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Hintergrund der Erfindung
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Bereich der Erfindung
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Der
Bereich der Erfindung betrifft einen Blutkoagulations-Reagens-Kit zur Verwendung
in der Diagnose von Antiphospholipid (aPL)-Antikörpersyndrom in Bereichen wie
klinischer Chemie und medizinischer Forschung, und betrifft insbesondere
ein Reagens-Kit, das in der Lage ist, spezifisch Lupus-Antikoagulans-positive
Krankheiten zu detektieren auf Basis eines in vitro Bluttests.
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Diskussion
des Standes der Technik
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Lupus-Antikoagulans
(im Folgenden als „LA" bezeichnet) ist
ein Immunglobulin, welches ursprünglich in
Patienten gefunden wurde, welche an systemischem Lupus erythematosus
litten (im Weiteren als „SLE-Patienten" bezeichnet). Während LA
in SLE-Patienten mit einer Frequenz im Bereich von 5 bis 10 detektiert
wird, wird es ebenfalls detektiert in Patienten, die unter anderen
Autoimmunerkrankungen und Tumorerkrankungen leiden. LA wird am Häufigsten
detektiert in Patienten mit Antiphospholipid-Syndrom (APS), wie
Patienten mit Thrombose, Frauen, die eine Missgeburt oder vorzeitige
Geburtswehen hatten, und Patienten mit Thrombozytopenie. Da die
Blutkoagulationszeit in APS-Patienten verlängert ist infolge der Phospholipid-abhängigen Koagulationsreaktion,
wird angenommen, dass LA ein Autoantikörper gegen Phospholipid ist.
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Gemäß einer
neuen Studie ist aufgeklärt
worden, dass LA ein heterogenes Immunglobulin ist, welches Antikörperreaktionen
gegen einen Komplex von negativ geladenem Phospholipid und β- 2-Glycoprotein I (β-2-GPI) oder
einen Komplex von negativ geladenen Phospholipiden und Prothrombin
zeigt. Es wird angenommen, dass LA Antikoagulationswirkung verursacht,
da die Bindung von LA an den Komplex die Umwandlung von Prothrombin
zu Thrombin verhindert.
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Es
gibt bekannte Reagentien, die bestimmte Mengen von Phospholipiden
enthalten zur Detektion von LA mit den zuvor genannten Eigenschaften,
wie Cephalin aus Hasenhirn, Cephalin aus Rinderhirn, Sojabohnenlecithin
und Schlangengift. Wenn LA in einer Blutprobe vorhanden ist, neutralisiert
das vorhandene LA das Phospholipid im Reagens, was zu einem Mangel
an Phospholipid führt,
welches nötig
ist zur Initiierung der Kaskadenreaktion der Blutkoagulation. Als
Folge dieses Mangels wird die Koagulationszeit jeder Blutprobe verlängert in
Abhängigkeit
von der Menge an Phospholipid in dem Reagens, welches durch LA neutralisiert wurde.
Somit ermöglicht
es dieser Ansatz zu bestimmen, ob eine Blutprobe LA-positiv ist
oder nicht.
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Zusätzlich zu
dem obigen Ansatz ist ein anderer Ansatz durchgeführt worden,
in welchem zwei oder mehrere unterschiedliche Schritte miteinander
kombiniert werden, um die Detektionsgenauigkeit zu gewährleisten,
umfassend das Verdünnen
des Reagens angesichts der Tatsache, dass die Detektionssensitivität für LA umso
höher ist,
desto weniger Phospholipid in dem Reagens vorhanden ist.
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Als
Beispiel des letzteren Ansatzes ist eine Technik bekannt zur Beurteilung,
ob eine Blutprobe LA-positiv ist oder nicht, unter Verwendung eines
aktivierten partiellen Thromboplastin-Zeitreagens (im Weiteren einfach bezeichnet
als „APTT-Reagens"), welches eine Kombination
von zwei Arten von Reagenzien mit unterschiedlichen Konzentrationen
von Phospholipid ist, und durch Berechnen des Rosner Index oder
des Lupus-Verhältnisses
(LR) auf Basis der Koagulationszeiten, die jeweils unter Verwendung
der zwei Arten von Reagenzien erhalten wurden.
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Ein
Beispiel eines kommerziell erhältlichen
Detektionsreagens ist Gradipore LA (hergestellt von Gradipore Ltd.,
Australien), welches ein Reagens-Kit ist, zur Messung von Koagulationszeiten
unter Verwendung des Gifts der Kettenviper („Russel's viper"). Das Reagens-Kit ist eine Kombination
eines ersten Koagulationszeitreagens enthaltend das Schlangengift,
und ein zweites Koagulationszeitreagens enthaltend Schlangengift, und
Phospholipid aus Sojabohnen im Überschuss.
Unter Verwendung dieses Reagens-Kits wird eine Blutprobe als LA-positiv
bezeichnet, wenn die folgende Formel erfüllt ist:
Das Verhältnis der
Koagulationszeit einer Blutprobe, die zu dem ersten Koagulationsreagens
hinzugefügt
wurde zu jener einer Blutprobe, die zu dem zweiten Koagulationszeitreagens
hinzugefügt
wurde, ist ≥ 1,3.
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Des
Weiteren ist gemäß einem
wissenschaftlichen Artikel (siehe V. Chantarangkul et al., Thromb.
Res. 1992, 67: 355-365; E. Rosner et al., Thromb. Haemost. 1987,
57: 144-149), eine Technik etabliert worden, in welcher LA arithmetisch
detektiert wird unter Verwendung eines Unterschieds in der Konzentration
von Phospholipid aus Hasenhirn oder dessen Äquivalent.
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Ein
wiederum anderer Ansatz wird vorgeschlagen. Diesem Ansatz entsprechend
werden Koagulationszeiten gemessen unter Verwendung eines APTT-Reagenzien-Kits,
bestehend aus zwei Arten von Koagulationszeitreagenzien mit unterschiedlichen
Phospholipidkonzentrationen, oder unter Verwendung eines verdünnten Kettenviperngift-Zeitreagens-Kit
(dRVVT), unter Verwendung einer Probe, welche eine Mischung aus Blutplasma
(normales Plasma) aus einem normalen gesunden Individuum und Blutplasma
(LA-enthaltendes Plasma) aus einem LA-positiven Patienten in einem
Mischungsverhältnis
von 1:1 ist, und LA wird detektiert auf Basis des Grads der Korrektur
der Abweichung der Koagulationszeit des LA enthaltenden Plasmas
von der Koagulationszeit des normalen Plasmas, als ein Index.
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In
dem konventionellen Ansatz zur Messung des Grads an Phospholipid-abhängiger Koagulation
wird aus natürlichen
Quellen abgeleitetes Phospholipid verwendet, und die Zusammensetzung
des Phospholipids ist unkontrolliert. Demgemäß ist es sehr wahrscheinlich,
dass fehlende Gleichförmigkeit
in der Zusammensetzung des Phospholipids aus natürlichen Quellen oder eine Abweichung
in den Extraktionsbedingungen des Phospholipids die Koagulationszeit
einer Blutprobe nachteilig beeinflussen können mit dem Ergebnis, dass
die Detektionsgenauigkeit von LA schwankt. Des Weiteren ist es entsprechend
des konventionellen Messverfahrens möglich, die Koagulationszeit
zu normalisieren durch Hinzufügen
von normalem Blut zu einer Blutprobe aus einem Individuum mit einer
Koagulationsfaktor-Defizienz, da der fehlende Koagulationsfaktor
durch das normale Blutplasma zur Verfügung gestellt wird. In diesem
Fall ist es jedoch schwierig, eine Blutprobe, die einen Koagulationsinhibitor,
wie Warfarin oder Heparin enthält,
von einer Blutprobe eines LA-positiven Patienten zu unterscheiden.
Demgemäß besteht
die Möglichkeit,
dass die diese Koagulationsinhibitoren enthaltenden Blutproben fälschlicherweise
als LA-positiv angesehen werden.
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Angesichts
dessen ist es nötig,
eine verlängerte
Koagulationszeit, die von einem Koagulationsinhibitor oder einer
Koagulationsfaktor-Defizienz resultiert, von einer verlängerten
Koagulationszeit, die von LA resultiert, zu unterscheiden, um Krankheiten,
die von LA herrühren,
genau zu bestimmen.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Ein
Ziel dieser Erfindung ist es, die Verwendung eines Reagens-Kits
und ein Verfahren zur Verfügung zu
stellen, die in der Lage sind, spezifisch und präzise LA zu detektieren durch
Erhöhen
der Detektionsgenauigkeit von LA und durch Unterscheiden zwischen
einer Blutprobe von einem LA-positiven Individuum und einer Blutprobe
eines Individuums, das eine Koagulationsfaktor-Defizienz hat, oder
einer Blutprobe, welche einen Koagulationsinhibitor wie Heparin
enthält.
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Als
Ergebnis intensiver Forschung, um das obige Ziel zu erreichen, hat
der Erfinder herausgefunden, dass Blutproben aus LA-positiven Individuen
einen bemerkenswerten Unterschied in der Koagulationszeit zeigen,
zwischen den Fällen,
in denen zwei Arten von Reagentien verwendet werden, die sich nur
in Bezug auf den Gehalt von Phosphatidylserin zu Phospholipid in
den jeweiligen Reagenzien unterscheiden, im Gegensatz zu einer Blutprobe
eines Individuums mit einer Koagulationsfaktor-Defizienz oder einer
Blutprobe enthaltend einen Koagulationsinhibitor wie Heparin, und
hat so diese Erfindung fertiggestellt.
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Bei
dieser Verwendung eines Reagens-Kits und eines Verfahrens unterscheidet
sich der Gehalt von Phosphatidylserin in Bezug auf den gesamten
Gehalt an Phospholipiden in dem ersten Koagulationszeit-Reagens
von dem Gehalt an Phosphatidylserin zu dem Gesamtgehalt von Phospholipiden
in dem zweiten Koagulationszeit-Reagens.
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Genauer
gesagt betrifft die vorliegende Erfindung die invitro-Verwendung
eines Reagens-Kits zur Unterscheidung zwischen Lupus-Antikoagulans-positiven
Individuen, und Individuen mit einer Koagulationsfaktor-Defizienz
oder Patienten, die einer anti-koagulierenden Therapie unterworfen
sind, wobei besagtes Kit umfasst:
ein erstes Koagulationszeitreagens,
umfassend ein erstes Vorbereitungsreagens enthaltend Phospholipide umfassend Phosphatidylserin,
welches synthetisches Phosphatidylserin oder von natürlichen
Quellen erhaltenes Phosphatidylserin mit einer Reinheit von 99 %
oder mehr ist, und ein zweites Vorbereitungsreagens enthaltend Calciumionen;
und
ein zweites Koagulationszeitreagens, umfassend ein
drittes Vorbereitungsreagens enthaltend Phospholipide umfassend
Phosphatidylserin, welches synthetisches Phosphatidylserin oder
von einer natürlichen
Quelle erhaltenes Phosphatidylserin mit einer Reinheit von 99 %
oder mehr ist, und ein viertes Vorbereitungsreagens enthaltend Calciumionen,
worin der Gehalt an Phosphatidylserin zu dem Gesamtgehalt der Phospholipide
in dem ersten Koagulationszeitreagens unterschiedlich ist zu dem
Gehalt an Phosphatidylserin zu dem Gesamtgehalt der Phospholipide
in dem zweiten Koagulationszeitreagens,
gekennzeichnet dadurch,
dass die Konzentration von Phosphatidylserin in dem ersten Vorbereitungsreagens im
Bereich von 30 μg/ml
bis 100 μg/ml
liegt, und die Konzentration von Phosphatidylserin in dem dritten
Vorbereitungsreagens in dem Bereich von 2 μg/ml bis 20 μg/ml liegt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft weiter die Verwendung eines Reagens-Kits
wie oben beschrieben, worin die Unterscheidung basiert ist auf einem
Unterschied zwischen der Koagulationszeit, die gemessen wird unter
Verwendung des ersten Koagulationszeitreagens und einer Koagulationszeit,
die gemessen wird unter Verwendung des zweiten Koagulationszeitreagens.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reagens-Kits,
wie oben beschrieben, worin sowohl das erste Vorbereitungsreagens
als auch das dritte Vorbereitungsreagens Phosphatidylethanolamin
im Bereich von 0,1 μg/ml
bis 300 μg/ml
und Phosphatidylcholin im Bereich von 2 μg/ml bis 1.000 μg/ml enthalten.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reagens-Kit,
wie oben beschrieben, worin die Konzentration des Phosphatidylethanolamin
in sowohl dem ersten als auch dritten Vorbereitungsreagens im Bereich
von 1 μg/ml
bis 30 μg/ml
liegt, und die Konzentration von Phosphatidylcholin in sowohl dem ersten
als auch dritten Vorbereitungsreagens im Bereich von 20 μg/ml bis
100 μg/ml
liegt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reagens-Kit,
wie oben beschrieben, worin sowohl das erste als auch das dritte
Vorbereitungsreagens des Weiteren einen Aktivator enthalten, welcher ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Ellagsäure, Kaolin und Sellait.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reagens-Kit,
wie oben beschrieben, worin sowohl das erste als auch das zweite
Koagulationszeitreagens des Weiteren ein Schlangengift enthalten.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reagens-Kits,
wie oben beschrieben, worin das Schlangengift zumindest eines ist
ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus dem Gift der Kettenviper („Russel's venom"), dem Gift der Braunschlange
(„textarin
venom") und dem
Gift der Sandrasselotter („ecarin
venom") ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch die Verwendung eines Reagens-Kits,
wie oben beschrieben, worin sowohl das erste als auch zweite Koagulationszeitreagens
des Weiteren einen Gewebefaktor enthalten.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren ein in vitro Verfahren
zur Unterscheidung zwischen Lupus-Antikoagulanspositiven Individuen,
und Individuen mit einer Koagulationsfaktor-Defizienz oder Patienten, die
antikoagulative Therapie empfangen, umfassend:
einen Schritt,
in dem eine Koagulationszeit, die unter Verwendung des ersten Koagulationszeitreagens
gemessen wurde, mit einer Koagulationszeit, die unter Verwendung
eines zweiten Koagulationszeitreagens gemessen wurde, verglichen
werden, worin das erste Koagulationszeitreagens ein erstes Vorbereitungsreagens
umfasst enthaltend Phospholipide umfassend Phosphatidylserin, welches
synthetisches Phosphatidylserin oder Phosphatidylserin erhalten
aus natürlichen
Quellen mit einer Reinheit von 99 % oder mehr ist, ein zweites Vorbereitungsreagens
enthaltend Calciumionen und das zweite Koagulationszeitreagens,
umfassend ein drittes Vorbereitungsreagens enthaltend Phospholipide
umfassend Phosphatidylserin, welches synthetisches Phosphatidylserin
oder Phosphatidylserin erhalten aus natürlichen Quellen mit einer Reinheit
von 99 % oder mehr ist, und ein viertes Vorbereitungsreagens enthaltend
Calciumionen, und worin der Gehalt von Phosphatidylserin zu dem
Gesamtgehalt der Phospholipide in dem ersten Koagulationszeitreagens
unterschiedlich ist von dem Gehalt an Phosphatidylserin zu dem Gesamtgehalt
von Phospholipiden in dem zweiten Koagulationszeitreagens, und die
Konzentration von Phosphatidylserin in dem ersten Vorbereitungsreagens
im Bereich von 30 μg/ml
bis 100 μg/ml
liegt, und die Konzentration von Phosphatidylserin in dem dritten
Vorbereitungsreagens im Bereich von 2 μg/ml bis 20 μg/ml liegt; und
einen Schritt,
Lupus-Antikoagulanz im Blut zu detektieren auf Basis des in dem
Vergleichsschritt erhaltenen Resultats.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch das oben beschriebene Verfahren,
worin sowohl das erste als auch das dritte Vorbereitungsreagens
des Weiteren einen Aktivator enthält, welcher ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Ellagsäure, Kaolin und Sellait.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch das Verfahren, wie oben beschrieben,
worin sowohl das erste als auch das zweite Koagulationszeitreagens
des Weiteren ein Schlangengift enthält.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch das oben beschriebene Verfahren,
worin das Schlangengift zumindest eines ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus dem Gift der Kettenviper („Russel's venom"), dem Gift der Braunschlange
(„textarin
venom") und dem
Gift der Sandrasselotter („ecarin
venom") ist.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren, wie oben beschrieben,
worin sowohl das erste als auch das zweite Koagulationszeitreagens
des Weiteren einen Gewebefaktor enthält.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Die
Verwendung eines Reagens-Kits oder eines Verfahrens dieser Erfindung
zur Unterscheidung zwischen Lupus-Antikoagulans (im Weiteren einfach bezeichnet
als „LA") positiven Individuen
und Individuen mit einer Koagulationsfaktor-Defizienz oder Patienten,
die eine antikoagulative Therapie erhalten, besteht im Wesentlichen
aus einem ersten Koagulationszeitreagens enthaltend Phospholipide
umfassend Phosphatidylserin, und einem zweiten Koagulationszeitreagens
enthaltend Phospholipide umfassend Phosphatidylserin, worin der
Gehalt des Phosphatidylserins in Bezug auf den Gesamtgehalt von
Phospholipiden in dem ersten Koagulationszeitreagens unterschiedlich
ist von dem Gehalt des Phosphatidylserins zu dem Gesamtgehalt von Phospholipiden
in dem zweiten Koagulationszeitreagens.
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Phosphatidylserin
(im Weiteren manchmal als „PS" bezeichnet), das
in dem ersten Koagulationszeitreagens und dem zweiten Koagulationszeitreagens
enthalten ist, ist ein synthetisches Phosphatidylserin oder ein Phosphatidylserin
aus natürlichen
Quellen. Vorzugsweise wird synthetisches Phosphatidylserin verwendet.
Im Fall der Verwendung von Phosphatidylserin aus natürlichen
Quellen wird Phosphatidylserin mit einer Reinheit von 99 % oder
mehr verwendet.
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Bevorzugte
Phospholipide, außer
PS, die in dem ersten und zweiten Koagulationszeitreagens enthalten
sind, umfassen Phosphatidylethanolamin (im Weiteren manchmal als „PE" bezeichnet) und
Phosphatidylcholin (im Weiteren manchmal als „PC" bezeichnet). Diese bevorzugten anderen
Phospholipide sind notwendige Zusammensetzungen zur Bildung eines
Blutgerinsels einer Probe, zu der das erste beziehungsweise zweite
Koagulationszeitreagens in vitro hinzugefügt wurde.
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Vorzugsweise
kann das erste (zweite) Koagulationszeitreagens andere Zusammensetzungen
als die obigen enthalten, welche Gerinselbildung in vitro verursachen.
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Beispiele
von anderen Zusammensetzungen umfassen einen Aktivator, Schlangengift,
Calciumionen und einen Gewebefaktor. Vorzugsweise ist der Aktivator
zumindest einer ausgewählt
bestehend aus der Gruppe bestehend aus Ellagsäure, Kaolin und Sellait. Das
Schlangengift ist vorzugsweise zumindest eines ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus dem Gift der Kettenviper („Russel's venom"), dem Gift der Braunschlange („textarin
venom") und dem
Gift der Sandrasselotter („ecarin
venom") ist. Der
Gewebefaktor kann aus Hasenhirn oder menschlicher Placenta sein,
oder ein rekombinanter Gewebefaktor.
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Die
obigen weiteren Zusammensetzungen werden optional ausgewählt in Abhängigkeit
von der Art des Koagulationszeitreagens. Z. B. werden in dem Fall,
dass das erste (zweite) Koagulationszeitreagens Calciumionen und
einen Aktivator umfassen, die Koagulationszeiten gemessen auf Basis
des Prinzips einer aktivierten partiellen Thromboplastinzeit (APTT).
Im Fall, dass das erste (zweite) Koagulationszeitreagens Calciumionen
und Schlangengift enthalten, werden Koagulationszeiten gemessen
auf Basis des Prinzips einer Ketten-Vipern-Giftzeit (RWT). In dem
Fall, dass das erste (zweite) Koagulationszeitreagens Calciumionen
und einen Gewebefaktor enthalten, werden Koagulationszeiten gemessen
auf Basis des Prinzips einer Prothrombinzeit (PT).
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Das
erste (zweite) Koagulationszeitreagens kann einen Puffer wie HEPES
und einen Trispuffer enthalten, wenn dies nötig ist. Die Konzentration
der Pufferlösung
kann in einem Bereich sein, der zulässig ist und im Allgemeinen
verwendet wird im Bereich der klinischen Chemie und wird empirisch
bestimmt auf Basis von vereinfachten und wiederholten Experimenten.
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Spezifisch
kann die PS-Konzentration des erstens Koagulationszeitreagens vorzugsweise
10- bis 20-fach höher
sein als jene des zweiten Koagulationszeitreagens.
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Noch
spezifischer kann die Konzentration von Phosphatidylserin in einer
Mischung einer Probe und dem ersten Koagulationszeitreagens enthaltend
Phospholipide umfassend Phosphatidylserin, vorzugsweise im Bereich
von 10 bis 30 μg/ml,
und noch bevorzugter im Bereich von 15 bis 20 μg/ml liegen. Andererseits kann die
Konzentration von Phosphatidylserin in einer Mischung einer Probe
und des zweiten Koagulationszeitreagens enthaltend Phospholipide
umfassend Phosphatidylserin, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 7 μg/ml und noch
bevorzugter im Bereich von 2 bis 4 μg/ml liegen.
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Alternativ
kann das erste (zweite) Koagulationszeitreagens eine Mischung aus
Phospholipiden und den anderen Zusammensetzungen sein. Als weitere
Alternative kann das erste Koagulationszeitreagens aus einem ersten
Vorbereitungsreagens und einem zweiten Vorbereitungsreagens bestehen,
die in verschiedenen Gefäßen enthalten
sind, wohingegen das zweite Koagulationszeitreagens aus einem dritten
Vorbereitungsreagens und einem vierten Vorbereitungsreagens bestehen
kann, die in unterschiedlichen Gefäßen enthalten sind. In dem
Fall, dass das erste Koagulationszeitreagens eine Kombination aus
den ersten und zweiten Vorbereitungsreagenzien ist, und das zweite
Koagulationszeitreagens eine Kombination aus dem dritten und vierten
Vorbereitungsreagens ist, können
die Konzentrationen von Phosphatidylserin in dem ersten und dritten Vorbereitungsreagens,
welches jeweils Phospholipide, umfassend Phosphatidylserin, enthält, dergestalt
sein, dass die Konzentration von Phosphatidylserin in dem ersten
Vorbereitungsreagens im Bereich von 30 bis 100 μg/ml, vorzugsweise 40 bis 60 μg/ml liegt,
wohingegen die Konzentration von Phosphatidylserin in dem dritten Vorbereitungsreagens
im Bereich von 2 bis 20 μg/ml,
vorzugsweise 6 bis 10 μg/ml
liegt. Es sollte angemerkt werden, dass die Konzentration von Phosphatidylserin
in dem ersten Vorbereitungsreagens immer höher ist als jene im dritten
Vorbereitungsreagens.
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In
dem Fall, dass sowohl das erste als auch das dritte Vorbereitungsreagens
Phosphatidylethanolamin enthält,
kann die Konzentration von Phosphatidylethanolamin in dem ersten
(dritten) Vorbereitungsreagens in dem Bereich von 0,1 bis 300 μg/ml, vorzugsweise
1 bis 30 μg/ml,
und noch bevorzugter 3 bis 15 μg/ml
liegen. In dem Fall, dass sowohl das erste als auch das dritte Vorbereitungsreagens
Phosphatidylcholin enthält,
kann die Konzentration an Phosphatidylcholin in dem ersten (dritten)
Vorbereitunsreagens in dem Bereich von 2 bis 1.000 μg/ml, vorzugsweise
20 bis 100 μg/ml,
und noch bevorzugter 35 bis 85 μg/ml
liegen.
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In
dem Fall, dass die erfindungsgemäße Verwendung
des Reagens-Kits oder des Verfahrens auf dem Prinzip von APTT basiert,
verwendet gemäß dieser
Erfindung das Koagulationszeitreagens-Kit im Wesentlichen das erste
Koagulationszeitreagens umfassend das erste Vorbereitungsreagens
und das zweite Vorbereitungsreagens, und das zweite Koagulationszeitreagens
umfassend das dritte Vorbereitungsreagens und das vierte Vorbereitungsreagens,
worin das erste (dritte) Vorbereitungsreagens einen Aktivator und
Phospholipide (Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin)
enthält
und das zweite (vierte) Vorbereitungsreagenz Calciumionen enthält.
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Des
Weiteren in dem Fall, dass die erfindungsgemäße Verwendung des Reagens-Kits
oder -verfahrens auf dem Prinzip von RVVT basiert, enthaltend sowohl
das erste als auch das zweite Koagulationszeitreagens Phospholipide
(Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin),
Schlangengift und Calciumionen.
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Des
Weiteren in dem Fall, dass die erfindungsgemäße Verwendung des Reagens-Kits
oder Verfahren auf dem Prinzip von PT basiert, enthält sowohl
das erste als auch zweite Koagulationszeitreagens Phospholipide
(Phosphatidylserin, Phosphatidylethanolamin und Phosphatidylcholin),
einen Gewebefaktor und Calciumionen.
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Die
Verwendung des LA-Reagens-Kits oder verfahrensgemäß dieser
Erfindung dieser Erfindung hat die Eigenschaft, dass eine Kombination
von zwei Arten an Reagenzien die unterschiedlichen Koagulationszeiten
zueinander aufweisen, durch Unterschiede im Gehalt von Phosphatidylserin
(PS-Gehalt-Verhältnis)
in dem ersten Koagulationszeitreagens zu dem gesamten Gehalt von
Phospholipiden von dem PS-Gehalt- Verhältnis in
dem zweiten Koagulationszeitreagens verwendet werden. Mit anderen
Worten kombiniert die Verwendung des LA-Reagen-Kits oder des Verfahrens
gemäß der Erfindung
das erste und zweite Koagulationszeitreagens mit unterschiedlichen
PS-Gehalt-Verhältnissen
in einer solchen Weise, dass die Koagulationszeiten durch die verschiedenen
Reagenzien zueinander verschieden sind durch Neutralisieren von
PS in dem ersten Koagulationszeitreagens durch LA.
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Als
nächstes
wird ein Verfahren zur Unterscheidung zwischen Lupus-Antikoagulans-positiven
Individuen und Individuen mit einer Koagulationsfaktor-Defizienz
oder Patienten, die antikoagulative Therapie erhalten, unter Verwendung
des LA-Reagens-Kits der Erfindung beschrieben.
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Zunächst wird
eine Probe in zwei Teile geteilt und das erste Koagulationszeitreagens,
welches PS in einer hohen Konzentration enthält, wird zu einer Hälfte der
Probe hinzugefügt,
wohingegen das zweite Koagulationszeitreagens, welches PS in einer
niedrigen Konzentration enthält,
zu der anderen Hälfte
der Probe hinzugefügt
wird. In dem Fall der Verwendung eines ersten Koagulationszeitreagens,
das aus einem ersten und zweiten Vorbereitungsreagens besteht, ist
es möglich,
das erste und zweite Vorbereitungsreagens zusammenzumischen vor
dem Hinzufügen
der Mischung zu der Probe, oder alternativ das erste (zweite) Vorbereitungsreagens
der Probe hinzuzufügen
und dann das zweite (oder erste) Vorbereitungsreagens in dieser
Reihenfolge. In dem Fall der Verwendung des zweiten Koagulationszeitreagens,
welches aus dem dritten und vierten Vorbereitungsreagens besteht,
trifft das Gleiche zu wie bei der Verwendung des ersten Koagulationszeitreagens
bestehend aus dem ersten und zweiten Vorbereitungsreagens.
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In
dem Fall dass das erste und zweite Vorbereitungsreagens separat
hinzugefügt
wird, kann die Mischung der Probe und des Vorbereitungsreagens erwärmt werden,
entsprechend den Bedürfnissen
nach dem Hinzufügen
des ersten (oder zweiten) Vorbereitungsreagens oder vor dem Hinzufügen des
zweiten (oder ersten) Vorbereitungsreagens. In dem Fall des separaten
Hinzufügens
des dritten und vierten Vorbereitungsreagens gilt das Gleiche wie
beim separaten Hinzufügen
des ersten und zweiten Vorbereitungsreagens.
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Nach
dem Hinzufügen
des LA-Reagens zu der Probe wird die Koagulationszeit der Probe
gemessen. Das Messverfahren der Koagulationszeit kann ein dem Fachmann
bekanntes Verfahren sein und kann z. B. gemessen werden unter Verwendung
eines bekannten automatischen Analyzers.
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Die
bei der Messung verwendete Probe ist vorzugsweise Blutplasma anstelle
von Blut als solchem, noch bevorzugter Blutplasma nach der Entfernung
von Blutplättchen,
und des Weiteren bevorzugt eine Mischung von Blutplasma aus einem
Patienten und normales Blutplasma oder normales Blutplasma nach
der Entfernung von Blutplättchen.
Die Verwendung einer Mischung enthaltend normales Blutplasma als
Probe ist vorteilhaft beim Verhindern der Verlängerung der Koagulationszeit,
die aus einer Koagulationsfaktor-Defizienz resultiert, sowie beim
Verbessern der Detektionssensitivität in einem Test zur Detektion
von Phospholipid-abhängigen
Blutkoagulationsstörungen.
Das Mischungsverhältnis
von Blutplasma eines Patienten zu normalem Blutplasma ist im Allgemeinen
im Bereich von 4:1 bis 1:4 und beträgt vorzugsweise 1:1.
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Koagulationstests,
die das LA-Reagens-Kit dieser Erfindung verwenden, zeigen, dass
die Koagulationszeiten von Proben mit anti-koagulativen Störungen wie
Blutproben von LA-positiven Patienten, Patienten mit einer Blutkoagulationsfaktor-Defizienz, Patienten,
welche Warferin erhalten haben, und Patienten, die Heparin verabreicht
bekommen haben, länger
sind als Koagulationszeiten von normalen Blutproben. Des Weiteren
wird ein Unterschied an Koagulationszeit erkannt zwischen der Verwendung
des ersten Koagulationszeitreagens und der Verwendung des zweiten
Koagulationszeitreagens in Bezug auf die Proben von LA-positiven
Patienten. Insbesondere zeigt die Beobachtung von Koagulationstests
in Bezug auf die Proben von LA-positiven Patienten, dass die Koagulationszeit
der Probe bei der Verwendung des zweiten Koagulationszeitreagens,
enthaltend niedrige Konzentrationen von PS, länger ist als jene der Probe
bei der Verwendung des ersten Koagulationszeitreagens, enthaltend
hohe Konzentrationen von PS. Auf der anderen Seite zeigt die Beobachtung
von Koagulationstests in Bezug auf die Proben von Patienten mit
einer Blutkoagulationsfaktor-Defizienz, Patienten, welche Warferin
erhalten haben, und Patienten, denen Heparin verabreicht wurde, dass
kein wahrnehmbarer Unterschied in der Koagulationszeit bei der Verwendung
des ersten Koagulationszeitreagens und der Verwendung des zweiten
Koagulationszeitreagens gefunden wird. Angesichts dieser Beobachtungen
kann LA spezifisch nachgewiesen werden auf Basis einer Koagulationszeitdifferenz
zwischen der Verwendung des ersten Koagulationsreagens und der Verwendung
des zweiten Koagulationsreagens.
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Es
ist zutreffend, dass LA nachgewiesen werden kann durch Beurteilen
einer Koagulationszeitdifferenz zwischen der Verwendung des ersten
Koagulationsreagens und der Verwendung des zweiten Koagulationsreagens.
Um eine Probe eines Patienten mit LA-Erkrankung mit einer hohen
Verlässlichkeit
als LA-positiv zu diagnostizieren, ist es bevorzugt, ein Verhältnis einer
Koagulationszeit einer Blutprobe von einem Patienten zur Koagulationszeit
einer normalen Blutprobe zu beurteilen, z. B, den Rosner-Index (siehe
Rosner et al., Thromb. Haemast. 1987, 57: 144-149) oder das Lupus-Verhältnis (siehe
R. Schjetlein et al., Thromb. Res. 1993, 69: 239-250).
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Im
Fall von normalen Blutplasmaproben beeinflusst das Verhältnis an
PS-Gehalt die Koagulationszeit nicht. Dementsprechend ist der LR-Wert,
der zum Verhältnis
des zweiten Koagulationszeitreagens zu dem ersten Koagulationszeitreagens
entspricht, in etwa 1 in Bezug auf die normalen Blutplasmaproben.
Genauso ist der LR-Wert von jeder der Proben von Patienten mit einer
Blutgerinnungsfaktor-Defizienz, Patienten, die Warferin erhalten
haben, oder Patienten, denen Heparin verabreicht worden ist, in
etwa 1, da kein wesentlicher Unterschied in der Koagulationszeit
nachgewiesen worden ist infolge eines Unterschieds an PS-Konzentration,
obwohl die Koagulationszeiten dieser Proben länger sind im Vergleich zu den
Koagulationszeiten von normalen Blutproben. Auf der anderen Seite
ist es im Fall von Proben von LA-positiven Patienten, trotz der
Verwendung des ersten und zweiten Koagulationszeitreagens in unterschiedlichen
Konzentrationen und Kombinationen offensichtlich, dass die Koagulationszeit
bei der Verwendung des zweiten Koagulationszeitreagens unterscheidbar
länger
ist als bei der Verwendung des ersten Koagulationszeitreagens. Dementsprechend
ist der Reagens-Kit dieser Erfindung vorteilhaft bei der Bestimmung
von LA-positiven durch Beurteilen, ob der LR-Wert jeder Probe größer ist
als ein Referenzwert.
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Wie
oben erwähnt,
hat die Verwendung des LA-Reagens-Kit oder des Verfahrens dieser
Erfindung das Merkmal, dass die Konzentration von PS, das spezifisch
an LA gebunden ist, kontrollierbar zwischen den beiden Reagenzien
variiert wird. Dementsprechend macht es die Verwendung des LA-Reagens-Kits
oder des Verfahrens dieser Erfindung medizinischem Personal möglich, LA-positive
Patienten zu diagnostizieren, um Koagulationszeitunterschiede einfach
zu erkennen. Auf der anderen Seite ist das konventionelle Reagens-Kit eine
Kombination von Reagenzien, welche Phospholipide aus natürlichen
Quellen enthalten, die in ihrer Zusammensetzung unkontrolliert sind.
Dementsprechend unterscheidet das konventionelle Reagens-Kit LA-positive
Patienten nicht von Individuen mit anderen anti-koagulativen Erkrankungen.
Die Verwendung des LA-Reagens-Kit dieser Erfindung ist vorteilhaft
durch die exklusive Bestimmung von LA-positiven Patienten ohne Wahrscheinlichkeit,
dass Proben von Individuen, denen ein Inhibitor wie Heparin verabreicht
worden ist, fälschlicherweise
als LA-positiv beurteilt werden.
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Beispiele
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Diese
Erfindung wird nachstehend weiter illustriert durch eine Anzahl
von konkreten praktischen Beispielen, welche jedoch in keiner Weise
den Umfang der Erfindung beschränken.
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Beispiel
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Ein
erstes und drittes Vorbereitungsreagens wurde hergestellt durch
Mischen von HEPES-Puffer, Ellagsäure,
Trispuffer, Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylcholin (PC)
und Phosphatidylserin (PS). Das resultierende erste Vorbereitungsreagens
hatte einen pH von 7,35 und jeweilige Konzentrationen von 50 mM HEPES-Puffer,
0,1 mM Ellagsäure,
25 mM Trispuffer, 50 μg/ml
PE, 50 μg/ml
PS und 70 μg/ml
PC. Das resultierende dritte Vorbereitunsreagens hatte einen pH
von 7,35 und jeweilige Konzentrationen von 50 mM HEPES-Puffer, 0,1 mM Ellagsäure und
25 mM Trispuffer, 50 μg/ml
PE, 10 μg/ml
PS und 70 μg/ml
PC. Ein zweites und viertes Vorbereitungsreagens, das jeweils 25
mM/ml Calciumionen enthielt, wurde hergestellt durch Hinzufügen von
Calciumchlorid zu gereinigtem Wasser.
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COAGUTROL
N® wurde
als eine Probe von normalem Plasma verwendet. Eine Mischung von
Patientenplasma und normalem Plasma in einem 1:1-Verhältnis wurde
als Probe von abnormalem Blutplasma verwendet. Als Proben von abnormalem
Plasma wurden vier Arten von Plasmaproben von LA-positiven Patienten,
vier Arten von Plasmaproben von Patienten, welche Warferin erhalten
hatten, und eine Plasmaprobe von einem Patienten, dem Heparin verabreicht
worden war, verwendet.
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Jede
der oben hergestellten Proben wurde in zwei Gruppen aufgeteilt.
Jede Probe der einen Gruppe wurde mit dem ersten Koagulationszeitreagens
behandelt (im Weiteren als „H-APTT-Reagens" bezeichnet), wohingegen
jede Probe der anderen Gruppe mit dem zweiten Koagulationszeitreagens
behandelt wurde (im Weiteren als „L-APTT-Reagens" bezeichnet). Die
Behandlung mit H-APTT-Reagens wurde in einer Weise durchgeführt, dass
eine Mischung von 50 μl
jeder Probe und dem oben hergestellten ersten Vorbereitungsreagens
erhitzt wurde für
drei Minuten auf 37°C
und dann 50 μl
des oben hergestellten zweiten Vorbereitungsreagens hinzugefügt wurden,
um die Koagulation auszulösen.
Die Behandlung mit L-APTT-Reagens wurde durchgeführt in der gleichen Weise wie
die Behandlung mit H-APTT-Reagens, außer dass das dritte und vierte Vorbereitungsreagens
anstelle des ersten und zweiten Vorbereitungsreagens verwendet wurde.
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Die
Koagulationszeit, welche gemessen werden kann als Zeit, die benötigt wird
zur Bildung eines bestimmten Blutgerinsels, wurde mit einem automatischen
Blutkoagulations-Analyzer „Coagrex-800" (erhältlich von
Shimadzu Corp.) gemessen. Die Messungen wurden zweimal durchgeführt und
die Mittelwerte der Messungen wurden berechnet. Das Lupus-Verhältnis (LR)
jeder Probe wurde berechnet gemäß der nachstehenden
Formel (beschrieben in R. Schjetlein et al., Thromb. Res. 1993,
69: 239-250). Lupus Ratio (LR) = (b/a)/(d/c)
= bc/adworin „a", „b", „c" und „d" Werte darstellen,
die unter den Bedingungen von Tabelle 1 gemessen wurden.
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Die
Ergebnisse für
Blutproben werden in Tabelle 2 gezeigt.
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Wie
in Tabelle 2 klar gezeigt wird, waren die Koagulationszeiten von
abnormalen Plasmaproben verlängert
im Vergleich zu den Koagulationszeiten von normalen Plasmaproben.
Des Weiteren zeigen die Ergebnisse, dass LA-positive Plasmaproben,
welche mit dem L-APTT-Reagens behandelt wurden, eine längere Koagulationszeit
hatten als solche, die mit dem H-APTT-Reagens behandelt wurden,
während
andere abnormale Plasmaproben (d. h. Proben von Blut nach der Verabreichung
mit Warferin oder Heparin) behandelt mit dem L-APTT-Reagens ähnliche
Koagulationszeiten aufweisen wie jene, die mit dem H-APTT-Reagens
behandelt wurden.
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Proben
wurden als positiv (+) bezeichnet, wenn der LR-Wert in der Probe
größer als
1,1 war, und als negativ (–)
bezeichnet, wenn der LR-Wert der Probe nicht größer als 1,1 war. Wie klar in
Tabelle 2 gezeigt, wurden alle Proben von LA-positiven Plasma als
positiv (+) bestimmt, während
die anderen abnormalen Plasmaproben als negativ bestimmt wurden
(–). Daher
ist die Verwendung des erfinderischen Reagens-Kit nützlich zur
einfachen und genauen Unterscheidung zwischen Blutproben von Patienten
mit einer Neigung, LA-positiv zu sein, und anderen Blutproben von
Individuen mit Blutkoagulationsstörungen.
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Vergleichsbeispiel
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Die
Koagulationszeiten der Proben wurden gemäß dem LA-Test „Gradipore" (erhältlich von
Medical Biolocigal Laboratory) gemessen. In diesem Test wird das
Reagens-Kit verwendet, welches eine Kombination eines Koagulationszeitreagens
enthaltend Schlangengift (im Weiteren als „RVVT-Reagens" bezeichnet) und einem
Koagulationszeitreagens enthaltend Schlangengift und Sojabohnenphospholipid
im Überschuss
(im Weiteren als „verdünntes RVVT-Reagens" bezeichnet) verwendet.
Dieselben Proben wie jene in dem obigen Beispiel wurden zur Messung
verwendet. Nach der Messung der Koagulationszeiten der Proben wurden LR-Werte
in derselben Weise wie in dem Beispiel berechnet. Die Ergebnisse
werden in Tabelle 3 gezeigt.
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Wie
aus Tabelle 3 ersichtlich ist, war die Koagulationszeit von jeder
abnormalen Plasmaprobe, die mit dem verdünnten RVVT-Reagens behandelt
wurde, verlängert
im Vergleich zu jener einer normalen Plasmaprobe, die mit demselben
Reagens behandelt wurde. Es zeigten jedoch nicht nur LA-positive
Plasmaproben, die mit dem verdünnten
RVTT-Reagens behandelt wurden, sondern auch andere abnormale Blutplasmaproben,
die mit demselben behandelt wurden, längere Koagulationszeiten als
die mit dem RVTT-Reagens behandelten Proben.
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Dementsprechend
sind die Kombinationen von Reagenzien mit unterschiedlichem Gehalt
von PS in Bezug auf den gesamten Gehalt von Phosopholipiden effektiv
für die
Unterscheidung zwischen Blutproben von LA-positiven Patienten und
Blutproben mit anderen Störungen
der Blutgerinnung.
