JPS59140899A - オキシダ−ゼによる基質の新規定量法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は基質定量方法に関□する。更には臨床化学検査
等に於ける、血液成分等を基質と、する酵素反応利用の
定量方法に関する。

酵素就中オキシダーゼによる基質定量方法では１、その
酵素反応で生成するものは、水であり、炭酸ガスであり
、過酸化水素であるが、近来その生成過酸化水素を測定
して、基質の定量を行うことは、酵素に先天的な特異性
が即ち定量性であるという極めて常識的な生化学の智識
によって、広い実用性を獲得した。これにより従前の化
学的定蓋法が、定−性を保持するには種々の工夫が要る
こと、薬なっていることは周知である。面も尚、近来の
酵素法が、十分満足できるものであるとは限らない。

これらのことを、コレステロールの定量を例として述べ
れば次の通りである。

コレステロールの増加ヲ高コレステロール血症、減少を
低コレステロール血症というが、前者はネフローゼ症候
群、重症糖尿病、甲状腺機能低下□ 能冗進症等にみられ、コレステロールの定量は、臨床化
学検査の分野で必須の試験項目である。一般に。リーベ
ルマン・プルクハルト反応やキリアニイ反応を、比色反
応に用いたザク・ヘンリイ変法とかズヤヨウォキー法が
□あったが、：ｌ’ｖ氷テ。−ルヲ、△４−コレステノ
ンと過酸化水素とに酸□化する酵素と、生成過酸化水素
を測定する試薬との組合せが提唱されたあと、方法の主
流はこの酵素法へ完全に移った。しかしこれが酵素法も
体液中の還元性物質の影響を回避できず、改良が提案′
キれねばならず、また感度が充分でなく、より高波長側
で発色する被酸化性呈色試薬を使う方法への改本発明者
らは、各種基質に対する夫々特異のオな最終生成ｉを単
純に産生ずるという従来の知識に疑問をもち、これら酵
素反応を深く解析すれば結果その洞察の正しいことを証
明することを得、本発明を完成した。即ち体液成分等の
種々の基質とそれら基質に夫々特異性を示すオキシダー
ゼとの組合せにつき、本発明者らをグループに分けて相
互に着想を交換し、研究を協同し、参人全く同様に、こ
れら基質に対し夫々のオキシダーゼが酵素反応をなすと
き、スーパーオキサイドイオンが定量的に生成、あらた
めて次の段階を経てこれが例えば過酸化水素に変換して
行くことを確認し、スーパーオキサイドイオンを測定す
る、基質の新規にして有用な実用的定量方法を完成した
。

スーパーオキサイドイオンは、被還元性試薬を以てすれ
ば真に容易であり普≠的である。被還元性□呈色試薬を
適宜に選ぶことによって、体液中に存在する還元力率さ
いビリルビン、アスコルビン酸等の影響が生じないのは
ひとつの利点である。

また高感度で且つ長波長側で発色する被還元性試薬を、
自由に選定使用できることはいまひとつの利点である。

従来遅ゝ速の差はあるにしても、スーパーオキサイドイ
オンは過酸化水素へ変化し、この変化は血清中に通常（
溶血しない限り、血清中の量は微量であるが）存在する
スーパーオキサイドジスムターゼによって促進されると
されている。本発明のいまひとつの重要な点は、過酸化
水素へのコースである。これはＳＨ基をもつ化合物即ち
チオール化合物を以てするものであり、このチオール化
合物の合目的々効果を、フェノール類（ナフトール類を
含む、以下同様）またはアミン類の添加で更に助長して
、還元反応を促進することである。且つパーオキシダー
ゼを共存させることにより、本発明方法の定量性が充分
に満足できるものになることも確認された。

即ち本発明方法及び試薬は、基質に夫々その基質に特異
性をもつオキシダーゼを作用させ、その酵素反応で定量
的に生成するスーパーオキサイドイオンを捉え、その還
元性を利用して基質を定量するものであるが、パーオキ
シダーゼ、アミン類またはフェノール類、及びＳＨ基を
もつ化合物を共存させることによって、測定時間、感度
、定量性などを、実用に当って要求される水準へ充分に
対応させたものである。

更に本発明者らは、試薬及び反応系に於いて、チオール
化合物等の添加剤の、またはおそらくは測定時の反応の
好ましくない副反応である、自動酸化を除去する為に、
キレート剤を共存させて、所望の反応を安定に進行させ
る方法を見出した。

即し本発明方法及び試薬は、更に、童歌対象であル基質
に特異なオキシダーゼ、パーオキシダーゼ、アミン類ま
たはフェノール類、チオール化合物、及びキレート剤を
共存させるものである。

０．１モル・トリス緩衝液（Ｐ　Ｈ８，０）に、チトク
ロームＣ７！ｌ（２，５Ｘ　１０−５モルに、コレステ
ロールオキシダーゼが１５単位／　ｄｔに、パーオキシ
ダーゼが６００単位／　ｄｔに、フェノールが０．１％
になるように溶解、これに同じ緩衝液にグルタチオン、
（還元型）０．８％溶解した液を加え、この両液の混液
にコレステロール２００　ｗ　／　ｄｌを含むイソプロ
パツールを添加、３７℃で例えば１０分間インキュベー
トする。チトクロームＣが発色し、波長５５０　ｎｍの
吸光度は試薬盲検を対照１こ（即ち０、Ｄ、　（−Ｂ　
ｔ）は）０．１０をポす。コレステロールのインプロパ
ツール溶液の代りに、口重のインプロパツールのみを与
える場合、チトクロームＣ（７）発色はない。また被還
元性呈色試薬に２．２′−ジ（４−ニトロフェニル）　
−５，５’−ジフェニル−３゜３’−（３，３’−ジメ
トキシ−４，４′−ジフェニレン）ジテトラゾリウム＝
クロイド（以下ニトロ　ＴＢという）を用いても同様で
ある。且つこれらの呈色は、スーパーオキサイドイオン
に特異的に作用する、スーパーオキサイドジスムターゼ
を大歌に存在させることによって阻害を認める。促ち本
発峰 曇の呈色は、スーパーオキサイドイオンの還元作用によ
ることが確認されるのである。

オキシダーゼは酸化酵素であり、基質毎に特異的にその
オキシダーゼが存在する。グルコースに対してはグルコ
ースオキじダーゼ、コレステ・ロールに対してはコレス
テロールオキシダーゼといつた具合であることは周知で
あり、パーオキシダーゼと同様に、それらを産生ずる生
物体から収得されて市販され、使用されていることも周
知であり、これらを夫々使用すれば良い。

アミン類は通常の有機アミンが使用される。脂肪族アミ
ンに比べて芳香族アミンが１５、使用最少くても効果が
ある。−級、二級、三級を問わない。

実用に当っては、アニリン、Ｎ−エチルアニリン、Ｎ、
Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ、Ｎ−ジエチルアニリン、Ｎ
、Ｎ−ジエチル−ｍ−）ルイジン、Ｎ−エチル−Ｎ−β
−ヒドロキシエチル−ｍ−トルイジン０００１％〜０．
２−程度存在するように添加すれば良い。　− フェノール類も特に他の置換−基によって支障を生スる
ということはない。フェノール、クロロフェノール類、
ジクロロフェノール類、ナフトールスルホン酸類なと、
入手し易い安価なものを適宜選んで使用すれば良く、多
くの場合呈色の段階で、反応液中０．０００１９６〜０
．２チ程度存在するように用いれば良い。

フェノール類とアミン類とを併用することも、また例え
ば１−　Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノ−４−ナフ（ トールとか、４−　Ｎ、Ｎ−ジーチルサリチル酸のよう
に、一つの化合物がフェノール類でもあり、アミン類で
もある化合物を使用することもできる。

但し基質がアミンとかし一アミム酸などで、オキシダー
ゼが夫々アミンオキシダーゼとかＬ−アミノ酸オキシダ
ーゼなどである場合、アミン類でなくフェノール類を用
いることは当然である。

チオール化合物についても特に制限はなく、還元型グル
タチオン、チオグリコール酸、メルカプトエタノール、
チオサリチル酸、システアミン、システィン、ジメルカ
プトコハク酸などが例示され、入手し易い安価なものを
適宜選んで使用すれば良く、多くの場合呈色の時点で、
反応液中１〜５０７？ｖ／　ｄｌ程度存在するように用
いれば良い。

被還元性呈色試薬としては、適当な酸化還元電位を示し
て、スーパーオキサイドイオンによって還元されて呈色
するもの、既に化学分析に於いてゾ 多数のものが使用され、ている中から、適斎に選んで使
用すれば良い。ニトロＴＢ、２−（４−ヨードフェニル
）−３−（４−二トロフェニル）−５−フェニルテトラ
ゾリウムコクロリド（以下ＩＮＴさいう）、または３−
（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェ
ニルテトラゾリウムにプロミド（ＭＴＴ）等のテトラゾ
リウム塩、チトクロームＣ１テトラニトロメタン（危険
性の故に実用は奨められない）、プラストシアニン、ブ
ループロティン等が例示できる。被還元性呈色試薬は通
常呈色の時点で、反応液中１〜４０．−ｙ’　／　ｄｉ
程度存在するように用いれば良い。テトラゾリウム類は
、従来それらが還元されて生ずるホルマザン類が水難溶
で、呈色の定量性及び機器類汚染につき問題ありとされ
ることがあったが、近時溶解性基を巧みに導入すること
により、その問題の解消が進み、本発明の実施に貢献す
るようになった。

キレート剤も、ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸）
、ＣｙＤＴＡ（トランス−７クロヘキサンジアミン四酢
酸＝トランス−１，２−シクロヘキサンジアミン−Ｎ、
Ｎ、Ｎ’　Ｎ’−テトラアセチックアシド）、ＤＴＰＡ
　（ジエチレントリアミン五酢酸＝ジエチレントリアミ
ン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ“、Ｎ“−ペンタアセチ！ノクア
Ｊド）と略称される通常周知のものを始め、極めて多数
のものがあるが、これもそれらの中から、入手し易い安
価なものを適宜選んで使用すれば良く、多くの場合呈色
の段階で、反応液中０．５〜５ミリモル／　ｄｔ程度存
在するように用いれば良い。キレート剤添加効果は、現
象的には試薬盲検値の変動が小さいという結果を招来す
る。

パーオキシダーゼは多くの場合呈色の段階の液量１こ湾
して、５０〜１０００単位／ｄｔ程度になるように用い
れば良い。

上記の各化合物を適宜に組み合せて使用する場合、呈色
を測定しようとする最終混液に、それは臨床化学分析に
ままあることで−あるが、万−濁りが生じて測定゛に支
障を来たす場合は、適宜界面活性剤乃至溶解補助剤を予
め加えて、この問題を解消する通常の手法を用いる。

またキレート剤を使用するのであるが、これは抗凝固剤
として、ヘパリン、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナト
リ、ウムと同様に使用され、別の目的で使用されている
場合もあるが、キレ−Ｉ・剤の存在は前述の通り、本発
明方法及び試薬では積極的に使用すべきものである。他
の抗凝固剤、またフッ化ナトリウムの如き解糖阻ｌｌ：
、剤の存在は、本発明方法及び試薬による呈色を全く阻
害しない。まン、ヘモグロビン、尿酸、ヒルビン酸、グ
ルコース等は、各々目的の基質に対する夫々のオキシダ
ーゼの特異性の故に、全く目的の呈色蝉を阻害しない。

実際の測定１こ当っては、適宜の媒体（通常緩衝液であ
るが）の中に於いて、被検液に、定量対象基質に特異な
オキシダーゼ、パーオキシダーゼ、アミン類またはフェ
ノール類、チオール化合物、及び被還元性呈色試薬、更
に好ましくは◆レート剤の混合を与え、インキュベート
して所望の反応たはそれらの変化を測定、被検液中の基
質を定量・する。その方法のためにオキシダーゼ以下の
添加剤乃至試薬を、一つに混合、或は幾つかの群に分け
て単独にまたは混合し、該当の基質の測定用試薬として
・組み合せ、本発明の試薬が得られる。試験中のｐＨが
７．０以上、好ましくは７．５以上になるように、試薬
の媒体乃至反応液の媒体を選んで処方する。

斯く本発明は、スーパーオキサイドイオンを測定するこ
とにより、体液成分などの基質を定量する方法と試薬と
を提供する、極めて画期的な発明であり、斯界に貢献す
る部署しいものである。以下に実施例を示すが、これら
は限定的な例示ではない。実施例中の発色試液は本発明
試薬の実施例であり、これによる測定定量が本発明方法
の実施例である。

実施例Ｌ（コレステロール） ニトロＴＢが２０う／ｄｔ、第１表のグエノニル゛化合
物またはアミン化合物が１．０６　ｍＭ／ｌ、還元型グ
ルタチオンが０．６５　ｍＭ／ｌ、パーオキシダーゼカ
３００　Ｕ／ｄｉ、コレステロールオキシダーゼが　１
　５　　Ｕ／ｄｌ、　　　）　　ＩＪ　　）　　７Ｘ　
−１００が　０．１　　ｆ／ｄｔ。

エマルゲン９２０が０．４　ｉ／ｄｔの濃度になるよう
に、”ｄ、ＩＭ・トリス緩衝液（１）　Ｈ８，０）に溶
解した発色試液と、コレステロール２００−１ｐを、イ
ソプロパツールに溶解して１００−とじた被検試液を準
備する。

被検試液５０μｔに発色試液３．０−を加え、３７℃恒
温槽中１０分間インキュベートし、夫々試薬ブランクを
対照として、−波長５６０　ｎｍに於ける吸光度を測定
する。

第１表に示す結果が得られ、本発明方法及び試薬に於け
る、フェノール類またはアミン類の添加効果が知られる
。

第１表 実施例２．（コレステロール） ニトロＴＢが２ｏη／ｄＡ、フェノール・が１．ｏ６ｍ
Ｍ／ｌ、第２表のチオール化合物が０．６５　ｍＭ／ｌ
ノ、；−オキシダーゼが３００１Ｊ／ｄｔ、コレステロ
ールオキシダーゼが１５Ｕ／ｄｔの濃度になるように、
９．１Ｍ・トリス緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）に溶解した発
色試液と、コレステロール２００　ｍｆを、インプロパ
ノニルに、溶解して１００　ｍｌとした被検試液を準備
する。

被検試液５０μｔと発色試液３．０−で、実施例１と四
伊に測定、第２表に示す結果を得、チオール（ヒ合物の
添加効果が知られる。

第２表 実施例ａ（コレステロール） ニトロＴＢが１０う／ｄｔ、フェノールが０．１チ、ト
リトンＸ−１００が０．１３チ、パーオキシダーゼ（バ
イオザイム社製）が６００Ｕ／ｄｔ、コレステロールオ
キシダーゼ（大野製薬掬製、　２．１　ｂｕ／”ｆ　）
　カ１５　Ｕ／ｄｔ、コレステロールエステラーゼ／ｄ
ｔ濃度液にしたものを第２発色試液さする。

検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはコレステロー
ルの２００　ｍｆ／ｄｔ　するインプロパツール溶液、
検体Ｃは、従来の測定法によってコレステロールの定量
値が、２８９　ｍ９７ｄｔとされた人血清であ゛る。

第１発色試液と第２発色試液とを、３７℃に予備加温し
ておき、第１発色試液４−に第２発色試液１００μｔを
混じた液を検体の数だけ作り、夫夫１５秒後に検体ＡＳ
Ｂ、及びＣを個々に２０μｔずつ添加、３７℃で各々を
正確に１ｏ分間インキユヘートし、５６０ｎｍの吸収（
０，Ｄ、５６０　）　７ｉ−測定、ｉ＠３表の結果から
、検体Ｃに含有されるコレステロールの量は、２８５ｍ
ｆＩ／ｄｔと算出される。

第３表 従来法でコレステロールの定量値が、１５５〜２８５−
ｇ／ｄｔと定量された１８検体屹つき、実施例３の試薬
を以て定量したところ、相関係数０．９２３、回帰直線
ｙ＝１．ｏｏ２ｘ−ｉ　４．５を得た。

なお、第１発色試液番とＥ　Ｄ　Ｔ　Ａ　２．５　ｍＭ
ｏ　ｌ／を添加した試液を用い、これに第２発色試液を
加えた場合の試薬ブランク（試薬盲検）　ｌ［Ｌの変化
はΔ実施例４．（アシルＣ０Ａ） ニドＩ＝ｌＴＢが１０−ｇ／ｄｔ　、　フェノールが０
．１１、パーオキシダーゼ（西洋ワサビ由来、バイオザ
イム社製）が６００Ｕ／ｄｔ、グルタチオン（還元型）
が２０　ｍｌ／ｄｔ　、アシルＣＯＡオキシダーゼ（東
洋醸造（横裂）が２４０　Ｕ　／ｄｔとなるように、０
．１Ｍ・トリス緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）に溶解して発色
試液とする。

検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはバルミトイル
Ｃ０Ａ（東洋醸造（構製、含量９３．６％）の２ｍＭ水
溶液である。

発色試液３−を２本の試験管にとり、各々に検体Ａまた
はＢを、夫□々１００μを加え、３７′″Ｇで１０分間
加温する。直ちにＡを対照にＢの吸光度を、波長５６０
　ｎｍで測定する。、また検体Ｂを蒸溜水で２倍及び４
倍に稀釈して検体Ｂ′及びＢ“とし、同様に操作して測
定する。結果は第４表であり、直線検量線が得られるこ
とが示される。

第４表 実施例＆（グルコース） ＩＮＴが１０−ｎｇ／ｄｔ、３．５−ジメトキシ−Ｎ−
エヂルーＮ−（２−ヒドロキシ−３−ノジウムスルホプ
ロピル）アニリンが０．１％、パーオキシダーゼ（バイ
オザイム社製）が６００　Ｕ／ｄｔ、グルタチオン（還
元型）が２０ｍｇ／ｄｔ１グルコースオキシダーゼ（大
野製薬掬製）が３００　ｏＴＪ／ａｚの濃度になるよう
に、０．１　Ｍ・燐酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）に溶解
して発色試液とする。

検体Ａｌｔブランクとして蒸溜水、検体Ｂはブドウ糖の
２００−ｇ／ｄｔ水溶液、検体Ｃは従来の測定法によっ
てグルコースの定量値が、１２１η１１１／ｄｔとされ
た人血清である。また検体Ｃを蒸溜水で２倍及び４倍に
稀釈して、夫々検体Ｃ′及びＣ“とする。

発色試液３−を５本の試験管に採り、各試験管３７℃で
１ｑ分間加温する。直ちにＡを対照にＢ以下の吸光度を
、波長５００　ｎｍで測定する。吸光度を第５表に示す
。

第５表 これより検体Ｃのグルコース含量は、１２０”＃／ｄｔ
と算出され、ｃ、ｃ’、及びＣ“から、検量線の直線性
が認められる。

実施例６（ピルビン酸） ニドＯＴＢが２０１ｎｆＩ／ｄｔ　、フェノールが０．
１　％、パーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が６０
０Ｕ／ｄｔ、グルタチオン（還元型）　カ１０　＝１／
ｄ４、ピルビン酸オキシダーゼ（東洋醸造（…製）が７
００Ｕ／ｄｔ、フラビンアデニンジヌクレオチドが２　
ｍｆ＠／ｄｌ−、チアミンピロホスフェートが４４　ｇ
／ｄ７゜酢酸マグネシウムが０．１５　％の濃度にな、
るように、（１，０２Ｍ・燐酸塩緩衝液（ｐＨ７，１）
に溶解して発色試液とする。

検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂはピルビン酸リ
チウムをピルビン酸として１０　ｍ９７ｄｔとなるよう
に溶解した水溶液である。

発色試液３−を２本の試験管にとり、各々に検体Ａ１並
びに検体Ｂを、夫々１００μを加え、３７“Ｃで１５分
間加温する。直ちにＡを対照ｉこしてＢの波長５６０　
ｎｍの吸光度を測定、０．０４２を得る。

実施例７　（コリン） ニトロＴＢが１０う／ｄｔ−フェノールが帆１チ、パー
オキシダーゼ（バイオザイム社製）が６００ＴＪ／ｄｚ
、チオサリチル酸が１０　ｗ／ｄｔ　、　ニア　１Ｊン
オキシダーゼ（東洋醸造■製）が５００Ｕ／ｄｔとなる
ように、０．１Ｍ・トリス緩衝１（ｐＨｓ、ｏ）に溶解
して発色試液とする。

検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体Ｂは塩化コリンの
７０−ｎｆ／ｄｔ水溶液である。検体Ｂを蒸溜水で２倍
及び４′倍に稀釈、夫々検体Ｂ′及びＢ“と発色試液３
−を４本の試験管にとり、各々に検体Ａ、Ｂ、Ｂ’、及
びＢ“を夫々２０μを加え、３７℃で１０分間加温する
。直ちにＡを対照に、Ｂ以下の吸光度を波長５６００ｍ
で測定、第６表の結果を得る。

第６表 実施例＆（グリセロール−３−燐酸） ニドＯＴＢがｉ　ｏ　ｍ１７ｄｔ　、フェノールが０．
０５チ、パーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が６０
０Ｕ／ｄｔ、グルタチオン（還元型）が２０−Ｌｊｌ”
／ｄｔ、グリセロール−３−燐酸オキシダーゼ（東洋醸
造■製）が６０　ＯＬ！／ｄｔの濃度になるように、０
．１Ｍ・トリス緩衝液＜ｐＨ８，０）に溶解して発色試
液とする。

検体Ａはブランクとして蒸溜水、検体５．Ｂはグリセロ
ール−３−燐酸の１０　ｍＭ（１７２−ｇ／ｄｌ　）水
溶液である。検体Ｂを蒸溜水で２倍及び４倍に稀釈、夫
々検体Ｂ′及びＢ＃とする。

発色試液４−を４本の試験管にとり、各３偏ｉ体Ａ、Ｂ
、Ｂ’、及びＢ＃を、夫ｈｓｏｐｔ加え、３７℃で１０
分間加温□する。直ちにＡを対照にＢ以下□の吸光度を
、波長５１ｉ　０　ｎｍで測定、第７表の結果を得る。

第７表 実施例ａ（グリセロール） □ニドＯＴＢが１０′７Ｆ＋ｆ／ｄｔ１フエノールが０
．０５チ、パーオキシダーゼ（バイオザイム社製）カ６
００ｔＪ／ｄｔ、グルタ≠オン（還元型）が２ｏｒｒＬ
Ｉ＋／ｄｔ１グリセロールオキシダーゼ（協和醗酵ｔｔ
ｔｉ）”□製）が６００／ｄｔとなるように、０．０’
５　Ｍ　−燐酸塩緩衝液（ｐ　Ｈ８，０）に溶解して発
色試液とする。

検体Ａはブランクとしての蒸溜水、検体Ｂはグる。

発色試液４−ずつを４本の試験管にとり、各々に検体Ａ
、Ｂ、Ｂ’、及びＢ“を夫々５０μを加える。３７℃で
１０分間加温し、直ちにＡを対照に、Ｂ以下の吸光度を
、波長５６Ｑｎｍで測定、第８表の結果を得る。

実施例１０．（尿酸） ニド０　’ｒ　Ｂが２０′ｒｎｆｌ／ｄｔ、フェノール
が０．１％、パニ４″″ダＩ−ｔｇ（′＜（”７４１社
製）が６°ＯＵ／ｄｔ、グルタチオン（還元型）が１０
ｍ４Ｉ／ｄｔ１ウリカーゼ（東洋紡績１横製）が３０　
Ｕ／ｄｔの濃度になるように、０．１Ｍ・トリス緩衝液
（ｐＨ７，１）に溶解して発色試液とする。

検体Ａはブランク、とじて蒸溜水、検体Ｂ、は尿酸１、
０　ｍｆｔをＩｑ６炭酸リチウム水溶液１００−に溶解
した１０−ｇ／ｄｔの溶液、検体Ｃは従来法で１２）／
ｄｔと定量された高尿酸血清である。

発色試液３ゴを２本の試験管にとり、各々に検体Ａ、Ｂ
、及びＣを夫／ｚ　６　（１ｐ　を加え、３７°ｃで１
０分間加温する。直ちにＡを対照にＢ、Ｃの吸光度を波
長５６０　ｎｍで測定、第９表の結果から、検体Ｃの本
来による尿酸含有量２１．８ｍｇ／ｄｉ　　を得た。

第９表 実施例１１．（Ｌ−乳酸） ニトロＴＢが２０−、ｇ　７’ｄｔ、フェノールが帆１
％、パーオキシダーゼ（バイオザイム社製）が６ｏＯＵ
／ｄｔ、グルタチオン（還元Ｍ　）　カ１．０−＝ｇ　
／　ｄｉ、Ｌ−乳酸オキシダーゼ（東洋醸造（割裂）が
８５Ｕ″／ｄｔとなるよう↓こ、０．１　Ｍ・トリス緩
衝液（ｐＨ７，５）に溶解して発色試液とする。

検体Ａはブランクとして蒸溜本、検体ＢはＬ−乳酸す）
　ＩＪウムの１０ｍＭ水溶液である。

分間インキュベートする。直ちにＡを対照にして１Ｂの
波長５６　Ｑ　ｎｍの吸光度を測定、ｎ、１ｉｏを得た
。

実施例１２．（コレステロール） 酸化型チトクロームＣ（ジグ−社製、タイプＪＩ［）が
３　Ｘ　１０−’モル、フェノールが０．１−、パーオ
キシダーゼ（バイオザイム社製）が６．００　Ｕ／ｄｉ
、コレステロールオキシダーゼ゛（大野製薬（…製）が
１５　ｔＪ／ａｔになるように、０．１Ｍ・トリス緩衝
液（ｐ　Ｈ８，０）に溶解した液を第１発色試液とし、
グルタチオン（還元型）を同じ緩衝液に溶解し、・８０
０　ｍｇ／ｄｔにしたものを第２発色試液とする。

検体Ａはブランクとしてインプロパツール、検体Ｂはコ
レステロールが２００−＝ｇ／ｄｔのイソプロパツール
溶液、検体Ｃはコレステロールが従来法で２３０−、ｇ
／ｄｔと定量された血清である。また検体Ｃをインプロ
パツールで２倍及び４倍に稀釈して、夫々検体Ｃ′及び
Ｃ“とする。

両発色試竺を３７℃に予備加温しておき、測定直前に第
１発色試液４ゴに、第２発色試液１００ｐｔと検体２　
、Ｏｐ　ｔを添加、３７°゛Ｃで正確に２分間加温した
後、波長５５０　ｎｍの吸収を測定する。

結果を第１０表に示す。

第１０表 コ４’ｊ）：’）、水沫による検体Ｃのコレステロール
定量１直は２３８キ１０であり、検体ｃ、ｃ’、及びＣ
″の直は直線性を示し゛ている。

特許出願人　和光純薬工業株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）基質にオキシダーゼを作用させて生成す、るスー
   パーオキサイドイオンを抑１．定する、基質の定量方法
   。 （２）スーパーオキサイドイオンの還元性を特徴する特
   許請求の範囲第１項に記載の定量方法。 （３）被還元性呈色試薬がスーパーオキサイドイオンに
   よって還元されることにより生ずる、呈色またはその変
   化を特徴する特許請求の範囲第１項又は第２項に記載の
   定量方法。 （４）　　オキシダーゼの酵素反応即ちスーパーオキサ
   イドイオンの生成、及びスーパーオキサイドイオンの被
   還元性呈色試薬に対する還元反応を、パーオキシダーゼ
   、アミン類又はフェノール、類（ナフトール類を含む）
   、及びＳＨ基をもつ化合物を特徴とする特許請求の範囲
   第１項、第２項又は第３項に記載の定量方法。 （５）　　オキシダーゼの酵素反応即ちスーパーオキサ
   イドイオンの生成、及びスーパーオキサイドイオンの被
   還元性呈色試薬に対する還元反応を、キレート剤−を存
   ぎさせて、安定に進行させる、特許請求の範囲第１項、
   第２項、第３項又は第４項に記載の定量方法。 （６）　、　、フルコース、コレステロール、りＩＪ、
   、セロール、クリセロール燐酸エステル、コリン、アｒ
   ル′・′”、−２、ｔ　−＋　７　ｚ’　−−ｔ＝　゛
   　ｖ　ｘ　ｆ　ｏ　−７’７”ｆ。 シダーゼ、グリセロールオキシダーゼ、グリセロール燐
   酸エステルオキシダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシル
   ＣＯＡオキシダーゼ、ピルビン酸オキシダーゼ、ウリカ
   ーゼ、キサンチンオキシダーゼ又は乳鍍オキシダーゼを
   組み合せて行われる、特許請求の範囲第１項、第２項、
   第′３項、第４項又は第１，５項に記載の定着方法、 ＜７）　　オキシダーゼとノ市オキシダーゼよ、ア、ミ
   ン類又はフェノール類（ナフトール類を含む）と、ＳＨ
   基をもつ化合物と、被還元性呈色試薬とを組合せて成る
   、基質の定量用試薬。 （８）　　オキシダーゼと、パーオキシダーゼと、アミ
   ン類又はフェノール類（ナフトール類を含む）と、ＳＨ
   基をもつ化合物と、キレート剤と、被還元性呈色試薬と
   を組合せて成る、基質の定量用試薬。 （９）　　ｉ　質カクルコース、コレステロール、グリ
   セロール、グリセロール燐酸エステル、コリン、アシル
   ＣＯＡ％　ピルビン酸、尿酸、キサンチン又は乳酸であ
   る場合、オキンダチ３、夫・、グー・−スオキシダーゼ
   、コレステロールオキシダーゼ、グリセロールオキシダ
   ーゼ、グリセロール燐酸エステルオキシダーゼ、コリン
   オキシダーゼ、アシルＣＯＡオキシダーゼ、ピルビン酸
   オキシダーゼ、ウリカーゼ、キサンチンオキシダーゼ又
   は乳酸オキシダーゼである、特許請求の範囲第７項又は
   第８項に記載の定量用試薬。