인간 제대로부터 줄기세포를 분리하는 방법
본 발명은 제대 유래 줄기세포의 분리방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 본 발명의 제대 유래 줄기세포의 분리방법을 통해 일정 크기의 제대로부터 현저히 많은 수의 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다.
줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 줄기세포는 그 분화능에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotency) 줄기세포로 나눌 수 있다. 만능줄기세포(pluripotent stem cells)는 모든 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 전분화능(pluripotency)의 세포로서 배아줄기세포(embryonic stem cells, ES cells) 및 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells, iPS cells) 등이 이에 해당된다. 다분화능 및/또는 단분화능 줄기세포로는 성체줄기세포를 예로 들 수 있으며, 조혈모세포(hematopoietic stem cell), 간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 신경줄기세포(neural stem cell) 등이 이에 해당한다.
줄기세포의 이용기술은 난치병 치료의 새로운 대책안으로 생각되어지고 있으며(대한민국 공개특허 2015-0016117호) 이전까지는 난치병 치료를 위해 장기이식이나 유전자 치료 등이 제시되었지만, 면역거부반응이나 공급 장기 부족, 또는 벡터개발이나 질환유전자에 대한 지식부족으로 인한 효율적인 실용화가 미진한 상태이다.
이에 따라 줄기세포연구에 대한 관심이 지속적으로 고조되고 있으며, 줄기세포를 이용한 장기재생이나 파킨슨병, 당뇨병, 척수손상 등의 치료에 다양하게 줄기세포의 가능성을 제시해 오고 있다.
줄기세포원(stem cell source)의 확보를 위한 여러 가지 방법이 존재한다. 윤리적인 문제가 없는 성체줄기세포를 확보하는 방법에도 최근 iPS가 새로운 가능성을 제시하고 있으나 아직 연구의 매우 초기 단계라 현실적인 대안이 되기에는 많은 과학적 검증을 받아야 하는 문제가 있다.
상기와 같은 문제점에 따라, 골수, 지방 등 성체줄기세포원을 활용하는 기술이 대두되고 있으나, 상기 세포의 증식은 어느 수준이상은 불가하다. 특히 성인의 골수 및 지방 유래 간엽 줄기세포는 계대 배양이 계속되면 줄기세포의 노화가 급격히 진행되며, 연령이 높은 골수 줄기세포의 경우 계대 배양 자체가 어려워지는 문제점이 있다. 다시 말해, 연령이 높거나, 만성질환이 있을수록, 줄기세포의 품질도 저하된다고 볼 수 있다.
구체적으로 줄기세포의 채취연령이 증가하면 채취된 줄기세포의 콜로니 형성능과 증식속도 및 분화능이 감소하게 되고, 골관절염 등의 만성질환이 있는 환자는 채취한 줄기세포의 증식력과 분화능이 정상군에 비해 감소된 것을 확인한 바 있다.
따라서 줄기세포의 채취에서 환자 자신도 불편함을 호소하고, 품질이 나빠 사용하지 못하는 경우가 대부분이며, 동종의 간엽줄기세포를 이식하거나 치료하기 위해서는 품질은 물론 신속한 사용을 담보하고 이식에 필요한 감염성 표지자 검사 등의 이식적합성을 판정하기 위해 충분한 양의 줄기세포 공급이 절실한 실정이다. 즉, 종래 줄기세포 배양, 분리기술은 매우 제한적이기 때문에 기존에 사용해오던 기술로는 충분한 양의 줄기세포를 제공하는데 한계가 있다.
성체줄기세포의 공급원으로써, 신생아 출산과 같이 배출되는 생물학적 폐기물은 가장 어린 세포로 구성되어 있다. 제대혈, 제대, 태반, 양막 등이 이에 해당하는 조직이며, 이 중 제대혈은 이미 조혈모세포 공급원으로써 치료로 인정되고 있다. 하지만, 제대혈 유래 간엽 줄기세포는 분리 성공률이 매우 낮은 것이 큰 문제로, 제대혈 보관후 간엽 줄기세포의 분리가 되지 않을 경우 많은 문제점을 야기할 수 있으며, Hows 등과 Wexler 등은 제대혈에서는 간엽 줄기세포를 분리할 수 없다고도 보고하는 등 분리 성공률이 그다지 높지 않은 문제가 있다(Hows, 1992; Wexler, 2003; Pojda, 2005; Bieback, 2004).
이에 따라, 제대조직이 새로운 세포치료원으로 부각되고 있으며, 제대는 태아 조직이므로 배아 이외 줄기세포를 채취할 수 있는 가장 어린 조직으로, 연령 및 여러 가지의 질환에 따른 줄기 세포 '품질'의 저하를 근본적으로 피할 수 있어, 배아 줄기세포와 성체 줄기세포의 단점을 모두 비껴갈 수 있다는 근본적인 장점을 가진다. 특히, 제대 유래 줄기세포는 골수 유래 줄기 세포보다 CFU-F의 숫자가 크고, 증식 속도가 빠르고, 계대 배양 능력도 크다고 보고되고 있다 (Karahuseyinoglu, 2007; Lund, 2007; Baksh,2007; Lu, 2006).
이에 따라, 제대로부터 최대한의 세포활성을 유지하면서 많은 수의 줄기세포를 분리하는 기술이 대두되고 있는 실정이다.
상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 이미 알려진 종래기술에 해당함을 인정하는 것으로 받아들여져서는 안 될 것이다.
본 발명자들은 줄기세포를 제대조직으로부터 대량생산할 수 있는 방법을 발굴하고자 예의 노력을 하였다. 그 결과, 많은 수의 우수한 증식능을 갖는 줄기세포 분리할 수 있는 전략을 고안하였고, 이를 이용하여 제대조직을 외식적 방법으로 제조한 후, 이를 배양하여 줄기세포를 대량생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 제대 유래 줄기세포의 분리방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 분리방법으로 분리된 제대 유래 줄기세포를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, (a) 분리된 제대조직을 가로와 세로의 길이가 2 내지 4 mm로 분쇄된 절편으로 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 절편을 배양배지 상에서 배양하는 단계를 포함하는 제대 유래 줄기세포의 분리방법을 제공한다.
상기 제대조직 1 g당 0.5 내지 3.0 ㎖의 배양배지를 첨가할 수 있다.
상기 배양배지는 DMEM(Dulbeccos Minimum Essential Medium), RPMI, Hams F-10, Hams F-12, a-MEM(a-Minimal Essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 절편은 단위면적당(㎠) 0.0007 내지 0.0068 g이 포함되도록 배양하는 것일 수 있다.
상기 (b) 단계는 60 내지 120 분 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 분리방법으로부터 제조된 제대 유래 줄기세포를 제공한다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
상기 분화된 세포는 중배엽, 내배엽 및 외배엽 유래 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 분화된 세포는 신경세포, 희돌기교세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 건 또는 인대 세포 및 근육 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 세포치료제는 단백질 또는 펩타이드 제제, 글리코사미노글리칸 (glycosaminoglycan), 프로테오글리칸(proteoglycan), 성장인자(growth factor) 및 유전자 치료제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.
상기 세포치료제는 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 세포치료제는 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 주사제 형태로 제공되거나, 지지체 또는 운반체에 포함되어 제공되는 것일 수 있다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 제공한다.
상기 약학조성물은 골, 연골, 근육, 건 또는 인대 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.
상기 약학조성물은 골 대사성 질환의 예방 또는 치료용일 수 있다.
상기 골 대사성 질환은 골다공증, 파제트병, 치주질환, 골전이암 또는 류마티스 관절염일 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 제대로부터 줄기세포를 효율적으로 분리할 수 있는 방법을 제공한다.
(ii) 또한, 본 발명의 분리방법을 이용할 경우 종래에 알려진 방법과 비교하여 동일 크기의 제대로부터 현저히 많은 수의 줄기세포를 분리할 수 있다.
(iii) 본 발명의 분리방법은 효소적 처리없이 제대조직으로부터 줄기세포를 분리할 수 있기 때문에, 세포에 주어지는 스트레스를 현저히 억제할 수 있다는 점에서 매우 큰 장점이 있다. 또한 본 발명의 분리방법으로 분리된 줄기세포는 종래 분리방법으로 분리된 줄기세포에 비해 우수한 세포 증식능을 갖는다.
즉, 본 발명의 제대 유래 줄기세포의 분리방법은 외식적 방법을 통해 일정 크기의 제대로부터 많은 수의 줄기세포를 간단하면서도 효율적으로 분리할 수 있는 기술로, 이 기능을 이용하여 줄기세포를 대량으로 필요로 하는 분야 혹은 치료용도로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1A는 실시예 1 내지 5로부터 제조된 시간에 따른 조직 절편의 수를 측정하여 나타낸 도면이다.
도 1B는 실시예 1 내지 5로부터 제조된 절편 크기에 따른 세포수를 나타낸 그래프이다.
도 1C는 실시예 1 내지 5로부터 제조된 절편 크기에 따라 배양된 콜로니의 크기를 나타낸 그래프이다.
도 2A는 0 ml/g, 0.5 ml/g, 1 ml/g의 배지가 들어있는 배양용기에서, 제대조직을 외식한 결과, 총 잘린 조직을 나타낸 그래프이다.
도 2B는 0 ml/g, 0.3 ml/g, 0.5 ml/g, 1 ml/g, 2 ml/g, 3 ml/g, 4 ml/g, 5 ml/g의 배지가 들어있는 각각의 배양용기에서, 제대조직을 외식한 결과, 총 분리세포수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3A는 절편의 중량에 따른 제대 유래 줄기세포의 CFU-fs의 수를 나타낸 것으로, 크리스탈 바이올렛 염색결과를 나타낸 것이고, 하단의 그래프는 형성된 CFU-fs의 수와 크기를 그래프로 나타낸 것이다.
도 3B는 절편의 중량에 따른 제대 유래 줄기세포의 분리세포수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4A는 실시예 8로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 분리세포수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 4B는 실시예 8로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 CFU-fs의 수를 나타낸 것으로, 크리스탈 바이올렛 염색결과를 나타낸 것이고, 하단의 그래프는 형성된 CFU-fs의 수와 크기를 그래프로 나타낸 것이다.
도 5A는 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 모폴로지를 관찰하기 위한 광학현미경 사진이다.
도 5B는 효소적 방법으로 제조된 제대 유래 줄기세포(비교예 1)와 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 배양기간에 따른 CPDL를 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5C는 효소적 방법으로 제조된 제대 유래 줄기세포(비교예 1)와 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 군집배가시간(PDT)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 실시예 9로부터 분리한 제대 유래 줄기세포의 유세포분석기를 통하여 분석한 면역표면학적 특성을 나타낸 그래프이다.
도 7은 실시예 9로부터 분리한 제대 유래 줄기세포의 Adipogenesis(A), osteogenesis(B), Chondrogenesis(C), Tenogenesis(D)로의 분화능력을 나타낸 도면이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 제대 유래 줄기세포의 분리방법을 제공한다.
종래 배아줄기세포(embryonic stem cells)는 윤리적인 문제가 존재하며, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cells)가 새로운 가능성을 제시하고 있으나 아직 연구의 매우 초기 단계라 현실적인 대안이 되기에는 많은 과학적 검증을 받아야 하는 문제가 있다. 또한, 성체 줄기세포로 각광을 받고 있는 골수 또는 지방 줄기세포는 연령에 따라서 줄기세포의 빈도, 증식능, 분화능이 떨어지며, 줄기세포를 분리할 조직을 얻기 위하여 침습적인 시술이 필요한 문제가 있다.
이러한 한계점과 문제점을 해결하기 위하여 제대로부터 효소나 부가적인 과정없이, 일정한 크기의 절편으로부터 체외증식능력이 우수하고, 분화능력이 현저한 줄기세포를 높은 수율로 얻을 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명에서 용어, "제대(umbilical cord)"란 태반과 태아를 연결하는 탯줄을 의미한다.
본 발명에서 용어, "제대 유래 줄기세포"는 제대 및 이와 연관된 조직으로부터 분리된 줄기세포를 지칭하는 것으로, 바람직하게는 제대혈(umbilical cord blood), 제대 정맥 내피(umbilical cord vein subendothelium), 제대 혈관주위 메트릭스(umbilical cord perivascular matrix), 제대 와튼 젤리(umbilical cord Wharton's Jelly), 제대 양막 하부위(umbilical cord subamnion) 및 양막(amnion) 또는 양수(amniotic fluid)와 태반(placenta) 및 융모막(chorion)을 포함하며, 보다 바람직하게는 제대혈, 제대 정맥 내피, 제대 혈관주위 메트릭스, 제대 와튼 젤리 또는 제대 양막 하부위에서 분리된 것이다.
특히, 제대는 다른 장기 또는 조직과는 달리, 분만과정에서 버려지는 물질로, 분만 과정에서 특별한 조작이나 시술없이 손쉽게 얻을 수 있으며, 그 양에 비해 많은 줄기세포를 포함하고 있다고 알려져 있으나, 체외에서 제대로부터 줄기세포를 배양하기 위해서는 다양한 조건들을 모두 만족시켜야만 하고, 배양하더라도 회수 가능한 줄기세포는 매우 소량이여서 치료제 개발에 한계가 있었다.
본 발명의 제대 유래 줄기세포의 분리방법은 하기의 단계를 포함한다:
(a) 분리된 제대조직을 가로와 세로의 길이가 2 내지 4 mm로 분쇄된 절편을 제조하는 단계; 및
(b) 상기 a) 단계에서 얻어진 절편을 배양배지 상에서 배양하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 분리방법은 배양된 제대 유래 줄기세포를 회수하는 단계를 추가적으로 포함한다(단계 c).
제대는 대표적인 줄기세포 유래 조직으로, 분만 과정에서 특별한 조작이나 시술 및 부작용 없이 채취할 수 있으므로 줄기세포를 분리 및 배양하기 위한 조직 수급상의 문제점이 없으며, 이질적 세포로부터 오염될 가능성이 낮아 난치성 질환의 세포치료제 제조하기 위해 분리, 배양하는데 이점이 있다.
다만, 앞서 설명한 바와 같이 제대 유래 줄기세포는 체외에서 배양하기가 매우 까다롭고 어려우며, 설사 가능하다하더라도 수율이 현저히 낮아, 회수되는 줄기세포의 수가 매우 낮거나, 분화능력이 매우 저하되어 있다는 문제점을 가지고 있었다.
따라서 본 발명은 줄기세포를 대량으로 회수할 수 있으면서도, 분화능이 매우 우수한 줄기세포를 분리하기 위한 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명은 우선 (a) 분리된 제대조직을 가로와 세로의 길이가 각각 2 내지 4 mm로 분쇄된 절편으로 제조하는 단계를 포함한다. 본 발명의 분리된 제대조직의 분쇄된 절편은 가로와 세로의 길이가 2 내지 4 mm 크기의 절편이 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 보다 바람직하게는 70% 이상 포함된다. 가장 바람직하게 상기 분쇄된 절편은 가로, 세로 및 높이가 각각 2 내지 4 mm인 절편이 50% 내지 70% 포함될 것일 수 있는데, 조직의 절편은 육면체이므로 가로, 세로 및 높이가 각각 2 내지 4 mm가 되도록 조직을 절편으로 잘게 절단할 경우 보다 절편의 크기가 균일하게 되어 후술하는 실험예에서와 같이 분리되는 세포의 수가 크게 증가하는 효과를 갖는다. 본 발명의 제대 유래 줄기세포 분리방법의 일례로, 상기 (a) 단계는 제대조직을 배양배지 내에 함입시킨 후, 가로와 세로의 길이가 각각 2 내지 4 ㎜가 되도록 조직을 절편으로 잘게 절단하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 균일한 크기의 절편의 제조가 용이하고, 최소한의 가위질로 소량의 조직을 균일한 크기의 절편으로 제조할 수 있어, 오염될 가능성이 낮아 분리 배양이 용이하다는 이점이 있다.
이때, 상기 제대조직 1 g당 0 내지 10 ㎖, 바람직하게는 0 내지 5.0 ㎖, 보다 바람직하게는 0.5 내지 3.0 ㎖의 배양배지가 첨가되는 것이 바람직한데, 만약 상기 제대조직 1 g당 배양배지가 10.0 ㎖를 초과할 경우 분리세포수가 더 감소하는 문제점이 발생할 수 있다.
이어서, (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 절편을 배양배지 상에서 배양한다. 이때 상기 절편은 배양용기의 단위면적당(㎠) 0.0001 내지 0.05 g, 바람직하게는 0,0006 내지 0.03 g, 보다 바람직하게는 0.0006 내지 0.0135 g, 가장 바람직하게는 0.0007 내지 0.0068 g이 포함되도록 배양되는 것이 바람직하다. 만약 상기 절편이 배양용기의 단위면적당(㎠) 0.0001 g 미만으로 포함되거나, 0.05 g을 초과하도록 포함될 경우, 분리세포수가 현저히 감소하는 문제가 발생할 수 있다.
또한 상기 (b) 단계는 1 내지 600분, 바람직하게는 10 내지 180분, 보다 바람직하게는 30 내지 120분, 가장 바람직하게는 60 내지 120분 동안 수행되는 것이 바람직한데, 이 역시 1분 미만으로 배양되거나, 600분을 초과하여 배양될 경우 분리세포수가 현저히 감소될 수 있다.
본 발명은 상술한 각각의 배양조건을 모두 만족하여 배양할 경우 절편 1 g당 1 × 106 내지 5 × 106 개의 세포가 분리될 수 있고, 바람직하게는 1.5 × 106 내지 2 × 106 개가 분리될 수 있음을 확인하였고, 이는 종래 다양한 방법에 비해 가장 우수한 효과임을 하기 표 1을 통해 확인할 수 있다.
분리 방법 |
절편 1 g당 분리 세포수 (개) |
본 발명의 배양조건을 모두 만족한 경우 |
1,820,000 ± 44,000 |
Hua, 20141)
|
67,000 ± |
Montanucci, 20112)
|
300,000 ± |
Kim, 20133)
|
130,000 ± 20,000 |
Yan, 20134)
|
150,000 ± |
Chatzistamatiou, 20145)
|
302,000 ± 66,000 |
Yoon, 20136)
|
489,000 ± 320,000 |
Jo, 20087)
|
399,000 ± 522,000 |
1) Hua J, Gong J, Meng H, et al. Comparison of different methods for the isolation of mesenchymal stem cells from umbilical cord matrix: Proliferation and multilineage differentiation as compared to mesenchymal stem cells from umbilical cord blood and bone marrow. Cell Biology International. 2014;38(2):198-210.
2) Montanucci P, Basta G, Pescara T, Pennoni I, Di Giovanni F, Calafiore R. New simple and rapid method for purification of mesenchymal stem cells from the human umbilical cord Wharton jelly. Tissue Eng Part A. 2011;17(21-22):2651-2661.
3) Kim SM, Moon SH, Lee Y, Kim GJ, Chung HM, Choi YS. Alternative xeno-free biomaterials derived from human umbilical cord for the self-renewal ex-vivo expansion of mesenchymal stem cells. Stem Cells Dev. 2013;22(22):3025-3038.
4) Yan M, Sun M, Zhou Y, et al. Conversion of human umbilical cord mesenchymal stem cells in Wharton's jelly to dopamine neurons mediated by the Lmx1a and neurturin in vitro: potential therapeutic application for Parkinson's disease in a rhesus monkey model. PLoS One. 2013;8(5):e64000.
5) Chatzistamatiou TK, Papassavas AC, Michalopoulos E, et al. Optimizing isolation culture and freezing methods to preserve Wharton's jelly's mesenchymal stem cell (MSC) properties: an MSC banking protocol validation for the Hellenic Cord Blood Bank. Transfusion. 2014;54(12):3108-3120.
6) Yoon JH, Roh EY, Shin S, et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013;2013:428726.
7) Jo CH, Kim OS, Park EY, et al. Fetal mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord sustain primitive characteristics during extensive expansion. Cell Tissue Res. 2008;334(3):423-433.
상기 배양배지는 생체 외에서 제대 유래 줄기세포의 활성을 유지하거나 증식을 유도할 수 있는 배지를 의미할 수 있고, 포유동물 세포 배양에 사용되는 통상의 배지를 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 일례로 상업적으로 제조된 배양배지인 DMEM(Dulbeccos Minimum Essential Medium), RPMI, Hams F-10, Hams F-12, a-MEM(a-Minimal Essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium) 등을 사용할 수 있다.
또한 본 발명의 배양배지 내에는 제대 유래 줄기세포의 증식을 촉진시킬 수 있는 혈청(즉, 인간을 포함하는 동물의 혈청) 및/또는 성장인자를 추가로 포함할 수 있으며, 이들 성장인자는 basic fibroblastic growth factor(bFGF), vascular endothelial growth factor(VEGF), 인슐린(Insulin), epidermal growth gactor(EGF), leukemia inhibitory factor(LIF), insulin-like growth factor(IGF), platelet-derived growth factor(PDGF), platelet-rich plasma(PRP) 및 platelet lysate(PL), stem cell factor(SCF) 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 성장배양액은 페니실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신 등의 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 배양배지는 DMEM:HamsF12 (1:1) 배양액, 우태아혈청, EGF, bFGF, IGF, 젠타마이신으로 구성될 수 있으며, 보다 구체적으로 70 내지 95 (vol/vol) % DMEM:Hams F12 (1:1) 배양액, 5 내지 15 (vol/vol)% 우태아혈청, 5 내지 50 ng/ml EGF, 0.5 내지 10 ng/ml bFGF, 5 내지 50 ng/ml IGF, 5 내지 50 mg/ml 젠타마이신으로 구성될 수 있다.
최종적으로 배양된 줄기세포를 회수한다. 상기 과정을 통해 제조된 제대 유래 줄기세포는 증폭시킬 수 있는데, 상기 증폭방법은 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 단층배양법에 의할 수 있다. 상기 과정을 통해 회수한 제대 유래 줄기세포를 배양용기에 파종 후, 배양용기 표면적의 60 내지 90% 차지하면, 이들 세포를 트립신-EDTA로 처리하여 배양용기에서부터 떼어내고, 다시 새로운 배양용기에 파종하는 계대배양을 통해 치료용량에 필요한 세포 수만큼 증폭배양할 수 있다.
본 발명의 제대 유래 줄기세포의 배양방법은 소량의 제대로부터 이를 무한 반복하여 배양할 수 있으므로 반복적 제대조직의 채취없이 난치성 질환의 치료에 필요한 양의 줄기세포를 분리할 수 있다.
상기 제대 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포로, 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm) 및 이들 유래의 조직 및 조직 세포로 분화할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 중배엽 기원 세포는 조골세포, 연골세포, 지방세포 및 골격근세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 제대 유래 줄기세포는 지방 분화(Adipogenic), 골분화(Osteogenic), 연골 분화(Chondrogenic) 및 건/인대 분화(Teno/ligamentognic) 능력을 갖는 것을 확인하였다.
상기 제대 유래 줄기세포는 하나의 세포가 두 개의 세포로 분열하는 배가시간이 30 내지 50 시간으로 체외 성장 능력이 뛰어날 수 있다. 종래의 배양방법에 의해 수득한 중간엽 줄기세포는 하나의 세포가 두 개의 세포로 분열하는 시간이 60 시간 이상 요구되었던 점에 비해 체외 성장 능력이 뛰어나 단시간 내에 난치성 질환 치료에 필요한 유효한 용량의 줄기세포를 확보할 수 있다는 장점이 있다.
상기 제대 유래 줄기세포는 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 신경세포, 희돌기교세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 건 및 인대 세포, 근육 세포 등으로 분화할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 제대 유래 줄기세포가 자발적으로 분화 가능한 세포는 그 종류에 있어서 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 조골세포, 연골세포, 지방세포, 건 및 인대 세포, 근육 세포 등으로 분화할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분리방법을 통해 제조된 제대 유래 줄기세포를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 분리방법을 통해 제조된 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공한다.
상기 세포치료제는 제대 유래 줄기세포를 특별한 분화과정을 거치지 않고 바로 이용할 수 있으며, 또는 세포치료를 하고자 목적하는 세포로 분화하여 이용할 수 있다.
상기 세포치료제에서의 분화된 세포는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 신경세포, 희돌기교세포, 성상세포, 슈반세포, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 건 및 인대 세포, 근육 세포 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포치료제는 단백질 또는 펩타이드 제제, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 프로테오글리칸(proteoglycan), 성장인자(growth factor) 및 유전자 치료제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포치료제는 상기 줄기세포가 내배엽, 중배엽 및 외배엽 등으로 분화되어 나타내는 효과 외에도, 줄기세포가 분비하는 miRNA 등을 함유하는 엑소좀(exosome)이나 마이크로베지클(microvesicle)을 포함하는 MSC-유래 세포외 소포(MSC-derived extracellular vesicle) 및 기질에 의한 주변분비 효과(paracrine effect)를 추가적으로 보유할 수 있으며, 상기 줄기세포의 주변분비 효과에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다(한국공개특허 제2017-0103697호(간섬유증의 치료), 미국 공개특허 제 2015-0190429호(항염 및 면역억제 작용), 유럽공개특허 제3145493호(폐질환의 치료), 중국공개특허 제101854941호(급성 신부전의 치료) 등).
상기 세포치료제의 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 세포치료제로 이용하는 방법은 특별히 한정하는 것은 아니나, 종래의 당업계에 공지된 방법에 의할 수 있고, 바람직하게는 상기 제대 유래 줄기세포를 지지체 혹은 운반체에 담아 제공될 수 있다.
상기 지지체 혹은 운반체는 숙주에 실질적인 해로운 반응을 유발하지 않으며, 필요시 생분해 또는 생물학적 시스템으로부터 자연적으로 제거될 수 있고/있거나 생물학적 시스템에 화학적으로 혼입될 수 있는 것일 수 있다. 상기 지지체 혹은 운반체는 그 종류에 있어 특별히 한정된 것은 아니나, 바람직하게는 피브린, 혈소판 용해물(platelet lysate), 혈소판 풍부 혈장(Platelet Rich Plasma, PRP), 천연 및 합성 고분자 등을 포함하는 젤 또는 하이드로젤 형태일 수 있다.
상기 제대 유래 줄기세포는 하이드로젤과 혼합되어 세포치료제로 사용될 수 있다. 상기 사용가능한 하이드로젤은 특별히 한정된 것은 아니나, 천연고분자로 구성된 하이드로젤일 수 있으며, 바람직하게는 콜라겐 하이드로젤일 수 있다. 일례로, 콜라겐 하이드로젤을 사용시 콜라겐 농도를 조절하여 생체 내에서 분해속도를 조절할 수 있다. 상기 하이드로젤은 세포주입 시 혈액 내로 소실되는 단점을 방지할 수 있으며, 또한 손상부위 내 염증세포 및 효소에 의한 세포손상을 감소시킬 수 있다.
상기 세포치료제는 추가적으로 항염증제제, 줄기세포 동원인자 및 혈관성장 유도인자로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 항염증제제는 하이드로젤이 이식된 제대 유래 줄기세포를 과도한 염증반응으로부터 보호하기 위하여 사용될 수 있고, 줄기세포 동원인자 또는 혈관성장 유도인자를 포함하여 말초신경 내 줄기세포의 동원 및 혈관성장을 유도함으로 세포재생 효과를 증대시킬 수 있다.
상기 항염증제제는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 COX 억제제, ACE 억제제, 살리실산염(salicylate), 덱사메타손(dexamethasone) 및 테스토스테론(Testosterone) 등을 포함하는 스테로이드 및 단백동화스테로이드(anabolic steroid) 제제 및 그 전구 물질 등으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 줄기세포 동원 인자는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 IGF, bFGF, PDGF 및 EGF로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 혈관성장 유도인자는 특별히 한정된 것은 아니나, 일례로 EGF, PDGF, VEGF, ECGF 및 엔지오제닌(angiogenin)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 세포치료제는 단백질 또는 펩타이드 제제, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 프로테오글리칸(proteoglycan), 성장인자(growth factor) 및 유전자 치료제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 세포치료제는 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 주사제 형태로 제공되거나, 지지체 또는 운반체에 포함되어 제공될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 약학조성물은 줄기세포가 보유하는 조직 재생능 및 이를 통한 질환의 예방 또는 치료효과, 줄기세포의 주변분비 효과(paracrine effect)에 기인한 항염증 및 면역 조절 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학조성물이 보유하는 조직 재생능 및 이를 통한 질환의 예방 또는 치료효과는, 바람직하게는 1) 순환 시스템에 있어서, 심장, 혈액 및 혈관의 손상 및 이로 인한 질환, 2) 외장 시스템에 있어서, 피부, 모발, 지방, 손톱의 손상 및 이로 인한 질환, 3) 골격 시스템에 있어서, 뼈, 연골, 힘줄, 인대 및 근육의 손상 및 이로 인한 질환 4) 생식 기관에 있어서, 난소, 난관, 자궁, 질, 유선, 고환, 정관, 정액 및 전립선과 같은 성기의 손상 및 이로 인한 질환, 5) 소화 기관에 있어서, 타액선, 식도, 위, 간, 담낭, 췌장, 내장, 직장 및 항문의 손상 및 이로 인한 질환, 6) 비뇨 기관에 있어서, 체액, 전해질 균형, 신장, 요관, 방광 및 요도의 손상 및 이로 인한 질환, 7) 호흡기 시스템에 있어서, 기관, 인두, 후두, 기관지, 폐 및 횡격막의 손상 및 이로 인한 질환, 8) 내분비 계에 있어서, 시상 하부 뇌하수체, 송과선 본체 또는 송과선, 갑상선, 부갑상선, 부신 및 내분비선의 손상 및 이로 인한 질환, 9) 면역 체계에 있어서, 면역 체계의 손상 및 이로 인한 질환, 10) 림프계에 있어서, 림프 노드와 혈관의 손상 및 이로 인한 질환, 11) 근육계에 있어서, 골격 근육, 평활근 및 심장 근육의 손상 및 이로 인한 질환, 12) 신경계에 있어서, 뇌, 척수, 자율 신경 및 말초 신경계의 손상 및 이로 인한 질환을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학조성물이 보유하는 항염증 및 면역 조절 효과는, 바람직하게는 1) 관절염, 베체트병, 통풍 등을 비롯한 관절염 및 여러 기관 및 조직에서의 염증성 질환, 2) 루푸스, 아토피, 류마치스 관절염 등의 자가 면역질환, 3) 암을 비롯한 종양, 4) 감염성 질환 및 쇼크, 5) 이식(transplantation) 시 거부 반응 치료 및 GVHD 치료를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학조성물은 골, 연골, 근육, 건 또는 인대 질환의 예방 또는 치료용으로 사용되는 것이다.
본 발명의 약학조성물은 골 대사성 질환의 예방 또는 치료용으로 사용될 수도 있으며, 바람직하게는 골다공증, 파제트병, 치주질환, 골전이암 또는 류마티스 관절염의 예방 또는 치료목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 분리방법에 의해 60 내지 120 분 내에 다량의 제대 유래 줄기세포를 배양할 수 있고, PDT가 30 내지 50 시간으로 체외 성장능력이 뛰어나 단시간 내에 세포치료제로 사용할 수 있는 유효량을 획득할 수 있다.
본 발명의 제대 유래 줄기세포는 체외 증식능력, 우수한 다분화능을 지녀 조직 재생능 및 이를 통한 질환의 예방 또는 치료효과 및/또는 항염증 및 면역 조절 효과를 나타내는 약학조성물로 효과적으로 활용될 수 있다.
본 발명의 약학조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이며, 예컨대, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 약학조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 본 발명의 제대 유래 줄기세포 또는 이의 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 주사제 형태로 제공되거나, 지지체 또는 운반체에 포함되어 제공될 수 있으며, 필요에 따라 단백질 또는 펩타이드 제제, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan), 프로테오글리칸(proteoglycan), 성장인자(growth factor) 및 유전자 치료제로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질과 함께 제공될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실험방법
1. CFU-F 실험 (Colony-forming unit-fibroblast; CFU-F assay)
배양 14일에 배양용기를 DPBS로 2회 세척하고 4% 파라포름알데히드로 20분간 고정한 후 0.1% 크리스탈 바이올렛 (Merck, Darmstadt, Germany) 용액으로 10분간 염색하였다. 염색된 세포의 수가 50개 이상의 세포 집합체를 CFU-F로 정의하고 개수와 면적을 측정하였다.
2. 줄기 세포의 증식능 분석 (Growth Kinetics Assay)
증식능은 누적 집단 배가 수(cumulative population doubling level; CPDL)와 집단 배가 시간 (population doubling time; PDT)을 측정하여 분석하였다. 9계대 동안 배양하였으며 총 배양기간은 분리 기간을 포함하여 60일이 소요되었다. 누적 집단 배가 수를 측정하기 위하여, 제대 줄기 세포를 배양 용기에 3,333 cells/cm2의 밀도로 접종 후 각 계대 배양 시마다 세포 수를 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)으로 측정하였다. 다음과 같은 공식을 이용하여 값을 산출하였고 Ni는 초기 세포 수, Nf는 마지막 세포 수를 나타낸다. 모든 실험은 3번 반복하였다. PD = Log (Nf/Ni)/Log2,PDT=CT/PD
3. 면역표현형 분석 (Immunophenotyping)
세포 표면항원의 면역표현형을 분석하기 위하여 3세대 계대 배양 세포 (P3)들을 이용하여 유세포 분석(flow cytometry)을 시행하였다. DPBS로 세척한 세포를 2x105개씩 분주하고 원심 분리 후, 차가운 염색 완충 용액 (staining buffer, DPBS, 0.1% sodium azide, and 2% fetal bovine serum)을 넣어준다.
총 8개의 항체 (HLA-DR, CD11b, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90 (이상 Becton Dickinson, San Jose, Calif., USA), CD105 (Abcam, Cambridge, UK)에 fluorescein isothiocyanate (FITC) 또는 phycoerythrin (PE)가 결합된 항체를 4℃, 암실에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음 DPBS를 이용하여 세척 후 1% 파라포름알데히드로 세포를 고정시켰다. 각각에 해당되는 동종 대조항체 (isotypic controls)로서 IgG1-FITC, IgG1- PE, IgG2a- FITC (이상 Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)가 사용되었다. 데이터는 Becton Dickinson FACSAria와 FACSDiva 소프트웨어 (Becton Dickinson, San Jose, Calif., USA)를 이용하여 총 10,000개의 이벤트를 분석하였다.
4. 실시간 역전사 중합효소 연쇄반응
실시간 역전사중합효소 연쇄반응(quantitative real time polymerase chain reaction, qPCR)을 통하여 지방, 골, 연골, 건 세포 특이 유전자의 발현을 확인하였다. 우선 각 세포들의 total RNA를 분리하기 위하여 HiYield Total RNA mini kit (Real Biotech Corporation, Taiwan)을 이용하였고, 분광광도계(NanoDrop, Wilmington, Delaware)를 사용하여 260 nm와 280 nm에서의 흡광도를 측정한 후, 유출액 내의 total RNA 를 정량하였다. 각각의 total RNA 1 μg을 50 μM oligo(dT), 10 mM dNTP와 홉합하고 최종 부피가 10 ul가 되도록 증류수를 더한 다음 65℃에서 5분간 반응시킨 후, 이 용액을 10X RT buffer, 25 mM MgCl2, 0.1 M DTT, 40 U/ml RNaseOut, 200 U/mL Superscript II Reverse Transcriptase (Superscript II Reverse Transcription kit (Invitrogen, Carlsbad, California)) 혼합 용액과 섞어 50℃, 50분 동안 반응시키고 85℃에서 5분 반응시킨다. 4℃에서 식힌 용액에 2 U/ml RNase H 용액을 첨가한 후 37℃에서 20분 동안 반응 시켜 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 Taq-Man Gene Expression Assays (Applied Biosystems, Foster City, California)를 이용하여 다음의 유전자 발현을 실시간으로 확인하였다; aP2 (assay ID: Hs01086177_m1), OPN (assay ID: Hs00959010_m1), Aggrecan (assay ID: Hs00153936_m1), SCX A/B (assay ID: Hs03054634_g1), GAPDH (assay ID: Hs99999905_m1). 중합 효소 연쇄반응은 LightCycler 480 (Roche Applied Science, Mannheim, Germany) 기계를 사용하여, denaturation 단계 95℃에서 10분, annealing 단계 95℃ 10초, 60℃ 1분, 72℃ 4초이며 60 cycle 수에 맞추어 실험한 후, polymerization은 72℃에서 7분 동안 반응하여 결과를 관찰하였다. 유전자 발현의 정량화는 GAPDH의 발현 정도를 대조군으로 계산하였다.
실시예
<실시예 1-5> 제대조직 유래 줄기세포의 배양
제대는 만삭 정상 산모에서 제왕절개 또는 질식 분만 후 산모의 동의 하에 채취하였다. 상기 채취한 제대는 항생제 (100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B (antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수 (Ca2+, Mg2+-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco)로 2~3회 세척하여 탯줄 외부의 혈액을 제거한 후 길이와 무게를 측정하였다. 대량의 제대를 가위로 균일하게 자르기 위해 약 가로, 세로 및 높이가 각각 5 cm인 단위 조각으로 자른 후, 제대조직을 가로, 세로 및 높이가 각각 1 ㎜ 미만인 것부터 10 ㎜까지(≤1 ㎜(실시예 1), 1-2 ㎜(실시예 2), 2-4 ㎜(실시예 3), > 4 ㎜(실시예 4), 10 ㎜(실시예 5)) 다양하게 절단한 절편(explant)을, 각각 멸균된 상태의 DMEM 배지가 들어있는 배양용기(culture dish)에 정렬하여 접종한 다음, 절편이 배양용기에 완전히 부착된 후, 배양배지를 첨가하였다.
배양용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고 trypsin-EDTA 용액(0.05% trypsin and 0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid(trypsin-EDTA; Welgene, Daegu, Korea)을 3분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후 세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 염색한 후 계수하여 3,333 cells/cm2 의 밀도로 세포를 지속적으로 배양하였다.
<실시예 6> 절편제조시, 배양배지의 유무에 따른 제대조직 유래 줄기세포의 배양
제대는 만삭 정상 산모에서 제왕절개 또는 질식 분만 후 산모의 동의 하에 채취하였다. 상기 채취한 제대는 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Ca2+, Mg2+-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco)로 2~3회 세척하여 탯줄 외부의 혈액을 제거한 후 길이와 무게를 측정하였다.
채취한 제대는 양이 많고 끈적거리는 특징이 있기 때문에 가위로 절단 시 많은 시간이 소요된다는 어려움이 있다. 그렇기 때문에 분리 시간을 절약하고 많은 수의 세포를 분리하기 위해, 상기 회수한 제대조직을 제대조직 1 g당 0~5 ㎖의 배양배지를 첨가한 후, 가로, 세로 및 높이가 각각 2-4 ㎜로 잘게 잘라 절편을 제조하였다. 상기 절편을 배양용기에 정렬하여 접종하고, 완전히 부착된 후, 배양배지를 첨가하였다.
배양용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고 trypsin-EDTA 용액(0.05% trypsin and 0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid(trypsin-EDTA; Welgene, Daegu, Korea)을 3분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후 세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 염색한 후 계수하여 3,333 cells/cm2 의 밀도로 세포를 지속적으로 배양하였다.
<실시예 7> 제대의 초기 접종 용량에 따른 제대조직 유래 줄기세포의 배양
제대는 만삭 정상 산모에서 제왕절개 또는 질식 분만 후 산모의 동의 하에 채취하였다. 상기 채취한 제대는 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Ca2+, Mg2+-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco)로 2~3회 세척하여 탯줄 외부의 혈액을 제거한 후 길이와 무게를 측정하였다.
상기 제대조직을 다시 가로, 세로 및 높이가 각각 2-4 ㎜가 되도록 잘라 절편을 제조한 후, 상기 절편(explant)을 배양용기의 면적(㎠)대비 중량이 0~13.5 mg이 되도록 배양용기에 정렬하여 접종하였다. 절편이 배양용기에 완전히 부착된 후, 배양 배지를 조심스럽게 첨가하였다.
배양용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고 trypsin-EDTA 용액(0.05% trypsin and 0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid(trypsin-EDTA; Welgene, Daegu, Korea)을 3분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후 세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 염색한 후 계수하여 3,333 cells/cm2 의 밀도로 세포를 지속적으로 배양하였다.
<실시예 8> 부착시간에 따른 제대조직 유래 줄기세포의 배양
제대는 만삭 정상 산모에서 제왕절개 또는 질식 분만 후 산모의 동의 하에 채취하였다. 상기 채취한 제대는 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Ca2+, Mg2+-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco)로 2~3회 세척하여 탯줄 외부의 혈액을 제거한 후 길이와 무게를 측정하였다.
상기, 제대조직을 가로, 세로 및 높이가 각각 2-4 ㎜가 되도록 절단하여 절편(explant)를 제조하였다. 상지 절편을 배양용기(culture dish)에 부착시켜 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기 내에서 10분, 30분, 60분, 120분, 180분 동안 각각 인큐베이터에 방치하였다.
배양용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고 trypsin-EDTA 용액(0.05% trypsin and 0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid(trypsin-EDTA; Welgene, Daegu, Korea)을 3분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후 세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 염색한 후 계수하여 3,333 cells/cm2 의 밀도로 세포를 지속적으로 배양하였다.
<실시예 9> 모든 조건을 만족한 제대 유래 줄기세포의 분리
제대는 만삭 정상 산모에서 제왕절개 또는 질식 분만 후 산모의 동의 하에 채취하였다. 상기 채취한 제대는 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Ca2+, Mg2+-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco)로 2~3회 세척하여 탯줄 외부의 혈액을 제거한 후 길이와 무게를 측정하였다.
상기 회수한 제대조직을 제대조직 1 g당 0~2 ㎖의 배양배지를 첨가한 후, 가로, 세로 및 높이가 각각 2-4 ㎜가 되도록 잘게 잘라 절편(explant)을 제조하였다. 상기 절편(explant)을 배양용기의 면적(㎠)대비 중량이 0.7~6.8 mg이 되도록 배양용기에 정렬하여 접종하였다. 이를 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기 내에서 60분 동안 각각 인큐베이터에 방치하였다.
배양용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고 trypsin-EDTA 용액(0.05% trypsin and 0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid (trypsin-EDTA; Welgene, Daegu, Korea)을 3분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후 세포는 트리판 블루 제외 방식 (trypan blue excluding)을 이용하여 염색한 후 계수하여 3,333 cells/cm2 의 밀도로 세포를 지속적으로 배양하였다.
<비교예 1> 제대조직 유래 줄기세포의 배양
제대는 만삭 정상 산모에서 제왕절개 또는 질식 분만 후 산모의 동의 하에 채취하였다. 상기 채취한 제대는 항생제(100 U/ml penicillin, 100 μg/ml streptomycin sulfate, and 0.25 μg/ml amphotericin B(antibiotic-antimycotic solution; Welgene, Daegu, Korea))가 첨가된 칼슘 및 마그네슘 부재 Dulbecco 인산염 완충 식염수(Ca2+, Mg2+-free Dubecco's phosphate-buffered saline; DPBS, Gibco)로 2~3회 세척하여 탯줄 외부의 혈액을 제거한 후 길이와 무게를 측정하였다. 대량의 제대를 가위로 균일하게 자르기 위해 약 5 cm 단위로 잘랐다.
상기 제대를 가위와 칼을 이용하여 각각 1-2 mm 가로, 세로 및 높이로 잘게 자른 후, 0.1% 제1형 콜라게나제(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 항생제가 함유된 low-glucose Dulbecco's modified Eagle medium(LG DMEM; Welgene, Daegu, Korea) 내에서 가볍게 교반하면서 37℃ 2시간 동안 처리하였다. 이 후 동량의 배양배지(LG DMEM, 10% fetal bovine serum(FBS; Welgene, Daegu, Korea), and antibiotic-antimycotic solution)를 첨가한 후, 분해되지 않은 조직을 100-μm 세포 여과기를 이용하여 제거하였다. 20℃ 에서 500 g로 15분간 원심분리 하여 세포를 모으고, 배양배지로 2회 세척하였다. 분리된 세포를 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 세포 수를 계수하고 1×104 cells/cm2 밀도로 150 mm 배양용기에 넣고 37℃, 5% CO2가 공급되는 배양기 내에서 배양하였다. 배양 3일 후 배양용기의 바닥에 붙지 않은 세포를 배지교환을 통해 제거하였고, 1주에 2~3회 배양액을 교체하였다.
배양용기의 60~80%로 정도로 세포가 자라면 DPBS로 두 번 세척을 해주고 trypsin-EDTA 용액(0.05% trypsin and 0.53 mM ethylenediamine tetraacetic acid(trypsin-EDTA; Welgene, Daegu, Korea)을 3분간 처리하여 부착된 세포를 떼어낸 후 세포는 트리판 블루 제외 방식(trypan blue excluding)을 이용하여 염색한 후 계수하여 3,333 cells/cm2 의 밀도로 세포를 지속적으로 배양하였다.
실험예 1. 실시예 1 내지 5 및 비교예 1에 따른 제대 유래 줄기세포의 분리세포수 측정
실시예 1 내지 4 및 비교예 1로부터 회수한 세포의 수를 세었고, 그 결과는 도 1 및 표 2에 나타낸 바와 같다.
도 1A는 가위질 시간에 따라 제조된 실시예 1 내지 4의 제대 유래 줄기세포를 나타낸 도면이고, 도 1B는 실시예 1로부터 제조된 절편 크기에 따른 제대 유래 줄기세포의 분리세포수를 나타낸 그래프이며, 도 1C는 실시예 1로부터 제조된 절편 크기에 따라 배양된 제대 유래 줄기세포의 콜로니 크기를 나타낸 그래프이다.
도 1에 따르면, 실시예 3으로부터 분리한 제대 유래 줄기세포의 세포수를 측정한 결과, 1.86 ± 0.49 × 106/g 세포수가 측정되었고, CFU-f 염색결과에서도 동일한 결과가 측정되었다. 즉 비교예 1, 실시예 1, 2, 4, 5보다 더 많은 세포가 실시예 3으로부터 분리되었음을 확인하였다. 또한 효율적인 세포 분리를 위해 이상적인 제대 크기인 실시예 3의 절편을 제조하기 위해서는 가위질 1분이 제일 적합함을 확인하였다.
또한, 가위질을 1분 수행한 결과 가로, 세포 및 높이가 각각 2-4 ㎜인 절편이 50% 이상 포함되었고, 이를 통해 제조된 실시예 3의 제대 유래 줄기세포는 후술하는 실험예를 통해 세포 증식 등의 면에서 매우 용이함을 알 수 있다.
절편의 크기 |
절편 1g 당 분리 세포 수(개) |
절편 1 g당 CFU-F 면적(㎠) |
10 mm(실시예 5) |
148,720 ± 122,661 |
1.0 ± 0.2 |
5 mm(실시예 4) |
264,138 ± 144,990 |
1.2 ± 0.5 |
2-4 mm(실시예 3) |
1,855,818 ± 490,340 |
9.0 ± 0.4 |
1-2 mm(실시예 2) |
320,000 ± 208,046 |
4.2 ± 1.2 |
<1 mm(실시예 1) |
123,333 ± 61,283 |
0.8 ± 0.3 |
비교예 1 |
432,830 ± 258,225 |
4.5 ± 0.0 |
실험예 2: 실시예 6에 따른 분리세포수 측정
도 2A는 0 ml/g, 0.5 ml/g, 1 ml/g의 배지가 들어있는 배양용기에서, 제대조직을 외식한 결과, 총 잘린 조직을 나타낸 그래프이고, 도 2B는 0 ml/g, 0.3 ml/g, 0.5 ml/g, 1 ml/g, 2 ml/g, 3 ml/g, 4 ml/g, 5 ml/g의 배지가 들어있는 각각의 배양용기에서, 제대조직을 외식한 결과, 총 분리세포수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
배양배지의 양 |
절편의 수(개) |
0 ml/g |
19.5 ± 3.5 |
0.5 ml/g |
24.0 ± 4.1 |
1.0 ml/g |
27.5 ± 2.6 |
배지의 양 |
절편 1 g당 분리 세포 수 (개) |
0.5 ml/g |
2,190,000 ± 189,934 |
1.0 ml/g |
1,990,000 ± 328,976 |
2.0 ml/g |
2,233,333 ± 267,815 |
3.0 ml/g |
1,510,000 ± 442,691 |
4.0 ml/g |
1,446,667 ± 285,832 |
5.0 ml/g |
1,503,333 ± 311,328 |
도 2 및 표 3, 표 4에 나타난 바와 같이, 배지를 넣고 제대조직을 자르면 더 잘게, 더 많은 조각으로 잘리는 것을 확인하였다. 제대조직 1g 당 0, 0.3, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 ml의 배양배지를 넣어서 제대를 자른 후, 80% confluence가 되면 세포 수 측정을 하였다. 제대조직을 절편으로 외식할 때, 배지의 양이 많을수록 제대조직이 더 잘게 잘리나, 분리세포수는 더 감소하는 것을 확인하였다.
따라서 제대조직 1 g을 기준으로 배양배지의 양은 0 내지 5.0 ㎖, 바람직하게는 0.5 내지 3 ㎖인 것을 확인하였다. 구체적으로 배지를 넣지않고 절편을 제조했을 때보다, 배지와 함께 제대조직을 자를 경우 절편의 개수가 1.4배 증가하였다.
또한, 실시예 3의 제대 유래 줄기세포에서 여타의 다른 크기의 절편을 이용한 경우보다 유의하게 큰 CFU-F 면적을 보임을 확인하였다. 특히 절편 1g 당 2-4 ㎜ 크기의 절편을 50% 이상 포함하고 있는 실시예 3은 총 CFU-F 면적이 9.0 ± 0.4 ㎠이였고, 실시예 2는 4.2 ± 1.2 ㎠이고, 비교예 1은 4.5 ± 0.0 ㎠이였다.
실험예 3: 절편의 양에 따른 분리세포수 측정
150 ㎜ 배양용기에 이송된, 외식된 절편(explant)의 중량(g)에 따른 분리세포수 변화를 확인하고자 하였다. 150 ㎜ 배양용기에 0.1, 0.5, 1.0, 2.0 g의 2-4 mm 절편을 정렬한 후, 2 주간 배양한 후, 80% confluence 다다를 때, 분리세포수를 측정하고, CFU-f를 하였다.
도 3A는 절편의 중량에 따른 실시예 7의 제대 유래 줄기세포의 CFU-fs의 수를 나타낸 것으로, 크리스탈 바이올렛 염색결과를 나타낸 것이고, 하단의 그래프는 형성된 CFU-fs의 수와 크기를 그래프로 나타낸 것이다. 도 3B는 절편의 중량에 따른 제대 유래 줄기세포의 분리세포수를 측정하여 나타낸 그래프이다.
접종 제대의 용량 |
절편 1 g당 CFU-F 면적(cm2) |
0.1 g |
2.2 ± 0.2 |
0.5 g |
4.8 ± 5.7 |
1.0 g |
21.5 ± 1.6 |
2.0 g |
21.2 ± 4.9 |
도 3 및 표 5에 나타난 바와 같이 절편의 중량에 따라 분리세포수는 큰 차이를 나타내지 않았으나, 절편의 중량이 많을수록, 콜로니의 개수가 증가하였음을 확인하였다. 특히 0.1 g, 1 g, 2 g, 5 g에서는 유의한 차이를 보였고, 1.0 g 및 2.0 g의 절편을 포함시킨 경우, 이로부터 분리된 제대 유래 줄기세포의 colony 개수는 차이가 없었다.
게다가 절편의 중량에 따른 배양용기의 단위면적으로 환산하면(0.0007~0.0135 g/㎠), 오히려 2.0 g의 절편을 넣은 배양용기에서는 제대 유래 줄기세포의 분리세포수가 감소하는 것으로 확인되었다. 즉 실시예 5에서와 같이 절편 중량에 따라 분리된 제대 유래 성체줄기세포는 제대조직의 중량이 과도하게 많을수록 오히려 저하되므로, 상기 절편이 단위면적당(㎠) 0.0007 내지 0.0068 g이 포함되도록 배양하는 것이 가장 많은 제대 유래 줄기세포를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.
실험예 4: 부착시간에 따른 제대 유래 줄기세포의 분리세포수 분석
부착시간에 따른 효과를 평가하기 위하여, 실시예 8을 통해 제조된 제대 유래 줄기세포를 CO2 배양기에서 10, 30, 60, 120, 180분 동안 배양 및 부착시켜, 이의 분리세포수를 측정하고, CFU-f를 하였다.
도 4A는 실시예 8로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 분리세포수를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 4B는 실시예 8로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 CFU-fs의 수를 나타낸 것으로, 크리스탈 바이올렛 염색결과를 나타낸 것이고, 하단의 그래프는 형성된 CFU-fs의 수와 크기를 그래프로 나타낸 것이다.
부착 시간 |
절편 1 g당 분리 세포수 (개) |
절편 1 g당 CFU-F 면적 (cm2) |
10 min |
195,000 ± 28,284 |
3.1 ± 1.2 |
30 min |
552,500 ± 109,602 |
6.9 ± 2.0 |
60 min |
1,250,000 ± 127,279 |
45.7 ± 6.9 |
120 min |
980,000 ± 77,782 |
33.9 ± 13.5 |
180 min |
360,000 ± 49,497 |
29.9 ± 1.0 |
도 4 및 표 6에 나타난 바와 같이 절편을 오래 부착시킬수록 분리세포수도 점진적으로 증가하였음을 확인하였고, 60 분동안 부착 시 최대 분리세포수가 측정되었다.
그러나 120 분을 초과하면서 분리세포수가 점점 감소였고, 이는 CFU-f의 수를 측정한 결과에서도 동일한 경향을 갖는 것으로 확인되었다. 구체적으로 CFU-F의 면적은 60분 부착 시 45.7 ± 6.9 cm2로 최대 면적을 보였으며, 120분 및 180분 부착 시 60분 부착 시와 유의한 차이가 없었다.
종합하면, 가로, 세로 및 높이가 각각 2-4 ㎜로 제조된 제대조직의 절편을 배양용기에 정렬한 다음 배양기에서 60분 동안 배양하는 것이 가장 바람직하다는 것을 확인하였다.
실험예 5: 성장 특성
배양배지로부터 회수한 제대 유래 줄기세포의 군집배가 시간(population doubling time, PDT)를 측정하기 위해, 실시예 9로부터 제조된 세포들을 48-멀티웰 배양용기에 파종한 후 배양하였다. PDT는 다음 공식에 따라 산정하였다. PDT=[(days in exponential phase)/((logN2-logN1)/log2)] 이때, N1은 지수성장기의 초기의 세포수이며, N2는 지수성장기의 말기에서의 세포수이다.
도 5A는 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 모폴로지를 관찰하기 위한 광학현미경 사진이고, 도 5B는 효소적 방법으로 제조된 제대 유래 줄기세포(비교예 2)와 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 배양기간에 따른 CPDL를 측정하여 나타낸 그래프이고, 도 5C는 효소적 방법으로 제조된 제대 유래 줄기세포(비교예 2)와 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 군집배가시간(PDT)을 측정하여 나타낸 그래프이다.
계대 배양수 |
Population Doubling Time (hr) |
비교예 1 효소 분해 분리법의 제대 유래 줄기세포 |
실시예 9의 제대 유래 줄기세포 |
P2 |
42.1 ± 1.7 |
30.3 ± 2.0 |
P5 |
42.1 ± 0.7 |
31.6 ± 0.7 |
P7 |
42.8 ± 1.0 |
28.6 ± 3.7 |
P9 |
43.5 ± 2.7 |
27.6 ± 3.2 |
도 5A에 나타난 바와 같이 본 발명의 방법을 통해 제조된 제대 유래 줄기세포는 방추형 모양을 보였으며, 계대 배양에서도 섬유아세포 형태의 특징적인 줄기세포 모양을 유지하고 있음을 확인하였다.
도 5B, C에 나타난 바와 같이 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 CPDL은 배양 60일과 88일 후, 각각 35.5 ± 2.36와 55.8 ± 1.96로 비교예 1로부터 제조된 제대 유래 줄기세포 및 기존에 보고된 연구에서의 값보다 현저히 큰 것을 확인하였다.
또한, 도 5와 표 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시에 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포는 비교예 1로부터 분리된 제대 유래 줄기세포보다 P2, P5, P7, 및 P9의 배양 단계 모두에서 유의하게 작은 PDT를 보였다. 또한 실시예 9의 제대 유래 줄기세포는 계대 배양이 증가함에 따른 PDT 변화가 관찰되지 않았다.
실험예 6: 면역표현형 분석(Immunophenotyping)
앞서 설명한 면역표현형 분석법을 통해 분석하였다. 일반적으로 중간엽줄기세포는 CD73, CD90, 및 CD105 양성이며, CD11b(or CD14), CD19(or CD79 alpha), CD34, CD45, 및 HLA-DR 음성을 보이는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 발명의 방법으로 분리된 제대 유래 줄기세포도 이 기준에 합당한 소견을 보일 것이라 예상하고, 분석을 수행하였다.
도 6은 실시예 9로부터 분리한 제대 유래 줄기세포의 유세포분석기를 통하여 분석한 면역표면학적 특성을 나타낸 그래프이고, 이의 결과를 표 8에 정리하였다. 이에 따르면 실시예 9로부터 분리한 제대 유래 줄기세포는 CD73, CD90 및 CD105(> 95 %)에서 강하게 양성이었지만, HLA-DR, CD11b, CD19, CD34 및 CD45에서는 음성이었다(<1.5 %).
표지자 |
양성율 |
CD73 |
97.2 ± 4.2 |
CD90 |
99.0 ± 1.8 |
CD105 |
95.8 ± 3.9 |
CD11b |
1.4 ± 0.5 |
CD19 |
0.1 ± 0.2 |
CD34 |
0.4 ± 0.3 |
CD45 |
0.8 ± 0.3 |
HLA-DR |
1.2 ± 0.9 |
실험예 7: 제대 유래 줄기세포의 다분화능력
1) 지방세포로의 분화능력
실시예 9 로부터 제조된 제대 유래 줄기세포의 지방세포로 분화능력을 평가하기 위해서, 8,000 cells/cm2의 밀도로 세포를 배양용기에 넣고 60~80% 정도로 차면 지방세포 분화 배양액(10% 소태아혈청, 1% 항생제 용액, 0.5 mM 3-isobutyl-1-methylxantine(Sigma), 1 μM dexamethasone, 5 μg/ml insulin(Gibco), 60 μM indomethacin(Sigma)을 첨가한 LG-DMEM)으로 21일 동안 배양하였다. Oil Red O 염색과 지방세포 마커 유전자 발현을 통해 분화 정도를 확인하였다. Oil Red O 염색은 배양한 세포를 한차례 증류수로 세척하고 4% 파라포름알데히드로 실온에서 1시간 동안 고정시킨 후 3회 세척, 0.18% Oil Red O(Sigma) 용액을 적용하여 상온에서 10분간 반응시키고 증류수로 세척한 후 관찰하였다.
도 7은 실시예 9로부터 분리한 제대 유래 줄기세포의 지방세포(Adipogenesis)(A), 골세포(osteogenesis)(B), 연골세포(Chondrogenesis)(C), 건 세포(Tenogenesis)(D)로의 분화능력을 나타낸 도면이다.
도 7A에서 제시하듯이 제대 유래 줄기세포는 지방세포로의 분화를 유도한 후 중성 지질 축적을 나타내는 붉은색이 관찰되었고(PPARγ2), 지단백질 리파아제 (LPL) 및 지방 세포 단백질 2(aP2)의 발현이 유의하게 증가하는 것을 확인하였다. 구체적으로, 지방분화마커인 aP2가 355 ± 31.94배 미분화 세포에서보다 더 높게 측정되었다.
2) 골세포로의 분화능력
실시예 9로부터 분리된 제대 유래 줄기세포의 골세포로의 분화능력을 평가하기 위해서 8,000 cells/cm2의 밀도로 세포를 배양접시에 넣고 60~80% 정도로 차면 골분화 배양액(10% 소태아혈청, 1% 항생제 용액, 100 nM dexamethasone(Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM β-glycerophosphate(Sigma), 0.2 mM ascorbic acid 2-phosphate(Sigma)를 첨가한 LG-DMEM)으로 21일 동안 배양하였다. Von Kossa 염색과 골 마커 유전자 발현을 통하여 분화 정도를 확인하였다. Von Kossa 염색은 증류수로 한 차례 세척한 배양 세포를 4% 파라포름알데히드로 실온에서 1시간 동안 고정시키고 3회 세척 후 5% silver nitrate(Sigma) 용액을 60W 램프 아래에서 1시간 동안 적용하여 반응시켰다. 그 다음 증류수로 3회 세척 후 5% sodium thiosulfate 5분 동안 처리하고 0.1% nuclear fast red 용액을 5분간 반응시키고 관찰하였다.
도 7B에 나타난 바와 같이, 세포외 칼슘의 존재를 확인하였고, 실시간 PCR에서 Runt 관련 전사 인자 2(Runx2), ALP(alkaline phosphatase) 및 OPN(osteopontin) 발현 수준이 미분화 세포보다 유의하게 높음을 확인하였다. 구체적으로 골 분화 마커인 OPN이 미분화세포보다 5.9 ± 1.94배 더 높게 검출되었다. 따라서 본 발명에 따른 제대 유래 줄기세포는 조골세포로의 분화능력을 지닌 것을 확인할 수 있다.
3) 연골세포로의 분화능력
연골세포로의 분화능력을 평가하기 위하여 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포를 소태아혈청이 포함되지 않은 HG-DMEM 배지에 2×105 개의 세포를 부유한 후 15 ml polypropylene tube에 넣고 원심 분리하여 3차원 배양을 위한 펠렛을 얻었다. DMEM-HG에 50 μg/ml ascorbic acid 2-phosphate, 100 nM dexamethasone, 100 μg/ml sodium pyruvate, 40 μg/ml proline, 10 ng/ml transforming growth factor-β1, 1X Insulin-Transferrin-Serenite(ITS; Gibco)가 첨가된 분화배지에서 21일간 배양하였다. 연골세포로의 분화 정도를 확인하기 위하여 Safranin O 염색과 연골세포 마커 유전자 발현을 통해 분화 정도를 확인하였다. Safranin O 염색을 하기 위해 펠렛을 4% 파라포름알데히드 용액에 4℃에서 24시간 고정한 후 5 μm 표본으로 만들었다. 0.2% safranin O 용액으로 10분 동안 염색하고 증류수로 세척 후 0.04% fast green 용액으로 15초 동안 반응시켜 연골 세포 분화 여부를 관찰하였다.
도 7C에 나타난 바와 같이 분화된 제대 유래 줄기세포에서 Safranin-O 염색된 aggrecan이 확인된 바, 미분화 세포보다 연골세포 분화능이 높았음을 확인하였다. 또한, 연골분화 마커인 Aggreca이 미분화세포보다 5.1 ± 1.65배 더 높게 검출된 바, 이를 통해 본 발명에 따른 제대 유래 줄기세포는 연골세포로 분화가능함을 확인하였다.
4) 건 세포로의 분화능력
힘줄세포로의 분화능력을 평가하기 위하여, 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포는 건 세포로 분화시키기 위해 우선 35 mm 배양 접시에 SYLGARD(Dow Corning, Midland, MI, USA)를 부어 1 ~ 2주동안 코팅시킨 다음 5 mm 크기의 두 개 실크 suture를 SYLGARD 위에 박는다. 배양 접시와 suture는 클린벤치에서 100% 에탄올과 UV를 이용하여 멸균하고 2시간 동안 말린 후, DMEM을 37℃ CO2 incubator에서 1시간 동안 미리 담궈 놓는다. 2×105개의 세포를 트롬빈 혼합 용액(thrombin mixture; DMEM supplemented with 10% 소태아혈청, 1% 항생제 용액, 1 U/ml thrombin(Merck Chemicals, UK), 200 μM aminohexanoic acid(Sigma-Aldrich), and 10 mg/ml aprotinin(Roche, UK))과 섞고 10 mg/ml fibrinogen(Sigma-Aldrich) 용액을 넣어주었다. 이 혼합 용액을 SYLGARD가 코팅된 배양 접시의 표면에 빠르게 펴주고 37℃에서 1시간 동안 놔두었다. 그 다음 DMEM-HG에 250 μM ascorbic acid, 50 μM L-proline이 포함되어 있는 건 세포 분화 배양액에서 14일 동안 배양하였다. 건 세포로의 분화 정도를 확인하기 위하여 H&E(hematoxylin and eosin), picrosirius red, 면역조직화학 염색을 시행하였다. 또한 건 세포 마커 유전자 발현을 통해 분화 정도를 확인하였다. 세포를 4% 파라포름알데히드 용액에 24시간 고정한 후 파라핀에 포매하여 10 μm의 박절 표본으로 만든 뒤 H&E(hematoxylin and eosin) 염색과 Picrosirius red 염색을 시행하였고 면역조직화학 염색을 위해 anti-Col I(Abcam)을 1:200으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시켰으며, HRP가 결합되어 있는 2차 항체를 실온에서 30분 반응시킨 후 관찰하였다.
도 7D에 나타난 바와 같이, 긴 축을 따라 정렬된 섬유소 구조의 존재를 확인하였고, 구체적으로 H&E 염색을 통해 건강한 건 기질과 유사한 옅은 붉은색으로 염색된 기질과 방추형의 세포를 확인하였다. 상기 건 기질이 picrosirius red를 통해 노란색으로 염색되는 제1형 콜라겐임을 확인할 수 있었다. 제1형 콜라겐 항체를 이용한 면역조직화학 염색을 통해 상기 부분이 제1형 콜라겐임을 다시 확인하였다.
실시간 PCR에서 분화된 실시예 9로부터 제조된 제대 유래 줄기세포는 Scleraxis(SCX)와 Mohawk(MKX) 발현 수준이 미분화 세포에서보다 유의하게 높았음을 확인하였고, 구체적으로 SCX가 57.4 ± 1.97배 더 높게 분석된 바, 본 발명에 따른 제대 유래 줄기세포는 힘줄세포로의 분화능력을 지닌 것을 확인할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.