WO2024128224A1 - 間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物 - Google Patents
間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物 Download PDFInfo
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Definitions
- the present invention relates to a composition for amplifying the differentiation ability of mesenchymal stem cells into adipocytes, and a method for amplifying the differentiation ability of mesenchymal stem cells into adipocytes.
- Mesenchymal stem cells are somatic stem cells derived from mesodermal tissue (mesenchyme) and have the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system. Depending on the tissue from which they are collected, they are called adipose-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, etc.
- Mesenchymal stem cells are known to have the pluripotency to differentiate into various somatic cells such as bone, blood vessels, and cardiac muscle, and also secrete cytokines that have immunosuppressive, anti-inflammatory, and angiogenic effects. In addition, because of their high immune tolerance, they can be used for not only autologous transplantation but also allogeneic transplantation.
- mesenchymal stem cells are pluripotent stem cells with great potential in regenerative medicine.
- numerous clinical studies have been conducted on mesenchymal stem cells for a variety of diseases, and they are expected to be used to treat a wide range of illnesses.
- Non-Patent Document 1 There is growing interest in fat grafting and its long-term clinical application (Non-Patent Document 2). However, a satisfactory solution to this ischemic volume loss has not yet been developed. A secondary procedure is often required for fat grafting to achieve satisfactory results. There is a need to develop fat transplantation techniques that have high fat and blood vessel regeneration capabilities.
- Adipose-derived mesenchymal stem cells are being investigated as a cellular therapy for enhancing fat grafting (Non-Patent Document 13).
- ASC supplemented fat grafting shows promise but requires further development to obtain consistent clinical results (Non-Patent Documents 14-15).
- ASCs have been observed to release proangiogenic cytokines (Non-Patent Document 16) and differentiate into vascular endothelium in vitro (Non-Patent Document 17).
- Patent Document 3 the present inventors have revealed that a composition containing a mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro has the effect of amplifying the effect of mesenchymal stem cells. Specifically, it has been found in two models, fat transplantation and lower limb ischemia, that supplementing a mesenchymal stem cell treatment with a mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro stimulates angiogenesis and exhibits anti-inflammatory and anti-immune effects, thereby amplifying the effect safely and effectively.
- WO2019/146131 describes a composition for amplifying the effect of a treatment with mesenchymal stem cells, which contains a mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro, as well as a method for amplifying the effect of a treatment with mesenchymal stem cells, which includes using a composition containing a mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro together with mesenchymal stem cells or a composition containing mesenchymal cells.
- WO2019/146131 shows that when mesenchymal stem cells are co-transplanted with a mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro, the angiogenic ability of the mesenchymal stem cells is promoted. The document also describes the effect on fat transplantation as being based on the promotion of angiogenic ability. WO2019/146131 does not mention at all the differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs) into adipocytes.
- ASCs adipose-derived mesenchymal stem cells
- a composition for amplifying the differentiation ability of mesenchymal stem cells into adipocytes comprising a mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro, and which is co-cultured with mesenchymal stem cells.
- Aspect 2 It is separated from mesenchymal stem cells during differentiation of mesenchymal stem cells into adipocytes. 2. The composition of claim 1.
- composition according to aspect 1 wherein the co-culture of the in vitro expanded mononuclear cell fraction and the mesenchymal stem cells is carried out for 1 to 7 days.
- the mononuclear cell fraction is a mononuclear cell fraction derived from bone marrow, peripheral blood or umbilical cord blood.
- the mononuclear cell fraction cultured by bioexpansion is a cell population enriched for vascular endothelial progenitor cells, anti-inflammatory cells, or cells that induce immune tolerance.
- composition according to aspect 1 or 2 wherein the mesenchymal stem cells are adipose-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, peripheral blood-derived mesenchymal stem cells, or umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
- the mesenchymal stem cells are adipose-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, peripheral blood-derived mesenchymal stem cells, or umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells.
- a method for amplifying the differentiation ability of mesenchymal stem cells into adipocytes comprising co-culturing a mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro with the mesenchymal stem cells.
- Mesenchymal stem cells co-cultured with the in vitro expanded and cultured mononuclear cell fraction of the present invention have a higher ability to differentiate into adipocytes compared to cases where co-culture is not performed.
- Mesenchymal stem cells with an amplified ability to differentiate into adipocytes increase the efficiency of fat transplantation using mesenchymal stem cells.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing an embodiment of the preparation of mesenchymal stem cells and fat transplantation using mesenchymal stem cells according to the present invention.
- Figure 2 shows the results of mRNA expression analysis of ASCs co-cultured with RE01 cells in an adipogenic differentiation-inducing medium for 3 days
- Figure 2A shows the results for FABP4
- Figure 2B shows the results for PPAR ⁇ .
- Figure 5 shows the results of investigating the adipogenic induction ability of ASCs by staining lipid droplets with oil red O using RE01 cells and ASCs cultured in adipogenic induction medium for two weeks.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing an embodiment of the preparation of mesenchymal stem cells and fat transplantation using mesenchymal stem cells according to the present invention.
- Figure 2 shows the results of mRNA expression analysis of ASCs co-cultured with RE01 cells in an adipogenic differentiation-inducing medium for 3 days
- Figure 2A shows the results for FABP
- FIG. 4 shows the results of mRNA expression analysis of ASCs co-cultured with RE01 cells for 3 days, and then cultured in adipogenesis-inducing medium for 3 days after removal of the RE01 cells.
- Figure 5 shows the results of staining lipid droplets with oil red O using ASCs that were co-cultured with RE01 cells for three days, then cultured in adipogenesis-inducing medium for two weeks after removal of the RE01 cells.
- composition for amplifying the differentiation potential of mesenchymal stem cells into adipocytes The present invention relates to a composition for amplifying the differentiation potential of mesenchymal stem cells into adipocytes.
- the composition of the present invention comprises a mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro and is co-cultured with mesenchymal stem cells.
- Mononuclear cell fraction is a general term for cells with round nuclei contained in peripheral blood, bone marrow, or umbilical cord blood obtained from an adult, and includes lymphocytes, monocytes, macrophages, vascular endothelial precursor cells, hematopoietic stem cells, etc. Mononuclear cells further contain CD34 and/or CD133 positive cells. They can be obtained by collecting bone marrow, umbilical cord blood, or peripheral blood from an animal and subjecting it to, for example, density gradient centrifugation to extract the fraction.
- the mononuclear cell fraction is a mononuclear cell fraction derived from bone marrow, peripheral blood or umbilical cord blood.
- the mononuclear cell fraction obtained by bioexpansion culture is a cell population enriched for endothelial progenitor cells, anti-inflammatory cells, or cells that induce immune tolerance, including endothelial progenitor cells, anti-inflammatory macrophages, T lymphocyte subsets, and regulatory T cells.
- Endothelial progenitor cells are mononuclear cell fractions, particularly CD34-positive and/or CD133-positive cells. They also include differentiated EPC colony-forming cells. Endothelial progenitor cells are known as cells that can differentiate into blood vessels, and are thought to be able to repair or replenish damaged blood vessels.
- the group of "anti-inflammatory cells or cells that induce immune tolerance” is a group of cells enriched with endothelial progenitor cells, M2 macrophages, T lymphocyte subsets, or regulatory T cells. These cells are thought to have anti-inflammatory and immune tolerance functions (Non-Patent Document 22).
- In vitro expansion (Quality and Quantity) (QQ) refers to modifying and amplifying stem cells taken from a living body by culturing them outside the body for a certain period of time in a serum-free or serum-based medium containing factors such as stem cell growth factors and interleukins.
- Modifying and amplifying means increasing the number and/or function of stem cells.
- the method for in vitro expansion and culture of the mononuclear cell fraction is not particularly limited, and any known method can be used.
- the stem cells are cultured in a serum-free medium or serum medium containing one or more factors selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin, and vascular endothelial cell growth factor.
- the stem cells are cultured in a serum-free medium or serum medium containing one or more, two or more, three or more, four or more, or five or more factors selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin, and vascular endothelial cell growth factor.
- stem cells are cultured in a serum-free medium or serum medium containing one or more factors selected from the group consisting of FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin, and vascular endothelial growth factor.
- Patent Document 2 describes a cell group obtained by culturing mononuclear cells derived from bone marrow, umbilical cord blood, or peripheral blood in a serum-free medium containing stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin, and vascular endothelial cell growth factor.
- Patent Document 4 describes a cell group obtained by culturing mononuclear cells derived from bone marrow, umbilical cord blood, or peripheral blood in a medium containing four or less factors selected from the group consisting of stem cell factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3 ligand, thrombopoietin, and vascular endothelial cell growth factor, and serum.
- the mononuclear cell fraction cultured by bioexpansion is preferably characterized in that it is enriched with anti-inflammatory cells or cells that induce immune tolerance, along with vascular endothelial progenitor cells. In one embodiment, it also contains anti-inflammatory M2 macrophages, T lymphocyte subsets, and regulatory T cells.
- Patent Document 4 and Non-Patent Documents 12, 20, and 21 disclose specific methods for in vitro expansion and culture of vascular endothelial progenitor cells.
- a medium supplemented with VEGF, SCF, Flt-3 ligand, TPO, IL-6, and 1% antibiotics can be used.
- the cells were cultured for one week in a medium containing IMDM medium (including GlutaMAX, Gibco) supplemented with 50 ng/mL VEGF, 100 ng/mL FLT-3 ligand, 20 ng/mL TPO, 0.5% FBS (fetal bovine serum), 0.5% HSA, and 1% antibiotics.
- IMDM medium including GlutaMAX, Gibco
- FBS fetal bovine serum
- HSA fetal bovine serum
- the method for expanding and culturing the mononuclear cell fraction in vitro may be the method described in International Publication WO2006/090882.
- the method includes incubating blood endothelial progenitor cells in a serum-free medium containing one or more factors selected from the group consisting of stem cell growth factor, interleukin 6, FMS-like tyrosine kinase 3, and thrombopoietin.
- composition containing the in vitro expanded and cultured mononuclear cell fraction is co-cultured with mesenchymal stem cells.
- the co-culture is performed in vitro or ex vivo.
- Mesenchymal stem cells are somatic stem cells derived from mesodermal tissue (mesenchyme) and have the ability to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system. Depending on the tissue from which they are collected, they are called adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs), bone marrow-derived mesenchymal stem cells, etc.
- ASCs adipose-derived mesenchymal stem cells
- Mesenchymal stem cells are included in stromal cells.
- bone marrow stromal cells can be induced to differentiate into cells belonging to the mesenchymal system (bone cells, cardiac muscle cells, chondrocytes, tendon cells, adipocytes, etc.).
- the mesenchymal stem cells are adipose-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, peripheral blood-derived mesenchymal stem cells, or umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells. In one embodiment, the mesenchymal stem cells are adipose-derived mesenchymal stem cells.
- the composition comprising mesenchymal stem cells is a stromal vascular cell fraction (SVF) (also referred to as a "stromal vascular cell population").
- the stromal vascular cell fraction is a cell population obtained by collagenase treatment of adipose tissue.
- the stromal vascular cell fraction is generally a heterogeneous cell population, and includes blood-derived cells as well as adipose tissue-derived cells.
- adipose stromal cells which include adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs).
- Mesenchymal stem cells may be derived from a living organism or may be artificially prepared. A composition containing an effective amount of mesenchymal stem cells may also be used for co-culture.
- the number of days for which the in vitro expanded and cultured mononuclear cell fraction is co-cultured with the mesenchymal stem cells is not particularly limited.
- the in vitro expanded and cultured mononuclear cell fraction is co-cultured with the mesenchymal stem cells for a period of half a day (12 hours) to seven days.
- the co-culture is performed for a period of half a day to six days, half a day to five days, half a day to four days, half a day to three days, one day to seven days, one day to six days, one day to five days, one day to four days, or one day to three days.
- the in vitro expanded mononuclear cell fraction is co-cultured with mesenchymal stem cells for 1-7 days.
- the ratio of cells in the co-culture of the in vitro expanded and cultured mononuclear cell fraction and the mesenchymal stem cells is not particularly limited.
- the mesenchymal stem cells are co-cultured with the in vitro expanded and cultured mononuclear cells at a number of 0.01 times or more, 0.03 times or more, 0.05 times or more, 0.07 times or more, 0.08 times or more, 0.09 times or more, or 0.1 times or more.
- the mesenchymal stem cells are co-cultured with the in vitro expanded and cultured mononuclear cells at a number of 10 times or less, 8 times or less, 5 times or less, 4 times or less, 3 times or less, or 2 times or less.
- the ratio of the number of mesenchymal stem cells to the number of in vitro expanded and cultured mononuclear cells during co-culture is in the range of 1:0.01 to 1:10. Preferably, it is in the range of 1:0.05 to 1:4, or 1:0.1 to 1:2.
- the culture medium for co-culture is not particularly limited.
- a medium suitable for culturing mesenchymal stem cells is used.
- the medium suitable for culturing mesenchymal stem cells can be appropriately prepared depending on the type of mesenchymal stem cells.
- ASC medium e.g., DMEM (high glucose) + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin
- ASC adipose-derived mesenchymal stem cells
- a differentiation induction medium suitable for inducing differentiation of somatic cells from mesenchymal stem cells can be used.
- an adipocyte differentiation induction medium e.g., DMEM + 10% FBS + insulin +
- induces differentiation of adipocytes from adipose-derived mesenchymal stem cells may be used.
- a medium suitable for culturing mononuclear cells expanded in vitro may be used.
- IMDM + 10% FBS can be used as a culture medium for mononuclear cells expanded in vitro.
- composition containing the mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro may be used directly for differentiation of mesenchymal stem cells into adipocytes after co-culture with the mesenchymal stem cells.
- the composition containing the mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro may be separated from the mesenchymal stem cells during the differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes after co-culture with the mesenchymal stem cells (including before inducing the differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes and during the induction of differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes).
- the mesenchymal stem cells may be separated from the mesenchymal stem cells before inducing the differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes, or may be separated from the mesenchymal stem cells during the induction of differentiation after starting the induction of differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes.
- the composition used to differentiate the separated mesenchymal stem cells into adipocytes contains only mesenchymal stem cells.
- the composition containing a mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro amplifies the ability of mesenchymal stem cells to differentiate into adipocytes, and this effect can persist even after the mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro is removed.
- the method of separating the composition containing the mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro from the mesenchymal stem cells during differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes after co-culturing with the mesenchymal stem cells is not particularly limited.
- an insert may be used that separates the mesenchymal stem cells and the mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro from each other with a membrane that allows the cells to pass through but the culture medium to pass through.
- a membrane for example, a polyethylene terephthalate membrane with a pore size of 0.4 ⁇ m and a pore density of 2.0 ⁇ 10 6 holes/cm 2 can be used.
- the in vitro expanded and cultured mononuclear cell fraction may be directly co-cultured with mesenchymal stem cells, and then the mesenchymal stem cells may be sorted using a flow cytometer to separate them.
- the ability of mesenchymal stem cells to differentiate into adipocytes refers to the ability of mesenchymal stem cells to differentiate into adipocytes.
- the ability of mesenchymal stem cells to differentiate into adipocytes is amplified means that the differentiation of mesenchymal stem cells into adipocytes is promoted more when co-cultured with a composition containing the mononuclear cell fraction that has been amplified and cultured in vitro than when not co-cultured.
- adipocyte differentiation-related genes can be indicated, for example, by the expression of adipocyte markers, adipocyte differentiation-related genes, etc.
- adipocyte markers include FABP4, adiponectin, and perilipin.
- adipocyte differentiation-related genes include PPAR ⁇ , C/EBP ⁇ , and AP-1.
- “the differentiation ability of mesenchymal stem cells into adipocytes is amplified” means that the expression of at least one adipocyte marker, adipocyte differentiation-related gene, etc.
- “differentiation into adipocytes” can also be evaluated by identifying adipocytes by staining components characteristic of adipocytes, such as lipids.
- lipids For example, Oil Red O has low polarity and specifically dissolves in oil to stain lipids red, so it can be used to evaluate the degree of adipocyte differentiation (Oil Red O staining).
- WO2019/146131 (Patent Document 3) does not mention at all the differentiation of adipose-derived mesenchymal stem cells (ASCs) into adipocytes.
- ASCs adipose-derived mesenchymal stem cells
- the promotion of angiogenesis and the promotion of adipocyte differentiation are due to completely different mechanisms, and the description in WO2019/146131 does not suggest the ability to promote adipocyte differentiation.
- the co-culture with the composition containing the mononuclear cell fraction amplified and cultured in vitro is preferably carried out in vitro or ex vivo.
- the mesenchymal stem cells with amplified "ability to differentiate into adipocytes" obtained by the co-culture can be used, for example, for transplantation for adipose tissue regeneration.
- mesenchymal stem cells may be cultured in an adipocyte differentiation induction medium that induces differentiation into adipocytes at the same time as or after the co-culture with the mesenchymal cells and the composition containing the mononuclear cell fraction amplified and cultured in vitro, and then used for transplantation.
- the adipocyte differentiation induction medium that induces differentiation of mesenchymal stem cells into adipocytes contains, for example, "DMEM + 10% FBS + insulin".
- Mesenchymal stem cells with amplified differentiation ability into adipocytes are applied in an appropriate manner for treatment, such as transplantation, to subjects such as humans.
- the subjects of treatment are not particularly limited as long as they require adipose tissue regeneration, and include mammals such as humans, non-human primates, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats, and rodents (mouse, rats, etc.).
- the subject is a human.
- Mesenchymal stem cells can be applied (used) to the subject by medical professionals (doctors, veterinarians) in an appropriate dosage and administration depending on the treatment site, the severity of the disease/condition, and the condition of the subject (age, weight, height, medical history, physical condition, etc.).
- a composition containing a mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro is co-cultured with mesenchymal stem cells and then separated from the mesenchymal stem cells, a composition that does not contain a mononuclear cell fraction and contains only mesenchymal cells that can be transplanted is used at the time of transplantation. Therefore, the mononuclear cell fraction is not limited to being of autologous origin. Therefore, it is possible to use cells derived from healthy individuals, rather than cells from the patient, for both the mononuclear cell fraction and the mesenchymal stem cells. Therefore, it is possible to manufacture cell preparations and pharmaceutical compositions and administer them to patients without subjecting the patient to the invasiveness of cell collection.
- composition used in the treatment can be manufactured and prepared before the treatment, it can be administered to the patient quickly at any time. Furthermore, by preparing it in advance and storing it frozen for a long period of time, advantageous effects such as reducing the burden on the patient and allowing treatment to be performed more quickly can be obtained.
- the present invention also relates to a method for amplifying the differentiation potential of mesenchymal stem cells into adipocytes.
- the method of the present invention comprises co-culturing a mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro with mesenchymal stem cells.
- the method is an in vitro or ex vivo method.
- the method further includes separating the in vitro expanded and cultured mononuclear cell fraction from the mesenchymal stem cells.
- composition for amplifying the differentiation potential of mesenchymal stem cells into adipocytes The matters explained in “1. Composition for amplifying the differentiation potential of mesenchymal stem cells into adipocytes” also apply to the "Method for amplifying the differentiation potential of mesenchymal stem cells into adipocytes” in this section, unless otherwise stated.
- the present invention also relates to the use of the mononuclear cell fraction expanded in vitro in co-culture with mesenchymal stem cells to expand the differentiation potential of the mesenchymal stem cells into adipocytes.
- the mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro may be separated from mesenchymal stem cells during differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes after co-culture with the mesenchymal stem cells (including before induction of differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes and during induction of differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes).
- the present invention also relates to a mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro, for co-culturing with mesenchymal stem cells to expand the differentiation ability of the mesenchymal stem cells into adipocytes.
- the mononuclear cell fraction that has been expanded and cultured in vitro may be separated from the mesenchymal stem cells during the differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes after co-culturing with the mesenchymal stem cells (including before the mesenchymal stem cells are induced to differentiate into adipocytes and during the induction of the mesenchymal stem cells to differentiate into adipocytes).
- the present invention also relates to a method for producing mesenchymal stem cells with an amplified ability to differentiate into adipocytes, which comprises co-culturing a mononuclear cell fraction that has been amplified in vitro with mesenchymal stem cells.
- the present invention also relates to a composition
- a composition comprising mesenchymal stem cells with amplified adipocyte differentiation potential, produced by co-culturing a mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro with mesenchymal stem cells.
- the mononuclear cell fraction that has been expanded in vitro may be separated from the mesenchymal stem cells during differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes after co-culturing with the mesenchymal stem cells (including before inducing differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes and during induction of differentiation of the mesenchymal stem cells into adipocytes).
- adipose tissue After washing the adipose tissue with PBS, it was digested with an equal volume of 0.1% collagenase 1 solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and an equal volume of ASC medium (DMEM (high glucose, Invitrogen) + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin) was added to stop the enzyme reaction. After centrifugation, the pellet was filtered with a 100 ⁇ m cell strainer (Corning Corporation). The residue was washed with ASC medium, seeded in a flask, and cultured.
- DMEM high glucose, Invitrogen
- the expression of surface markers on the cells of the 5th passage ASC was measured by flow cytometry (BD LSRFortessa, BD Biosciences), and those that were confirmed to be positive for CD73 and CD90, which are characteristics of ASC, and negative for CD31, CD34, CD45, and HLA-DR were used in the examples.
- the cells were collected in a centrifuge tube and centrifuged three times for 7-10 minutes at 250 x g ( ⁇ 1000 rpm). After centrifugation, the cells were suspended in PBS. In this specification, the obtained cell population may be referred to as "RE-01.”
- inserts manufactured by Corning
- the RE01 cells obtained in (2) above were seeded onto the inserts at a cell number 1/2 (ASC+RE01 2:1) or 1/10 (ASC+RE01 10:1) of the ASC.
- the insert and the culture plate are separated by a membrane with a pore size of 0.4 ⁇ m, and cells cannot pass through the membrane, but the culture solution can pass between the membranes.
- the insert seeded with RE01 cells was set on the culture plate seeded with ASCs and cultured at 37 ° C. and 5% CO 2 in fat differentiation induction medium (DMEM + 10% FBS + insulin +).
- DMEM + 10% FBS + insulin + Three days after the start of culture, RNA was collected and mRNA analysis was performed. In addition, lipid droplets were stained with oil red O staining two weeks after the start of culture.
- RNA analysis mRNA analysis was performed on the expression of FABP4, a marker for adipocytes, and PPAR ⁇ , a gene related to adipocyte differentiation. Specifically, RNA was purified after 3 days of co-culture of ASC and RE01 cells (adipocyte differentiation induction was also performed at the same time), and cDNA was synthesized. The expression levels of the FABP4 and PPAR ⁇ genes in the obtained cDNA were measured and analyzed by real-time PCR.
- FABP4 Hs01086177_m1
- PPAR ⁇ Hs01115513_m1
- 18S-rRNA Hs03928990_g1
- ⁇ Ct target gene
- Ct ⁇ Ct ⁇ Ct of each sample - average ⁇ Ct of the reference sample 0
- the obtained ⁇ Ct is applied to 2-(- ⁇ Ct) and three calculations for numerical comparison are carried out and compared.
- the 18S-rRNA value was used as the endogenous control Ct.
- Example 2 Induction of adipogenesis (RE01 isolated after co-culture)
- the ASCs prepared in (1) of “Materials and Methods” above were seeded at 7 ⁇ 10 4 cells/well into 6-well or 24-well plates and cultured overnight in ASC medium (DMEM (high glucose, Invitrogen) + 10% FBS + 1% penicillin/streptomycin).
- DMEM high glucose, Invitrogen
- FBS penicillin/streptomycin
- inserts manufactured by Corning
- the RE01 cells obtained in (2) above were seeded onto the inserts at a cell number 1/2 (ASC+RE01 2:1) or 1/10 (ASC+RE01 10:1) of the ASC.
- the insert and the culture plate are separated by a membrane with a pore size of 0.4 ⁇ m, and cells cannot pass through the membrane, but the culture solution can pass between the membranes.
- the insert seeded with RE01 cells was set on the culture plate seeded with ASCs and cultured in ASC medium for 3 days at 37° C. under 5% CO 2.
- the insert (RE01 cells) was removed from the co-culture of ASCs and RE01 cells (after 3 days of co-culture), and only the ASCs in the 6-well culture plate were separated.
- the isolated ASCs were then cultured in adipogenesis induction medium (DMEM + 10% FBS + insulin +) at 37 ° C. under 5% CO 2.
- adipogenesis induction medium DMEM + 10% FBS + insulin +
- RNA was collected and mRNA analysis was performed.
- lipid droplets were stained with oil red O staining.
- Oil red O staining was performed in the same manner as in Example 1. The results are shown in Figure 5.
- ASCs co-cultured with RE01 cells even when the ASCs were separated from RE01 and then subjected to adipogenesis induction alone, a tendency was observed for a large number of adipocytes to be stained red by oil red O staining.
- ASCs co-cultured with RE01 cells maintained their promoted adipogenesis ability even when separated from RE01 and used alone as ASCs.
- the examples herein show that ASCs co-cultured with RE01 cells have enhanced adipogenic potential compared to ASCs not co-cultured with RE01 cells.
- the present invention makes it possible to provide a pharmaceutical product containing ASCs not co-cultured with RE01 cells, i.e., a pharmaceutical product having higher adipogenic potential than existing pharmaceutical products containing mesenchymal stem cells.
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明は、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物および方法に関する。本発明の組成物は、生体外増幅培養された単核球画分を含み、間葉系幹細胞と共培養される。本発明の方法は、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法であって、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む。
Description
本発明は、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物、および、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法に関する。
近年、多くの疾患において間葉系幹細胞を用いた治療が研究されている。間葉系幹細胞は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、間葉系細胞に属する細胞への分化能を有する。採取する組織毎に、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞などと呼称される。間葉系幹細胞は、例えば、骨や血管、心筋等の様々な体細胞に分化できる多分化能を有している事が知られており，またサイトカインを分泌して免疫抑制作用、抗炎症作用、血管新生作用などを有する。また、免疫寛容能が高いことから、自家移植だけでなく他家移植も可能である。
これらの特性により、間葉系幹細胞は再生医療において大きな潜在的可能性を有する多能性幹細胞であり，現在までに様々な疾患に対する臨床研究が数多く行われ、幅広い疾患の処置に使用されることが期待されている。
乳がんは、女性が罹患するがんの中で罹患率が１位であり、年々増加傾向にある。乳がんで***切除が必要となる患者は約４０％であり（２０１７年）、***切除による特に精神的苦痛は大きい。脂肪移植は、体積を増大させ、そして輪郭を回復させる目的で、乳がん術後の***再建などの軟部組織再構築の分野で行われる。この技術は、自己充填材として、豊富に利用可能な脂肪組織を用いるため、自然な感触を成し得、かつ低い感染率の安価な処置であるため、脂肪組織は外因性の材料よりも優れたものとなっている。しかしながら、脂肪吸引による採取プロセス中、脂肪細胞は、元来の血液供給から遮断される。その結果、移植片は、注入後、一時的に虚血となり、これが部分的壊死および移植片体積減少を引き起こす（非特許文献１）。脂肪移植およびその長期臨床適用に関心が高まっている（非特許文献２）。しかしながら、この虚血による体積喪失に対する満足のいく解決法は未だ開発されていない。脂肪移植が満足のいく結果を達成するために、しばしば二次的な処置が必要である。高い脂肪再生・血管再生能を有する脂肪移植技術の開発が希求されている。
脂肪移植増進のための細胞療法として、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）が研究されている（非特許文献１３）。脂肪細胞移植の際にＡＳＣを補充する療法（ＡＳＣ補充脂肪移植法）は、有望であるが、一貫した臨床的結果を得るためには、まだ開発を続ける必要がある（非特許文献１４－１５）。ＡＳＣにより、血管新生促進性サイトカインの放出（非特許文献１６）およびｉｎ ｖｉｔｒｏ血管内皮分化（非特許文献１７）が観察されている。
本発明者らは、ＷＯ２０１９／１４６１３１（特許文献３）において、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物が、間葉系幹細胞の効果を増幅させる効果があることを明らかにした。具体的には、間葉系幹細胞の処置に生体外増幅培養された単核球画分を補充すると、血管形成を刺激するとともに、抗炎症作用や抗免疫作用を発現することによって、その効果を安全かつ有効に増幅させることが、脂肪移植、下肢虚血の２つのモデルで見いだされた。これらの間葉系幹細胞の効果の増幅効果は、間葉系幹細胞を、生体外増幅培養された単核球画分とともに、共移植した場合に認められた。ＷＯ２０１９／１４６１３１に記載されているのは、生体外増幅培養された単核球画分を含む、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅させるための組成物、並びに、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞、または間葉系細胞を含む組成物とともに使用する、ことを含む、間葉系幹細胞による処置の効果を増幅させるための方法である。
ＷＯ２０１９／１４６１３１で示されているのは、間葉系幹細胞を、生体外増幅培養された単核球画分とともに、共移植した場合に、間葉系幹細胞の血管形成能が促進される、というものである。当該文献は、脂肪移植への効果も血管形成能の促進に基づくものとして記載している。ＷＯ２０１９／１４６１３１は、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の脂肪細胞への分化については、全く言及していない。
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間葉系幹細胞を利用した脂肪移植の研究が進んでいるが、よりよい効果を得るためにさらなる研究・開発が望まれていた。
本発明は、上記問題を解決するために、鋭意研究に努めた結果、生体外増幅培養された単核球画分が、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させることを見出し、本発明を想到した。本発明は、非限定的に、以下の態様を含む。
［態様１］
間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物であって、生体外増幅培養された単核球画分を含み、間葉系幹細胞と共培養される、前記組成物。
［態様２］
間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に、間葉系幹細胞から分離される、
態様１に記載の組成物。
［態様３］
生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞との共培養が、１日－７日行われる、態様１に記載の組成物。
［態様４］
単核球画分が、骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核球画分である、態様１または２に記載の組成物。
［態様５］
生体増幅培養された単核球画分が、血管内皮前駆細胞または抗炎症性の細胞又は免疫寛容を誘導する細胞が富化した細胞群である、態様１または２に記載の組成物。
［態様６］
間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である、態様１または２に記載の組成物。
［態様７］
間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法であって、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む、前記方法。
［態様８］
生体外増幅培養された単核球画分を、間葉系幹細胞から分離する、ことをさらに含む、態様７に記載の方法。
［態様１］
間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物であって、生体外増幅培養された単核球画分を含み、間葉系幹細胞と共培養される、前記組成物。
［態様２］
間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に、間葉系幹細胞から分離される、
態様１に記載の組成物。
［態様３］
生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞との共培養が、１日－７日行われる、態様１に記載の組成物。
［態様４］
単核球画分が、骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核球画分である、態様１または２に記載の組成物。
［態様５］
生体増幅培養された単核球画分が、血管内皮前駆細胞または抗炎症性の細胞又は免疫寛容を誘導する細胞が富化した細胞群である、態様１または２に記載の組成物。
［態様６］
間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である、態様１または２に記載の組成物。
［態様７］
間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法であって、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む、前記方法。
［態様８］
生体外増幅培養された単核球画分を、間葉系幹細胞から分離する、ことをさらに含む、態様７に記載の方法。
本発明の生体外増幅培養された単核球画分と共培養させた間葉系幹細胞は、共培養を行わない場合と比較して、より高い脂肪細胞への分化能を有する。脂肪細胞への分化能を増幅された間葉系幹細胞は、間葉系幹細胞を利用した脂肪移植の効率を高める。
本発明を実施するための形態は、以下の形態を含む。
本明細書において「一態様において」と言及する場合は、その態様に限定されない、即ち、非限定的であることを意味する。本明細書において、「非限定的に」、「一態様において」は、同義に用いられ得る。
１．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物
本発明は、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物に関する。一態様において、本発明の組成物は、生体外増幅培養された単核球画分を含み、間葉系幹細胞と共培養される組成物である。
本発明は、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物に関する。一態様において、本発明の組成物は、生体外増幅培養された単核球画分を含み、間葉系幹細胞と共培養される組成物である。
「単核球画分」とは、成体から得られた末梢血、骨髄または臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞の総称で、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。単核球はさらにＣＤ３４および／またはＣＤ１３３陽性細胞を含んでいる。動物から骨髄、臍帯血または末梢血を採取し、それを例えば密度勾配遠心法に付して該分画を抽出することにより得られる。
一態様において、単核球画分は、骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核球画分である、
一態様において、生体増幅培養された単核球画分は、血管内皮前駆細胞または抗炎症性の細胞又は免疫寛容を誘導する細胞が富化した細胞群である。この細胞群は血管内皮前駆細胞、抗炎症性マクロファージ、Ｔリンパ球サブセット、および制御性Ｔ細胞を含む。
一態様において、生体増幅培養された単核球画分は、血管内皮前駆細胞または抗炎症性の細胞又は免疫寛容を誘導する細胞が富化した細胞群である。この細胞群は血管内皮前駆細胞、抗炎症性マクロファージ、Ｔリンパ球サブセット、および制御性Ｔ細胞を含む。
「血管内皮前駆細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ ｃｅｌｌ：ＥＰＣ）は、単核球画分のうち、特に、ＣＤ３４陽性および・またはＣＤ１３３陽性細胞である。また、分化型ＥＰＣコロニー形成細胞を含む。血管内皮前駆細胞は、血管に分化できる細胞として知られており，損傷した血管を修復または補充することができると考えられている。
一態様において、「抗炎症性の細胞又は免疫寛容を誘導する細胞」群とは、血管内皮前駆細胞、Ｍ２マクロファージ、Ｔリンパ球サブセット、または制御生Ｔ細胞が富化した細胞群である。これらの細胞は、抗炎症，免疫寛容機能を有する、と考えられている（非特許文献２２）。
「生体外増幅（Ｑｕａｌｉｔｙ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔｙ）（ＱＱ）」とは、生体から採取された幹細胞を、生体外で、幹細胞増殖因子、インターロイキン等の因子を含有する無血清培地又は血清培地中で、一定期間培養し、修飾および増幅させることである。「修飾および増幅させる」とは、幹細胞の数を増やす、および／または機能を増加させる、ことを意味する。
単核球画分を生体外増幅培養するための方法は特に限定されず、公知の任意の方法を使用することが可能である。一態様において、幹細胞の培養は、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される、１または２以上の因子を含有する無血清培地又は血清培地で行う。非限定的に、幹細胞の培養は、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される、１以上、２以上、３以上、４以上、または５以上の因子を含有する無血清培地又は血清培地で行う。
一態様において、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される、１または２以上の因子を含有する無血清培地又は血清培地において幹細胞を培養する。
例えば、特許文献２は、骨髄、臍帯血または末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子を含有する無血清培地中で培養して得られる、細胞群を記載している。特許文献４は、骨髄、臍帯血又は末梢血由来の単核球を、幹細胞因子、インタ一ロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド、トロンボポエチンおよび血管内皮細胞増殖因子からなる群から選択される４以下の因子、並びに、血清、を含む培地中で培養して得られる、細胞群を記載している。生体増幅培養された単核球画分は、好ましくは、血管内皮前駆細胞とともに、抗炎症性の細胞又は免疫寛容を誘導する細胞が富化されている、という特徴を有する。一態様において、抗炎症性のＭ２マクロファージ、Ｔリンパ球サブセットや制御性Ｔ細胞も含んでいる。
例えば、特許文献４、非特許文献１２、２０、２１には血管内皮前駆細胞を生体外増幅培養するための具体的な方法が開示されている。例えば、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、Ｆｌｔ－３リガンド、ＴＰＯ、ＩＬ－６および１％抗生物質を補充した培地を用いることができる。本願明細書の実施例では、ＩＭＤＭ培地（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＧｌｕｔａＭＡＸ， Ｇｉｂｃｏ）に５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３リガンド、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、０．５％ ＦＢＳ（ウシ胎児結成）、０．５％ ＨＳＡ、１％抗生物質を添加した培地で１週間培養した。
あるいは、単核球画分を生体外増幅培養するための方法は、国際公開ＷＯ２００６／０９０８８２に記載の方法を用いてもよい。当該方法は、幹細胞増殖因子、インターロイキン６、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３およびトロンボポエチンからなる群より選ばれる１または２以上の因子を含有する無血清培地で血液血管内皮前駆細胞をインキュベートすることを含む。
前記生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物は、間葉系幹細胞と共培養される。一態様において、共培養はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて行われる。
「間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）」は、中胚葉性組織（間葉）に由来する体性幹細胞であり、間葉系細胞に属する細胞への分化能を有する。採取する組織毎に、脂肪由来間葉系幹細胞（ａｄｉｐｏｓｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ：ＡＳＣ）、骨髄由来間葉系幹細胞などと呼称される。間葉系幹細胞は間質細胞に含まれる。例えば、骨髄間質細胞が分化誘導されることにより、間葉系に属する細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）になる。
一態様において、間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である。一態様において、間葉系幹細胞は、脂肪由来間葉系幹細胞である。
一態様において、間葉系幹細胞を含む組成物は、間質血管細胞分画（ＳＶＦ）（「間質血管細胞群」ともいう）である。間質血管細胞分画は、脂肪組織のコラゲナーゼ処理により得られる細胞群である。間質血管細胞分画は、一般に不均一な細胞群で、血液由来細胞の他に、脂肪組織由来の細胞群が含まれる、脂肪組織由来の細胞の中には、脂肪間質細胞が含まれ、これは、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）を含む。
「間葉系幹細胞」は、生体から得られたものであっても、人工的に調製したものであってもよい。有効量の間葉系幹細胞を含む組成物を共培養に利用することもできる。
生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞との共培養の日数は特に限定されない。一態様において、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞との共培養は、半日（１２時間）－７日の範囲で行われる。一態様において、共培養は、半日－６日、半日－５日、半日－４日、半日－３日、１日－７日、１日－６日、１日－５日、１日－４日、１日－３日の範囲で行われる。
一態様において、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞との共培養が、１日－７日行われる。
生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞との共培養の細胞の割合は特に限定されない。一態様において、間葉系幹細胞を、０．０１倍以上、０，０３倍以上、０．０５倍以上、０．０７倍以上、０．０８倍以上、０．０９倍以上、０．１倍以上の数の生体外増幅培養された単核球と共培養する。一態様において、間葉系幹細胞を、１０倍以下、８倍以下、５倍以下、４倍以下、３倍以下、２倍以下の数の生体外増幅培養された単核球と共培養する。採血量を考慮すると、使用する生体外増幅培養された単核球の細胞数は、少なく抑えられれば好ましい。一態様において、共培養時の間葉系幹細胞と生体外増幅培養された単核細胞の数の比は、１：０．０１～１：１０の範囲である。好ましくは、１：０．０５～１：４、１：０．１～１：２の範囲である。
共培養のための培養培地は特に限定されない。一態様において、間葉系幹細胞の培養に適した培地が使用される。間葉系幹細胞の培養に適した培地は、間葉系幹細胞の種類に応じて、適宜調製可能である。一態様において、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の培養培地として、例えば、ＡＳＣ培地（例えば、ＤＭＥＭ（高グルコース）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）を用いることができる。あるいは、間葉系幹細胞からの体細胞の分化を誘導するのに適した分化誘導培地を用いることもできる。例えば、脂肪由来間葉系幹細胞から脂肪細胞を分化誘導する脂肪分化誘導培地（例えば、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋インスリン＋）を用いてもよい。
あるいは、生体外増幅培養された単核球の培養に適した培地を用いても良い。生体外増幅培養された単核球の培養培地としては、例えば、ＩＭＤＭ ＋１０％ ＦＢＳを使用可能である。
生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物は、間葉系幹細胞との共培養後、そのまま、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化のために使用されてもよい。
あるいは、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物は、間葉系幹細胞との共培養後、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に（間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行う前、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行っている間を含む）、間葉系幹細胞から分離されてもよい。間葉系幹細胞等の共培養に使用された体外増幅培養された単核球画分を含む組成物の、間葉系幹細胞からの分離は、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行う前に行っても、あるいは、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を開始してから、分化誘導の途中で行っても良い。
体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞との共培養後、間葉系幹細胞から分離する場合、分離後の間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化に使用される組成物には間葉系幹細胞のみが含まれる。すなわち、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物により、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能が増幅され、その効果は、生体外増幅培養された単核球画分が除かれた後も持続しうる。
生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞と共培養後、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に、間葉系幹細胞から分離する方法は、特に限定されない。例えば、共培養時に、間葉系幹細胞と体外増幅培養された単核球画分とを、細胞は通り抜けられないが、培養液は通り抜けることができるような膜で仕切ったインサートを利用してもよい。体外増幅培養された単核球画分のみをインサート内で培養し、共培養後、インサートを除くことにより、生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞から分離することができる。そのような膜として、例えば、孔サイズ０．４μｍ、孔密度２．０×１０６穴／ｃｍ２のポリエチレンテレフタレート製が利用できる。
あるいは、インサートを利用せずに、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞を直接共培養後、フローサイトメーターを使用し間葉系幹細胞のみソーティングすることにより、分離を行ってもよい。
前記生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物との共培養により、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能が増幅される。
「間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能」とは、間葉系幹細胞から脂肪細胞へ分化する能力である。「間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能が増幅される」とは、前記生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物との共培養を行わなかった場合より、行った場合の方が、間葉系幹細胞から脂肪細胞への分化が促進される、ことを意味する。
「脂肪細胞への分化」は、例えば、脂肪細胞のマーカー、脂肪分化関連遺伝子等の発現を指標とすることができる。脂肪細胞のマーカーの例としては、ＦＡＢＰ４、アディポネクチン（Ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ）、ペリリピン（Ｐｅｒｉｌｉｐｉｎ）が含まれる。脂肪分化関連遺伝子の例としては、ＰＰＡＲγ、Ｃ/ＥＢＰα、ＡＰ－１が含まれる。一態様において、「間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能が増幅される」とは、前記生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物との共培養を行わなかった場合より、行った場合の方が、脂肪細胞のマーカー、脂肪分化関連遺伝子等の少なくとも１つの発現が増加する、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％、または５０％以上増加する、ことを意味する。
あるいは、「脂肪細胞への分化」は、例えば、脂肪細胞に特徴的な成分、例えば、脂質を染色することによって脂肪細胞を同定することによって、評価することもできる。例えば、オイルレッドＯは、極性が低いため油的に特異的に溶解することで脂質を赤く染色するため、脂肪細胞の分化の程度を評価に用いることができる（オイルレッドＯ染色）。
なお、ＷＯ２０１９／１４６１３１（特許文献３）は、脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の脂肪細胞への分化については、全く言及していない。血管形成能の促進と、脂肪分化の促進は全く異なる機序によるものであり、ＷＯ２０１９／１４６１３１の記載から、脂肪分化促進能を想定することはできない。
前記生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物との共培養は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏにおいて行うことが望ましい。共培養により得られた「脂肪細胞への分化能」が増幅した間葉系幹細胞を、例えば、脂肪組織再生のための移植に用いることができる。一態様において、間葉系細胞と生体外増幅培養された単核球画分を含む組成物との共培養と同時に、あるいは、共培養後に、間葉系幹細胞を、脂肪細胞を分化誘導する脂肪分化誘導培地で培養したものを移植に用いても良い。間葉系幹細胞から脂肪細胞を分化誘導する脂肪分化誘導培地は、例えば、「ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋インスリン」を含む。
脂肪細胞への分化能が増幅した間葉系幹細胞は、ヒト等の対象への移植などの処置に適切な態様で適用される。処置の対象は、脂肪組織再生が必要とされる対象であれば特に限定されず、ヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、げっ歯類（マウス、ラット等）などの哺乳動物を含む。好ましくは、対象はヒトである。間葉系幹細胞は、処置部位、疾患・状態の重篤度、対象の状態（年齢、体重、身長、既往症、体調等）によって、医療従事者（医師、獣医師）が適切な用法、用量で対象に適用（使用）されうる。
体外増幅培養された単核球画分を含む組成物を、間葉系幹細胞との共培養後、間葉系幹細胞から分離する場合、移植の際には、単核球画分は含まず、他家移植が可能な間葉系細胞のみを含む組成物が使用される。そのため、単核球画分が自家由来に限定されない。このため、単核球画分も、間葉系幹細胞も、患者の細胞ではなく健常人由来の細胞を用いることが可能である。このため、患者に細胞採取の侵襲を与えることなく細胞製剤、医薬組成物を製造し、患者に投与することが可能である。また、処置に使用する組成物の調製を治療前に製造し準備することが可能であるため、患者には迅速にいつでも投与可能となる。さらに、事前に調整しておき長期間凍結保存しておくことで、患者の負担を軽減してより迅速に処置を行うことができるなどの有利な効果が得られる。
２．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法
本発明はまた、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法に関する。一態様において、本発明の方法は、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む。一態様において、前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法である。
本発明はまた、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法に関する。一態様において、本発明の方法は、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む。一態様において、前記方法はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの方法である。
非限定的に、前記方法は、生体外増幅培養された単核球画分を、間葉系幹細胞から分離する、ことをさらに含む。
「生体外増幅培養された単核球画分」、「間葉系幹細胞」、「共培養」、「脂肪細胞への分化能を増幅させる」、「生体外増幅培養された単核球画分から分離」などの意義については、「１．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物」と同様である。「１．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物」で説明した事項は、特に矛盾がない限り、本項の「間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法」にも同様に適用される。
３．使用など
本発明はまた、生体外増幅培養された単核球画分の、間葉系幹細胞と共培養し、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための使用に関する。
本発明はまた、生体外増幅培養された単核球画分の、間葉系幹細胞と共培養し、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための使用に関する。
一態様において、生体外増幅培養された単核球画分は、間葉系幹細胞との共培養後、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に（間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行う前、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行っている間を含む）、間葉系幹細胞から分離されてもよい。
本発明はまた、間葉系幹細胞と共培養し、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための、生体外増幅培養された単核球画分、に関する。一態様において、生体外増幅培養された単核球画分は、間葉系幹細胞との共培養後、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に（間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行う前、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行っている間を含む）、間葉系幹細胞から分離されてもよい。
本発明はまた、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む、脂肪細胞への分化能を増幅した間葉系幹細胞の製造方法、に関する。
本発明はまた、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことによって製造された、脂肪細胞の分化能を増幅した間葉系幹細胞を含む、組成物に関する。一態様において、前記組成物において、生体外増幅培養された単核球画分は、間葉系幹細胞間葉系幹細胞との共培養後、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に（間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行う前、間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化誘導を行っている間を含む）、間葉系幹細胞から分離されてもよい。
「生体外増幅培養された単核球画分」、「間葉系幹細胞」、「共培養」、「脂肪細胞への分化能を増幅させる」、「生体外増幅培養された単核球画分から分離」などの意義については、「１．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物」、「２．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法」と同様である。「１．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物」、「２．間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法」で説明した事項は、特に矛盾がない限り、本項の「使用」等にも同様に適用される。
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
材料および方法
（１）脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の調製
ヒト脂肪組織は、順天堂大学倫理員会で承認済みの臨床研究にて手術時に破棄される腹部脂肪組織を使用した。
（１）脂肪由来間葉系幹細胞（ＡＳＣ）の調製
ヒト脂肪組織は、順天堂大学倫理員会で承認済みの臨床研究にて手術時に破棄される腹部脂肪組織を使用した。
脂肪組織をＰＢＳで洗浄後、等量の０．１％コラゲナーゼ１溶液（和光純薬）で消化し、ＡＳＣ培地（ＤＭＥＭ（高グルコース、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）を等量追加し、酵素反応を停止した。遠心分離後、ペレットを１００μｍのセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ社性）でろ過した。残渣をＡＳＣ培地で洗浄後、フラスコに播種し培養した。第５継代のＡＳＣをフローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にて、細胞上の表面マーカーの発現を測定し、ＡＳＣの特徴であるＣＤ７３、ＣＤ９０の陽性、並びに、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＨＬＡ－ＤＲの陰性を確認したものを、実施例に用いた。
（２）ＲＥ０１細胞の調製
（ｉ）単核球の単離
健常人のボランティアから、ＢＤ バキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ＢＤ社製）単核球分離用採血管を用いて８ｍＬの末梢血を採取した。採血後、そのまま採血管を遠心した後、輸送、到着後培養開始までは冷蔵で保管した。単核球および血漿を含むＣＰＴ（商標）採血管内のゲルバリアより上を遠心管へ回収し、少量のＥＤＴＡ－ＰＢＳでゲルバリア上など採血管内を洗いこみ、同じ遠心管へ回収した。細胞を回収した遠心管をＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップしたのち、遠心分離（３００ｘｇ、室温、１０分間）し、沈査として細胞を回収した。回収された細胞は、混入する赤血球を除くためＡＣＫ溶血緩衝液（１５ｍＬ／管）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社製）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＣＫ溶血緩衝液の組成は、ＮＨ４Ｃｌ ８，２９０ｍｇ／ｌ；ＫＨＣＯ３ １，０００ｍｇ／ｌ；ＥＤＴＡ．Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ ３７ｍｇ／ｌである。その後、ＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップし、遠心分離（２００ｘｇ、室温、１０分間）又は（１００ｘｇ、室温、１５分間）で細胞を回収する操作を２回繰り返した。
（ｉ）単核球の単離
健常人のボランティアから、ＢＤ バキュテイナ（登録商標）ＣＰＴ（商標）ＢＤ社製）単核球分離用採血管を用いて８ｍＬの末梢血を採取した。採血後、そのまま採血管を遠心した後、輸送、到着後培養開始までは冷蔵で保管した。単核球および血漿を含むＣＰＴ（商標）採血管内のゲルバリアより上を遠心管へ回収し、少量のＥＤＴＡ－ＰＢＳでゲルバリア上など採血管内を洗いこみ、同じ遠心管へ回収した。細胞を回収した遠心管をＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップしたのち、遠心分離（３００ｘｇ、室温、１０分間）し、沈査として細胞を回収した。回収された細胞は、混入する赤血球を除くためＡＣＫ溶血緩衝液（１５ｍＬ／管）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ社製）中、室温で５分間インキュベートした。ＡＣＫ溶血緩衝液の組成は、ＮＨ４Ｃｌ ８，２９０ｍｇ／ｌ；ＫＨＣＯ３ １，０００ｍｇ／ｌ；ＥＤＴＡ．Ｎａ２・２Ｈ２Ｏ ３７ｍｇ／ｌである。その後、ＥＤＴＡ－ＰＢＳでメスアップし、遠心分離（２００ｘｇ、室温、１０分間）又は（１００ｘｇ、室温、１５分間）で細胞を回収する操作を２回繰り返した。
（ｉｉ）血清培地での培養
回収した単核細胞を、ＩＭＤＭ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＧｌｕｔａＭＡＸ， Ｇｉｂｃｏ）に５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３リガンド、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、０．５％ ＦＢＳ、０．５％ ＨＳＡ（赤十字アルブミン２５％、日本血液製剤機構）、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、を添加した培地に懸濁した。その一部を使用してトリパンブルーを用いた細胞数計数を行った。得られた細胞増殖培地中で、細胞濃度を１ｘ１０６／ｍＬに調製し、Ｔ２５フラスコに播種した。通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で５日間培養した。
回収した単核細胞を、ＩＭＤＭ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ＧｌｕｔａＭＡＸ， Ｇｉｂｃｏ）に５０ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ＦＬＴ－３リガンド、２０ｎｇ／ｍＬ ＴＰＯ、０．５％ ＦＢＳ、０．５％ ＨＳＡ（赤十字アルブミン２５％、日本血液製剤機構）、１００単位／ｍＬ ペニシリン、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン、を添加した培地に懸濁した。その一部を使用してトリパンブルーを用いた細胞数計数を行った。得られた細胞増殖培地中で、細胞濃度を１ｘ１０６／ｍＬに調製し、Ｔ２５フラスコに播種した。通常の培養条件（３７℃、５％ＣＯ２）で５日間培養した。
５日間の培養終了後、遠心管に回収し、２５０ｘｇ（～１０００ｒｐｍ）で７－１０分間、遠心洗浄を３回実施した。遠心後、細胞はＰＢＳに懸濁した。本明細書中、得られた細胞群を「ＲＥ－０１」と呼称する場合がある。
実施例１ 脂肪分化誘導（共培養後ＲＥ０１を非分離）
（１）共培養
６ウェルプレートまたは２４ウェルプレートに、上記「材料および方法」の（１）で調製されたＡＳＣを７ｘ１０４細胞／ウェル播種し、ＡＳＣ培地（ＤＭＥＭ（高グルコース， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）で１晩培養した。
（１）共培養
６ウェルプレートまたは２４ウェルプレートに、上記「材料および方法」の（１）で調製されたＡＳＣを７ｘ１０４細胞／ウェル播種し、ＡＳＣ培地（ＤＭＥＭ（高グルコース， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）で１晩培養した。
次いで、インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）をセットし、インサートに上記（２）で頂戴したＲＥ０１細胞をＡＳＣの１／２（ＡＳＣ＋ＲＥ０１ ２：１）または１／１０（ＡＳＣ＋ＲＥ０１ １０：１）の細胞数となるように播種した。
インサートと培養プレートは、孔サイズ０．４μｍの膜で仕切られており、細胞は膜を通りぬけることができないが、培養液は膜間を通り抜けることができる。ＲＥ０１細胞が播種されたインサートが、ＡＳＣが播種された培養プレートにセットされた状態で、脂肪分化誘導培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ｉｎｓｕｌｉｎ＋）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養開始から３日後にＲＮＡを回収してｍＲＮＡ解析を行った。また、培養開始から２週間後にｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で脂肪滴を染色した。
（２）ｍＲＮＡ解析
ｍＲＮＡ解析は、脂肪細胞のマーカーであるＦＡＢＰ４、脂肪分化関連遺伝子であるＰＰＡＲγのｍＲＮＡの発現解析を行った。具体的には、ＡＳＣとＲＥ０１細胞の共培養（脂肪分化誘導も同時に行われた）３日後のＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡについて、ＦＡＢＰ４、ＰＰＡＲγの各遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定し解析した。
ｍＲＮＡ解析は、脂肪細胞のマーカーであるＦＡＢＰ４、脂肪分化関連遺伝子であるＰＰＡＲγのｍＲＮＡの発現解析を行った。具体的には、ＡＳＣとＲＥ０１細胞の共培養（脂肪分化誘導も同時に行われた）３日後のＲＮＡを精製し、ｃＤＮＡを合成した。得られたｃＤＮＡについて、ＦＡＢＰ４、ＰＰＡＲγの各遺伝子の発現量をリアルタイムＰＣＲで測定し解析した。
実施例１の共培養後、ＡＳＣのみを分離してＰＢＳで洗浄後、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。１～２μｇのＲＮＡをＨｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｃＤＮＡ合成した。次いで、ＴａｑＭａｎ ｆａｓｔ ａｄｖａｎｃｅｄ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ （Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて試薬調整し、ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定解析した。
解析に使用したＴａｑＭａｎ ｐｒｏｂｅは全てＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社で購入した。
ＦＡＢＰ４ （Ｈｓ０１０８６１７７＿ｍ１）；
ＰＰＡＲγ（Ｈｓ０１１１５５１３＿ｍ１）
１８Ｓ－ｒＲＮＡ （Ｈｓ０３９２８９９０＿ｇ１）。
ＰＰＡＲγ（Ｈｓ０１１１５５１３＿ｍ１）
１８Ｓ－ｒＲＮＡ （Ｈｓ０３９２８９９０＿ｇ１）。
ΔΔＣｔ法（比較Ｃｔ法）を用いて、ｍＲＮＡ発現を解析した。ΔΔＣｔ法では、
△Ｃｔ＝標的遺伝子Ｃｔ－内在性対照Ｃｔ
△△Ｃｔ＝各試料△Ｃｔ－基準試料の平均△Ｃｔ０
得られた△△Ｃｔを２－（－△△Ｃｔ）に当てはめて数の比較
の３つの計算を行って比較する。
△Ｃｔ＝標的遺伝子Ｃｔ－内在性対照Ｃｔ
△△Ｃｔ＝各試料△Ｃｔ－基準試料の平均△Ｃｔ０
得られた△△Ｃｔを２－（－△△Ｃｔ）に当てはめて数の比較
の３つの計算を行って比較する。
内在性対照Ｃｔとして、１８Ｓ－ｒＲＮＡの値を用いた。
ｍＲＮＡ解析の結果を図２に示す。ＲＥ０１細胞と共培養したＡＳＣでは、ＦＡＢＰ４やＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量が増加傾向にあった。
（３）Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色
ＡＳＣとＲＥ０１細胞の共培養（脂肪分化誘導も同時に行われた）２週間後、ＡＳＣのみを分離してＰＢＳで３回洗浄後、４％ＰＦＡで１時間固定した。蒸留水で３回洗浄後、６０％イソプロパノールで脱水し、オイルレッドＯ染色液（武藤化学）で２０分間染色した。その後、蒸留水で３回洗浄し、マイヤーヘマトキシリン（富士フィルム和光純薬）で５分間核を染色した。蒸留水で洗浄後、顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０，キーエンス）で撮影した。
ＡＳＣとＲＥ０１細胞の共培養（脂肪分化誘導も同時に行われた）２週間後、ＡＳＣのみを分離してＰＢＳで３回洗浄後、４％ＰＦＡで１時間固定した。蒸留水で３回洗浄後、６０％イソプロパノールで脱水し、オイルレッドＯ染色液（武藤化学）で２０分間染色した。その後、蒸留水で３回洗浄し、マイヤーヘマトキシリン（富士フィルム和光純薬）で５分間核を染色した。蒸留水で洗浄後、顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７１０，キーエンス）で撮影した。
結果を図３に示す。ＲＥ０１細胞と共培養したＡＳＣでは、ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色により赤く染色された脂肪細胞が多い傾向を認めたことから、ＲＥ０１細胞と共培養することでＡＳＣの脂肪分化能が促進する傾向が認められた。
実施例２ 脂肪分化誘導（共培養後ＲＥ０１を分離）
６ウェルプレートまたは２４ウェルプレートに、上記「材料および方法」の（１）で調製されたＡＳＣを７ｘ１０４細胞／ウェル播種し、ＡＳＣ培地（ＤＭＥＭ（高グルコース， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）で１晩培養した。
６ウェルプレートまたは２４ウェルプレートに、上記「材料および方法」の（１）で調製されたＡＳＣを７ｘ１０４細胞／ウェル播種し、ＡＳＣ培地（ＤＭＥＭ（高グルコース， Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）＋１０％ ＦＢＳ＋１％ ペニシリン／ストレプトマイシン）で１晩培養した。
次いで、インサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）をセットし、インサートに上記（２）で頂戴したＲＥ０１細胞をＡＳＣの１／２（ＡＳＣ＋ＲＥ０１ ２：１）または１／１０（ＡＳＣ＋ＲＥ０１ １０：１）の細胞数となるように播種した。
インサートと培養プレートは、孔サイズ０．４μｍの膜で仕切られており、細胞は膜を通りぬけることができないが、培養液は膜間を通り抜けることができる。ＲＥ０１細胞が播種されたインサートが、ＡＳＣが播種された培養プレートにセットされた状態で、ＡＳＣ培地にて３日間３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。ＡＳＣとＲＥ０１細胞の共培養物（共培養３日後）から、インサート（ＲＥ０１細胞）を除き、６ウェル培養プレート中のＡＳＣのみを分離した。
その後、分離されたＡＳＣを脂肪分化誘導培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋ｉｎｓｕｌｉｎ＋）にて３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。脂肪分化誘導開始から３日後にＲＮＡを回収してｍＲＮＡ解析を行った。また、脂肪分化誘導開始から２週間後にｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色で脂肪滴を染色した。
ｍＲＮＡ解析は実施例１と同様に行った。結果を図４に示す。ＲＥ０１細胞と共培養したＡＳＣでは、ＲＥ０１と分離した後に、ＡＳＣ単独で脂肪分化誘導を行った場合でも、ＦＡＢＰ４やＰＰＡＲγのｍＲＮＡ発現量が増加傾向にあった。
Ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色は実施例１と同様に行った。結果を図５に示す。ＲＥ０１細胞と共培養したＡＳＣでは、ＲＥ０１と分離した後に、ＡＳＣ単独で脂肪分化誘導を行った場合でも、ｏｉｌ ｒｅｄ Ｏ染色により赤く染色された脂肪細胞が多い傾向を認められた。ＲＥ０１細胞と共培養したＡＳＣは、ＲＥ０１と分離され、ＡＳＣ単独の状態でも、の脂肪分化能が促進された状態が維持されている。
本明細書の実施例は、ＲＥ０１細胞と共培養したＡＳＣは、ＲＥ０１細胞と共培養しないＡＳＣと比較して、脂肪分化能が促進していることを示す。本発明により、ＲＥ０１細胞と共培養しないＡＳＣを含む医薬品、即ち、間葉系幹細胞を含む既存の医薬品よりも、より高い脂肪分化能を有する医薬品の提供が可能となる。
Claims (10)
- 間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物であって、生体外増幅培養された単核球画分を含み、間葉系幹細胞と共培養される、前記組成物。
- 間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化の際に、間葉系幹細胞から分離される、
請求項１に記載の組成物。 - 生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞との共培養が、１日－７日行われる、請求項１に記載の組成物。
- 単核球画分が、骨髄、末梢血または臍帯血由来の単核球画分である、請求項１または２に記載の組成物。
- 生体増幅培養された単核球画分が、血管内皮前駆細胞または抗炎症性の細胞又は免疫寛容を誘導する細胞が富化した細胞群である、請求項１または２に記載の組成物。
- 間葉系幹細胞が、脂肪由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、末梢血由来間葉系幹細胞、または臍帯血由来間葉系幹細胞である、請求項１または２に記載の組成物。
- 間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための方法であって、生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む、前記方法。
- 生体外増幅培養された単核球画分を、間葉系幹細胞から分離する、ことをさらに含む、請求項７に記載の方法。
- 生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことを含む、脂肪細胞への分化能を増幅した間葉系幹細胞の製造方法。
- 生体外増幅培養された単核球画分と間葉系幹細胞とを共培養する、ことによって製造された、脂肪細胞の分化能を増幅した間葉系幹細胞を含む、組成物。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2022197877 | 2022-12-12 | ||
| JP2022-197877 | 2022-12-12 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2024128224A1 true WO2024128224A1 (ja) | 2024-06-20 |
Family
ID=91485820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2023/044432 WO2024128224A1 (ja) | 2022-12-12 | 2023-12-12 | 間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化能を増幅させるための組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| WO (1) | WO2024128224A1 (ja) |
-
2023
- 2023-12-12 WO PCT/JP2023/044432 patent/WO2024128224A1/ja unknown
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