<Desc/Clms Page number 1>
Verfahren zur Gewinnung von Gammaglobulin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Gammaglobulin, insbesondere in der Form klinisch verwendbarer Präparate, wobei man von humanem Serum ausgeht und aus diesem Gamma- globulin entweder in lyophilisierter Form oder als gebrauchsfertige Injektionslösung herstellt.
Verfahren zur technischen Plasmafraktionierung sind bekannt. Neben der Trennung mit Hilfe ver- schieden konzentrierter wässerig-alkoholischer Lösungen kann man auch so vorgehen, dass das Serum einer Ammonsulfatfraktionierung unterworfen wird, wobei jedoch ein reines Präparat, bei dem mit Hil- fe der Elektrophorese keine Verunreinigungen durch Alpha- oder Betaglobuline nachgewiesen werden können, erst nach verhältnismässig kompliziertem Arbeitsaufwand und grossen Ausbeuteverlusten erhal- ten werden kann. Oft gelingt die Abtrennung der beiden oben genannten Globuline vom Gammaglobulin nicht immer quantitativ.
Es ist bekannt, das gewonnene Gammaglobulin in einer 2, 25 igen Aminoessigsäurelösung klinisch zu verwenden, wobei diese Lösung noch einen geringen Zusatz eines Bakteriostatikums, wie Natrium- äthylquecksilberthiosalicylat, enthält.
Das erfindungsgemässe Verfahren beruht auf der Erkenntnis, dass sich Aminoessigsäure nicht nur als
Stabilisator für das Gammaglobulin eignet, sondern dass seine wässerigen Lösungen auch eine Trennwirkung auf die Plasmafraktionen ausüben, die in solchen Lösungen derart unterschiedliche Löslichkeiten zeigen, dass sich der Trenneffekt technisch ausnutzen lässt, wobei die Trennung schärfer gelingt, als dies mit dem vorbekannten Verfahren der Fall war.
Demnach besteht das Verfahren zur Gewinnung von Gammaglobulin, bei welchem die durch Fällung mit einer elektrolytisch stark dissoziierten Substanz, vorzugsweise mit Ammonsulfat, aus mit Was- ser verdünntem nativem humanem Serum gewonnenen Rohglobuline weiter gereinigt werden, im wesentlichen darin, dass das Gammaglobulin aus der nach Abtrennung des Ammonsulfats aus den Rohglobulinen gebildeten Flüssigkeit durch einen erneuten Ammonsulfatzusatz gefällt, der Niederschlag mit wässeriger Aminoessigsäure aufgenommen und gegen diese dialysiert wird, wobei alle andern Globuline ausfallen und nur reines Gammaglobulin in Lösung bleibt, worauf dieses nach Entfernung der Aminoessigsäure auf feste oder flüssige Handelspräparate aufgearbeitet wird.
Dieses Verfahren hat den Vorteil, dass es die Verwendung eines leicht flüchtigen Lösungsmittels wie Alkohol vermeidet, in kleinen Volumsmengen arbeitet und Gammaglobulin von 99 zuiger Reinheit in guten Ausbeuten liefert.
Es hat sich ferner herausgestellt, dass das humane Serum bei seiner Aufarbeitung mit Hilfe des er- findungsgernÅassen Verfahrens aus einem sogenannten Pool stammen kann, worunter ein steriler Plasmavorrat verstanden wird, in welchem das Plasma von vielen Spendern nach dem Abzentrifugieren der Formbestandteile des Blutes, der Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten, vereinigt ist. Wiewohl dieses Ausgangsmaterial ein besonders wirtschaftliches Arbeiten gestattet und deshalb bevorzugt ist, ist
<Desc/Clms Page number 2>
es auch möglich, das Plasma von Einzelspendern mit Hilfe des erfindungsgemässen Verfahrens aufzuarbeiten.
Bei der Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird aus dem Plasma zunächst in an sich bekannter Weise das Fibrinogen abgeschieden. Aus dem dabei gewonnenen Serum wird eine Fraktion abgetrennt, die im wesentlichen aus Gammaglobulin besteht, während der Rest auf PPL-Lösung aufgearbeitet wird. Zur Durchführung dieser Trennung kann das Serum in an sich bekannter Weise bei einem pH-Wert von 6, 3 mit Ammonsulfat versetzt werden, bis sein Stickstoffgehalt um 4Q % abgenommen hat.
Der dabei gebildete Niederschlag enthält die Globuline des Serums. Die Rohglobuline können aber auch auf jede andere bekannte Art gewonnen sein.
Aus dem erwähnten Niederschlag wird nun zunächst auf irgendeine bekannte Weise das Ammonsulfat entfernt. Dabei kann mit Vorteil so gearbeitet werden, dass die Rohglobuline in einer NaCl-Lösung dialysiert werden. Dabei ist es möglich, das NaCl in allen jenen Konzentrationen anzuwenden, bei denen einerseits der Elektrolytgehalt der Lösung noch so gross ist, dass kein Gammaglobulin ausfällt und anderseits so hohe Salzkonzentrationen vermieden werden, bei denen der Aussalzeffekt bereits wirksam werden kann. Es wurde gefunden, dass sich besonders günstige Verhältnisse für die Austauschzeit und für das anzuwendende Flüssigkeitsvolumen ergeben, wenn die NaCl-Lösung etwa 3 Gew.-% enthält.
EMI2.1
ein Grossteil der andern Proteine in Lösung bleibt.
Es hat sich gezeigt, dass dabei die Fällung am besten gelingt, wenn der erwähnten NaCl-haltigen Flüssigkeit so viel Ammonsulfat, vorteilhaft in wässeriger Lösung, zugesetzt wird, dass seine Endkonzentration etwa 33 % von der Sättigungskonzentration beträgt und in der Lösung ein pH-Wert von 7, zweckmässig durch Zusatz von Ammoniak, eingestellt wird.
Sollte die Gammaglobulinlösung, von der bei diesem Verfahrensschritt ausgegangen wird, aus einer andern Quelle stammen, so können andere Ammonsulfatkonzentrationen und gegebenenfalls auch andere pH-Werte zweckmässiger sein. Der Fachmann ist aber in jedem Falle imstande, durch einfache Handversuche die jeweils günstigste Konzentration zu ermitteln und anzuwenden.
Der erhaltene ammonsulfathaltige Niederschlag kann nun auf irgendeine bekannte Weise, z. B. durch Zentrifugieren von der Lösung, welche die Verunreinigungen enthält und aus dem Verfahren ausgeschieden wird, getrennt werden.
Erfindungsgemäss wird der Niederschlag mit wässeriger Aminoessigsäure aufgenommen und gegen diese bis zur Ammonsulfatfreiheit dialysiert, wobei nur reines Gammaglobulin in Lösung bleibt. An Stelle der Dialyse kann auch irgendein äquivalentes Verfahren zur Abtrennung des Ammonsulfats angewendet werden.
Die Aminoessigsäure, die dabei als Trennmittel zur Anwendung kommt, ist auch unter andern Bezeichnungen wie Glycin, Glykokoll, Aminoäthansäure, Leimzucker oder Leimsüss bekannt. Sie schmilzt bei 232 bis 2360C und löst sich in 4, 3 Teilen kalten Wassers zu einer farblosen Lösung.
Die Konzentration, in welcher die Aminoessigsäure beim erfindungsgemässen Verfahren angewendet wird, hängt von verschiedenen Faktoren ab, u. zw. vor allem von der Konzentration des Ammonsulfates bzw. allgemein von der Salzkonzentration des zu verarbeitenden Niederschlages. Sie hängt ferner auch von der Proteinkonzentration der Lösung ab, die bei der Trennung hergestellt werden soll. Sie kann deshalb in weiten Grenzen schwanken und zwischen 0,2 und 15 Gew. -010 oder mehr liegen. Es empfiehlt sich nicht, den Niederschlag in einer Lösung aufzuschlämmen, deren Aminoessigsäuregehalt weniger als OSGew.-beträgt, weil dann die Trennung unscharf wird.
Durch die Anwendung von Aminoessigsäurekonzentrationen von mehr als 15 Gew.-% in der Lösung wird die Trennung gleichfalls unscharf.
EMI2.2
Konzentrationsbereich entsteht beim Aufschlämmen des Niederschlages eine trübe Lösung, die sich beim Dialysieren gegen Glycinlösung bis zur Ammonsulfatfreiheit vollständig klärt, wobei nur noch reines Gammaglobulin in Lösung gegangen ist, während sich alle andern Proteine als fester Bodenkörper abgesetzt haben.
Die Trennung erfolgt am besten bei Temperaturen unterhalb 300C, vorzugsweise bei 2 bis 10 C, wobei die Dialyse gegen eine Aminoessigsäurelösung von vorzugsweise der gleichen Konzentration durchgeführt wird, wie sie in dem zu dialysierenden Niederschlag eingestellt wurde.
Nach Entfernung des Ammonsulfats liegt eine reine Gammaglobulinlösung vor, die neben dem Pro-
<Desc/Clms Page number 3>
tein lediglich noch Aminoessigsäure enthält und an sich bereits klinisch verwendbar wäre. Wenn diese
Lösung nach ihrer Trennung von dem Niederschlag noch weiterverarbeitet wird, so liegt der Grund einzig darin, dass ihre Proteinkonzentration mit derjenigen nicht übereinstimmt, die für klinische Präparate dieser Art üblich ist.
Die Weiterverarbeitung, die in einer Anreicherung des Gammaglobulins besteht, kann auf jede an sich bekannte Weise vorgenommen werden.
Ein vorteilhafter Weg besteht darin, das Gammaglobulin aus der genannten Lösung durch Zusatz von
Ammonsulfat quantitativ auszufällen, über Nacht stehen zu lassen und den durch Zentrifugieren erhal- tenen Niederschlag gegen 0, 2 %ige NaCl-Lösung bis zur Ammonsulfatfreiheit bei einer Temperatur zwi- schen 2 bis 100 zu dialysieren. Nach Filtration wird die Lösung der Gefriertrocknung unterworfen. Das erhaltene Trockenpräparat ist unbegrenzt lagerfähig und kann jederzeit zu einer Lösung verarbeitet wer- den, die einen bestimmten Prozentsatz an Antikörpern enthält.
Beispiel : 50 1 natives humanes Serum werden mit 10 l sterilem, pyrogenfreie, bidestilliertem
Wasser verdünnt. Hierauf wird mit Ammonsulfat bei einem pH-Wert von 6,3 so viel von dem im Serum vorhandenen Protein gefällt, dass der Stickstoffgehalt um 40 % gesenkt wird, und zentrifugiert.
Der Niederschlag wird mit wenig 30/0iger NaCl-Lösung vermischt und zunächst in reinem Wasser und hernach in 3 % iger NaCl-Lösung dialysiert, bis er kein Ammonsulfat mehr enthält.
Nach Abtrennung etwa vorhandener fester Bestandteile durch Zentrifugieren wird zu der Flüssig- keit, deren pH-Wert auf 7 gestellt wurde, unter Rühren so viel gesättigte Ammonsulfatlösung (pH-
Wert = 7,0) zugefügt, bis die Ammonsulfatkonzentration 33 % der Sättigungskonzentration erreicht hat.
Hierauf wird die Lösung durch Zugabe von Ammoniak auf einen PH- Wert von 7 eingestellt, falls dies erforderlich ist. Die dabei eingehaltene Temperatur ist nicht kritisch. Sie soll aber im allgemeinen 300C nicht übersteigen. Eine Temperatur zwischen 12 und 200C ist bevorzugt. Der Mischvorgang er- folgt innerhalb einer Zeitspanne von einer bis zu einigen Stunden, wiewohl auch längere Mischzeiten nicht schaden.
Sobald die Ammonsulfatlösung zugesetzt ist, wird die Lösung einige Stunden ruhig stehen gelassen.
Der Zeitraum kann zwischen 2 h und 8 Tagen liegen. Eine Dauer von 24 bis 48 h ist bevorzugt, wobei die Temperatur im allgemeinen 300C nicht übersteigt und vorzugsweise nicht höher als 200C liegt. Dabei bildet sich ein Niederschlag, der auf der Zentrifuge von der Lösung getrennt wird.
Der Niederschlag wird mit einer überschüssigen Menge Aminoessigsäure behandelt und zu diesem Zweck mit etwa 121 einer wässerigen Lösung dieser Säure bei Raumtemperatur vermischt, die 2,25 Gew.-% derselben enthält.
Das erhaltene Gemisch wird gegen eine 2, 25 loge wässerige Aminoessigsäurelösung dialysiert, bis das Ammonsulfat entfernt ist und zentrifugiert.
Die erhaltene Lösung enthält etwa 1 bis 2 % reinstes Gammaglobulin. Es wird darin so viel festes Ammonsulfat aufgelöst, bis das Gammaglobulin vollständig ausgefällt ist. Hierauf wird der pH- Wert der Lösung mit Ammoniak auf 7,2 gebracht und die Lösung etwa 24 h bei Raumtemperatur stehen gelassen.
Nach Abtrennung des Niederschlages auf der Zentrifuge wird dieser bei einer Temperatur von 2 bis 100C gegen 0,2 tige NaCl-Lösung dialysiert, bis er vom Ammonsulfat befreit ist. Ein etwa gebildeter Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und die Lösung der Gefriertrocknung unterworfen.
Weil der nach der Dialyse mit Aminoessigsäure abgetrennte Niederschlag meist noch Gammaglobulin okkludiert enthält, wird derselbe mit 4 l 2, 25 %iger Aminoessigsäurelösung aufgeschlämmt, einige Zeit stehen gelassen und abermals zentrifugiert. Die anfallende Lösung wird mit der Hauptmenge vereinigt oder für sich mit Ammonsulfat in der oben für die Hauptmenge angegebenen Weise bei einem pH-Wert von 7,2 gefällt und mit 0,2 gew.-iger NaCl-Lösung dialysiert.
Der erwähnte Niederschlag kann auf diese Weise mehrfach ausgewaschen werden.
Von dem im Serum vorhandenen Protein werden auf diese Weise wenigstens 9, 5 bis 10 % als Gammaglobulin von über 99 figer Reinheit (elektrophoretisch) gewonnen.
**WARNUNG** Ende DESC Feld kannt Anfang CLMS uberlappen**.