinweise auf die über Disulfidbindungen verknüpften Dimere gibt, die bei Material, das aus Tierzellen stammt, beobachtet werden (25 im Vergleich mit 22A & B). Daher ist nicht klar, ob dieses Protein korrekt gefaltet wird.
CUB
Die CUB-Domäne wurde als lösliches sezerniertes Protein in E. coli exprimiert (26). Das Protein wurde über die Bindung an Ni-NTA-Harz aufgereinigt (27) und in einem in-vitro-Proliferationsassay auf die Aktivität auf HUVECs getestet.
Eigenschaften des VEGF-X-Proteins
Das oben beschriebene transiente Säugerzellen-Expressionssystem wurde zur Erzeugung von Vollängen-VEGF-X-Protein verwendet, wie mittels Antikörpernachweis nach Western-Blotting gezeigt wurde (siehe 22A).
Über Disulfidbindungen verknüpfte Dimere
Die anderen Mitglieder der PDGF-Familie von Wachstumsfaktoren, den PDGFs und VEGFs, existieren alle als Dimere, bei denen zwei das Dimer bildende Monomere durch Disulfidbindungen zwischen den Ketten verknüpft sind. Die Röntgenstrukturen von PDGF-BB (Oefner et al, 1992) und VEGF-A (Muller et al, 1997) sind bekannt und deuten darauf hin, daß wenigstens diese beiden Mitglieder der Familie zwei Disulfidbindungen zwischen den Ketten enthalten. In der Praxis bedeutet dies, daß in der SDS-PAGE-Analyse dieser Wachstumsfaktoren das Vorhandensein von Disulfidbindungen zwischen den Ketten durch einen starken Abfall der Mobilität in Abwesenheit von Reduktionsmittel angezeigt wird (d.h. das nichtreduzierte Dimer wandert langsamer durch das Gel als das reduzierte Monomer). Dieser Effekt wurde auch für VEGF-X erwartet und wurde für das aus der transienten Expression in Säugerzellen erhaltene Material demonstriert (22A). Im Falle des in E. coli produzierten Vollängenmaterials scheinen nur etwa 10% des gesamten VEGF-X-Proteins in Form von durch Disulfidbindungen verknüpften Dimeren vorzuliegen (22B). Allerdings liefern diese Ergebnisse Hinweise darauf, daß das aus Säugerzellen stammende Protein korrekt gefaltet ist, ebenso wie ein Teil des aus E. coli stammenden Proteins.
Glykosylierung
Im VEGF-X-Protein gibt es 3 vorhergesagte potentielle N-verknüpfte Glykosylierungsstellen, und zwar bei Rest 25, 55 und 254 der Polypeptidsequenz. Die vorhergesagte Molmasse des reifen VEGF-X-Proteins beträgt 40 kDa, doch ergibt sich aus SDS-PAGE und Western-Blotting (Nachweis über ein eingeführtes C-terminales Epitop-Tag – siehe 19) des in COS-Zellen exprimierten Vollängenproteins eine Bande, deren Größe etwas größer als erwartet ist (45–50 kDa), ebenso wie eine Bande bei 25 kDa (22A). Bei dieser kleineren Bande handelt es sich vermutlich um ein vom Vollängenmolekül abgeleitetes C-terminales Proteolysefragment (Kontrollen aus nichtinfizierten Zellen zeigen diese Bande nicht), was wahrscheinlich einer Spaltung zwischen der CUB- und der VEGF-Domäne entspricht. Die Behandlung der Präparation mit EndoH ergibt eine leichte Mobilitätsänderung für das Vollängenprotein (23), wohingegen es bei dem kleineren VEGF-Domänenfragment eine deutliche Änderung gibt, was darauf hindeutet, daß die vorhergesagte Glykosylierungsstelle in der VEGF-Domäne bei Rest 254 tatsächlich glykosyliert ist.
Aktivierung von Proteinen in Assays auf Zellbasis
Proteinproben wurden auf Aktivität in Zellproliferations-, Zellwanderungs- und In-vitro-Angiogenese-Assays getestet. Aktive Proben lassen sich auch im in-vivo-Matrigel-Mausmodell für Angiogenese testen.
Vollängen-VEGF-X-Protein
Von VEGF-X transient exprimierenden COS-Zellen gewonnenes konditioniertes Medium (siehe 22A) zeigte in keinem der Assays eine nachweisbare Aktivität. Da jedoch VEGF-X-Protein in dieser Präparation nur über Western-Blotting und nicht über die Coomassie-Anfärbung von Gelen nachgewiesen werden konnte, liegt es eindeutig in sehr geringen Konzentrationen vor, was der Grund für das beobachtete Fehlen von Aktivität in den Zellproliferations-, Zellwanderungs- oder In-vitro-Angiogenesetests sein kann.
VEGF-Domäne
Das oben beschriebene VEGF-Domänenprotein wurde in Zellproliferationsassays (an einer Reihe von Zellarten), Zellwanderungsassays und In-vitro-Angiogenese-Assays getestet, wobei es jeweils keine Aktivität zeigte. Wie oben vorgeschlagen, kann dies an einer inkorrekten Faltung dieses Proteins liegen.
CUB-Domäne
Das CUB-Domänenprotein scheint bei der höchsten getesteten Dosis (1 μg/ml) die Proliferation von HUVECs in Abwesenheit einer anderen Stimulierung zu hemmen (28A & B). Dieser Effekt wird auch nach Stimulierung mit der geringsten getesteten VEGF-A₁₆₅-Dosis beobachtet (1 ng/ml – 28C). Die CUB-Domäne von VEGF-X scheint daher eine antiproliferative Aktivität auf HUVEC-Zellen zu zeigen, selbst in Gegenwart geringer VEGF-A₁₆₅-Dosen.
Gewebeverteilung von mRNA
Es konnte gezeigt werden, daß die VEGF-A mRNA-Expression in vielen verschiedenen menschlichen Tumoren heraufreguliert ist (Lunge, Brust, Ovarien, Colon, Magen, Leber, Pankreas, Niere, Blase und Prostata – Takahashi et al, 1995). Es konnte gezeigt werden, daß die VEGF-A-Expression in Tumoren mit der Tumorwachstumsrate, der mikrovaskulären Dichte und Tumormetatasierung korreliert (Takahashi et al, 1995). Somit bestand Interesse daran, die mRNA-Expressionsmuster von VEGF-X zu untersuchen. Entsprechenderweise wurde eine Northern-Blot-Analyse von aus unterschiedlichen Geweben stammender mRNA durchgeführt. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß VEGF-X-mRNA trotz ihrer Expression auf geringem Niveau in vielen verschiedenen Geweben vorhanden ist. Die PCR-Amplifikation von cDNA aus einer Reihe von Gewebequellen unterstützt diese Idee (29A). Die Haupt-mRNA-Spezies weist eine Größe von ungefähr 3,1 kB auf. In Tumorzellinien oder in den getesteten Tumorgeweben wird keine signifikante Heraufregulierung beobachtet (29B), mit der möglichen Ausnahme der Zellinien GI-117 (Lungenkarzinom) und SaOS-2 (Osteosarkom). Die Ergebnisse dieser ersten Gewebeverteilungsuntersuchungen liefern daher keine Hinweise auf eine Heraufregulierung von VEGF-X bei Tumorwachstum, wie sie bei VEGF-A beobachtet wird.
Genomische Struktur des VEGF-X-Gens
Ein den 3'-Teil des VEGF-X-Locus abdeckender genomischer BAC-Klon wurde durch Hybridisierungsscreening von eine menschliche BAC-Bibliothek enthaltenden Nylonfiltern isoliert. Die direkte Sequenzierung dieses Klons unter Verwendung von auf der VEGF-X-cDNA-Sequenz basierenden Oligonukleotidprimern gestattete die Bestimmung mehrerer Intron/Exon-Grenzen (30). Interessanterweise ist die Position der mRNA-Spleißstelle innerhalb der PDGF-Domäne (nt 1187/1188 in 30B) im Hinblick auf diejenigen in den Genen für VEGF-A und VEGF-D konserviert (Tischer et al, 1991; Rocchigiani et al, 1998).
Material & Methoden
PCR, Klonierung, DNA-Sequenzbestimmung und BAC-Screening.
Alle Primer wurden von der Firma Eurogentec, Seraing, Belgien bezogen. Insertionsspezifische Sequenzierprimer (15- und 16-mere) wurden über die visuelle Inspektion der DNA-Sequenzen konstruiert. DNA wurde an Qiagen-tip-20-Säulen oder an Qiaquick-Spin-Säulen (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) präpariert und aus den Spin-Säulen in 30 μl Tris/EDTA-Puffer (10 mM TrisHCl, pH 7,5, 1 mM EDTA (Natriumsalz) gewonnen). Die Sequenzierreaktionen wurden unter Verwendung von "BigDye^TM Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kits" (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, Kalifornien, USA) durchgeführt und am DNA-Sequenziergerät Applied Biosystems 377 (Perkin Elmer, ABI Division, Foster City, Kalifornien, USA) gefahren. Polymerasekettenreaktionen wurden gemäß Standardvorschriften durchgeführt (Ausubel et al, 1997). Die PCR-Fragmente wurden in die Vektoren pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA) oder pCR-TOPO (Invitrogen, NL) gemäß den Anweisungen des Herstellers kloniert. Einer dieser Vektoren, Plasmid VEGFX/pCR2.1 1TOPO FL, wurde am 1. März 1999 unter der Zugangsnummer LMBP 3925 hinterlegt. Nach der Sequenzbestimmung wurden die Insertionen in die gewünschten Expressionsvektoren kloniert (siehe 19, 20, 21, 24 & 26).
Eine menschliche genomische BAC-Bibliothek (Genome Systems, Inc., St Louis, Michigan, USA) wurde einem Screening mittels Hybridisierung an von der VEGF-X-cDNA-Sequenz abgeleitete Oligonukleotide gemäß den Anweisungen des Herstellers unterzogen. BAC-DNA wurde unter Verwendung eines Plasmid-Midi-Kits von Qiagen (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers mit einigen Änderungen (nach dem Klären des Lysats von chromosomaler DNA wurden Überstände aus individuellen Präparationen auf einer einzelnen Säule (tip 100) vereinigt, und nach Waschen mit 70% EtOH wurde das Sediment über Nacht bei 4°C in 100 μl TE resuspendiert) präpariert. 20-mer-Sequenzierprimer wurden auf der Grundlage der bekannten cDNA-Sequenz konstruiert, und die Sequenzierung wurde wie oben durchgeführt.
5'-RACE
Um den cDNA-Klon in 5'-Richtung zu verlängern, wurden RACE-Reaktionen durchgeführt. Da bekannt war, daß die mRNA in der Plazenta und dem Skelettmuskel vorliegt, wurden Marathon-Ready^TM-cDNAs der Plazenta und des Skelettmuskels von der Firma Clontech (Palo Alto, Kalifornien, USA) bezogen und gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. DNA-Fragmente wurden aus Agarosegelen ausgeschnitten, unter Verwendung von Qiaquick-PCR-Reinigungssäulen (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) aufgereinigt und direkt sequenziert.
VEGF-X-Proteinexpression und -aufreinigung
Für die gewünschten Proteinsequenzen codierende DNA-Fragmente wurden mittels PCR amplifiziert und in entsprechende Expressionsvektorsysteme kloniert.
Zur Expression in Säugerzellen wurde die vollständige codierende Sequenz in den Vektor pcDNA6/V5-his (Invitrogen, Leek, NL, siehe 19 bezüglich Konstruktsequenz) kloniert, um auf diese Weise ein C-terminales Peptid-Tag zur Unterstützung bei Nachweis und Aufreinigung anzufügen.
Zur Expression in Insektenzellen wurde die Sequenz des vorhergesagten reifen Polypeptids zunächst amplifiziert, um ein N-terminales 6His-Peptid anzufügen, und danach in den Vektor pMelBacB (Invitrogen, Leek, NL) kloniert, um eine Insektenzellen-Signalsequenz anzufügen. Die gesamte Insertion wurde anschließend in den Vektor pFASTBAC-1 (LifeTechnologies, Gaithersburg, Maryland, USA) mittels PCR zur Konstruktion eines Baculovirus nach den Anweisungen des Herstellers kloniert.
Zur Expression in E. coli wurde der codierende Bereich PCR-amplifiziert, um ein C-terminales 6His-Tag anzufügen, und danach in den Vektor pMAL-p2 (New England Biolabs, Beverly, Maryland, USA) kloniert. (Die codierende Sequenz dieses Konstrukts ist in 21 dargestellt). Das Protein wurde zunächst an Ni-NTA-Harz (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) und danach an Amyloseharz (New England Biolabs, Beverly, Maryland, USA) gemäß den Anweisungen der Hersteller aufgereinigt.
Für die CUB- und VEGF-Domänenfragmente von VEGF-X codierende DNA-Sequenzen wurden PCR-amplifiziert und in pET22b bzw. pET21a (Novagen, Madison, Wisconsin, USA) kloniert. Das CUB-Domänenprotein wurde entweder aus dem Periplasma oder dem Medium induzierter Kulturen mit Standardverfahren präpariert (Ausubel et al, 1997). Das Protein wurde zunächst durch Fällung mit 20% Ammoniumsulfat aufgereinigt. Nach Dialyse über Nacht gegen 20 mM Tris HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl zur Abtrennung von Ammoniumsulfat wurde das Protein weiter an Ni-NTA-Harz wie oben beschrieben aufgereinigt. Das VEGF-Domänenprotein wurde in unlöslicher Form exprimiert, und die Präparation der Einschlußkörperchen erfolgte unter Verwendung von Standardvorschriften (Ausubel et al, 1997). Die Einschlußkörperchen wurden in 6 M Guanidin-Hydrochlorid, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol gelöst und an Ni-NTA-Harz (Qiagen GmbH, Düsseldorf, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Das Protein wurde durch Dialyse gegen mehrere Pufferwechsel mit abnehmenden Konzentrationen an Denaturierungsmittel rückgefaltet.
Die Analyse der Proteinglykosylierung erfolgte unter Verwendung von EndoH (Roche Molecular Biochemicals, Brüssel, Belgien) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Zellproliferationsassay
HUVEC-Zellen (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) (Clonetics, San Diego, Kalifornien, USA) wurden mit 0,05% Trypsin/0,53 mM EDTA (Gibco, Gaithersburg, Maryland, USA) trypsinisiert, in dem EGM-2 (Clonetics, San Diego, Kalifornien, USA) resuspendiert, gezählt und in einer 96-Loch-Gewebekulturplatte bei 5000 Zellen/Loch verteilt. Nach Zellanbindung und Ausbildung eines Monolagers (16 Stunden) wurden die Zellen mit verschiedenen Konzentrationen an verkürztem VEGF-X (CUB-Domäne oder VEGF-Domäne) oder Verdünnungen von Kulturüberständen des Vollängen VEGF-X (COS 7 oder HEK293) in DMEM (Gibco, Gaithersburg, Maryland, USA) mit 0,5% bis 2% FBS (HyClone, Logan, Utah, USA) wie angegeben stimuliert. Bei menschlichen fötalen Hautfibroblasen (American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) wurde das Wachstumsmedium durch DMEM mit 0,1% BSA (Sigma, St Louis, Missouri, USA) mit oder ohne verschiedene Konzentrationen verkürzter VEGF-X-Proteine ersetzt. Bei HCASMC (Clonetics, San Diego, Kalifornien, USA) wurde das Medium durch DMEM mit 0,5% FBS ersetzt. Die Zellen wurden weitere 24 Std.-72 Std. behandelt. Zur Messung der Proliferation wurden die Kulturmedien durch 100 μl DMEM mit 5% FBS und 3 μCi/ml [3H]-Thymidin (Amersham, Arlington Heights, Illinois, USA) ersetzt. Nach der Impulsmarkierung wurden die Zellen mit Methanol/Essigsäure (3:1, v/v) eine Stunde bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen wurden zweimal mit 250 μl/Loch 80% Methanol gewaschen. Die Zellen wurden in 0,05% Trypsin (100 μl/Loch) 30 Minuten und danach in 0,5% SDS (100 μl/Loch) weitere 30 Minuten solubilisiert. Portionen der Zellysate (180 μl) wurden mit 2 ml Szintillationscocktail (Fisher, Springfield, New Jersey, USA) kombiniert, und die Radioaktivität der Zellysate wurde unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszählers (Wallac 1409) gemessen. Die Proben lagen in allen Fällen jeweils als Vierfachbestimmung vor.
Chemotaxis-Assay
Die chemotaktische Reaktion von HUVEC-Zellen wurde unter Verwendung einer modifizierten 48-Loch-Boyden-Kammer (NeuroProbe, Cabin John, Maryland, USA) sowie collagenbeschichteten (0,1 mg/ml Typ I Collagen, Collaboratic Biomedical, Redford, Massachusetts, USA) Polycarbonatmembranfiltern mit einem Porendurchmesser von 8 μm (NeuroProbe, Cabin John, Maryland, USA) getestet. Zellsuspensionen (15000/Loch) wurden auf den oberen Teil der Chemotaxiskammer aufgetragen und 4 Stunden mit rhVEGF₁₆₅ (0,1–10 ng/ml) (Calbiochem, San Diego, Kalifornien, USA) oder verschiedenen Konzentrationen von verkürztem VEGF-X (PDGF-Domäne) stimuliert. Auf der Oberseite der Membran verbliebene Zellen wurden entfernt. Die Wanderung wurde durch Auszählen der Anzahl von Zellen, die zur unteren Seite der Filtermembran wanderten, beurteilt. Die Membran wurde mit 10% Formaldehyd 15 min fixiert und anschließend mit Gill's Hämotoxylin III (Poly Scientific, Bay Shore, New York, USA) angefärbt. Der Assay wurde in Dreifachbestimmung durchgeführt, wobei sechs unabhängige Hochleistungsfelder pro Loch unter Verwendung eines Lichtmikroskops mit einer Vergrößerung von 250 gezählt wurden. Die Ergebnisse wurden als X-faches nichtstimulierter Zellen (EGM mit 0,1% BSA) ausgedrückt.
In-vitro-Angiogenese-Assay
Die in-vitro-Angiogenese in Fibringelen wurde unter Verwendung von Sphäroiden von HUVEC-Zellen (Human Umbilical Vein Endothelial Cells) (Korff et al., 1998) quantifiziert. Zur Erzeugung von Endothelzellensphäroiden einer definierten Größe und Zellzahl wurde eine spezifische Anzahl von Zellen (~800 Zellen pro Sphäroid) in EGM-2-Kulturmedium mit 20% Methylcellulose (Sigma, St Louis, Missouri, USA) suspendiert und in nichthaftende 96-Loch-Platten mit Rundboden ausgesäht. Alle suspendierten Zellen in einem Loch trugen zur Ausbildung eines einzelnen Endothelzellensphäroids innerhalb von 24 Stunden bei. Eine Fibringel-Stammlösung wurde vor Verwendung durch Mischen von 3 mg/ml Fibrinogen (Calbiochem, San Diego, Kalifornien, USA) in Medium 199 (Gibco, Gaithersburg, Maryland, USA) frisch hergestellt. Die Assays wurden in 24-Loch-Kulturplatten durchgeführt. Die Fibrinogen-Stammlösung (1 ml) wurde mit 50 HUVEC-Sphäroiden sowie der entsprechenden Testsubstanz, einschließlich rh-VEGF₁₆₅ oder verschiedener VEGF-X-Konzentrationen, gemischt. Das sphäroidhaltige Fibrionogen wurde schnell in 24-Loch-Platten überführt. Fünfzehn Mikroliter Thrombin (100 NIH U/ml Stammlösung, Sigma, St. Louis, Missouri, USA) wurden zur Fibringelbildung zum Gel gegeben. Die Gelbildung erfolgte üblicherweise innerhalb von 30 Sekunden. Nach der Gelbildung wurden 1 ml/Loch Medium 199, supplementiert mit 20% FBS, 1 mg/ml ε-Aminocaprosäure (Calbiochem, San Diego, Kalifornien, USA) sowie Antibiotika zugegeben. Das Gel wurde bei 37°C inkubiert (5% CO₂, 95% Luft, 100% Luftfeuchtigkeit). Nach 3 Tagen wurde die in-vitro-Angiogenese durch Messen der Länge der drei längsten Kapillartriebe, die aus jedem einzelnen Sphäroid herausgewachsen waren (100fache Vergrößerung) quantifiziert, wobei wenigstens 10 Sphäroide pro Versuchsgruppe und Experiment analysiert wurden.
Matrigel-Maus-Assay
Der Matrigel-Maus-Assay wird wie von Passanti et al. (1992) beschrieben durchgeführt.
Analyse der VEGF-X-Genexpression mittels RT-PCR-Analyse
Für die spezifische PCR-Amplifikation eines 350 Bp großen Fragments aus VEGF-X wurden die Oligonukleotidprimer VEGF-E2 und VEGF-X14 (16; 5) verwendet. Die PCR-Amplifikationen wurden an Tafeln mit mehreren menschlichen Gewebe-cDNAs (MTC^TM) (menschliche MTC-Tafeln I und II und menschliche Tumor-MTC-Tafel von Clontech), normiert auf die mRNA-Expressionsniveaus von sechs unterschiedlichen Haushaltsgenen, durchgeführt. Darüber hinaus wurde cDNA aus unterschiedlichen Tumorzellkulturen (Caco-2 kolorektal Adenokarzinom; T-84 kolorektal Karzinom; MCF-7 Brust Adenokarzinom; T-47D duktales Brustdrüsenkarzinom; HT1080 Knochenfibrosarkom; SaOS-2 Osteosarkom; SK-N-MC Neuroblastom; HepG2 Hepatoblastom; JURKAT T-Zellen-Leukämie und THP-1 Myelomonozytenleukämie) hergestellt. Zur Herstellung von Tumorzell-cDNA wurden Zellen homogenisiert und Gesamt-RNA unter Verwendung des RNeasy Mini-Kits (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers präpariert. 1 μg Gesamt-RNA wurde unter Verwendung von oligo(dT)15 als Primer und 50 U Expand^TM Reverse Transcriptase (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers revers transkribiert. PCR-Reaktionen mit VEGF-X-spezifischen oder Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (G3PDH)-spezifischen Primern wurden anschließend an 1 μl dieser cDNA durchgeführt. Bei allen cDNAs wurden PCR-Reaktionen mit VEGF-X-spezifischen Primern in einem Gesamtvolumen von 50 μl, enthaltend 5 μl (± 1 ng) cDNA, 1x Advantage KlenTaq-PCR-Reaktionspuffer, 0,2 mM dNTP, 250 nM Primer VEGF-E2 und VEGF-X14 sowie 1 μl Advantage KlenTaq-Polymerase-Mix, durchgeführt. Die Proben wurden 30 s auf 95°C erhitzt, und es wurden 25, 30 oder 35 Zyklen mit jeweils 30 s bei 95°C und 30 s bei 68°C durchgeführt. Ebenso wurden Kontrollreaktionen unter Verwendung spezifischer Primer, die ein 1 kB großes Fragment des Haushaltsgens G3PDH amplifizieren, gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt.
Northern-Blot-Analyse von VEGF-X
Northern-Blots mit jeweils 2 μg von aus unterschiedlichen menschlichen Geweben stammender Poly(A)-reicher RNA (Clontech Laboratories; MTN^TM-Blot, MTN^TM-Blot II und Cancer Cell Line MTN^TM-Blot wurden nach den Anweisungen des Herstellers mit einem durch Zufallspriming mit α-[³²P]-dCTP markierten (Multiprime-Markierungskit, Roche Diagnostics), 293 Bp großen spezifischen VEGF-X-Fragment (PinAI-StuI-Fragment, einschließlich 92 Bp des kodierenden 3'-Ende-Bereichs und 201 Bp des 3'-nichttranslatierten Bereichs von VEGF-X) hybridisiert. Die Blots wurden über Nacht bei 68°C hybridisiert, und die letzten Waschschritte wurden bei hoher Stringenz bei 68°C in 0,1 × SSC/0,1% SDS durchgeführt. Die Membranen wurden 1 bis 3 Tage mit Verstärkerfolien autoradiographiert.
Vollängen-VEGF-X
Der Effekt von Vollängen-VEGF-X auf die Proliferation von HUVEC-Zellen wurde mit dem 3H-Thymidin-Einbau-Assay bestimmt. Dabei wurde den HUVEC-Zellen 24 Stunden vor der Behandlung mit dem Vollängen-VEGF-X in einem Konzentrationsbereich von 100 pg/ml-10 μg/ml Serum entzogen. VEGF-X hatte bei einer Konzentration von 100 pg/ml-10 ng/ml keinen Effekt auf die Endothelzellenproliferation. Bei den höheren Konzentrationen an FL-VEGF-X (100 ng/ml und 1 μg/ml) gab es eine deutliche Hemmung der Endothelzellenproliferation. Dies liegt vermutlich an dem sehr hohen Endotoxinniveau in den Proben. Die VEGF-X-Probe wurde aufgereinigt, um das Endotoxinniveau zu verringern, und wird zur Zeit im Zellproliferationsassay getestet.
Zusammenfassung des Testens der CUB-Domäne
Der Effekt der CUB-Domäne auf die Hemmung der entweder durch Serum (2%), rh-VEGF oder bFGF stimulierten HUVEC-Proliferation wurde mit dem 3H-Thymidin-Einbau-Assay beurteilt. Dabei wurde den Zellen Serum entzogen, und diese wurden danach mit der CUB-Domäne und verschiedenen Wachstumsfaktoren behandelt. Die Ergebnisse zeigten, daß die CUB-Domäne die entweder durch Serum (2%), rh-VEGF oder bFGF stimulierte Endothelzellenproliferation in dosisabhängiger Weise mit einer maximalen Hemmung bei 10 μg/ml hemmte. Dabei lag eine ungefähr zweifache Hemmung der Proliferation (bei 10 μg/ml) von mit VEGF und bFGF stimulierten Zellen sowie eine fast fünffache Hemmung von mit Serum (2%) stimulierten Zellen vor. Ergebnisse mit dem LDH-Assay zeigten, daß mit der Hemmung der Zellproliferation durch die CUB-Domäne keine Cytotoxizität verbunden war.
Damit wurde gezeigt, daß der N-Terminus des Polypeptids aus 10 eine CUB-Domäne besitzt. Bei der Durchführung von Datenbanksuchen unter Verwendung der codierenden Vollängensequenz finden sich die besten Übereinstimmungen (d.h. bei einer BLAST-Suche diejenigen mit dem geringsten Wahrscheinlichkeitspunktwert) bei der CUB-Domäne und nicht bei der VEGF-ähnlichen Domäne. Die beste Übereinstimmung aus dem Search-Release 37 der SWISSPROT-Datenbank (Feb. 1999) liegt zur CUB-Domäne eines Neuropilins aus Xenopus laevis vor, wobei die Übereinstimmungen mit den CUB-Domänen der menschlichen Neuropiline 1 und 2 ebenso signifikanter sind als Übereinstimmungen mit den VEGFs.
Diese Ähnlichkeit stellt eine Herausforderung dar, angesichts der Identifizierung von Neuropilin-1 und -2 als zelluläre Rezeptoren für den VEGF-A 165 (Stoker et al. 1998, im Übersichtsartikel von Neufeld et al. 1999). Es ist daher plausibel, daß VEGF-X einen zweifachen regulatorischen Effekt ausüben könnte: über die Wechselwirkung mit den Tyrosinkinase-VEGF-Rezeptoren, vermittelt durch die VEGF-ähnliche Domäne, ebenso wie über die Wechselwirkung mit VEGF-Isoformen oder mit den Neurophilinrezeptoren, vermittelt durch die CUB-Domäne.
Unseres Wissens wäre der letztere Effekt vollkommen neuartig, und das Durchsuchen der aktuellsten Incyte-Datenbank zeigt keine anderen Proteine, die sowohl CUB- als auch VEGF-ähnliche Domänen enthalten. Diese Anordnung von Domänen läßt auf mögliche positive oder negative Modelle der Regulation schließen: Positiv – die VEGF-ähnliche Domäne ist in der Lage, produktiv mit den Tyrosinkinase-VEGF-Rezeptoren bei gegebener Aktivierung zu Wechselwirken, wobei die CUB- Domäne in der Lage ist, produktiv mit dem Neuropilinrezeptor bei gegebener Aktivierung zu Wechselwirken.

Negativ – die VEGF-ähnliche Domäne geht keine produktive Wechselwirkung mit den Tyrosinkinase-VEGF-Rezeptoren ein, wobei entweder die Rezeptordimerisierung verhindert wird oder die VEGF-Bindungsstellen blockiert werden. Ferner geht die CUB-Domäne keine produktive Wechselwirkung mit den Neuropilinrezeptoren ein, wobei entweder die Rezeptoraktivierung verhindert wird oder die VEGF-Bindungsstellen blockiert werden, oder sogar indem sie an VEGF-Isoformen bindet und deren Wechselwirkung mit Rezeptoren verhindert. TABELLE 1

Ursprünglicher Rest	Beispielhafte
	SUBSTITUTIONEN
ALA	SER, THR
ARG	LYS
ASN	HIS, SER
ASP	GLU, ASN
CYS	SER
GLN	ASN, HIS
GLU	ASP, GLU
GLY	ALA, SER
HIS	ASN, GLN
ILE	LEU, VAL, THR
LEU	ILE, VAL
LYS	ARG, GLN, GLU, THR
MET	LEU, ILE, VAL
PHE	LEU, TYR
SER	THR, ALA, ASN
THR	SER, ALA
TRP	ARG, SER
TYR	PHE
VAL	ILE, LEU, ALA
PRO	ALA

Literaturangaben

1. Ausubel, FM, R Brent, RE Kingston, DD Moore, JG Seidman, JA Simth, K Struhl (Hrsg.). (1997) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons.
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10. Oefner, C., D'Arcy, A., Winkler, F.K., Eggimann, B. und Hosang, M. (1992). Crystal structure of human platelet-derived growth factor BB. EMBO J. 11, 3921–3926.
11. Passanti, A., Taylor, R.M., Pili, R., Guo, Y., Long, P.V., Haney, J.A., Pauly, R., Grant, D.S. und Martin, G.R. (1992) A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antiangiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast growth factor. Laboratory Investigation, 67, 519–528.
12. Rocchigiani, M., Lestingi, M., Luddi, A., Orlandini, M., Franco, B., Rossi, E., Ballabio, A., Zuffardi, O. und Oliviero, S. (1990). Human FIGF: cloning, gene structure, and mapping to chromosome Xp22.1 between the PIGA and the GRPR genes. Genomics, 47, 207–216.
13. Takahashi, Y., Kitadai, Y., Bucana, C.D., Cleary, K.R. und Ellis, L.M. (1995). Expression of vascular endothelial growth factor and its receptor, KDR, correlates with vascularity, metastasis and proliferation of human colon cancer. Cancer Research, 55: 3964–3968.
14. Tischer, E., Mitchell, R., Hartman, T., Silva, M., Gospodarowicz, D., Fiddes, J.C. und Abraham, J.A. (1991). The human gene for vascular endothelial growth factor: Multiple protein forms are encoded through alternative exon splicing. J. Biol. Chem. 266, 11947–11954.

Sequenzprotokoll

Sequenz ID Nr. 1	entspricht der Aminosäuresequenz von Position 23 bis 345 der in Figur 10 dargestellten Aminosäuresequenz.
Sequenz ID Nr. 2	ist die in Figur 10 dargestellte Aminosäuresequenz.
Sequenz ID Nr. 3	entspricht der Sequenz von Position 257 bis 1291 der in Figur 9 dargestellten Nukleotidsequenz.
Sequenz ID Nr. 4	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX1.
Sequenz ID Nr. 5	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX2.
Sequenz ID Nr. 6	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX3.
Sequenz ID Nr. 7	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX4.
Sequenz ID Nr. 8	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX5.
Sequenz ID Nr. 9	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX6.
Sequenz ID Nr. 10	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX7.
Sequenz ID Nr. 11	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX8.
Sequenz ID Nr. 12	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX9.
Sequenz ID Nr. 13	entspricht der in Figur 3 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX10.
Sequenz ID Nr. 14	entspricht der in FIG. 4 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX11.
Sequenz ID Nr. 15	entspricht der in FIG. 4 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX12.
Sequenz ID Nr. 16	entspricht der in FIG. 4 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX13.
Sequenz ID Nr. 17	entspricht der in FIG. 4 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX14.
Sequenz ID Nr. 18	entspricht der Polynukleotidsequenz 5'-1 in Figur 8.
Sequenz ID Nr. 19	entspricht der Polynukleotidsequenz 5'-2 in Figur 8.
Sequenz ID Nr. 20	entspricht der in FIG. 13 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX6.
Sequenz ID Nr. 21	entspricht der in FIG. 13 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX7.
Sequenz ID Nr. 22	entspricht der in FIG. 13 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX8.
Sequenz ID Nr. 23	entspricht der in FIG. 13 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGFX9.
Sequenz ID Nr. 24	entspricht der in FIG. 13 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGBAC1.
Sequenz ID Nr. 25	entspricht der in FIG. 13 dargestellten Polynukleotidsequenz von VEGBAC2.
Sequenz ID Nr. 26	entspricht einem Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Aminosäureposition 40 bis 150 der Sequenz in Figur 10.
Sequenz ID Nr. 27	entspricht einem Polypeptid mit der in FIG. 26 dargestellten Aminosäuresequenz.
Sequenz ID Nr. 28	entspricht der Sequenz von Position 5 bis 508 der in Figur 26 dargestellten Nukleotidsequenz.
Sequenz ID Nr. 29	entspricht der Nukleotidsequenz von Position 5 bis 508 der in Figur 26 dargestellten Nukleotidsequenz.
Sequenz ID Nr. 30	entspricht der Sequenz von Position 214 bis 345 der in Figur 10 dargestellten Nukleotidsequenz.

Sequenzprotokoll

Claims

Nukleinsäuremolekül, codierend für ein CUB-Domäne-Polypeptid, bestehend aus dem N-terminalen Teil des VEGF-X-Proteins der SEQ ID Nr. 2, wobei das Polypeptid in der Lage ist, die durch VEGF oder bFGF induzierte Stimulierung der Proliferation von HUVECs zu hemmen.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, wobei das Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz von Position 40 bis 150 der Sequenz der SEQ ID Nr. 2 codiert.
Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Nukleinsäuremolekül für ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 27 codiert.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 28.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Nukleotidsequenz der SEQ ID Nr. 29.
Expressionsvektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Wirtszelle, transformiert oder transfiziert mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 6.
Protein, exprimiert von der Zelle nach Anspruch 7.
Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 5 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheitszuständen im Zusammenhang mit unangemessener Angiogenese, wie beispielsweise Tumor- oder Krebswachstum, Retinopathie, Osteoarthritis oder Psoriasis.
Polypeptid, codiert von einem Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung als Arzneimittel.
Polypeptid, bestehend aus der Aminosäuresequenz von Position 40 bis 150 der Sequenz der SEQ ID Nr. 2, zur Verwendung als Arzneimittel.
Verwendung eines Polypeptids, bestehend aus der Aminosäuresequenz von Position 40 bis 150 der Sequenz der SEQ ID Nr. 2, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheitszuständen im Zusammenhang mit unangemessener Angiogenese, wie beispielsweise Tumorwachstum, Retinopathie, Osteoarthritis oder Psoriasis.
Verwendung des von einem Nukleinsäuremolekül gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 codierten Polypeptids bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krankheitszuständen im Zusammenhang mit unangemessener Angiogenese, wie beispielsweise Tumorwachstum, Retinopathie, Osteoarthritis oder Psoriasis.
Antisense-Molekül, fähig zur Hybridisierung an ein Molekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 unter Bedingungen mit hoher Stringenz.
Antikörper, fähig zur Bindung an ein Protein nach Anspruch 8 oder ein Epitop davon.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Antikörper nach Anspruch 16 zusammen mit einem pharmazeutisch unbedenklichen Trägerverdünnungsmittel oder Hilfsstoff dafür.