WO2023287238A1 - 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물 - Google Patents

뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물 Download PDF

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WO2023287238A1
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transferrin receptor
human transferrin
seq
protein
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류성언
장혜현
김명빈
김소희
송다빈
박성호
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한양대학교 산학협력단
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to anti-human transferrin receptor antibodies with improved blood-brain barrier passage efficiency, and multispecific antibodies and pharmaceutical compositions using the same, wherein the binding affinity to human transferrin receptor is controlled to improve blood-brain barrier passage efficiency. It relates to human transferrin receptor antibodies, and multispecific antibodies and pharmaceutical compositions that can be effectively applied to the prevention or treatment of brain diseases using the same.
  • the blood-brain-barrier is a barrier that exists between the brain and blood vessels, and protects the central nervous system's regulatory function from pathogens or potentially dangerous substances by selectively permeating only nutrients or metabolites necessary for the brain. Plays an important role.
  • the selective permeability of the blood-brain barrier blocks the inflow of brain disease therapeutics, many brain disease therapeutics cannot be delivered to target cells, making it difficult to show clinical effects.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 10-2019-0045101 discloses a technique for improving treatment efficiency and blood-brain barrier permeability by designing an aminophenylthiazole derivative in which the calcium-dependent chloride channel blocker T16Ainh-A01 is structurally modified, there is.
  • transcytosis transcytosis pathway through endogenous receptors present in cells constituting the blood-brain barrier
  • Antibodies that bind to endogenous receptors present in the blood-brain barrier cross the blood-brain barrier by endocytosis (endocytosis) with the receptor, entering the cell, and exocytosis (exocytosis) on the other side. can do.
  • endocytosis endocytosis
  • exocytosis exocytosis
  • an anti-transferrin receptor (TfR) antibody is an antibody that binds to the transferrin receptor present in large quantities in the blood-brain barrier and binds tightly to the receptor so that endocytosis occurs well, but does not easily separate from the receptor when exocytosis occurs.
  • TfR anti-transferrin receptor
  • An anti-transferrin receptor antibody is an antibody that binds to the transferrin receptor present in large quantities in the blood-brain barrier and binds tightly to the receptor so that endocytosis occurs well, but does not easily separate from the receptor when exocytosis occurs.
  • the anti-transferrin receptor antibody does not enter the brain and is attached to the blood-brain barrier cells, resulting in a decrease in the delivery efficiency of the therapeutic substance.
  • the inventors of the present invention attempted to overcome the above-described limitations of the prior art by designing an anti-transferrin receptor antibody having a controlled binding affinity to the transferrin receptor and having excellent blood-brain barrier passage efficiency.
  • An object of the present invention is to provide an anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) with improved blood-brain barrier passage efficiency.
  • Another object of the present invention is to provide a multispecific antibody prepared using the anti-human transferrin receptor antibody.
  • Another object of the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases comprising the anti-human transferrin receptor antibody or multispecific antibody.
  • the present invention provides an anti-human transferrin receptor antibody with improved blood-brain barrier passage efficiency.
  • the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention includes a heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 2, and one of tyrosine (Y) in the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 and 2
  • VH heavy chain variable region
  • VL light chain variable region
  • Y tyrosine
  • the tyrosine may be selected from the group consisting of Y27, Y98, Y99 of SEQ ID NO: 1 and Y94 of SEQ ID NO: 2 according to Kabat numbering.
  • the substitution may include one or more mutations selected from the group consisting of Y27H, Y98A, Y99H of SEQ ID NO: 1 according to Kabat numbering, and Y94A of SEQ ID NO: 2.
  • one or more drug compounds may be conjugated to the anti-human transferrin receptor antibody.
  • Antibodies of the present invention may be humanized antibodies.
  • the present invention also provides a multispecific antibody using the anti-human transferrin receptor antibody.
  • the multispecific antibody is a multispecific antibody comprising at least one first binding domain binding to human transferrin receptor (hTfR) and at least one second binding domain binding to a target molecule, wherein the first binding domain
  • the domain includes a heavy chain variable region (VH) of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region (VL) of SEQ ID NO: 2, and in the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2, at least one of tyrosine (Y) is alanine (A) or It may be substituted with histidine (H).
  • the target molecules of the second binding domain are chondroitin sulfate, beta-secretase 1 (BACE1), gamma-secretase, amyloid beta, Abeta), epidermal growth factor receptor (EGFR), tau, apolipoprotein E4 (ApoE4), alpha-synuclein, CD20, huntingtin protein , prion protein (PrP), leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), amyloid precursor protein (APP), p75 neurotrophin receptor (p75NTR), caspase It may be caspase 6 or glucocerebrosidase.
  • the second binding domain may include a protein derived from PTPsigma (Protein Tyrosine Phosphatase sigma).
  • the PTPsigma-derived protein may include amino acid sequences from positions 30 to 231 of the PTPsigma protein.
  • leucine (L) in the PTPsigma-derived protein may be substituted with asparagine (N).
  • the first binding domain may be selected from the group consisting of Fab, scFv, di-scFv, dsFv and (dsFv) 2 .
  • the first binding domain and the second binding domain may be linked to an Fc region to constitute a multispecific antibody.
  • more than one drug compound may be conjugated to the multispecific antibody.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating brain diseases comprising the multispecific antibody.
  • the brain disease is Parkinson's disease, Alzheimer's disease, traumatic brain injury, stroke, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis It may be selected from the group consisting of lateral sclerosis, spinal cord injury, alcoholic cranial nerve disease, alcoholic dementia, and Wernicke-Korsakoff's syndrome.
  • the present invention also provides a method for preventing or treating a brain disease, comprising administering a pharmaceutical composition containing the anti-human transferrin receptor antibody or a multispecific antibody using the same.
  • the anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) designed in the present invention binds to the human transferrin receptor (hTfR) on the blood-brain barrier and enters the cell membrane through endocytosis, and has a controlled binding affinity with hTfR.
  • the road facilitates exocytosis. Accordingly, the anti-hTfR antibody of the present invention has excellent transcytosis efficiency for blood-brain barrier cells and can enter the brain without remaining in blood-brain barrier cells.
  • the anti-hTfR antibody of the present invention can be applied to multispecific antibodies, drug-antibody conjugates, etc. to efficiently deliver therapeutic proteins or drug compounds to the brain.
  • high-dose administration is possible when a protein having excellent aqueous solution solubility is combined as a therapeutic protein of the multispecific antibody, the effect as a therapeutic agent for brain diseases can be further improved.
  • Figure 1 shows tyrosine residues important for the structure and interaction of an anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) and human transferrin receptor (hTfR) complex.
  • anti-hTfR antibody anti-human transferrin receptor antibody
  • hTfR human transferrin receptor
  • VH heavy chain variable region
  • FIG. 3 schematically shows the structure of a multispecific antibody according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • Figure 4 shows the SDS PAGE results of the Fab fragment of the anti-hTfR antibody according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the determination of the Fab fragment of the anti-hTfR antibody according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows the crystal tertiary structure of the Fab fragment of anti-hTfR antibody.
  • FIG. 8 shows the results of measuring the binding affinity of an anti-hTfR antibody to hTfR according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9 shows the results of measuring the blood-brain barrier passage efficiency of the VH-Y27H mutant of the anti-hTfR antibody according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 11 shows the results of measuring blood-brain barrier passage efficiency for anti-hTfR:PTPsigma bispecific antibodies according to an embodiment of the present invention.
  • FIG 12 shows the results of neurite outgrowth assay of PTPsigma protein according to an embodiment of the present invention.
  • the present invention relates to an anti-transferrin receptor antibody with improved blood-brain barrier passage efficiency.
  • an anti-transferrin receptor antibody refers to an antibody that binds to the transferrin receptor (TfR).
  • the anti-transferrin receptor antibody may be an anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) in which endocytosis occurs when it binds to human transferrin receptor (human TfR, hTfR), specifically, human antibody Mutations may be formed in the variable region of 128.1.
  • the term “antibody” includes immunoglobulin (Ig)-derived molecules that are immunologically reactive with specific antigen(s), and the immunoglobulin includes IgG such as IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4; It may be IgA, IgE, IgD or IgM.
  • the term “antibody” includes both polyclonal antibodies and monoclonal antibodies, and includes genetic engineering antibodies such as chimeric antibodies (eg, humanized murine antibodies) and heterogeneous antibodies (eg, bispecific antibodies). It is meant to include forms produced by
  • the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention is an antibody protein containing a variable region, and its shape can be changed and prepared according to the purpose.
  • the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention may be a whole antibody having both Fab and Fc regions, antibody fragments, and recombinant antibodies thereof.
  • the antibody fragments and recombinant antibodies may be in the form of Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv) 2 , etc., or in the form of connecting them to the Fc region.
  • mutant is meant to include substitution, insertion and/or deletion of amino acid residues, and preferably, mutations in the present invention include substitution of amino acid residues. Substitutions of amino acid residues are indicated in the order of the amino acid residue present in the parent wild-type protein, the number of the amino acid residue, and the amino acid residue substituted.
  • the tertiary structure of the antigen-binding region of the human antibody 128.1 which has been reported to bind to the human transferrin receptor and undergoes endocytosis, was identified by X-ray crystallography, and based on the modeling of the complex structure with the receptor, protein-protein We found tyrosine residues important for the interaction, and in particular, structurally predicted tyrosine residues that did not affect the antibody structure when mutated. Based on this, as a result of mutating specific tyrosine residues, it was confirmed that the interaction between the anti-human transferrin receptor antibody and the transferrin receptor was reduced and the transcytosis of blood-brain barrier cells was significantly improved compared to the wild-type antibody. An anti-hTfR antibody with controlled levels was developed.
  • the anti-hTfR antibody of the present invention can effectively pass through the blood-brain barrier, and when produced in the form of a multispecific antibody together with a protein that promotes nerve cell growth, a brain disease treatment with improved brain delivery effect can be provided.
  • tyrosine (Y) in the heavy chain variable region (VH) and/or light chain variable region (VL) of human antibody 128.1 is substituted with another amino acid. characterized by being
  • amino acid sequence of the variable region of the human antibody 128.1 follows Kabat numbering.
  • the wild-type (WT) sequences of the heavy chain variable region (VH) and light chain variable region (VL) of the human antibody 128.1 may be represented by SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • the anti-human transferrin receptor antibody according to the present invention includes a heavy chain variable region of SEQ ID NO: 1 and a light chain variable region of SEQ ID NO: 2, and at least one of tyrosine (Y) in the amino acid sequences of SEQ ID NOS: 1 and 2 is alanine (A ) or histidine (H).
  • Figure 1 shows the complex structure of anti-human transferrin receptor antibody and human transferrin receptor and tyrosine residues important for interaction.
  • the tyrosine to be substituted in the present invention may be one or more of Y27, Y98 and Y99 of SEQ ID NO: 1 and Y94 of SEQ ID NO: 2.
  • Figure 2 shows the Kabat numbering of the heavy chain variable region (VH) of human antibody 128.1, and referring to this, the position of the tyrosine corresponding to the number in the heavy chain variable region of SEQ ID NO: 1 can be confirmed.
  • VH heavy chain variable region
  • the tyrosine may be substituted with histidine (H) or alanine (A), and the substitution includes one or more mutations selected from the group consisting of Y27H, Y98A, Y99H of SEQ ID NO: 1, and Y94A of SEQ ID NO: 2. can do.
  • the anti-human transferrin receptor antibody may be a humanized antibody. That is, the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention may contain all or part of the amino acid sequence of a complementarity determining region (CDR) derived from a non-human animal.
  • CDR complementarity determining region
  • an anti-human transferrin receptor antibody with improved blood-brain barrier passage efficiency by adjusting the binding affinity between the antibody and the receptor through the mutation.
  • the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention can be used in a multispecific antibody or antibody-drug conjugate, and can be usefully used for treatment of brain diseases requiring improved blood-brain barrier passage efficiency.
  • the present invention also provides a multispecific antibody using the anti-human transferrin receptor antibody.
  • multispecific antibody refers to an antibody capable of binding to two or more different antigens or receptors, for example, a bispecific antibody, a trispecific antibody ), etc., and includes forms produced by genetic engineering.
  • the multispecific antibody may include one or more first binding domains that bind human transferrin receptor (hTfR) and one or more second binding domains that bind target molecules. It is also possible that the multispecific antibody according to the present invention further comprises one or more binding domains different from the first binding domain and the second binding domain (multiple binding domains). In this case, various treatment strategies may be proposed by binding to other target molecules in addition to the targets of the first binding domain and the second binding domain.
  • hTfR human transferrin receptor
  • binding domain is interpreted as a concept that includes all antibody-derived proteins, biologically-derived proteins, and artificially designed interaction proteins.
  • the second binding domain and the multiple binding domains may each independently include a living protein or an artificially designed interaction protein in addition to an antibody-derived protein.
  • a multispecific antibody of the present invention may include a first binding domain that binds to a human transferrin receptor, a second binding domain that binds to a target molecule, and an Fc region, in which case the first binding domain and the second binding domain bind to the target molecule.
  • the binding domain may have a structure linked to the Fc region.
  • a fusion protein constructed to have multispecificity using a linker other than an Fc region-derived protein may also be included in the scope of the multispecific antibody of the present invention.
  • the multispecific antibody of the present invention has the variable region sequence of the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention in one arm (first binding domain), and the other arm (second binding domain) for treatment of brain diseases.
  • the multispecific antibody of the present invention binds to the human transferrin receptor through the first binding domain and easily passes through the blood-brain barrier through transcytosis, effectively delivering the therapeutic protein of the second binding domain to brain tissue.
  • the first binding domain is a region including a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL), and its shape can be changed and prepared according to the purpose.
  • the first binding domain may be a Fab form including VH-CH1 and VL-CL, a fragment thereof, and a recombinant form.
  • the first binding domain may be in the form of Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv) 2 and the like.
  • the heavy chain variable region (VH) of the first binding domain comprises SEQ ID NO: 1
  • the light chain variable region (VL) comprises SEQ ID NO: 2, but SEQ ID NOs: 1 and 2 It is characterized in that at least one of tyrosine (Y) is substituted with alanine (A) or histidine (H) in the amino acid sequence. Accordingly, the first binding domain can effectively induce transcytosis through the human transferrin receptor to transport the multispecific antibody into the brain.
  • the second binding domain may include a protein that binds to a target molecule, for example an antigen-binding region of an antibody that binds to a target molecule, or a therapeutic protein.
  • the second binding domain may be combined with a target molecule to promote nerve cell growth.
  • the antigen-binding region of the antibody that binds to the target molecule refers to a part of the antibody that specifically binds to part or all of the antigen (target molecule) and includes a region complementary to part or all of the antigen. can do.
  • the form of the antigen-binding region is not particularly limited, and may be in the form of sdAb, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv) 2 as well as Fab form.
  • the Fab form includes the CH1 domain of the heavy chain variable region (VH) and constant region (CH), and the light chain variable region (VL) and constant region (CL), and a disulfide bond is formed between the CH1 and CL.
  • the sdAb form means a single-domain variable fragment, and means one variable region domain.
  • the scFv form means a single-chain variable fragment in the form of a continuous variable region, and means a recombinant domain in which VH and VL regions are connected by a peptide linker.
  • the di-scFv form means a recombination domain in which two scFvs are linked by a linker.
  • the linker may suitably use a linker known in the art, and may be a peptide composed of 5 to 20 amino acids.
  • the linker may be composed of one or more amino acids selected from the group consisting of G, A, S, P, E, T, D and K.
  • the linker may be (GGGGX) n , X is preferably A or S, and n is preferably a natural number from 1 to 4.
  • dsFv form is a disulfide-linked variable fragment, similar to scFv in that the variable region is connected, but refers to a recombinant domain in which the VH and VL regions are connected by a disulfide bond rather than a linker.
  • (dsFv) 2 form means a recombination domain in which two dsFvs are connected by a linker.
  • Target molecules of the second binding domain include chondroitin sulfate, beta-secretase 1 (BACE1), gamma-secretase, amyloid beta (Abeta), epithelial Epidermal growth factor receptor (EGFR), tau, apolipoprotein E4 (ApoE4), alpha-synuclein, CD20, huntingtin protein, prion protein ( prion protein (PrP), leucine-rich repeat kinase 2 (LRRK2), amyloid precursor protein (APP), p75 neurotrophin receptor (p75NTR), caspase 6 6), glucocerebrosidase, and the like.
  • the second binding domain may include a protein derived from PTPsigma (Protein Tyrosine Phosphatase sigma) as a protein that promotes nerve cell growth.
  • PTPsigma Protein Tyrosine Phosphatase sigma
  • PTPsigma is a transmembrane receptor type PTP that penetrates cell membranes and consists of three parts: an extracellular domain (ectodomain), a cell membrane passage, and a cytoplasmic domain.
  • the extracellular domain is composed of three Ig-like domains starting from the N-terminal and several subsequent fibronectin domains.
  • the extracellular domain site undergoes receptor-ligand interaction, and this interaction is transferred to the cytoplasmic site to regulate the enzyme activity of the PTP active domain.
  • the PTPsigma-derived protein may be a protein derived from the extracellular domain (ectodomain) of PTPsigma.
  • the protein derived from the extracellular domain of PTPsigma means a protein containing all or part of the sequence of the extracellular domain of PTPsigma.
  • the protein derived from the extracellular domain of PTPsigma is preferably a protein derived from the Ig-like domain of the extracellular domain, among which the first and second Ig-like domains (Ig1-2), or the first -It is more preferably a protein derived from the third Ig-like domain (Ig1-3).
  • PTPsigma binds to chondroitin sulfate in cranial nerves to cause signal transmission, and when such signal transmission occurs, neurite growth and nerve cell regeneration are inhibited in the brain of brain patients with brain diseases such as Alzheimer's dementia, accidental brain damage, and Parkinson's disease. impede the recovery of damage;
  • PTPsigma's signal transmission can be blocked by transporting the extracellular domain of PTPsigma to the brain and binding to chondroitin sulfate, so it is expected to be useful as a therapeutic agent for brain diseases.
  • the PTPsigma-derived protein is an amino acid sequence derived from Ig1-2 of the PTPsigma extracellular domain, and may include sequences 30 to 231 of the PTPsigma protein.
  • the protein derived from PTPsigma may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 below.
  • a PTPsigma mutant may be formed in the PTPsigma-derived protein to improve the solubility of the multispecific antibody in an aqueous solution.
  • proteins containing Ig-like domains do not have high solubility in aqueous solution, so it is difficult to treat them in animals or humans at high doses.
  • hydrophobic amino acids exposed on the surface of the Ig-like domain of PTPsigma amino acids that do not modify the structure were selected, and solubility was improved by substituting them with hydrophilic amino acids.
  • one or more residues of isoleucine (I), valine (V), leucine (L), and tyrosine (Y) in the PTPsigma-derived protein are alanine (A), serine (S), It may be substituted with threonine (T), asparagine (N), glutamine (Q), aspartic acid (D), glutamic acid (E), lysine (K), arginine (R) or histidine (H), preferably , One or more of leucine (L) may be substituted with asparagine (N).
  • one or more residues of I36, V104, V108, L125, L143, L145, L155, L187, Y224 and V227 among sequences 30 to 231 of PTPsigma are A, S, T , N, Q, D, E, K, R or H is preferred, and from the viewpoint of improving solubility, at least one residue among L143, L155, L187, Y224 and V227 is more preferably substituted with A or N. Due to the above mutation, the aqueous solution solubility of the multispecific antibody is improved and high-dose treatment is possible in the treatment of humans and animals, so it is expected that the therapeutic effect can be further increased.
  • the first binding domain and the second binding domain may have a form linked to each chain of the Fc region.
  • Fc region refers to a C-terminal region including CH2 and CH3 domains (or CH2, CH3 and CH4 domains) among heavy chain constant regions of immunoglobulin, and is a wild-type Fc region. and variants thereof.
  • the immunoglobulin that is the parent of the Fc region may be IgG1, IgG2, IgG3, or IgG4, preferably IgG1.
  • the Fc region may refer to a region extending from residue 221 of a human IgG1 heavy chain to the C-terminus, or a region further including a hinge in the region.
  • the numbering of amino acid residues in the Fc region is according to EU numbering which defines the numbering of residues in human immunoglobulin heavy chains.
  • wild-type Fc region includes an amino acid sequence identical to the amino acid sequence of an Fc region of an immunoglobulin found in nature.
  • the term “variant of Fc region” includes one or more amino acid residues different from the wild-type Fc region, and may be abbreviated as “Fc variant”.
  • the Fc variant may have about 80% or more, preferably about 90% or more, homology to the parent wild-type Fc region sequence.
  • each chain of the Fc region may include sequences 221 to 447 of the heavy chain of IgG1. Sequences 221 to 447 of the heavy chain of the IgG1 may be represented by the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 below.
  • each binding domain and Fc region may be linked by 0 to 20 amino acid residues. That is, the binding domain and the Fc region may be directly linked or linked through a linker consisting of 1 to 20 amino acids. At this time, each binding domain may be linked to the N-terminus, C-terminus, or an amino acid located therebetween of the Fc region, preferably linked to the N-terminus.
  • the first binding domain may be linked to 1 to 3 sites among 4 binding sites including two N-terminus and two C-terminus of a dimer (dimer) of the Fc region, and among the remaining sites.
  • a second binding domain may be linked to one or more sites.
  • recombinant variants may be formed in the Fc region to form multispecific antibodies.
  • the dimer when the first binding domain and the second binding domain are respectively attached to the two chains of the Fc region dimer, the dimer can be formed by introducing a recombinant variant.
  • a knob-into-hole technique may be used as a recombination variant for forming the dimer.
  • the knob-into-hole technology is a technology designed to form only heterodimers between heavy chains of antibody fragments.
  • the knob is designed to have a side chain protruding from the opposite chain, and is inserted into a hole of the opposite domain. Due to this, heavy chains cannot be homodimerized due to side chain collisions, and only heterodimerization is possible.
  • one of the two chains constituting the Fc region may have a knob structure and the other may have a hole structure. It is called Fc-hole.
  • the Fc-knob may be formed by substituting one or more amino acids in the chain constituting the Fc region with a large amino acid selected from the group consisting of tryptophan (W), arginine (R), phenylalanine (F) and tyrosine (Y). .
  • the Fc-knob may have a T366W mutation formed in sequences 221 to 447 of the IgG1-Fc heavy chain.
  • the Fc-hole may be formed by replacing one or more amino acids in the chain constituting the Fc region with a small amino acid selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T) and valine (V).
  • a small amino acid selected from the group consisting of alanine (A), serine (S), threonine (T) and valine (V).
  • the Fc-hole is T366S, L368A and Y407V in sequences 221 to 447 of the IgG1-Fc heavy chain. A mutation may have been formed.
  • Figure 3 schematically shows the structure of a multispecific antibody according to an exemplary embodiment of the present invention.
  • a first binding domain in the form of a Fab is linked to an Fc-hole, and to a target molecule.
  • the second binding domain including the binding therapeutic protein may have a structure linked to the Fc-knob.
  • an Fc homodimeric multispecific antibody when the first binding domain and the second binding domain are attached to the N-terminus and C-terminus (or vice versa) of each Fc chain, multispecificity using an Fc homodimer It is possible to make anti-antibodies.
  • an Fc homodimeric multispecific antibody may be named.
  • the multispecific antibody of the present invention can easily pass through the blood-brain barrier through a domain that binds to the anti-human transferrin receptor antibody, whereby the domain that binds to a target molecule and exerts a therapeutic effect is effectively delivered to the brain, resulting in an excellent brain. It can show a disease treatment effect.
  • a drug compound may be conjugated to the anti-human transferrin receptor antibody or multispecific antibody of the present invention to form an antibody-drug conjugate (ADC).
  • ADC antibody-drug conjugate
  • the antibody-drug conjugate is for delivering a low-molecular drug compound to brain tissue by using transcytosis of an anti-human transferrin receptor antibody through a human transferrin receptor, and the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention or a multiplex using the same Attaching a drug compound to a specific antibody can improve the delivery efficiency of a drug that is difficult to pass through the blood-brain barrier.
  • the drug may be linked to the C-terminus and/or N-terminus of each antibody chain, as well as to one or more residues of amino acids within the chain.
  • the drug may be conjugated using an appropriate linker.
  • drug compounds, growth inhibitors, toxins, radioactive isotopes, miRNA, siRNA, shRNA, and the like known in the art may be used.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition comprising the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention or a multispecific antibody using the same.
  • the pharmaceutical composition may be used for treating brain diseases, and the brain diseases include Parkinson's disease, Alzheimer's disease, traumatic brain injury, stroke, Huntington's disease , amyotrophic lateral sclerosis, spinal cord injury, alcoholic cranial nerve disease, alcoholic dementia, and Wernicke-Korsakoff's syndrome. .
  • Parkinson's disease in the case of using a multispecific antibody prepared by fusing with a protein that promotes nerve cell growth according to one embodiment of the present invention, Parkinson's disease, Alzheimer's disease, and accidental brain damage It can be effectively used for prevention or disease of brain diseases such as traumatic brain injury.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antibody of the present invention.
  • the pharmaceutically acceptable carrier is one commonly used in formulation, and includes lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia gum, calcium phosphate, alginate, gelatin, calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include lubricants, wetting agents, sweeteners, flavoring agents, emulsifiers, suspending agents, preservatives, and the like, in addition to the above components.
  • composition of the present invention can be administered orally or parenterally, and in the case of parenteral administration, intravenous injection, subcutaneous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, endothelial administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, intrarectal administration, etc. can be administered with
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of a sterile injection solution, a lyophilized formulation, a pre-filled syringe solution, an oral formulation, an external preparation or a suppository according to conventional methods. there is.
  • the oral composition When administered orally, since the protein or peptide is digested, the oral composition may be formulated to coat the active agent or protect it from degradation in the stomach.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared in unit dosage form by formulation using a pharmaceutically acceptable carrier and/or excipient according to a method that can be easily performed by those skilled in the art, or Or it can be prepared by incorporating into a multi-dose container.
  • the formulation may be in the form of a solution, suspension, syrup or emulsion in an oil or aqueous medium, or may be in the form of an extract, powder, powder, granule, tablet or capsule, and may additionally contain a dispersing agent or stabilizer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include at least one other therapeutic or diagnostic agent.
  • at least one other therapeutic or diagnostic agent for example, an interferon, an anti-S protein monoclonal antibody, an anti-S protein polyclonal antibody, a nucleoside analog, a DNA polymerase inhibitor, or a siRNA agent.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, morbid condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity.
  • the daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be 0.001 to 100 mg/kg.
  • the present invention also relates to a method for preventing or treating a brain disease, which may include administering a pharmaceutical composition comprising the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention or a multispecific antibody using the same.
  • the administration subject may be a subject, specifically a subject requiring an anti-human transferrin receptor antibody or a multispecific antibody using the same, and the subject may be an animal, typically a mammal. there is.
  • amino acid sequence of the variable region (WT and mutant) of the anti-hTfR antibody used in the experiment is as follows. In the sequence below, amino acid numbering is according to Kabat numbering.
  • Anti-human transferrin receptor whole antibody and Fab fragments were expressed in expiCHO-S TM (Thermo Fisher Scientific). Cell culture was performed in a humidified CO 2 incubator using a 125mL Ellenmeyer cell culture flask. To transfect plasmids encoding whole antibodies and Fab fragments, ExpiFectamine TM CHO/plasmid DNA complexes were constructed and used. Cell culture fluid was collected 10 days after transfection, and proteins were purified using Ni-NTA resin (QIEAGEN). SDS PAGE was performed on the purified Fab fragments, and the results are shown in FIG. 4 . In FIG. 4, the left side is the result of the reduced condition, and the right side is the result of the non-reduced condition.
  • Fab fragment crystals of anti-human transferrin receptor antibody were grown at 18°C by sitting drop vapor diffusion method. Initial crystallization was performed with a commercial screening kit, and after securing the initial crystallization conditions, pH and salt concentrations were varied and optimized.
  • Table 1 shows the X-ray diffraction data processing results of anti-human transferrin receptor antibody Fab fragment crystals.
  • the tertiary structure was identified by molecular substitution method.
  • Table 2 shows the tertiary structure refinement parameters of anti-human transferrin receptor antibody Fab fragment crystals.
  • Fig. 5 is a photograph of a Fab fragment crystal of anti-human transferrin receptor antibody
  • Fig. 6 shows the tertiary structure of the anti-human transferrin receptor antibody Fab fragment crystal.
  • (a) shows the overall structure of the Fab
  • (b) shows the structure viewed from above the CDR loop portion.
  • FIG. 7 The modeling results of the Fab fragment of the anti-human transferrin receptor antibody and the human transferrin receptor complex are shown in FIG. 7 .
  • (a) shows the overall structure of the complex
  • (b) shows the structure of the interaction site between the antibody and the receptor.
  • the transferrin receptor (hTfR) binding affinity of the anti-human transferrin receptor antibody (anti-hTfR antibody) was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • Human TfR (2.5 ⁇ g/ml) was coated overnight at 4° C. on a 96-well half area plate (Corning).
  • the antibody was prepared by diluting 5-fold from 50 nM to 0.64 pM.
  • PBS pH 7.5, same as blocking buffer
  • the plate was washed three times with PBS pH 7.5, blocked for 2 hours at room temperature with blocking buffer, and washed several more times.
  • concentrations of anti-TfR antibody were added to the wells and binding was induced for 2 hours. Thereafter, unbound antibodies were washed twice with PBST and washed twice with PBS.
  • HRP horseradish peroxidase
  • FIG. 8 shows the ELISA results of measuring the binding affinity of the anti-transferrin receptor antibody designed in the present invention.
  • the curve marked with a square shape represents the wild type (WT) result
  • the curve marked with an asterisk represents the result of the mutant.
  • (a) to (d) show the results of measuring binding affinity to VH Y27H, VH Y98A, VH Y99H and VL Y94A, respectively.
  • Table 3 shows the results of measuring the binding affinity reduction effect of anti-transferrin receptor antibodies introduced with mutations.
  • each mutant has a lower binding affinity to TfR than that of the wild type, and it is predicted that the binding affinity of VH Y27H is suitable for optimizing the blood-brain barrier passage efficiency.
  • hBMEC human brain primary microvascular endothelial cells
  • a T-75 flask was coated with Attachment Factor TM (Cell systems). Coating was performed by adding 5 ml of Attachment Factor TM pre-warmed at 37° C. to a T-75 flask and removing after 10 seconds. Then, the cells were thawed and grown to 80-90% confluence in a 37°C, 5% CO 2 humidified incubator using complete classic medium supplemented with CultureBoost TM (Cell Systems). Thereafter, washed with pre-warmed PBS, put trypsin-EDTA, and incubated at 37°C for 5 minutes. After 5 minutes, trypsin was inactivated by adding cold complete culture medium.
  • the cell suspension was transferred to a 15ml conical tube and centrifuged at 900 xg, 4°C for 10 minutes. The upper layer of the medium was discarded, and the cells were resuspended in a supplemented culture medium at 37°C.
  • Transwell inserts 24-well, 0.4 ⁇ m filter, SPL were used to form an in vitro BBB model.
  • the insert was coated with Attachment Factor TM in the same way as described above.
  • the obtained hBMEC cells were seeded at 20 x 10 3 cells/well in the upper chamber of the transwell plate, and incubated for 48 hours.
  • HRP-attached control IgG was added to the upper chamber, and after incubation at 37° C. for 2 hours, the upper chamber and the lower chamber culture medium were recovered.
  • the permeated control IgG was quantitatively measured by reacting with the TMB solution.
  • the antibodies contained in the fresh supplemented complete culture medium were placed in the upper chamber in a manner of substituting half of the buffer solution, and then incubated at 37°C. At 2 hours and 4 hours after incubation, the culture medium in the lower chamber was recovered. Blood-brain barrier (BBB) passage efficiency was confirmed by measuring the penetration of the antibody by sandwich ELISA using a plate coated with anti-human IgG antibody.
  • BBB Blood-brain barrier
  • FIG. 9 shows the BBB passage efficiency of anti-transferrin receptor antibodies.
  • passage efficiency of 1.5 ng of the wild-type anti-TfR antibody (gray) and the anti-TfR antibody containing the VH-Y27H mutation (black) can be confirmed.
  • FIG. 9 shows the results of FIG. 9, as a result of comparing the BBB passage efficiency of VH-Y27H among the tyrosine mutants with that of the wild type, it was confirmed that VH-Y27H passed through the BBB cells with a significantly higher efficiency.
  • a bispecific antibody was prepared together with an anti-transferrin receptor antibody.
  • each purified protein After quantification of each purified protein through absorbance at 280 nm, it was mixed in the same molecular ratio. The compound was added to the mixed protein solution so that the final concentration was 0.1 M Arginine pH 9.0, 20 mM Glutathione (reduced) (Sigma-Aldrich). The reaction solution was reacted at 37°C for 3 hours to form a bispecific antibody.
  • Non-reducing SDS-PAGE was performed to confirm that bispecific antibodies were formed from the reacted proteins, and the results are shown in FIG. 10 .
  • lane 1 of the left SDS-PAGE result is PTPsigma-Fc knob
  • lane 2 is the result of anti-TfR(WT)-HC(Fc hole)
  • SDS-PAGE result of the center is anti-TfR (WT):PTPsigma antibody wild-type bispecific antibody results
  • the SDS-PAGE result on the right is the anti-TfR (VH-Y27H):PTPsigma antibody bispecific antibody result, the SDS-PAGE result Through this, it was confirmed that bispecific antibodies were formed.
  • amino acid sequences of the anti-TfR heavy chain (HC)/light chain (LC) and PTPsigma-Fc used to construct the bispecific antibody are as follows.
  • the underlined portion represents the sequence of the variable region
  • the bold portion of HC represents the sequence of the Fc region.
  • the underlined portion is the sequence of the PTPsigma-derived protein, and the bolded portion is the sequence of the Fc region.
  • the PTPsigma(2N) sequence is a sequence including the L155N and L187N mutations introduced to improve the aqueous solubility of the PTPsigma ectodomain Ig1-2.
  • hBMEC human brain primary microvascular endothelial cells
  • Cells were put into a T-75 flask coated with Attachment Factor TM (Cell systems) and cultured at 37°C and 8% carbon dioxide.
  • Attachment Factor TM Cell systems
  • SPL Life Sciences' 24-transwell insert was coated with Attachment Factor TM
  • cells isolated from the T-75 flask were seeded at a concentration of 3 x 10 4 cells/well using trypsin for 5 days cultured.
  • anti-mouse IgG-HRP antibody was placed in the upper layer of the transwell, waited, and then the culture medium in the lower layer was collected, and the collected culture medium was reacted with the TMB solution for 20 minutes to prevent color development. case was used in the experiment.
  • ELISA assay was performed using a 96-well plate. Between each step, the wells were washed 4 times with PBS and PBST solutions, and all antibodies were diluted in PBS containing 5% (w/v) skim milk powder. A tetramethylbenzidine substrate (LABIS KOMA) solution and a sulfuric acid solution were added and absorbance was measured at 450 nm.
  • LABIS KOMA tetramethylbenzidine substrate
  • sulfuric acid solution were added and absorbance was measured at 450 nm.
  • goat anti-human IgG (Sigma-Aldrich) antibody was diluted to a concentration of 2 ⁇ g/mL in a sodium carbonate pH 9.5 buffer solution and coated at 4°C. After coating, the plate was blocked for 2 hours at room temperature using 5% (w/v) skim milk powder.
  • Mouse anti-myc tag 9E10 antibody (Santa Cruz Biotechnology) and anti-mouse IgG-HRP antibody (GWVitek) were sequentially reacted at room temperature for 2 hours to detect samples bound to the coated antibody.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of blood-brain barrier passage assay of bispecific antibodies. According to FIG. 11, it was confirmed that the permeation amount of the anti-TfR(VH-Y27H):PTPsigma antibody was much higher than that of the anti-TfR(WT):PTPsigma antibody. Accordingly, it was confirmed that the anti-human transferrin receptor antibody prepared by introducing a mutation into the variable region of human antibody 128.1 was very excellent in terms of blood-brain barrier crossing efficiency.
  • Neurite outgrowth was measured using the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line.
  • the cells were cultured at 37°C and 8% carbon dioxide in a DMEM medium supplemented with 10% FBS.
  • a DMEM medium supplemented with 10% FBS.
  • cells separated by trypsin were seeded in a 96-well-collagen-coated plate (SPL Life Sciences) at a concentration of 8 x 10 3 cells/well.
  • Cells were treated with 5 ⁇ M retinoic acid (Tokyo Chemical Industry) to induce neurite outgrowth by differentiation, and 1 ⁇ M chondroitin sulfate sodium salt (Sigma-Aldrich) was treated to inhibit it.
  • MT is a protein to which 2N mutations (L155N and L187N) are added to improve aqueous solubility of PTPsigma ectodomain Ig1-2
  • WT represents wild-type PTPsigma ectodomain Ig1-2.
  • the wild-type PTPsigma ectodomain Ig1-2 protein it cannot be treated at concentrations higher than 100 nM, whereas the 2N mutants (L155N and L187N) have improved solubility and can be treated at high concentrations, further inhibiting neurite outgrowth by CS. It was confirmed that it could be blocked effectively.
  • the bispecific antibody prepared by combining the PTPsigma mutant protein with the anti-human transferrin receptor antibody of the present invention has excellent brain damage treatment efficiency and blood-brain barrier permeability, so it is expected that it can be used very effectively as a brain damage treatment agent. do.

Abstract

본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 설계된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 친화도가 조절되어 우수한 뇌혈관장벽 통과 효율을 나타낸다. 이에 따라, 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 다중특이적 항체나 항체-약물 접합체에 이용하는 경우 뇌질환 치료용 단백질이나 약물 화합물을 뇌 조직에 효율적으로 전달할 수 있다.

Description

뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물
본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용한 다중특이적 항체 및 약학 조성물에 관한 것으로, 인간 트랜스페린 수용체와의 결합 친화도가 조절되어 뇌혈관장벽의 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체, 및 이를 이용하여 뇌질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있는 다중특이적 항체 및 약학 조성물에 관한 것이다.
뇌혈관장벽(blood-brain-barrier, BBB)은 뇌와 혈관 사이에 존재하는 장벽으로서, 뇌에 필요한 영양소나 대사물질만을 선택적으로 투과시켜 병원체나 잠재적인 위험 물질로부터 중추신경계의 조절기능을 보호하는 중요한 역할을 한다. 그런데 이러한 뇌혈관장벽의 선택적 투과성으로 인해 뇌질환 치료제의 유입까지 차단되기 때문에, 많은 뇌질환 치료제가 표적 세포까지 전달되지 못하여 임상에서 효과를 보이기 어렵다는 문제가 있다.
관련하여, 면역글로불린(IgG)을 주입하였을 때 매우 낮은 비율(약 0.1%)만이 중추 신경계(CNS) 구획 내로 투과할 수 있을 것이라는 연구 내용이 발표된 바 있다(Felgenhauer, Klinische Wochenschrift 52, 1158-1164 (1974) 참조). 또한, 저분자 치료제의 경우에도 지질 용해도가 높고 분자량이 매우 작은 일부 약제만이 뇌혈관장벽을 통과할 수 있는 것으로 보고되고 있다. 이와 같이 뇌혈관장벽에 의해 치료제 물질의 효과가 제한되는바, 뇌질환 치료제 개발에 있어서 뇌혈관장벽의 통과 효율을 향상시키는 것이 매우 중요하며, 이를 위해 다양한 전략이 시도되어 왔다.
저분자 치료제의 경우, 소수성 성질을 갖도록 변형시키는 등 뇌혈관장벽 투과도를 향상시킬 수 있는 유도체를 설계하는 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 대한민국 공개특허공보 제10-2019-0045101호에서는 칼슘의존성 클로라이드 채널 차단제 T16Ainh-A01를 구조변형시킨 아미노페닐티아졸 유도체를 설계하여 치료 효율 및 뇌혈관장벽 투과율을 향상시킨 기술을 개시하고 있다.
한편, 알츠하이머성 치매, 파킨슨병 등의 뇌질환은 일반적인 지질 용해성 저분자 치료제가 효과를 나타내기 어렵기 때문에 단백질이나 항체 치료제의 개발이 이루어지고 있다. 그런데 단백질이나 항체 치료제는 뇌혈관장벽의 세포막을 직접 통과하는 것이 불가능하므로, 뇌혈관장벽을 이루는 세포에 존재하는 내인성 수용체를 통한 트랜스사이토시스(transcytosis, 세포통과) 경로를 이용하는 방법이 시도되었다. 뇌혈관장벽에 존재하는 내인성 수용체에 결합하는 항체는 수용체와 함께 엔도사이토시스(endocytosis, 세포내이입)되어 세포 내로 들어갔다가, 반대쪽으로 엑소사이토시스(exocytosis, 세포외배출)됨으로써 뇌혈관장벽을 횡단할 수 있다. 이 때, 항체에 치료용 단백질이나 치료용 항체의 항원결합 영역을 부착하면, 이와 같은 치료용 물질이 뇌 안으로 들어가도록 설계할 수 있다.
본 발명에서는 상기 내인성 수용체를 통한 트랜스사이토시스 전략의 일환으로, 항 트랜스페린 수용체 항체(anti-transferrin receptor(TfR) antibody)를 이용하는 전략을 제안한다. 항 트랜스페린 수용체 항체는 뇌혈관장벽에 다량 존재하는 트랜스페린 수용체에 결합하는 항체로서 수용체에 단단히 결합하여 엔도사이토시스는 잘 일어나는 반면, 엑소사이토시스가 일어날 때 수용체로부터 잘 떨어지지 않는 특징이 있다. 이로 인해 항 트랜스페린 수용체 항체가 뇌 안으로 들어가지 못하고 뇌혈관장벽 세포에 붙어 있게 되어 치료제 물질의 전달 효율이 떨어지는 문제가 발생한다.
이러한 상황에서, 본 발명의 발명자들은 트랜스페린 수용체와의 결합 친화도가 조절되어 뇌혈관장벽의 통과 효율이 우수한 항 트랜스페린 수용체 항체를 설계함으로써, 상술한 종래 기술의 한계를 극복하고자 하였다.
본 발명의 목적은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-hTfR 항체)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 이용하여 제작된 다중특이적 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 다중특이적 항체를 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 제공한다.
본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변영역(VH) 및 서열번호 2의 경쇄 가변영역(VL)을 포함하며, 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에서 티로신(Y) 중 하나 이상이 알라닌(A) 또는 히스티딘(H)으로 치환된 것이다.
본 발명에서, 상기 티로신은, Kabat 넘버링에 따른 서열번호 1의 Y27, Y98, Y99, 및 서열번호 2의 Y94로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서, 상기 치환은 Kabat 넘버링에 따른 서열번호 1의 Y27H, Y98A, Y99H, 및 서열번호 2의 Y94A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체에 하나 이상의 약물 화합물이 접합될 수 있다.
본 발명의 항체는 인간화 항체일 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 이용한 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에서, 상기 다중특이적 항체는 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)와 결합하는 하나 이상의 제1 결합 도메인 및 표적 분자와 결합하는 하나 이상의 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체로서, 상기 제1 결합 도메인이 서열번호 1의 중쇄 가변영역(VH) 및 서열번호 2의 경쇄 가변영역(VL)을 포함하며, 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에서 티로신(Y) 중 하나 이상이 알라닌(A) 또는 히스티딘(H)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제2 결합 도메인의 표적 분자는 콘드로이친 황산염(chondroitin sulfate), 베타 세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 감마 세크레타제(Gamma-secretase), 아밀로이드 베타(amyloid beta, Abeta), 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 타우(tau), 아포지단백질 E4(apolipoprotein E4, ApoE4), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), CD20, 헌팅틴 단백질(Huntingtin protein), 프리온 단백질(prion protein, PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2(leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), p75 뉴트로핀 수용체(p75 neurotrophin receptor, p75NTR), 카스파제 6(caspase 6) 또는 글루코세레브로시다아제(Glucocerebrosidase)일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제2 결합 도메인은 PTPsigma(Protein Tyrosine Phosphatase sigma) 유래의 단백질을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 PTPsigma 유래 단백질은 PTPsigma 단백질의 30 내지 231번 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 PTPsigma 유래 단백질에서 류신(L) 중 하나 이상이 아스파라진(N)으로 치환된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인은 Fab, scFv, di-scFv, dsFv 및 (dsFv)2로 구성된 군에서 선택되는 형태일 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 Fc 영역에 연결되어 다중특이적 항체를 구성할 수 있다.
본 발명에서, 상기 다중특이적 항체에 하나 이상의 약물 화합물이 접합될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 다중특이적 항체를 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury), 뇌졸중(Stroke), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수손상(spinal cord injury), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff's syndrome)으로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한, 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이를 이용한 다중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 설계된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-hTfR 항체)는 뇌혈관장벽의 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)에 결합하여 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포막에 이입 가능하면서, hTfR과의 조절된 결합 친화도로 인해 엑소사이토시스(exocytosis)가 용이하다. 이에 따라 본 발명의 anti-hTfR 항체는 뇌혈관장벽 세포에 대한 트랜스사이토시스(transcytosis) 효율이 우수하여 뇌혈관장벽 세포에 잔류하지 않고 뇌 안으로 들어갈 수 있다.
따라서, 본 발명의 anti-hTfR 항체는 다중특이적 항체, 약물-항체 접합체 등에 적용되어 치료용 단백질이나 약물 화합물을 뇌에 효율적으로 전달할 수 있다. 또한, 다중특이적 항체의 치료용 단백질로서 수용액 용해도가 우수한 단백질을 결합하면 고용량 투여가 가능하므로, 뇌질환 치료제로서의 효과를 더욱 향상시킬 수 있다.
도 1은 항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-hTfR 항체)와 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)의 복합체 구조 및 상호작용에 중요한 티로신 잔기를 나타낸다.
도 2는 항체 128.1의 중쇄 가변영역(VH)의 카밧(Kabat) 넘버링을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시 형태에 따른 다중특이적 항체의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-hTfR 항체의 Fab 절편에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-hTfR 항체의 Fab 절편의 결정을 나타낸다.
도 6은 anti-hTfR 항체의 Fab 절편에 대한 결정의 삼차 구조를 나타낸다.
도 7은 anti-hTfR 항체와 hTfR의 복합체 모델링 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-hTfR 항체의 hTfR에 대한 결합친화도 측정 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-hTfR 항체의 VH-Y27H 돌연변이체의 뇌혈관장벽 통과 효율 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-hTfR:PTPsigma 이중특이적 항체에 대한 SDS PAGE 결과를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른 anti-hTfR:PTPsigma 이중특이적 항체에 대한 뇌혈관장벽 통과 효율 측정 결과를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 PTPsigma 단백질의 신경돌기 성장 어세이 결과를 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 뇌혈관장벽 통과 효율이 개선된 항 트랜스페린 수용체 항체에 관한 것이다.
항 트랜스페린 수용체 항체(anti-TfR antibody)란 트랜스페린 수용체(TfR)에 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명에서, 항 트랜스페린 수용체 항체는 인간 트랜스페린 수용체(human TfR, hTfR)와 결합했을 때 엔도사이토시스(endocytosis)가 일어나는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-hTfR antibody)일 수 있고, 구체적으로는 인간항체 128.1의 가변영역에 돌연변이가 형성된 것일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항체"란 면역학적으로 특정 항원(들)과 반응성을 갖는 면역글로불린(immunoglobulin, Ig) 유래의 분자를 포함하며, 상기 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4와 같은 IgG, IgA, IgE, IgD 또는 IgM일 수 있다. 또한, 상기 용어 "항체"는 다클론항체 및 단일클론항체를 모두 포함하며, 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이종결합항체(예를 들면, 이중특이적 항체)와 같은 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함하는 의미이다.
본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 가변영역을 포함하는 항체 단백질로, 그 형태는 목적에 따라 변경하여 제작할 수 있다. 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 Fab 및 Fc 영역을 모두 갖는 전체 항체(whole antibody), 항체 단편 및 이들의 재조합 항체일 수 있다. 예를 들어, 상기 항체 단편 및 재조합 항체는 Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv)2 등의 형태, 또는 이들을 Fc 영역과 연결한 형태일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "돌연변이"는 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함하는 의미로, 바람직하게, 본 발명에서 돌연변이는 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 아미노산 잔기의 치환은 모체가 되는 야생형 단백질에 존재하는 아미노산 잔기, 아미노산 잔기의 번호 및 치환된 아미노산 잔기의 순서로 나타낸다.
본 발명에서는 인간 트랜스페린 수용체와 결합하여 엔도사이토시스가 일어나는 것으로 보고된 인간항체 128.1의 항원결합 영역의 삼차구조를 X-선 결정학적으로 규명하고, 수용체와의 복합체 구조의 모델링에 근거하여 단백질-단백질 상호작용에 중요한 티로신 잔기들을 발견하였으며, 특히 돌연변이 되었을 때 항체 구조에 영향을 미치지 않는 티로신 잔기를 구조적으로 예측하였다. 이에 근거하여 특정 티로신 잔기들을 돌연변이한 결과, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체와 트랜스페린 수용체의 상호작용이 감소하고 뇌혈관장벽 세포의 트랜스사이토시스(transcytosis)에 있어서 야생형의 항체보다 월등히 향상된 것을 확인함으로써, 결합친화도가 조절된 anti-hTfR 항체를 개발하였다.
본 발명의 anti-hTfR 항체는 뇌혈관장벽을 효과적으로 통과할 수 있으며, 신경세포 성장을 촉진하는 단백질과 함께 다중특이적 항체 형태로 제작하면 뇌 전달 효과가 향상된 뇌질환 치료제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는, 인간항체 128.1의 중쇄 가변영역(VH) 및/또는 경쇄 가변영역(VL)에서 티로신(Y) 중 하나 이상이 다른 아미노산으로 치환된 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 상기 인간항체 128.1의 가변영역의 아미노산 서열에서 번호 지정은 카밧(Kabat) 넘버링에 따른다.
상기 인간항체 128.1의 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)의 야생형(WT) 서열은 각각 아래 서열번호 1 및 2로 나타낼 수 있다.
[서열번호 1] 128.1 VH WT
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 2] 128.1 VL WT
GQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRNSYPWTFGGGTRLEIR
본 발명에 따른 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 서열번호 1의 중쇄 가변영역 및 서열번호 2의 경쇄 가변영역을 포함하며, 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에서 티로신(Y) 중 하나 이상이 알라닌(A) 또는 히스티딘(H)으로 치환된 구조를 가질 수 있다.
도 1은 항 인간 트랜스페린 수용체 항체와 인간 트랜스페린 수용체의 복합 구조 및 상호작용에 중요한 티로신 잔기를 나타낸 것이다. 도 1에 표시한 바와 같이, 본 발명에서 치환 대상이 되는 티로신은 서열번호 1의 Y27, Y98 및 Y99, 및 서열번호 2의 Y94 중 하나 이상일 수 있다. 도 2는 인간항체 128.1의 중쇄 가변영역(VH)의 카밧(Kabat) 넘버링을 나타낸 것으로, 이를 참조하면 서열번호 1의 중쇄 가변영역에서 상기 번호에 해당하는 티로신의 위치를 확인할 수 있다.
바람직하게, 상기 티로신은 히스티딘(H) 또는 알라닌(A)으로 치환될 수 있으며, 상기 치환은 서열번호 1의 Y27H, Y98A, Y99H, 및 서열번호 2의 Y94A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 인간화 항체(humanized antibody)일 수 있다. 즉, 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 비인간 동물 유래의 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)의 전부 또는 일부 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 돌연변이를 통해 항체와 수용체의 결합 친화도를 조정하여, 뇌혈관장벽 통과 효율이 향상된 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 제공할 수 있다. 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체는 다중특이적 항체 또는 항체-약물 접합체에 사용되어, 뇌혈관장벽 통과 효율의 향상이 필요한 뇌질환 치료제에 유용하게 이용될 수 있다.
이에 따라, 본 발명은 또한, 상기 항 인간 트랜스페린 수용체 항체를 이용한 다중특이적 항체를 제공한다.
본 발명에서, 용어 "다중특이적 항체(multispecific antibody)"란 서로 다른 2종 이상의 항원 또는 수용체에 결합할 수 있는 항체, 예를 들어 이중특이적 항체(bispecific antibody), 삼중특이적 항체(trispecific antibody) 등을 포함하는 의미로서, 유전공학에 의해 생산된 형태를 포함한다.
본 발명에서, 상기 다중특이적 항체는 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)와 결합하는 하나 이상의 제1 결합 도메인 및 표적 분자와 결합하는 하나 이상의 제2 결합 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 다중특이적 항체는 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인과 상이한 1종 이상의 결합 도메인(다중 결합 도메인)을 더 포함하는 것도 가능하다. 이 경우, 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인의 표적 외에 다른 표적 분자에도 결합하여 다양한 치료 전략을 제안할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "결합 도메인"은 항체 유래 단백질, 생체 유래 단백질 및 인공 설계된 상호작용 단백질을 모두 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, 상기 제2 결합 도메인 및 다중 결합 도메인은, 각각 독립적으로, 항체 유래 단백질 외에 생체 유래 단백질 또는 인공 설계된 상호작용 단백질을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 다중특이적 항체는 인간 트랜스페린 수용체와 결합하는 제1 결합 도메인, 표적 분자에 결합하는 제2 결합 도메인 및 Fc 영역을 포함할 수 있으며, 이 경우 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 Fc 영역에 연결된 구조를 가질 수 있다. 또는, Fc 영역 유래 단백질이 아닌 링커를 이용하여 다중특이성을 갖도록 제작한 융합단백질도 본 발명의 다중특이적 항체의 범주에 포함될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 다중특이적 항체는 한쪽 팔(제1 결합 도메인)에 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 가변영역 서열이 존재하고, 다른 한쪽 팔(제2 결합 도메인)에는 뇌질환 치료를 위한 표적 분자에 결합할 수 있는 치료용 단백질을 포함할 수 있다. 이로써, 본 발명의 다중특이적 항체는 제1 결합 도메인을 통해 인간 트랜스페린 수용체와 결합되고 트랜스사이토시스를 통해 뇌혈관장벽을 용이하게 통과하여, 제2 결합 도메인의 치료용 단백질을 뇌 조직에 효과적으로 전달할 수 있다.
본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인은 중쇄 가변영역(VH) 및 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 영역으로, 그 형태는 목적에 따라 변경하여 제작할 수 있다. 본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인은 VH-CH1 및 VL-CL을 포함하는 Fab 형태, 이의 단편 및 재조합 형태일 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 결합 도메인은 Fab, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv)2 등의 형태일 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항체에서, 상기 제1 결합 도메인의 중쇄 가변영역(VH)은 서열번호 1을 포함하고, 경쇄 가변영역(VL)은 서열번호 2를 포함하되, 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에서 티로신(Y) 중 하나 이상이 알라닌(A) 또는 히스티딘(H)으로 치환된 것을 특징으로 한다. 이에 따라, 제1 결합 도메인이 인간 트랜스페린 수용체를 통해 트랜스사이토시스를 효과적으로 유도하여 다중특이적 항체를 뇌 안으로 수송할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항체에서, 상기 제2 결합 도메인은 표적 분자와 결합하는 단백질, 예를 들어 표적 분자에 결합하는 항체의 항원결합 영역, 또는 치료용 단백질을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 표적 분자와 결합되어 신경세포 성장을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 제2 결합 도메인에서, 표적 분자에 결합하는 항체의 항원결합 영역은 항원(표적 분자)의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 항원의 일부 또는 전부에 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부를 의미할 수 있다. 상기 항원결합 영역의 형태는 특별히 제한되지 않으며, Fab 형태 뿐만 아니라 sdAb, scFv, di-scFv, dsFv, (dsFv)2 등의 형태일 수 있다.
Fab 형태는 중쇄의 가변영역(VH) 및 불변영역(CH)의 CH1 도메인, 및 경쇄의 가변영역(VL) 및 불변영역(CL)을 포함하고, 상기 CH1 및 CL 사이에 이황화결합이 형성된 형태이다. 또한, sdAb 형태는 단일 도메인 가변 단편(single-domain variable fragment)을 의미하며, 하나의 가변영역 도메인을 의미한다.
한편, scFv 형태는 가변영역이 이어진 형태의 단쇄 가변 단편(single-chain variable fragment)을 의미하는 것으로, VH 및 VL 영역을 펩타이드 링커(linker)로 연결한 재조합 도메인을 의미한다. 또한, di-scFv 형태는 두개의 scFv가 링커로 연결된 재조합 도메인을 의미한다. 상기 링커는 당해 기술 분야에 알려진 링커를 적절하게 사용할 수 있으며, 5 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 바람직하게, 상기 링커는 G, A, S, P, E, T, D 및 K로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 링커는 (GGGGX)n일 수 있으며, X는 A 또는 S인 것이 바람직하고, n은 1 내지 4의 자연수인 것이 바람직하다.
또한, dsFv 형태는 이황화-결합 가변 단편(disulfide-linked variable fragment)으로서 가변영역이 이어진 형태라는 점에서 scFv와 유사하나, VH 및 VL 영역을 링커가 아닌 이황화결합으로 연결한 재조합 도메인을 의미한다. (dsFv)2 형태는 두 개의 dsFv가 링커로 연결된 재조합 도메인을 의미한다.
상기 제2 결합 도메인의 표적 분자는 콘드로이친 황산염(chondroitin sulfate), 베타 세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 감마 세크레타제(Gamma-secretase), 아밀로이드 베타(amyloid beta, Abeta), 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 타우(tau), 아포지단백질 E4(apolipoprotein E4, ApoE4), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), CD20, 헌팅틴 단백질(Huntingtin protein), 프리온 단백질(prion protein, PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2(leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), p75 뉴트로핀 수용체(p75 neurotrophin receptor, p75NTR), 카스파제 6(caspase 6), 글루코세레브로시다아제(Glucocerebrosidase) 등일 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 제2 결합 도메인은 신경세포 성장을 촉진하는 단백질로서 PTPsigma (Protein Tyrosine Phosphatase sigma) 유래의 단백질을 포함할 수 있다.
PTPsigma는 세포막을 관통하는 수용체형(transmembrane receptor type) PTP로서, 세포외도메인(엑토도메인, ectodomain) 부위, 세포막 통과 부위 및 세포질 부위의 세 부위로 이루어져 있다. 이 중, 세포외도메인은 N-말단(N-terminal)에서 시작하여 3개의 Ig 유사(Ig-like) 도메인과 뒤이은 여러 개의 피브로넥틴 도메인으로 이루어져 있다. 세포외도메인 부위는 수용체-리간드 상호작용을 하고, 이러한 상호작용이 세포질 부위로 전달되어서 PTP 활성 도메인의 효소활성을 조절한다.
본 발명에서, 상기 PTPsigma 유래 단백질은 PTPsigma의 세포외도메인(ectodomain) 유래의 단백질일 수 있다. 이 때, PTPsigma의 세포외도메인 유래의 단백질이란 PTPsigma의 세포외도메인 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것을 의미한다.
특히, 본 발명에서 PTPsigma의 세포외도메인 유래의 단백질은 세포외도메인의 Ig 유사(Ig-like) 도메인 유래의 단백질인 것이 바람직하고, 그 중 첫째-둘째 Ig 유사 도메인(Ig1-2), 또는 첫째-셋째 Ig 유사 도메인(Ig1-3) 유래의 단백질인 것이 더 바람직하다.
PTPsigma는 뇌신경에서 콘드로이친 황산염과 결합하여 신호전달을 일으키고, 이러한 신호전달이 일어나면 뇌신경세포의 신경돌기 성장 및 신경 세포 재생이 저해되므로, 알츠하이머성 치매, 사고성 뇌손상, 파킨슨병 등 뇌질환 환자의 뇌손상 회복을 방해한다. 본 발명을 이용하면 PTPsigma의 세포외도메인을 뇌로 수송하여 콘드로이친 황산염과 결합시킴으로써 PTPsigma의 신호전달을 차단할 수 있으므로, 뇌질환 치료제로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 상기 PTPsigma 유래 단백질은 PTPsigma 세포외도메인의 Ig1-2 유래의 아미노산 서열로서, PTPsigma 단백질의 30 내지 231번 서열을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상기 PTPsigma 유래 단백질은 아래 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
[서열번호 3] PTPsigma 30-231
EEPPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLREDQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA
본 발명에서, 상기 PTPsigma 유래 단백질에는 다중특이적 항체의 수용액 용해도를 향상시키기 위한 PTPsigma 변이체(mutant)가 형성될 수 있다.
본 발명과 같이 Ig 유사 도메인을 포함하는 단백질은 수용액 용해도가 높지 않아 동물이나 인체에 고용량으로 처리하는데 어려움이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 PTPsigma의 Ig 유사 도메인 표면에 노출되어 있는 소수성 아미노산 중에서 구조를 변형시키지 않는 아미노산들을 선정하고, 이들을 친수성 아미노산으로 치환하여 용해도를 향상시켰다.
구체적으로, 용해도 향상을 위한 PTPsigma 변이체는 상기 PTPsigma 유래의 단백질에서 이소류신(I), 발린(V), 류신(L) 및 타이로신(Y) 중 하나 이상의 잔기가 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T), 아스파라진(N), 글루타민(Q), 아스파르트산(D), 글루탐산(E), 리신(K), 아르기닌(R) 또는 히스티딘(H)으로 치환된 것일 수 있으며, 바람직하게, 류신(L) 중 하나 이상이 아스파라진(N)으로 치환된 것일 수 있다.
그 중에서도, PTPsigma의 구조에 영향을 주지 않는 측면에서 PTPsigma의 30 내지 231번 서열 중 I36, V104, V108, L125, L143, L145, L155, L187, Y224 및 V227 중 하나 이상의 잔기가 A, S, T, N, Q, D, E, K, R 또는 H로 치환되는 것이 바람직하며, 용해도 향상 측면에서 L143, L155, L187, Y224 및 V227 중 하나 이상의 잔기가 A 또는 N으로 치환되는 것이 더 바람직하다. 상기 돌연변이에 의해, 다중특이적 항체의 수용액 용해도가 향상되어 인체 및 동물 치료 시 고용량 처리가 가능하므로, 치료 효과를 더욱 상승시킬 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서, 상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인은 Fc 영역의 각 사슬에 연결된 형태를 가질 수 있다.
본 발명에서, 용어 "Fc 영역"은 면역글로불린의 중쇄불변영역 중 CH2 및 CH3 도메인(또는, CH2, CH3 및 CH4 도메인)을 포함하는 C-말단 영역을 의미하며, 야생형(wild-type) Fc 영역 및 그의 변이체를 포괄하는 의미로 사용된다. 상기 Fc 영역의 모체가 되는 면역글로불린은 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4일 수 있으며, 바람직하게는 IgG1일 수 있다.
본 발명에서, 상기 Fc 영역은 인간 IgG1 중쇄의 221번 잔기로부터 C-말단에 이르는 영역, 또는 상기 영역에 힌지를 더 포함하는 영역을 의미할 수 있다. Fc 영역에서 아미노산 잔기의 번호는 인간 면역글로불린 중쇄 내의 잔기 번호를 정의하는 EU 넘버링에 따른다.
본 발명에서, 용어 "야생형 Fc 영역"은 자연에서 발견되는 면역글로불린의 Fc 영역의 아미노산 서열과 일치하는 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서, 용어 "Fc 영역의 변이체"는 야생형 Fc 영역과 상이한 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로서, "Fc 변이체"로 약칭할 수 있다. 본 발명에서, 상기 Fc 변이체는 모체가 되는 야생형 Fc 영역 서열과 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 Fc 영역의 각 사슬은 IgG1의 중쇄 221 내지 447번 서열을 포함할 수 있다. 상기 IgG1의 중쇄 221 내지 447번 서열은 아래 서열번호 4의 아미노산 서열로 나타낼 수 있다.
[서열번호 4] IgG1 221-447
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
본 발명에서, 각 결합 도메인 및 Fc 영역은 0 내지 20개의 아미노산 잔기에 의해 연결될 수 있다. 즉, 상기 결합 도메인과 Fc 영역은 직접적으로 연결되거나, 1 내지 20개의 아미노산으로 이루어진 링커(linker)를 통해 연결된 형태일 수 있다. 이 때, 각 결합 도메인은 Fc 영역의 N-말단, C-말단 또는 그 사이에 위치하는 아미노산에 연결될 수 있고, 바람직하게, N-말단에 연결될 수 있다.
예시적으로, Fc 영역의 이합체(이량체, dimer)의 두 N-말단 및 두 C-말단을 포함하는 4개의 결합 가능한 부위 중 1 내지 3부위에 제1 결합 도메인이 연결될 수 있고, 나머지 부위 중 하나 이상의 부위에 제2 결합 도메인이 연결될 수 있다. 또는, 제1 결합 도메인이 링커를 통해 제2 결합 도메인과 함께 연결된 다양한 오리엔테이션을 갖는 융합단백질을 제작하여 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에서, Fc 영역에는 다중특이적 항체를 형성하기 위한 재조합 변이체가 형성될 수 있다.
예를 들어, 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인을 Fc 영역 이합체의 두 사슬에 각각 부착하는 경우, 재조합 변이체를 도입하여 이합체를 형성할 수 있다. 상기 이합체를 형성하기 위한 재조합 변이체로는 놉-인투-홀(knob-into-hole) 기술을 이용할 수 있다.
상기 놉-인투-홀 기술은 항체 단편의 중쇄 사이에 이종이합체 만이 형성되게 하기 위하여 설계된 기술이다. 여기에서, 놉(knob)은 반대측 사슬로 돌출된 측쇄를 가지도록 설계되어, 반대측 도메인의 홀(hole)에 삽입된다. 이로 인하여, 중쇄들은 측쇄 충돌로 인하여 동종이합체화(homodimerization) 될 수 없고, 이종이합체화(heterodimerization) 만이 가능하게 된다. 본 발명에서, Fc 영역을 구성하는 두개의 사슬 중 하나는 놉(knob) 구조를 갖고, 다른 하나는 홀(hole) 구조를 가질 수 있으며, 이 때 놉 또는 홀이 형성된 사슬을 각각 Fc-knob 또는 Fc-hole이라 지칭한다.
상기 Fc-knob은 Fc 영역을 구성하는 사슬에서 하나 이상의 아미노산을 트립토판(W), 아르기닌(R), 페닐알라닌(F) 및 티로신(Y)으로 구성된 군에서 선택되는 큰 아미노산으로 치환함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, Fc-knob은 IgG1-Fc 중쇄 221 내지 447번 서열에 T366W 변이가 형성된 것일 수 있다.
상기 Fc-hole은 Fc 영역을 구성하는 사슬에서 하나 이상의 아미노산을 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T) 및 발린(V)으로 구성된 군에서 선택되는 작은 아미노산으로 치환함으로써 형성될 수 있다. 예를 들어, Fc-hole은 IgG1-Fc 중쇄 221 내지 447번 서열에 T366S, L368A 및 Y407V 변이가 형성된 것일 수 있다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시 형태에 따른 다중특이적 항체의 구조를 개략적으로 나타낸 것으로, 본 발명의 다중특이적 항체는 Fab 형태의 제1 결합 도메인이 Fc-hole에 연결되고, 표적 분자에 결합하는 치료용 단백질을 포함하는 제2 결합 도메인이 Fc-knob에 연결된 구조를 가질 수 있다.
본 발명의 일 실시 형태에서, 제1 결합 도메인과 제2 결합 도메인을 각 Fc 사슬의 N-말단 및 C-말단(또는 그 반대)에 부착할 경우, Fc 동종이합체(homodimer)를 이용하여 다중특이적 항체를 제조하는 것이 가능하다. 이 경우 Fc 동종이합체 다중특이적 항체라 명명할 수 있다.
본 발명의 다중특이적 항체는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체에 결합하는 도메인을 통해 뇌혈관장벽을 용이하게 통과할 수 있고, 이로써 표적 분자와 결합하여 치료 효과를 발휘하는 도메인이 뇌에 효과적으로 전달되어 우수한 뇌질환 치료 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 다중특이적 항체에는 약물 화합물이 접합되어, 항체-약물 결합체(antibody drug conjugate, ADC)를 형성할 수 있다.
상기 항체-약물 결합체는 인간 트랜스페린 수용체를 통한 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 트랜스사이토시스(transcytosis)를 이용하여 저분자 약물 화합물을 뇌 조직으로 전달하기 위한 것으로, 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이를 이용한 다중특이적 항체에 약물 화합물을 부착하면 뇌혈관장벽을 통과하기 어려운 약물의 전달 효율을 향상시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 약물은 항체 각 사슬의 C-말단 및/또는 N-말단 뿐 아니라 사슬 내의 아미노산 중 하나 이상의 잔기에 연결될 수 있다. 상기 약물은 적절한 링커(linker)를 이용하여 접합될 수 있다. 상기 약물로는 당해 기술 분야에 공지된 약물 화합물, 성장 억제제, 독소, 방사성 동위원소, miRNA, siRNA, shRNA 등을 이용할 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이를 이용한 다중특이적 항체를 포함하는, 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 뇌질환 치료용일 수 있으며, 상기 뇌질환은 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury), 뇌졸중(Stroke), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수손상(spinal cord injury), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff's syndrome)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 일 실시 형태에 따라 신경세포 성장을 촉진하는 단백질과 융합하여 제조된 다중특이적 항체를 이용하는 경우, 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury)과 같은 뇌질환의 예방 또는 질환에 효과적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 항체 외에 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은, 통상의 방법에 따라 멸균 주사용액, 동결건조(lyophilized) 제형, 사전 충전식 주사(pre-filled syringe) 용액제, 경구형 제형, 외용제 또는 좌제 등의 형태로 제형화될 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 추가로 적어도 하나의 다른 치료제 또는 진단제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 인터페론, 항-S 단백질 단일클론 항체, 항-S 단백질 폴리클로날 항체, 뉴클레오시드 유사체, DNA 폴리머라제 저해제 또는 siRNA 제제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001 내지 100㎎/㎏일 수 있다.
본 발명은 또한, 뇌질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이를 이용한 다중특이적 항체를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에서, 투여 대상은 개체(subject), 구체적으로는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 또는 이를 이용한 다중특이적 항체를 필요로 하는 개체일 수 있으며, 상기 개체는 동물일 수 있고, 통상적으로 포유동물일 수 있다.
실시예
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
제조예 1: 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 제조
유전자클로닝:
항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-hTfR 항체) 128.1의 중쇄(heavy chain, CH)와 경쇄(light chain, CL)를 코딩하는 유전자는 Twist Bioscience에서 합성되었다. 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region)을 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 증폭하였다. 중쇄에 human IgG CH3-Fc region과 His-tag을 갖고 있고 경쇄에 human kappa chain CL을 갖고 있는 pcDNA 3.1 / myc-His A 플라스미드 벡터 (Invitrogen)에 상기 가변영역을 삽입하였다.
실험에 사용한 anti-hTfR 항체의 가변영역(WT 및 돌연변이체)의 아미노산 서열은 아래와 같다. 하기 서열에서, 아미노산 번호 지정은 Kabat 넘버링에 따른다.
[서열번호 1] 128.1 VH WT 서열
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 2] 128.1 VL WT 서열
GQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRNSYPWTFGGGTRLEIR
[서열번호 5] 128.1 VH Y27H 서열
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASG H SFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 6] 128.1 VH Y98A 서열
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYY A YSLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 7] 128.1 VH Y99H 서열
EVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYY H SLDYWGQGTSVTVSS
[서열번호 8] 128.1 VL Y94A 서열
GQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRNS A PWTFGGGTRLEIR
단백질 정제:
항 인간 트랜스페린 수용체 전체 항체(whole antibody) 및 Fab 조각을 expiCHO-STM (Thermo Fisher Scientific)에서 발현시켰다. 세포 배양은 125mL 엘렌마이어 세포배양 플라스크를 이용하여 가습 이산화탄소 인큐베이터(humidified CO2 incubator)에서 수행하였다. 전체 항체 및 Fab 조각을 코딩하는 플라스미드를 트랜스펙션하기 위하여, ExpiFectamineTM CHO/plasmid DNA complexes를 제작하여 사용하였다. 트랜스펙션하고 10일 후에 세포배양액을 수집한 다음 Ni-NTA resin (QIEAGEN)을 사용하여 단백질을 정제하였다. 정제된 Fab 조각에 대해 SDS PAGE를 수행하고, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서, 왼쪽은 reduced 조건의 결과이며, 오른쪽은 non-reduced 조건의 결과이다.
실험예 1: anti-hTfR 항체의 결정화, 구조 규명 및 모델링
결정화 및 구조규명:
항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 Fab 조각 결정을 sitting drop vapor diffusion 방법으로 18℃에서 성장시켰다. 초기 결정화(Initial crystallization)는 스크리닝 키트 제품(commercial screening kit)으로 수행하였고 초기 결정화 조건을 확보한 후 pH 와 salt 농도를 변화시켜서 최적화하였다.
그 결과, 0.25M ammonium sulfate, 0.1M sodium acetate pH 4.5, 31% PEG 4000을 포함하고 있는 저장액(reservoir solution)에서 최적의 결정(best crystal)을 수득하였다. 10% 에틸렌글리콜을 포함하는 용액으로 동결보호(cryoprotection)된 결정을 사용하여 X-선 회절 데이터 측정을 수행하였다.
X-선 회절 실험은 포항가속기 빔라인 11C에서 수행되었고 2.7Å 해상도로 회절하였다. 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 Fab 조각 결정의 X-선 회절 데이터 처리 결과를 표 1에 나타내었다.
데이터 수집 항목 결과
공간군(space group) P212121
셀 파라미터 a, b, c (Å) 65.08, 110.76, 197.95
α, β, γ (°) 90.00, 119.15, 90.00
측정된 리플렉션 수 142786 (7967)
고유 리플렉션 수 35521 (2939)
해상도 범위 (Å) 49.49 - 2.75 (2.84 - 2.75)
R-merge 9.75 (26.20)
I/σ 11.03 (3.22)
CC1/2 0.99 (0.815)
완성도(completeness, %) 92.92 (77.90)
중복도(redundancy) 4.00 (2.70)
삼차구조는 분자치환법으로 규명하였다. 표 2는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 Fab 조각 결정의 삼차구조 정밀화 결과 항목(refinement parameter)을 나타낸 것이다.
정밀화 결과 항목 결과
수소를 제외한 원자의 개수 6846
구분 단백질 6585
비(非)단백질 261
단백질 잔기 860
R-work / R-free (%) 18.79 / 23.88 (26.64 / 35.70)
평균 B-factor 33.43
RMS 길이 (Å) 0.01
각도 (°) 1.03
라마찬드란　플롯
(Ramachandran plot)		 Favored (%) 93.41
Allowed (%) 5.29
Outliers (%) 1.29
Rotamer outliers (%) 0.40
도 5는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 Fab 조각 결정 사진이며, 도 6는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체 Fab 조각 결정의 삼차구조를 나타낸다. 도 6에서, (a)는 Fab의 전체 구조를 나타낸 것이고, (b)는 CDR loop 부분을 위에서 본 구조를 나타낸다.
항체-수용체 복합체 모델링:
항 인간 트랜스페린 수용체 항체와 인간 트랜스페린 수용체의 복합체 구조(PDB id code: 3KAS)를 Patchdock 프로그램으로 모델링하였다. 모델링 결과는 Phenix 프로그램의 comprehensive validation tool, MolProbity로 밸리데이션하였고, Firedock, fast interaction refinement 프로그램을 활용하여 정밀화(refinement)를 수행하였다. 모델링된 복합체 구조를 분석한 결과 도 1에서 나타낸 티로신 잔기들이 복합체 형성에 중요한 역할을 하는 것을 발견하였다.
항 인간 트랜스페린 수용체 항체의 Fab 조각과 인간 트랜스페린 수용체 복합체의 모델링 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에서, (a)는 복합체의 전체 구조를 나타내고, (b)는 항체와 수용체의 상호작용 부위의 구조를 나타낸다.
실험예 2: 항체 친화도 측정
항 인간 트랜스페린 수용체 항체(anti-hTfR 항체)의 트랜스페린 수용체(hTfR) 결합 친화도는 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)를 이용하여 측정하였다.
인간 TfR (2.5μg/ml)을 96-well half area plate (Corning)에 4℃에서 overnight 코팅하였다. 항체는 50nM에서 0.64pM로 5-fold 희석해서 준비하였다. 희석에는 5% 스킴 밀크가 들어있는 PBS (pH 7.5, 블로킹 버퍼와 동일)를 이용하였다. 플레이트는 pH7.5의 PBS로 3회 세척한 후, 블로킹 버퍼로 실온에서 2시간 블로킹하고 몇 번 더 세척하였다. 여러 농도의 anti-TfR 항체를 well에 넣어서 2시간 동안 결합을 유도하였다. 그 후 결합하지 않은 항체들은 PBST 로 2번 세척하고 PBS 로 두 번 세척하여 씻어냈다.
호스래디쉬퍼옥시다제(Horseradish peroxidase, HRP)가 결합된 인간 IgG 항체(anti-human IgG antibody, AB frontier)를 첨가하고 2시간 인큐베이션 하였다. 항체 세척 단계 이후에는 TMB 용액 50μl를 첨가하고 37℃에서 20분 인큐베이션 하였다. 마지막으로, 동일한 부피의 스톱 용액을 첨가하고 섞은 후, EMax 마이크로플레이트리더(Molecular Devices)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. TMB 인큐베이션 이외의 단계들은 상온에서 수행하였다.
본 발명에서 설계한 항 트랜스페린 수용체 항체의 결합친화도 측정의 ELISA 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8의 그래프에서, 사각형 모양으로 표시된 곡선은 야생형(WT)의 결과를 나타내고, 별표 모양으로 표시된 곡선은 돌연변이체의 결과를 나타낸다. 도 8에서, (a) 내지 (d)는 각각 VH Y27H, VH Y98A, VH Y99H 및 VL Y94A에 대한 결합친화도 측정 결과를 나타낸다.
또한, 돌연변이를 도입한 항 트랜스페린 수용체 항체의 결합친화도 감소효과 측정결과를 표 3에 나타내었다.
구분 EC50 (nM)
WT / mutant		 EC50의 Fold-increase
(결합친화도 감소 비율)
VH Y27H 0.057 / 1.98 35
VH Y98A 0.53 / >50 >100
VH Y99H 0.048 / 0.44 9.2
VL Y94A 0.44 / 0.52 1.2
상기 결과로부터 각 돌연변이체가 야생형에 비해 TfR과의 결합친화도가 낮은 것을 확인할 수 있으며, 뇌혈관장벽 통과 효율의 최적화를 위해 VH Y27H의 결합친화도가 적합할 것으로 예측하였다.
실험예 3: 뇌혈관장벽 통과 어세이
인간 뇌의 프라이머리 미세혈관내피세포(primary microvascular endothelial cells (hBMEC), Cell Systems ACBRI 376)를 사용하여 뇌혈관장벽 통과 실험을 수행하였다.
T-75 플라스크를 Attachment FactorTM (Cell systems)로 코팅하였다. 코팅은 37℃에서 미리 데워놓은 Attachment FactorTM 5ml를 T-75 플라스크에 넣고 10초 후에 제거함으로써 수행하였다. 그 후, 세포를 녹이고 CultureBoostTM (Cell systems)로 보충한 complete classic medium을 이용하여 37℃, 5% CO2 가습 인큐베이터에서 80~90% confluence까지 세포를 성장시켰다. 그 후, 미리 데워놓은 PBS로 세척하고 트립신-EDTA를 넣은 후 5분간 37℃에서 인큐베이션하였다. 5분 후, 차가운 complete culture medium을 넣어 트립신을 불활성화 시켰다. 세포 현탁액을 15ml 코니컬 튜브에 옮기고 900 x g, 4℃에서 10분간 원심분리하였다. Medium 상층부를 따라 버리고, 37℃의 supplemented culture medium에 세포를 resuspension 하였다.
트랜스웰 인서트 (transwell inserts, 24-well, 0.4μm filter, SPL)를 인비트로(in vitro) BBB 모델을 형성하는데 사용하였다. 상술한 방법과 동일한 방법으로 인서트를 Attachment FactorTM로 코팅하였다. 수득한 hBMEC cell들을 트랜스웰 플레이트의 위쪽 챔버(upper chamber)에 20 x 103 세포/웰(cells/well)로 시딩하고, 48시간 동안 인큐베이션하였다.
침투성(permeability)을 확인하기 위하여 HRP-부착 콘트롤 IgG를 위쪽 챔버에 첨가하고 37℃에서 2시간 인큐베이션 후에 위쪽 챔버(upper chamber)와 아래쪽 챔버(bottom chamber)의 배양액을 회수하였다. 침투한 콘트롤 IgG를 TMB 용액과 반응시켜 정량적으로 측정하였다.
침투성 확인 후에 fresh supplemented complete culture medium에 들어 있는 항체들을 위쪽 챔버에 완충액 반을 치환하는 방식으로 넣은 후 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후 2시간, 4시간 째에 아래쪽 챔버의 배양액을 회수하였다. 침투한 항체를 항 인간 IgG 항체(anti-human IgG)로 코팅한 플레이트를 이용한 샌드위치 ELISA로 측정하여 뇌혈관장벽(BBB) 통과 효율을 확인하였다.
도 9는 항 트랜스페린 수용체 항체의 BBB 통과 효율을 나타낸 것이다. 도 9에서, 1.5ng의 야생형 anti-TfR 항체(회색) 및 VH-Y27H 돌연변이를 포함하는 anti-TfR 항체(검은색)의 통과 효율을 확인할 수 있다. 도 9의 결과에 따라, 티로신 돌연변이 중 VH-Y27H에 대해 BBB 통과 효율을 야생형과 비교해 본 결과, 월등히 높은 효율로 BBB 세포를 통과하는 것을 확인하였다.
실험예 4: 이중특이적 항체를 이용한 뇌혈관장벽 통과 어세이
신경세포보호 단백질을 이용한 이중특이적 항체 제작:
신경세포보호 단백질로서 PTPsigma의 엑토도메인 Ig1-2를 사용하여, 항 트랜스페린 수용체 항체와 함께 이중특이적 항체를 제작하였다.
정제된 각각의 단백질을 280nm에서의 흡광도를 통해 정량 후, 동일 분자 비율로 혼합하였다. 혼합한 단백질 용액에 최종 농도가 0.1 M Arginine pH 9.0, 20 mM Glutathione(reduced)(Sigma-Aldrich)이 되도록 화합물을 추가하였다. 반응 용액은 37℃에서 3시간 동안 반응시켜 이중특이적 항체가 형성되도록 하였다.
반응이 끝난 단백질에서 이중특이적 항체가 형성된 것을 확인하기 위하여 비환원 SDS-PAGE를 수행하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서, 좌측 SDS-PAGE 결과의 1번 레인은 PTPsigma-Fc knob, 2번 레인은 anti-TfR(WT)-HC(Fc hole)에 대한 결과이고, 중앙의 SDS-PAGE 결과는 anti-TfR(WT):PTPsigma 항체의 야생형 이중특이적 항체에 대한 결과이며, 우측의 SDS-PAGE 결과는 anti-TfR(VH-Y27H):PTPsigma 항체의 이중특이적 항체에 대한 결과로서, 상기 SDS-PAGE 결과를 통해 이중특이적 항체가 형성된 것을 확인하였다.
이중특이적 항체 제작에 이용된 anti-TfR 중쇄(HC)/경쇄(LC) 및 PTPsigma-Fc의 아미노산 서열은 아래와 같다.
anti-TfR HC/LC 서열에서, 밑줄 친 부분은 가변영역의 서열을 나타내고, HC에서 굵게 표시한 부분은 Fc 영역의 서열을 나타낸다.
[anti-TfR(WT) HC]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH
[anti-TfR(VH Y27H) HC]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASG H SFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH
[anti-TfR(WT) LC]
MDFQVQIFSFLLISASVILSRGQIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSIDYIHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEPEDAATYYCHQRNSYPWTFGGGTRLEIRRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[anti-TfR(WT) HC (Fc hole)]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH
[anti-TfR(VH Y27H) HC (Fc hole)]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSEVQLQQSGPELVKPGASMKISCKASG H SFTGYTMNWVKQSHGENLEWIGRINPHNGGTDYNQKFKDKAPLTVDKSSNTAYMELLSLTSEDSAVYYCARGYYYYSLDYWGQGTSVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKLESRGPFEQKLISEEDLNMHTGHHHHHH
PTPsigma-Fc 서열에서, 밑줄 친 부분은 PTPsigma 유래 단백질의 서열이고, 굵게 표시한 부분은 Fc 영역의 서열이다. 또한, PTPsigma(2N) 서열은 PTPsigma 엑토도메인 Ig1-2의 수용액 용해도를 향상시키기 위해서 도입한 L155N 및 L187N 돌연변이를 포함하는 서열이다.
[PTPsigma(WT)-Fc(WT)]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIHHHHHHEEPPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLREDQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[PTPsigma(WT)-Fc(knob)]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIHHHHHHEEPPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLREDQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATMLCAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQLRSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[PTPsigma(2N)-Fc(WT)]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIHHHHHHEEPPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLREDQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATM N CAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQ N RSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[PTPsigma(2N)-Fc(knob)]
MDWTWRVFCLLAVAPGAHSDIHHHHHHEEPPRFIKEPKDQIGVSGGVASFVCQATGDPKPRVTWNKKGKKVNSQRFETIEFDESAGAVLRIQPLRTPRDENVYECVAQNSVGEITVHAKLTVLREDQLPSGFPNIDMGPQLKVVERTRTATM N CAASGNPDPEITWFKDFLPVDPSASNGRIKQ N RSGALQIESSEETDQGKYECVATNSAGVRYSSPANLYVRVRRVA DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
뇌혈관장벽 통과 어세이:
인간 뇌의 프라이머리 미세혈관내피세포(primary microvascular endothelial cells (hBMEC), Cell Systems ACBRI 376)를 사용하여 뇌혈관장벽 통과 실험을 수행하였다.
Attachment FactorTM (Cell systems)로 코팅한 T-75 플라스크에 세포를 넣어 37℃, 8% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 어세이의 수행을 위하여 SPL Life Sciences의 24-트랜스웰 인서트를 Attachment FactorTM로 코팅 후, 트립신을 이용하여 T-75 플라스크에서 분리한 세포를 3 x 104 세포/웰의 농도로 파종하여 5일간 배양하였다. 밀착연접(tight junction)의 형성을 판단하기 위해, anti-mouse IgG-HRP 항체를 트랜스웰 상층부에 넣고 대기한 후 하층부의 배양액을 수거하고, 수거한 배양액을 TMB 용액과 20분간 반응시켜 발색하지 않는 경우 실험에 사용하였다.
실험 농도 조건의 항체 샘플 3개를 트랜스웰 상층부에 넣은 뒤, 37℃ 인큐베이터에 두고 일정 시간마다 각 트랜스웰 하층부의 배양액을 수집하였다. 수집한 배양액에 대해 ELISA 어세이로 항체의 농도를 구하여 통과된 항체의 양을 비교하였다.
ELISA 어세이는 96-well plate를 이용하여 진행되었다. 각 단계 사이마다 PBS 및 PBST 용액으로 4차례 웰을 세척하였으며, 모든 항체는 5%(w/v) 탈지 분유를 함유한 PBS에 희석하였다. tetramethylbenzidine substrate (LABIS KOMA) 용액 및 황산 용액을 넣어 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
세포 통과 어세이 샘플 정량의 경우, 먼저 Goat anti-human IgG (Sigma-Aldrich) 항체를 sodium carbonate pH 9.5 조성의 완충 용액에 2μg/mL의 농도로 희석하여 4℃에서 코팅하였다. 코팅 후 5%(w/v) 탈지 분유를 이용하여 상온에서 2시간 동안 플레이트를 블로킹 처리하였다.
준비된 각 웰에 스탠다드 정량 곡선을 얻기 위한 항체와 실험에서 얻은 시료를 첨가하여 상온에서 2시간 반응시켰다. 코팅된 항체와 결합한 시료를 검출하기 위해 Mouse anti-myc tag 9E10 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 anti-mouse IgG-HRP 항체(GWVitek)를 순차적으로 상온에서 2시간씩 반응시켰다.
도 11은 이중특이적 항체의 뇌혈관장벽 통과 어세이 결과를 나타낸 그래프이다. 도 11에 따르면, anti-TfR(WT):PTPsigma 항체에 비하여 anti-TfR(VH-Y27H):PTPsigma 항체의 투과량이 훨씬 많은 것을 확인하였다. 이에 따라, 인간항체 128.1의 가변영역에 돌연변이를 도입하여 제작한 항 인간 트랜스페린 수용체 항체가 뇌혈관장벽 통과 효율 측면에서 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5: 신경돌기성장 어세이
인간 신경아세포종 SH-SY5Y 세포주를 사용하여 신경돌기 성장을 측정하였다. 세포는 10% FBS를 첨가한 DMEM 배양액에서 37℃, 8% 이산화탄소 조건으로 배양하였다. 어세이의 수행을 위하여 96웰-콜라겐 코팅 플레이트(SPL Life Sciences)에 트립신으로 분리한 세포를 8 x 103 세포/웰의 농도로 파종하였다. 분화에 의한 신경돌기 성장을 유도하기 위하여 세포에 5μM 레티노산(Tokyo Chemical Industry)를 처리하였으며, 이를 억제하기 위하여는 1μM 콘드로이친 황산 나트륨염(chondroitin sulfate sodium salt, Sigma-Aldrich)을 처리하였다.
각 웰에 화합물 및 PTPsigma Ig1-2 단백질을 처리한 다음 2일 뒤 세포를 Neurite Stain Solution (Millipore)으로 염색하여 신경돌기 성장의 측정을 수행하고, 획득한 이미지를 ImageJ 프로그램을 통해 정량적으로 분석하여 얻은 신경돌기 성장 어세이 결과를 도 12에 나타내었다.
도 12를 참조하면, 레티노산(RA)을 첨가했을 때 신경돌기의 성장이 나타나고, 이 성장은 콘드로이친 황산 나트륨염(CS)에 의한 PTPsigma 신호전달에 의해 차단되는 것을 확인할 수 있으며, 이때 PTPsigma 엑토도메인 Ig1-2를 첨가하면 신경돌기의 성장이 다시 나타나는 것을 볼 수 있다.
도 12에서 MT는 PTPsigma 엑토도메인 Ig1-2의 수용액 용해도를 향상시키기 위해 2N 돌연변이(L155N 및 L187N)를 추가한 단백질이며, WT는 야생형의 PTPsigma 엑토도메인 Ig1-2를 나타낸다. 야생형의 PTPsigma 엑토도메인 Ig1-2 단백질의 경우 농도를 100nM 이상 처리할 수 없는데 비해, 2N 돌연변이(L155N 및 L187N)는 용해도가 향상되어 높은 농도로 처리할 수 있으므로, CS에 의한 신경돌기 성장 저해를 더욱 효과적으로 차단할 수 있음을 확인할 수 있었다.
따라서, 이러한 PTPsigma 돌연변이 단백질을 본 발명의 항 인간 트랜스페린 수용체 항체와 결합하여 제작된 이중특이적 항체는 뇌 손상 치료 효율 및 뇌혈관장벽 투과율이 모두 우수하므로, 뇌 손상 치료제로서 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 형태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.

Claims (15)

  1. 서열번호 1의 중쇄 가변영역(VH) 및 서열번호 2의 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 항 인간 트랜스페린 수용체 항체로서,
    상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에서 티로신(Y) 중 하나 이상이 알라닌(A) 또는 히스티딘(H)으로 치환된, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 티로신이 Kabat 넘버링에 따른 서열번호 1의 Y27, Y98, Y99, 및 서열번호 2의 Y94로 구성된 군에서 선택되는, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 치환이 Kabat 넘버링에 따른 서열번호 1의 Y27H, Y98A, Y99H, 및 서열번호 2의 Y94A로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 변이를 포함하는, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체에 하나 이상의 약물 화합물이 접합된, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체가 인간화 항체인, 항 인간 트랜스페린 수용체 항체.
  6. 인간 트랜스페린 수용체(hTfR)와 결합하는 하나 이상의 제1 결합 도메인 및 표적 분자와 결합하는 하나 이상의 제2 결합 도메인을 포함하는 다중특이적 항체로서,
    상기 제1 결합 도메인이 서열번호 1의 중쇄 가변영역(VH) 및 서열번호 2의 경쇄 가변영역(VL)을 포함하며, 상기 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열에서 티로신(Y) 중 하나 이상이 알라닌(A) 또는 히스티딘(H)으로 치환된, 다중특이적 항체.
  7. 제 6 항에 있어서,
    상기 제2 결합 도메인의 표적 분자가 콘드로이친 황산염(chondroitin sulfate), 베타 세크레타제 1(Beta-secretase 1, BACE1), 감마 세크레타제(Gamma-secretase), 아밀로이드 베타(amyloid beta, Abeta), 상피 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR), 타우(tau), 아포지단백질 E4(apolipoprotein E4, ApoE4), 알파-시누클레인(alpha-synuclein), CD20, 헌팅틴 단백질(Huntingtin protein), 프리온 단백질(prion protein, PrP), 류신 풍부 반복 키나제 2(leucine-rich repeat kinase 2, LRRK2), 아밀로이드 전구체 단백질(amyloid precursor protein, APP), p75 뉴트로핀 수용체(p75 neurotrophin receptor, p75NTR), 카스파제 6(caspase 6) 또는 글루코세레브로시다아제(Glucocerebrosidase)인, 다중특이적 항체.
  8. 제 6 항에 있어서,
    상기 제2 결합 도메인이 PTPsigma(Protein Tyrosine Phosphatase sigma) 유래의 단백질을 포함하는, 다중특이적 항체.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 PTPsigma 유래 단백질이 PTPsigma 단백질의 30 내지 231번 아미노산 서열을 포함하는, 다중특이적 항체.
  10. 제 8 항에 있어서,
    상기 PTPsigma 유래 단백질에서, 류신(L) 중 하나 이상이 아스파라진(N)으로 치환된, 다중특이적 항체.
  11. 제 6 항에 있어서,
    상기 제1 결합 도메인이 Fab, scFv, di-scFv, dsFv 및 (dsFv)2로 구성된 군에서 선택되는 형태인, 다중특이적 항체.
  12. 제 6 항에 있어서,
    상기 제1 결합 도메인 및 제2 결합 도메인이 Fc 영역에 연결된, 다중특이적 항체.
  13. 제 6 항에 있어서,
    상기 항체에 하나 이상의 약물 화합물이 접합된, 다중특이적 항체.
  14. 제 6 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 다중특이적 항체를 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 뇌질환이 파킨슨병(Parkinson's disease), 알츠하이머 치매(Alzheimer's disease), 사고성 뇌손상(Traumatic brain injury), 뇌졸중(Stroke), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 척수손상(spinal cord injury), 알코올성 뇌신경질환, 알코올성 치매 및 베르니케-코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff's syndrome)으로 구성된 군에서 선택되는, 뇌질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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