WO2024049120A1 - 친환경 천연 공융 용매로 추출한 추출물을 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

친환경 천연 공융 용매로 추출한 추출물을 포함하는 화장료 조성물 Download PDF

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WO2024049120A1
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eutectic solvent
natural
skin
natural eutectic
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권순우
이근수
김진화
오정영
배수정
최수련
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주식회사 잇츠한불
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Definitions

  • organic solvents are used for liquid extraction.
  • Organic solvents have the advantage of being cheap and having good extraction efficiency, but they have the problem of being harmful to the user's health or causing environmental pollution problems. Accordingly, interest in sustainable development is increasing, and research related to extraction solvents that can replace organic solvents is actively underway.
  • a eutectic solvent is a eutectic mixture of two components that have a lower melting point than each component.
  • ionic liquids were used as an alternative to organic solvents, but they were found to be unsuitable as environmentally friendly solvents due to low biodegradability, toxicity, and the amount of pollutants emitted during the manufacturing process. There is a report. Since then, research has been conducted on deep eutectic solvents and natural eutectic solvents that complement the shortcomings of conventional ionic liquids.
  • One aspect is to provide a composition for improving skin condition containing as an active ingredient a natural product extract extracted with an eco-friendly natural eutectic solvent.
  • Another aspect is to provide a method for producing an environmentally friendly natural eutectic solvent.
  • Another aspect provides the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a cosmetic composition for improving skin condition, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid. .
  • Another aspect is the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a skin external composition for improving skin condition, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid.
  • the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid.
  • Another aspect is the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of skin inflammatory diseases, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid. is to provide.
  • Another aspect is the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss, or promoting hair growth or hair growth, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid. It provides a purpose.
  • Another aspect provides a method of preventing, ameliorating, or treating a condition in a subject comprising treating or administering an effective amount of the composition described above to the subject in need thereof.
  • One aspect provides a composition for improving skin condition containing as an active ingredient a natural product extract extracted with an eco-friendly natural eutectic solvent.
  • the natural eutectic solvent may be one or more selected from the group consisting of amino acids or derivatives thereof, and organic acids.
  • amino acids or their derivatives include, for example, betaine, alanine, cysteine, aspartic acid, glutamine, phenylalanine, glycine, histidine, isoleucine, lysine, leucine, methionine, asparagine, proline, glutamine, arginine, serine, threonine, and valine. , tryptophan, tyrosine, etc.
  • the organic acids include, for example, citric acid, lactic acid, malic acid, maleic acid, pyruvic acid, fumaric acid, succinic acid, acetic acid, aconitic acid, tartaric acid, ascorbic acid, malonic acid, oxalic acid, glucuronic acid, neuraminic acid, It may be sialic acid, shikimic acid, phytic acid, galacturonic acid, iduronic acid, hyaluronic acid, hydroxycitric acid, lactone derivative, etc.
  • the natural eutectic solvent may be a mixture of betaine and citric acid.
  • the betaine and citric acid may be mixed at a weight ratio of 1:0.001 to 10.
  • the betaine and citric acid are, for example, 1:0.001 to 10, 1:001 to 8, 1:0.05 to 7, 1:0.05 to 5, 1:0.01 to 10, 1:0.01 to 6, 1:0.1 to It can be mixed at a weight ratio of 4, 1:0.1 to 3, 1:1 to 10, 1:1 to 4, or 1:1 to 2.
  • the mixing weight ratio of betaine and citric acid is less than or exceeds the above range, there is a problem in that the betaine and citric acid precipitate, the eutectic solvent becomes suspended, or the eutectic solvent becomes discolored.
  • the natural eutectic solvent may have pH 2.5 to pH 8.
  • an acidic solution with a pH of less than 2.5 is prepared. Because extracts extracted with acidic solvents have low acidity, they are more likely to cause irritation or skin damage when applied to the skin. Therefore, the pH of the natural eutectic solvent can be adjusted to 2.5 to 8 by adding a pH adjuster to the mixture of betaine and citric acid.
  • the natural eutectic solvent is, for example, pH 2.5 to pH 8, pH 2.5 to pH 7.5, pH 3 to pH 7, pH 3 to pH 6.5, pH 3.5 to pH 6, pH 4 to pH 6, or pH 4.5 to pH 5.5. It can be.
  • the pH adjusting agent may be a base or a buffering agent, for example, sodium citrate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium bicarbonate, arginine, catalytic acid, etc.
  • a base or a buffering agent for example, sodium citrate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium bicarbonate, arginine, catalytic acid, etc.
  • Tromethamine triethanol amine, aminomethyl propanol, dipotassium phosphate, potassium phosphate, sodium anisate, sodium lactate , sodium carbonate, urea, etc.
  • the above-mentioned natural products include figs, black bean sprouts, black rice, Hyeolgal, black beans, Japanese jacaranda, snow lotus, mountain ash, pollen, duckweed, juniper, sagebrush, bleeding heart, mistletoe, sedum, goldenrod, sage mushrooms, tomatoes, Houttuynia cordata, dermis, peonies, and chestnut flowers. It may be selected from the group consisting of , kudzu, and walnut.
  • the natural product extract may be extracted by chopping the dried natural product and adding 2 to 20 times the weight of the natural product with a natural eutectic solvent.
  • the extraction temperature may be performed at 30°C to 100°C.
  • Extraction time may be performed for 1 hour to 10 hours.
  • Extraction methods may include cold immersion, ultrasonic extraction, or reflux cooling extraction. The number of extractions may be repeated 1 to 5 times.
  • a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent prepared by mixing betaine and citric acid not only has improved safety and stability compared to a natural product extract extracted with an organic solvent, but also has excellent reactive oxygen and free radical scavenging ability and ultraviolet rays. It was confirmed that the protective effect against cell damage was excellent.
  • the natural product extract extracted with the natural eutectic solvent significantly inhibits the expression of hyaluronidase, inflammatory cytokines, and/or inflammatory mediators compared to the natural product extract extracted with an organic solvent, and inhibits tyrosinase activity and melanin synthesis. It was confirmed that it not only inhibits but also increases the expression of factors related to skin barrier, moisture, and elasticity, and suppresses the expression of factors related to acne, sebum, or hair loss.
  • the improvement of skin condition or skin beauty may include suppressing or improving skin aging, wrinkles, elasticity, strengthening the skin barrier, skin moisturizing, and suppressing or improving skin acne or sebum. Additionally, it may be for preventing, improving or treating hair loss, or promoting hair growth or hair growth.
  • skin aging refers to both tangible and intangible changes that occur in the skin as one ages, such as thinning of the epidermis, number of cells or blood vessels in the dermis, DNA damage repair ability, cell replacement cycle, It refers to a decrease in wound recovery, skin barrier function, epidermal moisture retention, sweat secretion, sebum secretion, vitamin D production, physical damage defense, chemical removal ability, immune response, sensory function, and temperature regulation.
  • the composition may be used to improve skin aging caused by extrinsic or intrinsic factors.
  • the exogenous factors refer to various external factors, such as ultraviolet rays (light), and the endogenous factors are also referred to as chronological factors and mainly refer to factors that occur due to the passage of time.
  • the skin aging is not only a premature aging phenomenon induced by external stimuli such as ultraviolet rays, pollution, cigarette smoke, chemicals, etc., but also a natural aging phenomenon that occurs as the proliferation of skin cells decreases with age. It is a concept that includes wrinkles, loss of elasticity, skin sagging, and dryness.
  • wrinkles include stimulation caused by changes in internal and external factors that change the components that make up skin tissue, causing wrinkles.
  • the aging may be aging caused by active oxygen or photoaging.
  • the “active oxygen radicals” are generated by normal metabolic processes, ultraviolet rays, harmful toxins such as pesticides, cigarette smoke, air pollution, etc. Free radicals lead to skin cell and tissue damage, destroying the skin's antioxidant defense network, leading to lipid peroxidation, protein oxidation, activation of proteolytic enzymes that destroy interstitial components, chain cutting and abnormal cross-linking of elastic fibers collagen and elastin, and hyaluronidase. It causes damage to biological components such as cleavage of the ronic acid chain, acceleration of melanin production reaction, and oxidation of DNA.
  • the “photoaging” is a phenomenon caused by external environmental factors, the most representative factor being ultraviolet rays.
  • Ultraviolet rays cause damage to biological components such as activation of proteolytic enzymes, chain cutting of matrix proteins, and abnormal cross-linking, and repetition of this mechanism causes skin aging that is evident in appearance.
  • wrinkle refers to a state in which the skin loses its elasticity and becomes loose, for example, the skin may be folded.
  • prevention or improvement of skin wrinkles may refer to any action that prevents or improves wrinkles by suppressing the expression of factors related to wrinkles, or increases the total amount of collagen.
  • skin barrier strengthening may refer to any action that improves the function of the skin barrier, which is located on the outermost layer of the skin and prevents moisture and nutrition loss.
  • skin moisturizing may refer to any action that maintains skin moisture or prevents moisture loss.
  • the “skin disease” may be a disease caused by damage to the skin barrier function, skin aging, skin wound, skin scar, or skin inflammation.
  • prevention includes suppressing the occurrence of a disease.
  • treatment includes inhibiting, alleviating, or eliminating the development of a disease.
  • the damage to the skin barrier function may mean any change that appears in the skin due to decreased or damaged skin barrier function. For example, it may include increased skin wrinkles, dryness, dermatitis, atopic dermatitis, allergic dermatitis, acne, etc.
  • the skin inflammatory disease may be any one selected from the group consisting of skin wounds, dermatitis, atopic dermatitis, pruritus, eczematous skin disease, dry eczema, erythema, urticaria, psoriasis, drug rash, and acne.
  • lopecia refers to a phenomenon in which hair falls out from the scalp or a condition in which hair becomes sparse or thin, and "prevention or improvement of hair loss” not only promotes the creation of new hair, but also reduces existing hair. It means growing healthy.
  • the hair loss is, for example, Androgenic Alopecia, Alopecia Areata, Androgenetic Alopecia, Telogen Effluvium, Traumatic Alopecia, Trichotillomania, Pressure Alopecia ( Pressure Alopecia), anagen alopecia, alopecia pityroides, Alopecia Syphlltiac, Alopecia Seborrhecia, symptomatic alopecia, cicatricial alopecia, congenital alopecia, etc.
  • hair growth refers to hair growing from the scalp
  • hair growth refers to lengthening of hair (i.e., hair growth)
  • hair growth is another term used in the art. It is used with the same meaning.
  • the composition is effective in improving hair loss caused by exogenous or endogenous factors.
  • the exogenous factors include various external factors, such as ultraviolet rays, and the endogenous factors are factors that occur over time and include cell death of dermal papilla cells caused by telomeres and oxidative stress due to cell function decline. can do.
  • hair growth or hair growth promotion means promoting the production and growth of hair and ultimately increasing the proportion of growth-phase hair in total hair.
  • promotion of hair growth or hair growth means suppressing hair loss caused by a decrease in the specific gravity of hair in the growth phase.
  • the composition is 0.001% to 80% by weight, for example, 0.01% to 60% by weight, 0.01% to 40% by weight, 0.01% to 30% by weight, 0.01% to 20% by weight, based on the total weight of the composition. %, 0.01% to 10% by weight, 0.01% to 5% by weight, 0.05% to 60% by weight, 0.05% to 40% by weight, 0.05% to 30% by weight, 0.05% to 20% by weight, 0.05% to 10% by weight, 0.05% to 5% by weight, 0.1% to 60% by weight, 0.1% to 40% by weight, 0.1% to 30% by weight, 0.1% to 20% by weight, 0.1% by weight % to 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of natural eutectic solvent extract.
  • the skin condition improvement effect for example, skin aging inhibition, wound improvement, skin barrier strengthening, skin wrinkle inhibition, or skin moisturizing effect is not sufficiently exerted.
  • the term "included as an active ingredient” means that the natural product extract of the present specification is added to the extent that it can exhibit the effects mentioned above, and various ingredients are added as sub-ingredients for drug delivery and stabilization, etc. to form various forms. This means that it includes being formulated.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may have, for example, an softening lotion, nourishing lotion, massage cream, nourishing cream, essence, pack, gel, ampoule, or skin-adhesive type cosmetic formulation.
  • Ingredients included in the cosmetic composition may include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the composition as an active ingredient, for example, conventional auxiliaries and carriers such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments, and fragrances. may include.
  • the composition may be a composition for external application to the skin.
  • the external skin agent may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal delivery patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the external skin agents include scalp tonic, scalp lotion, scalp cream, scalp serum, scalp essence, scalp ampoule, scalp treatment, scalp conditioner, scalp shampoo, scalp pack, hair tonic, hair lotion, hair cream, hair spray, and hair. Mousse, hair gel, hair conditioner, hair shampoo, hair rinse, hair pack, hair treatment, eyebrow hair growth agent, eyelash growth medicine, eyelash nutrition, pet shampoo, pet rinse, hand sanitizer, detergent soap, soap, disinfectant cleanser, It may be a wet tissue, mask, ointment, patch, or filter filler.
  • the skin external preparations include ingredients commonly used in external skin preparations such as cosmetics and medicines, such as aqueous ingredients, oil-based ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, and fragrances. , colorants, various skin nutrients, or a combination thereof may be appropriately mixed according to need.
  • the skin external preparations include metal sequestrants such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, belafamil, licorice extract, glablidin, and calin.
  • Hot water extract of fruit, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glytylitinic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts, vitamin C, magnesium ascorbate phosphate, ascorbate glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars such as trehalose can also be appropriately mixed.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and the lubricant may be magnesium stearate, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, disintegrant, binder, lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethylcellulose, sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate anhydride, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as an oral or parenteral dosage form.
  • Oral dosage forms may be granules, powders, solutions, tablets, capsules, dry syrup, or combinations thereof.
  • Parenteral dosage forms may be injectable.
  • the composition may be a health functional food composition.
  • the health functional food composition can be used alone or with other foods or food ingredients, such as the strain or its culture medium, and can be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw materials.
  • beverage compositions may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary beverages.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the health food composition also contains nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, and carbonated beverages. It may contain the carbonating agent used, or a combination thereof.
  • the health functional food composition may also contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, vegetable beverage, or a combination thereof.
  • Another aspect provides the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a cosmetic composition for improving skin condition, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid.
  • the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid.
  • Another aspect provides the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a skin external composition for improving skin condition, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid.
  • the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid.
  • Another aspect is the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of skin inflammatory diseases, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid. to provide.
  • the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid.
  • Another aspect is the use of a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent for the production of a pharmaceutical composition for preventing or treating hair loss, or promoting hair growth or hair growth, wherein the natural eutectic solvent includes an amino acid or a derivative thereof, and an organic acid. It provides a useful purpose.
  • specific details regarding hair loss, prevention, treatment, hair growth, hair growth, pharmaceutical compositions, natural eutectic solvents, extractions, natural products, amino acids, derivatives, organic acids, etc. are as described above.
  • Another aspect provides a method of preventing, ameliorating, or treating a condition of a subject comprising treating or administering an effective amount of the composition described above to the subject in need thereof.
  • the condition of the subject may be a skin-related condition or an inflammation-related condition.
  • administering As used herein, the terms “administering,” “introducing,” and “implanting” are used interchangeably and are used interchangeably to introduce a composition into an individual by a method or route that results in at least partial localization to the desired site according to one embodiment. It may refer to the arrangement of the composition according to one embodiment of.
  • Administration can be done by methods known in the art. Administration may be administered directly to the subject by any means, such as, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. You can. The administration may be administered systemically or locally.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be an individual in need of skin beauty improvement, for example, skin moisturizing, skin barrier strengthening, skin inflammation inhibition, and skin wrinkle improvement effects.
  • the administration of the composition according to one embodiment is 0.1 mg to 1,000 mg, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1 mg per day.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and those skilled in the art will Taking these factors into consideration, the dosage can be adjusted appropriately.
  • the frequency of administration can be once a day or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and can be administered at one or two or more locations, daily or at intervals of 2 to 5 days.
  • the number of days of administration can be from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after an appropriate period.
  • the dosage per kg is the same as for humans, or the above dosage is converted into, for example, the volume ratio (e.g., average value) of the organs (heart, etc.) between the target animal and human.
  • One dose can be administered.
  • another aspect includes mixing betaine and citric acid to prepare a mixture;
  • aminomethyl propanol, dipotassium phosphate, potassium phosphate, sodium anisate, sodium lactate, sodium carbonate, and urea is provided, comprising the step of adjusting pH by adding any one selected from the group consisting of.
  • another aspect provides a method for producing a natural product extract extracted with a natural eutectic solvent, comprising the step of preparing the extract by extracting the natural product with an amino acid, an organic acid, or a mixture thereof. Details of the natural product, natural eutectic solvent, etc. are as described above.
  • the natural product extract prepared according to the above method has an excellent oxygen and free radical scavenging rate, inhibits melanin synthesis, increases the expression of SPT, AQP3, and RNase7, thereby strengthening the skin barrier, improving skin moisturization, elasticity, and skin aging. It can be useful in improving skin conditions such as: Additionally, it can be usefully used to prevent, improve, or treat skin inflammatory diseases by reducing the expression of inflammatory cytokines.
  • the cosmetic composition according to one aspect not only has lower cytotoxicity compared to organic solvent extracts by extracting natural products using an eutectic solvent of betaine and citric acid, but also improves safety and stability by preventing discoloration of the extract, thereby improving skin condition. It can be usefully used in improving cosmetics and external skin preparations.
  • a natural eutectic solvent containing betaine as an amino acid and citric acid as an organic acid was prepared. Specifically, betaine and citric acid were mixed in equal amounts and stirred at 60100°C at 150 rpm for 2 hours to prepare a natural eutectic solvent with pH 2. .
  • a natural eutectic solvent with adjusted pH was prepared. Specifically, 1, 5, and 10 kg of 1M sodium citrate aqueous solution were added to the natural eutectic solvent of Preparation Example 1, respectively, to pH 3 (Preparation Example 2), pH 5 (Preparation Example 3), and pH 7 ( The natural eutectic solvent of Preparation Example 4) was prepared.
  • a natural eutectic solvent extract of Ficus carica fruit was prepared. Specifically, 1 kg of dried and ground fig fruit was extracted with the natural eutectic solvent of Preparation Example 1 for 6 hours. Afterwards, the fig fruit eutectic solvent extract was prepared by filtering with Whatman #5 filter paper.
  • a eutectic solvent extract of Selaginella tamariscine was prepared in the same manner as in Example 1, except that Selaginella tamariscine was used.
  • a eutectic solvent extract of germinated black rice was prepared in the same manner as in Example 1, except that germinated black rice (Oryza sativa) was used.
  • a Daemonorops draco eutectic solvent extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that Daemonorops draco was used.
  • Example 5 Preparation of eutectic solvent extract of fig fruit, Kwonbaek, germinated black rice, and Hyeolgal mixture
  • a eutectic solvent extract of the fig fruit, Kwonbaek, germinated black rice, and blood stem mixture was prepared in the same manner as in Example 1, except that the same amounts of fig fruit, Kwonbaek, germinated black rice, and blood stem were used.
  • a pH-adjustable fig fruit natural eutectic solvent extract was prepared in the same manner as Example 1, except that the natural eutectic solvent of Preparation Examples 2 to 4 was used.
  • a pH-adjustable Kwonbaek natural eutectic solvent extract was prepared in the same manner as Example 1, except that the natural eutectic solvent of Preparation Examples 2 to 4 was used.
  • a pH-adjusted germinated black rice eutectic solvent extract was used in the same manner as Example 1, except that the natural eutectic solvent of Preparation Examples 2 to 4 was used.
  • a pH-adjustable Hyegal natural eutectic solvent extract was prepared in the same manner as Example 1, except that the natural eutectic solvent of Preparation Examples 2 to 4 was used.
  • a eutectic solvent extract of fig fruit, kimchi, germinated black rice, and blood stem mixture was prepared in the same manner as Example 1, except that the natural eutectic solvent of Preparation Examples 2 to 4 was used.
  • a fig fruit ethanol extract was prepared in the same manner as in Example 1, except that 70% (v/v) ethanol was used.
  • An ethanol extract of Kwonbaek was prepared in the same manner as in Example 1, except that 70% (v/v) ethanol was used.
  • An ethanol extract of germinated black rice was prepared in the same manner as in Example 1, except that 70% (v/v) ethanol was used.
  • the content of phenol and flavonoid contained in the natural eutectic solvent extract according to one embodiment was confirmed. Specifically, 1 ml each of Examples 1 to 20 and Comparative Examples 1 to 4 were added to 10 ml of distilled water, and then 2 ml of Folin-Ciocalteu phenol reagent (Sigma) was added and mixed. After reacting at room temperature for 5 minutes, 2 ml of 20% sodium carbonate was added and reacted at room temperature for an additional hour. The total phenol content was determined by measuring absorbance at 680 nm. Gallic acid was used as an indicator material.
  • Example 1 148.9 59.1
  • Example 2 212.5 73.8
  • Example 3 163.5 51.5
  • Example 4 184.1 53.7
  • Example 6 204.4 49.7
  • Example 7 221.4 71.6
  • Example 8 220.1 57.2
  • Example 9 241.8 64.7
  • Example 10 254.6 88.4
  • Example 11 245.4 88.2
  • Example 12 254.7 63.4
  • Example 13 268.9 73.5
  • Example 14 264.1 68.9
  • Example 15 210.4 74.1
  • Example 17 229.5 87.1
  • Example 18 213.5 63.2
  • Example 19 253.6 72.5
  • Comparative Example 3 279.4 103.8 Comparative Example 4 234.5 99.4
  • the natural eutectic solvent according to one embodiment can maximize the active ingredient to be extracted at a specific pH.
  • the cytotoxicity of the natural eutectic solvent extract according to one embodiment to skin cells was confirmed. Specifically, 1x10 5 cells/mL of fibroblasts diluted in cell culture medium containing 10% FBS in DMEM were added to a 96-well plate and allowed to attach for 24 hours. Thereafter, Examples 1 to 20 and Comparative Examples 1 to 4 were diluted to an appropriate concentration, applied to each well, and cultured for 24 hours. After 24 hours, the medium was removed, and cell culture medium containing MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) solution (2.5 mg/ml) was added to each well.
  • MTT 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide
  • Example 1 0.25%
  • Example 2 0.25%
  • Example 3 0.25%
  • Example 4 0.25%
  • Example 5 0.25%
  • Example 6 One%
  • Example 7 2%
  • Example 8 One%
  • Example 9 One%
  • Example 10 2%
  • Example 11 2%
  • Example 12 One%
  • Example 13 2%
  • Example 14 2%
  • Example 15 One%
  • Example 16 2%
  • Example 17 2%
  • Example 18 One%
  • Example 19 2%
  • Example 20 2% Comparative Example 1 0.05% Comparative Example 2 0.05% Comparative Example 3 0.05% Comparative Example 4 0.05%
  • the natural eutectic solvent according to one embodiment has a low possibility of causing skin irritation and has a wide useful concentration range, so it can be used as a safe and efficient solvent.
  • the room temperature stability of the natural eutectic solvent extract according to one embodiment was confirmed. Specifically, samples were prepared by mixing 60% by weight of dipropylene glycol with Examples 1 to 20 and Comparative Examples 1 to 4. Thereafter, the samples were each placed in a straw container and stored in a thermostat maintained at a constant temperature of 45°C for 4 weeks to measure the degree of discoloration. The color change ( ⁇ E) of the sample was measured using a chromatometer (Minolta CR300), stability was evaluated, and the results are shown in Table 3 below.
  • Example 1 19.84 Example 2 28.16 Example 3 22.98 Example 4 25.47 Example 5 25.81 Example 6 15.34 Example 7 8.32 Example 8 9.11 Example 9 23.47 Example 10 8.05 Example 11 11.36 Example 12 15.54 Example 13 9.51 Example 14 9.17 Example 15 19.57 Example 16 8.97 Example 17 9.24 Example 18 18.47 Example 19 8.16 Example 20 8.03 Comparative Example 1 18.35 Comparative Example 2 13.84 Comparative Example 3 9.44 Comparative Example 4 15.21
  • Comparative Examples 1 to 4 had excellent extraction efficiency compared to Examples 1 to 20, but had problems with cytotoxicity and poor room temperature stability.
  • the natural eutectic solvent according to one embodiment can be usefully used as a solvent for the production of cosmetics and external skin preparations in that it improves problems of cytotoxicity and room temperature stability that may occur due to organic solvent extraction.
  • the antioxidant activity of the natural eutectic solvent extract according to one embodiment was confirmed using the NBT (Nitro Blue Tetrazolium) method. Specifically, 2.4 ml of 0.05M Na2CO3, 0.1 ml of 3mM xanthine solution, 0.1 ml of 3mM EDTA solution, 0.1 ml of BSA solution, and 0.1 ml of 0.72mM NBT solution were added to the Bayer bottle, and Examples 7, 10, and 13 above were added. , 16 and 19 and Comparative Examples 1 to 4 were added at 0.1% by weight, respectively, and left at 25°C for 10 minutes.
  • NBT Niro Blue Tetrazolium
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment has excellent antioxidant activity and can be usefully used to prevent or improve aging.
  • the antioxidant activity of a natural eutectic solvent extract according to one embodiment was confirmed using the DPPH method [2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical].
  • DPPH 2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical.
  • Examples 7, 10, 13, 16, and 19 and Comparative Examples 1 to 4 were diluted to a concentration of 0.1% and placed in a 96-well plate. Afterwards, DPPH prepared from 100 ⁇ l methanol solution was added to bring the total volume of the solution to 200 ⁇ l, left at 37°C for 30 minutes, and absorbance was measured at 560 nm. Free radical scavenging activity (%) was calculated using Equation 3 below, and the results are shown in Table 5 below.
  • BHT Butylated hydroxytoluene
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment has excellent antioxidant activity and can be usefully used to prevent or improve aging.
  • the effect of a natural eutectic solvent extract on alleviating cytotoxicity caused by ultraviolet rays was confirmed. Specifically, 1x10 5 cells/ml of fibroblasts were placed in a 96-well plate and allowed to attach for 24 hours. After 24 hours, Examples 7, 10, 13, 16, and 19 and Comparative Examples 1 to 4 were treated and cultured for an additional 24 hours under the same culture conditions. Afterwards, the medium was removed, each well was washed once with PBS, and 100 ⁇ l of PBS was added to each well.
  • UVB ultraviolet B
  • Bo Cell viability in wells without UV irradiation and sample treatment.
  • St Cell viability of wells irradiated with ultraviolet rays and treated with samples.
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment has excellent activity in protecting against cell damage caused by ultraviolet rays, and can be usefully used to prevent or improve aging.
  • the inflammation prevention, improvement, or treatment effect of the natural eutectic solvent extract according to one embodiment was confirmed.
  • 50 ⁇ l of hyaluronidase solution (type Kygigma, 400 U/ml) was added to each well of Examples 7, 10, 13, 16, and 19 and 100 ⁇ l of Comparative Examples 1 to 4 at 37°C.
  • 100 ⁇ l of enzyme activation solution (compound 48/80 CaCl 2 2H 2 O, Sigma, 0.1 mg/ml) was added and reacted at 37°C for an additional 20 minutes.
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment can be usefully used for preventing, improving, or treating inflammatory diseases.
  • the effectiveness of the natural eutectic solvent extract according to one embodiment to prevent, improve, or treat inflammation caused by ultraviolet rays was confirmed. Specifically, 3 ml of the keratinocyte cell line diluted to 3X10 5 cells/ml was dispensed onto a 35 ⁇ dish in medium supplemented with 10% FBS and cultured for 24 hours. Thereafter, irradiated with UVB 15 mJ/cm 2 and Examples 7, 10, 13, 16, and 19 and Comparative Examples 1 to 4 were diluted in a medium containing 2% FBS to a concentration that did not cause cytotoxicity, and then incubated for 24 hours. Additional culture was carried out during the period.
  • the product generated by PCR was electrophoresed on a 2% agarose gel to confirm gene expression using an image analyzer, and the density of each band was determined using the Image J program (NIH Image software, Maryland, USA). Madecassoside was used as a positive control.
  • the inhibition rate of expression of inflammatory cytokines and inflammatory mediators was calculated according to Equation 7 below, and the results are shown in Table 8 below.
  • Bo Production amount of inflammatory cytokines or inflammatory mediators in wells without UV irradiation or sample treatment.
  • Bt Production amount of inflammatory cytokines or inflammatory mediators in wells irradiated with ultraviolet rays and without sample treatment.
  • St Production amount of inflammatory cytokines or inflammatory mediators in wells irradiated with ultraviolet rays and treated with samples.
  • Examples 7, 10, 13, 16, and 19 had a significant inhibition rate of expression of inflammatory cytokines and inflammatory mediators compared to Comparative Examples 1 to 4 in which the same extraction target was extracted with an organic solvent. I was able to confirm that it was quite high.
  • the natural eutectic solvent extract inhibits the expression of inflammatory cytokines and/or inflammatory mediators, and can be usefully used in the prevention, improvement or treatment of inflammatory diseases caused by ultraviolet rays.
  • the whitening improving activity of the natural eutectic solvent extract according to one embodiment was confirmed. Specifically, L-tyrosine (Sigma) was dissolved in 0.05M sodium phosphate buffer solution (pH 6.8) to prepare a 0.1 mg/ml solution, and then 0.5 ml of the prepared solution was placed in a test tube. Here, 0.5 ml each of Examples 7, 10, 13, 16, and 19 and Comparative Examples 1 to 4 dissolved in 0.05M sodium phosphate buffer solution (pH 6.8) adjusted to an appropriate concentration were added and incubated for 10 minutes in a thermostat at 37°C. It was left for a minute.
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment can be usefully used to improve skin whitening.
  • melanoma cells B16F10 (accession number: ATCC 6323) were dispensed into a 6 -well plate at a concentration of 2 10, 13, 16, and 19 and Comparative Examples 1 to 4 were treated and cultured for 72 hours. Afterwards, the cells were removed with trypsin-EDTA, the number of cells was measured, and the cells were recovered by centrifugation. Quantification of intracellular melanin was performed by slightly modifying the method of Lotan [Lotan: Cancer Res., 40, 3345-3350 (1980)].
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment can be usefully used to improve skin whitening.
  • HaCaT cells a human keratinocyte cell line
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 11965-092
  • fetal bovine serum 10% fetal bovine serum
  • primers and cDNA for the target genes SPT (serine palmitoyl transferase), AQP3, a factor related to skin barrier strengthening and moisturization, and RNase7, an antibacterial peptide, and cDNA were added and used in a real-time PCR machine (Mic qPCR, Real-time polymerase chain reaction was performed on a biomolecular system (Australia). The expression level of the gene was finally analyzed through correction for the GAPDH gene, and the results are shown in Table 11 below.
  • Examples 7, 10, 13, 16, and 19 have ceramide synthase SPT, skin moisturizing, barrier strengthening, and It was confirmed that the expression of RNase7, a related AQP and skin antibacterial peptide, was significantly high.
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment can be usefully used to strengthen the skin barrier.
  • the skin wrinkle and moisturizing improvement activity of the natural eutectic solvent extract was confirmed. Specifically, 10% fetal bovine serum (FBS) was added to DMEM/F-12 (3:1) medium, and human dermal fibroblasts (Modern Tissue Technology, Korea) were cultured at a concentration of 1 ⁇ 10 4 cell/cm 2 . When the cells grew to about 70-80%, they were divided and sub-cultured at a ratio of 1:3, and the 3rd-4th subcultured cells were used for experiments.
  • FBS fetal bovine serum
  • human dermal fibroblasts Modern Tissue Technology, Korea
  • the fibroblasts were cultured at a concentration of 90% or more in a 48 well plate, and then Examples 7, 10, 13, 16, and 19 and Comparative Examples 1 to 4 were added at a concentration that did not cause cytotoxicity, and after 24 hours, The amount of procollagen released in the medium was measured using a procollagen type-1 C-peptide EIA kit (MK101, Takara, Japan). Ascorbic acid was used as a positive control.
  • the natural eutectic solvent extract according to one embodiment can be usefully used to prevent or improve skin wrinkles and moisturization.
  • the effectiveness of the natural eutectic solvent extract according to one embodiment to prevent or improve acne, sebum, or hair loss was confirmed. Specifically, after adding 0.1 ⁇ Ci of testosterone radiolabeled with 3H (tritium) to each microplate hole, Examples 7, 10, 13, 16, and 19, and Comparative Examples 1 to 4. Fibroblasts were inoculated and cultured to contain 10,000 cells. After culturing for 24 hours, the supernatant was obtained, and steroids were obtained with 1 ml of ethyl acetate-cyclohexane (1:1) extraction solvent. The steroid was placed on a thin layer chromatography plate and developed with a chloroform/methanol mixture (98/2 (v/v)).
  • the radioactivity of the points corresponding to testosterone and dihydrotestosterone (DHT) was measured using a densitometer to calculate the conversion rate, and the results were compared with the negative control group to obtain 5-alpha-reductase enzyme by Equation 10 below. The inhibition rate was evaluated.
  • the natural eutectic solvent extract inhibits the conversion of dihydrotestosterone by 5-alpha-reductase, and not only prevents or improves acne and sebum, but also prevents, improves or treats hair loss, or hair growth or hair growth. It can be useful for promotion.
  • a cream-type cosmetic composition containing the ingredients and contents shown in Table 14 below was prepared. Specifically, phase B of Table 14 below was heated and stored at 70°C, and then phase A was added and pre-emulsified. Afterwards, the mixture was uniformly emulsified using a homomixer and then slowly cooled to prepare a cosmetic composition. Unless otherwise stated herein, content is in weight percent.
  • the natural eutectic solvent natural product extract according to one embodiment can be usefully used to improve skin elasticity.
  • the skin wrinkle improvement effect of a cosmetic composition containing a natural eutectic solvent extract according to one embodiment was confirmed.
  • Formulation Examples 1, 5, and Comparative Formulation Example 1 of Experimental Example 14 were used in the same manner on the same subject. After producing a replica of silicone material, the formulation example 1, The skin wrinkle condition was measured after using 5 and Comparative Formulation Example 1. The measured values were expressed as an average after subtracting the parameter values before use from the values of each parameter after two months of use. The more negative the measured value, the higher the wrinkle improvement effect.
  • R4 Average value of the wrinkle contour's baseline minus the values of each peak and valley.
  • the natural eutectic solvent natural product extract according to one embodiment can be usefully used to improve skin wrinkles.
  • Formulations Examples 1 and 5 showed a significant increase in skin color brightness compared to Comparative Formulation Example 1. Specifically, in Formulation Example 5, in which the acidity of the natural eutectic solvent was adjusted to pH 5, it was confirmed that the change in skin color brightness significantly increased.
  • the natural eutectic solvent natural product extract according to one embodiment can be usefully used to improve skin whitening.

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Abstract

화장료 조성물에 관한 것으로, 천연물을 베타인 및 구연산의 공융 용매를 이용하여 추출함으로써 유기 용매 추출물과 비교하여 세포 독성이 낮을 뿐만 아니라, 추출물의 변색을 방지하여 안전성 및 안정성이 개선되었는 바, 피부 상태 개선용 화장품 및 피부 외용제로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

친환경 천연 공융 용매로 추출한 추출물을 포함하는 화장료 조성물
화장료 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 액상 추출에는 유기 용매가 사용된다. 유기 용매는 값이 싸고 추출 효율이 좋다는 장점이 있으나, 사용자의 건강에 해롭거나 또는 환경 오염의 문제를 야기할 수 있다는 문제점이 있다. 이에, 지속 가능한 발전에 대한 관심이 높아지며 유기 용매를 대체할 수 있는 추출 용매와 관련된 연구가 활발히 진행되고 있다.
그 중에서도 공융 용매(Eutectic solvent)가 대안으로 제시되고 있다. 공융 용매란 두 종류의 성분이 혼합되어 각 성분보다 더 낮은 녹는점을 나타내는 공융 혼합물이다. 공융 용매의 개발 단계 초기에는 이온성 액체(ionic liquids)를 활용하여 유기 용매의 대안으로 사용하였으나, 낮은 생분해성, 독성, 및 제조 공정 상 배출되는 오염 물질의 양 등에 의하여 환경 친화적인 용매로서 부적법하다는 보고가 있다. 이후, 종래 이온성 액체의 단점을 보완한 깊은 공융 용매(Deep eutectic solvent), 천연 공융 용매(Natural eutectic solvent) 등에 대한 연구가 진행되고 있다. 그러나, 깊은 공융 용매, 천연 공융 용매는 염화콜린(Choline chloride)과 같이 화장품에 사용될 수 없는 성분이 다수 포함되어 있을 뿐만 아니라, 높은 점도를 갖고, 공융 용매 제조 공정 중 용매가 변색되는 등의 문제점으로 인하여 화장품 및 피부외용제로 적용하기에 한계가 있다.
따라서, 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 친환경 천연 공융 용매를 개발할 필요가 있다.
일 양상은 친환경 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 친환경 천연 공융 용매를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 피부 외용제 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 피부 염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 탈모 예방 또는 치료, 또는 발모 또는 육모 촉진을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 친환경 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 조성물을 제공한다.
상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 아미노산 또는 이의 유도체는 예를 들어, 베타인, 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루타민, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소로이신, 라이신, 로이신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 티로신 등일 수 있다.
또한, 상기 유기산은 예를 들어, 구연산, 락트산, 말산, 말레산, 피루브산, 푸마르산, 석신산, 아세트산, 아코니트산, 타트르산, 아스코르브산, 말론산, 옥살산, 글루쿠론산, 뉴라민산, 시알산, 시킴산, 피트산, 갈락투론산, 이두론산, 히알루론산, 하이드록시시트르산, 락톤 유도체 등일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 천연 공융 용매는 베타인 및 구연산의 혼합물일 수 있다. 상기 베타인 및 구연산은 1:0.001 내지 10의 중량비로 혼합될 수 있다. 상기 베타인 및 구연산은 예를 들어, 1:0.001 내지 10, 1:001 내지 8, 1: 0.05 내지 7, 1:0.05 내지 5, 1:0.01 내지 10, 1:0.01 내지 6, 1:0.1 내지 4, 1:0.1 내지 3, 1:1 내지 10, 1:1 내지 4, 또는 1:1 내지 2의 중량비로 혼합될 수 있다. 이때, 상기 베타인 및 구연산의 혼합 중량비가 상기 범위 미만이거나 또는 상기 범위를 초과하는 경우, 베타인 및 구연산이 침전되거나, 공융 용매가 현탁해지거나 또는 변색되는 문제점이 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 천연 공융 용매는 pH 2.5 내지 pH 8일 수 있다. 일반적으로 베타인 및 구연산을 혼합하는 경우, pH 2.5 미만의 산성 용액이 제조된다. 산성 용매로 추출한 추출물은 산도가 낮기 때문에 피부에 적용시 자극을 유발하거나 피부 손상을 유발할 가능성이 높다. 따라서, 상기 베타인 및 구연산의 혼합물에, pH 조절제를 추가하여 천연 공융 용매의 pH를 2.5 내지 8로 조절할 수 있다. 상기 천연 공융 용매는 예를 들어, pH 2.5 내지 pH 8, pH 2.5 내지 pH 7.5, pH 3 내지 pH 7, pH 3 내지 pH 6.5, pH 3.5 내지 pH 6, pH 4 내지 pH 6 또는 pH 4.5 내지 pH 5.5일 수 있다. 이때, 상기 천연 공융 용매의 pH가 상기 범위 미만인 경우, 산도가 높아 피부 자극을 유발하는 문제점이 있으며, 상기 범위를 초과하는 경우, 천연물 추출 효율이 떨어지는 바, 활성 성분에 의한 피부 상태 개선 효과를 충분히 발휘할 수 없다는 문제점이 있다.
상기 pH 조절제는 염기 또는 완충제일 수 있으며, 예를 들어, 시트르산삼나트륨(sodium citrate), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 수산화칼륨(potassium hydroxide), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 아르기닌(arginine), 트로메타민(tromethamine), 트리에탄올아민(triethanol amine), 아미노메틸프로판올(aminomethyl propanol), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate), 포타슘포스페이트(potassium phosphate), 아니스산나트륨(sodium anisate), 젖산나트륨(sodium lactate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 요소(urea) 등이 있다.
상기 천연물은 무화과, 권백, 흑미, 혈갈, 검은콩, 능소화, 설련, 마가목, 화분, 물개구리밥, 향나무, 봉미초, 금낭화, 겨우살이, 돌나물, 정금, 상황버섯, 토마토, 어성초, 진피, 모란, 밤꽃, 칡, 호두로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 천연물 추출물은 건조된 천연물을 세절한 후 천연 공융 용매를 천연물 무게의 2배 내지 20배를 첨가하여 추출하는 것일 수 있다. 추출 온도는 30℃ 내지 100℃에서 수행되는 것일 수 있다. 추출 시간은 1시간 내지 10시간 동안 수행되는 것일 수 있다. 추출 방법은 냉침, 초음파 추출 또는 환류 냉각 추출 방법 등을 이용할 수 있다. 추출 횟수는 1회 내지 5회 반복 추출하는 것일 수 있다.
일 실시예에서는 베타인 및 구연산을 혼합하여 제조한 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물이 유기용매로 추출한 천연물 추출물과 비교하여 안전성 및 안정성이 향상되었을 뿐만 아니라, 활성산소 및 자유라디컬 소거능이 우수하며 자외선에 의한 세포 손상 방어 효과가 우수한 것을 확인하였다. 또한, 상기 천연 공융 용매로 추출한 천연물 주출물이 유기 용매로 추출한 천연물 추출물과 비교하여 히알루로니다아제, 염증성 사이토카인 및/또는 염증 매개 물질의 발현을 유의하게 억제하며, 티로시나제 활성 저해 및 멜라닌 합성을 억제할 뿐만 아니라 피부 장벽 또는 보습, 탄력 관련 인자의 발현을 증가시키고, 여드름 또는 피지, 또는 탈모 관련 인자의 발현을 억제하는 것을 확인하였다.
상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 주름, 탄력, 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 여드름 또는 피지 억제 또는 개선일 수 있다. 또한, 탈모의 예방, 개선 또는 치료, 또는 발모 또는 육모 촉진일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.
상기 조성물은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.
상기 노화는 활성산소에 의한 노화 또는 광노화일 수 있다.
상기 "활성산소"는 정상적인 대사 과정, 자외선, 살충제와 같은 유해 독성, 담배 연기, 대기 오염 등에 의해 생성된다. 활성산소는 피부 세포 및 조직 손상을 주도하여 피부 항산화 방어망을 파괴함으로써 지질 과산화, 단백질 산화, 세포간질 성분을 파괴시키는 단백질 분해효소의 활성화, 탄력 섬유인 콜라겐과 엘라스틴의 사슬 절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬의 절단, 멜라닌 생성반응 촉진, DNA 산화와 같은 생체 구성 성분들의 손상을 야기한다.
상기 "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.
본 명세서에서 용어 "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증일 수 있다. 용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.
상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 염증성 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "탈모(Alopecia)"는 두피로부터 모발이 탈락하는 현상 또는 모발이 성기거나 가늘어지는 상태를 의미하며, "탈모 예방 또는 개선"은 새로운 모발의 생성을 촉진할 뿐만 아니라 기존 모발이 건강하게 자라도록 하는 것을 의미한다.
상기 탈모는 예를 들어, 안드로겐성 탈모증(Androgenic alopecia), 원형 탈모증(Alopecia Areata), 유전성 안드로겐 탈모증(Androgenetic Alopecia), 휴지기 탈모증(Telogen Effluvium), 외상성 탈모증, 발모벽(Trichotillomania), 압박성 탈모증(Pressure Alopecia), 생장기 탈모증, 비강성 탈모증, 매독성 탈모증(Alopecia Syphlltiac), 지루 탈모증(Alopecia Seborrhecia), 증후성 탈모증, 반흔성 탈모증, 선천성 탈모증 등일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "발모"는 두피에서 모발이 나는 것을 의미하고, "육모"는 모발의 길이가 길어지는 것(즉, 모발 성장)을 의미하며 당업계에서 이용하는 또 다른 용어인 "양모"와 동일한 의미로 사용된다.
상기 조성물은 외인성 또는 내인성 요인에 유발되는 탈모 개선에 효과적이다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인으로서, 예를 들어, 자외선 등이 있고, 상기 내인성 요인은 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인으로 텔로미어에 의한 모유두세포의 세포사와 세포 기능 저하에 따른 산화 스트레스 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "발모 또는 육모 촉진"은 모발의 생성 및 성장을 촉진하여 궁극적으로 전체 모발에서 성장기 모발의 비중을 증가시키는 것을 의미한다. 또한, 상기 발모 또는 육모 촉진은 성장기 모발의 비중이 감소함에 따라 유발되는 탈모를 억제하는 것을 의미한다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 천연 공융 용매 추출물을 포함할 수 있다. 이때, 상기 추출물의 함량이 상기 범위 미만인 경우, 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 노화 억제, 상처 개선, 피부 장벽 강화, 피부 주름 억제, 또는 피부 보습 효과가 충분히 발휘되지 않는다는 문제점이 있다.
본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 천연물 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 또한, 상기 피부외용제는 두피 토닉, 두피 로션, 두피 크림, 두피 세럼, 두피에센스, 두피 앰플, 두피 트리트먼트, 두피 컨디셔너, 두피 샴푸, 두피 팩, 헤어토닉, 헤어로션, 헤어크림, 헤어스프레이, 헤어무스, 헤어젤, 헤어컨디셔너, 헤어샴푸, 헤어 린스, 헤어팩, 헤어트리트먼트, 눈썹발모제, 속눈썹발모제, 속눈썹영양제, 애완동물용 샴푸, 애완동물용 린스, 손 세정제, 세제 비누, 비누, 소독청결제, 물티슈, 마스크, 연고제, 패치 또는 필터 충진제 등일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공힌다. 상기 용도에 있어서, 피부 상태, 개선, 화장료 조성물, 천연 공융 용매, 추출, 천연물, 아미노산, 유도체, 유기산 등에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
다른 양상은 피부 상태를 개선하기 위한 피부 외용제 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 피부 상태, 개선, 피부 외용제 조성물, 천연 공융 용매, 추출, 천연물, 아미노산, 유도체, 유기산 등에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
다른 양상은 피부 염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 피부 염증, 예방, 치료, 약학적 조성물, 천연 공융 용매, 추출, 천연물, 아미노산, 유도체, 유기산 등에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
다른 양상은 탈모 예방 또는 치료, 또는 발모 또는 육모 촉진을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도를 제공한다. 상기 용도에 있어서, 탈모, 예방, 치료, 발모, 육모, 약학적 조성물, 천연 공융 용매, 추출, 천연물, 아미노산, 유도체, 유기산 등에 대한 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 염증 억제, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
또한, 다른 양상은 베타인 및 구연산을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계; 상기 혼합물에 시트르산삼나트륨(sodium citrate), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 수산화칼륨(potassium hydroxide), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 아르기닌(arginine), 트로메타민(tromethamine), 트리에탄올아민(triethanol amine), 아미노메틸프로판올(aminomethyl propanol), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate), 포타슘포스페이트(potassium phosphate), 아니스산나트륨(sodium anisate), 젖산나트륨(sodium lactate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 및 요소(urea)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나를 추가하여 pH를 조절하는 단계를 포함하는, 천연 공융 용매의 제조방법을 제공한다.
또한, 다른 양상은 천연물을 아미노산, 유기산 또는 이들의 혼합물로 추출하여 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 제조방법을 제공한다. 상기 천연물, 천연 공융 용매 등의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
상기 방법에 따라 제조된 천연물 추출물은 활성산소 및 자유라디컬 소거율이 우수하고, 멜라닌 합성을 억제하여, SPT, AQP3, RNase7의 발현을 증가시킴으로써, 피부 장벽 강화, 피부 보습, 탄력, 피부 노화 개선 등과 같은 피부 상태 개선에 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 염증성사이토카인의 발현을 감소시킴으로써 피부 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
일 양상에 따른 화장료 조성물은 천연물을 베타인 및 구연산의 공융 용매를 이용하여 추출함으로써 유기 용매 추출물과 비교하여 세포 독성이 낮을 뿐만 아니라, 추출물의 변색을 방지하여 안전성 및 안정성이 개선되었는 바, 피부 상태 개선용 화장품 및 피부 외용제로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
제조예 1. 아미노산 및 유기산을 포함하는 천연 공융 용매의 제조
아미노산으로서 베타인(betaine) 및 유기산으로서 구연산(citric acid)를 포함하는 천연 공융 용매를 제조하였다. 구체적으로, 베타인과 구연산을 동일한 함량으로 혼합한 후, 60100 ℃에서 150 rpm으로 2시간 동안 교반하여 pH 2인 천연 공융 용매를 제조하였다. .
제조예 2~4. pH가 조절된 천연 공융 용매의 제조
pH가 조절된 천연 공융 용매를 제조하였다. 구체적으로, 상기 제조예 1의 천연 공융 용매에 1M 시트르산 나트륨(sodium citrate) 수용액을 각각 1, 5 및 10 ㎏씩 첨가하여 pH 3(제조예 2), pH 5(제조예 3) 및 pH 7(제조예 4)의 천연 공융 용매를 제조하였다.
[실시예]
실시예 1. 무화과 열매 공융 용매 추출물의 제조
무화과 열매(Ficus carica fruit) 천연 공융 용매 추출물을 제조하였다. 구체적으로, 건조 및 분쇄한 무화과 열매 1㎏을 제조예 1의 천연 공융 용매로 6시간 동안 추출하였다. 이후, 와트만(Whatman) #5 여과지로 여과하여 무화과 열매 공융 용매 추출물을 제조하였다.
실시예 2. 권백 공융 용매 추출물의 제조
권백(Selaginella tamariscine)을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 권백 공융 용매 추출물을 제조하였다.
실시예 3. 발아 흑미 공융 용매 추출물의 제조
발아 흑미(Oryza sativa)를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발아 흑미 공융 용매 추출물으 제조하였다.
실시예 4. 혈갈 공융 용매 추출물의 제조
혈갈(Daemonorops draco)을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 혈갈 공융 용매 추출물을 제조하였다.
실시예 5. 무화과 열매, 권백, 발아 흑미 및 혈갈 혼합물의 공융 용매 추출물의 제조
무화과 열매, 권백, 발아 흑미, 및 혈갈을 동일한 함량으로 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 무화과 열매, 권백, 발아 흑미 및 혈간 혼합물의 공융 용매 추출물을 제조하였다.
실시예 6~8. pH 조절형 무화과 열매 천연 공융 용매 추출물의 제조
제조예 2~4의 천연 공융 용매를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 pH 조절형 무화과 열매 천연 공융 용매 추출물을 제조하였다.
실시예 9~11. pH 조절형 권백 천연 공융 용매 추출물의 제조
제조예 2~4의 천연 공융 용매를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 pH 조절형 권백 천연 공융 용매 추출물을 제조하였다.
실시예 12~14. pH 조절형 발아 흑미 공융 용매 추출물의 제조
제조예 2~4의 천연 공융 용매를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 pH 조절형 발아 흑미 공융 용매 추출물을 사용하였다.
제조예 15~17. pH 조절형 혈갈 천연 공융 용매 추출물의 제조
제조예 2~4의 천연 공융 용매를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 pH 조절형 혈갈 천연 공융 용매 추출물을 제조하였다.
제조예 18~20. pH 조절형 무화과 열매, 권백, 발아 흑미 및 혈갈 혼합물의 공융 용매 추출물의 제조
제조예 2~4의 천연 공융 용매를 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 무화과 열매, 권백, 발아 흑미 및 혈간 혼합물의 공융 용매 추출물을 제조하였다.
[비교예]
비교예 1. 무화과 열매 에탄올 추출물의 제조
70%(v/v) 에탄올을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 무화과 열매 에탄올 추출물을 제조하였다.
비교예 2. 권백 에탄올 추출물의 제조
70%(v/v) 에탄올을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 권백 에탄올 추출물을 제조하였다.
비교예 3. 발아 흑미 에탄올 추출물의 제조
70%(v/v) 에탄올을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 발아 흑미 에탄올 추출물을 제조하였다.
비교예 4. 혈갈 에탄올 추출물의 제조
70%(v/v) 에탄올을 사용하였다는 점을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 혈갈 에탄올 추출물을 제조하였다.
[실험예]
실험예 1. 활성 성분 함량 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물에 포함된 페놀 및 플라보노이드의 함량을 확인하였다. 구체적으로, 증류수 10 ㎖에 상기 실시예 1~20 및 비교예 1~4를 각각 1 ㎖씩 첨가한 후, 2 ㎖의 Folin-Ciocalteu phenol reagent(Sigma)를 첨가하여 혼합하였다. 이후, 실온에서 5분 동안 반응시킨 뒤, 20% 소듐 카보네이트(Sodium Carbonate) 2 ㎖를 첨가하여 상온에서 1시간 동안 추가로 반응시켰다. 680 ㎚에서 흡광도를 측정하여 총 페놀 함량을 측정하였다. 지표물질로 갈릭산(gallic acid)를 사용하였다.
다음으로, 상기 실시예 1~20 및 비교예 1~4 각각 1.5 ㎖과 동량의 메탄올에 용해된 2% AlCl3H2O를 혼합한 뒤, 상온에서 10분 동안 반응시켰다. 이후, 367 ㎚에서 흡광도를 측정하여 총 플라보노이드 함량을 측정하였다. 지표 물질로 카테킨(catechin)을 사용하였다.
총 폴리페놀 함량
(mg/kg of powder)		 총 플라보노이드 함량
(mg/kg of powder)
실시예 1 148.9 59.1
실시예 2 212.5 73.8
실시예 3 163.5 51.5
실시예 4 184.1 53.7
실시예 5 189.9 56.5
실시예 6 204.4 49.7
실시예 7 221.4 71.6
실시예 8 220.1 57.2
실시예 9 241.8 64.7
실시예 10 254.6 88.4
실시예 11 245.4 88.2
실시예 12 254.7 63.4
실시예 13 268.9 73.5
실시예 14 264.1 68.9
실시예 15 210.4 74.1
실시예 16 238.6 94.9
실시예 17 229.5 87.1
실시예 18 213.5 63.2
실시예 19 253.6 72.5
실시예 20 240.7 69.4
비교예 1 255.8 73.4
비교예 2 262.3 102.5
비교예 3 279.4 103.8
비교예 4 234.5 99.4
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, pH가 조절된 실시예 6~20의 경우, pH가 조절되지 않은 실시예 1~5와 비교하여 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, pH5로 조절된 실시예 7, 10, 16 및 19에서 pH3 또는 pH7로 조절된 천연 공융 용매와 비교하여 총 폴리페놀 및 총 플라보노이드 함량이 높은 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매는 특정 pH에서 추출 대상의 활성 성분을 극대화할 수 있다.
실험예 2. 세포독성 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 피부 세포에 대한 세포 독성을 확인하였다. 구체적으로, 96-웰 플레이트에 DMEM에 10% FBS가 첨가된 세포 배양 배지에 희석된 섬유아세포(fibroblast)를 1x105 cells/mL개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 이후, 실시예 1~20 및 비교예 1~4를 적절한 농도로 희석하여 각 웰에 각각 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간 경과 후, 배지를 제거하고, 각 웰 당 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 용액(2.5㎎/㎖)이 함유된 세포배양 배지 200㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 100㎕씩 넣어주었다. 5분간 진탕하여 세포를 용해시킨 후, 마이크로플레이트 판독기에서 565 ㎚ 흡광도를 측정하였다. 하기 수학식 1에 의해 세포생존율(%)을 정하였으며, 세포의 생존에 영향을 미치지 않는 시료의 농도를 결정하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000001
Bo: 세포 배양 배지만을 발색 반응한 웰의 565 ㎚에서의 흡광도
Bt: 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565 ㎚에서의 흡광도
S: 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565 ㎚에서의 흡광도
100% 세포 생존 농도
실시예 1 0.25%
실시예 2 0.25%
실시예 3 0.25%
실시예 4 0.25%
실시예 5 0.25%
실시예 6 1%
실시예 7 2%
실시예 8 1%
실시예 9 1%
실시예 10 2%
실시예 11 2%
실시예 12 1%
실시예 13 2%
실시예 14 2%
실시예 15 1%
실시예 16 2%
실시예 17 2%
실시예 18 1%
실시예 19 2%
실시예 20 2%
비교예 1 0.05%
비교예 2 0.05%
비교예 3 0.05%
비교예 4 0.05%
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, 비교예 1~4와 비교하여 실시예 1~20에서 100% 세포 생존 농도가 5배 내지 40배 이상 높은 것을 확인할 수 있었다. 특히, 천연 공융 용매의 pH 3 내지 pH 7의 경우, pH 2.5와 비교하여 세포 생존 농도가 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, pH가 조절된 실시예 6~20의 경우, pH가 증가함에 따라 세포 독성이 감소하는 경향을 나타내었으며, 특히 pH5로 조절한 천연 공융 용매 추출물에서 100% 세포 생존 농도가 가장 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매는 피부 자극의 유발 가능성이 작고, 유용 농도의 범위가 넓은 바, 안전하고 효율적인 용매로 사용할 수 있다.
실험예 3. 상온 안정성 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 상온 안정성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1~20 및 비교예 1~4에 디프로필렌글리콜 60 중량%를 혼합하여 시료를 제조하였다. 이후, 상기 시료를 초가 용기에 각각 담은 뒤, 45℃로 일정하게 유지되는 항온조에서 4주 동안 보관하여 변색 정도를 측정하였다. 시료의 색상 변화는 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 색의 변화(ㅿE)를 측정한 후, 안정성을 평가하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
ㅿE
실시예 1 19.84
실시예 2 28.16
실시예 3 22.98
실시예 4 25.47
실시예 5 25.81
실시예 6 15.34
실시예 7 8.32
실시예 8 9.11
실시예 9 23.47
실시예 10 8.05
실시예 11 11.36
실시예 12 15.54
실시예 13 9.51
실시예 14 9.17
실시예 15 19.57
실시예 16 8.97
실시예 17 9.24
실시예 18 18.47
실시예 19 8.16
실시예 20 8.03
비교예 1 18.35
비교예 2 13.84
비교예 3 9.44
비교예 4 15.21
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, 비교예 1~4의 유기 용매 추출물과 비교하여 실시예 6~20의 경우, 상온에서의 색상 변화가 비교적 적은 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, pH5로 조절된 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물(실시예 7, 10, 14, 16 및 19)에서 색상 변화가 적은 바, 가장 높은 안정성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
상기 실험예 1 내지 3에 의할 때, 비교예 1~4는 실시예 1~20과 비교하여 추출 효율이 우수하였으나, 세포 독성 및 상온 안정성이 떨어지는 문제가 있다. 그러나, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매는 유기 용매 추출에 의해 발생할 수 있는 세포 독성, 상온 안정성의 문제를 개선하였다는 점에서, 화장품 및 피부외용제의 제조를 위한 용매로 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 4. 항산화 활성 확인(1)
상기 실험예 3의 결과에 따라, 이하의 실험예에서는 pH 5의 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 활성 실험을 수행하였다.
NBT(Nitro Blue Tetrazolium) 법을 이용하여 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 항산화 활성을 확인하였다. 구체적으로, 바이엘 병에 0.05M의 Na2CO3 2.4㎖, 3mM의 잔틴 용액 0.1㎖, 3mM의 EDTA 용액 0.1㎖, BSA 용액 0.1㎖, 및 0.72mM의 NBT 용액 0.1㎖를 가하고 상기 실시예 7, 10, 13, 16 및 19와 비교예 1~4를 0.1 중량%로 각각 첨가한 후 25 ℃에서 10 분 동안 방치하였다. 이후, 잔틴옥시다제 용액 0.1 ㎖를 첨가하여 빠르게 교반한 뒤, 25 ℃에서 20 분 동안 배양하고, 6 mM의 CuCl2용액 0.1 ㎖을 가하여 반응을 정지킨 후, 560 ㎚에서의 흡광도(St)를 측정하였다. 음성대조군으로는 상기 실시예의 추출물 대신 증류수(Bt)를 사용하였다. 시료 용액의 블랭크(Blank)는 반응 효소인 잔틴옥시다제 용액 대신 증류수(Bo)를 사용하였으며, 측정 결과를 하기 수학식 2에 의하여 산출하였다. 양성대조군으로 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 사용하였다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000002
St: 시료의 효소 반응 후 560 ㎚에서의 흡광도
Bt: 음성대조군의 효소 반응 후 560 ㎚에서의 흡광도
So: 효소 무첨가 시료의 효소 반응 전 560 ㎚에서의 흡광도
Bo: 효소 무첨가 음성대조군의 효소 반응 전 560 ㎚에서의 흡광도
활성산소 소거율(항산화 효과, %)
양성대조군 86.15
실시예 7 74.57
실시예 10 91.15
실시예 13 83.32
실시예 16 90.47
실시예 19 90.07
비교예 1 70.16
비교예 2 88.64
비교예 3 79.57
비교예 4 82.45
그 결과, 표 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 활성산소 소거율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 항산화 활성이 우수한 바, 노화 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 5. 항산화 활성 확인(2)
DPPH법[2,2-Di(4-tert-octylphenyl)-1-picrylhydrazyl free radical]을 이용하여 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 항산화 활성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4를 0.1% 농도로 희석한 뒤, 96-웰 플레이트에 넣어주었다. 이후, 100 ㎕ 메탄올 용액으로 제조된 DPPH를 첨가하여 용액의 총 부피가 200 ㎕가 되도록 한 뒤 37℃에서 30분간 방치한 후, 560 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 자유라디컬 소거활성(%)은 하기 수학식 3에 의하여 산출하였고, 그 결과를 하기 표 5에 나탸내었다. 양성대조군으로 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 사용하였다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000003
A: 무처리 대조군 웰의 흡광도
B: 실험군 웰의 흡광도
자유라디컬 소거율(항산화 효과, %)
양성대조군 81.33
실시예 7 70.51
실시예 10 89.67
실시예 13 81.35
실시예 16 74.51
실시예 19 88.87
비교예 1 61.34
비교예 2 78.24
비교예 3 69.47
비교예 4 66.50
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 자유라이컬 소거율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 항산화 활성이 우수한 바, 노화 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 6. 자외선에 의한 피부세포 방어 효과 확인
일 구쳬예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 자외선에 의한 세포 독성 완화 효과를 확인하였다. 구체적으로, 섬유아세포(fibroblast)를 96-웰 플레이트에 1x105cells/㎖ 개씩 넣고 24시간 동안 부착시켰다. 24시간 후 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4를 처리하여 동일한 배양조건에서 24시간 동안 추가로 배양하였다. 그 후 배지를 제거하고 각 웰을 PBS로 1회 세척한 뒤, 각 웰에 100 ㎕의 PBS를 넣었다. 이후, 자외선 B(UVB) 램프(Model: F15T8, UV B 15W, Sankyo Dennki사, Japan)를 이용하여 자외선 10 mJ/㎠를 조사한 후 PBS를 덜어내고 10% FBS가 첨가된 DMEM 200 ㎕을 첨가하였다. 여기에 각각의 시료를 세포독성을 나타내지 않는 농도로 처리한 후 24시간 동안 배양하였다. 24시간이 지나면 배지를 제거하고, 각 웰 당 세포배양 배지를 함유하는 MTT 용액(2.5㎎/㎖) 200 ㎕를 넣은 후 2시간 동안 37℃, CO2 배양기에서 배양하였다. 배지를 제거하고 DMSO(Dimethyl sulfoxide)을 100 ㎕씩 넣어준 뒤, 2분간 진탕하여 세포를 용해하고 마이크로플레이트 판독기에서 565 ㎚ 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율(%) 및 자외선에 의한 세포독성 완화율을 각각 하기 수학식 4 및 수학식 5에 의하여 산출하였고, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000004
Bo: 세포 배양 배지만을 발색 반응한 웰의 565 ㎚에서의 흡광도
Bt: 시료를 처리하지 않고 발색 반응한 웰의 565 ㎚에서의 흡광도
St: 시료를 처리하고 발색 반응한 웰의 565 ㎚에서의 흡광도
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000005
Bo: 자외선 조사 및 시료 처리하지 않은 웰의 세포 생존율
Bt: 자외선 조사하고, 시료 처리 하지 않은 웰의 세포 생존율
St: 자외선 조사하고, 시료 처리한 웰의 세포 생존율
세포독성 완화율(%)
실시예 7 25.9
실시예 10 28.5
실시예 13 32.7
실시예 16 30.1
실시예 19 35.4
비교예 1 12.8
비교예 2 11.5
비교예 3 14.6
비교예 4 11.1
그 결과, 표 6에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 세포독성 완화율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 자외선에 의한 세포 손상 방어 활성이 우수한 바, 노화 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 7. 염증유발관련 효소 활성 억제 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 염증 예방, 개선 또는 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4 100 ㎕에 히알루로니디아제 용액(type 쿞igma, 400 U/㎖) 50 ㎕를 각각의 웰에 넣고 37℃에서 20분 동안 반응시킨 후, 효소활성화용액(compound 48/80 CaCl22H2O, Sigma, 0.1㎎/㎖)을 100 ㎕를 첨가하고 37℃에서 20분 동안 추가로 반응시켰다. 이후, 히알루론산(hyaluronic acid) 용액(0.4㎎/㎖)을 250 ㎕ 넣고 37℃에서 40분 동안 반응시킨 뒤, 0.4N NaOH 100 ㎕를 넣어 반응을 종결시켰다. 포타슘보레이트 용액을 100 ㎕ 첨가하여 95℃에서 3분 동안 반응시키고 냉각시킨 다음 ρ-디메틸아미노벤즈알데히드 용액을 3 ㎎ 넣고 37℃에서 20분 동안 추가로 반응시킨 후 발색시켰다. 이후, 585㎚에서 흡광도를 측정하여 히알루로니디아제 활성 저해율을 측정하였다. 양성대조군으로 유용성 감초 추출물을 사용하였다. 히알루로니다아제의 활성 저해율(%)은 하기 수학식 6에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000006
A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 효소 활성
B: 시료를 첨가한 웰의 효소 활성
히알루로니다아제 활성 저해율(%)
양성대조군 78.6
실시예 7 65.2
실시예 10 74.1
실시예 13 59.2
실시예 16 62.7
실시예 19 66.8
비교예 1 53.7
비교예 2 43.4
비교예 3 46.7
비교예 4 41.3
그 결과, 표 7에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 히알루로니다아제 활성 저해율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 8. 자외선에 의한 염증성 사이토카인 억제 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 자외선에 의한 염증 예방, 개선 또는 치료 효과를 확인하였다. 구체적으로, 10%의 FBS가 첨가된 배지에 35φ dish에 3X105 cells/ml로 희석한 각질형성세포주를 3 ml씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후, UVB 15 mJ/cm2로 조사하고 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4를 세포독성이 나타나지 않는 농도로 FBS 2% 함유된 배지에 희석한 후 24시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후 RNeasy mini kit (Qiagen, Hilden)을 이용하여 총 RNA를 추출하고, 1㎍의 총 RNA를 oligo (dT)15 primer, dNTP (0.5uM), 1 unit RNase 억제제 및 4 unit Omniscript reverse transcriptase(Qiagen, Hilden, Germany)로 37℃에서 60 분, 93℃에서 5분 동안 가열 후, 반응을 중지시킴으로써 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA로부터 IL-1α, TNF-α, IL-1β, IL-6, COX-2, GAPDH를 증폭하기 위해 PCR을 실시하였다. PCR에 의하여 생성된 산물을 2% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 유전자의 발현을 image analyzer로 확인하였으며, 각 밴드의 밀도는 Image J program (NIH Image software, Maryland, USA)을 이용하였다. 양성대조군으로 마데카소사이드를 사용하였다. 염증성사이토카인 및 염증매개물질의 발현 억제율을 하기 수학식 7에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000007
Bo: 자외선 조사 및 시료 처리하지 않은 웰의 염증성사이토카인 또는 염증매개물질의 생성량
Bt: 자외선 조사하고, 시료 처리 하지 않은 웰의 염증성사이토카인 또는 염증매개물질의 생성량
St: 자외선 조사하고, 시료 처리한 웰의 염증성사이토카인 또는 염증매개물질의 생성량
염증사이토카인 발현 억제율(%) 염증매개물질 발현 억제율(%)
IL-1α IL-1β IL-6 TNF-α COX-2
양성대조군 32 31 21 44 54
실시예 7 44 37 45 56 64
실시예 10 40 42 50 58 57
실시예 13 34 42 28 63 55
실시예 16 37 41 34 53 56
실시예 19 48 52 41 54 63
비교예 1 25 21 25 36 37
비교예 2 29 32 32 45 43
비교예 3 27 29 24 43 48
비교예 4 23 27 29 41 40
그 결과, 표 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 염증성사이토카인 및 염증매개물질의 발현 억제율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 염증성사이토카인 및/또는 염증매개물질의 발현을 억제하는 바, 자외선에 의한 염증 질환의 예방, 개선 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 9. 티로시나제 활성 억제 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 미백 개선 활성을 확인하였다. 구체적으로, L-티로신(Sigma)을 0.05M 인산나트룸 완충용액(pH 6.8)에 용해하여 0.1㎎/㎖ 용액으로 제조한 후, 제조된 용액 0.5 ㎖를 시험관에 넣었다. 여기에 0.05M 인산나트륨 완충 용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4를 각각 0.5 ㎖씩 추가하고 37℃ 항온기에서 10분간 방치하였다. 이후, 200 unit/㎖ 티로시나제 0.5 ㎖를 첨가하고 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤, 얼음 위에 놓아 급냉시켜 반응을 중지시켰다. 분광광도계를 파장 475 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로 완충용액 0.5 ㎖를 사용하였고, 양성대조군으로 0.05M 인산나트륨 완충 용액(pH 6.8)에 적당한 농도로 조절하여 용해한 알부틴 용액을 사용하였다. 티로시나제에 대한 저해율(%)을 하기 수학식 8에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 9에 나타내었다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000008
A: 시료를 첨가한 웰의 반응 전 흡광도
B: 시료를 첨가한 웰의 반응 후 흡광도
C: 시료를 첨가하지 않은 웰의 반응 전 흡광도
D: 시료를 첨가하지 않은 웰의 반응 후 흡광도
티로시나제 활성 저해율(%)
양성대조군 92.4
실시예 7 64.1
실시예 10 56.8
실시예 13 73.1
실시예 16 68.9
실시예 19 63.3
비교예 1 49.7
비교예 2 51.2
비교예 3 62.7
비교예 4 52.4
그 결과, 표 9에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 티로시나제 활성 저해율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 피부 미백 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 10. 멜라닌 합성 억제 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 미백 개선 활성을 확인하였다. 구체적으로, 멜라노마 세포인 B16F10(기탁번호: ATCC 6323)를 6웰 플레이트에 각 웰당 2 x 106 cells/㎖ 농도로 분주하고 세포를 부착시킨 후 독성을 유발하지 않는 농도로 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이후, 세포를 트립신(trypsin)-EDTA로 떼어낸 후 세포 수를 측정한 다음 원심분리하여 세포를 회수하였다. 세포 내 멜라닌의 정량은 로탄[Lotan: Cancer Res., 40, 3345- 3350(1980)]의 방법을 약간 변형하여 실시하였다. 셀 펠릿을 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 후 균질화 완충액(50mM 소듐 포스페이트, pH 6.8, 1% Triton X-100, 2mM PMSF(phenyl methane sulphonyl fluoride)) 1 ㎖를 첨가하여 5분간 와류하여 세포를 파쇄하였다. 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 세포 여액에 1N NaOH 10% DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 첨가하여 추출된 멜라닌을 용해하였다. 이후, 마이크로 플레이트 판독기로 405 ㎚에서 멜라닌의 흡광도를 측정한 뒤, 멜라닌을 정량하여 시료의 멜라닌 생성 저해율(%)을 측정하였다. 멜라닌 생성 저해율을 하기 수학식 9에 의하여 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다. 양성대조군으로 알부틴을 사용하였다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000009
A: 시료를 첨가하지 않은 웰의 멜라닌 양
B: 시료를 첨가한 웰의 멜라닌 양
멜라닌 생성 저해율(%)
양성대조군 59.4
실시예 7 65.3
실시예 10 54.5
실시예 13 38.5
실시예 16 48.3
실시예 19 61.1
비교예 1 45.3
비교예 2 35.4
비교예 3 27.6
비교예 4 31.1
그 결과, 표 10에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 멜라닌 생성 저해율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 피부 미백 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 11. 피부 장벽 강화 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 피부 장벽 강화 효과를 확인하였다. 구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 11965-092)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃ 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 실시예 7, 10, 13, 16 및 19 및 비교예 1~4를 처리하고 24시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, 각 시료의 세포에서 RNeasy mini kit(Qiagen, Germany)를 이용하여 총 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260 ㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 피부 장벽 강화 및 보습과 관련된 인자인 SPT(serine palmitoyl transferase), AQP3과 항균 펩타이드인 RNase7에 대한 프라이머 및 cDNA를 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Mic qPCR, biomolecular system, 오스트레일리아)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 유전자의 발현량은 GAPDH 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
SPT mRNA발현량 AQP3 mRNA발현량 RNase 7 mRNA발현량
5% FBS 1.440 4.200 2.600
0% FBS 1.000 1.000 1.000
실시예 7 1.343 3.547 1.943
실시예 10 1.452 2.979 1.644
실시예 13 1.389 2.714 2.145
실시예 16 1.411 3.009 1.840
실시예 19 1.402 3.248 1.742
비교예 1 1.151 2.684 1.640
비교예 2 1.217 1.746 1.216
비교예 3 1.270 2.357 1.574
비교예 4 1.187 2.246 1.157
그 결과, 표 11에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 세라마이드 합성 효소인 SPT, 피부 보습, 장벽 강화와 관련된 AQP 및 피부 항균 펩타이드인 RNase7의 발현이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 피부 장벽 강화에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 12. 피부 주름 및 보습 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 피부 주름 및 보습 개선 활성을 확인하였다. 구체적으로, DMEM/F-12(3:1)배지에 10% 우태아혈청(FBS)을 첨가하여 인간 진피섬유아세포(Modern Tissue Technology, Korea)를 1Х104 cell/cm2 농도로 배양하였다. 70~80% 정도 자라면 1:3의 비율로 분주하여 계대 배양하였고, 3~4차 계대배양된 세포를 실험에 이용하였다. 상기 섬유아세포를 48 웰 플레이트(well plate)에 90% 이상 배양한 후 세포독성이 나타나지 않는 농도로 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4를 가하고, 24시간 후에 배지 중에 유리된 프로콜라겐의 양을 프로콜라겐타입-1C-펩타이드 EIA 키트(procollagen type-1 C-peptide EIA kit)(MK101, Takara, Japan)를 사용하여 측정하였다. 양성대조군으로 아스코르브산을 사용하였다.
타입 1 프로콜라겐 생성율 (%)
양성대조군 65.4
실시예 7 43.5
실시예 10 35.3
실시예 13 63.1
실시예 16 41.8
실시예 19 56.8
비교예 1 25.4
비교예 2 21.5
비교예 3 43.6
비교예 4 24.7
그 결과 표 12에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 프로콜라겐 생성율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 피부 주름 및 보습 예방 또는 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 13. 여드름 및 피지 개선 또는 탈모 예방 또는 개선 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물의 여드름 및 피지, 또는 탈모의 예방 또는 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, 마이크로플레이트 홀(microplate hole)마다 3H(트리튬)으로 방사선표지(radio labelling)된 테스토스테론 0.1μCi 및 상기 실시예 7, 10, 13, 16, 및 19와 비교예 1~4를 첨가한 후 섬유아세포를 10,000개의 세포가 들어가도록 접종하여 배양하였다. 24시간 배양한 후, 상등액을 얻고 에틸아세테이트(ethyl acetate)-사이크로헥산(cyclohexane)(1:1) 추출용매 1 ㎖로 스테로이드(steroids)를 얻었다. 상기 스테로이드를 박막크로마토그래피판에 올려놓고 클로로포름/메탄올 혼합액(98/2 (v/v))로 전개시켰다. 테스토스테론과 디하이드로테스토스테론(Dihydrotestosterone, DHT) 에 해당하는 점의 방사 활성을 덴시토미터를 이용하여 측정하여 전환율을 계산하고, 그 결과를 음성대조군과 비교하여 하기 수학식 10에 의하여 5알파-환원효소 저해율을 평가하였다.
Figure PCTKR2023012660-appb-img-000010
A: 시료 미첨가시, 테스토스테론에서 디하이드로테스토스테론으로의 전환율
B: 시료 첨가시, 테스토스테론에서 디하이드로테스토스테론으로의 전환율
5알파-환원효소 저해율 (%)
실시예 7 57.1
실시예 10 61.3
실시예 13 30.2
실시예 16 51.4
실시예 19 55.3
비교예 1 38.5
비교예 2 46.7
비교예 3 28.6
비교예 4 34.8
그 결과, 표 13에 나타낸 바와 같이, 실시예 7, 10, 13, 16 및 19는 동일한 추출 대상을 유기 용매로 추출한 비교예 1~4와 비교하여 5알파-환원효소 저해율이 유의하게 높은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물은 5알파-환원효소에 의한 디하이드로테스토스테론의 전환을 억제하는 바, 여드름 및 피지 예방 또는 개선뿐만 아니라, 탈모의 예방, 개선 또는 치료, 또는 발모 또는 육모 촉진에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 14. 피부 탄력 개선 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 피부 탄력 개선 효과를 확인하였다. 먼저, 하기 표 14의 성분 및 함량을 포함하는 크림 제형의 화장료 조성물을 제조하였다. 구체적으로, 하기 표 14의 B상을 가열하여 70℃에서 보관한 뒤, A상을 가하여 예비 유화하였다. 이후, 호모믹서로 균일하게 균일하여 유화한뒤, 서서히 냉각하여 화장료 조성물을 제조하였다. 본 명세서에서 다른 언급이 없는 한 함량은 중량%이다.
20~35세의 여성 20명에게 제형예 1~6 및 비교 제형예 1~4를 각각 1일 2회씩 2개월 동안 사용하게 하였다. 이후, 피부탄력측정기 (cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 상기 제형예 1, 5 및 비교 제형예 1을 사용하기 전과 후의 피부 탄력을 측정하였다. 측정값은 Cutometer SEM 575의 R7 값으로 기재하였으며, 상기 R7값은 피부의 점탄성(viscoelasticity)을 나타낸다.
제형예 1 제형예 2 제형예 3 제형예 4 제형예 5 비교 제형예 1 비교제형예 2 비교제형예 3 비교제형예 4
A 스테아릴 알코올 8 8 8 8 8 8 8 8 8
스테아린산 2 2 2 2 2 2 2 2 2
스테아린산 콜레스테롤 2 2 2 2 2 2 2 2 2
스쿠알란 4 4 4 4 4 4 4 4 4
2-옥틸도데실알콜 6 6 6 6 6 6 6 6 6
폴리옥시에틸렌(25몰부가)알코올에스테르 3 3 3 3 3 3 3 3 3
글리세릴모노스테아린산 아스테르 2 2 2 2 2 2 2 2 2
B 실시예 7 1 - - - - - - - -
실시예 10 - 1 - - - - - - -
실시예 13 - - 1 - - - - - -
실시예 16 - - - 1 - - - - -
실시예 19 - - - - 1 - - - -
비교예 1 - - - - - 1 - - -
비교예 2 - - - - - - 1 - -
비교예 3 - - - - - - - 1 -
비교예 4 - - - - - - - 1
프로필렌글리콜 5 5 5 5 5 5 5 5 5
정제수 잔량
피부 점탄성
제형예 1 0.33
제형예 5 0.31
비교 제형예 1 0.11
그 결과, 표 15에 나타낸 바와 같이, 제형예 1 및 5는 비교 제형예 1과 비교하여 피부 점탄성이 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 천연물 추출물은 피부 탄력 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 15. 피부 주름 개선 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 피부 주름 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실험예 14의 제형예 1, 5, 및 비교 제형예 1을 동일한 대상자에게 동일한 방법으로 사용하게 하였다. 이후, 실리콘 재질의 모사판(replica)을 제작한 뒤, 화상분석기인 비지오미터(visiometer: SV60, C+K Electronic Co., 등록특허 10-1905517-13-Germany)를 이용하여 상기 제형예 1, 5 및 비교 제형예 1을 사용한 후의 피부 주름 상태를 측정하였다. 측정 값은 2개월 사용 후의 각각의 파라미터(parameter) 값에서 사용 전 파라미터 값을 뺀 뒤 평균으로 나타내었으며, 측정 값이 음수가 나올수록 주름 개선 효과가 높음을 의미한다.
R1 R2 R3 R4 R5
제형예 1 -0.23 -0.19 -0.13 -0.17 -0.07
제형예 5 -0.24 -0.15 -0.13 -0.14 -0.08
비교 제형예 1 -0.17 -0.16 -0.06 -0.14 -0.02
R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이 값
R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균
R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고치
R4: 주름 등고선의 기선(baseline)에서 각각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값
R5: 주름 등고선의 기선에서 각각의 주름 윤관을 뺀 값의 평균값
그 결과, 표 16에 나타낸 바와 같이, 제형예 1 및 5는 비교 제형예 1과 비교하여 피부 주름 상태를 나타내는 파라미터 값이 유의하게 낮은 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 천연물 추출물은 피부 주름 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 16. 피부 미백 개선 효과 확인
일 구체예에 따른 천연 공융 용매 추출물을 포함하는 화장료 조성물의 피부 미백 개선 효과를 확인하였다. 구체적으로, 상기 실험예 14의 제형예 1, 5, 및 비교 제형예 1을 동일한 대상자에게 동일한 방법으로 사용하게 하였다. 이후, 도포 부위 피부를 화상분석기 및 크로마메타(Minolta CR300)를 이용하여 피부색의 밝기 변화(L)를 측정하였다. 또한, 복수의 숙련자에 의하여 객관적 육안 관찰과 피험자에 의한 주관적 육안 관찰을 실시하여 미백 효능 정도를 하기의 등급에 따라 평가하였다.
-3: 매우 악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선
피부색의 밝기 변화(L) 숙련자의 객관적 평가 피험자의 주관적 평가
제형예 1 3.14 2.0 2.3
제형예 5 3.79 3.0 3.0
비교 제형예 1 2.15 2.0 2.0
그 결과, 표 17에 나타낸 바와 같이, 제형예 1 및 5는 비교 제형예 1과 비교하여 피부색의 밝기 변화가 현저하게 증가한 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 천연 공융 용매의 산도를 pH 5로 조절한 제형예 5에서 피부색의 밝기 변화가 유의하게 증가한 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 천연 공융 용매 천연물 추출물은 피부 미백 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (17)

  1. 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 천연물은 무화과, 권백, 흑미, 혈갈, 검은콩, 능소화, 설련, 마가목, 화분, 물개구리밥, 향나무, 봉미초, 금낭화, 겨우살이, 돌나물, 정금, 상황버섯, 토마토, 어성초, 진피, 모란, 밤꽃, 칡, 호두로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 천연 공융 용매는 pH 2.5 내지 pH 8인 것인, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 또는 이의 유도체는 베타인, 알라닌, 시스테인, 아스파르트산, 글루타민, 페닐알라닌, 글리신, 히스티딘, 이소로이신, 라이신, 로이신, 메티오닌, 아스파라긴, 프롤린, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌, 발린, 트립토판, 및 티로신로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 유기산은 구연산, 락트산, 말산, 말레산, 피루브산, 푸마르산, 석신산, 아세트산, 아코니트산, 타트르산, 아스코르브산, 말론산, 옥살산, 글루쿠론산, 뉴라민산, 시알산, 시킴산, 피트산, 갈락투론산, 이두론산, 히알루론산, 하이드록시시트르산, 및 락톤 유도체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 또는 이의 유도체 및 유기산은 1:0.001 내지 10의 중량비로 혼합된 것인, 조성물.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 피부 상태는 피부 노화, 보습, 주름, 탄력, 피부 장벽 강화, 여드름 또는 피지 분비인 것인, 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 피부 노화는 자외선 또는 활성산소에 의한 것인, 조성물.
  9. 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태 개선용 피부 외용제 조성물로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산인 것인 조성물.
  10. 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산인 것인 조성물.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 염증 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군에서 선택된 것인, 조성물.
  12. 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 탈모 예방 또는 치료, 또는 발모 또는 육모 촉진용 약학적 조성물로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산인 것인 조성물.
  13. 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 혼합하여 혼합물을 제조하는 단계;
    상기 혼합물에 시트르산삼나트륨(sodium citrate), 수산화나트륨(sodium hydroxide), 수산화칼륨(potassium hydroxide), 중탄산나트륨(sodium bicarbonate), 아르기닌(arginine), 트로메타민(tromethamine), 트리에탄올아민(triethanol amine), 아미노메틸프로판올(aminomethyl propanol), 디포타슘포스페이트(dipotassium phosphate), 포타슘포스페이트(potassium phosphate), 아니스산나트륨(sodium anisate), 젖산나트륨(sodium lactate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 및 요소(urea)로 이루어진 군에서 선택되는 pH 조절제를 추가하는 단계를 포함하는, 천연 공융 용매의 제조방법.
  14. 피부 상태를 개선하기 위한 화장료 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도.
  15. 피부 상태를 개선하기 위한 피부 외용제 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도.
  16. 피부 염증 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도.
  17. 탈모 예방 또는 치료, 또는 발모 또는 육모 촉진을 위한 약학적 조성물의 제조를 위한, 천연 공융 용매로 추출한 천연물 추출물의 용도로서, 상기 천연 공융 용매는 아미노산 또는 이의 유도체, 및 유기산을 포함하는 것인 용도.
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