JP7323919B2 - 虚血性心疾患治療用細胞シート - Google Patents
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Description
[1] 血管内皮前駆細胞を準備する工程;
筋芽細胞を準備する工程;
血管内皮前駆細胞 とシート形成上有効量の筋芽細胞とを、血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との細胞数比(血管内皮前駆細胞数:筋芽細胞数)が1:0.5~20 となるように播種して共培養し、細胞シートを形成する工程
を含む、細胞シートの製造方法。
[2] 共培養された血管内皮前駆細胞の少なくとも一部を取り除く工程をさらに含む、1に記載の製造方法。
[3] シート形成上有効量が、1.0×103~1.0×105個/cm2 である、2に記載の製造方法。
[4] 血管内皮前駆細胞が、末梢血単核球由来である、1~3のいずれか一に記載の製造方法。
[5] 末梢血単核球が、細胞シートが移植される対象から得たものである、4に記載の製造方法。
[6] 血管内皮前駆細胞を準備する工程が、末梢血単核球を無血清培地を用いて培養する工程である、4または5に記載の製造方法。
[7] 筋芽細胞が、細胞シートが移植される対象から得たものである、1~6のいずれか1項に記載の製造方法。
[8] 血管内皮前駆細胞および筋芽細胞を含む、細胞シート。
[9] 虚血性心疾患の処置のための、8に記載の細胞シート。
[10] 血管内皮前駆細胞および筋芽細胞の少なくとも一方が、細胞シートが移植される対象から得たものである、8または9に記載の細胞シート。
[11] 再生医療等製品である、8~10のいずれか一に記載の細胞シート。
[12] 8~11のいずれか一に記載の細胞シートを調製するための、キット。
[13] 筋芽細胞シートと組み合わせて使用するための、血管内皮前駆細胞の使用。
血管内皮前駆細胞が共培養されていることにより、細胞シートを移植した組織において血管新生が促進されうる。また炎症が抑制されうる。
本発明の細胞シートには、ある程度分化した細胞が使用されるため、腫瘍化の懸念が少ないと考えられる。
細胞シートが用いられる対象から採取した細胞を利用する態様においては、移植した細胞が免疫的に拒絶されることを抑制できる。
血管内皮前駆細胞を準備する工程;
筋芽細胞を準備する工程;
血管内皮前駆細胞 とシート形成上有効量の筋芽細胞とを、血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との細胞数比(血管内皮前駆細胞数:筋芽細胞数)が1:0.5~20 となるように播種して共培養し、細胞シートを形成する工程。
(血管内皮前駆細胞)
本発明には、血管内皮前駆細胞(Endothelial progenitor cells;EPCs)が用いられる。本発明で用いられる血管内皮前駆細胞は、血管内皮細胞に成り得る未分化な細胞であれば特に限定されない。血管内皮前駆細胞は分化程度によって、直径20~50μmの細胞を主に含む分化型EPCコロニー(CFU-Large cell like EC、大型EPCコロニーともいう)と、直径20μm以下の細胞を主に含む未分化型EPCコロニー(CFU-small cell like EC、小型EPCコロニーともいう)の、大きさの異なる2種類のコロニーにより区別できる。早い段階で出現する未分化型(小型)EPCコロニーは、増殖能にすぐれた早期分化段階のEPCコロニーであり、また遅い段階で出現する分化型(大型)EPCコロニーは、血管発生にすぐれた晩期分化段階のEPCコロニーであるといえる(例えば、Masuda H. et al., Circulation Research, 109: 20-37 (2011)を参照)。本発明には、いずれも好適に用いることができる。
QQ細胞は、単核球から得られる。単核球とは、末梢血、骨髄または臍帯血等に含まれる円形核を持つ細胞の総称で、リンパ球、単球、マクロファージ、血管内皮前駆細胞、造血幹細胞等が含まれる。単核球は通常、CD34および/またはCD133陽性細胞を含んでいる。動物から骨髄、臍帯血または末梢血を採取し、それを例えば密度勾配遠心法に付して該分画を抽出することにより単核球が得られる。密度勾配遠心法としては、単核球分画が得られる限り特に限定されないが、好ましくはHistopaque-1077(Sigma-Aldrich)が用いられる。
本発明において、血管内皮前駆細胞として、単核球をCD34/CD133による選別を行うことなく無血清培地で培養して得られた細胞群が用いられる場合、培養に用いられる無血清培地の好ましい例は、幹細胞因子(SCF)、インターロイキン6(IL-6)、FMS様チロシンキナーゼ3リガンド(Flt-3 ligand、またはFL略されることがある。)、トロンボポエチン(TPO)および血管内皮細胞増殖因子(VEGF)の5種の因子を含有する無血清培地である。
無血清培地中での単核球の培養条件は特に限定されず、動物細胞を培養するための通常の条件で実施することができる。例えば、5%CO2環境下、37℃で7日間以上(例えば10日間以上)培養される。無血清培地中での単核球の密度は、EPC等の富化を可能とする限り特に限定されないが、好ましくは0.5~10×105細胞/mLであり、より好ましくは1~5×105細胞/mLであり、さらに好ましくは3~4×105細胞/mLである。
本発明において、単核球を上述した因子を含有する無血清培地で培養した結果得られる細胞群には、分化型EPCコロニー形成細胞数が多く含まれうる。細胞群にはまた、抗炎症性マクロファージが含まれていてもよい。抗炎症性マクロファージとは、CD206陽性、抗炎症性で血管形成や修復に寄与するマクロファージである。好ましくはM2マクロファージであり、より好ましくはCD206陽性のM2マクロファージである。
本発明には、筋芽細胞が用いられる。筋芽細胞は、ある程度分化した細胞であるので、腫瘍化のリスクがより少ないということができる。筋芽細胞の由来は特に限定されるものではないが、生体内に豊富に存在し、比較的容易な操作で採取できるとの観点からは、骨格筋組織の骨格筋芽細胞であることが好ましい。採取する部位は、特に限定されず、例えば大腿部の内側広筋とすることができる。
本発明の細胞シートは、血管内皮前駆細胞と筋芽細胞とを共培養することにより製造される。共培養は、培養開始時に、血管内皮前駆細胞と筋芽細胞とを同一の培養器材表面上に播種することにより開始される。
共培養のための血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との播種の方法は、少なくとも血管内皮前駆細胞と筋芽細胞とが同一器材表面上に共存しつつ、筋芽細胞シートが形成される限り、特に限定されないが、好ましい態様においては、まずシート形成上有効量の筋芽細胞が培養器材表面上に播種され、次いで筋芽細胞に対して所定の比の細胞数の血管内皮前駆細胞が播種される。
共培養開始時の血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との比は、シート化できる限り特に限定されないが、例えば、播種される血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との細胞数比(血管内皮前駆細胞数:筋芽細胞数)は、1:0.5~20とすることができる。好ましくは、血管内皮前駆細胞数:筋芽細胞数は、1:0.2~5であり、より好ましくは1:0.3~3であり、さらに好ましくは1:0.5~2である。このような範囲での共培養は、血管新生関連因子の発現が高くなることが期待でき、かつ抗炎症効果および細胞生存に有利であると考えられる。また、血管内皮前駆細胞の割合が低すぎると共培養されている筋芽細胞の機能を増強させるだけの十分な効果が期待できず、逆に血管内皮前駆細胞の割割合が高すぎる場合、筋芽細胞により細胞シートが形成されず、好ましくない。なお、本発明に関し、細胞の比率をいうときは、特に記載した場合を除き、細胞数に基づく値である。
共培養が行われる培養器材は、特に限定されないが、形成される細胞シートの器材からの剥離が容易に行えるとの観点からは、0~80℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養器材が用いられることが好ましい。すなわち、細胞は0~80℃の温度範囲で水和力が変化するポリマーを表面に被覆した細胞培養器材上で、ポリマーの水和力の弱い温度域で培養される。その温度は、通常動物細胞の培養に適した温度である37℃付近であることが好ましい。温度応答性高分子はホモポリマー、コポリマーのいずれであってもよい。このような高分子としては、例えば、特開平2-211865号公報に記載されているポリマーが挙げられる。具体的には、例えば、(メタ)アクリルアミド化合物、N-(若しくはN,N-ジ)アルキル置換(メタ)アクリルアミド誘導体、またはビニルエーテル誘導体等のモノマーの重合体が挙げられ、コポリマーの場合は、これらの中で任意の2種以上が重合された物でありえる。更には、上記モノマー以外のモノマー類との共重合、ポリマー同士のグラフトまたは共重合、あるいはポリマー、コポリマーの混合物を用いたものであってもよい。また、ポリマー本来の性質を損なわない範囲で架橋されていてもよい。その際、その上で培養されるものが動物細胞であることから、剥離が5℃~50℃の範囲で行えることが好ましく、そのため温度応答性ポリマーの好ましい例としては、ポリ-N-n-プロピルアクリルアミド(単独重合体の下限臨界溶解温度21℃)、ポリ-N-n-プロピルメタクリルアミド(同27℃)、ポリ-N-イソプロピルアクリルアミド(同32℃)、ポリ-N-イソプロピルメタクリルアミド(同43℃)、ポリ-N-シクロプロピルアクリルアミド(同45℃)、ポリ-N-エトキシエチルアクリルアミド(同約35℃)、ポリ-N-エトキシエチルメタクリルアミド(同約45℃)、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルアクリルアミド(同約28℃)、ポリ-N-テトラヒドロフルフリルメタクリルアミド(同約35℃)、ポリ-N,N-エチルメチルアクリルアミド(同56℃)、ポリ-N,N-ジエチルアクリルアミド(同32℃)が挙げられる。温度応答性の細胞培養器材は市販されており、例えばUpCell(登録商標)(CellSeed, cat# CS3003, CS3004, CS3005, CS3006, CS3007)等が共培養のために使用できる。
好ましい態様において、血管内皮前駆細胞と筋芽細胞が一定期間共培養された後、共培養された血管内皮前駆細胞の少なくとも一部が除去される。少なくとも一部の血管内皮前駆細胞の除去は、培地の交換とともに行うことができる。すなわち、培養器から培養上清を除去する際に、浮遊している血管内皮前駆細胞は容易に上清とともに除去できる。血管内皮前駆細胞の少なくとも一部の除去は、培養期間中のどの時点で行ってもよい。例えば、共培養後、2~5日目に培地交換とともに行い、新鮮培地を追加した後、さらに残りの期間、血管内前駆細胞の少なくとも一部が除去された状態で、培養を続けることができる。
共培養に用いられる培地は、筋芽細胞の培養のために用いられる従来のものが使用できる。例えば、DMEM、MEM、F12、DME、RPMI1640、MCDB(MCDB102、104、107、131、153、199など)、L15、SkBM、RITC80-7等の基礎培地に、必要に応じ、成分を添加する等して改変を加えたものが使用できる。
共培養は、筋芽細胞をシート形成を目的に培養する場合と同様の条件で行うことができる。典型的な培養条件としては、37℃、5%CO2での培養が挙げられる。培養期間は、シート状の構造物が形成されるまで行うことができる。この期間は、血管内皮前駆細胞の少なくとも一部を除した後の培養期間を含み、例えば1.0×103~1.0×105個/cm2で筋芽細胞を播種した場合の培養期間は、2日~2週間であり、より特定すると3日~10日であり、例えば1週間前後である。培養期間は、筋芽細胞の播種量がより多い場合はより短い期間でありうる。
血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との共培養を経て形成された細胞シートは、培養器材表面から剥離させ、回収することができる。細胞シートを回収する方法は特に限定されないが、温度応答性の培養器材を用いた場合は、適切な温度に変化させることにより回収することができ、他の例として、希薄なタンパク質分解酵素を用いる方法、特殊なタンパク質分解酵素を用いる方法、キレート剤(例えばEDTA)を用いる方法、スクレーパー等を使いて物理的に剥離する方法等が挙げられる。得られた細胞シートは、必要に応じて積層化し、三次元構造体とすることができる。
本発明は、上述の製造方法で得られる、血管内皮前駆細胞および筋芽細胞を含む、細胞シートを提供する。
本発明の細胞シートは、虚血性心疾患の処置のために用いることができる。虚血性心疾患は、心筋において、血量の減少によって組織内の血流がさがり細胞の変性、萎縮、線維化などの組織障害が生じることによって起こる疾患である。虚血はその原因により、閉塞性虚血、圧迫性虚血、痙攣性虚血、代償性虚血に大別される。なお処置とは、病気の治療、病気の進行の抑制、病気の予防、および病気の発症リスクの低減を含む。
移植された細胞の流失が抑制される;
移植された細胞の免疫的拒絶が抑制される;
患部の血管新生が促進される;
幹部の血流が改善される;
患部の炎症が抑制される;
移植された細胞の残存率、生着率が上昇する;
移植された細胞の心筋への分化度が高くなる;
移植された細胞が腫瘍化する懸念が少なくなる;
移植された細胞の電気的・組織的な孤立化(不整脈)が起こりにくくなる。
(QQ細胞)
末梢血から、常法により単核球を遠心分離により採取し、単核球を2×106 個/6-well Primaria plate (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ) wellに播種した。培地は、5つのサイトカインであるrecombinant human vascular endothelial growth factor (rhVEGF) (50 ng/ml), rh interleukin-6 (rhIL-6) (20 ng/ml), rh Fms-related tyrosine kinase-3 ligand (rhFlt-3L) (100 ng/ml), rh thrombopoietin (rhTPO) (20 ng/ml), rh stem cell factor (rhSCF) (100 ng/ml) (all from PeproTech, Rocky Hill, NJ) と抗生剤 antibiotics cocktail (Invtrogen) をStemline II medium (Sigma, St. Lois, MO) に添加したものを用いた。7日間、37 °C、5% CO2で培養し、QQ細胞(QQCs)を得た。
筋芽細胞(MBCs)は市販のヒト由来のセルラインを用いた(Lonza cat# CC2580, Lot# 0000418971)。15%FBS加MCDB培地にて細胞を培養、2回ほど継代し十分な量に増やした。
(共培養)
プロトコールを図1に示した。
QQCsは健康ボランティアのものを用いた。50mL採血し、QQCsを培養した。培養したMBCsを0.25%のトリプシンEDTAを用いて剥離し、1x105/wellとなるように通常の6well dish(9.6 cm2/well)に播種した。翌日にQQCsを、MBCsとの細胞数がそれぞれQQCs:MBCs = 1:1、1:3、1:10となるようにwellに播種した。48時間の共培養ののち培地の上清を吸引し、QQCsを取り除いた(図1中の(1))。MBCsの培地を入れさらに3日間、通常酸素下培養および低酸素下で培養を行った。3日後に0.25%のトリプシンEDTAを用いて細胞を回収し(図1中の(2))、PCR用の試料を作成するためRNAlater (Invitrogen, cat# AM7021) に入れた。1週間後に上清を2mlに置換し、24時間後に回収し、培地中の炎症関係サイトカインの濃度をELISAで計測した。
培養後の細胞の写真を、図2~5に示した。共培養群では通常の細胞の上などに小型の細胞が多く見られる。回収後にも残存しているQQCsと考えられる。その他の形態上の違いなどは見られない。
(細胞シートの作成)
In vivoの検討用に細胞シートを作成した。それぞれMBCs単独シートおよびQQCs共培養のシートを作成した。MBCs単独シートは、MBCsを1x104個/cm2の密度で12wellの温度応答性の培養ディッシュUpcell(登録商標)(CellSeed, cat# CS3003) に播種した。共培養シートは、これまでのin vitroの検討から最も有効であった1:1のプロトコール、すなわちMBCs播種24時間後にQQCsも同量加え、同様に、37 °C、5% CO2、48時間の共培養を行った。共培養の後、QQCsを取り除き、さらに3日間培養を行った。
8週齢の雄性のヌードマウスを用いた。マウスに挿管し人工呼吸器で呼吸管理後、右側臥位左開胸にて心臓を露出した。左冠動脈を7-0のモノフィラメント糸で結紮、心筋梗塞を作成した。作成後、左心室の虚血部位を覆うようにそれぞれの細胞シートを留置、心膜を閉じることによりシートを固定し、胸腔を閉じて手術を終了した。
プロトコールを図8に示した。手術直後、1週間後、2週間後および4週間後に小動物用の超音波装置を用いて心機能を測定した。1および4週間後の超音波の後、マウス心臓を摘出、半数をPCR解析用に、残りの半数を組織化学用の凍結用切片とした。PCR解析用では心臓をヘパリン加PBSで還流した後にこれを摘出、RNAlaterに浸透させた。組織化学用として4%のPFAで固定の後に10,15,20%のスクロースで脱水、OCTコンパウンドに包埋し-80℃に保存し凍結切片とした。
心機能の測定結果を、図9に示した。左室駆出率(LVEF)は心筋梗塞作成直後は、コントロール(CTL)群=28.0±1.7%、MBCs単独投与(MBCs only)群=28.7±1.3%、MBCs+QQCs混合投与(MBCs+QQCs)群=28.0±2.3%であり3群間に有意差はなかった。CTL群とMBCs群は術後1週間では直後と差はなかったが、CTL群はその後LVEFは低下傾向でありリモデリングの進行が示唆された。一方でMBCs単独群のLVEFはその後も低下はせず、4週間目で33.0±3.6%と軽度の改善傾向が見られた。MBCs+QQCs群は1週目で31.6±2.2と増加傾向が見られ、その後もMBCs単独群よりも常に高く4週間後では39.6±1.6%と直後に比べて約10%の改善効果が見られた。また4週間目における左室拡張末期径(LVDd)と左室収縮末期径(LVDs)は有意差はなかったもののMBCs+QQCs群で低値であり、リモデリングの軽減作用が示唆された。
Claims (12)
- 血管内皮前駆細胞を準備する工程;
筋芽細胞を準備する工程;
血管内皮前駆細胞とシート形成上有効量の筋芽細胞とを、血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との細胞数比(血管内皮前駆細胞数:筋芽細胞数)が1:0.5~20となるように播種して共培養し、細胞シートを形成する工程
を含む、細胞シートの製造方法。 - 共培養された血管内皮前駆細胞の少なくとも一部を取り除く工程をさらに含む、請求項1に記載の製造方法。
- シート形成上有効量が、1.0×103~1.0×105個/cm2である、請求項2に記載の製造方法。
- 血管内皮前駆細胞が、末梢血単核球由来である、請求項1~3のいずれか1項に記載の製造方法。
- 末梢血単核球が、細胞シートが移植される対象から得たものである、請求項4に記載の製造方法。
- 血管内皮前駆細胞を準備する工程が、末梢血単核球を無血清培地を用いて培養する工程である、請求項4または5に記載の製造方法。
- 筋芽細胞が、細胞シートが移植される対象から得たものである、請求項1~6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 下記の工程を含む製造方法により得られる、血管内皮前駆細胞および筋芽細胞を含む、細胞シート:
血管内皮前駆細胞を準備する工程;
筋芽細胞を準備する工程;
血管内皮前駆細胞とシート形成上有効量の筋芽細胞とを、血管内皮前駆細胞と筋芽細胞との細胞数比(血管内皮前駆細胞数:筋芽細胞数)が1:0.5~20となるように播種して共培養し、細胞シートを形成する工程。 - 虚血性心疾患の処置のための、請求項8に記載の細胞シート。
- 血管内皮前駆細胞および筋芽細胞の少なくとも一方が、細胞シートが移植される対象から得たものである、請求項8または9に記載の細胞シート。
- 再生医療等製品である、請求項8~10のいずれか1項に記載の細胞シート。
- 請求項8~11のいずれか1項に記載の細胞シートの製造における、血管内皮前駆細胞の使用。
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Non-Patent Citations (1)
Title |
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Yasuhiro Shudo et al.,Spatially Oriented, Temporally Sequential Smooth Muscle Cell-Endothelial Progenitor Cell Bi-Level Cell Sheet Neovascularizes Ischemic Myocardium.,Circulation,2013年09月10日,Vol.128, No.11, Suppl.1,S59-S68,doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.112.000293 |
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