WO2024005174A1 - 導電性炭素フィラーを含む試薬層、当該試薬層を有するセンサ、および当該試薬層の形成方法 - Google Patents

導電性炭素フィラーを含む試薬層、当該試薬層を有するセンサ、および当該試薬層の形成方法 Download PDF

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reagent
group
electrode
polymer
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圭吾 羽田
直 林野
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Ｐｈｃホールディングス株式会社
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    • A61B5/1473—Measuring characteristics of blood in vivo, e.g. gas concentration, pH value; Measuring characteristics of body fluids or tissues, e.g. interstitial fluid, cerebral tissue using chemical or electrochemical methods, e.g. by polarographic means invasive, e.g. introduced into the body by a catheter
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    • G01N27/416—Systems

Definitions

  • the present invention relates to a reagent layer and a sensor containing a conductive carbon filler. More specifically, the present invention provides a conductive carbon filler dispersant as an agent for improving the dispersibility of conductive carbon filler in an aqueous solvent, a reagent layer containing the dispersant, the conductive carbon filler, and a cationic mediator. , a sensor including the reagent layer, and a method for forming the reagent layer.
  • sensors have been known that measure analytes in a sample by making proteins act on them.
  • Such sensors include electrochemical sensors that use enzymes, such as glucose oxidoreductase, and, if necessary, redox mediators (redox substances that mediate electron transfer) or redox polymers (redox polymers (redox substances via linkers, etc.).
  • enzymes such as glucose oxidoreductase
  • redox mediators redox substances that mediate electron transfer
  • redox polymers redox polymers (redox substances via linkers, etc.
  • An example of this is a glucose sensor fabricated using a polymer bonded with a mediator.
  • Glucose sensors are used, for example, for self-testing of blood sugar levels, and in the past, it was common to collect a small amount of blood to use as a sample, but in recent years, glucose sensors have been implanted into living organisms to measure the amount of blood in the blood.
  • implantable electrochemical glucose sensors have also been developed that continuously measure glucose in the interstitium.
  • Glucose sensors are also used to measure glucose in samples other than biological materials, such as culture media.
  • Such a glucose sensor measures the glucose concentration in a sample continuously or semi-continuously for a long period of time, typically from several days to several weeks.
  • Patent Document 1 discloses a sensor made of a carbon black dispersion using hydroxypropylcellulose
  • Patent Document 2 discloses an enzyme-immobilized electrode using ethyl cellulose as a binder and carbon particles. is disclosed.
  • a reagent layer containing a conductive carbon filler and a redox mediator or redox polymer, and further containing an oxidoreductase, etc. as necessary, on a working electrode (enzyme electrode), etc. it is necessary to A reagent solution in which these necessary components are dispersed is prepared, and the reagent solution is applied to a desired area and dried.
  • conductive carbon fillers generally have strong hydrophobicity and therefore are difficult to disperse in aqueous solvents, and also tend to aggregate due to van der Waals forces, making it difficult to maintain a dispersed state.
  • the detection sensitivity of the analyte may be significantly reduced, and the detection sensitivity may be significantly reduced, or it may be difficult to detect the analyte for a long period of time in a humid environment such as in vivo or in a culture medium. In long-term measurements (continuous monitoring), problems such as poor durability occur. Note that it is appropriate to dissolve the oxidoreductase in an aqueous solvent, and it is not appropriate to use an organic solvent as a solvent for preparing the reagent solution.
  • One aspect of the present invention is to provide a reagent layer and a method for forming the same for producing an electrochemical sensor that can detect an analyte with high sensitivity.
  • the present inventors have discovered that in a reagent solution prepared preferably under specific conditions using a conductive carbon filler, a cationic redox mediator or a redox polymer (cationic mediator), and an anionic dispersant, conductive
  • the carbon particles do not aggregate or precipitate, resulting in a good dispersion state, and the reagent layer formed using such a reagent solution can closely adsorb the cationic mediator onto the electrode.
  • an electrochemical sensor has improved analyte detection sensitivity and excellent durability for continuous monitoring, leading to the completion of the present invention.
  • the present invention includes at least the following matters.
  • the anionic dispersant (b) is a polymer having a carboxy group and/or a sulfo group in its side chain.
  • the reagent layer according to Item 3 wherein the anionic dispersant (b) is a polymer containing at least one selected from the group consisting of acrylic acid-derived units, maleic acid-derived units, and styrene sulfonic acid-derived units.
  • the anionic dispersant (b) is a polymer containing at least one selected from the group consisting of acrylic acid-derived units, maleic acid-derived units, and styrene sulfonic acid-derived units.
  • the cationic mediator (c) is a compound in which the redox mediator compound (c1) and the cationic polymer (c2) are bonded, optionally via a linker part (c3). reagent layer.
  • the cationic polymer (c2) has a quaternary ammonium cation group.
  • the anionic dispersant (b) is a polymer containing at least one selected from the group consisting of acrylic acid-derived units, maleic acid-derived units, and sty
  • the reagent layer according to Item 1 wherein the conductive carbon filler (a) is carbon black.
  • Item 2 The reagent layer according to Item 1, further comprising an oxidoreductase (e) that oxidizes or reduces the analyte.
  • oxidoreductase (e) is of a coenzyme-binding type.
  • Si2 The reagent layer according to Item 8, wherein the oxidoreductase (e) is crosslinked with the cationic polymer (c2).
  • FIG. 11 An electrochemical sensor for detecting or quantifying an analyte, comprising a working electrode, a counter electrode, and a reagent layer according to any one of Items 1 to 10.
  • FIG. 12 The electrochemical sensor according to Item 11, further comprising a reference electrode.
  • FIG. 13 The electrochemical sensor according to item 11, further comprising a protective film covering at least the reagent layer.
  • [Section 14] (1) A step of preparing a reagent solution containing a conductive carbon filler (a), an anionic dispersant (b), and a cationic mediator (c), (2) a step of applying the reagent solution to a reagent layer forming site; and (3) a step of drying the applied reagent solution to form a reagent layer.
  • a method for forming a reagent layer comprising: [Section 15] Item 15. The method for forming a reagent layer according to Item 14, wherein the pH of the reagent solution is 8.0 or less. [Section 16] Item 16.
  • Item 17 The method for forming a reagent layer according to Item 16, wherein the metal ion in the reagent solution is an alkali metal ion, and the concentration thereof is less than 100 mM.
  • the anionic dispersant (b) is a polymer having a weight average molecular weight of 70,000 or less and containing at least one selected from the group consisting of acrylic acid-derived units, maleic acid-derived units, and styrene sulfonic acid-derived units. 15. The method for forming a reagent layer according to 14.
  • the cationic mediator (c) is formed by bonding a redox mediator compound (c1) and a cationic polymer (c2) having a quaternary ammonium cation group, optionally via a linker part (c3).
  • Item 15 The method for forming a reagent layer according to Item 14, wherein the reagent layer is a compound that is
  • a conductive carbon filler can be favorably dispersed in a reagent solution containing an aqueous solvent.
  • a reagent liquid carbon dispersion liquid
  • the conductive carbon material is "dispersed” (including “redispersion") or "agglomerated” (including “agglomeration/precipitation”) in the reagent solution depends mostly on can be visually determined. For example, if the conductive carbon material is "agglomerated”, floating or precipitated aggregates can be easily visually confirmed.
  • Centrifugal separation treatment can also be used when determining dispersion and aggregation of the conductive carbon filler. For example, if a reagent solution in which conductive carbon filler is "dispersed” is centrifuged, the conductive carbon filler will not precipitate, but if a reagent solution in which conductive carbon filler is "agglomerated” is centrifuged, If separated, the agglomerates settle out and separate into a layer of conductive carbon filler and a clear aqueous phase.
  • the processing conditions for centrifugation can be, for example, 10,000 x g for 5 minutes, but may be adjusted as appropriate depending on the embodiment, taking into account, for example, the type of conductive carbon filler and its concentration. can.
  • FIG. 1 is a plan view of a sensor in one embodiment of the invention.
  • FIG. 1(A) shows the entire sensor
  • FIG. 1(B) shows an enlarged view of the tip portion of the sensor.
  • FIG. 2 is a cross-sectional view of the sensor at a specific portion of FIG. 1(B).
  • FIG. 2(A) is a sectional view taken along the line AA in FIG. 1(B).
  • FIG. 2(B) is a sectional view taken along the BB arrow in FIG. 1(B).
  • FIG. 2(C) is a sectional view taken along the line CC in FIG. 1(B).
  • FIG. 3 is a top view showing another example of the front side (the side having the working electrode and the reference electrode) of the sensor in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a top view showing another example of the front side (the side having the working electrode and the reference electrode) of the sensor in one embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a top view showing another
  • FIG. 4 is a sectional view taken along the line A-A' in FIG. 3.
  • FIG. 5 is a sectional view taken along the line B-B' in FIG. 4.
  • FIG. 6 is a sectional view taken along the line C-C' in FIG. 4.
  • FIG. 7 is a plan view of a sensor in one embodiment of the invention.
  • FIG. 7(A) shows the electrode pattern before the film (insulating resist film) is formed
  • FIG. 7(B) shows the electrode pattern after the film is formed.
  • FIG. 8 is an image of recovered liquid samples derived from various reagent liquid samples prepared in Test Example 1 and reflecting the dispersion effect of carbon black. [A] Recovery liquid samples corresponding to reagent liquid samples 1-1 to 1-8, respectively.
  • FIG. 9 shows the measurement results regarding the responsiveness of the sensor in Test Example 6.
  • FIG. 10 shows the measurement results regarding the durability of the sensor in Test Example 7.
  • the reagent layer of the present invention includes a conductive carbon filler (a), an anionic dispersant (b), and a cationic mediator (c).
  • the reagent layer of the present invention is a layer that can be formed by a formation method using a carbon dispersion liquid as described below, that is, a reagent liquid in which conductive carbon filler (a) is dispersed, and is preferably a layer that can be formed by a formation method using a carbon dispersion liquid as described later.
  • This layer includes a carbon filler (a), an anionic dispersant (b), and a cationic mediator (c) in a uniform state.
  • Conductive carbon filler in the present invention is not limited to a specific type, but takes into account the embodiments of the present invention (reagent layer, electrochemical sensor applications, etc.), effects, etc.
  • Various conductive carbon fillers can be used.
  • conductive carbon filler conductive carbon materials having various shapes such as spherical (particulate), scale-like, fibrous, and porous shapes can be used.
  • the conductive carbon filler (a) may be used alone or in combination of two or more types (for example, may be used in combination).
  • Examples of the conductive carbon filler include carbon black, graphite powder, porous carbon materials, nanocarbon materials, and the like.
  • Specific examples of carbon black include furnace black, thermal black, acetylene black, Ketjen black, and channel black.
  • Specific examples of graphite powder include pyrolytic graphite and spherical graphite.
  • Specific examples of porous carbon materials include not only activated carbon powder or activated carbon fibers having mesopores of 2 to 50 nm, but also carbon materials having continuous pores in which mesopores are connected.
  • Specific examples of nanocarbon materials include single-walled carbon nanotubes, multi-walled carbon nanotubes, graphene, fullerenes, carbon nanohorns, and carbon nanocoils.
  • the size of the conductive carbon filler (a) may be within an appropriate range.
  • the conductive carbon filler is spherical (particulate)
  • its average particle diameter (for example, the average value measured for a predetermined number of particles using an electron microscope) is generally in the range of 10 nm to 20 ⁇ m.
  • the BET specific surface area of the conductive carbon filler is, for example, 10 m 2 /g or more, preferably 30 m 2 /g or more.
  • the conductive carbon filler (a) in the present invention is preferably a spherical (particulate) carbon filler, such as carbon black.
  • an "anionic dispersant” is a compound that has the essential function of dispersing the conductive carbon filler (a) in the reagent solution, and that Refers to a compound that has a negative net charge (anionic).
  • the anionic dispersant (b) may be used alone or in combination of two or more thereof (for example, may be used in combination).
  • anionic surfactant and “anionic polysaccharide” do not correspond to the anionic dispersant (b) in the present invention.
  • anionic surfactants include methylnaphthalenesulfonic acid formalin condensate salt (e.g. methylnaphthalenesulfonic acid formalin condensate sodium salt, product name "Demol MS” (Kao)), naphthalenesulfonic acid formalin condensate salt ( Examples: ⁇ -naphthalene sulfonic acid formalin condensate sodium salt, product name "Demol N" (Kao)), alkylene maleic acid copolymer salt (e.g.
  • anionic polysaccharides include anionic cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose, anionic guar gums such as carboxymethylated guar gum, and xanthan gums. Such anionic surfactants or anionic polysaccharides are not used as the anionic dispersant (b) of the present invention.
  • An electrochemical sensor in a specific embodiment of the present invention has a protective film that covers a reagent layer formed on the sensor (working electrode).
  • the sensor (working electrode) in order to prevent the anionic dispersant (b) from leaking out of the protective film (in vivo, culture medium, etc.), the sensor (working electrode) is attached in advance after forming the protective film.
  • the anionic dispersant (b) may be eluted and removed from the reagent layer by immersing it in an aqueous solvent.
  • the anionic dispersant (b) combined with the conductive carbon filler (a) may be eluted from the reagent layer (outside the protective film).
  • the anionic dispersant (b) that is not bonded to the conductive carbon filler (a) is eluted from the reagent layer (eluted out of the protective film), although it is not/is difficult to be eluted.
  • the aqueous solvent used in this treatment can be the same as the aqueous solvent for preparing the reagent solution used in the method for forming a reagent layer of the present invention, which will be described later.
  • Anionic polymers (excluding those corresponding to anionic surfactants and anionic polysaccharides) can be used as the anionic dispersant (b) in the present invention.
  • Anionic polymers may have any "chain structure" such as linear, branched, or comb-like. It may contain one or more ring structures derived from aromatic hydrocarbon rings, aromatic heterocycles, non-aromatic heterocycles, etc.).
  • the main chain (the relatively long part of the chain structure) and side chain (the relatively short part of the chain structure) of anionic polymers are generally mainly composed of carbon atoms. and may contain at least one heteroatom selected from the group consisting of nitrogen atoms, oxygen atoms, and sulfur atoms; in other words, a bond containing a heteroatom such as an ether bond, thioether bond, or amide bond in the middle. may exist.
  • Anionic polymers generally have multiple (many) negatively charged functional groups (anionic functional groups) in their side chains, and further have anionic functional groups at one or both ends of the main chain. You can leave it there.
  • anionic polymers having anionic functional groups in side chains and/or terminals are known, and one can purchase one with desired properties, modify an appropriate polymer to produce it, It is possible to synthesize using appropriate monomers.
  • the anionic polymer may be a homopolymer (homopolymer), a copolymer (copolymer), or a polymer in which these are bonded and/or mixed, and may also be a random polymer, a block polymer, or a graft polymer. It may be.
  • anionic functional group examples include a carboxy group which may have a substituent, preferably an unsubstituted carboxy group, which forms -COO - in an aqueous solvent, and a group which has a substituent.
  • examples include a sulfo group which may be substituted, preferably an unsubstituted sulfo group, which forms -SO 3 - in an aqueous solvent.
  • anionic polymers include ethylene polymers having anionic functional groups in side chains (and terminals).
  • Examples of monomers containing ethylenic carbon-carbon double bonds include ethylene, propylene, butadiene, isobutene, tetrafluoroethylene, vinyl alcohol, vinyl acetate, vinyl chloride, vinylidene chloride, styrene, methylstyrene, allylamine, diallylamine, diallyl.
  • Dimethylammonium chloride acrylic acid, methacrylic acid, methyl acrylate (also known as methyl acrylate), methyl methacrylate (also known as methyl methacrylate), butyl acrylate (also known as butyl acrylate), butyl methacrylate (also known as butyl methacrylate), hydroxyethyl methacrylate, Examples include acrylonitrile.
  • the anionic dispersant (b) is a polymer containing at least one selected from the group consisting of acrylic acid-derived units, maleic acid-derived units, and styrene sulfonic acid-derived units, that is, acrylic acid-derived units. It is a homopolymer or copolymer synthesized using at least one monomer selected from the group consisting of , maleic acid, and styrene sulfonic acid (eg, 4-styrene sulfonic acid).
  • the copolymer contains at least one monomer selected from the group consisting of acrylic acid, maleic acid, and styrenesulfonic acid (e.g., 4-styrenesulfonic acid), as well as acrylic acid, maleic acid, and styrenesulfonic acid (e.g., 4-styrenesulfonic acid).
  • Styrene sulfonic acid may be synthesized using a monomer other than at least one selected from the group consisting of styrene sulfonic acid.
  • the anionic dispersant (b) is a polymer having a carboxy group and/or a sulfo group in its side chain as an anionic functional group.
  • Preferred polymers as the anionic dispersant (b) of the present invention include poly(acrylic acid), poly(styrene sulfonic acid), poly(styrene sulfonic acid), and poly(styrene sulfonic acid). -co-maleic acid), poly(ethylene oxide)-b-poly(acrylic acid), and poly(styrene)-b-poly(acrylic acid).
  • the degree of polymerization, weight average molecular weight, other properties, characteristics, etc. of the anionic polymer as the anionic dispersant (b) can be adjusted according to the embodiments and effects of the present invention and the type of the anionic polymer. can.
  • the degree of polymerization of the anionic polymer is usually 50 or more.
  • the average molecular weight, typically the weight average molecular weight, of the anionic polymer is, for example, 1,000 or more, preferably 5,000 or more.
  • the upper limit of the weight average molecular weight of the anionic polymer is not particularly limited, but is, for example, 100,000 or less, preferably 70,000 or less.
  • the weight average molecular weight and molecular weight distribution of the anionic polymer can be measured by known means depending on the type of the anionic polymer, and for example, gel permeation chromatography (GPC) can be used.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the numerical value indicated in its catalog for example, as "Mw” or "M.W." can be regarded as the weight average molecular weight. can.
  • a "cationic mediator” refers to a compound having an essential function as a redox mediator (redox mediator compound) itself, or a compound containing a site derived from such a redox mediator compound. refers to a compound that has a positive charge (cationic) as a net charge of the entire molecule.
  • redox mediator refers to a redox substance that mediates electron transfer, and refers to, for example, a substance that is responsible for transferring electrons generated by a redox reaction of an analyte by an oxidoreductase. Any one type of cationic mediator may be used alone, or two or more types may be used in combination.
  • the cationic mediator (c) is composed of a “redox mediator compound” (c1) and a “cationic polymer” (c2), optionally with a “linker moiety” (c3). It is a compound that has a structure in which it is bonded through
  • the "cationic mediator” in the present invention that is, the "redox mediator”, “cationic polymer”, and “linker site” for constituting it, are not limited to specific types, and the embodiments of the present invention, Various materials can be used in consideration of effects and the like.
  • Redox mediator compound in the present invention is not limited to a specific type, but is determined based on the embodiment of the present invention (reagent layer, electrochemical sensor application, etc.), action and effect, etc. , various redox mediators or derivatives thereof can be used.
  • redox mediator compound examples include phenazine compounds, phenothiazine compounds, osmium complexes, ruthenium complexes, quinone compounds, and ferrocene compounds.
  • the redox mediator compound is a phenazine-based compound or a phenothiazine-based compound.
  • Phenazine-based compounds and phenothiazine-based compounds have a negative redox potential (vs.Ag/AgCl/saturated KCl) (lower than 0 V), and may contain contaminants for electrochemical measurements contained in the sample, such as in biological samples or It can be said to be a preferable redox mediator because it is not easily affected by easily oxidizable compounds such as ascorbic acid (vitamin C) and uric acid, which are not used as analytes, and are contained in the culture medium sample.
  • vitamin C ascorbic acid
  • uric acid which are not used as analytes
  • Phenazine-based compounds and phenothiazine-based compounds refer to compounds each having a phenazine skeleton or a phenothiazine skeleton, represented by the following general formulas (1) and (2), and capable of functioning as a redox mediator.
  • R 3 is a substituted amino group represented by the formula -NR 31 R 32 (wherein both R 31 and R 32 are substituents, or one of which is a substituent and the other is a hydrogen atom)
  • the phenothiazine compound has a resonance structure of the following general formulas (2-1) and (2-2), and is a cationic compound alone. It becomes a compound that becomes a sexual mediator.
  • R 1 to R 9 each independently represent any group or atom of the following (i) to (ix') (provided that (ix') is
  • the cationic mediator (c) is a compound having a structure in which a "redox mediator compound” (c1) and a “cationic polymer” (c2) are bonded via a “linker part” (c3) as necessary.
  • (ix') is a specific reactive group of the phenazine compound or phenothiazine compound (details will be described later) as the redox mediator compound (c1), or a specific reactive group of the cationic polymer (c2) or (limited to cases where it reacts with a specific reactive group of the linker compound): (i) Hydrogen atom; (ii) halogen atom; (iii) a hydroxy group which may have a substituent; (iv) an amino group which may have a substituent; (v) a saturated or unsaturated hydrocarbon group that may have a substituent (for example, a C 1-15 alkyl group, preferably a C 1-6 alkyl group); (vi) an acyl group that may have a substituent (for example, a C 1-6 acyl group, that is, a C 1-6 alkyl-carbonyl group); (vii) a phenyl group which may have a substituent; (viii)
  • the substituents (iii) to (vii) above may have, for example, (a) a halogen atom, (b) a hydroxy group, (c) an amino group, (d) a linear or branched saturated or unsaturated hydrocarbon groups (e.g. C 1-15 alkyl groups, preferably C 1-6 alkyl groups, more preferably C 1-3 alkyl groups), (e) acyl groups (e.g.
  • C 1-3 alkyl groups (6 acyl group, preferably C 1-3 acyl group), (f) guanidino group, (g) mesyl group, (h) phenyl group, (i) thiol group, (j) formyl group (aldehyde group), (k ) an epoxy group, (l) a maleimide group, (m) an active esterified carboxy group, (m') a carboxy group, and (n) an oxyethylene group.
  • (m') means that the cationic mediator (c) is connected to the "redox mediator compound" (c1) and the "cationic polymer” (c2) via a "linker part” (c3) as necessary.
  • the cationic polymer when (m') is a specific reactive group (details will be described later) of the phenazine compound or phenothiazine compound as the redox mediator compound (c1), the cationic polymer This is limited to the case where it reacts with the specific reactive group of (c2) or the specific reactive group of the linker compound.
  • the substituent that the substituents (iii) to (vii) above may have may be a group consisting of any one of (a) to (n) above, or (a) above.
  • substituents from (a) to (n) for each of (iii) to (vii) above, or select chemically appropriate substituents from (a) to (n).
  • the present invention can be carried out by selecting and linking two or more substituents.
  • the number of substituents that each of the above (iii) to (vii) may have is not particularly limited, and may be, for example, 1, 2, or 3, or one atom (e.g. , a carbon atom of an alkyl group, a nitrogen atom of an amino group), a plurality of substituents may be bonded.
  • the quaternary ammonium cation group (viii) is a group represented by -R A -N + (R B )(R C )(R D ) (in the formula, R A , R B , R C and R Each D represents a saturated hydrocarbon group which may have a substituent (for example, a C 1-15 alkyl group, preferably a C 1-6 alkyl group).
  • oxyethylene group is the same as the oxyethylene group (for example, polyethylene glycol chain (PEG chain)) described in relation to (c3) linker part (linker-like hydrophilic part).
  • At least one of R 1 to R 9 may be a group for positively charging the redox mediator compound.
  • a phenazine compound or a phenothiazine compound has (iv) a substituent as at least one of R 1 to R 9 so that the charge of the compound alone is positive (cationic).
  • An amino group preferably an unsubstituted amino group, which generates -NH 3 + in an aqueous solvent, or a positively charged functional group (such as (viii) a quaternary ammonium cation group) (referred to as a "cationic functional group" in the specification).
  • R 1 At least one of ⁇ R9 is a reactive group (hereinafter referred to as In this book, it is called “specific reactive group of redox mediator compound (c1),” but when it is clear from the context that it belongs to redox mediator compound (c1), it is sometimes simply called “specific reactive group.”) There may be.
  • At least one of R 1 to R 9 may be another group related to the performance as a redox mediator or a group related to the production of the reagent layer.
  • a phenazine compound or a phenothiazine compound has (iii) a hydroxy group that may have a substituent, preferably an unsubstituted hydroxy group, as at least one of R 1 to R 9 .
  • Hydroxy groups (iv) amino groups that may have substituents, preferably unsubstituted amino groups, (viii) quaternary ammonium cation groups, and other functional groups called "hydrophilic groups"themselves; A group derived from a hydrophilic group such as the one having hydrophilic properties (preferably (n) a hydrophilic group substituted with an oxyethylene group or other hydrophilic group), or (v) having a substituent. (n) as a substituent among a saturated or unsaturated hydrocarbon group that may have a substituent, (vi) an acyl group that may have a substituent, and (vii) a phenyl group that may have a substituent.
  • the group as a whole may be hydrophilic by having an oxyethylene group or other hydrophilic group.
  • hydrophilic refers to a compound that has a high affinity for water and is used for water or other polar solvents, for example, for reacting a redox mediator compound and a cationic polymer when synthesizing a cationic mediator. It refers to the property of being soluble or miscible in a solvent or a solvent for dissolving a cationic mediator when forming a predetermined layer in an electrochemical sensor to the extent that the purpose can be achieved.
  • polar solvent examples include methanol, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-butanol, 2-butanol, 2-methyl-1-propanol, 2-methyl-2-propanol, formic acid, acetic acid, tetrahydrofuran, and acetone. , dioxane, methyl ethyl ketone, ethyl acetate, acetonitrile, dimethylformamide, and dimethyl sulfoxide.
  • Cationic polymer is a general term for polymers that have a net positive charge as a whole.
  • the cationic polymer (c2) in the present invention has a structure capable of supporting the redox mediator compound (c1), that is, reacts with a group possessed by the redox mediator compound (c1) itself or a group possessed by the linker portion (c3) used as necessary. Any material may be used as long as it has a suitable group and can be applied to a desired site, such as a working electrode, to form a reagent layer.
  • the type of cationic polymer is not particularly limited, and any one type may be used alone or two or more types may be used in combination.
  • the cationic polymer may have a linear, branched, or comb-like "chain structure," and the "chain structure" may be a cyclic compound (aromatic hydrocarbon ring, It may contain one or more ring structures derived from aromatic hydrocarbon rings, aromatic heterocycles, non-aromatic heterocycles, etc.).
  • the main chain and side chains of the cationic polymer (c2) generally consist mainly of carbon atoms, and may also contain at least one heteroatom selected from the group consisting of nitrogen atoms, oxygen atoms, and sulfur atoms. In other words, a bond containing a heteroatom such as an ether bond, thioether bond, or amide bond may exist in the middle.
  • Cationic polymers (c2) generally have multiple (many) positively charged functional groups (cationic functional groups) in their side chains, and further have cationic functional groups at one or both ends of the main chain. It may have.
  • the cationic polymer (c2) c2) is a reactive group (hereinafter referred to as "reactive group") that has a bonding property with a group possessed by the redox mediator compound (c1) itself or a linker moiety (c3) used as necessary or a group possessed by a linker compound for forming the linker moiety (c3).
  • the specific reactive group of the cationic polymer (c2)'' when it is clear from the context that it belongs to the cationic polymer (c2), it is sometimes simply called the ⁇ specific reactive group'') on the side. It is appropriate to have a specific reactive group in the chain, and one or both ends of the main chain may also have a specific reactive group.
  • the cationic polymer (c2) may be a homopolymer (homopolymer), a copolymer (copolymer), or a polymer in which they are bonded and/or mixed, and may also be a random polymer, a block polymer, a graft polymer, or a polymer in which they are bonded and/or mixed. It may be any polymer.
  • Examples of the cationic polymer (c2) include ethylene-based polymers, imine-based polymers, amino acid-based polymers, etc., which have a cationic functional group and a specific reactive group in their side chains (and terminals). In addition, it can be said that it is a polymer whose monomer is an amino acid (however, it is conceptually distinguished from an artificially synthesized amino acid-based polymer). ) Proteins and polypeptides having an amino acid sequence and having a cationic functional group and a specific reactive group in their side chains (and terminals) are also included in the cationic polymer (c2). Polysaccharide-based polymers that inherently have or have been introduced with specific reactive groups and cationic functional groups are also included in the cationic polymer (c2).
  • Examples of monomers containing ethylenic carbon-carbon double bonds include ethylene, propylene, butadiene, isobutene, tetrafluoroethylene, vinyl alcohol, vinyl acetate, vinyl chloride, vinylidene chloride, styrene, methylstyrene, allylamine, diallylamine, diallyl.
  • Dimethylammonium chloride acrylic acid, methacrylic acid, methyl acrylate (also called methyl acrylate), methyl methacrylate (also called methyl methacrylate), butyl acrylate (also called butyl acrylate), butyl methacrylate (also called butyl methacrylate) ), hydroxyethyl methacrylate, acrylonitrile, etc.
  • copolymers of methyl methacrylate and hydroxyethyl methacrylate, copolymers of butyl methacrylate and hydroxyethyl methacrylate, and poly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine-co-n-butyl), which are generally known as biocompatible polymers, are also available.
  • Preferred ethylene-based polymers include (meth)acrylic polymers such as (methacrylate) and polyester-based polymers such as polyethylene terephthalate.
  • ethylene-based polymers preferable as the cationic polymer (c2) include polyallylamine hydrochloride, allylamine hydrochloride/diallylamine hydrochloride copolymer, and allylamine/diallyldimethylammonium chloride copolymer.
  • (Meth)acrylic polymers having quaternary ammonium cations, amino groups, etc. in side chains (and terminals) are also mentioned as preferred ethylene polymers.
  • imine-based polymers examples include poly(ethyleneimine).
  • Poly(ethyleneimine) has -(CH 2 ) 2 -NH 2 , -(CH 2 ) 2 -NH-(CH 2 ) 2 -NH 2 , -(CH 2 ) 2 -N((CH 2 ) 2 -NH 2 ) 2 , and the amino group: -NH 2 in the structure becomes a specific reactive group of the cationic polymer (c2), and a corresponding specific reactive group (for example, active esterified carboxy group) or a linker portion (c3).
  • amino acid-based polymers examples include poly(L-lysine), poly(L-arginine), and poly(L-ornithine).
  • Poly(L-lysine) has a structure of -(CH 2 ) 4 -NH 2 in its side chain.
  • the amino group: -NH 2 (or guanidino group: -NH-C( NH)-NH 2 ), etc.
  • the redox mediator compound (c1) or linker moiety (c3) can be bonded to a redox mediator compound (c1) or a linker moiety (c3) having an appropriate specific reactive group (for example, an active esterified carboxy group).
  • the amino acid-based polymer may form a salt, such as poly(L-arginine hydrochloride).
  • polysaccharide-based polymers examples include cellulose derivatives such as chitosan.
  • Chitosan is a polysaccharide obtained by hydrolyzing chitin and has an amino group in the side chain (in the sugar structure).
  • the amino group contained in the side chain of such a polysaccharide polymer becomes a specific reactive group of the cationic polymer (c2), and has a corresponding appropriate specific reactive group (for example, an active esterified carboxy group). It can be combined with a redox mediator compound (c1) or a linker part (c3).
  • the degree of polymerization, weight average molecular weight, other properties, characteristics, etc. of the cationic polymer (c2) can be adjusted depending on the embodiments and effects of the present invention and the type of the cationic polymer (c2).
  • the degree of polymerization of the cationic polymer (c2) is usually 100 or more.
  • the average molecular weight, typically the weight average molecular weight, of the cationic polymer (c2) is usually 10,000 or more, preferably 50,000 or more, more preferably 100,000 or more.
  • the upper limit of the weight average molecular weight of the cationic polymer (c2) is not particularly limited, but is usually less than 10,000,000, preferably less than 1,000,000.
  • the weight average molecular weight and molecular weight distribution of the cationic polymer (c2) can be measured by known means depending on the type of the cationic polymer (c2), such as gel permeation chromatography (GPC). can be used.
  • GPC gel permeation chromatography
  • Mw weight average molecular weight
  • M.W. weight average molecular weight
  • the linker portion (c3) is a structure that is present as necessary and serves to mediate the bond between the redox mediator compound (c1) and the cationic polymer (c2).
  • the linker part (c3) has a carbon atom as a main component, and the part excluding the reactive group before the reaction or the bond structure after the reaction at both ends is selected from the group consisting of a nitrogen atom, an oxygen atom, and a sulfur atom.
  • a chain structure in which a bond containing a hetero atom such as an ether bond, thioether bond, or amide bond may exist in the middle. It is a part that has.
  • the "chain structure" of the linker portion (c3) may be linear or branched.
  • “chain structure” includes one or more ring structures derived from a cyclic compound (aromatic hydrocarbon ring, non-aromatic hydrocarbon ring, aromatic heterocycle, non-aromatic heterocycle, etc.). It's okay to stay.
  • the linker part (c3) has a function as a part (hydrophilic part) for improving the hydrophilicity of the cationic mediator (c), and is referred to as a "linker-like hydrophilic part”. It can also be called.
  • the linker part (c3) is a linker-like hydrophilic part, from the viewpoint of hydrophilicity, it is preferably linear and does not contain any ring structure derived from a cyclic compound.
  • the linker-like hydrophilic moiety comprises an oxyethylene group represented by the formula: -(OC 2 H 4 ) q -.
  • q in the formula represents, for example, an integer of 1 to 80, preferably an integer of 3 to 36. Note that among the oxyethylene chains represented by the formula, those in which q is relatively large are generally referred to as “polyethylene glycol chains (PEG chains)."
  • the linker-like hydrophilic moiety comprises a hydrocarbon chain of the formula: -(CH 2 ) p -.
  • the main chain of the linker-like hydrophilic moiety is a hydrocarbon chain represented by the above formula: -(CH 2 ) p - and a hydrocarbon chain represented by the above formula: -(OC 2 H 4 ) q -. contains both oxyethylene chains.
  • p in the formula representing a hydrocarbon chain can be appropriately adjusted in consideration of the hydrophilicity of the linker-like hydrophilic moiety so as to be balanced with q in the formula representing an oxyethylene chain.
  • the linker part (c3) has at least two reactive groups (specific reactive groups) that have bonding properties with each of the group (specific reactive group) possessed by the redox mediator compound (c1) and the group (specific reactive group) possessed by the cationic polymer (c2).
  • a linker compound is reacted with a redox mediator compound (c1), and then the linker compound bound to the redox mediator compound (c1) (in other words, "redox mediator compound (c1)-linker compound reactant") is converted into a cationic compound.
  • a cationic mediator (c) is produced as a compound in which the redox mediator compound (c1) and the cationic polymer (c2) are bonded via a linker part (c3).
  • the linker compound is reacted with the cationic polymer (c2), and then the linker compound bound to the cationic polymer (c2) (in other words, the "cationic polymer (c2)-linker compound reactant") is redoxed. Also by reacting with the mediator compound (c1), a cationic mediator (c) is produced as a compound in which the redox mediator compound (c1) and the cationic polymer (c2) are bonded via the linker part (c3). do.
  • Specific reactive group Various known reactive groups are employed as the specific reactive groups in the present invention, that is, the specific reactive groups of the redox mediator compound (c1), the specific reactive groups of the cationic polymer (c2), and the specific reactive groups of the linker compound. , can be in various combinations.
  • the predetermined reactive groups in the present invention may be bonded to each other by covalent bonds or non-covalent bonds (for example, electrostatic interaction), but for example, the stability of the bond may be From this point of view, those that are bonded by covalent bonds are preferred.
  • the specific reactive group in the present invention is a "group consisting of a carboxy group or an active ester thereof, an amino group, a thiol group, a formyl group (aldehyde group), an epoxy group, and a maleimide group" (herein referred to as a "preferred specific reactive group”). ) is preferred.
  • the amino group, thiol group, formyl group (aldehyde group), epoxy group, and maleimide group as preferable specific reactive groups are R 1 to R 1 in general formulas (1) and (2) regarding the redox mediator compound (c1), respectively.
  • the carboxy group and its active ester correspond to the substituents (m') and (m), respectively.
  • Table 1 shows groups with which each of the reactive groups included in the preferred specific reactive group group can react.
  • the other reactive group included in the preferred specific reactive group group is selected as the other reactive group included in the preferred specific reactive group.
  • it may be a reactive group that is not included in the preferred specific reactive group group (those not underlined in the table or not included in the table).
  • either the specific reactive group of the redox mediator compound (c1) or the specific reactive group of the linker compound and the specific reactive group of the cationic polymer (c2) are the “reactive groups” in Table 1. A” and the other is “reactive group B.”
  • one of the specific reactive groups of the redox mediator compound (c1) and the specific reactive group of the linker compound is "reactive group A” in Table 1, and the other is "reactive group A” in Table 1. "Group B”.
  • one of the specific reactive group of the redox mediator compound (c1) or the specific reactive group of the linker compound and the specific reactive group of the cationic polymer (c2) is an amino group, and the other is an amino group. is a carboxy group or its active ester.
  • one of the specific reactive groups of the redox mediator compound (c1) and the specific reactive group of the linker compound is an amino group, and the other is a carboxy group or an active ester thereof. It is.
  • a redox mediator compound (c1) having an active esterified carboxy group as a specific reactive group a redox mediator compound (c1) having an amino group as a first specific reactive group and an active esterified carboxy group as a second specific reactive group
  • a linker compound having a carboxy group that has been actively esterified with NHS and a cationic polymer (c2) that has an amino group as a specific reactive group
  • a linker-like hydrophilic moiety-introduced redox mediator compound is obtained by the reaction between the group and the amino group of the linker compound (first amide bond), and the active esterified carboxylic acid of the linker-like hydrophilic moiety-introduced redox mediator compound obtained
  • a cationic mediator (c) is obtained by reaction between the group and the amino group of the cationic polymer (c2) (second amide bond).
  • the reagent layer of the present invention is typically placed on the working electrode in the electrochemical sensor of the present invention.
  • the reagent layer may use only one type or a combination of two or more types (for example, conductive carbon filler (a), anionic dispersant (b), and cationic mediator (c)). Two or more types of reagent layers having different compositions (types and/or contents) may be stacked.
  • the reagent layer may contain a type of "oxidoreductase" corresponding to the analyte, such as an electrochemical sensor in the form of a biosensor, or an electrochemical sensor other than a biosensor, or an electrochemical sensor.
  • oxidoreductase may not be included, as in the case of taking the form of other sensors (eg, optical sensors).
  • the reagent layer may further contain components other than the conductive carbon filler (a), the anionic dispersant (b), and the cationic mediator (c), if necessary.
  • Such optional components include, for example, "oxidoreductase” (d).
  • the oxidoreductase (d) refers to an enzyme that can oxidize (including dehydrogenation) or reduce an analyte targeted by an electrochemical sensor or the like.
  • the electrochemical sensor of the present invention typically takes the form of an electrochemical sensor (biosensor) containing a redox enzyme in a reagent layer, but is not limited to this. It can also take the form of an electrochemical sensor other than a biosensor, or a sensor other than an electrochemical sensor (for example, an optical sensor) that does not contain an enzyme.
  • the reagent layer contains an oxidoreductase (d) or not, and what type of oxidoreductase (d) it contains depending on the type of analyte. can do.
  • oxidoreductase (d) examples include oxidase enzymes (glucose oxidase (Gox), lactate oxidase, pyruvate oxidase, cholesterol oxidase, amino acid oxidase, glutamate oxidase, fructosyl amino acid oxidase, alcohol oxidase, ascorbate oxidase, fructosyl peptide oxidase, bilirubin oxidase, aldehyde oxidase, etc.) and dehydrogenase enzymes (glucose dehydrogenase (GDH), lactate dehydrogenase, pyruvate dehydrogenase, amino acid dehydrogenase, glutamate dehydrogenase, 3-hydroxybutyrate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, aldehyde dehydrogenase). Can be mentioned. Any one type of oxidoride
  • the oxidoreductase (d) is a coenzyme-binding type.
  • coenzyme-reduced oxidoreductase (d) include pyrroloquinoline quinone (PQQ)-bound GDH and flavin adenine dinucleotide (FAD)-bound GDH.
  • PQQ pyrroloquinoline quinone
  • FAD flavin adenine dinucleotide
  • glucose is the analyte
  • the reactivity to maltose, which is not an analyte is low (for example, the enzyme activity to maltose is 5% or less, preferably 3% or less, when the enzyme activity to glucose is 100%).
  • FAD-binding GDH is preferable from the viewpoint of Examples of FAD-binding GDH include those derived from the genus Aspergillus (oryzae, terreus, etc.) and those derived from the genus Mucor.
  • the oxidoreductase (d) may be crosslinked with the cationic mediator (c), particularly the cationic polymer (c2) constituting it.
  • the cationic mediator (c) particularly the cationic polymer (c2) constituting it.
  • a crosslinking agent (e) it is possible to crosslink the oxidoreductase (d) and the cationic mediator (c), especially the cationic polymer (c2).
  • the crosslinking agent (e) include glutaraldehyde.
  • the crosslinking agent (e) has a redox reaction between a reactive group (e.g., amino group) possessed by the oxidoreductase (d), which is a protein, and a reactive group possessed by the cationic mediator (c), for example, the cationic polymer (c2). Reactions with the mediator compound (c1) or the linker moiety (c2) as a reactive group that did not react or as a reactive group of a different type than that for reaction with the redox mediator compound (c1) or the linker moiety (c2) By reacting with each of the groups (eg, amino group), the oxidoreductase (d) and the cationic mediator (c) can be bonded via the crosslinking agent (e).
  • a reactive group e.g., amino group
  • the mediator compound (c1) or the linker moiety (c2) a reactive group that did not react or as a reactive group of a different type than that for reaction with the redox mediator compound (c1) or
  • the oxidoreductase (d) and the cationic mediator (c), especially the redox mediator compound (c1) constituting it can be released from the protective film. Outflow can be further suppressed.
  • the oxido-reductase (d) can be linked together via the cross-linking agent (e) by reacting with the reactive groups of each of the two molecules of the oxido-reductase (d). Sometimes they are combined.
  • the oxidoreductase (d) is crosslinked with the cationic mediator (c), especially the cationic polymer (c2), and at the same time, the oxidoreductase (d) is crosslinked with the cationic mediator (c), especially the cationic polymer (c2), in the reagent layer. ) may be crosslinked with each other.
  • the method for forming a reagent layer of the present invention includes at least the following step (1), and usually further includes (2) and (3): (1) A step of preparing a reagent solution containing a conductive carbon filler (a), an anionic dispersant (b), and a cationic mediator (c) (herein referred to as "reagent solution preparation step") ); (2) the step of applying the reagent solution to the reagent layer forming site (herein sometimes referred to as the "applying step”); (3) A step of drying the applied reagent solution to form a reagent layer (herein sometimes referred to as a "reagent layer forming step").
  • the reagent liquid preparation step (1) consists of the main components constituting the reagent layer, that is, at least the conductive carbon filler (a), the anionic dispersant (b), and the cationic mediator (c). This is a step of preparing a reagent solution that may further contain other components such as an oxidoreductase (d) and a crosslinking agent (e) as required.
  • Reagent solutions are generally prepared by adding the necessary components (a) to (e) to an aqueous solvent (water or a mixed solvent of water and a water-compatible solvent).
  • aqueous solvent water or a mixed solvent of water and a water-compatible solvent
  • liquid can be prepared.
  • the aqueous solvent can be adjusted to have an appropriate pH by adding a pH adjuster, a buffer (liquid), other compounds, etc., as necessary.
  • the pH of the reagent solution is 8.0 or less.
  • the buffer solution in such an amount that the pH of the reagent solution is 8.0 or less, the effect of improving the dispersibility of the conductive carbon filler (a) is more likely to be achieved.
  • the reagent solution contains an oxidoreductase (d)
  • it is appropriate that the pH of the reagent solution is within a range in which the activity of the oxidoreductase (d) is maintained.
  • the pH of the reagent solution is usually adjusted using a buffer.
  • Various buffers can be used as the buffer, for example, acetate buffer (acetic acid and sodium acetate), phosphate buffer, citrate buffer, citrate phosphate buffer, Tris buffer (tris hydroxyl) methylaminomethane (also known as trometamol), Bis-Tris buffer (bis(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methane), HEPES buffer (2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethane) sulfonic acid), MES (2-morpholinoethanesulfonic acid monohydrate), MOPS (3-morpholinopropanesulfonic acid), PBS (phosphate-buffered saline, typically sodium chloride, potassium chloride, dihydrogen phosphate), sodium and potassium dihydrogen phosphate).
  • the pH of the reagent can be adjusted to a desired value (range).
  • the concentration of metal ions in the reagent solution is 200 mM or less. If the concentration of metal ions in the reagent solution is high, depending on the type of metal ion, the dispersibility of the conductive carbon filler may be inhibited and aggregation may occur, so the lower the concentration of metal ions in the reagent solution, the better. There is a tendency. When using a compound containing metal ions (buffer) or a buffer prepared using the same to adjust the pH of the reagent solution, the amount of the buffer or buffer required to achieve the desired pH.
  • the concentration of metal ions in the reagent solution is preferably less than 100 mM, for example, 80 mM or less.
  • the metal ions in the reagent solution are derived from various substances used in the preparation of the reagent solution, so the composition of the reagent solution, the type and type of each component, etc. must be carefully selected to keep the metal ion concentration within an appropriate range.
  • the amount used can be adjusted.
  • metal ions in the reagent solution may originate from the buffer solution, so the composition of the buffer solution (type and concentration of compounds contained in the buffer solution) used to adjust the pH of the reagent solution must be appropriate. do it.
  • the metal ions in the reagent solution may originate from the anionic dispersant (b) that forms a salt, so if necessary, the anionic dispersant that forms such a salt may be used.
  • the amount of (b) may also be taken into account.
  • (1-1) A step of dispersing the conductive carbon filler (a) in an aqueous solution containing at least the anionic dispersant (b) to obtain a dispersion liquid.
  • (1-1) A step of adding a cationic mediator (c) to the obtained dispersion to obtain a reagent solution.
  • the respective concentrations of the conductive carbon filler (a), anionic dispersant (b), and cationic mediator (c) in the reagent solution, and the redox enzyme (d) used as necessary, or the ratio of their concentrations to each other can be appropriately adjusted in consideration of the embodiments, effects, etc. of the present invention.
  • the concentration of the conductive carbon filler (a) in the reagent solution is, for example, within the range of 0.1 to 30 w/v% (mg/mL).
  • the concentration of the anionic dispersant (b) in the reagent solution is, for example, within the range of 0.01 to 30 w/v% (mg/mL).
  • a treatment (herein referred to as "dispersion") is performed to improve the dispersibility of the conductive carbon filler (a) in the reagent solution by applying physical energy to the reagent solution.
  • the dispersion treatment can be performed, for example, between the step (1-1) and the step (1-2), or instead of or in addition to the step (1-2) (the next step). It can also be carried out (before the apply step (2)).
  • the means for applying "physical energy” are particularly limited as long as they can improve the dispersibility of the conductive carbon filler (a) in the reagent solution. It is not something that will be done.
  • a representative embodiment of the invention uses ultrasound treatment as the above-mentioned means, other means can also be used.
  • the conditions for ultrasonication can be adjusted as appropriate.
  • the device for ultrasonic treatment can also be selected as appropriate; for example, an ultrasonic homogenizer can be used.
  • the oxidoreductase (d) is preferably added at the stage after the dispersion treatment in the reagent solution preparation step (1) so as not to be affected by physical energy.
  • a crosslinking agent (e) for crosslinking the oxidoreductase (d) with the cationic mediator (c) or crosslinking the oxidoreductases (d) with each other, such as glutaraldehyde, can be used as the oxidoreductase (d). It is preferable to add it after adding.
  • the conductive carbon filler (a) is added after the conductive carbon filler (a) is improved in dispersibility by imparting physical energy to the reagent solution through dispersion treatment, such as ultrasonic treatment.
  • the applying step (2) is a step of applying (dropping, coating, etc.) the reagent solution obtained in the reagent solution preparation step (1) to the reagent layer forming site, for example, at least a part of the working electrode. be.
  • the means for "applying" are not particularly limited as long as they can form a reagent layer from a reagent solution, and can be any conventional method for forming a reagent layer.
  • a method similar to the reagent solution application step in (or method for manufacturing an electrochemical sensor) can be adopted.
  • the application step is performed by dropping an appropriate amount of the reagent solution obtained in the reagent solution preparation step (1) onto at least a portion of the working electrode (the portion forming the reagent layer). conduct.
  • the area to be applied and the amount of the reagent solution can be adjusted depending on the desired thickness of the reagent layer.
  • Reagent layer forming step (4) the reagent liquid applied to the reagent layer forming site (for example, at least a part of the working electrode) in the applying step (2) is dried to form a coating layer. This is the process of forming.
  • the means for "drying" are not particularly limited as long as a (preferably uniform) reagent layer can be formed from the applied reagent solution, and conventional A method similar to the drying process of a reagent solution in manufacturing an electrochemical sensor can be adopted.
  • a reagent layer forming step is performed by leaving the working electrode to which a reagent solution has been applied still at room temperature to form a reagent layer.
  • Electrochemical sensor for detecting or quantifying an analyte of the present invention has a working electrode, a counter electrode, and a reagent layer of the present invention as described above disposed on the working electrode, and optionally further includes at least a reagent layer. It has a protective film covering it.
  • the "protective film” is a substance contained in the reagent layer (conductive carbon filler (a), cationic mediator (c), oxidoreductase (d) used as necessary, etc.) in the environment outside the protective film ( It is a membrane-like member for preventing or suppressing leakage into the living body, culture medium, etc.
  • the protective film covering the reagent layer suitably has permeable pores in the protective film so that analytes present in the environment outside the protective film can come into contact with the reagent layer.
  • a protective film is preferably formed when the electrochemical sensor is used for continuous measurement, and does not need to be formed when the electrochemical sensor is used for one-off measurement. .
  • the working electrode (probe equipped with the same) on which the reagent layer is formed is used by being inserted into a living body or immersed in a medium, so the protective film covering its surface is coated with proteins.
  • the polymer is made of a biocompatible polymer that does not or does not easily adsorb cells or cells.
  • biocompatible polymers include copolymers of methyl methacrylate and hydroxyethyl methacrylate, copolymers of butyl methacrylate and hydroxyethyl methacrylate, poly(2-methacryloyloxyethylphosphorylcholine-co-n-butyl methacrylate), and the like. .
  • protective film solution a solution containing raw materials for forming the protective film
  • immersionse the area where you want to form the protective film for example, the area where at least the reagent layer of the working electrode is formed, and then pull it up. It can be formed by drying and, if necessary, repeating such a process multiple times.
  • the electrochemical sensor of the present invention may further include a reference electrode as necessary. That is, the electrochemical sensor of the present invention can be of a two-electrode type composed of a working electrode and a counter electrode, or can be of a three-electrode type composed of a working electrode, a counter electrode, and a reference electrode.
  • the electrochemical sensor is an implantable electrochemical sensor, e.g. an autoglycemic sensor that measures glucose concentration in blood or interstitial fluid continuously or semi-continuously, e.g. over a period of days to weeks. It can be produced as a biosensor for CGM (Continuous Glucose Monitoring) for measurement.
  • the electrochemical sensor may be fabricated as a non-implantable electrochemical sensor, for example a biosensor for continuously or semi-continuously measuring the concentration of glucose etc. in the culture medium. You can also do it.
  • the surface located toward the front of the paper in FIGS. 1A and 1B, FIGS. 3 and 7, and the top of the paper in FIGS. 2A to 6 is referred to as the "top surface.” ", and the surface located toward the back of the page in FIGS. 1(A) and (B), FIGS. 3 and 7, and toward the bottom of the page in FIGS. 2(A) to (C) and FIGS. 1(A) and (B), FIGS. 2(A) to (C), and either the left or right side of the page in FIGS. 5 to 7, and either the front or back side of the page in FIG.
  • the side on the surface is sometimes called the "side".
  • FIG. 1 is a plan view of a sensor 11 in an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1(A) shows the entire sensor 11.
  • FIG. 1(B) shows an enlarged view of the tip portion (sensing portion) of the sensor 11 shown in FIG. 1(A).
  • the sensor 11 is suitable for constructing an implantable biosensor system that is used by attaching it to a living body for self-testing of blood sugar levels, for example. It can be inserted into a living body as a protruding part (probe) from the body.
  • the sensor 11 can also be used, for example, when constructing a system for measuring the concentration of an analyte in a culture medium.
  • the region X1 (head) of the sensor 11 shown in FIG. 1(A) is housed in the main body (not shown), and the tip portion (sensing portion) of the sensor 11 protrudes from the main body.
  • Arrow X2 indicates the insertion direction when inserting the sensor 11 into a living body, for example.
  • the sensing portion has a length of, for example, 20 to 3 mm, preferably 10 to 3 mm, and a width of, for example, 1 to 50 ⁇ m, preferably 500 to 50 ⁇ m.
  • the sensor 11 includes a substrate 21, an electrode 22, a reagent layer 23, a silver/silver chloride layer (sometimes referred to as a reference layer) 24, and a film 25.
  • the electrode 22 is uniformly formed on the substrate 21 and includes a working electrode 22a, a reference electrode 22b, and a counter electrode 22c.
  • the working electrode 22a and the reference electrode 22b are physically and electrically separated by the groove A1, and the reference electrode 22b and the counter electrode 22c are physically and electrically separated by the groove A2.
  • Reagent layer 23 is formed on working electrode 22a.
  • a silver/silver chloride layer 24 is formed on the reference electrode 22b.
  • the film 25 is formed with the exception of a part of the electrode 22 (a part of the region X4 of the region X1 of the head, a part of the region X3 of the counter electrode 22c, etc.) and a part of the reagent layer 23 (by having an opening that exposes them). ), covering the upper surface of the sensor 11. Note that the exposed region X4 of the electrode 22 is connected to the circuit of the main body 11.
  • the reagent layer 23 not be formed at the tip of the sensor 11 (over a predetermined distance from the tip).
  • the reagent layer 23 is preferably formed away from the tip of the sensor 11. This is because by doing so, it is possible to prevent the reagent layer 23 from peeling off (turning over) from the sensor 11 when the sensor 11 is inserted into the living body.
  • FIG. 2(A) is a cross-sectional view taken along the line AA in FIG. 1(B).
  • the substrate 21, the electrode 22 (working electrode 22a), and the reagent layer 23 are laminated in this order.
  • the electrode 22 (working electrode 22a), the reagent layer 23, and the film 25 are not laminated (trimmed), and the substrate 21 is exposed.
  • FIG. 2(B) is a sectional view taken along the BB arrow in FIG. 1(B).
  • a substrate 21, an electrode 22 (reference electrode 22b), a silver/silver chloride layer 24, and a film 25 are laminated on the right side of the groove A1 in a portion where the silver/silver chloride layer 24 is formed.
  • a substrate 21, an electrode 22 (working electrode 22a), and a film 25 are laminated on a portion on the left side of the groove A1 that is physically and electrically separated from the reference electrode 22b.
  • the film 25 is not disposed on the side surface of the silver/silver chloride layer 24 (the right side surface in FIG. 2(B)) and is exposed.
  • the upper surface of the silver/silver chloride layer 24 is covered with the film 25, but it may not be covered with the film 25 and may be exposed.
  • FIG. 2(C) is a sectional view taken along the CC arrow in FIG. 1(B).
  • a substrate 21 and an electrode 22 are stacked on the right side of the groove A2.
  • the upper surface of the counter electrode 22c is not covered with the film 25 and is exposed.
  • a substrate 21, an electrode 22 (reference electrode 22b), and a film 25 are laminated in a portion sandwiched between groove A1 and groove A2.
  • a substrate 21, an electrode 22 (working electrode 22a), and a film 25 are laminated on the left side of the groove A1.
  • the substrate 21 is typically a sheet-shaped synthetic resin.
  • the material of the substrate 21 is not particularly limited as long as it is a resin material such as a plastic material (synthetic resin) having at least one of the following characteristics: flexibility, easy workability, and heat resistance.
  • a typical example of such a resin material for the substrate 21 is polyethylene terephthalate (PET), but other general-purpose plastics such as polyethylene, polypropylene, and polyethylene naphthalate are also available.
  • PET polyethylene terephthalate
  • polyimide is preferable.
  • the electrode 22 is a thin film (thin layer) formed on the substrate 21.
  • the material of the electrode 22 is not particularly limited as long as it is a metal or carbon material that has conductivity and stability (for example, oxidation resistance or salt resistance).
  • a typical example of the material for such an electrode 22 is gold, but other materials include platinum, palladium, carbon, and the like. Note that when forming the working electrode 22a (reagent layer 23) on one of the upper and lower surfaces of the sensor 11 and forming the counter electrode 22c on the other, different electrode materials may be used.
  • a potential (potential based on the reference electrode 22b) sufficient to oxidize the mediator reduced by the reaction of the analyte (eg, glucose) by the oxidoreductase is applied to the working electrode 22a.
  • Glucose concentration is measured by monitoring the current flowing between working electrode 22a and counter electrode 22c.
  • the reagent layer 23 is formed on the upper surface of the working electrode 22a at the tip of the sensor 11.
  • the silver/silver chloride layer 24 is formed on the upper surface of the reference electrode 22b at the tip of the sensor 11, if necessary.
  • an example of a three-electrode configuration consisting of a working electrode 22a, a reference electrode 22b, and a counter electrode 23c is shown in order to realize more accurate measurement. It is also possible to adopt a two-electrode configuration consisting of 23c (for example, such a two-electrode configuration is the mainstream for currently commercially available SMBGs (self-monitoring blood sugar meters)).
  • the reference electrode can be a silver/silver chloride electrode formed with a silver/silver chloride (Ag/AgCl) layer 24 as shown in this embodiment, or a hydrogen electrode or a mercury-containing electrode such as a calomel electrode. A layer may be formed.
  • the film 25 is an insulating film that is formed (laminated) on predetermined portions of the electrodes 22 (working electrode 22a, reference electrode 22b, and counter electrode 22c) formed on the substrate 21 and on the silver/silver chloride layer 24. It is a sheet-like member with.
  • the thickness of the film 25 is usually 1 ⁇ m or more and 150 ⁇ m or less, preferably 3 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less, and more preferably 5 ⁇ m or more and 30 ⁇ m or less.
  • the film 25 has openings in a part corresponding to the reagent layer 23 at the tip of the sensor 11 and a part corresponding to a part of the counter electrode 22c, and the reagent layer 23 and the counter electrode 22c in these parts are exposed. .
  • the film 25 can be, for example, a sheet made of the same resin material as the substrate 21 and an adhesive sheet (for example, acrylic, rubber, or hot melt) attached thereto.
  • the sheet of resin material mentioned above may be a sheet of the same resin material as the substrate 21, or may be a sheet of a different resin material.
  • a single adhesive sheet may be used as the film 25. It is also possible to use as film 25 a thermo- or photoplastic resist film or a layer formed from a resist ink.
  • the reagent solution for forming the reagent layer 23 can be applied dropwise onto the surface of the electrode 22 (working electrode 22a) through the openings in the corresponding portions of the film 25.
  • the contact angle ( ⁇ ) of the reagent liquid with respect to the surface of the film 25 is determined by the contact angle ( ⁇ ) of the reagent liquid with respect to the opening of the film 25, that is, the exposed surface of the working electrode 22a.
  • ⁇ is preferably larger.
  • ⁇ is preferably 90° or more, and ⁇ is preferably 50° or less.
  • the "contact angle” here is a "static contact angle” measured by the " ⁇ /2 method.” Even if the material itself that forms the film 25 and/or the material that forms the exposed working electrode 22a does not satisfy the above-mentioned contact angle conditions, the film 25 can be treated with water repellent treatment by appropriate surface treatment. By performing at least one of hydrophilic treatment on the working electrode 22a, it is possible to satisfy the above contact angle conditions.
  • At least the portion of the sensor 11 that includes the reagent layer 23 may be covered with a protective film. That is, a protective film may be formed (laminated) on the upper surface of the reagent layer 23 in FIG. 2(B).
  • a protective film may be formed (laminated) on the upper surface of the reagent layer 23 in FIG. 2(B). The reagent layer will be discussed below with reference to FIGS. 4-6, where it is illustrated.
  • the method of manufacturing the sensor 11 is not particularly limited, and any method that can manufacture the sensor 11 having the above-described configuration at a predetermined portion can be appropriately selected and used.
  • the sensor 11 can be manufactured by performing the following steps (i) to (viii): (i) Step of forming (laminating) the electrode 22 on the upper surface of the substrate 21; (ii) forming grooves A1 and A2 that physically and electrically separate the electrode 22 into three regions: the working electrode 22a, the reference electrode 22b and the counter electrode 22c; (iii) forming a silver/silver chloride layer 24 on the upper surface of the electrode 22 (reference electrode 22b); (iv) forming (laminating) the film 25 on the upper surface of the electrode 22 and the silver/silver chloride layer 24; (v) forming a reagent layer 23 on the upper surface of the electrode 22 (working electrode 22a); (vi) removing part of the reagent layer 23 and the electrode 22 (region X6); (vii) Step of cutting out
  • the method for forming (laminating) the electrode 22 can be appropriately selected and adjusted in consideration of the combination of the material of the electrode 22 and the material of the substrate 21, etc.
  • the material of the substrate 21 is a synthetic resin such as PET and the material of the electrode 22 is a metal
  • the electrode 22 made of the metal material may be formed on the surface of the substrate 21 by vapor deposition (including sputtering).
  • other methods such as printing, plating, and spin coating can also be used.
  • the material of the substrate 21 is a synthetic resin such as PET and the material of the electrode 22 is carbon
  • the electrode 22 made of carbon can be formed by printing carbon paste on the surface of the substrate 21, for example.
  • the substrate 21 in this step does not need to have the shape of the sensor 11 in advance, and may have a larger size than the sensor 11 so that the sensor 11 can be cut out in the subsequent step (vii). can be used.
  • laser trimming for example, can be used as a means for forming the grooves A1 and A2.
  • the method for forming the silver/silver chloride layer 24 can be appropriately selected and adjusted in consideration of the combination of the material of the silver/silver chloride layer 24 and the material of the electrode 22, etc.
  • silver/silver chloride paste (ink) is printed or applied on the top surface of the electrode 22 made of metal or carbon by a screen printing method, an inkjet method, etc., and then dried.
  • a silver/silver chloride layer 24 can be formed.
  • the silver/silver chloride layer 24 can also be formed by printing, coating, plating, etc. with silver (Ag) on the upper surface of the electrode 22 and then subjecting the surface to a chlorination treatment.
  • the method for forming (laminating) the film 25 can be appropriately selected and adjusted in consideration of the combination of the material of the film 25 and the materials of the electrode 22 and silver/silver chloride layer 24.
  • an opening corresponding to the dimensions of the reagent layer 23 is formed in the film 25 made of a laminate of a resin sheet and an adhesive sheet, or made of a single adhesive sheet.
  • Such a film 25 is placed on the upper surface of the electrode 22 so that its opening surrounds the portion of the electrode 22 (working electrode 22a) that forms the reagent layer 23, and is fixed with an adhesive sheet.
  • the film 25 having a predetermined opening can also be formed (laminated) by removing a portion with a predetermined position and size as described above using a resist film or resist ink.
  • the film 25 is not formed on the upper surface of a part (region X3) of the counter electrode 22c of the electrode 22, and the counter electrode 22c is exposed. Therefore, for example, after once forming a film including the upper surface of the counter electrode 22c as described above, a notch-shaped opening may be formed in the film 25 by cutting or the like.
  • the reagent solution is applied to the opening of the film 25 formed (laminated) in the above step (iv). It can be applied to at least a part of the working electrode 22a by dropping it onto the area. Then, by drying the applied reagent solution, a reagent layer 23 is formed on the upper surface of the working electrode 22a.
  • the opening of the film 25 may have, for example, a size and shape such that a reagent layer having a width larger than the width of the sensor 11 (the tip portion shown in FIG. 1(B)) is formed.
  • the reagent layer formed from the applied reagent liquid to be larger than the width of the sensor 11 is shaped to have a predetermined width and shape in the next step (vi).
  • the removal (trimming) of the reagent layer 23 and the electrode 22 in the above step (vi) is performed at a predetermined position in the length direction of the sensor 11 (for example, in the direction of insertion into the living body) at the widthwise end of the sensor 11 (tip portion). carried out over the length of After the reagent layer is formed over a certain area by trimming in step (vi), an appropriate portion (preferably a uniform portion) is selected to form a reagent layer with a predetermined area aligned between the sensors. In addition to the formation, in the next step (vii), the sensor 11 can be cut out from the substrate 21 along its outer shape without breaking the formed reagent layer.
  • the method for removing the reagent layer 23 and the electrode 22 can be appropriately selected and adjusted in consideration of the material of the reagent layer 23 (composition of the reagent solution), the material of the electrode 22, and the like.
  • reagent layer 23 and electrode 22 can be removed by laser trimming.
  • the method of cutting out (cutting) the sensor 11 from the substrate 21 can be appropriately selected and adjusted in consideration of the material of the substrate 21, the shape of the sensor to be cut out, etc.
  • the material of the substrate 21 is resin
  • a general cutting technique can be used.
  • the cutting position includes the portion trimmed in step (vi), and for example, the cutting position may be near the center line of the bottom portion of the recessed portion by laser trimming. In other words, the cutting is performed at a position somewhat distant from the trimmed reagent layer 23 and the working electrode 22a.
  • the material of the protective film that is, the composition of the protective film solution, and the material of the coated part (mainly the reagent It can be selected and adjusted as appropriate by considering the combination of materials for the layer 23 (ie, the composition of the reagent solution), the shape and area of the portion to be coated, etc. For example, by immersing the working electrode 22a (at least the part where the reagent layer 23 is formed) in a protective film solution, pulling it up and drying it, that part can be covered with a protective film.
  • FIG. 3 is a plan view showing a sensor 101 in another embodiment of the present invention.
  • the sensor 101 is composed of a sensing part (a tip part inserted into a living body or immersed in a culture medium) 121, and a terminal part 122 for electrical connection with an internal circuit of a main body (not shown). Ru.
  • FIG. 4 shows a cross-sectional view of the sensor 101 taken along the line A-A' in FIG.
  • a conductive thin film 112 is provided on both sides of an insulating substrate 111.
  • the conductive thin film 112 on one surface (front side) of the insulating substrate 111 is formed with a groove 113 deep enough to reach the surface of the insulating substrate 111 by laser drawing to electrically insulate the working electrode region 112a. and a reference pole region 112b.
  • the upper surface of the insulating substrate 111 is covered with an insulating resist film 116a having an opening for forming the reference electrode 115 at a predetermined position of the reference electrode region 112b, and the lower surface of the insulating substrate 111 is covered with an insulating resist film 116a. 116b.
  • the upper nor the lower surfaces are covered with the insulating resist films 116a and 116b, and the region 112a on the front side becomes the working electrode 114, and the region 112c on the back side. becomes the counter electrode 117.
  • Reagent layer 118 is formed on working electrode 114.
  • FIG. 5 shows a cross-sectional view taken along the line B-B' in FIG. 4
  • FIG. 6 shows a cross-sectional view taken along the line C-C' in FIG.
  • the protective film 119, reagent layer 118, working electrode 114, insulating substrate 111, counter electrode 117, and A protective film 119 is formed. Further, as shown in FIG.
  • the protective film 119, the reference electrode 115 (insulating resist film 116a), the working electrode region 112a, an insulating substrate 111, a counter electrode region 112c, an insulating resist film 116b, and a protective film 119 are formed.
  • the working electrode region 112a and the counter electrode region 112c shown in FIG. 6 have insulating resist films 116a and 116b on their upper surfaces, so they do not function as a working electrode and a counter electrode.
  • FIG. 7 is a plan view showing a sensor 201 in another embodiment of the present invention.
  • the sensor 201 includes a sensing section 202 having a configuration for electrochemically measuring an analyte, a terminal section 203 having a configuration for electrically connecting to an internal circuit of a main body (not shown), and a terminal. It includes a notch 204 provided near the section.
  • the sensor 201 is a preferred embodiment when constructing a system for measuring analytes in a culture medium, for example, and the sensing part 202 has a structure that can be immersed even in a medium with a small liquid volume,
  • the cutout 204 has a structure suitable for installing the sensor 201 in the culture container.
  • FIG. 7(A) shows the electrode pattern before the film (insulating resist film) 230 is formed
  • FIG. 7(B) shows the electrode pattern after the film 230 is formed.
  • an electrode 220 is formed on a substrate 210, and the electrode 220 is physically and electrically connected to a first working electrode 221, a second working electrode 221, and a second working electrode 221 through a groove 225. It is separated into a working electrode 222, a reference electrode 223, and a counter electrode 224.
  • the first working electrode 221 has an exposed region 221a in the sensing section 202 and an exposed region 221b in the terminal section 203.
  • the second working electrode 222, the reference electrode 223, and the counter electrode 224 have exposed regions 222a, 223a, and 224a in the sensing section 202, and exposed regions 222b, 223b, and 224b in the terminal section 203, respectively.
  • an exposed region 221a of a first working electrode and an exposed region 222a of a second working electrode are arranged side by side to maximize the area
  • an exposed region 223a of a reference electrode and an exposed region 222a of a counter electrode are arranged side by side to maximize the area.
  • An exposed region 224a is also arranged.
  • Different types of reagent layers for measuring different analytes can be formed in the exposed region 221a of the first working electrode and the exposed region 222a of the second working electrode, respectively.
  • the exposed areas 221b, 222b, 223b, and 224b in the terminal portions 203 of the first working electrode, second working electrode, reference electrode, and counter electrode are connected to the main body (not shown) by, for example, electrode pads (not shown). can be connected.
  • Non-anionic dispersant (Non-b) Hydroxypropyl cellulose...NISSO HPC by Nippon Soda Co., Ltd.
  • Cationic mediator (c) Polymer-bound PNT1...phenothiazine compound NHS form (PNT-70) as redox mediator compound (c1) and 2-aminoethyl methacrylate as cationic polymer (c2) It has a structure in which hydrochloride, (4-vinylphenyl)methanamine, and a copolymer of methacryloylcholine chloride (hereinafter referred to as "Polymer C”) are bonded.
  • c-2 Polymer-bound PNT2...phenothiazine compound (PNT-70) as a redox mediator compound (c1) and poly(L-lysine) hydrochloride (ALAMANDA POLYMERS Co., Ltd.) as a cationic polymer (c2) PLKC800" (hereinafter referred to as "PLL").
  • PNT-70, Polymer C, Polymer-bonded PNT1, and Polymer-bonded PNT2 are as follows.
  • a sulfonic acid fragment was synthesized by the above reaction.
  • a carboxylic acid fragment was synthesized by a two-step reaction in acetonitrile and tetrahydrofuran (THF) as described above.
  • the sulfonic acid fragment and carboxylic acid fragment synthesized as described above were suspended in MeOH/H 2 O, and 50% Ag 2 CO 3 /Celite was added in portions over 15 minutes at an internal temperature of around 47°C. After the addition, the mixture was stirred for 2.5 hours at an internal temperature of around 68°C. After cooling to room temperature, the mixture was filtered through Celite and the filtrate was concentrated. PNT-34 was obtained by purifying the residue multiple times using silica gel column chromatography.
  • PNT-34 was dissolved in dichloromethane, and after adding amino-PEG12-t-butyl ester and 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDCI HCl), at room temperature. Stirred for 3 hours. After concentrating the reaction solution, it was purified three times by silica gel column chromatography to obtain a condensate (PNT-68).
  • the deprotected product (PNT-69) was dissolved in dichloromethane, N-hydroxysuccinimide (NHS) and EDCI/HCl were added, and the mixture was stirred at room temperature for 4 hours.
  • the reaction solution was purified by silica gel column chromatography to obtain PNT-69NHS (PNT-70) in which the terminal carboxy group of the PEG chain (PEG12) was activated (NHS esterification).
  • 2-aminoethyl methacrylate hydrochloride, (4-vinylphenyl)methanamine, and methacroylcholine chloride were prepared. Then, in a four-necked flask, add 0.97 mmol of 2-aminoethyl methacrylate hydrochloride, 0.97 mmol of (4-vinylphenyl)methanamine, 11.97 mmol of methacroylcholine chloride, 0.08 mmol of V-50, and ethanol. 10.49g was added. Thereafter, the same treatment as in the case of Polymer A was performed to obtain Polymer C.
  • GPC gel permeation chromatography
  • the total volume was adjusted to 1200 ⁇ L with MilliQ water. Thereafter, the reaction was allowed to proceed for about 20 hours at room temperature with stirring. Thereafter, ultrafiltration was performed several times using a centrifugal ultrafiltration filter (Amicon Ultra-4 50k; Merck Millipore), and the liquid from which low molecules were removed was collected.
  • a centrifugal ultrafiltration filter Amicon Ultra-4 50k; Merck Millipore
  • ⁇ Filtering of reagent solution The reagent solution sample obtained as described above was treated in an ultrasonic bath for about 10 minutes before use.
  • the obtained redispersion liquid sample was filtered with a 0.8 ⁇ m filter (ADVANTEC, DISMIC 25CS080AN), and the collected filtrate was diluted 10 times with Milli-Q water to obtain a recovered liquid sample.
  • a photographed image of the recovered liquid sample is shown in Figure 8.
  • the conductive carbon filler (a) is dispersed in an aqueous solvent, although there are differences in degree.
  • the reagent solution sample was prepared as follows. First, the conductive carbon filler (a) was added to an aqueous solution of the anionic dispersant (b) and treated with an ultrasonic homogenizer for 3 minutes or more, and the buffer solution (f) and metal salt (g) were added thereto. Next, a cationic mediator (c) was added to the treatment solution, and the treatment solution was treated with an ultrasonic homogenizer for about 30 seconds. The presence or absence of aggregation in the obtained reagent liquid sample was visually confirmed. The results are also shown in Table 3.
  • Test Example 3 pH and metal ion concentration dependence test part 2 Reagent liquid samples containing various components at predetermined concentrations were prepared according to the formulations shown in Table 4. In addition, in this test example 3, the pH is adjusted using a buffer solution that does not contain metal ions (metal salts), and then the dispersibility of reagent liquid samples containing different concentrations of metal ions (metal salts) is compared. It is something.
  • the reagent solution sample was prepared as follows. First, the conductive carbon filler (a) was added to an aqueous solution of the anionic dispersant (b) and treated with an ultrasonic homogenizer for 3 minutes or more, and the buffer solution (f) and metal salt (g) were added thereto. Next, a cationic mediator (c) was added to the treatment solution, and the treatment solution was treated with an ultrasonic homogenizer for about 30 seconds. The presence or absence of aggregation in the obtained reagent liquid sample was visually confirmed. The results are also shown in Table 4.
  • Test Example 4 pH and metal ion concentration dependence test part 3 Reagent liquid samples containing various components at predetermined concentrations were prepared according to the formulations shown in Table 5. In this Test Example 4, the pH was adjusted using a buffer solution that does not contain metal ions (metal salts), and then the dispersibility of reagent solution samples containing different types and concentrations of metal salts (metal ions) was tested. It is for comparison.
  • the reagent solution sample was prepared as follows. First, the conductive carbon filler (a) was added to an aqueous solution of the anionic dispersant (b) and treated with an ultrasonic homogenizer for 3 minutes or more, and the buffer solution (f) and metal salt (g) were added thereto. Next, a cationic mediator (c) was added to the treatment solution, and the treatment solution was treated with an ultrasonic homogenizer for about 30 seconds.
  • the occurrence of aggregation varies depending on the type of metal ion contained in the reagent solution, but in general, when the concentration of metal ions is high, aggregation tends to occur easily. It is suggested that if the concentration of metal ions is less than 100mM, the occurrence of aggregation can be suppressed for many metal ions; It was found that in some cases, it is possible to suppress the occurrence of aggregation (even if the conductive carbon filler is used), and therefore, within an appropriate concentration range depending on the type of metal ion, the dispersibility of the conductive carbon filler can be improved and aggregation can be suppressed.
  • Test of anionic dispersant (b) According to the formulation shown in Table 6, reagent liquid samples containing various components at predetermined concentrations were prepared.
  • the test liquid sample was prepared as follows. First, the conductive carbon filler (a) was added to an aqueous solution of the anionic dispersant (b), treated with an ultrasonic homogenizer for 3 minutes or more, and the buffer solution (f) was added thereto. Next, a cationic mediator (c) was added to the treated solution and treated with an ultrasonic homogenizer for about 30 seconds, and finally, an oxidoreductase (d) and a crosslinking agent (e) were added to the treated solution.
  • the test liquid sample was prepared as follows. First, the conductive carbon filler (a) was added to an aqueous solution of the anionic dispersant (b) or its counterpart and treated with an ultrasonic homogenizer for 3 minutes or more, and the buffer solution (f) was added thereto. Next, a cationic mediator (c) was added to the treated solution and treated with an ultrasonic homogenizer for about 30 seconds, and finally, an oxidoreductase (d) and a crosslinking agent (e) were added to the treated solution.
  • RPMI-1640 Medium R1383, manufactured by Sigma-Aldrich
  • 2-morpholinoethanesulfonic acid MES, manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.
  • MOPS 3-morpholinopropanesulfonic acid
  • a three-electrode system consisting of the sensor electrode prepared as described above as a working electrode, a platinum electrode as a counter electrode, and an Ag/AgCl electrode (saturated KCl) (manufactured by BAS) as a reference electrode.
  • the time change in current (current response value) in RPMI medium at about 37° C. was measured by amperometric method using a potentiostat (manufactured by BAS). Specifically, glucose was added every 100 seconds from 100 seconds after the start of measurement to the theoretical value of 3 mM, 15 mM, or 30 mM, and the current response value was measured.
  • the current response value was calculated from the measured values at 5 points after adding the glucose to be measured, 5 seconds before, 10 seconds before, 15 seconds before, 20 seconds before, and 25 seconds before the next glucose addition. The average value was used.
  • the current value at the final concentration was determined from the measured values at 5 points 80 seconds, 85 seconds, 90 seconds, 95 seconds, and 100 seconds after adding the glucose solution so that the glucose concentration was 30 mM. The calculated average value was used. Note that the current value at each glucose concentration is the current value after performing background correction processing to subtract the current value at the glucose concentration of 0 mM.
  • cyclic voltammetry was performed in a RPMI medium using a similar three-electrode measurement system.
  • the scanning speed was 10 mV/s. Note that both the current response value and the cyclic voltammetry results are the average of the measured values of two sensors.
  • Test Example 7 Durability (response maintenance rate) evaluation test ⁇ Preparation of reagent solution> In Test Example 7, reagent liquid samples 6-1 and 6-6 in Test Example 6 were prepared again and used.
  • tBuMA4VP tBuMA4VP
  • TGMAS4VP TGMAS4VP
  • PEGDGE PEGDGE
  • Mw/Mn 1.16
  • the number average molecular weight Mn of PEGDGE is ⁇ 1,000.
  • the HEPES buffer solution was prepared using 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl]ethanesulfonic acid (manufactured by Dojindo Chemical Co., Ltd.).
  • a three-electrode system consisting of the sensor electrode prepared as described above as a working electrode, a platinum electrode as a counter electrode, and an Ag/AgCl electrode (saturated KCl) (manufactured by BAS) as a reference electrode.
  • time changes in current in RPMI medium at approximately 37° C. were measured by an amperometric method using a potentiostat (manufactured by BAS). Specifically, glucose was added every 1000 seconds from 1500 seconds after the start of measurement to a theoretical value of 5 mM, 15 mM, or 30 mM, and the current response value was continuously measured.
  • the current values at glucose concentrations of 5mM and 15mM are measured at 5 seconds, 10 seconds, 15 seconds, 20 seconds, and 25 seconds after adding the glucose to be measured, immediately before adding the next glucose. This is the average value calculated from the measured values at the points.
  • the current value at the final concentration was determined from the measured values at 5 points after 980 seconds, 985 seconds, 990 seconds, 995 seconds, and 1000 seconds after adding the glucose solution so that the glucose concentration was 30 mM. This is the calculated average value.
  • the current value at each glucose concentration is the current value after performing background correction processing to subtract the current value at the glucose concentration of 0 mM.

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Abstract

本発明は、アナライトを高感度で検出することのできる、かつ／または、長期間にわたる測定（連続モニタリング）にとって好適な耐久性に優れている、電気化学センサを作製するための試薬層およびその形成方法を提供することを課題とする。本発明による試薬層は、導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む。本発明による試薬層の形成方法は、（１）導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む試薬液を調製する工程、（２）前記試薬液を試薬層形成部位にアプライする工程、及び（３）アプライされた前記試薬液を乾燥させて、試薬層を形成する工程、を含む。

Description

導電性炭素フィラーを含む試薬層、当該試薬層を有するセンサ、および当該試薬層の形成方法
　本発明は、導電性炭素フィラーを含む試薬層およびセンサに関する。より詳しくは、本発明は、導電性炭素フィラーの水系溶媒への分散性を向上させるための剤としての導電性炭素フィラー分散剤、当該分散剤、導電性炭素フィラーおよびカチオン性メディエータを含む試薬層、当該試薬層を備えたセンサ、および当該試薬層の形成方法に関する。
　従来、試料中のアナライトにタンパク質を作用させてアナライトを測定するセンサが知られている。このようなセンサとしては、酵素を用いた電気化学センサ、例えば、グルコース酸化還元酵素と、必要に応じてレドックスメディエータ（電子伝達を仲介する酸化還元物質）や、レドックスポリマー（リンカー等を介してレドックスメディエータを結合させたポリマー）などを用いて作製される、グルコースセンサが挙げられる。グルコースセンサは、例えば、血糖値の自己検査のために用いられており、従来は微量の血液を採取して試料とするものが一般的であったが、近年では、生体内に埋め込んで血液中または間質中のグルコースを連続的に測定する、埋め込み型の電気化学式グルコースセンサも開発されている。また、グルコースセンサは、生体物質外の試料、例えば培地中のグルコースを測定するためにも用いられている。このようなグルコースセンサは、一般的には数日～数週間といった長時間、連続的又は半連続的に試料中のグルコース濃度の測定を行う。
　このような電気化学式グルコースセンサに代表されるグルコースセンサや、バイオ燃料電池に用いられている電極には、近年、電極比表面積の向上による高感度化や高出力化を実現する観点から、ナノカーボン材料等の高比表面積の導電性炭素フィラーが用いられている。例えば、特許文献１には、ヒドロキシプロピルセルロースを用いたカーボンブラック分散液で作製したセンサが開示されており、特許文献２には、バインダーとしてのエチルセルロースと、カーボン粒子とを用いた酵素固定化電極が開示されている。
特開２０２１－０８２３９４号公報 ＷＯ２０１３／０６５５８１号公報
　一般的に、導電性炭素フィラーおよびレドックスメディエータまたはレドックスポリマーを含み、必要に応じて酸化還元酵素等をさらに含む試薬層を、作用極（酵素電極）などに形成するためには、水系溶媒中にそれらの必要な成分を分散させた試薬液を調製し、その試薬液を所望の部位にアプライし、乾燥させることが行われている。しかしながら、導電性炭素フィラーは、一般的に疎水性が強いために水系溶媒への分散が難しく、また、ファンデルワールス力により凝集が起きやすいため、分散状態を保持するのは困難である。導電性炭素フィラーが十分に分散していない試薬液を用いて試薬層を形成した場合は、アナライトの検出感度が著しく低下したり、生体内や培地内のような湿潤環境中での長期間にわたる測定（連続モニタリング）において、耐久性に劣ったりする問題が起きる。なお、酸化還元酵素は水系溶媒に溶解させることが適切であり、試薬液を調製するための溶媒として有機溶剤を用いることは適切でない。
　本発明は、一側面において、アナライトを高感度で検出することのできる電気化学センサを作製するための試薬層およびその形成方法を提供することを課題とする。本発明は、別の側面において、長期間にわたる測定（連続モニタリング）にとって好適な、耐久性に優れた電気化学センサを作製するための試薬層およびその形成方法を提供することを課題とする。
　本願発明者らは、導電性炭素フィラーおよびカチオン性のレドックスメディエータまたはレドックスポリマー（カチオン性メディエータ）と、アニオン性分散剤とを用いて、好ましくは特定の条件で調製した試薬液中では、導電性カーボン粒子の凝集や沈澱が生じず、分散状態が良好なものとなること、そのような試薬液を用いて形成された試薬層は、電極上へ密接にカチオン性メディエータを吸着させることができるため、電気化学センサはアナライトの検出感度が向上し、また連続モニタリングにとっての耐久性に優れたものとなることなどを見出し、本発明を完成させるに至った。
　すなわち、本発明は少なくとも下記の事項を包含する。
［項１］
　導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む試薬層。
［項２］
　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、重量平均分子量が７００００以下のポリマーである、項１に記載の試薬層。
［項３］
　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、側鎖にカルボキシ基および／またはスルホ基を有するポリマーである、項１に記載の試薬層。
［項４］
　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、アクリル酸由来ユニット、マレイン酸由来ユニット、およびスチレンスルホン酸由来ユニットからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むポリマーである、項３に記載の試薬層。
［項５］
　前記カチオン性メディエータ（ｃ）が、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）とカチオン性ポリマー（ｃ２）とが、必要に応じてリンカー部（ｃ３）を介して、結合している化合物である、項１に記載の試薬層。
［項６］
　前記カチオン性ポリマー（ｃ２）が、第四級アンモニウムカチオン基を有する、項５に記載の試薬層。
［項７］
　前記導電性炭素フィラー（ａ）が、カーボンブラックである、項１に記載の試薬層。
［項８］
　アナライトを酸化または還元する酸化還元酵素（ｅ）をさらに含む、項１に記載の試薬層。
［項９］
　前記酸化還元酵素（ｅ）が、補酵素結合型のものである、項８に記載の試薬層。
［項１０］
　前記酸化還元酵素（ｅ）が、前記カチオン性ポリマー（ｃ２）と架橋されている、項８に記載の試薬層。
［項１１］
　アナライトを検出又は定量する電気化学センサであって、作用極、対極、および項１～１０のいずれか一項に記載の試薬層を有する、電気化学センサ。
［項１２］
　さらに参照極を有する、項１１に記載の電気化学センサ。
［項１３］
　さらに、少なくとも前記試薬層を被覆する保護膜を有する、項１１に記載の電気化学センサ。
［項１４］
　（１）導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む試薬液を調製する工程、
　（２）前記試薬液を試薬層形成部位にアプライする工程、及び
　（３）アプライされた前記試薬液を乾燥させて、試薬層を形成する工程、
を含む、試薬層の形成方法。
［項１５］
　前記試薬液のｐＨが８．０以下である、項１４に記載の試薬層の形成方法。
［項１６］
　前記試薬液中の金属イオンの濃度が２００ｍＭ以下である、項１５に記載の試薬層の形成方法。
［項１７］
　前記試薬液中の前記金属イオンがアルカリ金属イオンであり、その濃度が１００ｍＭ未満である、項１６に記載の試薬層の形成方法。
［項１８］
　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、重量平均分子量が７００００以下の、アクリル酸由来ユニット、マレイン酸由来ユニット、およびスチレンスルホン酸由来ユニットからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むポリマーである、項１４に記載の試薬層の形成方法。
［項１９］
　前記カチオン性メディエータ（ｃ）が、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）と、第四級アンモニウムカチオン基を有するカチオン性ポリマー（ｃ２）とが、必要に応じてリンカー部（ｃ３）を介して、結合している化合物である、項１４に記載の試薬層の形成方法。
　本発明により、水系溶媒を含む試薬液中で導電性炭素フィラーを良好に分散させることができるようになる。また、そのような導電性炭素フィラーが分散した試薬液（カーボン分散液）を用いることにより、導電性炭素フィラーを含みながらも高感度化や耐久性（例えば、湿潤環境中での測定において、その測定期間中応答性を維持する性能）の向上を実現した、実用性に優れた電気化学センサを作製することが可能となる。
　なお、本発明において、試薬液中で導電性カーボン材料が「分散」（「再分散」を含む。）しているか、「凝集」（「凝集／沈澱」を含む。）しているかは、大半が目視で判別可能である。例えば、導電性カーボン材料が「凝集」している場合は、浮遊または沈澱している凝集塊を容易に目視で確認することができる。
　導電性炭素フィラーの分散および凝集を判別する際には、遠心分離処理を利用することもできる。例えば、導電性炭素フィラーが「分散」している試薬液を遠心分離した場合は、導電性炭素フィラーの沈澱は生じないのに対し、導電性炭素フィラーが「凝集」している試薬液を遠心分離した場合は、凝集塊が沈澱し、導電性炭素フィラーの層と透明な水溶液相に分離する。遠心分離の処理条件は、例えば、１０，０００×ｇ、５分間とすることができるが、実施形態に応じて、例えば導電性炭素フィラーの種類およびその濃度を考慮して、適宜調節することもできる。
図１は、本発明の一実施形態におけるセンサの平面図である。図１（Ａ）はセンサ全体を示し、図１（Ｂ）はセンサの先端部分を拡大して示す。 図２は、図１（Ｂ）の特定の部分における、センサの断面図である。図２（Ａ）は、図１（Ｂ）のＡＡ矢視断面図である。図２（Ｂ）は、図１（Ｂ）のＢＢ矢視断面図である。図２（Ｃ）は、図１（Ｂ）のＣＣ矢視断面図である。 図３は、本発明の一実施形態におけるセンサの表側（作用極及び参照極を有する側）の別の一例を示す上面図である。 図４は、図３におけるＡ－Ａ’切断線における断面図である。 図５は、図４におけるＢ－Ｂ’切断線における断面図である。 図６は、図４におけるＣ－Ｃ’切断線における断面図である。 図７は、本発明の一実施形態におけるセンサの平面図である。図７（Ａ）はフィルム（絶縁性レジスト膜）が形成される前の電極パターンを示し、図７（Ｂ）は、フィルムが形成された後の電極パターンを示す。 図８は、試験例１において調製された各種の試薬液サンプルに由来し、カーボンブラックの分散化効果を反映している、回収液サンプルの画像である。［Ａ］試薬液サンプル１－１～１－８にそれぞれ対応する回収液サンプル。［Ｂ］試薬液サンプル１－９～１－１１にそれぞれ対応する回収液サンプル。 図９は、試験例６におけるセンサの応答性に関する測定結果を示す。［Ａ］電流応答値の結果。［Ｂ］サイクリックボルタンメトリーの結果。 図１０は、試験例７におけるセンサの耐久性に関する測定結果を示す。［Ａ］ポリ(アクリル酸)を用いて作製されたセンサの結果。［Ｂ］ヒドロキシプロピルセルロースを用いて作製されたセンサの結果。
　１１　　センサ（プローブ）
　２１　　基板
　２２　　電極
　２２ａ　作用極
　２２ｂ　参照極
　２２ｃ　対極
　２３　　試薬層
　２４　　銀／塩化銀層
　２５　　フィルム
　Ｘ１　　センサ頭部
　Ｘ２　　センサの生体への挿入方向
　Ｘ３　　対極の、フィルムで被覆されていない領域
　Ｘ４　　センサ頭部の、フィルムで被覆されていない領域
　Ｘ５　　試薬層が形成されていない領域
　Ｘ６　　試薬層および電極（作用極）が形成されていない（トリミングされている）領域
１０１　　センサ
１１１　　絶縁性基板
１１２　　導電性薄膜
１１２ａ　作用極領域
１１２ｂ　参照極領域
１１２ｃ　対極領域
１１３　　溝
１１４　　作用極
１１５　　参照極
１１６ａ　　絶縁性レジスト膜（上面）
１１６ｂ　　絶縁性レジスト膜（下面）
１１７　　対極
１１８　　試薬層
１１９　　保護膜
１２１　　センシング部
１２２　　端子部
２０１　　センサ
２０２　　センシング部
２０３　　端子部
２０４　　切り欠き部
２１０　　基板
２２０　　電極
２２１　　第１の作用極
　２２１ａ　第１の作用極のセンシング部における露出領域
　２２１ｂ　第１の作用極の端子部における露出領域
２２２　　第２の作用極
　２２２ａ　第２の作用極のセンシング部における露出領域
　２２２ｂ　第２の作用極の端子部における露出領域
２２３　　参照極
　２２３ａ　参照極のセンシング部における露出領域
　２２３ｂ　参照極の端子部における露出領域
２２４　　対極
　２２４ａ　対極のセンシング部における露出領域
　２２４ｂ　対極の端子部における露出領域
２２５　　溝
２３０　　フィルム（絶縁性レジスト膜）
―　試薬層　―
　本発明の試薬層は、導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む。本発明の試薬層は、後述するようなカーボン分散液、すなわち導電性炭素フィラー（ａ）が分散された状態にある試薬液を使用する形成方法により形成することができる層であり、好ましくは導電性炭素フィラー（ａ）、アニオン性分散剤（ｂ）およびカチオン性メディエータ（ｃ）が均一な状態にある層である。
　（ａ）導電性炭素フィラー
　本発明における「導電性炭素フィラー」は特定の種類に限定されるものではなく、本発明の実施形態（試薬層、電気化学センサの用途等）、作用効果等を考慮して、様々な導電性炭素フィラーを用いることができる。導電性炭素フィラーとしては、球状（粒子状）、鱗片状、繊維状、多孔質状等の様々な形状の導電性カーボン材料を用いることができる。導電性炭素フィラー（ａ）は、いずれか１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を併用しても（例えば混合して用いても）よい。
　導電性炭素フィラーとしては、例えば、カーボンブラック、黒鉛粉、多孔質炭素材料、ナノカーボン材料等が挙げられる。カーボンブラックの具体例としては、ファーネスブラック、サーマルブラック、アセチレンブラック、ケッチェンブラック、チャンネルブラックが挙げられる。黒鉛粉の具体例としては、熱分解黒鉛、球状黒鉛が挙げられる。多孔質炭素材料の具体例としては、２～５０ｎｍのメソ孔を有する活性炭粉末または活性炭素繊維だけでなく、メソ孔がつながった連通孔を有する炭素材料も挙げられる。ナノカーボン材料の具体例としては、単層カーボンナノチューブ、多層カーボンナノチューブ、グラフェン、フラーレン、カーボンナノホーン、カーボンナノコイルが挙げられる。導電性炭素フィラー（ａ）のサイズは適切な範囲にあればよい。例えば、導電性炭素フィラーが球状（粒子状）である場合、その平均粒子径（例えば、電子顕微鏡により所定の数の粒子について測定した平均値）は、一般的に１０ｎｍ～２０μｍの範囲にある。導電性炭素フィラーのＢＥＴ比表面積は、例えば１０ｍ２／ｇ以上であり、好ましくは３０ｍ２／ｇ以上である。本発明における導電性炭素フィラー（ａ）は、好ましくは球状（粒子状）の炭素フィラー、例えばカーボンブラックである。
　（ｂ）アニオン性分散剤
　本発明において「アニオン性分散剤」とは、試薬液中で導電性炭素フィラー（ａ）を分散させるための本質的な機能を有する化合物であって、かつ分子全体の正味の電荷として負に荷電している（アニオン性である）化合物を指す。アニオン性分散剤（ｂ）は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、２種以上を併用しても（例えば混合して用いても）よい。
　ただし、「アニオン性界面活性剤」および「アニオン性多糖類」は、本発明におけるアニオン性分散剤（ｂ）には該当しない。アニオン性界面活性剤としては、例えば、メチルナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物塩（例：メチルナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩、製品名「デモールＭＳ」（花王））、ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物塩（例：β－ナフタレンスルホン酸ホルマリン縮合物ナトリウム塩、製品名「デモールＮ」（花王））、アルキレンマレイン酸共重合体塩（例：ジイソブチレン・無水マレイン酸共重合体ナトリウム塩、製品名「デモールＥＰ」（花王））、ドデシル硫酸ナトリウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。アニオン性多糖類としては、例えば、カルボキシメチルセルロース等のアニオン性セルロース誘導体、カルボキシメチル化グアーガム等のアニオン性グアーガム類、キサンタンガム類が挙げられる。このようなアニオン性界面活性剤またはアニオン性多糖類は、本発明のアニオン性分散剤（ｂ）としては用いられない。
　本発明の特定の実施形態における電気化学センサは、センサ（作用極）に形成された試薬層を被覆する保護膜を有する。このような実施形態では、保護膜外（生体内、培地中等）にアニオン性分散剤（ｂ）が流出することを防止するために、保護膜を形成した後に、そのセンサ（作用極）をあらかじめ水系溶媒に浸すことで、アニオン性分散剤（ｂ）を試薬層から溶出させて除去してもよい。このような処理において、保護膜の有する孔のサイズと分子量の関係によっては、例えば導電性炭素フィラー（ａ）と結合したアニオン性分散剤（ｂ）は、試薬層から溶出（保護膜外への溶出）されない／され難いが、導電性炭素フィラー（ａ）と結合していないアニオン性分散剤（ｂ）は、試薬層から溶出（保護膜外への溶出）されることになる。なお、この処理における水系溶媒としては、後述する本発明の試薬層の形成方法で使用される、試薬液を調製するための水系溶媒と同様のものを用いることができる。
　例えば、試薬液中で導電性炭素フィラー（ａ）を分散させるための本質的な機能を有するポリマーであって、かつポリマー全体の正味の電荷として負に荷電している（アニオン性である）「アニオン性ポリマー」（アニオン性界面活性剤およびアニオン性多糖類に該当するものを除く。）は、本発明におけるアニオン性分散剤（ｂ）として用いることができる。アニオン性ポリマーは、直鎖状、分岐鎖状、櫛状、いずれの「鎖状の構造」であってもよく、その「鎖状の構造」は、環式化合物（芳香族炭化水素環、非芳香族炭化水素環、芳香族ヘテロ環、非芳香族ヘテロ環等）から誘導される環構造を一つまたは複数含んでいてもよい。アニオン性ポリマーの主鎖（鎖状の構造中、ポリマー長が相対的に長い部分）および側鎖（鎖状の構造中、ポリマー長が相対的に短い部分）は、一般的に炭素原子を主体とし、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１種のヘテロ原子を含んでいてもよい、換言すれば、途中にエーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合などヘテロ原子を含む結合が存在していてもよい。アニオン性ポリマーは、一般的に、複数（多数）の負に荷電する官能基（アニオン性官能基）を側鎖に有し、さらに主鎖の一方または両方の末端にアニオン性官能基を有していてもよい。アニオン性官能基を側鎖および／または末端に有するアニオン性ポリマーとしては様々なものが公知となっており、所望の性状を有するものを購入したり、適切なポリマーを改変して作製したり、適切なモノマーを用いて合成したりすることが可能である。アニオン性ポリマーは、ホモポリマー（単独重合体）、コポリマー（共重合体）、およびそれらが結合および／または混合されたポリマーのいずれであってもよく、またランダムポリマー、ブロックポリマー、グラフトポリマーのいずれであってもよい。
　アニオン性官能基としては、例えば、置換基を有していてもよいカルボキシ基、好ましくは無置換のカルボキシ基であって、水系溶媒中で－ＣＯＯ－を生じる基や、置換基を有していてもよいスルホ基、好ましくは無置換のスルホ基であって、水系溶媒中で－ＳＯ３ －を生じる基が挙げられる。
　アニオン性ポリマーとしては、例えば、エチレン系ポリマーであって、側鎖（および末端）にアニオン性官能基を有するものが挙げられる。エチレン系ポリマーとしては、ラジカル重合が可能なエチレン性炭素－炭素二重結合、例えばビニル基（ＣＨ２＝ＣＨ－）、アリル基（ＣＨ２＝ＣＨ－ＣＨ２－）、アクリロイル基（ＣＨ２＝ＣＨ－Ｃ(Ｏ)－）、メタクリロイル基（ＣＨ２＝Ｃ(ＣＨ３)－Ｃ(Ｏ)－）などを含むモノマーから選ばれる、１種または２種以上のモノマーから合成される、ホモポリマーおよびコポリマーならびにそれらの修飾物（例えば酢酸ビニルに由来する単位をケン化によりビニルアルコール化したものや、親水性を賦与するような処理をしたもの）が挙げられる。エチレン性炭素－炭素二重結合を含むモノマーとしては、例えば、エチレン、プロピレン、ブタジエン、イソブテン、テトラフルオロエチレン、ビニルアルコール、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレン、メチルスチレン、アリルアミン、ジアリルアミン、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸、メタクリル酸、メチルアクリレート（別称アクリル酸メチル）、メチルメタクリレート（別称メタクリル酸メチル）、ブチルアクリレート（別称アクリル酸ブチル）、ブチルメタクリレート（別称メタクリル酸ブチル）、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリロニトリル等が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、アニオン性分散剤（ｂ）は、アクリル酸由来ユニット、マレイン酸由来ユニット、およびスチレンスルホン酸由来ユニットからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むポリマー、つまり、アクリル酸、マレイン酸およびスチレンスルホン酸（例：４－スチレンスルホン酸）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモノマーを用いて合成された、ホモポリマーまたはコポリマーである。なお、当該コポリマーは、アクリル酸、マレイン酸およびスチレンスルホン酸（例：４－スチレンスルホン酸）からなる群より選ばれる少なくとも１つのモノマーと共に、アクリル酸、マレイン酸およびスチレンスルホン酸（例：４－スチレンスルホン酸）からなる群より選ばれる少なくとも１つ以外のモノマーを用いて合成されたものであってもよい。
　本発明の一実施形態において、アニオン性分散剤（ｂ）は、アニオン性官能基として、側鎖にカルボキシ基および／またはスルホ基を有するポリマーである。
　上記２つの実施形態のどちらにおいても用いることのできる、本発明のアニオン性分散剤（ｂ）として好ましいポリマーとしては、例えば、ポリ(アクリル酸)、ポリ(スチレンスルホン酸)、ポリ(スチレンスルホン酸－ｃｏ－マレイン酸)、ポリ(エチレンオキシド)－ｂ－ポリ(アクリル酸)、ポリ(スチレン)－ｂ－ポリ(アクリル酸)が挙げられる。
　アニオン性分散剤（ｂ）としてのアニオン性ポリマーの重合度、重量平均分子量、その他の性状、特性等は、本発明の実施形態および作用効果や、アニオン性ポリマーの種類に応じて調整することができる。アニオン性ポリマーの重合度は、通常は５０以上である。アニオン性ポリマーの平均分子量、代表的には重量平均分子量は、例えば１，０００以上、好ましくは５，０００以上である。アニオン性ポリマーの重量平均分子量の上限は、特に限定されるものではないが、例えば１００，０００以下、好ましくは７０，０００以下である。
　なお、アニオン性ポリマーの重量平均分子量や分子量分布は、アニオン性ポリマーの種類に応じて公知の手段によって測定することが可能であり、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などを用いることができる。また、アニオン性ポリマーとして市販されているものを購入して用いる場合は、そのカタログ等に（例えば「Ｍｗ」、「Ｍ．Ｗ．」として）示されている数値を重量平均分子量とみなすことができる。
　（ｃ）カチオン性メディエータ
　本発明において「カチオン性メディエータ」とは、レドックスメディエータとしての本質的な機能を有する化合物（レドックスメディエータ化合物）自体、またはそのようなレドックスメディエータ化合物に由来する部位を含む化合物であって、かつ分子全体の正味の電荷として正に荷電している（カチオン性である）化合物を指す。なお、「レドックスメディエータ」とは、電子伝達を仲介する酸化還元物質を指し、例えば、酸化還元酵素によるアナライトの酸化還元反応によって生じる電子の伝達を担う物質を指す。カチオン性メディエータは、いずれか１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の好ましい一実施形態において、カチオン性メディエータ（ｃ）は、「レドックスメディエータ化合物」（ｃ１）と、「カチオン性ポリマー」（ｃ２）とが、必要に応じて「リンカー部」（ｃ３）を介して結合した構造を有する化合物である。本発明における「カチオン性メディエータ」、すなわちそれを構成するための「レドックスメディエータ」、「カチオン性ポリマー」、「リンカー部位」は、特定の種類に限定されるものではなく、本発明の実施形態、作用効果等を考慮して、様々なものを用いることができる。
　（ｃ１）レドックスメディエータ化合物
　本発明における「レドックスメディエータ化合物」は特定の種類に限定されるものではなく、本発明の実施形態（試薬層、電気化学センサの用途等）、作用効果等を考慮して、様々なレドックスメディエータまたはその誘導体を用いることができる。
　レドックスメディエータ化合物としては、例えば、フェナジン系化合物、フェノチアジン系化合物、オスミウム錯体、ルテニウム錯体、キノン類化合物、フェロセン類化合物等が挙げられる。
　本発明の一実施形態において、レドックスメディエータ化合物は、フェナジン系化合物またはフェノチアジン系化合物である。フェナジン系化合物およびフェノチアジン系化合物は、酸化還元電位（ｖｓ．Ａｇ／ＡｇＣｌ・飽和ＫＣｌ）が負であり（０Ｖよりも低く）、試料中に含まれる電気化学測定に対する夾雑物、例えば生体試料中または培地試料中に含まれる、アナライトとしない、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、尿酸等の易酸化性化合物の影響を受け難いことから、好ましいレドックスメディエータといえる。
　フェナジン系化合物およびフェノチアジン系化合物はそれぞれ、下記の一般式（１）および（２）で表される、フェナジン骨格またはフェノチアジン骨格を有し、レドックスメディエータとして機能し得る化合物を指す。例えば、一般式（２）で表されるフェノチアジン系化合物において、Ｒ３が式－ＮＲ３１Ｒ３２で表される置換されたアミノ基（式中、Ｒ３１およびＲ３２両方が置換基である、またはいずれか一方が置換基、他方が水素原子である。）である場合、そのフェノチアジン系化合物は、下記の一般式（２－１）および（２－２）の共鳴構造を有する、単独でカチオン性メディエータとなる化合物となる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
　一般式（１）および（２）において、Ｒ１～Ｒ９は、それぞれ独立して、下記（i）～（ix’）のいずれかの基または原子を表す（ただし、（ix’）は、カチオン性メディエータ（ｃ）は、「レドックスメディエータ化合物」（ｃ１）と、「カチオン性ポリマー」（ｃ２）とが、必要に応じて「リンカー部」（ｃ３）を介して結合した構造を有する化合物である場合、つまり、（ix’）が、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）としてのフェナジン系化合物またはフェノチアジン系化合物の特定反応基（詳細は後述する。）として、カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基またはリンカー化合物の特定反応基と反応する場合に限る。）：
（i）水素原子；
（ii）ハロゲン原子；
（iii）置換基を有していてもよいヒドロキシ基；
（iv）置換基を有していてもよいアミノ基；
（v）置換基を有していてもよい飽和もしくは不飽和の炭化水素基（例えば、Ｃ１－１５アルキル基、好ましくはＣ１－６アルキル基）；
（vi）置換基を有していてもよいアシル基（例えば、Ｃ１－６アシル基、すなわちＣ１－６アルキル－カルボニル基）；
（vii）置換基を有していてもよいフェニル基；
（viii）第４級アンモニウムカチオン基；
（ix）活性エステル化されたカルボキシ基（例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性エステル化されたカルボキシ基）；
（ix’）カルボキシ基。
　上記（iii）～（vii）の置換基が有していてもよい置換基としては、例えば、（a）ハロゲン原子、（b）ヒドロキシ基、（c）アミノ基、（d）直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基（例えば、Ｃ１－１５アルキル基、好ましくはＣ１－６アルキル基、より好ましくはＣ１－３アルキル基）、（e）アシル基（例えばＣ１－６アシル基、好ましくはＣ１－３アシル基）、（f）グアニジノ基、（g）メシル基、（h）フェニル基、（i）チオール基、（j）ホルミル基（アルデヒド基）、（k）エポキシ基、（l）マレイミド基、（m）活性エステル化されたカルボキシ基、（m’）カルボキシ基、（n）オキシエチレン基の少なくとも１つを含む基が挙げられる。ただし、（m’）は、カチオン性メディエータ（ｃ）が、「レドックスメディエータ化合物」（ｃ１）と、「カチオン性ポリマー」（ｃ２）とが、必要に応じて「リンカー部」（ｃ３）を介して結合した構造を有する化合物である場合、つまり、（m’）が、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）としてのフェナジン系化合物またはフェノチアジン系化合物の特定反応基（詳細は後述する。）として、カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基またはリンカー化合物の特定反応基と反応する場合に限る。上記（iii）～（vii）の置換基が有していてもよい置換基は、上記（a）～（n）のいずれか単独で構成される基であってもよいし、上記（a）～（n）から選ばれる２つ、または３つ以上で構成される基、例えば、（c）アミノ基、（i）チオール基、（j）ホルミル基、（k）エポキシ基、（l）マレイミド基、（m）活性エステル化されたカルボキシ基、または（n）オキシエチレン基でさらに置換されている、（d）直鎖もしくは分岐鎖の飽和もしくは不飽和の炭化水素基のような基であってもよい。当業者であれば、上記（iii）～（vii）それぞれに対して化学的に適切な置換基を（a）～（n）から選択したり、（a）～（n）から化学的に適切な２つまたは３つ以上の置換基を選択して連結したりすることで、本発明を実施することができる。上記（iii）～（vii）それぞれが有していてもよい置換基の数は特に限定されるものではなく、例えば１個、２個または３個であってもよく、また一つの原子（例えば、アルキル基の炭素原子、アミノ基の窒素原子）に複数の置換基が結合していてもよい。
　なお、第４級アンモニウムカチオン基（viii）は、－ＲＡ－Ｎ＋(ＲＢ)(ＲＣ)(ＲＤ)で表される基（式中、ＲＡ、ＲＢ、ＲＣおよびＲＤはそれぞれ置換基を有していてもよい飽和炭化水素基（例えば、Ｃ１－１５アルキル基、好ましくはＣ１－６アルキル基））を指す。また、（n）オキシエチレン基については、（ｃ３）リンカー部（リンカー様親水部）との関係で記載するオキシエチレン基（例えばポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖））と同様である。
　Ｒ１～Ｒ９の少なくとも１つは、レドックスメディエータ化合物を正に荷電させるための基であってもよい。例えば、フェナジン系化合物またはフェノチアジン系化合物は、当該化合物単独の荷電を正とする（カチオン性とする）ために、Ｒ１～Ｒ９の少なくとも１つとして、（iv）置換基を有していてもよいアミノ基、好ましくは無置換のアミノ基であって、水系溶媒中で－ＮＨ３ ＋を生じる基や、（viii）第四級アンモニウムカチオン基のように、正に荷電する官能基（本明細書において「カチオン性官能基」と呼ぶ。）を有していてもよい。
　また、カチオン性メディエータ（ｃ）がレドックスメディエータ化合物（ｃ１）と、カチオン性ポリマー（ｃ２）とが、必要に応じてリンカー部（ｃ３）を介して結合した構造を有する化合物である場合、Ｒ１～Ｒ９の少なくとも１つは、カチオン性ポリマー（ｃ２）または必要に応じて用いられるリンカー部（ｃ３）もしくはそれを形成するためのリンカー化合物が有する基との結合性を有する反応基（本明細書において「レドックスメディエータ化合物（ｃ１）の特定反応基」と呼ぶ、ただし文脈上レドックスメディエータ化合物（ｃ１）のものであることが明らかなときは単に「特定反応基」と呼ぶこともある。）であってもよい。
　Ｒ１～Ｒ９の少なくとも１つは、その他の、レドックスメディエータとしての性能に関係する基または試薬層の製造に関係する基であってもよい。例えば、フェナジン系化合物またはフェノチアジン系化合物は、親水性を向上させるために、Ｒ１～Ｒ９の少なくとも１つとして、（iii）置換基を有していてもよいヒドロキシ基、好ましくは無置換のヒドロキシ基、（iv）置換基を有していてもよいアミノ基、好ましくは無置換のアミノ基、（viii）第四級アンモニウムカチオン基など、いわゆる「親水基」と呼ばれる官能基自体や、そのような親水基から誘導される基であって親水性を有するもの（好ましくは（n）オキシエチレン基またはその他の親水基で置換されている親水基）、あるいは（v）置換基を有していてもよい飽和もしくは不飽和の炭化水素基、（vi）置換基を有していてもよいアシル基、（vii）置換基を有していてもよいフェニル基のうち、置換基として（n）オキシエチレン基またはその他の親水基を有することにより基全体として親水性となっているものなどを有していてもよい。
　なお、本発明において「親水性」とは、水に対して親和性が高く、水またはその他の極性溶媒、例えば、カチオン性メディエータを合成する際にレドックスメディエータ化合物とカチオン性ポリマーを反応させるための溶媒や、電気化学センサにおける所定の層を形成する際にカチオン性メディエータを溶解させるための溶媒などに対して、目的を達成できる程度に溶解または混和する性質をいう。極性溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、１－プロパノール、２－プロパノール、１－ブタノール、２－ブタノール、２－メチル－１－プロパノール、２－メチル－２－プロパノール、ギ酸、酢酸、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン、メチルエチルケトン、酢酸エチル、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシドが挙げられる。
　（ｃ２）カチオン性ポリマー
　「カチオン性ポリマー」は、ポリマー全体の正味として正の電荷を有するポリマーの総称である。本発明におけるカチオン性ポリマー（ｃ２）は、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）を担持できる構造、すなわちレドックスメディエータ化合物（ｃ１）自体が有する基または必要に応じて用いられるリンカー部（ｃ３）が有する基と反応可能な基を有し、かつ所望の部位、例えば作用極上にアプライし、試薬層を形成することのできるものであればよい。カチオン性ポリマーの種類は特に限定されるものではなく、いずれか１種類を単独で用いても、２種類以上を組み合わせて用いてもよい。
　カチオン性ポリマーは、直鎖状、分岐鎖状、櫛状、いずれの「鎖状の構造」であってもよく、その「鎖状の構造」は、環式化合物（芳香族炭化水素環、非芳香族炭化水素環、芳香族ヘテロ環、非芳香族ヘテロ環等）から誘導される環構造を一つまたは複数含んでいてもよい。カチオン性ポリマー（ｃ２）の主鎖および側鎖は、一般的に、炭素原子を主体とし、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１種のヘテロ原子を含んでいてもよい、換言すれば、途中にエーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合などヘテロ原子を含む結合が存在していてもよい。カチオン性ポリマー（ｃ２）は、一般的に、複数（多数）の正に荷電する官能基（カチオン性官能基）を側鎖に有し、さらに主鎖の一方または両方の末端にカチオン性官能基を有していてもよい。また、１分子のカチオン性ポリマー（ｃ２）に、必要に応じてリンカー部（ｃ３）を介して、複数（多数）のレドックスメディエータ化合物（ｃ１）を担持できるようにする観点から、カチオン性ポリマー（ｃ２）は、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）自体が有する基または必要に応じて用いられるリンカー部（ｃ３）もしくはそれを形成するためのリンカー化合物が有する基との結合性を有する反応基（本明細書において「カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基」と呼ぶ、ただし文脈上カチオン性ポリマー（ｃ２）のものであることが明らかなときは単に「特定反応基」と呼ぶこともある。）を側鎖に有することが適切であり、さらに主鎖の一方または両方の末端も特定反応基を有していてもよい。カチオン性官能基および特定反応基を側鎖および／または末端に有するカチオン性ポリマー（ｃ２）としては様々なものが公知となっており、所望の性状を有するものを購入したり、適切なポリマーを改変して作製したり、適切なモノマーを用いて合成したりすることが可能である。カチオン性ポリマー（ｃ２）は、ホモポリマー（単独重合体）、コポリマー（共重合体）、およびそれらが結合および／または混合されたポリマーのいずれであってもよく、またランダムポリマー、ブロックポリマー、グラフトポリマーのいずれであってもよい。
　カチオン性ポリマー（ｃ２）としては、例えば、エチレン系ポリマー、イミン系ポリマー、アミノ酸系ポリマーなどであって、側鎖（および末端）にカチオン性官能基および特定反応基を有するものが挙げられる。また、アミノ酸をモノマーとするポリマーといえる（但し、概念として、人工的に合成されるアミノ酸系ポリマーとは区別される）、天然のアミノ酸配列または改変された（置換、欠失、付加等された）アミノ酸配列を有する、タンパク質やポリペプチドであって、側鎖（および末端）にカチオン性官能基および特定反応基を有するものも、カチオン性ポリマー（ｃ２）に包含される。特定反応基およびカチオン性官能基を元来有する、または導入された、多糖類系ポリマーも、カチオン性ポリマー（ｃ２）に包含される。
　エチレン系ポリマーとしては、ラジカル重合が可能なエチレン性炭素－炭素二重結合、例えばビニル基（ＣＨ２＝ＣＨ－）、アリル基（ＣＨ２＝ＣＨ－ＣＨ２－）、アクリロイル基（ＣＨ２＝ＣＨ－Ｃ(Ｏ)－）、メタクリロイル基（ＣＨ２＝Ｃ(ＣＨ３)－Ｃ(Ｏ)－）などを含むモノマーから選ばれる、１種または２種以上のモノマーから合成される、ホモポリマーおよびコポリマーならびにそれらの修飾物（例えば酢酸ビニルに由来する単位をケン化によりビニルアルコール化したものや、親水性を賦与するような処理をしたもの）が挙げられる。エチレン性炭素－炭素二重結合を含むモノマーとしては、例えば、エチレン、プロピレン、ブタジエン、イソブテン、テトラフルオロエチレン、ビニルアルコール、酢酸ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン、スチレン、メチルスチレン、アリルアミン、ジアリルアミン、ジアリルジメチルアンモニウムクロリド、アクリル酸、メタクリル酸、メチルアクリレート（アクリル酸メチルともいう。）、メチルメタクリレート（メタクリル酸メチルともいう。）、ブチルアクリレート（アクリル酸ブチルともいう。）、ブチルメタクリレート（メタクリル酸ブチルともいう。）、ヒドロキシエチルメタクリレート、アクリロニトリル等が挙げられる。また、一般的に生体適合性ポリマーとして知られている、メタクリル酸メチルとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマー、ブチルメタクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマー、ポリ(２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－ｃｏ－ｎ－ブチルメタクリレート)などの（メタ）アクリル系ポリマーや、ポリエチレンテレフタレート等のポリエステル系ポリマーも、好ましいエチレン系ポリマーとして挙げられる。
　カチオン性ポリマー（ｃ２）として好ましいエチレン系ポリマーとしては、例えば、ポリアリルアミン塩酸塩、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体、アリルアミン・ジアリルジメチルアンモニウムクロリド共重合体などが挙げられる。側鎖（および末端）に第四級アンモニウムカチオン、アミノ基等を有する（メタ）アクリル系ポリマーも、好ましいエチレン系ポリマーとして挙げられる。より具体的には、２－アミノエチルメタクリレート、(ビニルベンジル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリロイルコリンクロリドなどに由来する構成単位を含む単独共重合体または共重合体や、ポリ(塩化ジアリルジメチルアンモニウム)、ポリ(アリルアミン塩酸塩)、アリルアミン塩酸塩・ジアリルアミン塩酸塩共重合体、アリルアミン・塩化ジアリルジメチルアンモニウム共重合体などが、カチオン性ポリマー（ｃ２）として好ましく用いることができる。
　イミン系ポリマーとしては、例えば、ポリ(エチレンイミン)が挙げられる。ポリ(エチレンイミン)は、側鎖に－(ＣＨ２)２－ＮＨ２、－(ＣＨ２)２－ＮＨ－(ＣＨ２)２－ＮＨ２、－(ＣＨ２)２－Ｎ((ＣＨ２)２－ＮＨ２)２などの構造を有し、当該構造中のアミノ基：－ＮＨ２が当該カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基となり、それに対応する適切な特定反応基（例えば、活性エステル化されたカルボキシ基）を有するレドックスメディエータ化合物（ｃ１）またはリンカー部（ｃ３）と結合することができる。
　アミノ酸系ポリマーとしては、例えば、ポリ(Ｌ－リジン)、ポリ(Ｌ－アルギニン)、ポリ(Ｌ－オルニチン)が挙げられる。ポリ(Ｌ－リジン)は、側鎖に－(ＣＨ２)４－ＮＨ２の構造を有する。ポリ(Ｌ－アルギニン)は、側鎖に－(ＣＨ２)２－ＮＨ－Ｃ(＝ＮＨ)－ＮＨ２の構造を有する。これらのアミノ酸系ポリマーの側鎖に含まれるアミノ基：－ＮＨ２（またはグアニジノ基：－ＮＨ－Ｃ(＝ＮＨ)－ＮＨ２）などが当該カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基となり、対応する適切な特定反応基（例えば、活性エステル化されたカルボキシ基）を有するレドックスメディエータ化合物（ｃ１）またはリンカー部（ｃ３）と結合することができる。なお、アミノ酸系ポリマーは、例えばポリ(Ｌ－アルギニン塩酸塩)のように、塩を形成していてもよい。
　多糖類系ポリマーとしては、例えば、キトサン等のセルロース誘導体が挙げられる。キトサンは、キチンを加水分解することにより得られる多糖類であり、側鎖（糖構造中）にアミノ基を有する。このような多糖類系ポリマーの側鎖に含まれるアミノ基などが当該カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基となり、対応する適切な特定反応基（例えば、活性エステル化されたカルボキシ基）を有するレドックスメディエータ化合物（ｃ１）またはリンカー部（ｃ３）と結合することができる。
　カチオン性ポリマー（ｃ２）の重合度、重量平均分子量、その他の性状、特性等は、本発明の実施形態および作用効果や、カチオン性ポリマー（ｃ２）の種類に応じて調整することができる。カチオン性ポリマー（ｃ２）の重合度は、通常は１００以上である。カチオン性ポリマー（ｃ２）の平均分子量、代表的には重量平均分子量は、通常１０，０００以上、好ましくは５０，０００以上、より好ましくは１００，０００以上である。カチオン性ポリマー（ｃ２）の重量平均分子量の上限は、特に限定されるものではないが、通常１０，０００，０００未満、好ましくは１，０００，０００未満である。
　なお、カチオン性ポリマー（ｃ２）の重量平均分子量や分子量分布は、カチオン性ポリマー（ｃ２）の種類に応じて公知の手段によって測定することが可能であり、例えば、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）などを用いることができる。また、カチオン性ポリマー（ｃ２）として市販されているものを購入して用いる場合は、そのカタログ等に（例えば「Ｍｗ」、「Ｍ．Ｗ．」として）示されている数値を重量平均分子量とみなすことができる。
　（ｃ３）リンカー部
　リンカー部（ｃ３）は、必要に応じて存在する、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）とカチオン性ポリマー（ｃ２）との結合を仲介するための構造である。リンカー部（ｃ３）は、一般的に、両端にある反応前の反応基または反応後の結合構造を除く部分が、炭素原子を主体とし、窒素原子、酸素原子および硫黄原子からなる群から選択される少なくとも１種のヘテロ原子を含んでいてもよい鎖状の構造、換言すれば、途中にエーテル結合、チオエーテル結合、アミド結合などヘテロ原子を含む結合が存在していてもよい、鎖状の構造を有する部位である。リンカー部（ｃ３）の「鎖状の構造」は、直鎖状であっても、分岐鎖状であってもよい。また「鎖状の構造」は、環式化合物（芳香族炭化水素環、非芳香族炭化水素環、芳香族ヘテロ環、非芳香族ヘテロ環等）から誘導される環構造を一つまたは複数含んでいてもよい。
　本発明の一実施形態において、リンカー部（ｃ３）は、カチオン性メディエータ（ｃ）の親水性を向上させるための部位（親水部）としての機能を兼ね備えたものであり、「リンカー様親水部」と呼ぶこともできるものである。リンカー部（ｃ３）がリンカー様親水部である場合、親水性の観点から、直鎖状であること、また環式化合物から誘導される環構造を一つも含まないことが好ましい。
　本発明の好ましい一実施形態において、リンカー様親水部は、式：－(ＯＣ２Ｈ４)ｑ－で表されるオキシエチレン基を含む。式中のｑは、例えば１～８０の整数、好ましくは３～３６の整数を表す。なお、当該式で表されるオキシエチレン鎖のうちｑがある程度大きいものは、一般的に「ポリエチレングリコール鎖（ＰＥＧ鎖）」などと呼ばれている。
　本発明の一実施形態において、リンカー様親水部は、式：－(ＣＨ２)ｐ－で表される炭化水素鎖を含む。本発明の一実施形態において、リンカー様親水部の主鎖は、上記式：－(ＣＨ２)ｐ－で表される炭化水素鎖と、上記式：－(ＯＣ２Ｈ４)ｑ－で表されるオキシエチレン鎖の両方を含む。炭化水素鎖を表す式中のｐは、リンカー様親水部の親水性を考慮して、オキシエチレン鎖を表す式中のｑとのバランスが取れるよう、適宜調節することができる。
　リンカー部（ｃ３）は、    レドックスメディエータ化合物（ｃ１）が有する基（特定反応基）およびカチオン性ポリマー（ｃ２）が有する基（特定反応基）それぞれとの結合性を有する少なくとも２つの反応基（本明細書において「リンカー化合物の特定反応基」と呼ぶ、ただし文脈上リンカー化合物のものであることが明らかなときは単に「特定反応基」と呼ぶこともある。）を有する化合物（本明細書において「リンカー化合物」と呼ぶ。）から誘導することができる。例えば、リンカー化合物をレドックスメディエータ化合物（ｃ１）と反応させ、次にレドックスメディエータ化合物（ｃ１）と結合した状態のリンカー化合物（換言すれば「レドックスメディエータ化合物（ｃ１）－リンカー化合物反応物」）をカチオン性ポリマー（ｃ２）と反応させることにより、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）とカチオン性ポリマー（ｃ２）とがリンカー部（ｃ３）を介して結合している化合物としてのカチオン性メディエータ（ｃ）が生成する。また、リンカー化合物をカチオン性ポリマー（ｃ２）と反応させ、次にカチオン性ポリマー（ｃ２）と結合した状態のリンカー化合物（換言すれば「カチオン性ポリマー（ｃ２）－リンカー化合物反応物」）をレドックスメディエータ化合物（ｃ１）と反応させることによっても、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）とカチオン性ポリマー（ｃ２）とがリンカー部（ｃ３）を介して結合している化合物としてのカチオン性メディエータ（ｃ）が生成する。
＜特定反応基＞
　本発明における特定反応基、すなわちレドックスメディエータ化合物（ｃ１）の特定反応基、カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基、およびリンカー化合物の特定反応基としては、それぞれ公知の様々な反応基を採用し、様々な組み合わせとすることができる。本発明における所定反応基同士は、共有結合により結合するものであってもよいし、非共有結合（例えば静電的相互作用）により結合するものであってもよいが、例えば結合の安定性の観点から、共有結合により結合するものが好ましい。
　本発明における特定反応基は、それぞれ「カルボキシ基またはその活性エステル体、アミノ基、チオール基、ホルミル基（アルデヒド基）、エポキシ基およびマレイミド基からなる群」（本明細書において「好ましい特定反応基群」と呼ぶ。）より選ばれる少なくとも１種が好ましい。なお、好ましい特定反応基としてのアミノ基、チオール基、ホルミル基（アルデヒド基）、エポキシ基およびマレイミド基はそれぞれ、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）に関する一般式（１）および（２）中のＲ１～Ｒ９としての置換基（iii）～（vii）がさらに有していてもよい置換基として例示した、置換基（c）、(i)、（j）、（k）および（l）に相当し、カルボキシ基およびその活性エステル体は、それぞれ置換基（m’）および（m）に相当する。好ましい特定反応基群に含まれる反応基それぞれが反応することのできる基を表１に示す。本発明における特定反応基の一方として、好ましい特定反応基群に含まれる反応基を選択した場合、それと反応させる相手の基は、好ましい特定反応基群に含まれる他の反応基（表中の下線を引いたもの）であってもよいし、好ましい特定反応基群に含まれない反応基（表中の下線を引いていないもの、または表中に含まれないもの）であってもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明の好ましい一実施形態において、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）の特定反応基またはリンカー化合物の特定反応基と、カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基は、いずれか一方が表１の「反応基Ａ」で、他方が「反応基Ｂ」である。同様に、本発明の好ましい一実施形態において、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）の特定反応基と、リンカー化合物の特定反応基は、いずれか一方が表１の「反応基Ａ」で、他方が「反応基Ｂ」である。
　本発明のより好ましい一実施形態において、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）の特定反応基またはリンカー化合物の特定反応基と、カチオン性ポリマー（ｃ２）の特定反応基は、いずれか一方がアミノ基で、他方がカルボキシ基またはその活性エステル体である。同様に、本発明のより好ましい一実施形態において、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）の特定反応基と、リンカー化合物の特定反応基は、いずれか一方がアミノ基で、他方がカルボキシ基またはその活性エステル体である。例えば、特定反応基として活性エステル化されたカルボキシ基を有するレドックスメディエータ化合物（ｃ１）；第１の特定反応基としてアミノ基を有し、第２の特定反応基として活性エステル化されたカルボキシ基（例えばＮＨＳで活性エステル化されたカルボキシ基）を有するリンカー化合物；および特定反応基としてアミノ基を有するカチオン性ポリマー（ｃ２）を用いる場合、まず当該レドックスメディエータ化合物（ｃ１）の活性エステル化されたカルボキシ基と当該リンカー化合物のアミノ基の反応（第１のアミド結合）によりリンカー様親水部導入型レドックスメディエータ化合物が得られ、得られたリンカー様親水部導入型レドックスメディエータ化合物の活性エステル化されたカルボキシ基と当該カチオン性ポリマー（ｃ２）のアミノ基の反応（第２のアミド結合）によりカチオン性メディエータ（ｃ）が得られる。
　本発明の試薬層は、典型的には、本発明の電気化学センサにおいて、作用極上に配置されるものである。試薬層は、いずれか１種類のみを用いてもよいし、２種類以上を組み合わせて用いても（例えば、導電性炭素フィラー（ａ）、アニオン性分散剤（ｂ）およびカチオン性メディエータ（ｃ）の組成（種類および／または含有量）が異なる２種類以上の試薬層を積層しても）よい。
　試薬層は、例えばバイオセンサの形態をとる電気化学センサのように、アナライトに対応した種類の「酸化還元酵素」を含んでいてもよいし、バイオセンサ以外の電気化学センサ、あるいは電気化学センサ以外のセンサ（例えば光学センサ）の形態をとる場合のように、酸化還元酵素を含まないでもよい。
　試薬層は、必要に応じて導電性炭素フィラー（ａ）、アニオン性分散剤（ｂ）およびカチオン性メディエータ（ｃ）以外の成分をさらに含んでいてもよい。そのような任意の成分としては、例えば「酸化還元酵素」（ｄ）が挙げられる。
　（ｄ）酸化還元酵素
　酸化還元酵素（ｄ）は、電気化学センサ等が対象とするアナライトを酸化（脱水素化を含む。）または還元することができる酵素を指す。本発明の電気化学センサは、典型的には、試薬層中に酸化還元酵素を含む電気化学センサ（バイオセンサ）の形態をとるが、これに限定されるものではなく、試薬層中に酸化還元酵素を含まない、バイオセンサ以外の電気化学センサ、あるいは電気化学センサ以外のセンサ（例えば光学センサ）の形態をとることもできる。電気化学センサ等の用途に応じて、試薬層が酸化還元酵素（ｄ）を含むかどうか、またアナライトの種類に応じて、どのような種類の酸化還元酵素（ｄ）を含むかを、選択することができる。
　酸化還元酵素（ｄ）としては、例えば、オキシダーゼ系の酵素（グルコースオキシダーゼ（Ｇｏｘ）、ラクテートオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、アミノ酸オキシダーゼ、グルタミン酸オキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、アルコールオキシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、ビリルビンオキシダーゼ、アルデヒドオキシダーゼなど）およびデヒドロゲナーゼ系の酵素（グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ラクテートデヒドロゲナーゼ、ピルビン酸デヒドロゲナーゼ、アミノ酸デヒドロゲナーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、３－ヒドロキシ酪酸デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ）が挙げられる。酸化還元酵素（ｄ）は、いずれか１種を単独で用いてもよいし、必要に応じて２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　本発明の一実施形態において、酸化還元酵素（ｄ）は、補酵素結合型のものである。補酵素還元型の酸化還元酵素（ｄ）としては、例えば、ピロロキノリンキノン（ＰＱＱ）結合型ＧＤＨ、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）結合型ＧＤＨが挙げられる。グルコースをアナライトとする実施形態において、アナライトではないマルトースに対する反応性が低い（例えば、グルコースに対する酵素活性を１００％とした場合のマルトースに対する酵素活性を５％以下、好ましくは３％以下とすることができる）という観点からは、ＦＡＤ結合型ＧＤＨが好ましい。ＦＡＤ結合型ＧＤＨの例としては、アスペルギルス属（オリゼ、テレウス等）由来のもの、ムコール属由来のものが挙げられる。
　本発明の一実施形態において、酸化還元酵素（ｄ）は、カチオン性メディエータ（ｃ）、特にそれを構成しているカチオン性ポリマー（ｃ２）と架橋されていてもよい。例えば、架橋剤（ｅ）を使用することで、酸化還元酵素（ｄ）とカチオン性メディエータ（ｃ）、特にカチオン性ポリマー（ｃ２）とを架橋することができる。架橋剤（ｅ）としては、例えば、グルタルアルデヒドが挙げられる。架橋剤（ｅ）が、タンパク質である酸化還元酵素（ｄ）が有する反応基（例：アミノ基）と、カチオン性メディエータ（ｃ）が有する反応基、例えば、カチオン性ポリマー（ｃ２）が、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）もしくはリンカー部（ｃ２）とは反応しなかった反応基として、またはレドックスメディエータ化合物（ｃ１）もしくはリンカー部（ｃ２）との反応用のものとは異なる種類の反応基として有する反応基（例：アミノ基）のそれぞれと反応することで、架橋剤（ｅ）を介して酸化還元酵素（ｄ）とカチオン性メディエータ（ｃ）を結合させることができる。このような架橋により分子量のより大きな複合体を形成することで、酸化還元酵素（ｄ）およびカチオン性メディエータ（ｃ）、特にそれを構成しているレドックスメディエータ化合物（ｃ１）の保護膜外への流出をより抑制することができる。なお、架橋剤（ｅ）を使用する場合は、酸化還元酵素（ｄ）の２つの分子それぞれが有する反応基と反応することで、架橋剤（ｅ）を介して酸化還元酵素（ｄ）同士を結合することもある。すなわち、架橋剤（ｅ）を使用した場合、試薬層において、酸化還元酵素（ｄ）はカチオン性メディエータ（ｃ）、特にカチオン性ポリマー（ｃ２）と架橋されるのと同時に、酸化還元酵素（ｄ）同士が架橋されていてもよい。
―　試薬層の形成方法　―
　本発明の試薬層の形成方法は、少なくとも下記工程（１）を含み、通常はさらに（２）および（３）を含む：
　（１）導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む試薬液を調製する工程（本明細書において「試薬液調製工程」と呼ぶことがある）；
　（２）前記試薬液を試薬層形成部位にアプライする工程（本明細書において「アプライ工程」と呼ぶことがある。）；
　（３）アプライされた前記試薬液を乾燥させて、試薬層を形成する工程（本明細書において「試薬層形成工程」と呼ぶことがある。）。
　（１）試薬液調製工程
　試薬液調製工程（１）は、試薬層を構成する主な成分、すなわち少なくとも導電性炭素フィラー（ａ）、アニオン性分散剤（ｂ）およびカチオン性メディエータ（ｃ）を含み、必要に応じてさらにその他の成分、例えば酸化還元酵素（ｄ）、架橋剤（ｅ）などを含んでいてもよい試薬液を調製する工程である。
　試薬液は一般的に、水系溶媒（水、または水と相溶性のある溶媒と水との混合溶媒）に、上記成分（ａ）～（ｅ）のうち必要なものを添加することで、試薬液を調製することができる。水系溶媒は、必要に応じて、ｐＨ調整剤、緩衝剤（液）、その他の化合物等を添加することにより、適切なｐＨを有するよう調整することができる。
　本発明の一実施形態において、試薬液のｐＨは、８．０以下である。試薬液のｐＨが８．０以下となるような量で緩衝液を用いることにより、導電性炭素フィラー（ａ）の分散性を向上させる効果が奏されやすくなる。なお、試薬液が酸化還元酵素（ｄ）を含む場合は、その試薬液のｐＨは、その酸化還元酵素（ｄ）の活性が維持される範囲とすることが適切である。
　試薬液のｐＨは通常、緩衝液を用いて調節される。緩衝液としては様々な緩衝液を用いることができるが、例えば、酢酸緩衝液（酢酸および酢酸ナトリウム）、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液（トリスヒドロキシメチルアミノメタン、別称トロメタモール）、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ緩衝液（ビス(２－ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（２－[４－(２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジニル]エタンスルホン酸）、ＭＥＳ（２－モルホリノエタンスルホン酸モノハイドレート）、ＭＯＰＳ（３－モルホリノプロパンスルホン酸）、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、一般的に、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸水素二ナトリウムおよびリン酸二水素カリウム）などが挙げられる。適切な緩衝液（緩衝剤）を用いることで、試薬のｐＨを所望の値（範囲）とすることができる。
　本発明の一実施形態において、試薬液中の金属イオンの濃度は２００ｍＭ以下である。試薬液の金属イオンの濃度が高い場合、金属イオンの種類によっては、導電性炭素フィラーの分散性が阻害され、凝集が発生するおそれがあるため、試薬液の金属イオンの濃度は低い方がよい傾向にある。試薬液のｐＨの調製のために、金属イオンを含む化合物（緩衝剤）またはそれにより調製された緩衝液を用いる場合は、所望のｐＨとするために必要な当該緩衝剤または当該緩衝液の量に基づいて試薬液中の金属イオンの濃度を算出し、それが２００ｍＭ以下となるようにすること、逆に言えば２００ｍＭ以下にすることができる緩衝剤または緩衝液を選択することが好ましい。金属イオンを含まない化合物（緩衝剤）またはそれにより調製された緩衝液を用いる場合は自ずと、試薬液中の金属イオンの濃度を２００ｍＭ以下とすることができる。試薬液中の金属イオンの濃度は、金属塩がアルカリ金属イオンである場合は、１００ｍＭ未満、例えば８０ｍＭ以下とすることが好ましい。
　試薬液中の金属イオンは、試薬液の調製に用いられる様々な物質に由来するものであるため、金属イオンの濃度が適切な範囲となるよう、試薬液の組成や、各成分等の種類および使用量を調節することができる。例えば、試薬液中の金属イオンは緩衝液に由来する場合があるので、試薬液のｐＨを調整するために用いる緩衝液の組成（緩衝液に含まれる化合物の種類および濃度）を適切なものとすればよい。また、試薬液中の金属イオンは、アニオン性分散剤（ｂ）として塩を形成しているものに由来する場合もあるので、必要に応じてそのような塩を形成しているアニオン性分散剤（ｂ）の量も考慮に入れればよい。
　試薬液に含まれる成分の添加順番は適宜調整することができるが、例えば、下記の工程（１－１）および（１－２）の順で行うことが好ましい。
　（１－１）少なくともアニオン性分散剤（ｂ）を含む水溶液中に、導電性炭素フィラー（ａ）を分散させ、分散液を得る工程。
　（１－２）得られた分散液に、カチオン性メディエータ（ｃ）を添加して、試薬液を得る工程。
　試薬液中の導電性炭素フィラー（ａ）、アニオン性分散剤（ｂ）およびカチオン性メディエータ（ｃ）、ならびに必要に応じて用いられる酸化還元酵素（ｄ）それぞれの濃度、あるいは互いの濃度の比は、本発明の実施形態、作用効果等を考慮して、適切に調節することができる。
　試薬液中の導電性炭素フィラー（ａ）の濃度は、例えば０．１～３０ｗ／ｖ％（ｍｇ／ｍＬ）の範囲内である。
　試薬液中のアニオン性分散剤（ｂ）の濃度は、例えば０．０１～３０ｗ／ｖ％（ｍｇ／ｍＬ）の範囲内である。
　試薬液調製工程（１）では、試薬液に対して物理的なエネルギーを与えることにより、試薬液中の導電性炭素フィラー（ａ）の分散性を向上させるための処理（本明細書において「分散処理」と呼ぶことがある。）を行ってもよい。分散処理は、例えば、前記工程（１－１）と前記工程（１－２）の間に行うことができ、それに代えて、またはそれに加えて、前記工程（１－２）の後に（次のアプライ工程（２）の前に）行うこともできる。
　「物理的なエネルギー」を与えるための手段（方法およびその条件、用いる装置等）は、試薬液中の導電性炭素フィラー（ａ）の分散性を向上させることができるものであれば、特に限定されるものではない。本発明の代表的な実施形態では、上記の手段として超音波処理を用いるが、その他の手段を用いることも可能である。超音波処理の条件（出力、時間等）は適宜調節することができる。超音波処理のための装置も適宜選択することができ、例えば超音波ホモジナイザーを用いることができる。
　酸化還元酵素（ｄ）は、物理的なエネルギーの影響を受けないよう、試薬液調製工程（１）において、分散処理を終えた段階で添加することが好ましい。酸化還元酵素（ｄ）を、カチオン性メディエータ（ｃ）と架橋させたり、酸化還元酵素（ｄ）同士を架橋させたりするための架橋剤（ｅ）、例えばグルタルアルデヒドは、酸化還元酵素（ｄ）を添加した後に添加することが好ましい。
　また、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）とカチオン性ポリマー（ｃ２）とが、必要に応じてリンカー部（ｃ３）を介して結合している化合物を、カチオン性メディエータ（ｃ）として用いる場合は、当該カチオン性メディエータ（ｃ）は、分散処理により、例えば超音波処理等により物理的なエネルギーを試薬液に与えて導電性炭素フィラー（ａ）の分散性を良化させてから、添加することが好ましい。
　（２）アプライ工程
　アプライ工程（２）は、試薬液調製工程（１）により得られた試薬液を、試薬層形成部位、例えば作用極の少なくとも一部にアプライ（滴下、塗布等）する工程である。
　「アプライ」のための手段（方法およびその条件、用いる装置等）は、試薬液から試薬層を形成することができるものであれば、特に限定されるものではなく、従来の試薬層の形成方法（または電気化学センサの製造方法）における試薬液のアプライ工程に準じた手段を採用することができる。本発明の代表的な実施形態では、試薬液調製工程（１）により得られた試薬液の適量を、作用極の少なくとも一部（試薬層を形成する部分）に滴下することにより、アプライ工程を行う。アプライする面積および試薬液の量は、目的とする試薬層の厚さに応じて調節することができる。
　（３）試薬層形成工程
　試薬層形成工程（４）は、アプライ工程（２）により試薬層形成部位（例えば作用極の少なくとも一部）にアプライされた試薬液を乾燥させて、塗膜層を形成する工程である。
　「乾燥」のための手段（方法およびその条件、用いる装置等）は、アプライされた試薬液から（好ましくは均一な）試薬層を形成することができれば、特に限定されるものではなく、従来の電気化学センサの製造における試薬液の乾燥工程に準じた手段を採用することができる。本発明の代表的な実施形態では、試薬液がアプライされた作用極を室温で静置することにより、試薬層形成工程を行い、試薬層を形成する。
―　電気化学センサ　―
　本発明のアナライトを検出又は定量する電気化学センサは、作用極、対極、および作用極上に配置された、上述したような本発明の試薬層を有し、必要に応じてさらに、少なくとも試薬層を被覆する保護膜を有する。
　「保護膜」は、試薬層に含まれる物質（導電性炭素フィラー（ａ）、カチオン性メディエータ（ｃ）、必要に応じて用いられる酸化還元酵素（ｄ）等）の保護膜外の環境中（生体内、培地中等）への漏出を防止又は抑制するための膜状の部材である。試薬層を被覆する保護膜は、保護膜外の環境中に存在するアナライトが試薬層と接触できるよう、保護膜内に透過可能な孔を有することが適切である。このような保護膜は、例えば、電気化学センサが持続的な測定に使用される場合に形成することが好ましく、電気化学センサが単発的な測定に使用される場合には形成しなくてもよい。
　試薬層が形成されている作用極（それを備えたプローブ）は、生体内に挿入して使用されたり、培地中に浸漬して使用されたりするため、その表面を被覆する保護膜は、タンパク質や細胞が吸着しない又はし難い生体適合性を有すること、一般的にはそのような性質を有する生体適合性ポリマーによって形成されることが好ましい。生体適合性ポリマーとしては、例えば、メタクリル酸メチルとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマー、ブチルメタクリレートとヒドロキシエチルメタクリレートとのコポリマー、ポリ(２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン－ｃｏ－ｎ－ブチルメタクリレート)等が挙げられる。
　保護膜は、保護膜を形成するための原料を含む溶液（保護膜溶液）を調製し、保護膜を形成したい領域、例えば作用極の少なくとも試薬層が形成されている領域を浸漬し、引き上げて乾燥させること、必要に応じてそのような工程を複数回繰り返すことにより、形成することができる。
　本発明の電気化学センサは、必要に応じて参照極をさらに含んでいてもよい。つまり、本発明の電気化学センサは、作用極および対極により構成される二電極式とすることもできるし、作用極、対極および参照極により構成される三電極式とすることもできる。
　本発明の一実施形態において、電気化学センサは、埋め込み型の電気化学センサ、例えば血液中または間質液中のグルコース濃度を連続的または半連続的、例えば数日から数週間にわたって測定する自己血糖測定用のＣＧＭ（Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　Ｇｌｕｃｏｓｅ　Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）のためのバイオセンサとして作製することができる。一方で、本発明の一実施形態において、電気化学センサは、非埋め込み型の電気化学センサ、例えば培地中のグルコース等の濃度を連続的または半連続的に測定するためのバイオセンサとして作製することもできる。
　以下、図面を参照しながら、本発明の電気化学センサが埋め込み型である場合の実施形態について説明する。ただし、図面および以下の記載は例示的なものであり、本発明の技術的範囲はそれらによって開示された実施形態に限定されるものではなく、本発明の課題を解決できる範囲で、また本発明の作用効果が奏される範囲で、様々に改変された実施形態を含んでいることが理解されるべきである。
　以下の記載において、図１（Ａ）および（Ｂ）、図３ならびに図７の紙面手前方向、図２（Ａ）～（Ｃ）および図４～図６の紙面上方向にある面を「上面」と呼び、図１（Ａ）および（Ｂ）、図３ならびに図７の紙面奥方向、図２（Ａ）～（Ｃ）および図４～図６の紙面下方向にある面を「下面」と呼び、図１（Ａ）および（Ｂ）、図２（Ａ）～（Ｃ）、図５～図７の紙面左右いずれかの方向、ならびに図４の紙面手前側または奥側いずれかの方向にある面を「側面」と呼ぶことがある。また、図１（Ａ）の紙面の上下方向、すなわち生体へのセンサの挿入方向を示す矢印Ｘ２に対して平行な方向の寸法、ならびに図３および図７の紙面の上下方向の寸法を「長さ」と呼び、図１（Ａ）の紙面の左右方向、すなわち矢印Ｘ２に対して垂直な方向の寸法、ならびに図３および図７の紙面の上下方向の寸法を「幅」と呼ぶことがある。
　図１は、本発明の一実施形態における、センサ１１の平面図である。図１（Ａ）は、センサ１１の全体を示す。図１（Ｂ）には、図１（Ａ）に示されているセンサ１１の先端部分（センシング部分）を拡大して示す。センサ１１は、例えば血糖値の自己検査のために生体に装着して使用される、埋め込み型バイオセンサのシステムを構築する場合に好適であり、その場合のセンサ１１は、本体（図示せず）からの突出部分（プローブ）として、生体内に挿入することができる。また、センサ１１は、例えば培地中のアナライトの濃度を測定するためのシステムを構築する場合にも使用することができる。
　図１（Ａ）に示されている、センサ１１の領域Ｘ１（頭部）は本体（図示せず）に収容され、センサ１１の先端部分（センシング部分）は本体から突出している。矢印Ｘ２は、例えばセンサ１１を生体へ挿入する場合の挿入方向を示す。センシング部分の寸法は、長さは例えば２０～３ｍｍ、好ましくは１０～３ｍｍであり、幅は例えば１～５０μｍ、好ましくは５００～５０μｍである。
　図１において、センサ１１は、基板２１と、電極２２と、試薬層２３と、銀／塩化銀層（参照層と呼ばれることもある。）２４と、フィルム２５を有する。電極２２は、基板２１上に一様に形成されており、作用極２２ａ、参照極２２ｂおよび対極２２ｃを含んでいる。作用極２２ａおよび参照極２２ｂは、溝Ａ１によって物理的かつ電気的に分離されており、参照極２２ｂおよび対極２２ｃは、溝Ａ２によって物理的かつ電気的に分離されている。試薬層２３は作用極２２ａ上に形成されている。銀／塩化銀層２４は参照極２２ｂ上に形成されている。フィルム２５は、電極２２の一部（頭部の領域Ｘ１のうち領域Ｘ４の部分、対極２２ｃの領域Ｘ３の部分等）および試薬層２３の部分を除いて（それらを露出させる開口を備えることにより）、センサ１１の上面を被覆している。なお、電極２２の露出している領域Ｘ４は、本体１１の回路と接続される。
　なお、図１（Ｂ）の領域Ｘ５によって示されているように、センサ１１の先端には（先端から所定の距離にわたって）試薬層２３は形成されないことが好ましい。別言すれば、試薬層２３は、センサ１１の先端から離されて形成されることが好ましい。そのようにすることで、センサ１１が生体内に挿入されるときに、試薬層２３がセンサ１１から剥がれる（めくれる）のを抑制できるからである。
　図２（Ａ）は、図１（Ｂ）のＡＡ矢視断面図である。センサ１１の試薬層２３が形成されている部分には、基板２１、電極２２（作用極２２ａ）および試薬層２３がこの順に積層されている。１１ａおよび１１ｂの部分において、電極２２（作用極２２ａ）、試薬層２３およびフィルム２５は積層されておらず（トリミングされており）、基板２１は露出している。
　図２（Ｂ）は、図１（Ｂ）のＢＢ矢視断面図である。溝Ａ１に対して右側の、銀／塩化銀層２４が形成されている部分には、基板２１、電極２２（参照極２２ｂ）、銀／塩化銀層２４、およびフィルム２５が積層されている。溝Ａ１に対して左側の、参照極２２ｂとは物理的および電気的に分離されている部分には、基板２１、電極２２（作用極２２ａ）およびフィルム２５が積層されている。銀／塩化銀層２４の側面（図２（Ｂ）の右側側面）は、フィルム２５は配置されず、露出している。本実施形態において、銀／塩化銀層２４の上面はフィルム２５で被覆されているが、フィルム２５で被覆されず、露出していてもよい。
　図２（Ｃ）は、図１（Ｂ）のＣＣ矢視断面図である。溝Ａ２に対して右側の部分には、基板２１および電極２２（対極２２ｃ）が積層されている。対極２２ｃの上面はフィルム２５で被覆されず、露出している。溝Ａ１と溝Ａ２に挟まれた部分には、基板２１、電極２２（参照極２２ｂ）およびフィルム２５が積層されている。溝Ａ１の左側の部分には、基板２１、電極２２（作用極２２ａ）およびフィルム２５が積層されている。
　基板２１は、典型的にはシート状の合成樹脂である。基板２１の材料は、柔軟性、易加工性、および耐熱性の少なくとも一つ以上の特徴を有するプラスチック材料（合成樹脂）のような樹脂材料であれば特に限定されない。そのような基板２１の樹脂材料の代表例としては、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）が挙げられるが、他にもポリエチレン、ポリプロピレン、およびポリエチレンナフタレートなどの汎用プラスチックが挙げられる。また、高い耐熱性が必要な場合は、ポリイミドが好ましい。
　電極２２は、基板２１上に形成されている薄膜（薄層）である。電極２２の材料は、導電性および安定性（例えば、耐酸化性または耐塩性）を有する金属または炭素材料であれば特に限定されない。そのような電極２２の材料の代表例としては金が挙げられるが、他にも白金、パラジウム、カーボンなどが挙げられる。なお、センサ１１の上面および下面の一方に作用極２２ａ（試薬層２３）を形成し、他方に対極２２ｃを形成するようにする場合は、互いに異なる電極材料を用いてもよい。
　作用極２２ａには、酸化還元酵素によるアナライト（例えばグルコース）の反応によって還元されたメディエータを酸化させるのに十分な電位（参照極２２ｂを基準とした電位）が与えられる。グルコース濃度は、作用極２２ａと対極２２ｃとの間を流れる電流をモニタすることによって、測定される。試薬層２３は、センサ１１の先端部分における作用極２２ａの上面に形成される。
　銀／塩化銀層２４は、必要に応じて、センサ１１の先端部分における参照極２２ｂの上面に形成される。本実施形態では、より精度のよい測定を実現するよう、作用極２２ａ、参照極２２ｂおよび対極２３ｃからなる３電極構成の例を示しているが、参照極２２ｂを含まず、作用極２２ａおよび対極２３ｃからなる２電極構成とすることも可能である（例えば、現在市販されているＳＭＢＧ（血糖自己測定器）は、そのような２電極構成が主流である）。参照極は、本実施形態に示したように、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）層２４を形成した銀／塩化銀電極とすることができるほか、水素電極や、カロメル電極等の水銀を含む層を形成したものとすることができる。
　フィルム２５は、基板２１上に形成された電極２２（作用極２２ａ、参照極２２ｂおよび対極２２ｃ）の所定の部分ならびに銀／塩化銀層２４の上に形成（積層）されている、絶縁性を有するシート状の部材である。フィルム２５の厚さは、通常１μｍ以上１５０μｍ以下、好ましくは３μｍ以上５０μｍ以下、より好ましくは５μｍ以上３０μｍ以下である。フィルム２５は、センサ１１の先端にある試薬層２３に対応する部分、および対極２２ｃの一部に対応する部分に開口を有しており、その部分の試薬層２３および対極２２ｃは露出している。
　フィルム２５は、例えば、基板２１と同じ樹脂材料のシートに、粘着シート（例えば、アクリル系、ゴム系、またはホットメルト系）を貼り付けたものとすることができる。上記の樹脂材料のシートは、基板２１と同じ樹脂材料のシートであってもよいし、異なる樹脂材料のシートであってもよい。粘着シート単体をフィルム２５として用いてもよい。熱もしくは光可塑性レジストフィルム、またはレジストインキから形成された層を、フィルム２５として用いることも可能である。
　試薬層２３を形成するための試薬液は、フィルム２５の対応する部分にある開口から、電極２２（作用極２２ａ）の表面に滴下して塗布することができる。そのような工程の作業性等の観点から、フィルム２５の表面に対する試薬液の接触角（α）は、フィルム２５の開口部、すなわち露出している作用極２２ａの表面に対する試薬液の接触角（β）よりも高いことが好ましく、その差（α－β）は大きいほど好ましい。例えば、αは９０°以上であり、かつβは５０°以下であることが好ましい。なお、ここでいう「接触角」は、「θ／２法」により測定される「静的接触角」である。フィルム２５を形成する材料自体および／または露出している作用極２２ａを形成する材料自体が上記のような接触角の条件を満たさないとしても、適切な表面処理により、例えばフィルム２５に対する撥水処理および作用極２２ａに対する親水処理の少なくとも一方を行うことにより、上記のような接触角の条件を満たすことが可能である。
　図１（Ａ）および（Ｂ）には図示していないが、センサ１１の少なくとも試薬層２３を含む部分は保護膜で被覆されていてもよい。つまり、図２（Ｂ）の試薬層２３の上面には保護膜が形成（積層）されていてもよい。試薬層については、それが図示されている図４～図６を参照しながら後述する。
　センサ１１の製造方法は特に限定されるものではなく、上述したような構成を所定の部位に有するセンサ１１を製造できる方法を適宜選択して用いることができる。例えば、センサ１１は下記の工程（i）～（viii）を行うことにより製造することができる：
（i）基板２１の上面に電極２２を形成（積層）する工程；
（ii）電極２２を作用極２２ａ、参照極２２ｂおよび対極２２ｃの３つの領域に物理的かつ電気的に分離する、溝Ａ１およびＡ２を形成する工程；
（iii）電極２２（参照極２２ｂ）の上面に、銀／塩化銀層２４を形成する工程；
（iv）電極２２および銀／塩化銀層２４の上面に、フィルム２５を形成（積層）する工程；
（v）電極２２（作用極２２ａ）の上面に、試薬層２３を形成する工程；
（vi）試薬層２３および電極２２の一部（領域Ｘ６）を除去する工程；
（vii）基板２１からセンサ１１を切り出す工程；
（viii）保護膜を形成する工程。
　上記工程（i）について、電極２２の形成（積層）方法は、電極２２の材料と基板２１の材料の組み合わせ等を考慮して、適宜選択し調整することができる。例えば、基板２１の材料がＰＥＴ等の合成樹脂であり、電極２２の材料が金属である場合、蒸着（スパッタリングを含む。）により、その金属材料からなる電極２２を基板２１の表面に形成することができるが、他にも印刷、メッキ、スピンコート等を用いることもできる。基板２１の材料がＰＥＴ等の合成樹脂であり、電極２２の材料が炭素である場合は、例えば、基板２１の表面にカーボンペーストを印刷することにより炭素からなる電極２２を形成することができる。なお、この工程における基板２１は、あらかじめセンサ１１の形状を有している必要はなく、後に行われる工程（vii）によりセンサ１１を切り出すことができるよう、センサ１１よりも大きな寸法を有する基板２１を用いることができる。
　上記工程（ii）について、溝Ａ１およびＡ２を形成する手段としては、例えばレーザートリミングを用いることができる。
　上記工程（iii）について、銀／塩化銀層２４の形成方法は、銀／塩化銀層２４の材料と電極２２の材料の組み合わせ等を考慮して、適宜選択し調整することができる。例えば、銀／塩化銀ペースト（インク）を用いて、金属または炭素を材料とする電極２２の上面にスクリーン印刷法、インクジェット法などにより印刷または塗布した後、乾燥することにより、電極２２の上面に銀／塩化銀層２４を形成することができる。また、電極２２の上面に銀（Ａｇ）を印刷、塗布、メッキ等をした後、その表面を塩化処理することにより、銀／塩化銀層２４を形成することもできる。
　上記工程（iv）について、フィルム２５の形成（積層）方法は、フィルム２５の材料と電極２２および銀／塩化銀層２４の材料の組み合わせ等を考慮して、適宜選択し調整することができる。例えば、樹脂シートおよび粘着シートの積層体からなる、または粘着シート単体からなるフィルム２５に、試薬層２３の寸法に対応した（少なくとも試薬層２３の寸法よりも大きな）開口を形成しておく。そのようなフィルム２５を、その開口が電極２２（作用極２２ａ）の試薬層２３を形成する部分を取り囲むよう、電極２２の上面に配置し、粘着シートにより固定する。一方、レジストフィルムまたはレジストインキを用いて、上述したような所定の位置および寸法の部分を除去することで、所定の開口を有するフィルム２５を形成（積層）することもできる。
　なお、電極２２のうち対極２２ｃの一部（領域Ｘ３）の上面にはフィルム２５は形成されず、対極２２ｃが露出している。したがって、例えば、上記のようにして一旦対極２２ｃの上面も含めてフィルムを形成した後、カッティング等によりフィルム２５に切り欠き形状の開口を形成するようにしてもよい。
　上記工程（v）では、例えば、所定の開口を有するフィルム２５と、あらかじめ調製された試薬液とを用いて、その試薬液を上記工程（iv）により形成（積層）されているフィルム２５の開口の部分に滴下することで、作用極２２ａの少なくとも一部にアプライすることができる。そして、そのアプライされた試薬液を乾燥させることで、作用極２２ａの上面に試薬層２３が形成される。
　なお、フィルム２５の開口は、例えば、センサ１１（図１（Ｂ）に示す先端部分）の幅よりも大きな幅の試薬層が形成される寸法および形状を有していてもよい。その場合、アプライされた試薬液から、センサ１１の幅より大きく形成された試薬層は、次の工程（vi）によって、所定の幅および形状を有するものとなるよう整形される。
　上記工程（vi）における、試薬層２３および電極２２の除去（トリミング）は、センサ１１（先端部分）の幅方向の端部において、センサ１１の長さ方向（例えば生体への挿入方向）の所定の長さにわたって行われる。このような工程（vi）におけるトリミングにより、試薬層をある程度の面積にわたって形成した後に、適切な部分（好ましくは均一の部分）を選択して、センサ間で揃えられた所定の面積の試薬層を形成すること、あわせて次の工程（vii）において、形成された試薬層を割ることなく、センサ１１を外形に沿って基板２１から切り出すことができる。試薬層２３および電極２２の除去方法は、試薬層２３の材料（試薬液の組成）および電極２２の材料等を考慮して、適宜選択し調整することができる。例えば、試薬層２３および電極２２は、レーザートリミングにより除去することができる。
　上記工程（vii）について、センサ１１を基板２１から切り出す（カッティングする）方法は、基板２１の材料や切り出されるセンサの形状等を考慮して、適宜選択し調整することができる。例えば、基板２１の材料が樹脂である場合は、一般的なカッティング技術を用いることができる。
　なお、カッティング位置には工程（vi）によりトリミングされた部分が含まれ、例えば、レーザートリミングによる凹部の底部分の中央線付近をカッティング位置とすることができる。換言すれば、トリミングされた試薬層２３および作用極２２ａから多少離れた位置においてカッティングされる。
　上記工程（viii）は、本発明の電気化学センサとの関係で記載した保護膜の形成方法を参照できるほか、保護膜の材料すなわち保護膜溶液の組成および被覆される部分の材料（主に試薬層２３の材料すなわち試薬液の組成）の組み合わせ、被覆される部分の形状や面積等を考慮して、適宜選択し調整することができる。例えば、保護膜溶液に作用極２２ａ（少なくとも試薬層２３が形成されている部分）を浸し、引き上げて乾燥することにより、その部分を保護膜で被覆することができる。
　図３は、本発明の他の実施形態におけるセンサ１０１を表す平面図である。センサ１０１は、センシング部（生体内に挿入したり、培地中に浸漬したりする先端部分）１２１、および本体（図示せず）の内部回路と電気的に接続するための端子部１２２から構成される。
　図４は、図３のＡ－Ａ’切断線でのセンサ１０１の断面図を示す。絶縁性基板１１１の両面に導電性薄膜１１２を備える。絶縁性基板１１１の一方の面（表側）の導電性薄膜１１２は、レーザー描写によって絶縁性基板１１１の表面に達する深さの溝１１３を形成し、電気的に絶縁することで、作用極領域１１２ａと参照極領域１１２ｂに分離されている。
　絶縁性基板１１１の上面は、参照極領域１１２ｂの所定の位置に、参照極１１５を形成するための開口を有する絶縁性レジスト膜１１６ａで被覆され、絶縁性基板１１１の下面は、絶縁性レジスト膜１１６ｂで被覆されている。一方、センシング部分１２１の端部から一定距離離れた部分までは、上面、下面とも絶縁性レジスト膜１１６ａ、１１６ｂで被覆されておらず、その表側の領域１１２ａが作用極１１４となり、裏側の領域１１２ｃが対極１１７となる。試薬層１１８は、作用極１１４上に形成されている。
　図５は、図４におけるＢ－Ｂ’切断線における断面図を示し、図６は、図４におけるＣ－Ｃ’切断線における断面図を示す。図５に示すように、Ｂ－Ｂ’切断線では、上面から下面に向けて順に（図中の矢印方向）、保護膜１１９、試薬層１１８、作用極１１４、絶縁性基板１１１、対極１１７及び保護膜１１９が形成されている。また、図６に示すように、Ｃ－Ｃ’切断線では、上面から下面に向けて順に（図中の矢印方向）、保護膜１１９、参照極１１５（絶縁性レジスト膜１１６ａ）、作用極領域１１２ａ、絶縁性基板１１１、対極領域１１２ｃ、絶縁性レジスト膜１１６ｂ及び保護膜１１９が形成されている。なお、図６に示す作用極領域１１２ａ及び対極領域１１２ｃは、その上面側に絶縁性レジスト膜１１６ａ、１１６ｂを備えているため、作用極及び対極として機能しないこととなる。
　図７は、本発明の他の実施形態におけるセンサ２０１を表す平面図である。センサ２０１は、アナライトを電気化学的に測定するための構成を備えたセンシング部２０２、本体（図示せず）の内部回路と電気的に接続するための構成を備えた端子部２０３、および端子部の近傍に設けられた切り欠き部２０４を含む。センサ２０１は、例えば培地中のアナライト測定用のシステムを構築する場合に好適な実施形態であり、センシング部２０２は、液量の少ない培地中にも浸漬可能なような構造を有し、切り欠き部２０４は、培養容器にセンサ２０１を設置するのに適した構造を有する。図７（Ａ）は、フィルム（絶縁性レジスト膜）２３０が形成される前の電極パターンを示し、図７（Ｂ）は、フィルム２３０が形成された後の電極パターンを示す。
　図７（Ａ）に示すように、センサ２０１は、基板２１０上に電極２２０が形成されており、電極２２０は、溝２２５によって物理的かつ電気的に、第１の作用極２２１、第２の作用極２２２、参照極２２３および対極２２４に分離されている。図７（Ｂ）に示すように、フィルム２３０で被覆されることにより、第１の作用極２２１は、センシング部２０２における露出領域２２１ａと、端子部２０３における露出領域２２１ｂを有する。同様に、第２の作用極２２２、参照極２２３および対極２２４も、それぞれ、センシング部２０２における露出領域２２２ａ、２２３ａおよび２２４ａと、端子部２０３における露出領域２２２ｂ、２２３ｂおよび２２４ｂを有する。センシング部２０２には、第１の作用極の露出領域２２１ａおよび第２の作用極の露出領域２２２ａが、面積が最大化されるように横並びで配置されると共に、参照極の露出領域２２３ａおよび対極の露出領域２２４ａも配置される。第１の作用極の露出領域２２１ａおよび第２の作用極の露出領域２２２ａには、それぞれ異なるアナライトを測定するための、異なる種類の試薬層（図示せず）を形成することができる。第１の作用極、第２の作用極、参照極および対極それぞれの端子部２０３における露出領域２２１ｂ、２２２ｂ、２２３ｂおよび２２４ｂは、例えば電極パット（図示せず）により本体（図示せず）と電気的に接続することができる。
　本実施例（試験例を含む。）で用いた材料は以下の通りである。
（ａ）導電性炭素フィラー
　（ａ－１）カーボンブラック…Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ「０５－１５３０」
（ｂ）アニオン性分散剤
　（ｂ－１Ａ）ポリ(アクリル酸)１００，０００…Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ「５２３９２５」、Ａｖｅｒａｇｅ　Ｍｗ～１００，０００
　（ｂ－１Ｂ）ポリ(アクリル酸)２５，０００…富士フイルム和光純薬株式会社「１６２－１８５８１」、平均分子量：約２５，０００
　（ｂ－１Ｃ）ポリ(アクリル酸)５，０００…富士フイルム和光純薬株式会社「１６５－１８５７１」、平均分子量：約５，０００
　（ｂ－２Ａ）ポリ(スチレンスルホン酸ナトリウム塩)…Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ「８１６０９」、Ａｖｅｒａｇｅ　Ｍｗ～１６，８００
　（ｂ－２Ｂ）ポリ(４－スチレンスルホン酸ナトリウム)…Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ「２４３０５１」、Ａｖｅｒａｇｅ　Ｍｗ～７０，０００
　（ｂ－３）ポリ(４－スチレンスルホン酸－ｃｏ－マレイン酸)ナトリウム塩…Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ「４３４５５８」、Ａｖｅｒａｇｅ　Ｍｗ～２０，０００
　（ｂ－４）ポリ(エチレンオキシド)－ｂ－ポリ(アクリル酸)…Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｏｕｒｃｅ社「Ｐ６３４８－ＥＯＡＡ」、Ｍｎ（ＰＯＡ－ｂ－ＰＡＡ）：２－ｂ－２．４（１０３ｇ／ｍｏｌ）
　（ｂ－５）ポリ(スチレン)－ｂ－ポリ(アクリル酸)…Ｐｏｌｙｍｅｒ　Ｓｏｕｒｃｅ社「Ｐ２３９７－ＳＡＡ」、Ｍｎ（ＰＳ－ｂ－ＰＡＡ）：１．５－ｂ－４４（１０３ｇ／ｍｏｌ）
（非ｂ）非アニオン性分散剤
　（非ｂ－１）ヒドロキシプロピルセルロース…日本曹達株式会社「ＮＩＳＳＯ　ＨＰＣ」
（ｃ）カチオン性メディエータ
　（ｃ－１）ポリマー結合型ＰＮＴ１…レドックスメディエータ化合物（ｃ１）としてのフェノチアジン系化合物ＮＨＳ体（ＰＮＴ－７０）と、カチオン性ポリマー（ｃ２）としての、２－アミノエチルメタクリレート塩酸塩、(４－ビニルフェニル)メタンアミン、およびメタクリロイルコリンクロリドの共重合体（以下「ポリマーＣ」と呼ぶ。）とが結合した構造を有する。
　（ｃ－２）ポリマー結合型ＰＮＴ２…レドックスメディエータ化合物（ｃ１）としてのフェノチアジン系化合物（ＰＮＴ－７０）と、カチオン性ポリマー（ｃ２）としての、ポリ(Ｌ－リジン)塩酸塩（ＡＬＡＭＡＮＤＡ　ＰＯＬＹＭＥＲＳ社「ＰＬＫＣ８００」）（以下「ＰＬＬ」と呼ぶ。）とが結合した構造を有する。
　上記ＰＮＴ－７０、ポリマーＣ、ポリマー結合型ＰＮＴ１、ポリマー結合型ＰＮＴ２の合成方法は、それぞれ下記のとおりである。
　［合成例１］ＰＮＴ－７０の合成
（１）スルホン酸フラグメントの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　上記の反応により、スルホン酸フラグメントを合成した。
（２）スルホン酸フラグメントの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　上記のようなアセトニトリル中およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）中での２段階の反応により、カルボン酸フラグメントを合成した。
（３）ＰＮＴ－３４の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　上記のようにして合成したスルホン酸フラグメントおよびカルボン酸フラグメントをＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏに懸濁させ、内温４７℃付近で５０％Ａｇ２ＣＯ３／セライトを１５分かけて分割添加した。添加後、内温６８℃付近にて２．５時間撹拌した。室温まで放冷後、セライト濾過を行い、濾液を濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて複数回精製することで、ＰＮＴ－３４を得た。
（４）縮合体（ＰＮＴ－６８）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　Ａｒ雰囲気下、ＰＮＴ－３４をジクロロメタンに溶解させ、アミノ－ＰＥＧ１２－ｔ－ブチルエステルおよび１－エチル－３－(３－ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣＩ・ＨＣｌ）を添加後、室温下、３時間撹拌した。反応液を濃縮後、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにて３回精製することで縮合体（ＰＮＴ－６８）を得た。
（５）脱保護体（ＰＮＴ－６９）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　（４）で得られた縮合体（ＰＮＴ－６８）をジクロロメタンに溶解させ、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を添加した後、室温下、３時間撹拌した。反応液を濃縮後、トルエンで数回共沸させることで脱保護体（ＰＮＴ－６９）を得た。
（６）ＰＮＴ－６９ＮＨＳ体（ＰＮＴ－７０）の合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　脱保護体（ＰＮＴ－６９）をジクロロメタンに溶解させ、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）およびＥＤＣＩ・ＨＣｌを添加した後、室温下、４時間撹拌した。反応液をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製することで、ＰＥＧ鎖（ＰＥＧ１２）の末端のカルボキシ基が活性化（ＮＨＳエステル化）されたＰＮＴ－６９ＮＨＳ体（ＰＮＴ－７０）を得た。
　［合成例２］ポリマーＣの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　まず、２－アミノエチルメタクリレート塩酸塩と、(４－ビニルフェニル)メタンアミンと、メタクロイルコリンクロリドとを用意した。そして、４つ口フラスコに２－アミノエチルメタクリレート塩酸塩を０．９７ｍｍｏｌ、(４－ビニルフェニル)メタンアミンを０．９７ｍｍｏｌ、メタクロイルコリンクロリドを１１．９７ｍｍｏｌ、Ｖ－５０を０．０８ｍｍｏｌ、エタノールを１０．４９ｇ投入した。以降はポリマーＡの場合と同様の処理を施し、ポリマーＣを得た。ポリマーＣは、１Ｈ－ＮＭＲの結果からモル比を算出した結果、ｎ：ｍ：ｌ＝２１．２：８．１：７０．７であるポリマーに相当する。また、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定した結果、当該ポリマーの数平均分子量Ｍｎは３７，７７４であり、重量平均分子量Ｍｗは２１４，３６７であった。
　［合成例３］ポリマー結合型ＰＮＴ１の合成
　ＰＮＴ－６９ＮＨＳ体（ＰＮＴ－７０）を２１．０５ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水で溶解させた（液(1)）。高分子量ポリマーとして、ポリマーＣを１５ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水で溶解させた（液(2)）。次に、ＷＳＣ（ＤＯＪＩＮＤＯ　Ｗ００１）を２０ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水で溶解させた（液(3)）。液(1)を４０μＬ、液(2)を１４０．３μＬ、液(3)を３８３．４μＬ、別途調製した２５０ｍＭ　２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）を９６μＬ混合し、ＭｉｌｌｉＱ水で合計体積１２００μＬになるように調整した。その後、約２０時間、室温にて撹拌しながら反応させた。その後、遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ－４　５０ｋ；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を数回行い、低分子を除いた液を回収した。
　［合成例４］ポリマー結合型ＰＮＴ２の合成
　ＰＮＴ－６９ＮＨＳ体（ＰＮＴ－７０）を１５ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水で溶解させた（液(1)）。高分子量ポリマーとして、ポリ(Ｌ－リジン)塩酸塩（ＡＬＡＭＡＮＤＡ　ＰＯＬＹＭＥＲＳ　ＰＬＫＣ８００）を１０ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水で溶解させた（液(2)）。次に、ＷＳＣ（ＤＯＪＩＮＤＯ　Ｗ００１）を２０ｍｇ／ｍＬになるようにＭｉｌｌｉＱ水で溶解させた（液(3)）。液(1)を４３．７μＬ、液(2)を５１．３μＬ、液(3)を４７９．３μＬ、別途調製した２５０ｍＭ　２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液（ｐＨ６．０）を９６μＬ混合し、ＭｉｌｌｉＱ水で合計体積１２００μＬになるように調整した。その後、約２０時間、室温にて撹拌しながら反応させた。その後、遠心式限外ろ過フィルター（アミコンウルトラ－４　５０ｋ；メルクミリポア）を用いて限外ろ過を数回行い、低分子を除いた液を回収した。
（ｄ）酸化還元酵素
　（ｄ－１）ＦＡＤ依存性グルコースデヒドロゲナーゼ…ＧＤＨ ＧＬＤ１：ＢＢＩインターナショナル社製
（ｅ）架橋剤
　（ｅ－１）グルタルアルデヒド…グルタルアルデヒド２５％溶液（富士フイルム和光純薬株式会社）
（ｆ）緩衝液
　（ｆ－１）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ：(ビス(２－ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン)…同仁化学社製
　（ｆ－２Ａ）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５…Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ＵｌｔｒａＰｕｒｅ　１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社
　（ｆ－２Ｂ）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０…Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　ＵｌｔｒａＰｕｒｅ　１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ社
　（ｆ－２Ｃ）Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ８．５…１Ｍ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　（ｐＨ８．５）、富士フイルム和光純薬（製造元株式会社ニッポンジーン）
（ｇ）金属塩
　塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）…富士フイルム和光純薬株式会社（製品コード：１９１－０１６６５）
　塩化カリウム（ＫＣｌ）…ナカライテスク株式会社（製品コード：２８５１４－７５）
　臭化ナトリウム（ＮａＢｒ）…富士フイルム和光純薬株式会社（製品コード：１９２－０９４１２）
　臭化カリウム（ＫＢｒ）…富士フイルム和光純薬株式会社（製品コード：１６４－０３４７２）
　臭化マグネシウム（ＭｇＢｒ２）六水和物…富士フイルム和光純薬株式会社（製品コード：１３８－０９１９２、純度９９．９％）
　硫酸カリウム（Ｋ２ＳＯ４）…富士フイルム和光純薬株式会社（製品コード：１６９－１３５５２、純度９９．９％）
　［試験例１］分散性試験
　＜試薬液サンプルの調製＞
　表２に示す配合に従って、１ｍｇ／ｍＬまたは２ｍｇ／ｍＬの濃度の各種のアニオン性分散剤（ｂ）の水溶液に、カーボン濃度が２０ｍｇ／ｍＬとなるようにカーボンブラック（ａ－１）を添加した後、超音波ホモジナイザーで３分間以上処理することにより、試薬液サンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　＜試薬液のフィルター処理＞
　上記のようにして得られた試薬液サンプルを、使用時に超音波バスで約１０分間処理した。得られた再分散液サンプルを、０．８μｍのフィルター（ＡＤＶＡＮＴＥＣ、ＤＩＳＭＩＣ　２５ＣＳ０８０ＡＮ）で濾過し、回収された濾液をＭｉｌｌｉ－Ｑ水で１０倍希釈し、回収液サンプルとした。
　回収液サンプルの撮影画像を図８に示す。回収液サンプルの色が薄いほど、フィルターを通過したカーボンブラック（ａ－１）が少なく、凝集したカーボンブラック（ａ－１）であってフィルターに捕捉されたものが多いこと、つまり分散性が小さいことを意味している。しかしながら、試薬液（回収液）サンプル１－１～１－１１いずれのアニオン性分散剤（ｂ）であっても、程度の差はあるが、導電性炭素フィラー（ａ）を水系溶媒中に分散化させる効果を有することが示されている。また、アニオン性分散剤（ｂ）として、平均分子量の異なるポリ(アクリル酸)を同濃度（１ｍｇ／ｍＬ）で用いている試薬液（回収液）サンプル１－１～１－３の結果から、ポリ(アクリル酸)のようなアニオン性ポリマーをアニオン性分散剤（ｂ）として用いる場合、その平均分子量が大きくなると、導電性炭素フィラー（ａ）の分散化効果が小さくなることが示唆されている。
　［試験例２］ｐＨおよび金属イオン濃度依存性試験　その１
　表３に示す配合に従って、所定の濃度の各種の成分を含む試薬液サンプルを調製した。緩衝液は、所定の量で用いたときに試薬液のｐＨが所定の値となるよう、調製したものを用いた。なお、この試験例２は、金属イオン（金属塩）を含まない緩衝液を用いてｐＨを調節した上で、すべて同濃度の金属イオン（金属塩）を含有する試薬液サンプルの分散性を比較するものである。
　ポリマー結合型ＰＮＴの濃度は、まず各ポリマー結合型ＰＮＴのストック溶液を２５倍希釈してマイクロプレートに１００μＬ投入し、プレートリーダーで吸収スペクトルを測定することで、ストック溶液における濃度を確認し、その値を元に各試薬サンプルにおける濃度の調整を行った。「吸光度３相当」という値は、２５倍希釈時に６０８ｎｍの吸光度において約０．１２であることを示す。ここで、マイクロプレートには、グライナー・バイオ・ワン社製のＵＶ－Ｓｔａｒ（登録商標）９６Ｗｅｌｌ　Ｆ－Ｂｏｄｅｎを用いた。また、プレートリーダーには、テカン社製のｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）Ｍ２００　Ｐｒｏを用いた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　試薬液サンプルの調製は次のように行った。まず、アニオン性分散剤（ｂ）の水溶液に導電性炭素フィラー（ａ）を添加して超音波ホモジナイザーで３分間以上処理し、そこに緩衝液（ｆ）および金属塩（ｇ）を添加した。次に、その処理液にカチオン性メディエータ（ｃ）を添加して超音波ホモジナイザーで約３０秒間処理した。得られた試薬液サンプルにおける凝集の有無を目視で確認した。結果を表３にあわせて示す。
　［試験例３］ｐＨおよび金属イオン濃度依存性試験　その２
　表４に示す配合に従って、所定の濃度の各種の成分を含む試薬液サンプルを調製した。なお、この試験例３は、金属イオン（金属塩）を含まない緩衝液を用いてｐＨを調節した上で、異なる濃度の金属イオン（金属塩）を含有する試薬液サンプルの分散性を比較するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　試薬液サンプルの調製は次のように行った。まず、アニオン性分散剤（ｂ）の水溶液に導電性炭素フィラー（ａ）を添加して超音波ホモジナイザーで３分間以上処理し、そこに緩衝液（ｆ）および金属塩（ｇ）を添加した。次に、その処理液にカチオン性メディエータ（ｃ）を添加して超音波ホモジナイザーで約３０秒間処理した。得られた試薬液サンプルにおける凝集の有無を目視で確認した。結果を表４にあわせて示す。
　［試験例４］ｐＨおよび金属イオン濃度依存性試験　その３
　表５に示す配合に従って、所定の濃度の各種の成分を含む試薬液サンプルを調製した。なお、この試験例４は、金属イオン（金属塩）を含まない緩衝液を用いてｐＨを調節した上で、異なる種類および濃度の金属塩（金属イオン）を含有する試薬液サンプルの分散性を比較するものである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　試薬液サンプルの調製は次のように行った。まず、アニオン性分散剤（ｂ）の水溶液に導電性炭素フィラー（ａ）を添加して超音波ホモジナイザーで３分間以上処理し、そこに緩衝液（ｆ）および金属塩（ｇ）を添加した。次に、その処理液にカチオン性メディエータ（ｃ）を添加して超音波ホモジナイザーで約３０秒間処理した。
　得られた試薬液サンプルにおける凝集の有無を目視で確認した。結果を表５にあわせて示す。試験例２～４の結果について、まず試験例２の結果から、試薬液のｐＨが高い場合には（ｐＨの調整のための緩衝液由来の金属塩の濃度による影響ではなく、ｐＨ自体の影響により）凝集が発生することもあるが、試薬液の組成に応じた適切なｐＨの範囲において、導電性炭素フィラーの分散性を向上させ、凝集を抑制できることが分かった。また、試験例３および４の結果から、試薬液中に含まれる金属イオンの種類によって凝集の発生状況は異なるが、概して、金属イオンの濃度が高い場合に凝集が生じやすい傾向にあること、例えば、金属イオンの濃度が１００ｍＭ未満であれば、多くの金属イオンにとって凝集の発生を抑制できることが示唆されること、一方でマグネシウムイオンのように、濃度が５０ｍＭより高くても（例えば２００ｍＭ程度であっても）凝集の発生を抑制できる場合もあること、したがって金属イオンの種類に応じた適切な濃度の範囲において、導電性炭素フィラーの分散性を向上させ、凝集を抑制できることが分かった。
　［試験例５］アニオン性分散剤（ｂ）の試験
　表６に示す配合に従って、所定の濃度の各種の成分を含む試薬液サンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　試験液サンプルの調製は次のように行った。まず、アニオン性分散剤（ｂ）の水溶液に導電性炭素フィラー（ａ）を添加して超音波ホモジナイザーで３分間以上処理し、そこに緩衝液（ｆ）を添加した。次に、その処理液にカチオン性メディエータ（ｃ）を添加して超音波ホモジナイザーで約３０秒間処理し、最後に、その処理液に酸化還元酵素（ｄ）および架橋剤（ｅ）を添加した。
　得られた試験液サンプルにおける凝集の有無を目視で確認した。結果を表６にあわせて示す。カチオン性ポリマー（ｃ）として所定の共重合体を用いて合成されたポリマー結合型ＰＮＴ１と、カチオン性ポリマー（ｃ）としてＰＬＬを用いて合成されたポリマー結合型ＰＮＴ２とでは、その試薬液中の濃度や試薬液のｐＨによって導電性炭素フィラー（ａ）の分散性の改善効果に相違が見られるが、いずれのカチオン性ポリマー（ｃ）であっても導電性炭素フィラー（ａ）の分散性の改善効果が認められる条件が存在する。
　［試験例６］応答性評価試験
　＜試薬液の調製＞
　表７に示す配合に従って、所定の濃度の各種の成分を含む試薬液サンプルを調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　試験液サンプルの調製は次のように行った。まず、アニオン性分散剤（ｂ）またはその対照物の水溶液に導電性炭素フィラー（ａ）を添加して超音波ホモジナイザーで３分間以上処理し、そこに緩衝液（ｆ）を添加した。次に、その処理液にカチオン性メディエータ（ｃ）を添加して超音波ホモジナイザーで約３０秒間処理し、最後に、その処理液に酸化還元酵素（ｄ）および架橋剤（ｅ）を添加した。
　＜センサ用電極の作製＞
　絶縁基板上にスクリーン印刷法で作製したカーボン電極上に、上記のように調製した各試薬液サンプル０．６μＬ塗布し、オーバーナイトで乾燥させ、センサ用電極を得た。
　＜ＲＰＭＩ培地の調製＞
　ＲＰＭＩ－１６４０　Ｍｅｄｉｕｍ（シグマアルドリッチ社製　Ｒ１３８３）で作製した溶液に、緩衝液成分として２－モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ、同仁化学社製）、３－モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ、同仁化学社製）を各々終濃度２５ｍＭになるように加え、かつｐＨ７．４に調整した。このようにして得られた培地を、以下の実施例における「ＲＰＭＩ培地」として用いた。
　＜応答性に関するセンサ評価＞
　上記のように作製したセンサ用電極を作用極とし、対極としての白金電極と、参照極としてのＡｇ／ＡｇＣｌ電極（飽和ＫＣｌ）（ビー・エー・エス社製）とを組み合わせた３電極式の測定系について、ポテンショスタット（ビー・エー・エス社製）を用い、アンペロメトリック法によって、約３７℃、ＲＰＭＩ培地中での電流の時間変化（電流応答値）を測定した。具体的には、測定開始１００秒後から１００秒毎に、理論値３ｍＭ、１５ｍＭまたは３０ｍＭになるようにグルコースを添加し、電流応答値を測定した。電流応答値は、測定対象となるグルコースを添加した後から、次のグルコース添加直前の５秒前、１０秒前、１５秒前、２０秒前および２５秒前の５点の測定値から算出した平均値とした。また、最終濃度の電流値は、グルコース濃度が３０ｍＭになるようにグルコース溶液を添加した後、８０秒後、８５秒後、９０秒後、９５秒後および１００秒後の５点の測定値から算出した平均値とした。なお、各グルコース濃度における電流値は、グルコース濃度０ｍＭにおける電流値を減じるバックグラウンド補正処理を施した後の電流値である。
　また、同様の３電極式の測定系について、ＲＰＭＩ培地中でサイクリックボルタンメトリーを行った。スキャン速度は１０ｍＶ／ｓで行った。なお、電流応答値、サイクリックボルタンメトリー、どちらの結果もセンサ２本の測定値の平均である。
　電流応答値の結果を図９［Ａ］、サイクリックボルタンメトリーの結果を図９［Ｂ］に示す。電流応答性について、ヒドロキシプロピルセルロースを用いたセンサ（試薬液サンプル６－６）よりも、各アニオン性分散剤（アニオン性ポリマー）を用いたセンサ（試薬液サンプル６－１～６－５）の方が高い応答性を示した。同様に、サイクリックボルタンメトリーの結果についても、ヒドロキシプロピルセルロースを用いたセンサよりも各アニオン性分散剤（アニオン性ポリマー）を用いたセンサの方が高い酸化還元ピーク値が得られた。これは、アニオン性分散剤（アニオン性ポリマー）を用いることで、電極上へ密接にメディエータを吸着できたためと推察される。
　［試験例７］耐久性（応答維持率）評価試験
　＜試薬液の調製＞
　試験例７では、試験例６における試薬液サンプル６－１および６－６を再度調製して用いた。
　＜保護膜用ポリマー溶液の調製＞
　以下に示す各試薬を以下の終濃度となるように混合し、保護膜用ポリマー溶液を調製した。
　・ポリ(ｔｅｒ．ブチルメタクリレート－ｂ－４－ビニルピリジン)（ポリマーソース社製、以下「ｔＢｕＭＡ４ＶＰ」と称する。）　終濃度：７．１１％（ｗｔ／ｖ）
　・トリプロピレングリコールメチルエーテルメタクリレート－スチレン－４－ビニルピリジンのランダムコポリマー（ナード社製、以下「ＴＧＭＡＳ４ＶＰ」と称する。）　終濃度：０．８９％（ｗｔ／ｖ）
　・ポリ(エチレングリコール)ジグリシジルエーテル（シグマアルドリッチ社製、以下「ＰＥＧＤＧＥ」と称する。）　終濃度：０．９８％（ｗｔ／ｖ）
　・ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）　終濃度：５ｍＭ
　なお、ｔＢｕＭＡ４ＶＰ、ＴＧＭＡＳ４ＶＰおよびＰＥＧＤＧＥは、エタノールに溶解して用いた。ｔＢｕＭＡ４ＶＰの数平均分子量Ｍｎは、ポリ(ｔｅｒ．ブチルメタクリレート)が８７，０００、ポリ(４－ビニルピリジン)が７４，０００である。ｔＢｕＭＡ４ＶＰのＭｗ／Ｍｎは１．１６である。ＴＧＭＡＳ４ＶＰは、トリプロピレングリコールメチルエーテルメタクリレート：スチレン：４－ビニルピリジン＝６．６：２０．３：７３．０であり、数平均分子量Ｍｎが６０，７０４であり、重量平均分子量Ｍｗが１２０，０９５であり、Ｍｗ／Ｍｎが１．９８である。ＰＥＧＤＧＥの数平均分子量Ｍｎは～１，０００である。ＨＥＰＥＳ緩衝液は、２－[４－(２－ヒドロキシエチル)－１－ピペラジニル]エタンスルホン酸（同仁化学社製）を用いて調製した。
　＜センサ用電極の作製＞
　絶縁基板上にスパッタリングにて作製した金電極上に、上記のように調製した試薬液サンプルを０．５μＬ塗布し、１５分間乾燥させ、これを２回繰り返し、計３回塗布を行った。その後、オーバーナイトで乾燥させた。これにより、各金電極上に各試薬液サンプルに対応する試薬層を形成した。試薬層を形成した各金電極を、上記のように調製した保護膜用ポリマー溶液に浸漬し、引き上げ、乾燥させる作業を複数回繰り返し、各金電極上に保護膜を形成した。以上の工程により、センサ用電極を得た。
＜耐久性（応答維持率）に関するセンサ評価＞
　上記のように作製したセンサ用電極を作用極とし、対極としての白金電極と、参照極としてのＡｇ／ＡｇＣｌ電極（飽和ＫＣｌ）（ビー・エー・エス社製）とを組み合わせた３電極式の測定系について、ポテンショスタット（ビー・エー・エス社製）を用い、アンペロメトリック法によって、約３７℃、ＲＰＭＩ培地中での電流の時間変化を測定した。具体的には、測定開始１５００秒後から１０００秒毎に、理論値５ｍＭ、１５ｍＭまたは３０ｍＭになるようにグルコースを添加し、継続的に電流応答値を測定した。測定後は電極を３７℃のＲＰＭＩ培地中に保存した。また、保存後１日目、２日目および３日目に同様の測定を行った。なお、グルコース濃度５ｍＭおよび１５ｍＭにおける電流値は、測定対象となるグルコースを添加した後から、次のグルコース添加直前の５秒前、１０秒前、１５秒前、２０秒前および２５秒前の５点の測定値から算出した平均値である。また、最終濃度の電流値は、グルコース濃度が３０ｍＭになるようにグルコース溶液を添加した後、９８０秒後、９８５秒後、９９０秒後、９９５秒後および１０００秒後の５点の測定値から算出した平均値である。各グルコース濃度における電流値は、グルコース濃度０ｍＭにおける電流値を減じるバックグラウンド補正処理を施した後の電流値である。
　結果を図１０に示す。保護膜被膜後についても、電流応答性はヒドロキシプロピルセルロース（試薬液サンプル６－６）を用いたセンサよりも、ポリ(アクリル酸)（試薬液サンプル６－１）を用いたセンサの方が高い値を示した。また、３日後のセンサ耐久性（初日に対する電流維持率）についても、ポリ(アクリル酸)（試薬液サンプル６－１）を用いたセンサがより高い値を示した。これは、メディエータがより強固に電極上に吸着しているためと推察される。

 
 

Claims (19)

  1. 　導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む試薬層。
  2. 　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、重量平均分子量が７００００以下のポリマーである、請求項１に記載の試薬層。
  3. 　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、側鎖にカルボキシ基および／またはスルホ基を有するポリマーである、請求項１に記載の試薬層。
  4. 　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、アクリル酸由来ユニット、マレイン酸由来ユニット、およびスチレンスルホン酸由来ユニットからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むポリマーである、請求項３に記載の試薬層。
  5. 　前記カチオン性メディエータ（ｃ）が、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）とカチオン性ポリマー（ｃ２）とが、必要に応じてリンカー部（ｃ３）を介して、結合している化合物である、請求項１に記載の試薬層。
  6. 　前記カチオン性ポリマー（ｃ２）が、第四級アンモニウムカチオン基を有する、請求項５に記載の試薬層。
  7. 　前記導電性炭素フィラー（ａ）が、カーボンブラックである、請求項１に記載の試薬層。
  8. 　アナライトを酸化または還元する酸化還元酵素（ｅ）をさらに含む、請求項１に記載の試薬層。
  9. 　前記酸化還元酵素（ｅ）が、補酵素結合型のものである、請求項８に記載の試薬層。
  10. 　前記酸化還元酵素（ｅ）が、前記カチオン性ポリマー（ｃ２）と架橋されている、請求項８に記載の試薬層。
  11. 　アナライトを検出又は定量する電気化学センサであって、作用極、対極、および請求項１～１０のいずれか一項に記載の試薬層を有する、電気化学センサ。
  12. 　さらに参照極を有する、請求項１１に記載の電気化学センサ。
  13. 　さらに、少なくとも前記試薬層を被覆する保護膜を有する、請求項１１に記載の電気化学センサ。
  14. 　（１）導電性炭素フィラー（ａ）と、アニオン性分散剤（ｂ）と、カチオン性メディエータ（ｃ）とを含む試薬液を調製する工程、
    　（２）前記試薬液を試薬層形成部位にアプライする工程、及び
    　（３）アプライされた前記試薬液を乾燥させて、試薬層を形成する工程、
    を含む、試薬層の形成方法。
  15. 　前記試薬液のｐＨが８．０以下である、請求項１４に記載の試薬層の形成方法。
  16. 　前記試薬液中の金属イオンの濃度が２００ｍＭ以下である、請求項１５に記載の試薬層の形成方法。
  17. 　前記試薬液中の前記金属イオンがアルカリ金属イオンであり、その濃度が１００ｍＭ未満である、請求項１６に記載の試薬層の形成方法。
  18. 　前記アニオン性分散剤（ｂ）が、重量平均分子量が７００００以下の、アクリル酸由来ユニット、マレイン酸由来ユニット、およびスチレンスルホン酸由来ユニットからなる群より選ばれる少なくとも１つを含むポリマーである、請求項１４に記載の試薬層の形成方法。
  19. 　前記カチオン性メディエータ（ｃ）が、レドックスメディエータ化合物（ｃ１）と、第四級アンモニウムカチオン基を有するカチオン性ポリマー（ｃ２）とが、必要に応じてリンカー部（ｃ３）を介して、結合している化合物である、請求項１４に記載の試薬層の形成方法。

     
     
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