JPH03228699A - ビリルビン影響を回避したリパーゼ活性測定用試薬組成物 - Google Patents
ビリルビン影響を回避したリパーゼ活性測定用試薬組成物Info
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Abstract
め要約のデータは記録されません。
Description
試薬組成物であり、主に膵疾患の診断または治療効果の
判定等に利用する際、測定系のビリルビンの影響を回避
した、基質として1.2−ジグリセリドを用いてなるリ
パーゼ活性測定用試薬組成物に関する。
素を定量する方法は、エマーソン・トリシダー法が一般
的に用いられているが、この方法は酸化カップリング反
応において、還元性物質。
ンの反応系への影響が問題となっており、ビリルビンの
影響を回避する公知技術として、生体成分として例えば
、尿酸、コレステロール、トリグリセリドの測定系にフ
ェロシアン化物イオンを含有せしめた試薬組成物の報告
がある(特開昭55−138656号、特開昭56−1
55852号、特開昭59−28664号)。しかしな
がら、上記の過酸化水素定量系におけるフェロシアン化
物イオンによるビリルビン影響の回避効果が不充分であ
ることから、さらにフェロシアン化物イオンとアルブミ
ンを共存せしめることによりビリルビンの影響を相乗的
に回避する方法が報告され(特開昭60−228963
号)、さらに過酸化水素定量系に鉄錯体を添加したビリ
ルビン影響の回避方法の報告(特開平1−109260
号)がある。
る例えば尿酸、コレステロール、トリグリセリド等の測
定系にビリルビン影響回避の目的でフェロシアン化物イ
オンや鉄錯体を添加することが知られているものの、そ
の効果が不充分であることからさらに過酸化水素定量系
のビリルビン影響回避の効果を改善するに当たってはア
ルブミンの共存が必要であることが知られているが、本
発明のように、生体内の主に膵疾患の診断等に有用であ
る1、2−ジグリセリド、非イオン性界面活性剤、モノ
グリセリドリパーゼ、グリセロールキナーゼ、グリセロ
リン酸オキシダーゼ等に基づくリパーゼ活性測定の目的
において、さらにこの測定系の中ヘビリルビン影響を回
避するための手段を組み込んだリパーゼ活性測定用の試
薬組成物は未だ報告されていない。
ず天然または合成基質である1、2−ジグリセリドが非
イオン性界面活性剤を用いることにより水に可溶化し、
得られる組成物が安定に長期間保存でき、かつ水可溶化
の形態であるために分光学的な測定方法にも使用でき、
再現性の良好なリパーゼ活性測定用としての基質組成物
であることを見出しく特開昭59−91898号)、さ
らに1.2−ジグリセリドの分解物であるモノグリセリ
ドからグリセロールへの分解反応が律速である点を解消
して迅速な測定をする目的で、モノグリセリドに特に強
く作用するモノグリセリドリパーゼを見出した(特開昭
63−245672号)。次いで本発明に至っては、基
質である1、2−ジグリセリドにこれら非イオン性界面
活性剤、・モノグリセリドリパーゼやグリセロールキナ
ーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ水素供与体とそのカ
プラー、パーオキシダーゼ等を添加せしめ、さらに測定
系における過酸化水素定量系でのビリルビン影響を回避
するために鉄錯体である例えばフェロシアン化物イオン
やエチレンジアミン四酢酸鉄(EDTA−Fe)イオン
を添加した組成物を作製することにより、アルブミンの
共存によるビリルビン影響回避の改善効果を何ら必要と
することなく、この鉄錯体により測定系における生体内
ビリルビン影響を良好に回避することを可能とした有用
なリパーゼ活性測定用試薬組成物(以下、本発明組成物
ということがある)を見出した。
少なくとも1,2−ジグリセリド、モノグリセリドリパ
ーゼ、非イオン性界面活性剤、グリセロールキナーゼ、
グリセロリン酸オキシダーゼ。
するものであり、その目的はリパーゼ活性系におけるビ
リルビン影響を効率良く回避せしめる組成物を提供する
ことである。
ず測定対象成分である検体中のリパーゼは、非イオン性
界面活性剤により水に可溶化され種々の点で好ましい状
態の天然または合成基質である1、2−ジグリセリドに
作用してモノグリセリドを遊離し、これをモノグリセリ
ドに特に強く作用するモノグリセリドリパーゼにより迅
速にグリセロールと脂肪酸に分離し、このグリセロール
をグリセロールキナーゼでリン酸化し、さらにグリセロ
リン酸からグリセロリン酸オキシダーゼの作用により過
酸化水素を生成する。このようにして生成された過酸化
水素を水素供与体とそのカプラーである例えばフェノー
ル類またはアニリン誘導体と4−アミノアンチピリン、
及びパーオキシダーセ゛を用いて比色定置するが、この
反応系において生体成分中のビリルビンの影響のために
正確な測定が行われないことを回避する目的で、鉄錯体
であるフェロシアン化物イオン等あるいはEDTAFe
イオン等を含有せしめたリパーゼ活性測定用試薬を提供
するものである。
濃度について詳細に説明する。
イオンを用いるのが好ましく、例えばフェロシアン化ナ
トリウム、またはフェロシアン化カリウムのようなアル
カリ金属塩、並びにフェロシアン化物イオンを含有また
は放出することのできるその他の塩等のフェシアン化物
イオン源が挙げられる。またその他の鉄錯体として、例
えばEDTA−Feイオンについては、EDTA−Fe
ナトリウムやEDTA−FeカリウムのようなEDTA
−Feイオンを含有または放出することができるその他
の塩等のEDTA−Feイオン源が挙げられる。またそ
の他にもニトリロ三酢酸、エチレンジアミンニ酢酸5エ
チレンジアミンニプロピオン酸、ヒドロキシエチルエチ
レンジアミン三酢酸、ジアミノプロパン四酢酸、グリコ
ールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ
ニ酢酸、イミノニ酢酸、ニトリロニ酢酸プロピオン酸、
エチレンジアミンスルホン酸、グリコン酸エチレンジア
ミン ジヒドロキシエチルグリシントランス−シクロヘ
キサンジアミン四酢酸等の鉄錯体を挙げることができ、
またこれらの例示した化合物に限らず、鉄と錯体を形成
しうるちのであれば本発明に有効に用いることができる
。
アン化物イオンを用いる場合の濃度は、1 nmole
/ m 1未満であるとビリルビン影響を完全に回避す
ることができず、また15nIIO1eノIlNを越え
る濃度であると試薬ブランク値が上昇するために正誤差
の原因となり試薬性能を損ない測定感度が低下するので
、これらの好ましい使用濃度は1nIIlole/ m
ff1〜15nmole/ sj!の範囲となる。同様
に鉄錯体としてEDTA−Feイオン等を用いる場合の
濃度は、10nmole/ m j! 〜25On+*
ole/m lの範囲である。
としては、下記一般式(1) %式% [1) (ただし、R1およびR2は同一または異なって炭素数
12以上の高級脂肪酸基を示す)で表される天然または
合成の化合物である。
る高級脂肪酸基としての構成因子である高級脂肪酸は炭
素数12以上の高級脂肪酸であればよく、例えば、ラウ
リン酸(C+□。)、トリデシレン酸(C,3,。)、
ミリスチン酸(C1a +。)、ペンタデシレン酸(C
I5+。)、−パルミチン酸(C2゜:0)、マーガリ
ン酸(C,□、。)、ステアリン酸(C+s+o)、ノ
ナデシレン酸(C11,。)、アラキン酸(CZ。、。
:。)等の飽和高級脂肪酸やパルミトオレイン酸(CI
6+1) 、9−オクタデセン酸(C1:1;オレイン
酸)、11−オクタデセン酸(CIlllliバクセン
酸)、l、2−オクタデセン酸(c+g++)、9−ア
イコセン酸(CZ。、、) 、11− トコセン酸(C
tt:1> 、13− トコセン酸(Czz++iエル
カ酸)、リノール酸(C+s、z) 、リルン酸(C0
I+3)、11、14−エイコサジエン酸CCto+t
) 、8.ICl3−エイコサトリエン酸(Cz。+3
) 、5,8,11.14−エイコサトラエン酸(Cz
。、4;アラキドン酸)等の不飽和高級脂肪酸が挙げら
れる。このR1およびR。
肪酸となすことにより得られる組成物の透明度がよく、
好ましいもので炭素数16以上の不飽和高級脂肪酸を構
成因子とする1、2−ジグリセリドが好ましい。従って
、また1、2−ジグリセリドにおいてそのR1またはR
2のいずれか一方が不飽和高級脂肪酸、他方が飽和高級
脂肪酸の残基である化合物であってもよく、さらにR1
,Rzがラジール基であってもよい。特に好ましくはR
1が不飽和高級脂肪酸(C+th++、 C+s=+、
Cz。、1.Czz++、 CIIjL Cl
l13. Cg++z、 Czo:z、 Cto+
<)残基、R2が飽和高級脂肪酸(C,。。、 C,4
,。
は不飽和高級脂肪酸(C1&ll、 C−s++、 C
z。+I+C2□、、、 C11□+ C1g1L
Cl。! 2 + CM Or 2 + C2
□4)残基である1、2−ジグリセリドであり、例えば
、1−パルミトオレオイル−2−ラウロイル−グリセロ
ール、1パルミトオレオイル−2−バルミトイル−グリ
セロール、■−オレオイルー2−バルミトイル−グリセ
ロール、1−リルオイルー2−ラウロイルーグリセロー
ル、1−リルオイル−2−ミリストイル−グリセロール
、1−リルオイルー2−バルミトイルーグリセロール、
1−リルオイルーステアロイルーグリセロール、1−リ
ルノイルーラウロイルーグリセロール、1−リルノイル
−2−ミリストイル−グリセロール、1−リルノイルー
2−バルミトイルーグリセロール、1−リルノイルー2
−ステアロイルーグリセロール、1− (11,14−
エイコセノイル)−2ミリストイル−グリセロール、1
− (11,14−エイコセノイル)−2−バルミトイ
ル−グリセロール、l(8,11,14,17−ニイコ
サテトラエノイル)−2−ラウロイル−グリセロール、
1− (8,11,14,17−ニイコサテトラエノイ
ル)−2−バルミトイル−グリセロール、1.2−シリ
ルオイル−グリセロール、1.2−ジパルミトイル−グ
リセロール、1,2−シリルノイル−グリセロール等が
挙げられる。また、簡便な1.2−ジグリセリドを得る
に当たっては、ホスホリパーゼCとレシチンとの反応に
よって生成される1、2−ジグリセリド、ホスファチジ
ン酸ホスファターゼとホスファチジン酸との反応によっ
て生成される1、2−ジグリセリド、ホスホリパーゼD
、ホスファチジン酸ホスファターゼとレシチンとの反応
によって生成される1、2−ジグリセリドを用いてもよ
い。さらに、これらの1.2−ジグリセリドは単離、精
製することなく反応前のホスホリパーゼCとレシチンか
らなる含有物、ホスファチジン酸ホスファターゼとホス
ファチジン酸からなる含有物、ホスホリパーゼD、ホス
ファチジン酸ホスファターゼとレシチンからなる含有物
を1.2−ジグリセリドの代わりに用いてもよい。
組成物への含有量は、0.3 mM〜1.0鱈の範囲で
使用するのが好ましい。
ばポリオキシエチレン(POE)脂肪アルコールエーテ
ルとしては、例えば花王アトラス社製のEMULGEN
106(POEラウリルアルコールエーテル:HLBl
o、5)、EMLILGEN108(POEラウリルア
ルコールエーテル:HLB12.1)、EMULGEN
220(POEセチルアルコールエーテル:HL814
.2)、EMULGEN408(POEオレイルアルコ
ールエーテル:HLBlo、0)、Br1j35(po
e(23)ラウリルアルコールエーテル:HLB16.
9)、Br1j78(POE(20)アテアリルアルコ
ールエーテル:I(LB15.3)、Br1j98(P
OE120)オレイルアルコールエーテル:HLB15
.3) 、 EMULGEN340(POEステアリル
エーテル:HLB17.3)、共栄社油脂社製のノ二′
オライドAL−11(POEラウリルエーテル:HLB
14.0) 、ノニオライトAO−20(POEオレイ
ルエーテル: ズ社製のNIKl[OL BB−20(POEヘヘニル
エーテル:HLB17、0)、NIKKOL BL−9
EX.NIKKOL BO−10TX,NIKKOL
8C15TX,NIKKOL BB5 、日本エマルジ
ツン社製のエマレックスBAIO(POEブチルアルコ
ールエーテル:HLB16、9) 、エマレックスBA
15(POEブチルアルコールエーテル:HLB18.
7) 、エマレックス130 (POEセチルアルコー
ルエーテル:HLB16.0)、エマレックス100
(POEセチルアルコールエーテル:HLB14.5)
、エマレ・ノクス550(POEオレイルアルコール
エーテル:ilLB18、2)、エマレックス700
(POEラウリルアルコールエーテル:HLB16.7
) 、日本油脂社製のノニオンE−213 (POEオ
レイルアルコールエーテル:HLB13.6) 、ノニ
オンE−220 (POEオレイルアルコールエーテル
:HLB15.3)、ノニオンF−225 (POEセ
チルアルコールエ−チル:HLB16.4) 、ノニオ
ンS−215(POEステアリルアルコールエーテル:
HLB14.2) 、ノニオンT−208,5(POE
)リゾシルアルコールエーテル:HLB13.0)、
ライオン油脂社製リポノックスOCS (POEアルキ
ルエーテル:HLB15.0) 、リポノックスLCR
(POEアルキルエーテル:HL816.2) 、リポ
ノックス0(POEアルキルエーテル、HLB14.3
)等が使用できる。
Adeka to l (アデカトール)50−120
(第2級直鎖アルコールエトキシレート:HLB12.
O) 、アデカトール5o−145(第2級直鎖アルコ
ールエトキシレート:HLB14.5) 、アデカトー
ルLO−9(第1級直鎖アルコールエトキシレート:H
LB13.0) 、アデカトールLO’12(第1級直
鎖アルコールエトキシレートHLB14.O)、アデカ
トールLO−15(第1級アルコールエトキシレート1
5.0 ) 、アデカトールNP−720(ノニルフェ
ノールエトキシレー) :HLB14.(1) 、アデ
カトールNP−695(ノニルフェノールエトキシレー
ト:HLB13.O)等が使用できる。
アトラス社製のEMULGEN810 (POEオクチ
ルフェニールエーテル:HLB13.1) 、 EMU
LGEN911 (POEエノルフヱニールエーテル:
HLB13.7) 、 EMULGEN930 (P
OEノニルフェニールエーテル:HLB15.1)、E
MULGEN950 (POEノニルフェニールエーテ
ル:HLB18.2) 、共栄社油脂社製のノニオライ
トPO−9(POEオクチルフェニールエーテル:HL
B13.2) 、ノニオライトPA−15(POEアル
キルフェニールエーテル: 本エマルジョン社製のエマレックスNP45(POEア
ルキルフェノールエーテル:HLB13.2)、エマレ
ックスOP−25 (POEアルキルフェノールエーテ
ル:HLB15、8)、日本油脂社製のノニオンNS−
215(POEノニルフェノールエーテル:HLB15
.O) 、ノニオンMS−220(P0Eノニルフェノ
ールエーテル:HLB16.O) 、ノニオンHS−2
20 (POEノニルフェノールエーテル:lILB1
6.2)、ライオン油脂社製のりボノックスNCM (
POEアルキルフェノールエーテル:HL314.5)
、リポノックスNCN (POEアルキルフェノール
エーテル:)!LB14.8) 。
テル:HLB15.0) 、シェル社製のNonide
t−40(POEアルキルアリールエーテル)、ローム
アンドハス社製のTtritonX−100(1)Oe
アルキルアリールエーテル)、日光ケミカルズ社製のN
IKKOL NP−18TX,NIKKOLNP−20
,NrにKOL OP−40等が使用できる。
製のEMANON1112(POEモノラウレート:
HLB13、7) 、E?lANON4115(POE
モノオレイト:HLB13.4)、Myrj 45 (
POE (8)ステアレー) :ILBll.1)、M
yri52(POE(40)ステアレー) :HLB1
6.9)、Myri53(POE(50)ステアレート
:HLB17.9) 、共栄社油脂社製のノニオライト
S−100(POEステアレート:HLB15.6)
、ノニオライトT−40(POE )−ル油脂肪酸エス
テル:)ILBll.5)、日本エマルジョン社製のエ
マレックス202 (POEオレート:f(LaI3.
1)、エマレックス203 (POEオレート:HLB
17.6)、エマレックス800 (POEモノラウレ
ート:HLB15.8) 、ノニオンP−10 (PO
Eモノパルミテート:41LB15.7) 、ノニオン
S−10(POEモノステアート: )ILB15、2
)、ノニオンS−40 (POEモノステアレート:H
LB18、2)、日光ケミカルズ社製のMYL−to,
MYO−10等が使用できる。
アトラス社製のEMASOL1130(POEソルビタ
ンモノラウレート:l(LaI6.3)、E阿ASOL
3130 (POEソルビタンモノステアレート:HL
B14.9)、Tween20(POE(20)ソルビ
タンモノラウレート:HLB16.7) + Twee
n40 (POE (20)ソルビタンモノパルミテー
ト:HLB15.6) 、 Tween80 (PQE
(20)ソルビタンモノオレイト: HLB15、0
) 、共栄社油脂社製のノニオライトTWL−20(P
OE(20)ソルビタンモノラウレート:■LB16.
2)、ノニオライトTMS−13 (POE (13)
ソルビタンモノステアレート:HLB12.5) 、第
一工業製薬社製のSOLGEN TM01 (POI!
ソルビタンモノラウレート:HLB16.7)、SOL
GEN TM01(POEソルビタンモノオレート:H
LB15.0)、日光ケミカルズ社製のNIKKOL
TSDL−202OL(POEソルビタンオリーブ脂肪
酸:HLB16.5)、NIKKOL TLlo、NI
KKOL To−106、日本エマルジョン社製のエマ
レックスET− 2000 (POEソルビタンラウリ
レート:HLB16.6) 、日本油脂社製のノニオン
LT−221 (POEソルビタンラウリレー) :H
LB16.7) 、ノニオンST221 (POEソル
ビタンステアレート:HLB14.9) 、ノニオン0
T−221(POEソルビタンオレート:HLB15.
O) 、東邦化学工業社製の5orbon T−20(
POEソルビタンモノラウレート:HLB16.7)、
5orbon T−40(POEソルビタンモノパルミ
テート:HLB15.7)、5orbon T−80(
POEソルビタンモノオレート:HLB15.0)等が
使用できる。
王アトラス社製のAt1ox1045^(POEソルビ
トールオレイトラウレート:HLB13.2)、At1
oxl196(POEソルビトールオレイト:HLBl
l、4)、G−1045(POEソルビタールラウレー
) :HLBll、5) 、G−1441(POEソル
ビトールラノリン誘導体二肛B14) 、日光ケミカル
ズ社製のNIKKOL TSOL−102OL(POE
ソルビトールオリーブ脂肪酸エステル;HLB16.0
)、NrKKOL GL−1等が使用できる。
ては、例えば花王アトラス社製のG−1288(ヒマシ
油酸化エチレン付加物:HLB16.O)、G−129
5(POE硬化硬化ヒマ酸油酸化エチレン付加物LB1
7.5)G−1292(硬化ヒマシ油酸化エチレン付加
物:)ILBIO18)、日光ケミカルズ社製のNIK
KOL Co−60TX(POE(60)ヒマシ油:H
LB14.1)等が使用できる。
ケミカルズ社製のN[KOL TGSO215(POE
グリセリン植物油脂肪酸エステル:HLB14.O)
、 NIKKOLTGSO220(POEグリセリン植
物油脂肪酸エステル:HLB15.5)、NIKIIO
L TO3OL−2010(POEジグリセリンオリー
ブ油:HLB12.5)が使用できる。
製のG−1790,G−1795、日光ケミカルズ社製
のB−^−5等が使用できる。
ールモノ脂肪酸エステル等のPOE系非イオン性界面活
性剤、ポリオキシプロピレンブロックとPOEブロック
を有するブロック系非イオン性界面活性剤としては、例
えば旭電化工業社製のPluronic (プルロニン
ク)L121.プルロニンク(Pluronic)L1
22等が使用できる。
シー1w等の炭素数6以上の多価アルコールと、天然油
脂であるラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、イ
ソステアリン酸等の脂肪酸炭素数12以上の高級脂肪酸
とのエステルである多価アルコール系非イオン性界面活
性剤等が使用できる。
セリドとPOEアルキルアリールエーテル系界面活性剤
やアルコールエトキシレート系界面活性剤またはブロッ
ク形界面活性剤との組合せが好ましく、本発明にこれら
非イオン性界面活性剤を用いることにより、基質である
1、2−ジグリセリドを水に可溶化せしめることから、
安定に長期間保存でき、かつ水可溶化の形態であるため
に分光学的な測定方法に有効に使用でき、再現性の良好
なリパーゼ活性測定用試薬組成物を捷供できる。
程度以上、好ましくはHLBII程度以上のものを用い
ることが好ましく、二種以上の非イオン性界面活性剤を
併用してHLBIO程度以上に調製して用いてもよい。
2χの範囲で使用するのが好ましい。
として1,2−ジグリセリドから分解されたモノグリセ
リドに対して強ぐ作用しうる酵素であれば何れでもよく
、特に好ましくはバチルス ステアロサーモフィラスH
−165(FERM BP−1673)由来のモノグ
リセリドリパーゼ(特開昭63−245672号)を用
いればよい。さらに、本発明組成物への含有量は、0.
4LI/m1〜2.5U/mj2の範囲で使用するのが
好ましい。
ネシウムイオン共存下、グリセロールとアデノシン三リ
ン酸(ATP)に作用し、グリセロリン酸とADPを生
成する酵素であり、例えばストレプトマイセス属、キャ
ンシダ属、バチルス属に由来するもの等がある。これら
の本発明組成物への含有量としては、0.051J/
mll−3U/witの範囲で使用するのが好ましい。
酵素存在下、グリセロリン酸に作用し、ジヒドロキシア
セトンリン酸と過酸化水素を生成する酵素であり、例え
ば、ストレプトコツカス属、ペデイオコッカス属、アエ
ロコツカス属に由来するもの等がある。これらの本発明
組成物への含有量としては、1511/ ml−150
υ/■!の範囲で使用するのが好ましい。
と色原体に作用し、酸化カップリングを起こし、発色物
質と水を生成する酵素であり、例えば、ホースラデイツ
シュに由来するもの等がある。これらの本発明組成物へ
の含有量としては、0.25Ll/ mQ〜3υ/閤2
の範囲で使用するのが好ましい。
ーとともに色原体としてパーオキシダゼと過酸化水素の
共存下酸化カップリングを起こし、発色物質に変換する
ものであればよく、例えばフェノール類として例えばフ
ェノール、2.4−ジクロロフェノール、3.5−ジク
ロロ−2−ヒドロキンベンゼンスルホン酸、p−ヒドロ
キシベンゾエート等、また例えばアニリン誘導体として
例えばN−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホ
プロピル)1トルイジン(TOO3) 、N−エチル−
N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプロピル)1′ニリ
ン、N−エチル−N−(2−ヒドロキシ−3−スルホプ
ロピル)1−アニシジン、N−(2−ヒドロキシ−3−
スルホプロピル)−3,5ジメトキシアニリン等が好ま
しい、これら水素供与体として例示したフェノール類ま
たはアニリン誘導体の本発明組成物への含有量としては
、0.02%〜0.1χの範囲で使用するのが好ましい
。
ては、好ましくは水素供与体としてフェノール類または
アニリン誘導体を用いる場合の組み合わせとして4−ア
ミノアンチピリンであり、その他3−メチルー2−ベン
ゾチアゾリンヒドラジン、ジアミノアンチピリン、1−
(p−ジエチルアミノフェニル)−2,3−ジエチル−
4−アミノ−ピラゾン5.1−(p−アミノ−フェニル
)−2,3−ジメチル−4アミノ−ピラゾロン−5,1
−(p−アセトアミノフェニル)−2,3−ジエチル−
4−アミノ−ピラゾロン−5等を使用することができ、
これらの本発明組成物への含有量としては、0.O1%
〜0.11の範囲で使用するのが好ましい。
るための添加物として、必要に応じ、酵素、活性化剤、
保存剤、安定化剤等を適宜用いることが好ましく、例え
ば塩化カルシウムを組成物全量に対し0.5 mM〜[
1、塩化マグネシウムを0゜5 +sM〜4 mM、塩
化アンモニウムを0.5 mM〜60+M、コリパーゼ
を50/鴎2〜750/5ffi、デオキシコール酸を
611M〜151mM、ATPを0.05d〜1mM等
を適宜用いればよい。
にあたっては、上述した本発明組成物を構成する物質を
組成として1mfの試薬とし、これを検体を含む被検液
に通常5〜20μlを用い、全体量を50μl〜100
0μlとした後、好ましくは37°Cで1−10分間反
応せしめ、吸光度を測定すればよい。
当り、l液で用いても、あるいは2液以上の組成に分け
て用いても適用が可能であるが、2液に分けて測定する
のがより好ましく、また2液以上に分けて測定する場合
″、発色前液あるいは発色時液ならいずれの液に鉄錯体
を添加してもよい。尚、本発明組成物は1液で用いる場
合その系はpH〜9であり特に好ましくはPH8,2で
ある。
明は何らこれらによって限定されるものではない。
響回避への効果 〔第一試薬)pH6,8 (東洋醸造社製) グリ七ロリン酸オキシダーゼ 40、OU/ ml L コリパーゼ(東洋醸造社製) 40.OLI
/ ml” BESIl衝液・ ・N、N−ビス(2
−ヒFuキンエチル)−2−7ミノエタンスJシ参ン酸 ”L2−ジグリセリド・・精製した卵黄レシチンにホス
ホリパーゼCを作用させ て、調製した天然型基質 ′″”T OOS ・ ・ N−エチル−N−(2−
ヒドロキン−3−スルネプロビル)−一トルイシンナト
リウム 上記第一試薬にフェロシアン化カリウム(和光純薬社製
)の濃度がO〜30 nmole/ m j!となるよ
うに調製した。
”” TAPSIl衝液 ・ ・ N−トリス(ヒF
Oキシエチル)メチル−37ミノプロパンスルネン 酸 〔検体〕 (A)血清(ビリルビン濃度: 0.2+I1g/di
)(B)ビリルビン添加血清((A)+ビリルビン20
mg/dl) ビリルビン測定:”総ビリルビン]1−)IAテストワ
コー″ (和光純薬社製) 上記の第一試薬300μlに検体(A) 、 (B)を
それぞれ5μl加え、37℃で5分間反応せしめた後、
第二試薬100μlを加え第一試薬と第二試薬の混合比
率を3:1とし、さらに37°Cで反応せしめ、546
nmの波長(日立7050自動分析機)で3分目から5
分目までの1分間当りの吸光度変化を測定し、リパーゼ
活性を求めた。
に示すとうり、フェロシアン化カリウムを添加すること
により多少測定感度が変動するが、フェロシアン化カリ
ウムの添加濃度による影響はみられなかった。
図に示すとうり、フェロシアン化カリウム無添加の場合
には測定値に負の影響を与えているが、0.5nmol
e/量!以上のフェロシアン化カリウムの添加によって
負誤差は改善され、特に1r+mole/m1以上のフ
ェロシアン化カリウムの添加により良好に改善された。
リパーゼ活性測定に対して充分な改善効果がみられず、
多量すぎると測定値に変化はないが、ブランク値が上昇
したため、好ましいフェロシアン化物イオンの添加濃度
は、1 nmole/ m l −ISnsole/
tm lであった。
ビリルビン影響回避に対する効果〔試薬〕 実施例1と同様の第一試薬:第二試薬を用い、フェロシ
アン化カリウムを無添加の場合と、第一試薬へフェロシ
アン化カリウムを最終濃度が5r+mo1e/mff1
となるように添加した場合とに各試薬を調製した。
ルビン濃度はO〜20tag/d Iに調製(ビリルビ
ン:パ干渉チエツクA“(国際試薬社製))上記の試薬
および検体を用い、実施例1と同様の測定法にてリパー
ゼ活性測定を行った。その結果を、フェロシアン化カリ
ウム無添加の場合を一○−0−15r+mole/ m
l添加の場合を−・−・−とし、第3図に示した。こ
の結果から、フェロシアン化カリウム無添加の場合は、
検体中のビリルビン濃度を増加していくと測定値への負
の影響は大きくなったが、測定系にフェロシアン化カワ
ウムを5 nmole/ s4添加させた場合は、ビリ
ルビンの負影響が回避され、測定値も回復した。
アルブミンの相互作用 〔試薬〕 実施例1と同様の第一試薬、第二試薬を用い、第一試薬
にフェロシアン化カリウムおよびアルブミンを下記の濃
度になるように調製した。
添加 (B)フェロシアン化カリウム5nwbole/ va
lアルブミン 無添加 (C)フェロシアン化カリウム5nmole/ mlア
ルブミン0.272 〔検体〕 実施例2と同様の検体を用いた。
にてリパーゼ活性測定を行った。その結果、試薬(A)
の場合を−〇−O−1試薬(B)の場合を−・−・−1
試薬(C)の場合を一〇−〇−とし、第4図に示した。
回避の効果に差はみうけられず、アルブミンとヅエロシ
アン化カリウムとの間に相互作用はみられなかった。
回避に対する効果 〔試薬〕 実施例1と同様の第一試薬、第二試薬を用い、鉄錯体と
してEDTA−Fe (和光純薬社製)を無添加の場合
と、第一試薬へEDTA−Feを最終濃度が100n1
00n/5ffiとなるように添加した場合の各試薬を
調製した。
た。
うりであった。
の効果は、測定値が100χは回復しないものの、フェ
ロシアン化物イオンを添加した場合と同様の効果が認め
られた。すなわち、鉄錯体の濃度が増加すると、ブラン
ク値の上昇、測定感度の低下等があるので、添加濃度は
、10nmole/ mji!〜250nlIoIe/
lIlが好ましいと認めらレタ。
ド、非イオン性界面活性剤、モノグリセリド゛リパーゼ
、グリセロールキナーゼ、グリ七ロリン酸オキシダーゼ
、水素供与体とそのカプラー、パーオキシダーゼ、鉄錯
体等を含有するリパーゼ活性測定用試薬組成物であり、
測定系におけるビリルビン影響を回避するために鉄錯体
である例えばフェロシアン化物イオンまたはEDTA−
Feイオンを添加することにより、アルブミンの共存に
よるビリルビン影響回避の効果改善を何ら必要とするこ
となく、この鉄錯体により測定系における生体内ビリル
ビン影響を良好に回避することを可能とした有用なリパ
ーゼ活性測定用試薬組成物を提供する。
ェロシアン化カリウム添加によるビリルビン影響回避効
果を示し、第2図は同様に実施例1でのビルリビン添加
検体におけるフェロシアン化カリウム添加による効果を
示す、第3図は実施例2でのフェロシアン化カリウムの
添加有無による効果を示し、第4図は実施例3でのビリ
ルビン影響回避に対するフェロシアン化カリウムとアル
ブミンの相互作用を示す。
Claims (5)
- (1)少なくとも1,2−ジグリセリド、非イオン性界
面活性剤、モノグリセリドリパーゼ、グリセロールキナ
ーゼ、グリセロリン酸オキシダーゼ、水素供与体とその
カプラー、パーオキシダーゼ、鉄錯体を含有することを
特徴とするリパーゼ活性測定用試薬組成物。 - (2)鉄錯体として、フェロシアン化物イオンを1nm
ole/ml〜15nmole/mlを含有する請求項
第1項記載の試薬組成物。 - (3)鉄錯体として、エチレンジアミン四酢酸鉄イオン
を10nmole/ml〜250nmole/ml含有
する請求項第1項記載の試薬組成物。 - (4)水素供与体とそのカプラーが、フェノール類また
はアニリン誘導体と4−アミノアンチピリンの組み合わ
せである請求項第1項記載の試薬組成物。 - (5)少なくとも組成物全量に対し1,2−ジグリセリ
ドの含量が0.3mM〜1.0mM、非イオン性界面活
性剤の含量が0.05%〜0.2%、モノグリセリドリ
パーゼの含量が0.4U/ml〜2.5U/ml、グリ
セロールキナーゼの含量が0.05U/mIl〜3U/
ml、グリセロリン酸オキシダーゼの含量が15U/m
l〜150U/ml、フェノール類またはアニリン誘導
体の含量が0.02%〜0.1%、4−アミノアンチピ
リンの含量が0.01%〜0.1%、パーオキシダーゼ
の含量が0.25U/ml〜3U/mlである請求項第
1項記載の試薬組成物。
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- 1990-01-31 JP JP2137490A patent/JP2885453B2/ja not_active Expired - Lifetime
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