WO2023190714A1 - リゾホスホリパーゼｄの活性測定方法、リゾホスホリパーゼｄ活性測定用感度向上剤、組成物、及び、キット - Google Patents

リゾホスホリパーゼｄの活性測定方法、リゾホスホリパーゼｄ活性測定用感度向上剤、組成物、及び、キット Download PDF

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WO2023190714A1
WO2023190714A1 PCT/JP2023/012871 JP2023012871W WO2023190714A1 WO 2023190714 A1 WO2023190714 A1 WO 2023190714A1 JP 2023012871 W JP2023012871 W JP 2023012871W WO 2023190714 A1 WO2023190714 A1 WO 2023190714A1
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WO
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lysophospholipase
activity
composition
measuring
measurement
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Application number
PCT/JP2023/012871
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English (en)
French (fr)
Inventor
喜丸 大窪
友和 板井
Original Assignee
富士フイルム株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring lysophospholipase D activity, a sensitivity improver for measuring lysophospholipase D activity, a composition, and a kit.
  • Lysophospholipase D is an enzyme that plays an important role in vivo as a lysophosphatidic acid (hereinafter sometimes abbreviated as LPA) producing enzyme. Lysophospholipase D activity in the blood has been reported to increase with liver fibrosis, and is attracting attention as a liver fibrosis marker.
  • LPA is a bioactive lipid that affects migration, proliferation, and survival in various cell types, and has been shown to be involved in inflammation such as arthritis, neurodegeneration, neuropathic pain, thyroid disease, and pathology including cancer in vivo. It is thought to play a role in promoting a variety of diseases, including physical and psychological conditions.
  • Non-Patent Document 1 describes that autotaxin, a type of lysophospholipase D, dramatically increases the chemotaxis and proliferation of multiple different cell lines in the presence of lysophosphatidylcholine (LPC), and It has been described that several cancer cell lines release large amounts of LPC, a substrate for ATX, into the culture medium.
  • LPC lysophosphatidylcholine
  • lysophospholipase D has been suggested to have a causal relationship with various diseases, so measuring the activity of lysophospholipase D in samples such as blood can be used to discover various diseases and predict the severity of the disease. It is considered to be useful in such situations.
  • conventional methods for measuring lysophospholipase D activity take a long time to measure, and therefore have not been applied clinically. This is considered to be because the sensitivity of measuring lysophospholipase D activity is not sufficient with the conventional method.
  • the objects of the present invention are a method for measuring lysophospholipase D activity with excellent sensitivity in activity measurement, a sensitivity improver for lysophospholipase D activity measurement, a composition for measuring lysophospholipase D activity with excellent sensitivity in activity measurement, Another object of the present invention is to provide a kit for measuring the activity of lysophospholipase D, which has excellent sensitivity in measuring the activity.
  • the present inventors have conducted studies and found that the sensitivity of lysophospholipase D activity measurement can be improved by coexisting ferrocyanide when measuring lysophospholipase D activity, and have completed the present invention. Typical embodiments of the present invention are shown below. However, the present invention is not limited to these.
  • a method for measuring the activity of lysophospholipase D which comprises measuring the lysophospholipase D activity possessed by lysophospholipase D in the presence of ferrocyanide.
  • ⁇ 3> The method for measuring the activity of lysophospholipase D according to ⁇ 1> or ⁇ 2>, wherein the measurement includes bringing the lysophospholipase D into contact with a substrate to produce a product.
  • ⁇ 4> The method for measuring the activity of lysophospholipase D according to ⁇ 3>, wherein the substrate is lysophosphatidylcholine and the product is choline.
  • ⁇ 5> The method for measuring the activity of lysophospholipase D according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 4>, wherein the lysophospholipase D is autotaxin.
  • ⁇ 6> The method for measuring the activity of lysophospholipase D according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the concentration of the ferrocyanide in the measurement of the lysophospholipase D activity is 0.005 mmol/l or more.
  • ⁇ 8> Contains ferrocyanide and lysophospholipase D substrate, A composition for measuring the activity of lysophospholipase D.
  • ⁇ 9> The composition according to ⁇ 8>, wherein the substrate is lysophosphatidylcholine.
  • composition according to ⁇ 8> or ⁇ 9> wherein the concentration of the ferrocyanide in the activity measurement is 0.005 mmol/l or more.
  • a kit for measuring the activity of lysophospholipase D comprising the composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 10> or two or more reagents in which the components contained in the composition are distributed. .
  • the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention includes measuring the lysophospholipase D activity possessed by lysophospholipase D in the presence of ferrocyanide.
  • Non-Patent Document 1 describes a method for measuring lysophospholipase D activity of autotaxin (ATX), which is produced by bringing autotaxin in a sample into contact with lysophosphatidylcholine (LPC), which is a substrate.
  • a measurement method for detecting choline is disclosed.
  • Non-Patent Document 1 1 to 50 ul of the sample was subjected to 1 mM LPC in the presence of 100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 , 0.05% Triton X-100. (derived from eggs) for 1 hour at 37°C, and the liberated choline was treated with choline oxidase (Asahi Kasei), horseradish peroxidase (Toyobo), and TOOS reagent (N-ethyl-N-(2-hydroxy-3) as a hydrogen donor). -sulfoprolyl)-3-methylaniline) was detected by enzymatic photometry.
  • Non-Patent Document 1 has low sensitivity and takes a long time when actually measuring low concentrations of lysophospholipase D such as autotaxin in a specimen.
  • the present inventors conducted studies and found that the sensitivity of measuring lysophospholipase D activity can be improved by coexisting ferrocyanide in measuring lysophospholipase D activity.
  • the present inventors have also found that simultaneous reproducibility is excellent when ferrocyanide is present in the activity measurement of lysophospholipase D.
  • Excellent simultaneous reproducibility means that the variation in measurement results is small when the same specimen is repeatedly measured in a short period of time.
  • mmol/l is also referred to as mM.
  • the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention includes measuring the lysophospholipase D activity possessed by lysophospholipase D in the presence of ferrocyanide.
  • ferrocyanide is not particularly limited and any known ferrocyanide can be used, but potassium ferrocyanide or sodium ferrocyanide is preferred.
  • ferrocyanide is ionized into ferrocyanide ions ([Fe(CN) 6 ] 4- ) and cations (e.g., metal cations such as K + and Na + ) when measuring lysophospholipase D activity.
  • concentration of ferrocyanide when measuring lysophospholipase D activity is not particularly limited, but is preferably 0.005mM or more, more preferably 0.050mM or more, and 0.500mM or more. is even more preferable.
  • the upper limit of the concentration is not particularly limited, but is preferably, for example, 30 mM or less, more preferably 20 mM or less. Only one type of ferrocyanide may be used, or two or more types may be used in combination. When two or more types are used in combination, it is preferable that the total concentration is within the above range.
  • the method for measuring lysophospholipase D activity is not particularly limited, except that it is carried out in the presence of the above-mentioned ferrocyanide, and any known method can be used without restriction.
  • Lysophospholipase D to be measured is not particularly limited, but autotaxin (ATX) is preferable, and human autotaxin is more preferable.
  • Human autotaxin was identified in 1992 by M. L. It is a glycoprotein isolated from the culture supernatant of the human malignant melanoma cell line A2058 as a factor having cell motility promoting activity by Stracke et al. (J. Biol. Chem. 1992 267:2524-2529.).
  • the measurement of lysophospholipase D activity is preferably a method of measuring lysophospholipase D activity in a specimen or a standard product.
  • the specimen is not particularly limited as long as it contains or may contain lysophospholipase D. Furthermore, the sample may not contain lysophospholipase D as a result.
  • specimens include body fluids (e.g. blood, urine, cerebrospinal fluid, pleural effusion, ascites fluid, puncture fluid or extracts thereof, etc.), tissues (e.g. biopsy tissue or extracts thereof, etc.), lysophospholipase D solution, culture. Examples include cells or extracts thereof, cell culture supernatants, and blood is preferred.
  • the specimen may be subjected to a treatment such as separation or purification in advance.
  • a treatment such as separation or purification in advance.
  • the blood sample may be separated serum or plasma.
  • a treatment such as removing this compound from the sample may be performed in advance.
  • the measurement of lysophospholipase D activity preferably includes contacting the lysophospholipase D with a substrate to produce a product.
  • lysophospholipase D activity can be measured, for example, by measuring the amount of product produced per unit time.
  • the above contact between lysophospholipase D and the substrate is preferably carried out in a liquid, more preferably in a pH buffer.
  • pH buffers include phosphate buffers, citrate buffers, acetate buffers, Tris-HCl buffers, Good's buffers such as TAPS, Bicine, PIPES, MES, HEPES, and other chemical buffers.
  • buffer solutions containing compounds that are commonly used as buffers include buffer solutions containing compounds that are commonly used as buffers.
  • the pH of the liquid during the above-mentioned contact is not particularly limited, but may be, for example, pH 6.0 to 11.0.
  • the substrate is not particularly limited and may be any substrate for lysophospholipase D, but lysophosphatidic acid ester, which is a substrate for lysophospholipase D, is preferable, lysophosphatidylcholine or lysophosphatidylglycerol is more preferable, and lysophosphatidylcholine is more preferable. preferable.
  • a substrate for lysophospholipase D for example, a substrate labeled to have functions such as fluorescence and luminescence, such as a compound that is cleaved by the action of lysophospholipase D and emits fluorescence after cleavage, may be used.
  • a labeled substrate conventionally known substrates can be used without particular limitation, and for example, FS-3 (manufactured by Echelon Biosciences) and the like can be used.
  • the substrate is lysophosphatidylcholine and the product is choline.
  • Examples of the lysophosphatidylcholine include compounds represented by the following formula (LPC-1).
  • R 1 and R 2 is a hydrogen atom, and the other is an alkylcarbonyl group.
  • the number of carbon atoms in the alkylcarbonyl group is preferably 2 to 30, more preferably 10 to 20.
  • Examples of the compound represented by formula (LPC-1) include, but are not limited to, compounds having the following structure.
  • the concentration of the substrate during the above-mentioned contact is not particularly limited and may be determined taking into consideration the solubility of the substrate itself, measurement sensitivity, simultaneous measurement reproducibility, etc., but is preferably 0.1 to 20mM, and preferably 0.5 to 20mM. 10mM is more preferred. Only one type of substrate may be used, or two or more types may be used in combination. When two or more types are used in combination, it is preferable that the total concentration is within the above range.
  • the above-mentioned contact may be carried out in the presence of a surfactant for the purpose of assisting in dissolving the substrate, dispersing the generated coloring reagent, etc.
  • the above-mentioned surfactant is not particularly limited and may be an ionic surfactant or a nonionic surfactant, for example, a nonionic surfactant such as Triton (registered trademark) X-100. Examples include sterile surfactants.
  • the concentration of the surfactant is not particularly limited, but is preferably, for example, 0.001 to 1.0% (w/v) based on the volume of the reaction solution.
  • % (w/v) indicates the ratio of the content (g) of the compound to 100 mL of liquid volume. Only one type of surfactant may be used, or two or more types may be used in combination. When two or more types are used in combination, it is preferable that the total concentration is within the above range.
  • the temperature during the above-mentioned contact is not particularly limited, and may be a temperature around the optimal temperature of the lysophospholipase D to be measured, for example, 20 to 45°C.
  • the amount of the above-mentioned product produced is measured, for example, by measurement using an oxidase-peroxidase coloring system.
  • Measurement using an oxidase-peroxidase coloring system is a method in which the above product is subjected to an enzymatic reaction to generate hydrogen peroxide, and the hydrogen peroxide is reacted with a coloring reagent in the presence of peroxidase to perform colorimetric determination. Since the degree of color development (for example, measured as absorbance) depends on the concentration of the product, the concentration of the product and the amount of the product can be determined from the degree of color development.
  • the product can be converted into a substrate (in multiple steps) that catalyzes a reaction that can convert the product to a substrate capable of generating hydrogen peroxide. It is also possible to measure the amount of the substance to be measured by appropriately designing a coupling reaction that combines a product (the product may be converted into the above-mentioned substrate) and an oxidase.
  • glycerol when the substrate is lysophosphatidylglycerol and the product is glycerol, glycerol is converted to glycerol-3-phosphate by glycerol kinase and ATP (adenosine triphosphate), and then the oxidase glycerol-3-phosphate is used to convert glycerol to glycerol-3-phosphate.
  • Hydrogen peroxide may be generated by phosphate oxidase.
  • a preferred embodiment includes a product oxidase, a coloring reagent, and a peroxidase during the above-mentioned contact in the method for measuring the activity of lysophospholipase D of the present invention.
  • Coloring reagents include a combination of a hydrogen donor such as Trinder's reagent and its coupler, a combination of a hydrogen acceptor such as nitrotetrazolium blue and its coupler, 10-(carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethyl Compounds that generate color by themselves, such as leuco dyes such as sodium aminophenothiazine, can be used.
  • preferred embodiments include an oxidase product, a Trinder reagent, a coupler for the Trinder reagent, and a peroxidase during the above-mentioned contact in the method for measuring the activity of lysophospholipase D of the present invention.
  • the oxidizing enzyme for the above product is not particularly limited, and may be selected depending on the type of product.
  • choline oxidase is included.
  • the above-mentioned choline oxidase is not particularly limited as long as it produces hydrogen peroxide from choline. Examples include choline oxidase derived from Microorganism or Arthrobacter species.
  • the choline oxidase may be a natural product, chemically or biochemically synthesized, or genetically engineered. Also, commercially available materials can be used. For example, when the product is glycerol, glycerol-3-phosphate oxidase is included.
  • glycerol-3-phosphate oxidase an enzyme and substrate (eg, glycerol kinase and ATP) are used to further generate glycerol-3-phosphate from glycerol, as described above.
  • the concentration of the oxidase in the product at the time of the contact may be a concentration sufficient to react with the generated product, and may be determined taking into consideration measurement sensitivity, simultaneous measurement reproducibility, etc. 0.01 to 200 U/mL is preferable, and 0.1 to 100 U/mL is more preferable.
  • the product oxidase may be used alone or in combination of two or more. When two or more types are used in combination, it is preferable that the total concentration is within the above range. Further, the product oxidase may be immobilized on a container (for example, a well of a plate), a bead (for example, resin beads), etc. used for measurement.
  • Trinder reagent examples include, but are not particularly limited to, phenol and its derivatives, aniline derivatives, naphthol and its derivatives, naphthylamine and its derivatives, and the like.
  • the Trinder reagent includes N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline (ADPS), N-ethyl-N-sulfopropylaniline (ALPS), and N-ethyl-N-sulfopropyl-3.
  • ADPS N-ethyl-N-sulfopropyl-3-methoxyaniline
  • APS N-ethyl-N-sulfopropylaniline
  • N-ethyl-N-sulfopropyl-3 examples include, but are not particularly limited to, phenol and its derivatives, aniline derivatives, naphthol and its derivatives, naphthylamine and its derivatives, and the like.
  • the Trinder reagent includes
  • TOPS N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline
  • ADOS N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3
  • DAOS N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyaniline
  • HDAOS N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3
  • MAOS N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methoxyaniline
  • TOOS N-(3-sulfopropyl)-3-methoxy-5-methyl
  • HMPS alanine
  • TODB N,N-bis(4-sulfobutyl)-3-methylaniline
  • the concentration of the Trinder reagent at the time of the contact is not particularly limited and may be determined by considering measurement sensitivity, simultaneous measurement reproducibility, etc., but is preferably 0.1 to 20 mM, more preferably 0.5 to 10 mM. preferable. Only one type of Trinder reagent may be used, or two or more types may be used in combination. When two or more types are used in combination, it is preferable that the total concentration is within the above range.
  • Couplers for the Trinder reagent include 4-aminoantipyrine (4-AA) or its derivatives, vanillin diamine sulfonic acid, methylbenzthiazolinone hydrazone (MBTH), and sulfonated methylbenzthiazolinone hydrazone (SMBTH). From the viewpoint of stability of the coupler itself, 4-aminoantipyrine is preferred.
  • the concentration of the coupler in the Trinder reagent at the time of the contact is not particularly limited and may be determined in consideration of measurement sensitivity, simultaneous measurement reproducibility, etc., but is preferably 0.1 to 20mM, and 0.5 to 10mM. is more preferable. Only one type of coupler for the Trinder reagent may be used, or two or more types may be used in combination. When two or more types are used in combination, it is preferable that the total concentration is within the above range.
  • the peroxidase is not particularly limited, and any peroxidase may be used as long as it oxidizes and condenses the Trinder reagent and the coupler of the Trinder reagent.
  • Examples include peroxidase derived from horseradish or microorganisms such as bacteria and mold.
  • Peroxidase may be a natural product, chemically or biochemically synthesized, or genetically engineered. Also, commercially available materials can be used.
  • the concentration of peroxidase may be determined as long as it is sufficient to react with the generated hydrogen peroxide, and may be determined by considering measurement sensitivity, simultaneous measurement reproducibility, etc., but 0.01 to 200 U/mL is sufficient. Preferably, 0.1 to 100 U/mL is more preferable.
  • peroxidase Only one type of peroxidase may be used, or two or more types may be used in combination. When two or more types are used in combination, it is preferable that the total concentration is within the above range. Further, peroxidase may be immobilized on a container (for example, a well of a plate), a bead (for example, resin beads), etc. used for measurement.
  • a container for example, a well of a plate
  • a bead for example, resin beads
  • the amount of the above-mentioned product produced may be measured by other known methods. Specifically, it may be amplified and measured by an enzyme cycling method that includes the product in the reaction mechanism.
  • the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention is preferably carried out by adding ferrocyanide, Trinder's reagent, choline oxidase, peroxidase, lysophosphatidylcholine, and a coupler of Trinder's reagent to a sample.
  • the couplers for ferrocyanide, Trinder's reagent, choline oxidase, peroxidase, lysophosphatidylcholine, and Trinder's reagent, and preferred concentrations of each component after mixing with the specimen are as described above.
  • the following blue pigment is produced by the following reaction.
  • the amount of choline produced can be measured by measuring the amount of the blue pigment using a colorimetric method (for example, absorbance measurement, etc.). By dividing the amount of choline produced by the reaction time, the amount of choline produced per unit time can be obtained, making it possible to measure the activity of lysophospholipase D in the sample.
  • the activity of lysophospholipase D can be measured, for example, by adding Composition 1 and Composition 2 below to a specimen.
  • Composition 1 Contains Trinder's reagent, choline oxidase, and peroxidase.
  • Composition 2 Contains ferrocyanide, lysophosphatidylcholine, and a Trinder reagent coupler.
  • Composition 1 and Composition 2 may be added to the specimen simultaneously or within a short time, but by adding Composition 1 first and then adding Composition 2 after a certain period of time, it is possible to add Composition 1 and Composition 2 to the specimen.
  • a color development (coloring) reaction can also be carried out after removing the derived choline.
  • Composition 1 may contain a component for decomposing hydrogen peroxide such as catalase.
  • a component for removing hydrogen peroxide may be added.
  • the hydrogen peroxide generated by Reagent 1 and the hydrogen peroxide finally generated by the action of lysophospholipase D after the addition of Reagent 2 have different generation timings.
  • the activity measurement of lysophospholipase D is performed by adding, for example, a sensitivity improver for measuring lysophospholipase D activity containing ferrocyanide, the following composition 3, and the following composition 4 to the sample.
  • a sensitivity improver for measuring lysophospholipase D activity containing ferrocyanide for measuring lysophospholipase D activity containing ferrocyanide
  • Composition 3 Contains Trinder's reagent, choline oxidase, and peroxidase.
  • Composition 4 Contains lysophosphatidylcholine and a Trinder reagent coupler.
  • the sensitivity improver, composition 3, and composition 4 may be added to the sample simultaneously or within a short time, but first, composition 3 is added, and after a certain period of time, composition 4 is added.
  • the sensitivity enhancer can be added, for example, before the addition of Composition 4 containing the substrate lysophosphatidylcholine, or at the same timing as the addition of Composition 4. For example, a method may be mentioned in which the reaction is carried out for 30 seconds to 30 minutes after adding Composition 3, and then Composition 4 is added. In the above embodiment, the sensitivity improver can be added before or at the same time as composition 4 is added.
  • Composition 3 may contain a component for decomposing hydrogen peroxide such as catalase.
  • a component for decomposing hydrogen peroxide may be added after the addition of Composition 3 and before the addition of Composition 4, a component for decomposing hydrogen peroxide may be added.
  • the hydrogen peroxide generated by reagent 3 and the hydrogen peroxide finally generated by the action of lysophospholipase D after addition of reagent 4 have different generation timings.
  • the activity of lysophospholipase D can also be measured, for example, by adding Composition 5 below to the specimen.
  • Composition 5 Contains Trinder's reagent, choline oxidase, peroxidase, ferrocyanide, lysophosphatidylcholine, and a coupler for Trinder's reagent.
  • there are two coloring reactions a coloring reaction that progresses due to choline derived from the specimen (coloring reaction 1), and a coloring reaction that progresses due to choline produced from lysophospholipase D and lysophosphatidylcholine in the specimen (coloring reaction 2). The reaction progresses.
  • composition 5 when Composition 5 is added to the specimen, Color Reaction 1 proceeds rapidly, whereas Color Reaction 2 proceeds slowly, with lysophospholipase D activity being rate-limiting.
  • the effect of color development due to sample-derived choline i.e., the effect of color reaction 1 can be subtracted and the activity of lysophospholipase D can be calculated. It is also possible to evaluate Details of the composition 5 will be described later.
  • the sample may be pretreated by another method to remove sample-derived choline in advance.
  • the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention is carried out by catalyzing the forward reaction of producing its phosphorylated product from glycerol and its reverse reaction in the presence of ferrocyanide, lysophosphatidylglycerol, and a nucleotide coenzyme.
  • one of the following first nucleotide coenzyme and the following second nucleotide coenzyme is used, and in the above reverse reaction, one of the following first nucleotide coenzyme and the following second nucleotide coenzyme is used in the above forward reaction.
  • This is preferably carried out by adding a glycerol kinase that utilizes the unused one, a first nucleotide coenzyme, and a second nucleotide coenzyme whose nucleoside moiety is different from the first nucleotide coenzyme.
  • a second aspect of measurement the following second nucleotide coenzyme phosphorylated product is produced by the following reaction.
  • the amount of glycerol produced can be measured.
  • the amount of glycerol produced per unit time can be obtained, making it possible to measure the activity of lysophospholipase D in the sample.
  • the production amount of glycerol is measured using the first nucleotide coenzyme, the dephosphorylated product of the first nucleotide coenzyme, the second nucleotide coenzyme, and the second nucleotide coenzyme. This can be carried out by detecting the amount of change in one or more enzyme phosphorylation levels. Details of the second aspect of the measurement can be performed according to JP 2017-038569A.
  • the sensitivity enhancer for measuring lysophospholipase D activity of the present invention contains ferrocyanide.
  • the sensitivity enhancer is preferably a sensitivity enhancer for measuring the activity of lysophospholipase D of the present invention described above.
  • the sensitivity improver may be ferrocyanide alone or a composition containing ferrocyanide. Preferred embodiments of ferrocyanide are the same as the preferred embodiments of ferrocyanide in the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • the amount of ferrocyanide when the sensitivity enhancer is ferrocyanide alone, and the concentration of ferrocyanide when the sensitivity enhancer is a composition depend on the concentration used in the measurement of lysophospholipase D activity. You just have to decide. As the concentration used in the measurement of lysophospholipase D activity, the concentration explained in the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention described above can be referred to.
  • the sensitivity enhancer may further include a solvent, a pH buffer, and other additives as components other than ferrocyanide.
  • the solvent include water, water-soluble organic solvents, and mixtures thereof, with water being preferred.
  • pH buffers include phosphate buffers, citrate buffers, acetate buffers, Tris-HCl buffers, Good's buffers such as PIPES, MES, HEPES, and other chemical buffers. Examples include compounds.
  • Other additives include preservatives, antioxidants, stabilizers, and the like. These compounds are not particularly limited and known compounds can be used as long as the effects of the present invention are achieved.
  • composition of the present invention is a composition for measuring lysophospholipase D activity, which contains ferrocyanide and a lysophospholipase D substrate.
  • the composition of the present invention is preferably a composition for measuring the activity of lysophospholipase D of the present invention described above.
  • a preferred embodiment of the ferrocyanide and the substrate for lysophospholipase D contained in the composition of the present invention is a preferred embodiment of the ferrocyanide and the substrate for lysophospholipase D in the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • the substrate for lysophospholipase D is preferably lysophosphatidylcholine.
  • the composition of the present invention may contain at least one selected from the group consisting of the above-mentioned Trinder reagent coupler, the above-mentioned Trinder reagent, the above-mentioned choline oxidase, and the above-mentioned peroxidase. Preferred embodiments of these compounds are the same as the preferred embodiments of these compounds in the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • the composition of the present invention may further contain a solvent, a pH buffer, and other additives. Examples of the solvent include water, water-soluble organic solvents, and mixtures thereof, with water being preferred.
  • pH buffers include phosphate buffers, citrate buffers, acetate buffers, Tris-HCl buffers, Good's buffers such as PIPES, MES, HEPES, and other chemical buffers.
  • examples include compounds.
  • Other additives include preservatives, antioxidants, stabilizers, and the like. These compounds are not particularly limited and known compounds can be used as long as the effects of the present invention are achieved.
  • the concentration of each component contained in the composition may be determined according to the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity. As the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity, reference can be made to the concentration of each component explained in the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • the kit of the present invention includes the above-described composition of the present invention or two or more reagents in which the components contained in the composition of the present invention are distributed.
  • the kit of the present invention is a kit for measuring the activity of lysophospholipase D, and is preferably a kit for measuring the activity of lysophospholipase D of the present invention.
  • the kit of the present invention is preferably a reagent kit in which the composition of the present invention is appropriately divided into two or more reagents (single components or compositions).
  • the kit of the present invention contains two or more reagents, and that all components contained in the composition of the present invention are contained in one of the two or more reagents.
  • kits of the present invention may also include the composition of the present invention.
  • the kit of the present invention preferably includes a composition containing ferrocyanide, lysophosphatidylcholine, a coupler for Trinder's reagent, Trinder's reagent, choline oxidase, and peroxidase.
  • a kit may include only one reagent, which is the above-mentioned composition.
  • the kit of the present invention includes a reagent that contains at least choline oxidase and does not substantially contain at least one compound necessary for color development, and a reagent for color development that is not substantially contained in the above reagent. It is also preferable to include a reagent containing the necessary compound.
  • the kit of the present invention preferably includes a reagent (Reagent 1) that contains at least choline oxidase and does not substantially contain a Trinder reagent coupler, and a reagent that contains a Trinder reagent coupler (Reagent 2).
  • the ferrocyanide, peroxidase, and Trinder reagent may be contained in either Reagent 1 or Reagent 2, in both, or in another reagent.
  • ferrocyanide, peroxidase, and Trinder reagent may be distributed among multiple reagents or may be contained in the same reagent.
  • one reagent contains a Trinder reagent and a coupler for the Trinder reagent.
  • embodiments containing all of the Trinder reagent, the Trinder reagent coupler, and peroxidase may be avoided.
  • substantially not containing means that the content is 1 ⁇ M or less, preferably 0.1 ⁇ M or less, and more preferably 0.01 ⁇ M or less.
  • the lower limit of the content is not limited and may be 0 ⁇ M or more.
  • the composition may be further divided into a plurality of reagents, such as composition 1 described below, which is further divided into two, a reagent containing Trinder's reagent and a reagent containing choline oxidase and peroxidase.
  • the composition may be further divided into a plurality of reagents, such as dividing Composition 2 described below into two, a reagent containing ferrocyanide and a reagent containing a coupler of lysophosphatidylcholine and Trinder's reagent.
  • the kit of the present invention preferably includes the following composition 1 and the following composition 2.
  • Composition 1 Contains Trinder's reagent, choline oxidase, and peroxidase.
  • Composition 2 Contains ferrocyanide, lysophosphatidylcholine, and a Trinder reagent coupler.
  • a preferred embodiment of the method for measuring the activity of lysophospholipase D using Composition 1 and Composition 2 is as described in the first embodiment of the measurement above.
  • composition 1 Preferred embodiments of the Trinder reagent, choline oxidase, and peroxidase in Composition 1 are the same as the preferred embodiments of these compounds in the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • Composition 1 may further contain a solvent, a pH buffer, and other additives. Preferred embodiments of these compounds are the same as those in the composition of the present invention described above.
  • the concentration of each component contained in Composition 1 may be determined according to the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity. As the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity, reference can be made to the concentration of each component explained in the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • Composition 2 Preferred embodiments of the coupler of ferrocyanide, lysophosphatidylcholine, and Trinder reagent in Composition 2 are the same as the preferred embodiments of these compounds in the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • Composition 2 may further contain a solvent, a pH buffer, and other additives. Preferred embodiments of these compounds are the same as those in the composition of the present invention described above.
  • the concentration of each component contained in Composition 2 may be determined depending on the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity. As the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity, reference can be made to the concentration of each component explained in the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • the kit of the present invention preferably contains the sensitivity improver of the present invention, Composition 3 below, and Composition 4 below.
  • Composition 3 Contains Trinder's reagent, choline oxidase, and peroxidase.
  • Composition 4 Contains lysophosphatidylcholine and a Trinder reagent coupler.
  • a preferred embodiment of the method for measuring the activity of lysophospholipase D using Composition 3 and Composition 4 is as described in the first embodiment of the measurement above.
  • composition 3 may further contain a solvent, a pH buffer, and other additives. Preferred embodiments of these compounds are the same as those in the composition of the present invention described above.
  • concentration of each component contained in Composition 3 may be determined according to the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity. As the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity, reference can be made to the concentration of each component explained in the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • Composition 4 Preferred embodiments of lysophosphatidylcholine and Trinder's reagent in Composition 4 are the same as the preferred embodiments of these compounds in the above-described method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention.
  • Composition 4 may further contain a solvent, a pH buffer, and other additives. Preferred embodiments of these compounds are the same as those in the composition of the present invention described above.
  • the concentration of each component contained in Composition 4 may be determined depending on the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity. As the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity, reference can be made to the concentration of each component explained in the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • the kit of the present invention includes Composition 5 below.
  • Composition 5 Contains Trinder's reagent, choline oxidase, peroxidase, ferrocyanide, lysophosphatidylcholine, and a coupler for Trinder's reagent.
  • a preferred embodiment of the method for measuring the activity of lysophospholipase D using Composition 5 is as described in the first embodiment of the measurement above.
  • composition 5- Preferred embodiments of the Trinder reagent, choline oxidase, peroxidase, ferrocyanide, lysophosphatidylcholine, and the coupler of the Trinder reagent in Composition 1 are the same as the preferred embodiments of these compounds in the method for measuring lysophospholipase D activity of the present invention described above. It is. Composition 5 may further contain a solvent, a pH buffer, and other additives. Preferred embodiments of these compounds are the same as those in the composition of the present invention described above. Further, the concentration of each component contained in Composition 5 may be determined according to the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity. As the concentration of each component used in the measurement of lysophospholipase D activity, reference can be made to the concentration of each component explained in the measurement of lysophospholipase D activity of the present invention described above.
  • composition of the present invention or the kit of the present invention may be incorporated into an analyte measuring device.
  • Such devices include, for example, body fluids (e.g. blood, urine, cerebrospinal fluid, pleural effusion, ascites fluid, puncture fluid or extracts thereof, etc.), tissues (e.g. biopsy tissue or extracts thereof, etc.), lysophospholipase D solution, etc. , an apparatus equipped with a system for measuring lysophospholipase D activity using the composition of the present invention or the kit of the present invention using cultured cells or extracts thereof, cell culture supernatants, etc. as specimens.
  • it may be a device that measures lysophospholipase D activity, such as a self-glucose meter, using the above-mentioned body fluid as a clinical specimen. That is, it may be an apparatus used for POCT (Point-of-Care Testing), that is, a clinical examination in a medical field such as medical treatment or nursing. Moreover, the apparatus may be an apparatus equipped with a sample collection system and a sample processing system.
  • POCT Point-of-Care Testing
  • the measurement target was 7 ⁇ L of pooled serum supplemented with recombinant ATX (Asahi Kasei Pharma, human autotaxin ⁇ isoform), and the photometric wavelength was set to 545 nm using the automatic analyzer JCA-BM9130 (JEOL) using the above measurement reagent.
  • the analysis conditions were RRA (initial reaction rate assay), and the change in absorbance ( ⁇ E/min) was measured 2 to 7 minutes after the start of measurement.
  • the enzymatic activity of ATX was defined as 1U, based on J.
  • the sensitivity is the measurement sensitivity of the sample minus the measurement sensitivity of physiological saline, and "vs 0mM" is a relative value based on the sensitivity when potassium ferrocyanide is not contained (comparative example 1) as 100%. .
  • Simultaneous reproducibility is an indicator of the degree of variation in measurement results when the same specimen is repeatedly measured in a short period of time, and is one of the basic performances of test reagents.
  • a reagent for a general-purpose automatic analyzer it is preferable that the coefficient of variation (CV%) when the same sample is normally measured five times is 10% or less. Furthermore, the smaller the CV is, the better the simultaneous reproducibility is, which is preferable. From Table 2, when the enzyme activity of ATX was measured without using potassium ferrocyanide, the coefficient of variation was 16.2%, and the simultaneous reproducibility was low (Comparative Example 2).
  • Comparative Example 3 and Examples 17 to 18 Verification of the sensitivity improvement effect of sodium ferrocyanide in measuring the activity of lysophospholipase D possessed by ATX
  • 70 ⁇ L of sodium ferrocyanide manufactured by Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • the measurement was carried out in the same manner as in Example 1, except that the sample was used. The measurement results are shown in Table 3.
  • the sensitivity is the measurement sensitivity of the sample minus the measurement sensitivity of physiological saline, and "vs 0mM” is a relative value based on the sensitivity when sodium ferrocyanide is not contained (Comparative Example 3) as 100%. It is.
  • Comparative Example 4 and Examples 19-21 Verification of the sensitivity improvement effect when each component of the composition is divided into two reagents
  • the measurement reagents were prepared at the concentrations shown in Table 4.
  • the amount of reagents used for the measurement was 100 ⁇ L in Comparative Example 4 and Example 19, and 50 ⁇ L for Reagent 3 and 50 ⁇ L for Reagent 4 in Example 20, for a total of 100 ⁇ L.
  • Example 20 in order to match the final concentration of each component with Example 19, the concentrations of choline oxidase, TOPS, peroxidase, 4-aminoantipyrine, and myristoyl lysophosphatidylcholine, which are reagents contained only in one of Reagent 3 and Reagent 4, were adjusted. was twice the concentration in Reagent 2 of Example 19. 10 ⁇ L of pooled serum with recombinant ATX (Asahi Kasei Pharma, human autotaxin ⁇ isoform) was measured, and using the above measurement reagent, an automatic analyzer JCA-BM9130 (manufactured by JEOL Ltd.) was used.
  • ATX Asahi Kasei Pharma, human autotaxin ⁇ isoform
  • the photometric wavelength was 545 nm
  • the analysis conditions were RRA (initial reaction rate assay)
  • the absorbance change ( ⁇ E/min) was measured 6 to 7 minutes after the start of the measurement.
  • the enzymatic activity of ATX was defined as 1U, based on J. Cell Biol., 158, 227-233 (2002), as the activity of producing 1 ⁇ mol of choline per minute from the substrate myristoyl lysophosphatidylcholine at 37°C.
  • the measurement results are shown in Table 5.
  • the sensitivity is obtained by subtracting the measurement sensitivity of physiological saline from the measurement sensitivity of the sample, and "vs 0mM" is a relative value based on the sensitivity when potassium ferrocyanide is not contained (Comparative Example 4) as 100%. .

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Abstract

フェロシアン化物の存在下で、リゾホスホリパーゼＤが有するリゾホスホリパーゼＤ活性を測定することを含む、リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法、フェロシアン化物を含む、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤、リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法のための組成物、及び、リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法のためのキット。

Description

リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤、組成物、及び、キット
　本発明は、リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤、組成物、及び、キットに関する。
　リゾホスホリパーゼＤは、リゾホスファチジン酸（以下ＬＰＡと略す場合がある。）生成酵素として生体内で重要な役割を果たす酵素である。
　血中のリゾホスホリパーゼＤ活性は、肝臓の線維化に伴い上昇することが報告されており、肝臓の線維化マーカーとして注目されている。また、ＬＰＡは様々な細胞型において移動、増殖及び生存に影響を及ぼす生理活性脂質であり、生体内での関節炎等の炎症、神経変性、神経障害性疼痛、甲状腺疾患、がんを含む病理学的状態等の多様な疾病を推進する上で役割を果たしていると考えられている。そこで、ＬＰＡの産生酵素であるリゾホスホリパーゼＤについて、様々な疾病との因果関係が研究されている。
　例えば非特許文献１には、リゾホスホリパーゼＤの１種であるオートタキシンがリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の存在下で、複数の異なる細胞株の走化性と増殖を劇的に増加させること、及び、いくつかのがん細胞株が、ＡＴＸの基質であるＬＰＣを培養液中に大量に放出することが記載されている。
J Cell Biol. 2002 Jul 22;158(2):227-33
　上述の通り、リゾホスホリパーゼＤは様々な疾病との因果関係が示唆されているため、例えば血液等の検体中のリゾホスホリパーゼＤの活性を測定することは様々な疾病の発見、疾病の程度の予測等において有用であると考えられる。
　しかし、従来のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法は測定に時間がかかることもあり、臨床応用されていない。これは、従来の方法ではリゾホスホリパーゼＤ活性測定の感度が十分ではないためであると考えられる。
　本発明の目的は、活性測定の感度に優れたリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤、活性測定の感度に優れたリゾホスホリパーゼＤの活性測定のための組成物、及び、活性測定の感度に優れたリゾホスホリパーゼＤの活性測定のためのキットを提供することである。
　本発明者らは検討を行い、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定時にフェロシアン化物を共存させることにより、リゾホスホリパーゼＤ活性測定の感度が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
　本発明の代表的な態様を以下に示す。ただし、本発明はこれらに限定されるものではない。
＜１＞　フェロシアン化物の存在下で、リゾホスホリパーゼＤが有するリゾホスホリパーゼＤ活性を測定することを含む、リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
＜２＞　上記フェロシアン化物が、フェロシアン化カリウム又はフェロシアン化ナトリウムである、＜１＞に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
＜３＞　上記測定が、上記リゾホスホリパーゼＤと基質とを接触させ、生成物を生成させることを含む、＜１＞又は＜２＞に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
＜４＞　上記基質がリゾホスファチジルコリンであり、上記生成物がコリンである、＜３＞に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
＜５＞　上記リゾホスホリパーゼＤがオートタキシンである、＜１＞～＜４＞のいずれか１つに記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
＜６＞　上記リゾホスホリパーゼＤ活性の測定における上記フェロシアン化物の濃度が０．００５ｍｍｏｌ／ｌ以上である、＜１＞～＜５＞のいずれか１つに記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
＜７＞　フェロシアン化物を含む、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤。
＜８＞　フェロシアン化物と、リゾホスホリパーゼＤの基質とを含む、
　リゾホスホリパーゼＤの活性測定のための組成物。
＜９＞　上記基質がリゾホスファチジルコリンである、＜８＞に記載の組成物。
＜１０＞　上記活性測定における上記フェロシアン化物の濃度が０．００５ｍｍｏｌ／ｌ以上である、＜８＞又は＜９＞に記載の組成物。
＜１１＞　＜８＞～＜１０＞のいずれか１つに記載の組成物、又は、前記組成物に含まれる成分を振り分けた２以上の試薬を含む、リゾホスホリパーゼＤの活性測定のためのキット。
　本発明によれば、活性測定の感度に優れたリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法、リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤、活性測定の感度に優れたリゾホスホリパーゼＤの活性測定のための組成物、及び、活性測定の感度に優れたリゾホスホリパーゼＤの活性測定のためのキットが提供される。
（リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法）
　本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法は、フェロシアン化物の存在下で、リゾホスホリパーゼＤが有するリゾホスホリパーゼＤ活性を測定することを含む。
　本発明によれば、活性測定の感度に優れたリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法が提供される。
　ここで、例えば非特許文献１には、オートタキシン（ATX）のリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する方法として、基質であるリゾフォスファチジルコリン（LPC）と試料中のオートタキシンを接触させることにより生じるコリンを検出する測定方法について開示されている。
　具体的には、非特許文献１には、1～50ulの検体を、100 mM Tris-HCl, pH 9.0, 500 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0.05% Triton X-100の存在下で1 mM LPC（卵由来）とともに37℃、1時間インキュベーションし、遊離したコリンを、コリンオキシダーゼ（旭化成）、西洋わさびペルオキシダーゼ（東洋紡）、水素供与体としてTOOS試薬（N-エチル-N-（2-ヒドロキシ-3-スルホプロリル）-3-メチルアニリン）を用いた酵素的光度法により検出した旨が記載されている。
　しかし、この非特許文献１に記載の方法は感度が低く、実際に検体中の低濃度のオートタキシン等のリゾホスホリパーゼＤを測定する場合には、測定に時間がかかってしまうことが分かった。
　そこで本発明者らは検討を行い、リゾホスホリパーゼＤの活性測定においてフェロシアン化物を共存させることで、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定感度が向上することを見出した。
　また本発明者らは、リゾホスホリパーゼＤの活性測定においてフェロシアン化物を共存させることで、同時再現性に優れることを見出した。
　同時再現性に優れるとは、同一の検体を短時間で繰返し測定した際に、測定結果のばらつきが小さいことをいう。
　以下に本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法の詳細について記載する。本発明において、ｍｍｏｌ／ｌはｍＭとも記載する。
＜リゾホスホリパーゼＤ活性の測定＞
　本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法は、フェロシアン化物の存在下で、リゾホスホリパーゼＤが有するリゾホスホリパーゼＤ活性を測定することを含む。
〔フェロシアン化物〕
　上記フェロシアン化物としては、特に限定されず公知のフェロシアン化物を用いることができるが、フェロシアン化カリウム又はフェロシアン化ナトリウムが好ましい。
　また、フェロシアン化物は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定時にフェロシアン化物イオン（[Ｆｅ（ＣＮ）６］４－）とカチオン（例えば、Ｋ＋、Ｎａ＋等の金属カチオン）とに電離していてもよい。
　リゾホスホリパーゼＤ活性を測定する際のフェロシアン化物の濃度としては、特に限定されないが、０．００５ｍＭ以上であることが好ましく、０．０５０ｍＭ以上であることがより好ましく、０．５００ｍＭ以上であることが更に好ましい。上記濃度の上限は特に限定されないが、例えば３０ｍＭ以下であることが好ましく、２０ｍＭ以下であることがより好ましい。
　フェロシアン化物は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。
〔測定方法〕
　リゾホスホリパーゼＤ活性の測定方法としては、上記フェロシアン化物の存在下で行う以外は特に限定されず、公知の方法を制限なく用いることができる。
　測定対象とされるリゾホスホリパーゼＤとしては、特に限定されないが、オートタキシン（ATX）が好ましく、ヒトオートタキシンがより好ましい。
　ヒトオートタキシンは、１９９２年Ｍ．Ｌ．Ｓｔｒａｃｋｅらによってヒト悪性黒色腫細胞株Ａ２０５８の培養上清中より、細胞運動促進活性を有する因子として単離された糖タンパク質である（J.Biol.Chem. 1992 267:2524-2529.）。
　ここで、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定は、検体や標準品中のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定方法であることが好ましい。
　検体としては、リゾホスホリパーゼＤが含有されているか、含有されている可能性が有るものである限りにおいて特に限定されない。また検体には、結果としてリゾホスホリパーゼＤが含有されない場合もある。
　検体として具体的には、体液（例えば血液、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、穿刺液又はその抽出物等）、組織（例えば生検組織又はその抽出物等）、リゾホスホリパーゼＤ溶液、培養細胞又はその抽出物、細胞培養上清等が挙げられ、血液が好ましい。
　また、検体はあらかじめ分離又は精製等の処理に供されていてもよい。例えば血液検体は分離した血清又は血漿を用いてもよい。また、後述するリゾホスホリパーゼＤ及び基質から生成される生成物に該当する化合物が検体にも含まれる場合、あらかじめ検体中からこの化合物を除去するなどの処理を行ってもよい。
　リゾホスホリパーゼＤ活性の測定は、上記リゾホスホリパーゼＤと基質とを接触させ、生成物を生成させることを含むことが好ましい。このような態様において、例えば生成物の単位時間当たりの生成量を測定することにより、リゾホスホリパーゼＤ活性を測定することができる。
　リゾホスホリパーゼＤと基質との上記接触は、液中で行われることが好ましく、ｐＨ緩衝液中で行われることがより好ましい。ｐＨ緩衝液としては、例えば、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、又は、ＴＡＰＳ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ、等のグッド緩衝剤、その他化学的に緩衝剤として用いられる化合物を含む緩衝液等が挙げられる。
　上記接触時の液のｐＨは特に限定されないが、例えばｐＨ６．０～１１．０が挙げられる。
　基質としては、特に限定されず、リゾホスホリパーゼＤの基質であればよいが、リゾホスホリパーゼＤの基質であるリゾホスファチジン酸エステルが好ましく、リゾホスファチジルコリン、又は、リゾホスファチジルグリセロールがより好ましく、リゾホスファチジルコリンが更に好ましい。
　また、リゾホスホリパーゼＤの基質として、例えばリゾホスホリパーゼＤの作用により切断されて、切断後に蛍光を発する化合物など、蛍光、発光などの機能を持たせるための標識がなされた基質を用いてもよい。
　このような標識がなされた基質としては、従来公知のものを特に限定なく用いることができるが、例えば、ＦＳ－３（Echelon Biosciences社製）等を用いることができる。
　本発明において、上記基質がリゾホスファチジルコリンであり、上記生成物がコリンであることが好ましい。
　上記リゾホスファチジルコリンとしては、下記式（ＬＰＣ－１）で表される化合物が挙げられる。

　Ｒ１及びＲ２の一方は水素原子であり、他方はアルキルカルボニル基である。上記アルキルカルボニル基の炭素数は、２～３０が好ましく、１０～２０がより好ましい。
　式（ＬＰＣ－１）で表される化合物としては、例えば、下記構造の化合物が挙げられるが、これに限定されるものではない。
 
　上記接触時の基質の濃度は特に限定されず、基質自体の溶解度、測定感度、測定の同時再現性等を考慮して決定すればよいが、例えば０．１～２０ｍＭが好ましく、０．５～１０ｍＭがより好ましい。
　基質は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。
　上記接触が液中で行われる場合、基質の溶解補助、発生する発色試薬の分散などを目的として、上記接触は界面活性剤の存在下で行ってもよい。上記界面活性剤としては、特に限定されずイオン性の界面活性剤であってもよいし非イオン性の界面活性剤であってもよいが、例えばTriton（登録商標） X-100等の非イオン性の界面活性剤が挙げられる。
　上記界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、反応液の体積に対して、例えば0.001～１．０%（w/v）であることが好ましい。本明細書において、%（w/v）とは液の体積１００ｍＬに対する化合物の含有量（ｇ）の割合を示す。
　界面活性剤は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。
　上記接触時の温度は、特に限定されず、測定したいリゾホスホリパーゼＤの至適温度付近の温度であればよいが、例えば２０～４５℃が挙げられる。
　リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において、上記生成物の生成量は、例えば酸化酵素－ペルオキシダーゼ発色系による測定により測定される。酸化酵素－ペルオキシダーゼ発色系による測定とは、上記生成物を酵素反応させて過酸化水素を発生させ、過酸化水素をペルオキシダーゼの存在下で発色試薬と反応させて比色定量する方法である。
　発色の程度（例えば、吸光度として測定される）は生成物の濃度に依存するため、発色の程度から生成物の濃度、及び、生成物の量を定量できる。
　生成物を直接酸化して過酸化水素を発生させる反応を触媒する適当な酵素がない場合、生成物を、過酸化水素を発生可能な基質に変化させうる反応を触媒する酵素（複数の段階により生成物を上記基質に変化させてもよい）と、酸化酵素とを組み合わせた共役反応を適宜設計することにより、測定対象物質の量を測定することも可能である。
　例えば、基質がリゾホスファチジルグリセロールであり、生成物がグリセロールである場合、グリセロールをグリセロールキナーゼ及びＡＴＰ（アデノシン三リン酸）によりグリセロール－３－リン酸に変換した後に、酸化酵素であるグリセロール－３－リン酸オキシダーゼにより過酸化水素を発生させてもよい。
　すなわち、本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法における上記接触時に、生成物の酸化酵素、発色試薬、及び、ペルオキシダーゼを含む態様が好ましい。
　発色試薬としては、トリンダー試薬等の水素供与体とそのカップラーとの組み合わせ、ニトロテトラゾリウムブルー等の水素受容体とそのカップラーとの組み合わせ、１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３，７－ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンナトリウム等のロイコ色素のように単体で発色する化合物などを用いることができる。
　例えば、本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法における上記接触時に、生成物の酸化酵素、トリンダー試薬、トリンダー試薬のカップラー、及び、ペルオキシダーゼを含む態様が好ましく挙げられる。
　上記生成物の酸化酵素としては、特に限定されず、生成物の種類によって選択すればよい。
　例えば生成物がコリンである場合、コリンオキシダーゼが挙げられる。
　上記コリンオキシダーゼは特に限定されず、コリンから過酸化水素を産生するものであればよい。例えば、Microorganism 、又は、Arthrobacter種由来のコリンオキシダーゼ等が挙げられる。
上記コリンオキシダーゼは天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。また、商業的に入手可能なものを利用することができる。
　例えば生成物がグリセロールである場合、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼが挙げられる。ただし、グリセロール－３－リン酸オキシダーゼを用いる場合、上述の通り、グリセロールからグリセロール－３－リン酸を更に生成するための酵素及び基質（例えば、グリセロールキナーゼ及びＡＴＰ）が用いられる。
　上記接触時の上記生成物の酸化酵素の濃度は、生じた生成物と反応するのに十分な濃度であればよく、測定感度、測定の同時再現性などを考慮して決定すればよいが、０．０１～２００Ｕ／ｍＬが好ましく、０．１～１００Ｕ／ｍＬがより好ましい。
　生成物の酸化酵素は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。また、生成物の酸化酵素は測定に用いられる容器（例えば、プレートのウェル）、ビーズ（例えば、樹脂ビーズ）等に固相化されていてもよい。
　上記トリンダー試薬としては、特に限定されないが、フェノールおよびその誘導体、アニリン誘導体、ナフトールおよびその誘導体、ナフチルアミンおよびその誘導体等が挙げられる。
　具体的には、トリンダー試薬としては、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メトキシアニリン（ＡＤＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピルアニリン（ＡＬＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－スルホプロピル－３－メチルアニリン（ＴＯＰＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＡＤＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＤＡＯＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメトキシアニリン（ＨＤＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３，５－ジメチルアニリン（ＭＡＯＳ）、Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メトキシアニリン（ＴＯＯＳ）、Ｎ－(３－スルホプロピル)－３－メトキシ―５－メチルアラニン（ＨＭＭＰＳ）、Ｎ，Ｎ－ビス（４－スルホブチル）－３－メチルアニリン（ＴＯＤＢ）等が挙げられる。
　上記接触時の上記トリンダー試薬の濃度は、特に限定されず、測定感度、測定の同時再現性などを考慮して決定すればよいが、０．１～２０ｍＭが好ましく、０．５～１０ｍＭがより好ましい。
　トリンダー試薬は１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。
　上記トリンダー試薬のカップラーとしては、４－アミノアンチピリン（４－ＡＡ）又はその誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、及びスルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等が挙げられ、カップラー自体の安定性の観点からは４－アミノアンチピリンが好ましい。
　上記接触時の上記トリンダー試薬のカップラーの濃度は、特に限定されず、測定感度、測定の同時再現性などを考慮して決定すればよいが、０．１～２０ｍＭが好ましく、０．５～１０ｍＭがより好ましい。
　トリンダー試薬のカップラーは１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。
　ペルオキシダーゼは特に限定されず、トリンダー試薬とトリンダー試薬のカップラーとを酸化縮合するものであればよい。例えば、西洋わさび由来、又は、細菌、カビ等の微生物由来のペルオキシダーゼ等が挙げられる。ペルオキシダーゼは天然物であっても、化学的又は生化学的に合成されたものであってもよく、遺伝子工学的に生産されたものであってもよい。また、商業的に入手可能なものを利用することができる。
　ペルオキシダーゼの濃度は、生じた過酸化水素と反応するのに十分な濃度であればよく、測定感度、測定の同時再現性などを考慮して決定すればよいが、０．０１～２００Ｕ／ｍＬが好ましく、０．１～１００Ｕ／ｍＬがより好ましい。
　ペルオキシダーゼは１種のみを用いてもよいし、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、その合計の濃度が上記範囲内であることが好ましい。また、ペルオキシダーゼは測定に用いられる容器（例えば、プレートのウェル）、ビーズ（例えば、樹脂ビーズ）等に固相化されていてもよい。
　また、上記生成物の生成量は、他の公知の方法により測定してもよい。具体的には、生成物を反応機構に含む酵素サイクリング法等により増幅して測定してもよい。
　以下、本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性方法の代表的な好ましい態様について記載するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔リゾホスホリパーゼＤ活性の測定の第一の態様〕
　本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定は、検体にフェロシアン化物と、トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーとを添加することにより行うことが好ましい。このような態様を、以下、単に「測定の第一の態様」ともいう。
　フェロシアン化物、トリンダー試薬、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、リゾホスファチジルコリン、及び、トリンダー試薬のカップラーの好ましい態様、及び、検体と混合後の各成分の好ましい濃度については、上述の通りである。
　測定の第一の態様によれば、下記反応により下記青色色素が産生される。ここで、比色法（例えば、吸光度測定等）により上記青色色素量を測定することにより、コリンの産生量を測定することができる。このコリンの産生量を反応時間で除することにより、単位時間当たりのコリンの産生量を得ることができ、検体中のリゾホスホリパーゼＤの活性測定が可能となる。
　測定の第一の態様において、リゾホスホリパーゼＤの活性測定は、例えば、検体に下記組成物１及び下記組成物２を添加することにより行うことができる。
　組成物１：トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとを含む。
　組成物２：フェロシアン化物と、リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーとを含む。
　ここで、組成物１及び組成物２は同時又は短時間内に検体に添加してもよいが、まず組成物１を添加して、一定時間の経過後に組成物２を添加することにより、検体由来のコリンを除去した後に発色（呈色）反応を行うこともできる。ここで、検体由来のコリンと組成物１中のコリンオキシダーゼとの反応により発生する過酸化水素を除去するため、例えば、組成物１には、カタラーゼ等の過酸化水素を分解するための成分を含有させてもよいし、組成物１の添加後、組成物２の添加前に、過酸化水素を除去するための成分を添加してもよい。また、試薬１により発生する過酸化水素と、試薬２の添加後にリゾホスホリパーゼＤの作用により最終的に発生する過酸化水素とでは発生タイミングが異なる。したがって、例えばリゾホスホリパーゼＤの作用により過酸化水素が発生するまでの時間を考慮することにより、試薬１により発生する過酸化水素を除去しなくとも、上記過酸化水素の影響を差し引いてリゾホスホリパーゼＤの活性を評価することもできる。例えば、組成物１の添加後に３０秒～３０分間反応させ、その後に組成物２を添加する方法が挙げられる。
　組成物１及び組成物２の詳細については後述する。
　また、測定の第一の態様において、リゾホスホリパーゼＤの活性測定は、例えば、検体にフェロシアン化物を含むリゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤、下記組成物３、及び、下記組成物４を添加することにより行うことができる。
　組成物３：トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとを含む。
　組成物４：リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーとを含む。
　ここで、上記感度向上剤、組成物３及び組成物４は同時又は短時間内に検体に添加してもよいが、まず組成物３を添加して、一定時間の経過後に組成物４を添加することにより、検体由来のコリンを除去した後に発色反応を行うこともできる。この場合、上記感度向上剤は、例えば、基質であるリゾホスファチジルコリンを含む組成物４の添加前、又は、組成物４の添加と同じタイミングで添加することができる。　例えば、組成物３の添加後に３０秒～３０分間反応させ、その後に組成物４を添加する方法が挙げられる。上記態様において、上記感度向上剤は、組成物４の添加前又は組成物４の添加と同じタイミングで添加することができる。　ここで、検体由来のコリンと組成物３中のコリンオキシダーゼとの反応により発生する過酸化水素を除去するため、例えば、組成物３には、カタラーゼ等の過酸化水素を分解するための成分を含有させてもよいし、組成物３の添加後、組成物４の添加前に、過酸化水素を分解するための成分を添加してもよい。また、試薬３により発生する過酸化水素と、試薬４の添加後にリゾホスホリパーゼＤの作用により最終的に発生する過酸化水素とでは発生タイミングが異なる。したがって、例えばリゾホスホリパーゼＤの作用により過酸化水素が発生するまでの時間を考慮することにより、試薬３により発生する過酸化水素を除去しなくとも、上記過酸化水素の影響を差し引いてリゾホスホリパーゼＤの活性を評価することもできる。
　上記感度向上剤、組成物３及び組成物４の詳細については後述する。
　また、測定の第一の態様において、リゾホスホリパーゼＤの活性測定は、例えば、検体に下記組成物５を添加することにより行うこともできる。
　組成物５：トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、フェロシアン化物と、リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーとを含む。
　このような態様においては、検体由来のコリンにより進む発色反応（発色反応１）と、検体中のリゾホスホリパーゼＤ及びリゾホスファチジルコリンから産生されるコリンにより進む発色反応（発色反応２）との２つの発色反応が進行する。しかし、検体に組成物５を添加すると、発色反応１は速やかに進行するのに対し、発色反応２の進行は、リゾホスホリパーゼＤ活性が律速となり、緩やかに進行する。このように、それぞれの発色反応による発色には時間差が存在するため、時間差を考慮することにより、検体由来のコリンによる発色の影響（すなわち、発色反応１の影響）を差し引いてリゾホスホリパーゼＤの活性を評価することも可能である。
　上記組成物５の詳細については後述する。
　また、測定の第一の態様において、他の方法により検体の前処理を行い、検体由来のコリンを事前に除去してもよい。
〔リゾホスホリパーゼＤ活性の測定の第二の態様〕
　本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定は、フェロシアン化物と、リゾホスファチジルグリセロールと、ヌクレオチド補酵素の存在下、グリセロールからそのリン酸化物を生成する正反応及びその逆反応を触媒し、上記正反応において、下記第一のヌクレオチド補酵素及び下記第二のヌクレオチド補酵素のうち一方を利用し、上記逆反応において、下記第一のヌクレオチド補酵素及び下記第二のヌクレオチド補酵素のうち上記正反応において利用されない一方を利用するグリセロールキナーゼと、第一のヌクレオチド補酵素と、第一のヌクレオチド補酵素とはヌクレオシド部分が異なる、第二のヌクレオチド補酵素とを添加することにより行うことが好ましい。このような態様を、以下、単に「測定の第二の態様」ともいう。
　測定の第二の態様によれば、下記反応により下記第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物が産生される。この第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物の量を測定することにより、グリセロールの産生量を測定することができる。このグリセロールの産生量を反応時間で除することにより、単位時間当たりのグリセロールの産生量を得ることができ、検体中のリゾホスホリパーゼＤの活性測定が可能となる。
　測定の第二の態様において、グリセロールの産生量の測定は、第一のヌクレオチド補酵素、第一のヌクレオチド補酵素の脱リン酸化物、上記第二のヌクレオチド補酵素、及び、第二のヌクレオチド補酵素のリン酸化物の１又は２以上の変化量の検出により行うことができる。
　測定の第二の態様の詳細は、特開２０１７－０３８５６９号公報に従い行うことができる。
（リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤）
　本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤（本明細書において、単に「感度向上剤」とも記載する）は、フェロシアン化物を含む。
　感度向上剤は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定のための感度向上剤であることが好ましい。
　感度向上剤は、フェロシアン化物単体であってもよいし、フェロシアン化物を含む組成物であってもよい。
　フェロシアン化物の好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるフェロシアン化物の好ましい態様と同様である。
　感度向上剤がフェロシアン化物単体である場合のフェロシアン化物の量、及び、感度向上剤が組成物である場合のフェロシアン化物の濃度は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される濃度に応じて決定すればよい。リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される濃度としては、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定において説明した濃度を参照することができる。
　感度向上剤が組成物である場合、感度向上剤はフェロシアン化物とは異なる成分として、溶剤、ｐＨ緩衝剤、その他の添加剤を更に含んでもよい。
　溶剤としては、水、水溶性有機溶剤又はこれらの混合物が挙げられ、水が好ましい。
　ｐＨ緩衝剤としては、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、又は、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝剤、その他化学的に緩衝剤として用いられる化合物が挙げられる。
　その他の添加剤としては、防腐剤、酸化防止剤、安定化剤等が挙げられる。これらの化合物としては、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されず公知の化合物を用いることができる。
（組成物）
　本発明の組成物は、フェロシアン化物と、リゾホスホリパーゼＤの基質とを含む、リゾホスホリパーゼＤの活性測定のための組成物である。
　本発明の組成物は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定のための組成物であることが好ましい。
　本発明の組成物に含まれる、フェロシアン化物、及び、リゾホスホリパーゼＤの基質の好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるフェロシアン化物、及び、リゾホスホリパーゼＤの基質の好ましい態様と同様である。
　例えば、上記リゾホスホリパーゼＤの基質は、リゾホスファチジルコリンであることが好ましい。
　本発明の組成物は、上述のトリンダー試薬のカップラー、上述のトリンダー試薬、上述のコリンオキシダーゼ、上述のペルオキシダーゼからなる群より選ばれた少なくとも１種を含んでもよい。
　これらの化合物の好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるこれらの化合物の好ましい態様と同様である。
　また、本発明の組成物は、溶剤、ｐＨ緩衝剤、その他の添加剤を更に含んでもよい。
　溶剤としては、水、水溶性有機溶剤又はこれらの混合物が挙げられ、水が好ましい。
　ｐＨ緩衝剤としては、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩緩衝剤、酢酸塩緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、又は、ＰＩＰＥＳ、ＭＥＳ、ＨＥＰＥＳ等のグッド緩衝剤、その他化学的に緩衝剤として用いられる化合物が挙げられる。
　その他の添加剤としては、防腐剤、酸化防止剤、安定化剤等が挙げられる。これらの化合物としては、本発明の効果を奏する範囲において、特に限定されず公知の化合物を用いることができる。
　また、組成物に含まれる各成分の濃度は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度に応じて決定すればよい。リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度としては、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定において説明した各成分の濃度を参照することができる。
（キット）
　本発明のキットは、上述の本発明の組成物、又は、本発明の組成物に含まれる成分を振り分けた２以上の試薬を含む。
　本発明のキットは、リゾホスホリパーゼＤの活性測定のためのキットであり、本発明のリゾホスホリパーゼＤの活性測定のためのキットであることが好ましい。
　本発明のキットは、本発明の組成物を適宜２以上の試薬（成分単体又は組成物）に振り分けた試薬キットであることが好ましい。ここで、本発明のキットは２以上の試薬を含み、本発明の組成物に含まれる全ての成分が、上記２以上の試薬のいずれかに含まれていることが好ましい。本発明の組成物に含まれるそれぞれの成分は、それぞれ分けられた複数の試薬中に重複して含まれてもよい。
　また、本発明のキットは、本発明の組成物を含んでもよい。例えば、本発明のキットは、フェロシアン化物と、リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーと、トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとを含む組成物を含むキットであることも好ましい。ここで、このようなキットは、上記組成物である１試薬のみを含むキットであってもよい。
　ここで、本発明のキットは、コリンオキシダーゼを少なくとも含み、発色のために必要な化合物のうち少なくとも１種を実質的に含有しない試薬と、上記試薬には実質的に含まれない発色のために必要な化合物を含有する試薬とを含むことも好ましい。
　例えば、本発明のキットは、コリンオキシダーゼを少なくとも含み、トリンダー試薬のカップラーを実質的に含有しない試薬（試薬１）と、トリンダー試薬のカップラーを含有する試薬（試薬２）とを含むことも好ましい。
　フェロシアン化物、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬は試薬１と試薬２のいずれかに含まれていてもよいし、両方に含まれていてもよいし、更に別の試薬に含まれていてもよい。更に別の試薬に含まれる場合、フェロシアン化物、ペルオキシダーゼ及びトリンダー試薬は複数の試薬に振り分けられていてもよいし、同一の試薬に含まれていてもよい。
　ただし、試薬の保管中等に発色反応が進行してしまうことを防ぐ等の目的のため、１つの試薬中にトリンダー試薬及びトリンダー試薬のカップラーを含む態様については避けることもできる。特に、トリンダー試薬、トリンダー試薬のカップラー及びペルオキシダーゼを全て含む態様については避けることもできる。
　本発明において、実質的に含有しないとは、含有量が１μＭ以下であることをいい、含有量が０．１μＭ以下であることが好ましく、０．０１μＭ以下であることがより好ましい。含有量の下限は限定されず、０μＭ以上であればよい。
　このような態様によれば、まずは試薬１を検体に添加することにより、トリンダー試薬のカップラーが存在せず発色反応が進行しない条件下で検体中のコリンをコリンオキシダーゼにより分解、除去した後に、試薬２を添加することで発色反応を進行させることができる。
　また、上記検体中のコリン及びコリンオキシダーゼにより発生する過酸化水素を除去するため、試薬１の添加から試薬２の添加までの時間を空けてもよいし、試薬１はカタラーゼ等の過酸化水素を除去するための化合物を更に含有してもよい。
　本発明のキットの具体的な態様を以下に示すが、本発明のキットはこれらに限定されない。例えば後述の組成物１を、更にトリンダー試薬を含む試薬と、コリンオキシダーゼ及びペルオキシダーゼを含む試薬との２つに分けるなど、組成物を複数の試薬に更に分けてもよい。また、後述の組成物２を、フェロシアン化物を含む試薬と、リゾホスファチジルコリン及びトリンダー試薬のカップラーとを含む試薬との２つに分けるなど、組成物を複数の試薬に更に分けてもよい。
〔キットの第一の態様〕
　本発明のキットは、下記組成物１及び下記組成物２を含むことが好ましい。
　組成物１：トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとを含む。
　組成物２：フェロシアン化物と、リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーとを含む。
　組成物１及び組成物２を用いたリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法の好ましい態様は、上述の測定の第一の態様に記載した通りである。
－組成物１－
　組成物１におけるトリンダー試薬、コリンオキシダーゼ、及び、ペルオキシダーゼの好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるこれらの化合物の好ましい態様と同様である。
　組成物１は、溶剤、ｐＨ緩衝剤、その他の添加剤を更に含んでもよい。これらの化合物の好ましい態様は、上述の本発明の組成物におけるこれらの好ましい態様と同様である。
　また、組成物１に含まれる各成分の濃度は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度に応じて決定すればよい。リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度としては、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定において説明した各成分の濃度を参照することができる。
－組成物２－
　組成物２におけるフェロシアン化物、リゾホスファチジルコリン、及び、トリンダー試薬のカップラーの好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるこれらの化合物の好ましい態様と同様である。
　組成物２は、溶剤、ｐＨ緩衝剤、その他の添加剤を更に含んでもよい。これらの化合物の好ましい態様は、上述の本発明の組成物におけるこれらの好ましい態様と同様である。
　また、組成物２に含まれる各成分の濃度は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度に応じて決定すればよい。リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度としては、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定において説明した各成分の濃度を参照することができる。
〔キットの第二の態様〕
　本発明のキットは、本発明の感度向上剤、下記組成物３及び下記組成物４を含むことが好ましい。
　組成物３：トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼとを含む。
　組成物４：リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーとを含む。
　組成物３及び組成物４を用いたリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法の好ましい態様は、上述の測定の第一の態様に記載した通りである。
－組成物３－
　組成物３におけるトリンダー試薬、コリンオキシダーゼ、及び、ペルオキシダーゼの好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるこれらの化合物の好ましい態様と同様である。
　組成物３は、溶剤、ｐＨ緩衝剤、その他の添加剤を更に含んでもよい。これらの化合物の好ましい態様は、上述の本発明の組成物におけるこれらの好ましい態様と同様である。
　また、組成物３に含まれる各成分の濃度は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度に応じて決定すればよい。リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度としては、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定において説明した各成分の濃度を参照することができる。
－組成物４－
　組成物４におけるリゾホスファチジルコリン、及び、トリンダー試薬の好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるこれらの化合物の好ましい態様と同様である。
　組成物４は、溶剤、ｐＨ緩衝剤、その他の添加剤を更に含んでもよい。これらの化合物の好ましい態様は、上述の本発明の組成物におけるこれらの好ましい態様と同様である。
　また、組成物４に含まれる各成分の濃度は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度に応じて決定すればよい。リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度としては、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定において説明した各成分の濃度を参照することができる。
〔キットの第三の態様〕
　本発明のキットは、下記組成物５を含むことも好ましい。
　組成物５：トリンダー試薬と、コリンオキシダーゼと、ペルオキシダーゼと、フェロシアン化物と、リゾホスファチジルコリンと、トリンダー試薬のカップラーとを含む。
　組成物５を用いたリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法の好ましい態様は、上述の測定の第一の態様に記載した通りである。
－組成物５－
　組成物１におけるトリンダー試薬、コリンオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェロシアン化物、リゾホスファチジルコリン、及び、トリンダー試薬のカップラーの好ましい態様は、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性測定方法におけるこれらの化合物の好ましい態様と同様である。
　組成物５は、溶剤、ｐＨ緩衝剤、その他の添加剤を更に含んでもよい。これらの化合物の好ましい態様は、上述の本発明の組成物におけるこれらの好ましい態様と同様である。
　また、組成物５に含まれる各成分の濃度は、リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度に応じて決定すればよい。リゾホスホリパーゼＤ活性の測定において使用される各成分の濃度としては、上述の本発明のリゾホスホリパーゼＤ活性の測定において説明した各成分の濃度を参照することができる。
　また、本発明の組成物又は本発明のキットは、検体測定装置に組み込まれていてもよい。
　このような装置としては、例えば、体液（例えば血液、尿、脳脊髄液、胸水、腹水、穿刺液又はその抽出物等）、組織（例えば生検組織又はその抽出物等）、リゾホスホリパーゼＤ溶液、培養細胞又はその抽出物、細胞培養上清等を検体として、本発明の組成物又は本発明のキットによりリゾホスホリパーゼＤ活性を測定するシステムを備えた装置が挙げられる。
　例えば、上記体液を臨床検体として、自己血糖測定器のようにリゾホスホリパーゼＤ活性を測定する装置であってもよい。すなわち、ＰＯＣＴ（Point-of-Care Testing）すなわち、診療、看護などの医療現場での臨床検査に用いられる装置であってもよい。
　また、装置は検体採取システム、及び、検体処理システムを備えた装置であってもよい。
　以下に実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。以下の実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り、適宜、変更することができる。従って、本発明の範囲は以下に示す具体例に限定されるものではない。
（比較例1および実施例１～8：ATXが有するリゾホスホリパーゼＤの活性測定におけるフェロシアン化カリウムによる感度向上効果の検証）
　ATXのリゾホスホリパーゼＤ活性の測定におけるフェロシアン化カリウムによる感度向上効果を検証した。測定試薬は、100mMのTris-HCl（pH9.0）、5mMの塩化マグネシウム・六水和物（富士フイルム和光純薬）、0.05%（w/v）のTritonX-100（富士フイルム和光純薬）、1mMのミリストイルリゾホスファチジルコリン（旭化成ファーマ）、2mMの4-アミノアンチピリン（ワコーケミカル）、1mMのTOPS（N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3-methylaniline, sodium salt, monohydrate、同仁化学）、2U/mLのコリンオキシダーゼ（旭化成ファーマ）、及び、10U/mLのペルオキシダーゼ（TOYOBO）をベースとし、各実施例又は比較例において、それぞれ、下記表1に示す濃度となるようにフェロシアン化カリウム（富士フイルム和光純薬）を含有させたもの70μLをそれぞれ用いた。プール血清に組み換え体のATX（旭化成ファーマ、ヒトオートタキシンβアイソフォーム）を添加したもの7μLを測定対象とし、上記測定試薬により自動分析装置JCA-BM9130（日本電子）を用いて、測光波長を545nm、分析条件をRRA（initial reaction rate assay）とし、測定開始後2～7分の吸光度変化（ΔE/min）を測定した。ATXの酵素活性はJ. Cell Biol., 158, 227－233 (2002)に基づき、37℃にて基質であるミリストイルリゾホスファチジルコリンから1分間に1μmolのコリンを産生する活性を1Uと定義した。測定結果を表1に示す。表中、感度は試料の測定感度から生理食塩水の測定感度を差し引いたものであり、「vs 0mM」はフェロシアン化カリウムを含有しない場合（比較例1）の感度を100％とした相対値である。
　表１に記載された結果から、ATXのリゾホスホリパーゼD活性測定において、フェロシアン化カリウムを共存させることにより感度 が1.5倍以上と大幅に向上することが判った（比較例１、実施例1－8）。
（比較例2および実施例9－16：ATXが有するリゾホスホリパーゼＤの活性測定におけるフェロシアン化カリウムによる同時再現性の改善効果の検証）
　比較例1および実施例１－8と同様の方法により同一検体を5回測定し、フェロシアン化カリウムによる同時再現性の改善効果を変動係数CV(%)により評価した。結果を表2に示す。
　同時再現性は同じ検体を短時間で繰り返し測定した際に、測定結果がどの程度ばらつくかの指標であり、検査薬における基本的な性能の一つである。汎用自動分析装置用試薬として、通常同一検体を5回測定した際の変動係数（CV%）は10%以下であることが好ましいといえる。また上記CVは小さいほど同時再現性に優れ、好ましいといえる。表2より、フェロシアン化カリウムを用いずにATXの酵素活性を測定した場合の変動係数は16.2%であり同時再現性が低かった（比較例２）。一方、フェロシアン化カリウムの共存下でATXの酵素活性を測定した場合、フェロシアン化カリウム0.005mM以上でCVは10%以下となり同時再現性の改善がみられた。フェロシアン化カリウム0.1mM以上では、CVは5%以下となり特に有用であることが判った。
（比較例３および実施例１７～１８： ATXが有するリゾホスホリパーゼＤの活性測定におけるフェロシアン化ナトリウムによる感度向上効果の検証）
　ATXのリゾホスホリパーゼＤ活性の測定におけるフェロシアン化ナトリウムによる感度向上効果を検証した。比較例３および実施例１７～１８においては、フェロシアン化カリウムの代わりに表３に記載の濃度となるようにフェロシアン化ナトリウム（富士フイルム和光純薬（株）製）を含有させたもの70μLをそれぞれ用いた以外は、実施例１と同様の方法により測定をした。
　測定結果を表３に示す。表中、感度は試料の測定感度から生理食塩水の測定感度を差し引いたものであり、「vs 0mM」はフェロシアン化ナトリウムを含有しない場合（比較例３）の感度を100％とした相対値である。
　表３に記載された結果から、ATXのリゾホスホリパーゼD活性の測定において、フェロシアン化ナトリウムを共存させることにより感度が1.5倍以上と大幅に向上することが判った（比較例３、実施例１７、１８）。
（比較例４および実施例１９－２１：組成物の各成分を２試薬に振り分けた場合の感度向上効果についての検証）
　測定試薬は、表４の濃度で調製を行った。測定に用いる試薬量は、比較例４、実施例１９では100μL、実施例２０では試薬3を50μL、試薬4を50μLの計100μLとした。実施例２０では、最終的な各成分濃度を実施例１９と合わせる為、試薬3及び試薬4の一方にのみ含まれる試薬であるコリンオキシダーゼ、TOPS、ペルオキシダーゼ、4-アミノアンチピリン、ミリストイルリゾホスファチジルコリンの濃度を実施例１９の試薬２における濃度の2倍とした。プール血清に組み換え体のATX（旭化成ファーマ、ヒトオートタキシンβアイソフォーム）を添加したもの10μLを測定対象とし、上記測定試薬により自動分析装置JCA-BM9130（日本電子（株）製）を用いて、測光波長を545nm、分析条件をRRA（initial reaction rate assay）とし、測定開始後6～7分の吸光度変化（ΔE/min）を測定した。ATXの酵素活性はJ. Cell Biol., 158, 227－233 (2002) に基づき、37℃にて基質であるミリストイルリゾホスファチジルコリンから1分間に1μmolのコリンを産生する活性を1Uと定義した。測定結果を表５に示す。表中、感度は試料の測定感度から生理食塩水の測定感度を差し引いたものであり、「vs 0mM」はフェロシアン化カリウムを含有しない場合（比較例４）の感度を100％とした相対値である。
　表５の結果から、ATXのリゾホスホリパーゼD活性の測定において、組成物の各成分を２試薬に振り分けた場合（実施例２０）においても、1試薬に含む場合（実施例１９）と同様、フェロシアン化物による感度向上が認められた。（比較例４、実施例１９、２０）。

Claims (11)

  1. 　フェロシアン化物の存在下で、リゾホスホリパーゼＤが有するリゾホスホリパーゼＤ活性を測定することを含む、リゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
  2. 　前記フェロシアン化物が、フェロシアン化カリウム又はフェロシアン化ナトリウムである、請求項１に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
  3. 　前記測定が、前記リゾホスホリパーゼＤと基質とを接触させ、生成物を生成させることを含む、請求項１又は２に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
  4. 　前記基質がリゾホスファチジルコリンであり、前記生成物がコリンである、請求項３に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
  5. 　前記リゾホスホリパーゼＤがオートタキシンである、請求項１又は２に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
  6. 　前記リゾホスホリパーゼＤ活性の測定における前記フェロシアン化物の濃度が０．００５ｍｍｏｌ／ｌ以上である、請求項１又は２に記載のリゾホスホリパーゼＤの活性測定方法。
  7. 　フェロシアン化物を含む
    　リゾホスホリパーゼＤ活性測定用感度向上剤。
  8. 　フェロシアン化物と、リゾホスホリパーゼＤの基質とを含む、
    　リゾホスホリパーゼＤの活性測定のための組成物。
  9. 　前記基質がリゾホスファチジルコリンである、請求項８に記載の組成物。
  10. 　前記活性測定における前記フェロシアン化物の濃度が０．００５ｍｍｏｌ／ｌ以上である、請求項８又は９に記載の組成物。
  11. 　請求項８又は９に記載の組成物、又は、前記組成物に含まれる成分を振り分けた２以上の試薬を含む、リゾホスホリパーゼＤの活性測定のためのキット。
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