AT402070B - Herstellungsverfahren neuer bicyclischer brenzcatechinderivate - Google Patents

Description

AT 402 070 B

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer bicyclischer Brenzcatechinderivate der allgemeinen Formeln (I) und (II)

worin Ri und R2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe stehen;

Ra für ein aromatisches Radikal oder ein heterocyclisches einfach oder mehrfach ungesättigtes aromatisches Radikal, gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogenatome oder Trifluoromethylgruppen substituiert, steht und Z für eine Valenzbindung oder eine Carbonyl-, Hydroxymethylen-, Methylen-, Carbonylmethylen-, Hydroxy-ethylen- oder Ethylengruppe steht, wobei die Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindung im Falle des Carbonylmethy-lens und Hydroxyethylens das Kohlenstoffatom, welches dem Kohlenstoffatom, das in die Ringbildung einbezogen ist, benachbart ist, betrifft.

Die Verbindungen der Formeln I und II wie oben definiert, verhindern die Lipoxygenase und die Cyclogenase. Sie können in der Behandlung des Menschen als nicht Steroide Entzündungshemmer, als Antithrombotika, Antiallergika, Antianaphylactika und Antiischiatica verwendet werden.

Die Erfindung umfaßt somit ein Verfahren, in dem man eine Verbindung der allgemeinen Formel IX

(IX) worin Ri und R2 die oben angegebene Bedeutung haben und A für ho2c-(C) H ho2c Π oder steht, in an sich bekannter Weise cyclisiert.

Die Verbindungen I und II, bei denen Z Methylen, Ethylen, Hydroxymethylen oder Hydroxyethylen ist, können durch übliche Reduktionsmethoden erhalten werden.

Die Carbonylgruppe kann durch Behandlung mit stöchiometrischen Mengen Aluminiumtrichlorids oder Lithiumaluminiumhydrids gemäß einem Verfahren, abgeleitet von dem von H.NAKAZUMI, T.VEYAMA und T.KITAO in J. of HETEROCYCLIC CHEMISTRY 1984, 21, 193 angegebenen, oder in Hydroxymethylen durch Reduktion mit Natriumborohydrid gemäß V.J.TRAYNELIS und R.F.LOVE, J. Org. Chem. 1961, 26, 2728, in eine Methylengruppe übergeführt werden.

Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung. 2

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Beispiel 1 6,7-Dihydroxy-2-phenyl-4-oxo-thiachromen (| : R, = R2 = Η, Z = CO, R3 = Cg Hs) 5g (0,017 Mol) der 0-(3,4-Dihydroxyphenylthio)-Zimtsäure wurden absatzweise 10,5 ml konzentrierter Schwefelsäure in einer zweihalsigen 50 ml Flasche, die mit einem Magnetrührer ausgerüstet war, zugeführt. Die Reaktionsmischung wurde auf Eis gekühlt und die erhaltene Suspension wurde getrocknet und gewaschen mit Benzin.

Rekristallisation aus warmen Äthanol ergab ein oranges Pulver (Ausbeute 13 %). Diese Verbindung hatte einen Schmelzpunkt von über 250°C, gemessen nach Tottoli. Identität und Struktur wurden durch PMR-Stektroskopie und elementare Mikroanalyse bestätigt. C H % berechnet % gefunden 66.65 66.71 3.73 3.81

Beispiel 2 6,7-Dihydroxy-2-(o-trifluoromethyl-phenyl)-4-oxo-thiachromen (I : R, = R2 = Η, Z = CO, R3 = 0-CF3 - C6H4) 1 g (0,028 Mol) der o-Trifluoromethy 1-0-(3,4-dihydroxyphenylthio)-Zimtsäure wurden in 15 ml wasserfreiem Chloroform in einer dreihalsigen 50 ml Flasche, ausgerüstet mit einem Magnetrührer unter einem leichten Stickstoffstrom gelöst. Eine Lösung von 3,25 g (0,0075 Mol) Athylpolyphosphat in 1 ml wasserfreiem Chloroform wurde bei 20°C zugegebenn. Die Mischung wurde für 2 h am RückfluG gehalten. Die Reaktionsmischung wurde auf Eis gekühlt und mit Ammoniak alkalysiert. Nach Extraktion wurde die organische Phase mit Wasser gewaschen. Abdampfen des organischen Lösungsmittels ergab einen orangen Gummi, der durch Silikagelchromatographie gereinigt wurde, wobei als Spülmedium Dichlorome-than (Ausbeute 12 %) Verwendung fand. Diese Verbindung ist ein Feststoff, der gemessen nach Tottoli bei 131°C schmilzt. Identität und Struktur wurden durch C'3 NMR-Spektroskopie und Elementarmikroanalyse bestätigt. C H % berechnet % gefunden 56.80 56.64 2.70 2.69

Beispiel 3 6,7-Dimethoxy-2-phenyl-4-oxo-thiachromen (I : Ri = Rz = CH3, Z = CO, R3 = CgH5)

Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren unter Verwendung der 0-(3,4-Dimethoxyphenylthio-)Zimtsäure anstelle der o-Trifluormethy 1-0-(3,4-dihydroxyphenylthio)-Zimtsäure wurde die obige Verbindung mit 15 % Ausbeute erhalten. Es ist ein gelber Feststoff, der bei 212°C gemessen, nach Tottoli schmilzt. Identität und Struktur wurden durch ,3C NMR Spektroskopie und Elementarmikroanalyse bestätigt. C H % berechnet % gefunden 68.44 68.44 4.73 4.74 3

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Beispiel 4 6,7-Dimethoxy-2-(o-trifluoromethyl-phenyl)-4-oxo-thiachromen (I : Ri = R2 = CH3, Z = CO, R3 = o-CF3-C6H*)

Nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde unter Verwendung der o-Trifluoromethyl-jS-(3,4-dimethoxyphenylthio)-Zimtsäure anstelle der o-Trifluoromethyl-£-(3,4-dihydroxyphenylthio)-Zimtsäure, die obige Verbindung mit 50 % Ausbeute erhalten. Es ist ein weißer Feststoff, der bei 194°C schmilzt. Identität und Struktur wurden durch C13 NMR Spektroskopie und Elementarmikroanaiyse bestätigt. C H % berechnet % gefunden 59.01 58.84 3.57 3.56

Beispiel 5 7,8-Dimethoxy-2-phenyl-5-oxo-benzo/b/ thiepan (II : R, = R2 = CH3, Z = CH2. CO, R3 = C6H5

Mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wurde unter Verwendung der 4-Phenyl-4-(3,4-diemthox-yphenylthio)-Buttersäure anstelle der o-Trifluoromethyl-ß-(3,4-dihydroxyphenylthio)-Zimtsäure obige Verbindung mit 27 % Ausbeute erhalten. Reinigung wurde durch Dekantieren von Diäthyläther durchgeführt. Diese Verbindung ist ein weißer Feststoff, der gemessen nach Tottoli bei 135°C schmilzt. Identität und Struktur wurden durch C13 NMR Spektroskopie und Elementarmikroanalysen bestätigt. C H % berechnet % gefunden 68.76 68.63 5.77 5.84

Beispiel 6 6,7-Dimethoxy-2-(o-trifluoromethylphenyl)-4H-thiachromen (I : Ri = R2 = CH3, Z = CH2, R3 = o-CF3-CßH4 204,9 mg (5,4 mMol) des Lithiumaluminiumhydrids und 720 mg (5,6 mMol) Aluminiumchlorid wurden bei Umgebungstemperatur in 32 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran in einem dreihältigen 100 ml Kolben ausgerüstet, mit einem Magnetrührer und unter einem leichten Stickstoffluß gelöst. Eine Lösung von 1 g (2,7 mMol) der 6,7-Dimethoxy-2-(o-trifluoromethyl-phenyl)- 4-oxo-thiachromen hergestellt, wie in Beispiel 4 beschrieben, in 9 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran wurde bei 25°C zugefügt. Das Reaktionsmedium wurde für 2 h bei 20 - 25°C gerührt und dann mit 0,54 g Wasser und 1,35 ml Konzentrierter Schwefelsäure hydrolisiert. Die erhaltene Mischung wurde gefiltert und mit Diäthyläther extrahiert. Abdampfen des organischen Lösungsmittels gab ein rotes Pulver (Ausbeute 20 %), welches gemessen nach Tottoli bei 94°C schmolz. Die Identität und Struktur der Verbindung wurden durch C13 NMR-Spektroskopie und Elementarmikroanalyse bestätigt. C H % berechnet % gefunden 61.36 61.52 4.29 4.35 4

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Pharmakologie

Lipoxygenasen (LOs) verwandeln Arachidonsäure (AA)in Hydroxyderivate und Leukotriene. Diese Produkte sind wirksame pharmakologische Mittel mit potentiell wichtigen Rollen in Entzündungs- und Überempfindlichkeitskrankheiten. Verschiedene LOs wirken auf AA, im wesentlichen 5 LO führt zu Leukotrienen, 12 LO führt zu 12-Hydroperoxyeicosatetraensäure (12 HPETE) und anderen 12 HydroxyVerbindungen, 15 LO führt zu 15 HPETE und anderen 15 Hydroxyverbindungen, und (auf einer geringeren Ebene) 8 LO und 11 LO.

Die wichtigsten Produkte der LO-Synthesewege sind Leukotriene, die durch 5-LO hergestellt werden. Die vermutete Wichtigkeit der SRS-A bei Asthma und anaphylaktischen Reaktionen und die Erkenntnis das SRS-A zu den Leukotrienen gehört, erhöhte das Interesse an Studien über die Biologie dieser Substanzen. LTC 4 und LTD 4 (0,1 bis 1.nM) bewirken konzentrationsabhängige Kontraktionen des Dünndarmendes von Meerschweinchen, wie es üblicherweise bei der Bestimmung der biologischen Wirksamkeit der SRS-A in Relation zum Histamin festgestellt wurde. Es wurde gefunden, daß auf molarer Basis Histamin nur ein 200 Hundertstel der Wirksamkeit des LTC 4 aufweist, woraus gefolgert wird, daß eine Einheit SRS-A (6 ng Hist, HCl) etwa 0,2 pMol LTC 4 entspricht. LTC 4 und LTD 4 erhöhten auch die vaskulare Durchlässigkeit in der Haut von Meerschweinchen und stimulieren die glatten Muskeln, wie bereits bei SRS-A beobachtet. LTC 4 und LTD 4 spielen eine entscheidende Rolle in der Herz- oder Atmungsmikrozirkulation. LTB 4 beeinflußt die Leukozytenwanderung, indem es das Festhalten der Leukozyten am Endothelium in nachkapillaren Blutgefäßen bewirkt und durch starke chemotaktische Effekte. Aus diesen Gründen sind die Leukotriene wichtige Vermittler im Verteidigungsmechanismus als unmittelbare übersensitive Reaktionen und akute Entzündungsreaktionen. Darüberhinaus sind die Effekte einiger Cyclooxygenasenprodukte (CO) und der Leukotriene komplementär. Dieser Synergismus zwischen Leukotrienen, die Plasmaaustritt bewirken und der Gefäßerweiterer PGE 2 und PGI 2 sind möglicherweise wichtig bei der Ödembildung. Weiters muß den synergistischen Effekten zwischen den Leukotrienen und dem Thromboxan (TxA2) in der Bronchienverengung große Bedeutung beigemessen werden. LTC 4 und LTD 4 bewirken die Freigabe von TxA2 in Meerschweinchenlungen AS. TxA2 ist ein wirksamer Luftwegekontraktor, dessen Freigabe zur Bronchienlähmung bei allergischen Ausbrüchen beitragen kann. Darüberhinaus scheinen einige Ergebnisse anzuzeigen, daß manche Wirkungen des PAF-Acether durch LTB 4 bewirkt werden können. Nichtsteroide, entzündungshemmende Drogen (AINS) verhindern die Anaphylaxis nicht. Im Gegenteil, sie erhöhen die hypersensitiven Reaktionen, da sie AA für die LO-Reaktionswege mobilisieren. Corticosteroide (CS) verhindern die Freisetzung des Vorläufers, indem sie die Synthese des Lipomodulin, eines Peptidinhibitors des Phospholipase A2, stimulieren. Durch die Verhinderung der Freisetzung von AA verhindert CS nicht nur die Bildung der CO-Produkte sondern auch der LO-Produkte und somit die Leukotrienbildung.

Das erhöhte Wissen über das LO-System scheint neue Möglichkeiten für die Entwicklung neuer und therapeutisch wirksamerer Mittel, besonders in der Behandlung von Krankheiten, die mit unmittelbaren hypersensitiven Reaktionen, wie Asthma, Allergie, Herzanaphylaxis, Hirnblutleere und Entzündungen zu tun haben, zu eröffnen. Solche Drogen können auf Antagonisten der Endprodukte oder auf Inhibitoren von Enzymen in der Bildung und Umwandlung des Schlüsselzwischenproduktes LTA 4 beruhen, gebaut werden. Din zweifacher Effekt am Leukotrienreaktonsweg und dem Cyclooxygenasereaktionsweg kann wertvoll sein. 1)"ln vitro" Untersuchung von 7 Verbindungen als mögliche Inhibitoren der Sojabohnenlipoxygenase a. Einführung

Monohydroxyeicosatetraensäuren (HETEs) sind quantitativ signifikante Metaboliten der Arachidonsäure (AA) in einer Vielzahl von Säugetierzellen und Geweben. So wurde 12-L-HETE, beispielsweise in Blutkörperchen gefunden; 5-D-HETE in Kaninchen PMN; 12-L-HETE, 11-HETE und 15-HETE in Meerschweinchenlungen und den Mastzellen von Ratten; 5-HETE, 8-HETE, 9-HETE, 11-HETE und 12-HETE in menschlichen Neutrophilen. Die HETE-Verteilung hängt von der betrachteten Species ab und ist repräsentativ für den durch Lipoxygenasen enzymatisch katalysierten Methabolismus der AA. Die möglichen biologischen Rollen dieser Produkte sind bis jetzt nicht vollständig geklärt worden. 12-HETE von menschlichen Blutkörperchen zeigt chemotaxe Wirksamkeit für menschliche Polymorphonuclearleukozyten (Siegel, M.l. und al. Proc. Nati. Acad. Sei. 77, 308-312; 1980). 5-HETE (die Hydroperoxysäure) ist der Vorläufer der "Slow Reacting Substance" (SRS), eines mächtigen Kontraktionsmittels für die glatte Muskulatur, welches die Symptome der unmittelbaren Übersensibilität überträgt. Es scheint so, daß die Blokade der Lipoxygenase nur dann 5

AT 402 070 B günstig sein kann, wenn antiallergische und Antientzündungsmedikamente gesucht werden. Säugetiere und Pflanzenlipoxygenase (Sojabohnen) haben viele biochemische Eigenschaften gemeinsam und es wurde gezeigt, daß die meisten Inhibitoren der Pflanzenenzyme auch Lipoxygenase, die von Blutkörperchen oder Leukozyten stammen, inhibieren (Baumann, J. und al., Prostglandins 20, 627-639, 1980). Sojabohnenlipoxy-genase bewirkt die ausschließlich Bildung von 15-HPETE (C.P.A. Van Os und al, Biochim. und Biophys. Acta 663, 177-193, 1981) und es wurde gezeigt, daß sie zehnmal so sensitiv ist, wie die Blutplättchenlipoxy-genase (Wallach, D.P., und al, Biochim. und Biophys. Acta 663, 361-372, 1981). Zusätzlich ist 15-HETE ein wirksamer und spezifischer Inhibitor der Blutplättchenlipoxygenase (12-HETE), die indirekt die Bildung von Thromboxan A2 (Vanderhoek, J., und al., J. Biolog. Chem. 225, 5996-5998; 1980) stimuliert. Von 15-Hydroperoxy wurde analog berichtet, daß es bei Schweineaorten die Aktivität der Prostacyclinsynthetase unterdrückt (Gryglewski, R.J. und al. Prostaglandins 12, 685-713; 1976). Diese inhibitorische Aktivität wird durch die Bildung einer destruktiven oxidierend wirkenden Species, möglicherweise eines OH-Radikals oder einer Verbindung ähnlicher Aktivität, ausgeübt (Weiss, S.J., und ai. Blood, 53. 1191, 1979). b. Materialien und Verfahren b1) Spektrophotometrische Untersuchung

Eine spektrophotometrische Methode wurde von Corey E.J. et al. (J. Amer. Chem. Soc, 104, 1750-1752; 1982) zur Bestimmung der Enzymaktivität entwickelt. In einem Endvolumen von 1,8 ml wurden 0,2 M belüfteten Borax Puffer mit pH = 9,00 mit 500 Einheiten Sojabohnenlipoxygenase gemischt. Beim Testen von Inhibitoren wurden diese in einer Endkonzentration von 10~3 M bis 10'8M in 0,6 ml zugegeben, wobei anschließend 10 Minuten Vorinkubation bei Zimmertemperatur durchgeführt wurden. Die Reaktion wurde durch 10'4M Arachidonsäure gestartet. Es folgten 90 Minuten Inkubation bei Raumtempertur, die 15 HPETE wurde durch Absorptionsmessung bei 236 nm bestimmt. b2) Bewertung der Ereignisse

Dieses Verfahren wurde mit bekannten Inhibitoren der Lipoxygenase verglichen. Für jede Testsusbtanz wurde eine Kontrolle mit gekochter Lipoxygenase durchgeführt, um die Absorption der Verbindung bei der verwendeten Wellenlänge berücksichtigen zu können. Der Prozentsatz der enzymatischen Aktivität wurde für jede Konzentration berechnet, die Menge der benötigten Substanz um 50 % der Enzymaktivität zu verhindern, wurde durch lineare Regression eines Datensatzes berechnet, der den Logarithmus der Konzentration (M) über der Inhibition (%) beschrieb (Tabelle 1). 2) "In vitro" Inhibitionswirksamkeit gegenüber dem Peroxidanionradikal (02-). a) Einleitung

Der Entzündungsprozeß ist durch eine herabgesetzte Unversehrtheit (Wirksamkeit) der endothelialen Zellenbarriere, der Änderung der vaskulären Durchlässigkeit und der Aktivierung von Phagocyten, wie polymorphonuklearer Leukozyten (PMN), mit der nachfolgenden Freisetzung und Bildung einer Gruppe aktiver Verbindungen, von denen einige freie Radikale sind, im extracellulären Raum gekennzeichnet. Die Beziehungen dieser Radikale zu anderen Erscheinungen der Entzündung werden noch nicht vollständig verstanden. Ein wesentlicher Bestandteil der Stoffwechselprodukte aktivierter Entzündungszellen, wie der PMN ist die univalente enzymatische Reduktion des O2 zum Peroxidanionradikal 02~. Ein großer Teil des gebildeten 02“wird in den extracellularen Raum entlassen, wo spontane Umlagerungen geschehen können, unter Bildung von H202 und 02. Die gleichzeitige Anwesenheit von 02~, H202 und Metailkatalysatoren in Chelatform im extracellulären Raum können zur Bildung von noch aktiveren sauerstoffabgeleiteten Molekülen, wie dem Hydroxylradikal (OH·) und dem Singletsauerstoff (’02) führen. Peroxiddismutase (SOD) fungiert als ein enzymatischer Abbauer des 02~ (McCord et al. J. Biol. Chem. 244, 6049-6055; 1969); während I-Methionin und DMSO OH· Abbauer sind. 6

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Enz-H 2 2 0

Enz + 02 + 2H

SOD

0 2 h2o<

CAT

Metallione

O °ne > OH. + OH" + X02 2 i

1-Methionin oder DMSO

Versuchsmechanismus der freien Radikalbildung der Xanthin-Substrat-Oxidase

Schema 1

Das Xanthin-Substrat-Oxidasemodell zur Bildung freier Radikale wurde intensiv studiert (Fridowich, I., J. Biol. Chem. 215, 4053-4057; 1970) um freie Radikale sowohl "in vitro" als auch "in vivo" zu bilden (Chmori, H., et ai. Biochem, Pharmacol. 27, 1397-1400; 1978).

Ein bequemer und empfindlicher spektrophotometrischer Zugang zur Erkennung und Feststellung speziell des 02~ basiert auf der Eigenschaft dieses Radikals, Ferricytochrom C (Cyt c3+) zu reduzieren. Die Gegenwart der Xanthin-Oxidase mit Hypoxanthin und Cyt c3+ in einem Bicarbonatpuffer erzeugt 02‘, weiches Cyt c3+ auf Cyct c2+ reduziert (Del Maestro, R.F., Microvascular Res. 22, 255-270; 1981), gefolgt durch eine Reoxidation eines Teils des Cyt c2+ durch OH· (Fong, K., et al., Chem. Biol. Interact. 15, 77-89; 1976).

Hypoxanthin + Xanthin-Oxidase + Cyt c3+ = > = > 02' + Cyt c2+ +OH· => Cyt c3+

Das Wasserstoffperoxid wird durch zwei Elektronenreduktionen molekularen Sauerstoffs oder durch die Dismutation des 02~ gebildet. Catalase (CAT) reduziert H202 zu H20. b. Materialien und Verfahren 02' Anionradikalbildung

Die verwendete Prozedur war identisch zu der, die von Del Maestro, R.F., J. Bjork und K.E. Arfors (Microvascular Res. 22, 239-254; 1981) beschrieben wurde. Besonders die Reduktion des Cytochrom c3+ -(Cyt c3+) wurde in einem System von 0,96 mM Hypoxanthin 5.10‘SM Cyt c3+ in einem Bicarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 7,35 (0,132 NaCI, 4.7.10~3M KCl, 2.10~3M CaCI2, 1.2.10~3M MgSO*, 0,018 M NaHC03) durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Xanthin-Oxidase in einer Konzentration von 0,07 U/ml gestartet. Der Anstieg der Absorption bei 550 nm wurde bei 37°C in einer Spektrophotometriezelle mit Thermostat jede Minute während 4 min beobachtet.

Jede Testverbindung wurde vor der Xanthin-Oxidase zugeführt. Eine Aktivitätseinheit wurde als ein Wechsel von 0,001 Einheiten pro Minute definiert. Der Prozentsatz der Enzymaktivität wurde für jede Konzentration der getesteten Verbindungen berechnet, und die Menge der Substanz, die für eine Inhibition von 50 % des Enzyms (IC50) notwendig war, wurde durch lineare Regression eines Datensatzes erhalten, der den Log. der Konzentration M gegen % Inhibition beschrieb (Tabelle 2). 7

AT 402 070 B 3) "In vitro" Sichtung der Verbindungen des Arachidonkaskadenmetabolismus in menschlichen Blutplätt-chenmikrosomen a. Materialien und Verfahren

Die enzymatischen Versuche wurden in silanisierten Glasgefäßen gemäß dem Verfahren von P. Ho, P. Walters und H, Sullivan (Prostaglandins 12, 951; 1976) durchgeführt. Die Reaktionsmischung enthält 50 mM Tris HCI-Puffer, pH = 7,9, 5mM 2-Tryptophan, 2 M Methemglobin, 0,2 mg Mikrosomalpulver und die Testverbindung in einem totalen Volumen von 0,2 ml wurde bei 37°C 5 min vor der Zugabe von 10 Mikroliter, von 20 MikromoluC Arachidonsäure (0,08 Mikro CI) inkubiert. Nach 5 min der Inkubationszeit wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 Mikroliter 1M Zitronensäure gestoppt.

Die Mischung wurde 4 mal mit 0,5 ml wasserfreiem Diäthyläther extrahiert und mit Natriumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde in etwa 40 Mikroliter Äther wieder gelöst und der Chromatographie auf Silikagelplatten unterworfen. Das Spülsystem bestand aus Diäthyläther / Methanol / Essigsäure (90:1:2). Die RF-Werte wurden relativ zur Arachidonsäure gemessen. Dünnschichtchromatographieplatten (TLC) wurden auf LKB Ultrafiim für c. 24 h entwickelt. Teilweise Identifizierung der Punkte wurde durch Standardvergleiche erhalten (PGA2, PGB2, PGE2, PGF2, PXB2 Arachidonsäure), wobei dasselbe Lösungsmittelsystem verwendet wurde. Quantitative Resultate wurden durch Untersuchung des entwickelten Films mit einem Transmissionsdensitometer (EC Apparatus 910), gekoppelt mit einem Hewlett Packard 3390A Integrator erhalten. Imidazol und Indomethacin wurden als positive Standards für die spezielle Inhibition der Throm-boxansynthetase und der Cyclooxygenase mit untersucht (Tabelle 3). 4) "In vitro" Inhibition der Prostaglandinsynthetase in Bläschenmikrosomen von Vita-Samen, a. Materialien und Verfahren

Ein verbessertes Verfahren war von den veröffentlichten Verfahren von Bauman et al (Naunyn-Schmiedeberg’s Arch. Pharm. 307, 73; 1979) und Takeguchi, C. et al (Biochem. 10, 2372; 1971) abngelei-tet. Die enzymatische Radiobeobachtung wurde in silanisierten Glasgefäßen durchgeführt. Die Reaktionsmischung enthielt 50 mM Tris-HCl-Puffer, ph = 8,3 in Gegenwart reduzierten Glutathions (GSH), 1mM sowie als Hydrochinon 0,55 mM die Testverbindung und 50 Mikrogramm Samenbläschen Mikrosomalpulver des Vitas in einem Gesamtvolumen von 0,2 Milliliter, welches für 5 min bei 37 °C vor Zugabe von 10 Mikroliter von CH Arachidonsäure 10-6M (0,08 Mikro Ci) inkubiert wurde. Nach 30 min Inkubieren mit gelegentlichem Schütteln wurde die Reaktion durch Zugabe von 10 Mikroliter Zitronensäure 1M beendet.

Die Mischung wurde 4 mal mit 0,5 ml wasserfreiem Diäthyläther extrahiert und mit Natriumsulfat getrocknet. Der Rückstand wurde in etwa 40 Mikroliter Äther aufgenommen und der Chromatographie auf Silikagelplatten unterworfen. Das Spülsystem bestand aus Diäthyläther / Methanol / Essigsäure (45:1:2). Die RF-Werte wurden in Bezug auf Arachidonsäure gemessen. Dünnschichtchromatographieplatten wurden auf LKB Ultrafilm für etwa 20 h entwickelt. Vergleichsweise Identifizierung der Punkte wurde durch Standard (PGE1, PGE2, PGF1a, PGF2a, PGA1, PGA2, PGBt, PGBi) im selben Lösungsmittelsystem ermöglicht. Quantitative Resultate wurden durch Densitometrie erhalten (Tabelle 4). 5) "In vitro" Prüfung von Verbindungen als mögliche Inhibitoren der Xanthinoxidase a. Materialien und Verfahren

Xanthinoxidase-Aktivität wurde nach dem Verfahren nach H.M. Kalckar (J. Biol. Chem. 167, 429-443, 1947) welches Harnsäurebildung spektrophotometrisch mißt, bestimmt.

In einer spektrophotometrischen Cuvette wurde Xanthinoxidase zugefügt, um eine Endkonzentration von 0,01 Einheiten/ml zu erhalten, gefolgt von Phosphatpuffer 0,05 M, ph = 7,4 oder dem Inhibitor. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Xanthin mit einer Endkonzentration von 5 10“5M gestartet. Die Bildung von Harnsäure wurde bei 295 nm alle 30 Sekunden für 2 min gemessen (lineare Phase). Eine Aktivitätseinheit wurde als Wechsel von 0,001 Einheiten/Minute definiert. Der Prozentsatz der enzymatischen Aktivität wurde für jede Konzentration der getesteten Verbindung berechnet und die Menge der Substanz, die benötigt wurde um 50 % des Enzyms (IC50) zu inhibieren, wurde durch lineare Regression aus einem Datensatz, der den Logarithmus der Konzentration M als Funktion der Prozent-Inhibition darstellte, erhalten (Tabelle 5) 8

AT 402 070 B 6) Inhibition der Human - Leukozytenlipoxygenase (LO) a) Inhibition an menschlicher polynuklearer 5- und 12- Lipoxygenase.

Protokoll für das Experiment No. 1: 1. Inkubation von 15 x 1o6 menschlichen Leukozyten /ml mit Ca2+ 2 mM, Mg2+0,5 mM in Gegenwart der Inhibitoren bei 37°C für 20 min. 2. Stimulation mit 1 Mikrogramm Ionophor (A23187)/ml für 4 min. 3. Stoppen der Inkubation Mit 1 Volumen Methanol. 4. Analyse mit RP-HPLC, Kolonne C18, 5 Mikrometer. 5. Messen der Höhe der Spitzen und Vergleich mit dem internen Standard (PGB2) (Tabelle 6a). b) Inhibition an menschlichen Polynuklearen von 5-, 12- und 15- Lipoxygenasen Protokoll für das Experiment Nr. 2: 1. Inkubation von 11 x 106 menschlichen Leukozyten/ml mit den Inhibitoren für 20 min (2 mM Ca2+ und 0,5 mM Mg2+) bei 37°C. 2. Stimulation mit 10 Mikrogramm Arachidonsäure und einem Mikrogramm Ionophor (A23187)/ml für 4 Minuten. 3. Stoppen der Inkubation mit einem Volumen Methanol und Analyse durch RP-HPLC. 4. Messung der Höhe der Spitzen und Vergleich mit dem internen Standard (PGB2) (Tabelle 6b).

Bemerkungen:

Stimulation der 15-Lipoxygenase bei den obigen drei Verbindungen der Konzentrationen von 10'6M bis 3 x 10'6M wird beobachtet, während die 5-Lipoxygenase bei diesen Konzentrationen inhibiert wird.

Es ist zu bemerken, daß beim Experiment No. 1 die Leukozyten durch lonophore allein stimuliert wurden, während im Experiment No. 2 die Zellen durch Ionophor und Arachidonsäure stimuliert wurden. Die Gegenwart der Arachidonsäure erhöht den ID50-Wert der Inhibitoren um den Faktor 10; andererseits erlaubt die Addition der Arachidonsäure die Messung der Aktivität der 15-Lipoxygenase die normalerweise in Leukozyten, die nur von Ionophor stimuliert wurden, nicht feststellbar ist.

Tabelle 1

Verbindung ICso (Konzentration der 50 % Inhibition) Beispiel 1 7.25 10'5 Beispiel 2 8.23 10'5 Beispiel 3 1.21 10'6 Beispiel 4 1.35 10'6 Beispiel 5 2.29 10'6 Beispiel 6 1.42 10'6 Diphenylthiocarbazon 1.61 10'6M 9

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Tabelle 2

Verbindung 02 Abbau ICso (Konzentration der 50 % Inhibition) Beispiel 1 6.64 10~6 Beispiel 2 6.33 10~6 Beispiel 3 2.22 10'5 Beispiel 4 3.67 10'5 Beispiel 5 5.81 10'6 Beispiel 6 4.12 10'6 Kampherol 9.05 10'6M 3,4- Dihydroxyphenylessigsäure 3.87 10'5M

Tabelle 3

Verbindung IC50 (Konzentration der 50 % Inhibition) Beispiel 1 1.51 10'4 Beispiel 2 1.68 10'4 Beispiel 3 9.37 10~4 Beispiel 4 1.33 10'5 Beispiel 5 3.56 10'6 Beispiel 6 7.39 10"6 Indomethacin 1.12 10~5M Phenylbutazon 2.74 10’4M

Die Aktivität der Substanz der Cyclooxygenase wird durch 2 Punkte entsprechend PGE2 und Txß2 ( Verhältnis PGE2/TXB2) quantifiziert.

Tabelle 4

Verbindungen 3.2 10'6M Autoradiographische Quantifikation % Variation PGF2a pge2 pgd2 Beispiel 1 - 51.49 -15.12 - 5.12 Beispiel 2 - 59.12 - 17.30 - 6.30 Beispiel 3 - 36.26 - 22.47 - 2.11 Beispiel 4 - 42.84 - 41.25 - 11.28 Beispiel 5 -28.10 - 33.33 - 16.75 Beispiel 6 - 30.29 - 16.48 - 29.63 Phenylbutazon (2 10'5M) - 43.36 - 15.37 - 21.98 10

Claims (1)

1. AT 402 070 B Tabelle 5 Verbindung ICso (Konzentration der 50 % Inhibition) Beispiel 1 5.20 10'5 Beispiel 2 5.39 10'5 Beispiel 3 1.13 IO-5 Beispiel 4 9.04 10-4 Beispiel 5 3.37 10~5 Beispiel 6 1.03 10’6 Folsäure 6.76 10_7M Kampherol 7.89 10"®M Produkt ICso 5-HETE LTB* 12-HETE Beispiel 1 2.10*6Μ 2.10"6M 2.10-®M Beispiel 3 10_6M 10" ®M 10"®M Beispiel 5 2.10-6 10'6M 10*6M Beispiel 6 3.10-6 10" 6M 2.10-®M Tabelle 6b Produkt ICso 5-HETE 12-HETE 15-HETE HHT ltb4 Beispiel 1 2.10"6M 10" 6M 3.10~5M 4.10'5M 4.10-®M Beispiel 2 2.10~6M io-6m 10_5Μ 5.10'SM 2.10~6M Beispiel 3 5.10-SM 5.10"6M 5.10"5M 10'6M 5.10_6M Beispiel 4 10'6M 10"5Μ 2.10"6M 10~5M 5.10"6M Beispiel 5 3.10"6M 2.10"6M 10*6M 2.10'6M 10'®M Beispiel 6 2.10-6 3.10"®M 5.10"6M 2.10'6M 10-®M Patentansprüche 1. Verfahren zur Herstellung neuer bicyclischer Brenzcatechinderivate der allgemeinen Formeln (I) und CD 11 55 AT 402 070 B

   worin Ri und R2 unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe stehen; R3 für ein aromatisches Radikal oder ein heterocyclisches einfach oder mehrfach ungesättigtes aromatisches Radikal, gegebenenfalls durch ein oder mehrere Halogenatome oder Trifluoromethylgrup-pen substituiert, steht und Z für eine Valenzbindung oder eine Carbonyl-, Hydroxymethylen-, Methylen-, Carbonylmethylen-, Hydroxyethylen- oder Ethylengruppe steht, wobei die Sauerstoff-Kohlenstoff-Bindung im Falle des Carbonylmethylens und Hydroxyethylens das Kohlenstoffatom, welches dem Kohlenstoffatom, das in die Ringbildung einbezogen ist, benachbart ist, betrifft, in dem man eine Verbindung der allgemeinen Formel IX

   worin Ri und R2 die oben angegebene Bedeutung haben und A für H02c-(C)X H H02C Y , Y i oder steht, in an sich bekannter Weise cyclisiert. 12