WO2023135704A1 - 捕集方法、検査方法、容器、遠心装置および検査システム - Google Patents
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
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-
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
Definitions
- the present invention relates to collection methods, inspection methods, containers, centrifugal devices, and inspection systems. More specifically, the present invention provides a method for collecting microorganisms, a method for testing microorganisms, a container, and a centrifuge for separating a sample containing impurities such as blood cells into a solution containing microorganisms such as bacteria and a solution containing blood cells. It relates to equipment and inspection systems.
- Sepsis is an infectious disease with a high fatality rate, and it is important to provide appropriate treatment promptly.
- Diagnosis of sepsis usually involves a blood culture test to determine whether bacteria are present in blood, which is a sterile sample.
- a smear test is performed after that, the blood culture-positive sample is isolated and cultured, and the obtained colonies are subjected to an identification test to identify the type of bacteria, and a susceptibility test to measure the susceptibility of the bacteria to antibacterial drugs. done.
- the series of tests described above requires 1 day for the blood culture test, 1 day for the isolation culture, and 1 day for the susceptibility test, thus requiring a total of 2 to 3 days. Therefore, it currently takes 2 to 3 days to find out whether treatment with appropriate antimicrobials has been carried out, and if ineffective antimicrobials are administered, the fatality rate is extremely high. .
- the isolation culture is still one of the time-consuming inspection steps, and it is a bottleneck in shortening the inspection time.
- the separation and culture process can be omitted, leading to a reduction in examination time.
- an identification test and a susceptibility test are performed as a set in a normal bacteriological test, it is necessary to prepare a sample suitable for both tests when extracting bacteria from a blood culture-positive sample. If a sample suitable for both inspections can be obtained in a single operation, it will lead to shortening of inspection time and labor saving of inspection, which will greatly benefit the user.
- an identification test consider using mass spectrometry by MALDI-TOF, which is becoming more popular.
- MALDI mass spectrometry by MALDI-TOF, which is becoming more popular.
- a dry sample is irradiated with a laser to desorb and ionize the sample. Therefore, it is preferable that the amount of water in the sample is small, and from the viewpoint of detection sensitivity, the amount of bacteria required is 10 5 CFU (Colony forming unit) or more.
- a liquid containing live bacteria is used as a sample in the turbidimetric method or the rapid method utilizing a microscope that is currently being developed.
- a bacterial solution whose concentration is adjusted in the range of 10 5 to 10 6 CFU/mL is used.
- McFarland turbidimetric method is generally used . It is necessary to prepare ⁇ L. Therefore, a larger amount of bacteria is required than in the identification test.
- bacteria are extracted from a relatively large volume of blood culture-positive samples of several mL or more, and multiple samples with different solid and liquid forms and different amounts of bacteria are prepared. It is necessary to get it at once.
- Patent Document 1 discloses a technique for separating bacteria from blood samples and extracting bacterial proteins. Further, Patent Document 2 discloses a method of selectively destroying only blood cell components using a protease-mediated decomposition of blood cells, a swelling treatment with a hypotonic solution, and a surfactant. Further, Patent Document 3 discloses a technique for separating a specific component from a blood sample.
- samples prepared by this method do not contain live bacteria and cannot be used for susceptibility testing because they are treated with reagents that disrupt bacterial cell walls.
- Patent Document 3 it is possible to easily separate a specific component from a blood sample in one step by rotating it like a top. However, it is difficult to obtain samples in different solid and liquid forms for use in a series of bacteriological tests. In addition, since a filter such as a porous material is used to separate a blood sample, it is not suitable for rapid processing of samples of several mL to 10 mL due to the problem of clogging.
- Patent Document 1 and Patent Document 2 disclose methods for extracting bacteria from blood samples. It is not possible to obtain a large number of high-concentration bacterial samples at once.
- the method disclosed in Patent Document 3 allows pretreatment of a blood sample in a simple manner, but there is a problem in obtaining samples of different solid and liquid forms from a large volume of sample at once. was there.
- the present invention has been made in view of such circumstances, and provides a collection method, an inspection method, a container, a centrifugal device, and an inspection system for obtaining samples of different shapes from a sample at once by a simple and stable method. It is something to do.
- the collection method of the present invention includes a first storage unit having a first flow path and a second flow path with different heights on the side surface, and a first storage unit and the first storage unit.
- a sample in a first storage part of a container comprising a second storage part connected via a flow path and a third storage part connected to the first storage part and the second storage part via the second flow path and centrifuging the sample introduced into the first storage unit with a first centrifugal force to form a first solution containing the first component and a second solution containing the second component
- FIG. 2 is a cross-sectional view of the container of Example 1.
- FIG. 2 is a transition diagram of blood samples in containers, showing a method of obtaining samples with different forms from the blood samples introduced into the container of Example 1.
- FIG. 2 is a graph showing the relationship between centrifugal acceleration and time in a method for obtaining samples of different morphologies from blood samples.
- FIG. 2 is a block diagram showing the configuration of the centrifugal device of Example 1.
- FIG. 1 is a flow chart showing a method of obtaining different morphology samples from a blood sample and tests using the samples.
- FIG. 11 is a block diagram showing the configuration of an inspection system of Example 2;
- a collection method for simultaneously obtaining samples with different morphologies from a blood sample containing microorganisms containing impurities such as blood cells, and a first component from the sample obtained by this collection method are examined. I will explain the inspection method of. Further, in the following examples, a container used in the collection method, a centrifugal device including the container, and an inspection system including the centrifugal device will be described.
- Microorganisms to be collected refer to various types of microorganisms, including bacteria, actinomycetes, and fungi. However, microorganisms do not include viruses. Specifically, microorganisms that are subject to detection by the sterility test method in the pharmacopeia, pathogenic bacteria and pathogenic fungi that are subject to inspection in hospital laboratories, and the like.
- Escherichia specifically examples, Escherichia coli
- Staphylococcus specifically examples, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis
- Propionibacterium specifically examples, Proprio Novactor acnes (Proprionobacter acnes)
- Micrococcus Streptococcus (specifically, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae)
- Enterococcus specifically, Enterococcus faecium
- Neisseria e.g., Rhinococcus, Meningococcus
- Moraxella Shigella (e.g., Shigella), Salmonella )
- Salmonella specifically examples are Salmonella typhi, Paratyphoid A, Enteritidis
- Enterobacter Serratia (Specific examples include Serratia marc
- Bacteroides Bacteroides fragilis
- Fusobacterium, Mycobacterium as a specific example, Mycobacterium tuberculosis
- Campylobacter Helicobacter (as
- the blood sample is not particularly limited as long as it contains blood cells.
- biological samples derived from living organisms and samples suspected of being contaminated with microorganisms are included.
- various samples such as blood, urine, bone marrow fluid, breast milk, amniotic fluid, biopsy tissue, cell culture fluid, cell culture supernatant can be used.
- the origin of the blood sample is not particularly limited, and can be derived from any biological species.
- blood samples derived from at least one of various types of organisms such as animals, plants, and insects are used as test samples.
- the blood sample is a liquid sample, it can be used as it is or after being diluted or concentrated with a solvent.
- the blood sample is a solid sample
- the supernatant obtained by suspending it in a solvent, homogenizing it with a grinder or the like, or stirring it with a solvent may be used.
- a blood sample may be diluted with an appropriate medium or physiological saline, or may be pretreated.
- Capturing means separating microorganisms from a solution containing blood cells, concentrating the microorganisms contained in the solution, and so on.
- concentration of microorganisms that may be contained in the sample is not particularly limited.
- the configuration of the container 1 of Example 1 will be described with reference to FIG.
- the container 1 includes a first container 100 into which a blood sample can be introduced, a second container 101 for collecting solid bacteria, and a third container 101 for collecting liquid bacteria. a portion 102;
- a blood sample containing blood components is introduced into the first container 100 .
- a sample that is positive in a blood culture test is introduced.
- the introduced sample components may include blood components such as red blood cells, white blood cells and platelets, media for bacterial growth, and bacteria.
- a first flow path 103 and a second flow path 104 are provided on the side surface of the first housing portion 100 .
- the first accommodation portion 100 is connected to the second accommodation portion 101 via the first flow path 103 .
- the first housing portion 100 is connected to the third housing portion 102 via the second flow path 104 .
- the first channel 103 is positioned higher than the second channel 104 .
- the blood sample positioned higher than the first channel 103 can be moved to the second container 101 via the first channel 103 .
- the blood sample at a position higher than the second channel 104 can be moved to the third container 102 via the second channel 104 .
- a filtration filter 105 is provided in the second housing portion 101 .
- the second housing portion 101 has a portion in which the filtration filter 105 is installed.
- This filtration filter 105 is a filtering member that separates the solution that has moved from the first container 100 to the second container 101 into microorganisms and liquid components.
- a waste liquid reservoir 106 is formed in the second storage section 101 .
- the filtration filter 105 collects only solid bacterial components, and the liquid component of the solution contained in the second container 101 moves to the waste liquid reservoir 106 .
- the housing portions 100, 101 and 102 are sealed.
- the first container 100 is covered with the lid 107 .
- the lid 107 is preferably a lid such as a rubber stopper or a seal stopper.
- the second storage portion 101 and the third storage portion 102 are covered with a lid 108 .
- the collected bacteria accumulate in the second containing portion 101 and the third containing portion 102 . Since the collected bacteria can be recovered with a needle or stick with a sharp tip and a pipette tip or syringe, a lid made of a material that can be easily peeled off, for example, a sealing lid is preferable.
- a blood sample 200 is introduced into the first container 100 of the container 1 .
- the introduction of the blood sample 200 into the first container 100 may be performed by a user or by a robot.
- Blood sample 200 is preferably introduced to a position sufficiently higher than the position of first channel 103 .
- a reagent (for example, blood cell destruction reagent) 201 for destroying red blood cells is introduced into the third container 102 .
- the reagent 201 may be introduced into the third container 102 by a user or by a robot.
- Reagent 201 is, for example, a surfactant.
- the concentration of the surfactant is preferably of a composition and concentration that disrupts red blood cell membranes, but does not affect bacterial cell membranes.
- the surfactant may be introduced after the blood sample 200 is introduced, or may be introduced into the third container 102 before the blood sample 200 is introduced.
- the container 1 into which the blood sample 200 has been introduced is mounted on the centrifugal device. After that, the container 1 is centrifuged at various centrifugal accelerations according to the order of FIGS. 2(b) to 2(e). The centrifuged container 1 is gradually inclined, and finally placed so that centrifugal force is applied toward the bottom surface of the container 1 . At this time, the direction of the first channel 103 and the second channel 104 of the container 1 is different from the direction in which the centrifugal force is applied. Details of the centrifugal acceleration applied to the container 1 and the centrifugal time are shown in FIG. 3, which will be described later.
- a blood sample 200 consists of a bacterial solution (first solution) 202 containing bacteria (first component) and the mass of red blood cells, white blood cells, etc. (second component). is separated into a solution (second solution) 203 containing heavy particles.
- the bacterial liquid 202 contains plasma, medium, etc. in addition to bacteria, and in some cases may contain red blood cells and white blood cells that have not been completely separated.
- the blood sample 200 is then centrifuged at a slightly higher acceleration than the initial low-acceleration centrifugation. Then, as shown in FIG. 2(c), the centrifugal force exceeds the pressure of the liquid in the first flow path 103, and the fungus liquid 202 flows through the first flow path 103 into the second container 101. move to After that, the bacterial liquid 202 comes into contact with the filtration filter 105 , and the bacteria (first sample) 204 as solid components are collected on the filtration filter 105 .
- the filtration filter 105 may be of any type, for example, a membrane filter with a diameter of 0.1 ⁇ m or less is preferable, and a hydrophilic filter such as PVDF is preferable.
- the diameter of the filtration filter 105 may be any diameter as long as it can collect the bacteria 204, and a diameter of several micrometers or less is suitable for this application.
- the liquid component 205 that has passed through the filtration filter 105 contains plasma, culture medium, proteins sufficiently smaller than bacteria, and the like, and moves to the waste liquid reservoir 106 . In this way, bacteria 204 contained in bacterial liquid 202 contained in second containing portion 101 are collected on filtration filter 105 .
- the solution 203 is centrifuged at the same low acceleration as at the beginning. Then, as shown in FIG. 2(d), the solution 203 in the first container 100 consists of a bacterial solution (third solution) 206 containing bacteria and blood cells containing heavy particles such as red blood cells and white blood cells. The components (fourth solution) 207 are separated.
- the solution 203 is centrifuged at the highest acceleration. Then, as shown in FIG. 2( e ), the centrifugal force exceeds the pressure of the liquid in the second channel 104 , and the fungus liquid 206 enters the third container 102 through the second channel 104 .
- the bacterial fluid 206 moved to the third container 102 is mixed with the reagent 201, and the minute blood cell components left unseparated by centrifugation are destroyed.
- the bacterial liquid 206 that has moved to the third container 102 is separated into a liquid component 208 and bacteria (second sample) 209 .
- the bacteria 209 accumulate on the bottom surface of the third container 102 and can be collected.
- bacteria 204 collected in second container 101 and bacteria 209 collected in third container 102 may be contaminated with impurities contained in blood sample 200 .
- the liquid component 208 is first removed from the state of FIG. 2(e). After that, an appropriate amount of surfactant or physiological saline is dripped onto the bacteria 204 and bacteria 209, and the bacteria are centrifuged again at a high acceleration for washing, thereby obtaining a higher-purity bacterial sample without complicated operations. can be done.
- the blood sample 200 is centrifuged at a centrifugal acceleration (first centrifugal force) x1 for a time t1.
- the centrifugal acceleration x1 must be set as follows.
- the centrifugation time t1 depends on the blood cell sedimentation velocity and the first flow rate. It is determined based on the height of road 103 .
- the centrifugal acceleration x1 is preferably 20 to 100 G, for example, although it is affected by the diameter of the first channel 103, the material of the container 1, and the physical properties (eg, viscosity) of the blood sample 200.
- the blood sample 200 is centrifuged at a centrifugal acceleration (second centrifugal force) x2 for a time t2.
- the centrifugal acceleration x2 must be greater than the centrifugal acceleration x1.
- the centrifugal acceleration x2 is set such that the centrifugal force is greater than the pressure in the first flow path 103 .
- the liquid cannot be retained in the first channel 103 , and the bacterial liquid 202 moves to the second container 101 .
- the pressure in the first channel 103 is determined by surface tension in addition to the diameter and length of the first channel 103 .
- different liquids are in contact with the first channel 103 and the second channel 104 .
- the first channel 103 is in contact with a bacterial solution 202 containing few blood cells
- the second channel 104 is in contact with a solution 203 containing blood cells. Since the liquid with which the first channel 103 is in contact and the liquid with which the second channel 104 is in contact have different surface tensions, the solution 203 moves from the second channel 104 in contact with the liquid with high surface tension. do not.
- the solution 203 is centrifuged at a centrifugal acceleration (third centrifugal force) x1 for a time t3.
- the pressure in the second channel 104 is set higher than the centrifugal force so that the liquid does not move from the first container 100 to the third container 102 via the second channel 104.
- Centrifugal acceleration x1 needs to be set.
- the centrifugation time t3 is determined by the sedimentation velocity of the blood cells and the second is determined based on the height of the flow path 104 of
- the solution 203 is centrifuged at a centrifugal acceleration (fourth centrifugal force) x3 for a time t4. It is preferable that the centrifugal acceleration x3 has a sufficiently high value in order to quickly move the bacterial liquid 206 from the second channel 104 to the third container 102 . However, it is preferable to set the centrifugal acceleration as high as possible within the range of 10 4 G or less, considering the possibility that the growth of bacteria in the bacterial liquid 206 may be affected.
- bacteria 204 and 209 are collected in second container 101 and third container 102, respectively. Solid bacteria 204 are collected on the filtration filter 105 provided in the second container 101 , and highly concentrated bacteria 209 are collected on the bottom surface of the third container 102 .
- ⁇ Height of flow path formed in container 1> The heights of the first channel 103 and the second channel 104 formed in the container 1 will be described with reference to FIG. 4 .
- the heights of the first channel 103 and the second channel 104 are different. The reason for this is to automatically collect different forms of bacteria used for different tests.
- Two types of tests are considered: an identification test by MALDI and a susceptibility test. For example, 10 5 to 10 6 CFU or more of bacteria are required for identification tests by MALDI.
- a susceptibility test requires a bacterial solution of 10 5 to 10 6 CFU/mL. A few hundred microliters of bacterial solution is prepared, and then diluted 100 to 100 times and used for testing.
- first channel 103 and second channel 104 To consider the height of first channel 103 and second channel 104, consider a blood culture positive sample.
- the liquid volume of the blood culture-positive sample introduced into the first container 100 was set to 10 mL.
- the concentration of bacteria contained in the blood culture-positive sample should be in the range of 10 7 to 10 9 CFU/mL, although it varies depending on the time until the blood culture is positive, the elapsed time after positive, the bacterial species, and the strain. is common. Therefore, a case where the bacterial concentration, which is expected to be the most difficult to pretreat, is 10 7 CFU/mL was considered.
- the heights of the first channel 103 and the second channel 104 are as shown in FIG.
- y1 is the height from the bottom surface of the first housing portion 100 to the second flow path 104
- y2 is the height from the second channel 104 to the first channel 103
- y3 is the height from the first channel 103 to the scale line 400 indicating the specified value.
- y1+y2+y3 is the height of the blood sample 200 when the assumed blood sample 200 is put in the total volume, ie, 10 mL.
- the container 1 is provided with the visible scale lines 400 at the height of y1+y2+y3.
- a blood sample 200 of at least a specified value or more must be introduced into the first container 100 .
- the height y1 from the bottom surface of the first housing portion 100 to the second flow path 104 is determined as follows. Since the centrifuged red blood cells are deposited in the first storage part 100, the volume of the first storage part 100 from the bottom surface of the first storage part 100 to the height y1 is the number of red blood cells in the blood sample 200. It must be at least volume.
- the hematocrit value which indicates the ratio of erythrocytes in blood, is in the range of 30 to 55%, depending on gender and health condition.
- the blood sample 200 introduced into the first container 100 contains the patient's blood as well as about 2 ⁇ 3 of the total volume of medium components introduced in advance.
- the ratio of erythrocytes in the blood culture-positive sample is at most about 1/6. Therefore, in order to pretreat the blood sample more efficiently, the height of y1 is preferably 16.7% or more, for example 20%, of the specified height of the input amount of the blood sample 200. be done.
- the height of y3 is determined as follows. If the bacterial concentration is 10 7 CFU/mL, 1 mL of sample can extract 10 7 CFU of bacteria. This is more than 10 times the required amount of bacteria in MALDI, and it is considered that a sufficient amount of bacteria can be extracted. Therefore, the height of y3 is preferably about 10% of the specified height of the input amount of blood sample 200 .
- the height of y2 is automatically determined. That is, the height of y2 is about 70% of the specified height of the input amount of blood sample 200 .
- such a minute amount of highly concentrated bacterial solution is diluted to several hundred ⁇ L, for example, 200 ⁇ L, and the concentration is adjusted to 1.5 ⁇ 10 8 CFU/mL (equivalent to 0.5 McFarland). and According to this calculation, 3.5 ⁇ 10 8 CFU/mL of bacterial solution can be extracted while 1.5 ⁇ 10 8 CFU/mL of bacterial solution is required, so the loss of bacteria during separation is considered. However, it is possible to extract a sufficient amount.
- the elements that characterize the container 1 are as follows.
- the container 1 a container into which the blood sample 200 can be introduced and subjected to centrifugation can be used.
- the volume of the first container 100 can be 1-20 mL, preferably 8-15 mL.
- the sum of the volume of the second storage portion 101 and the volume of the third storage portion 102 may be equal to or greater than the volume of the first storage portion 100 .
- the material of the container 1 is not particularly limited as long as it is a material suitable for operations such as centrifugation.
- the container 1 is preferably made of a hydrophobic material.
- the container 1 is preferably made of a material such as acrylic resin, ABS resin, polypropylene, polystyrene, or polyethylene, and is made using a 3D printer or injection molding.
- the container 1 may be produced by cutting aluminum or stainless steel.
- the container 1 may be chemically treated to render it hydrophobic and to modify the surface.
- the container 1 may be opaque, but if it is transparent, the internal state can be easily visually recognized, or optically measured or photographed by a device.
- the container 1 is preferably transparent in order to facilitate detection of excess or deficiency of the liquid volume, clogging of the sample, and detection of foreign matter in the sample.
- the container 1 is preferably disposable from the viewpoint of contamination, it can be used repeatedly after washing and sterilization, for example.
- the container 1 may have any shape as long as it can be centrifuged.
- the bottom portion of the second storage portion 101 where the filter 105 is installed and the bottom portion of the third storage portion 102 which stores the reagent are mortar-shaped in order to efficiently collect the bacteria 204 and 209. Preferably.
- the first channel 103 and the second channel 104 may have any shape.
- the first flow path 103 and the second flow path 104 are, for example, cylindrical with a circular cross-sectional shape, or rectangular parallelepiped with a rectangular cross-sectional shape.
- the diameters of the first channel 103 and the second channel 104 are considered as follows. Blood contains erythrocytes, leukocytes, and platelets, the largest of which is leukocytes, which have a diameter of 6 to 30 ⁇ m. If the diameters of the first channel 103 and the second channel 104 are smaller than this, the blood cells clog the first channel 103 and the second channel 104 without the effect of the capillary valve, and the liquid may not be released.
- a typical optimum range of the diameters of the first channel 103 and the second channel 104 is 10 to 100 ⁇ m. Also, the diameter of the first channel 103 and the diameter of the second channel 104 may be different, but preferably they are the same diameter.
- the reagent 201 introduced into the third container 102 is not particularly limited as long as it can destroy blood cells without affecting the growth of microorganisms.
- reagent 201 preferably contains at least one surfactant.
- surfactants include, but are not limited to, anionic surfactants having hydrophilic and hydrophobic moieties, wherein said hydrophobic moieties are chain hydrocarbons, or hydrophilic and hydrophobic moieties. and wherein said hydrophobic portion comprises a cyclic hydrocarbon, or a combination of both.
- the former includes sodium dodecyl sulfate, lithium dodecyl sulfate, and sodium N-lauroyl sarcosinate
- the latter includes saponin, sodium cholate, sodium deoxycholate, 3-[(3-cholamidopropyl). dimethylammonio]-1-propanesulfonate, and 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate.
- the inspection system 500 includes a centrifugal device 501 , a fractionating device 502 , a coating device 503 , a concentration measuring device 504 , an identification testing device 505 , a susceptibility testing device 506 and a control PC 508 . Each device is connected by a signal line 507, and a control PC 508 controls the operation of each device.
- the centrifugal device 501 can be loaded with one or a plurality of containers 1 described above, and centrifuges the blood sample 200 introduced into the first container 100 of the mounted container 1 to be used in the identification test device 505. Bacteria 204 used in susceptibility testing device 506 and bacteria 209 used in susceptibility testing device 506 are isolated.
- the centrifugal device 501 includes at least three centrifuges set for centrifugation of the blood sample 200, transfer of the bacterial liquid 202 to the second container 101, and transfer of the bacterial liquid 206 to the third container 102. Centrifuge the blood sample 200 with acceleration.
- the container 1 is transported to the sorting device 502 by the transport mechanism 509 . A user may transport the container 1 from the centrifugal device 501 to the sorting device 502 .
- the sorting device 502 acquires the bacteria 204 collected in the second container 101 of the container 1 using, for example, a sample-collecting rod 510 with a sharp tip, and uses a syringe 511 to collect the bacteria 204 in the third container 1 of the container 1. Bacteria 209 collected in the container 102 are acquired. The acquired bacteria 204 and bacteria 209 are sent to different devices.
- the applicator 503 applies solid bacteria and matrix reagents to MALDI target plates used in mass spectrometry for identification tests.
- the concentration measuring device 504 measures the concentration of the bacterial liquid by measuring McFarland turbidity, for example.
- a pretreatment device 512 is provided with the centrifugal device 501, fractionating device 502, coating device 503, and concentration measuring device 504 described above.
- the coating device 503 does not necessarily have to exist as a necessary component.
- the sampling device 502 may return the sample-collecting rod 510 from which the bacteria 204 have been acquired to the user, and the user may apply the sample to the target plate.
- the concentration value measured by the preprocessing device 512 may be displayed on a display attached to the control PC 508 to notify the user.
- the density value is equal to or higher than the target value, for example, the user is notified and the user adjusts the density to the target value, thereby maintaining the reliability of the inspection. If the concentration is less than the target value, an error flag may be displayed and the pretreatment may be performed again, or the bacterial solution may be additionally cultured and then used for testing.
- the sorting apparatus 502 has a function of acquiring appearance information of the container 1 using, for example, concentration measurement or image measurement, and confirming whether the preceding processing is being executed normally.
- the liquid level of the blood sample 200 in the first container 100 is equal to the level of the second channel 104 as shown in FIG. 2(e). to the same extent as However, when the preceding process is stopped in the middle, the liquid level of blood sample 200 in first container 100 becomes sufficiently higher than the height of second channel 104 . Based on such information, the preparative collection device 502 can validate whether or not the preceding process has been completed normally.
- the sample processed by the pretreatment device 512 is once returned to the user, subjected to additional processing steps as necessary, and then tested by the identification testing device 505 and the susceptibility testing device 506 .
- the identification inspection device 505 uses the sample obtained from the bacteria 204 to determine the type of bacteria.
- the susceptibility test device 506 uses the sample obtained from the bacteria 209 to determine the degree of bacterial growth. In the case of an identification test, depending on the case, the user himself/herself applies the bacteria and the matrix reagent to the target plate, and then the identification of the bacterial species is carried out by the device.
- the bacterial solution is adjusted to a target concentration and dispensed into a 96-well plate or the like, and the susceptibility test device 506 determines proliferation and MIC.
- the progress status and determination results of identification of bacterial species and determination of susceptibility tests are displayed on a display attached to the control PC 508 to notify the user of the results.
- the control PC 508 inputs the parameters of each device such as the acceleration and time of centrifugation in the centrifugal device 501 and the target value of the concentration of bacteria in the concentration measuring device 504 according to the blood sample 200. It is preferable that the content of processing can be changed by pressing the
- the centrifugal device 501 includes a container mounting section 601 , a driving section 602 and a control board 603 .
- One or more containers 1 are mounted on the container mounting portion 601 .
- Drive unit 602 is an actuator that applies centrifugal force to blood sample 200 in container 1 mounted on container mounting unit 601 .
- a control board 603 is a control unit that controls the operation of the driving unit 602 .
- the control board 603 includes a processor 610 , a main storage device 611 , an auxiliary storage device 612 , an input/output I/F 613 , and a bus 614 that communicably connects each part of the control board 603 .
- the input/output I/F 613 is communicably connected to the control PC 508 via the signal line 507 and receives instructions from the control PC 508 .
- the processor 610 generates drive signals for driving the driving section 602 according to instructions from the control PC 508 .
- the input/output I/F 613 is communicably connected to the drive unit 602 and outputs drive signals generated by the processor 610 to the drive unit 602 .
- the drive unit 602 centrifuges the container 1 at various centrifugal accelerations according to the drive signal.
- the blood sample 200 is introduced into the first container 100 of the container 1.
- the process of introducing the blood sample 200 into the container 1 may be performed by a user or by a robot.
- the reagent 201 such as a surfactant that destroys blood cells may be introduced into the third container 102 in step S70, or may be introduced into the third container 102 before step S70.
- steps S71 to S74 are described individually in FIG. 7, a series of processes of steps S71 to S74 are automatically performed continuously by the centrifugal device 501.
- step S71 container 1 containing blood sample 200 is centrifuged at low acceleration to separate blood sample 200 into bacterial fluid 202 and solution 203.
- step S72 the container 1 containing the blood sample 200 is centrifuged at medium acceleration to move the bacterial fluid 202 from the first container 100 to the second container 101 via the first channel 103.
- the liquid component 205 is removed from the bacterial liquid 202 moved to the second container 101 by the filtration filter 105, and the bacteria 204 are collected.
- step S 73 the container 1 containing the solution 203 is centrifuged at low acceleration to separate the solution 203 into the bacterial liquid 206 and the blood cell component 207 .
- step S74 the container 1 containing the solution 203 is centrifuged at a high acceleration to move the fungal liquid 206 from the first containing portion 100 to the third containing portion 102 via the second flow path 104.
- the reagent 201 destroys red blood cells remaining in the bacterial liquid 206 and eluates them into the liquid. As a result, only bacterial components accumulate on the bottom surface of the third containing portion 102 .
- the identification test device 505 uses the bacteria 204 collected in the second container 101 to perform an identification test.
- an identification test by MALDI a mass of solid bacteria 204 captured on the filtration filter 105 of the second storage unit 101 is obtained, applied to a target plate, and then an appropriate matrix reagent is added.
- the identification test may be performed after dropping and drying.
- protein extraction treatment with ethanol, formic acid, acetonitrile, etc. may be performed as in the usual MALDI technique.
- the susceptibility test device 506 acquires the high-concentration fungal fluid accumulated on the bottom surface of the third container 102 and performs a susceptibility test. Specifically, the high-concentration bacteria 209 accumulated on the bottom surface are obtained with a pipette tip or the like, or the high-concentration bacteria 209 accumulated on the bottom surface are obtained after removing the supernatant. Then, the concentration of the bacterial solution is adjusted, for example, by the McFarland turbidimetric method, and the susceptibility test is performed using the bacterial solution.
- step S77 the results of the bacteriological examination are reported. Specifically, the identification test performed in S75 reports information on the bacterial species and determination score. In addition, information such as the name of the drug, its MIC (Minimum Inhibition Concentration), sensitivity/tolerance, etc. is reported to the laboratory technician and the doctor by the sensitivity test performed in S76.
- the identification test performed in S75 reports information on the bacterial species and determination score.
- information such as the name of the drug, its MIC (Minimum Inhibition Concentration), sensitivity/tolerance, etc. is reported to the laboratory technician and the doctor by the sensitivity test performed in S76.
- Example 1 a first containing portion 100 having a first flow channel 103 and a second flow channel 104 with different heights on the side surface, and a flow through the first containing portion 100 and the first flow channel 103 Centrifuge the container 1 including the connected second containing portion 101 and the third containing portion 102 connected to the first containing portion 100 via the second flow path 104 at various centrifugal accelerations. do. As a result, blood cells and bacteria can be separated from the blood sample 200 introduced into the first container 100 .
- the bacterial solution 202 By centrifuging the blood sample 200 contained in the first container 100, the bacterial solution 202 can be moved to the second container 101 via the first flow path 103, and The bacteria liquid 206 can be moved to the third container 102 via the second channel 104 .
- Example 1 it is possible to simultaneously obtain different forms of bacterial samples used in identification tests and susceptibility tests by a simple and stable method.
- a series of centrifugal separation operations are performed once at a predetermined centrifugal acceleration to extract different forms of bacterial samples.
- a solid bacterial sample with little liquid content is suitable for use in mass spectrometry by MALDI, and a liquid bacterial sample is suitable for use in susceptibility testing. Since the amount of bacteria to be extracted can be controlled by adjusting the heights of the first flow path 103 and the second flow path 104, the user can automatically obtain a predetermined amount or more of the bacterial sample suitable for each test without complicated operations. It is possible to obtain
- Example 1 the solid bacteria 204 can be collected by the filtration filter 105 of the second storage section 101 . This makes it possible to obtain the solid bacteria required for the identification test.
- Example 1 the reagent 201 introduced into the third container 102 does not affect the cell membranes of bacteria in the bacterial liquid 206, but makes it possible to destroy the cell membranes of red blood cells. As a result, it is possible to destroy a small amount of blood cell components in the bacterial liquid 206 that remained without being separated by centrifugation.
- the height of the first flow path 103 and the second flow path 104 is 1/6 or more of the height from the bottom surface of the first housing portion 100 to the specified value
- the difference (y2) between the height of the first channel 103 and the height of the second channel 104 is 1/2 or more of the height from the bottom surface of the first housing part 100 to a specified value.
- Example 1 by centrifuging the solution 203 at a centrifugal acceleration x3 that is sufficiently greater than the centrifugal acceleration x2, the bacterial liquid 206 can be rapidly moved from the second flow path 104 to the third container 102. becomes.
- the bacteria 204 can be used to determine the type of bacteria, and the bacteria 209 can be used to determine the degree of bacterial growth.
- Example 1 since the bottom surface of each of the second containing portion 101 and the third containing portion 102 of the container 1 is mortar-shaped, the collected bacteria 204 and 209 are removed with a sharp needle or stick. , and can be efficiently retrieved with a pipette tip or syringe.
- Example 2 In the first embodiment, an example has been described in which the user manually obtains the bacteria 209 collected in the second container 101 and 204 third container 102 using a needle or pipette tip. .
- the bacteria 204 collected in the second container 101 are automatically separated and applied, and the bacteria 209 collected in the third container 102 are automatically separated. , dilute, and measure concentration.
- the inspection system 800 of Example 2 includes a centrifugal device 501, a sorting device 502, a coating device 503, an identification testing device 505, a susceptibility testing device 506, and a control PC 508, as in the first embodiment.
- the inspection system 800 of Example 2 includes a concentration measuring and diluting device 801 , a driving mechanism 802 , a driving control mechanism 803 , a gripping mechanism 804 and a transporting device 809 .
- the drive mechanism 802 is controlled by a drive control mechanism 803.
- a drive mechanism 802 moves a gripping mechanism 804 from the centrifuge device 501 to the sorting device 502 .
- the gripping mechanism 804 is configured to grip the container 1 and grips the container 1 centrifuged by the centrifugal device 501 .
- the driving mechanism 802 moves the specimen-picking rod 510 from the sorting device 502 to the coating device 503 .
- the drive mechanism 802 moves the syringe 511 from the sorting device 502 to the concentration measuring and diluting device 801 .
- the sample prepared by the coating device 503 is transported to the identification inspection device 505 by the transport device 809 .
- the sample whose concentration has been measured and diluted by the concentration measuring and diluting device 801 is transported to the susceptibility testing device 506 by the transporting device 809 .
- the testing system 800 of the second embodiment can automatically perform centrifugation in the centrifugal device 501 , testing in the identification testing device 505 and testing in the susceptibility testing device 506 .
- the present invention is not limited to the above examples, and includes various modifications.
- the above embodiments have been described in detail for easy understanding of the present invention, and are not necessarily limited to those having all the configurations described. It is also possible to replace part of the configuration of one embodiment with the configuration of another embodiment, or to add the configuration of another embodiment to the configuration of one embodiment. Moreover, it is also possible to add, delete, or replace a part of the configuration of each embodiment with another configuration.
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Abstract
簡便で安定的な方法により、血液試料から形態の異なる試料を一度に得る。 微生物の捕集方法は、側面に高さの異なる第１の流路１０３及び第２の流路１０４を有する第１の収容部１００と、第２の収容部１０１と、第３の収容部１０２とを備える容器１の第１の収容部１００に血液試料２００を導入すること、血液試料２００を、第１の遠心力にて遠心し、微生物を含む菌液２０２と血球を含む溶液２０３とに分離させること、血液試料２００を第１の遠心力より大きい第２の遠心力にて遠心し、溶液２０３を第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１に移動させること、第２の溶液２０３を第３の遠心力にて遠心し、微生物を含む菌液２０６と血球を含む血球成分２０７とに分離させること、及び、溶液２０３を第３の遠心力より大きい第４の遠心力にて遠心し、菌液２０６を第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２に移動させること、を有する。
Description
本発明は、捕集方法、検査方法、容器、遠心装置および検査システムに関する。より具体的には、本発明は、血球細胞などの不純物が含まれる試料から細菌等の微生物を含む溶液と血球を含む溶液とに分離する微生物の捕集方法、微生物の検査方法、容器、遠心装置および検査システムに関する。
敗血症は致死率の高い感染症であり、適切な治療を迅速に行うことが重要である。通常敗血症の判定には血液培養検査が行われ、無菌試料である血液中に細菌が存在するかどうかの判定が行われる。一般的には、その後に塗抹検査を行い、血液培養陽性試料を分離培養し、得られたコロニーに対して細菌の種類を特定する同定検査、その細菌の抗菌薬に対する感受性を測定する感受性検査が行われる。以上の一連の検査は、血液培養試験に１日、分離培養に１日、さらに感受性検査に１日を要するため全体で２～３日の検査時間を要する。従って、適切な抗菌薬による治療が実施できているかどうか判明するまでには、現状、２～３日を要し、効果の無い抗菌薬が投与されていた場合には、致死率は極めて高くなる。
現在、この一連の感染症検査を迅速化しようという試みが活発に研究されている。例えば、細菌の同定検査には、従来用いられてきた比色法および蛍光法がゴールデンスタンダードであった。現在では、ＭＡＬＤＩ―ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ Ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｌａｓｅｒ Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ － Ｔｉｍｅ Ｏｆ Ｆｌｉｇｈｔ）による質量分析を用いて同定検査を行う方法が開発され、検査の迅速性やコストメリットの観点から飛躍的な普及が進んでいる。また、感受性検査に関して、従来は比濁法が用いられてきたが、レーザを用いて高感度に細菌を検出する方法や顕微鏡により細菌の増殖や形態変化を元に感受性を予測する方法が開発されている。このように検査の迅速化が進んでいる。一方、分離培養は依然として時間を要する検査の一工程として残っており、検査時間短縮のボトルネックとなっている。ここで、血液培養陽性試料から細菌以外の例えば血球成分やその他不純物を除去し、細菌のみを抽出することができれば分離培養の工程を省略することが可能となり、検査時間の短縮につながる。
通常の細菌検査では同定検査と感受性検査とがセットで行われるため、血液培養陽性試料から細菌を抽出する際には、両者の検査に適した試料を用意する必要がある。一度の操作で両者の検査に適した試料を得ることができれば、検査時間の短縮および検査の省力化につながりユーザメリットは大きい。例えば、同定検査の場合には、普及が進むＭＡＬＤＩ―ＴＯＦによる質量分析を用いることを考える。ＭＡＬＤＩでは、乾燥した試料にレーザを照射し、試料の脱離イオン化を行う。従って、試料中の水分量は少ない方が好ましく、また検出感度の観点から１０５ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）以上の量の細菌が必要である。
他方、感受性検査の場合には、比濁法もしくは現在開発が進む顕微鏡などを活用した迅速法では、生きた菌を含む液体を試料に用いる。この場合には、例えば、１０５～１０６ＣＦＵ／ｍＬの範囲で濃度調整された菌液を用いる。この菌液を調製する際には、マクファーランド比濁法と呼ばれる方法が用いられるのが一般的であって、菌濃度を正確に調整するためには１０８ＣＦＵ／ｍＬの溶液を数百μＬ用意する必要がある。そのため、同定検査の場合と比べて必要な菌量は多い。従って、一連の細菌検査を迅速に実施するためには、比較的大容量の数ｍＬ以上の血液培養陽性試料から細菌を抽出し、固体状および液体状の形態ならびに細菌量も異なる複数の試料を一度に得ることが必要である。
特許文献１には、血液試料から細菌を分離し、細菌のタンパク質を抽出する手法が開示されている。また、特許文献２には、血球細胞に対してプロテアーゼによる分解および低張液による膨張処理、および界面活性剤を用いて血球成分だけを選択的に破壊する手法が開示されている。また、特許文献３には、血液試料から特定の成分を分離する手法が開示されている。
特許文献１の方法によると、ＭＡＬＤＩを用いた質量分析で同定を行うのに適した試料を得ることが可能である。しかし、細菌の細胞壁を破壊する試薬で処理を行うため、この方法で調製された試料中には生きた菌は含まれず、感受性検査に用いることはできない。
また、特許文献２の方法によると、血球成分を十分に破壊、除去することが可能である。本処理には繰り返しの遠心分離や溶液置換による洗浄工程が多く含まれ、煩雑かつ処理に時間を要する。液体状の試料を得ることは容易であるが、固体状の試料を得るためには追加の遠心分離および上清の除去等の操作が必須のため、操作ステップが増える。また、細菌量の異なる試料を得るためには、ユーザが菌液の分注量等をコントロールする必要があり、その正確性は分注等の手技に依存するほか、やはり煩雑な操作となる。
また、特許文献３の方法では、コマのように回転させることで血液試料中から特定の成分をワンステップで容易に分離させることが可能である。しかし、一連の細菌検査で使用するために固体状および液体状の形態の異なる試料を得ることは難しい。また、血液試料の分離には多孔質材料のようなフィルタを用いるため、詰まりの問題と関連し数ｍＬ～１０ｍＬの試料を迅速に処理する用途には向かない。
特許文献１及び特許文献２に開示された方法では、血液試料から細菌を抽出する方法が開示されているが、いずれの方法も同定検査で必要な固体状の細菌試料及び感受性検査で必要な液体状の高濃度の細菌試料を一度に得ることはできない。また、特許文献３に開示された方法では、簡便な方法で血液試料の前処理が可能であるが、大容量の試料から固体状および液体状の形態の異なる試料を一度に得るためには課題があった。
本発明はこのような状況を鑑みてなされたものであり、簡便で安定的な方法により、試料から形態の異なる試料を一度に得る捕集方法、検査方法、容器、遠心装置および検査システムを提供するものである。
上記課題を解決するために、本発明の捕集方法は、側面に高さの異なる第１の流路及び第２の流路を有する第１の収容部と、第１の収容部と第１の流路を介して接続された第２の収容部と、第１の収容部と第２の流路を介して接続された第３の収容部とを備える容器の第１の収容部に試料を導入すること、第１の収容部に導入された試料を、第１の遠心力にて遠心し、第１の成分を含む第１の溶液と第２の成分を含む第２の溶液とに分離させること、第１の収容部に収容される試料を、第１の遠心力より大きい第２の遠心力にて遠心し、第１の溶液を第１の流路を介して第２の収容部に移動させること、第１の収容部に収容される第２の溶液を、第３の遠心力にて遠心し、第１の成分を含む第３の溶液と第２の成分を含む第４の溶液とに分離させること、及び、第１の収容部に収容される第２の溶液を、第３の遠心力より大きい第４の遠心力にて遠心し、第３の溶液を第２の流路を介して第３の収容部に移動させること、を有する。
本発明によれば、簡便で安定的な方法により、試料から形態の異なる試料を一度に得ることが可能となる。
本発明に関連するさらなる特徴は、本明細書の記述、添付図面から明らかになるものである。また、上記した以外の、課題、構成および効果は、以下の実施の形態の説明により明らかにされる。本発明の記述は典型的な例示に過ぎず、特許請求の範囲または適用例をいかなる意味においても限定するものではない。
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。
添付図面は、本発明の原理に基づいて具体的な実施の形態を示しているが、これらは本発明の理解のためのものであり、本発明を限定的に解釈するために用いられるものではない。なお、実施の形態および実施の形態を説明するための全図において、同一機能を有するものは同一符号を付け、その繰り返しの説明は省略する。
以下の実施例では、血球細胞などの不純物が含まれる微生物を含む血液試料から形態の異なる試料を一度に得る捕集方法、及び、この捕集方法によって得られた試料から第１の成分を検査するの検査方法について説明する。また、以下の実施例では、捕集方法で使用される容器、その容器を備える遠心装置、及び、遠心装置を備える検査システムについて説明する。
以下の実施例では、血液試料の血球及び微生物への分離、血球の破壊、並びに、微生物の捕集抽出を連続的に行うことによって、固体状および液体状の形態ならびに細菌量が異なる試料を一度に得る。
捕集の対象となる「微生物」とは、細菌、放線菌、真菌などを含む様々な種類の微生物をいう。但し、微生物にウイルスは含まれない。具体的には、薬局方において無菌試験法により検出対象となっている微生物、病院の検査室などで検査対象となる病原性細菌や病原性真菌などの微生物などである。例えば、大腸菌属（Escherichia）（具体例として、大腸菌）、ブドウ球菌属（Staphylococcus）（具体例として、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌）、プロピオニバクテリウム属（Propionibacterium）（具体例として、プロプリオノバクター・アクネス（Proprionobacter acnes））、ミクロコッカス属（Micrococcus）、レンサ球菌属（Streptococcus）（具体例として、化膿性レンサ球菌、肺炎球菌）、エンテロコッカス属（Enterococcus）（具体例として、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・フェカリス）、ナイセリア属（Neisseria）（具体例として、りん菌、髄膜炎菌）、モラクセラ属（Moraxella）、赤痢菌属（Shigella）（具体例として、赤痢菌）、サルモネラ属（Salmonella）（具体例として、チフス菌、パラチフスA菌、腸炎菌）、シトロバクター属（Citrobacter）、クレブシエラ属（Klebsiella）（具体例として、肺炎桿菌）、エンテロバクター属（Enterobacter）、セラチア属（Serratia）（具体例として、セラチア・マルセッセンス）、プロテウス属（Proteus）、プロビデンシア属（Providencia）、モルガネラ属（Morganella）、エルシニア属（Yersinia）（具体例として、ペスト菌）、ビブリオ属（Vibrio）（具体例として、コレラ菌、腸炎ビブリオ、ビブリオ・バルニフィカス、ビブリオ・ミミカス）、エロモナス属（Aeromonas）、シュードモナス属（Pseudomonas）（具体例として、緑膿菌）、アシネトバクター属（Acinetobacter）（具体例として、アシネトバクター・バウマニイ）、アルカリゲネス属（Alcaligenes）、アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、フラボバクテリウム属（Flavobacterium）、ヘモフィルス属（Haemophilus）（具体例として、インフルエンザ菌）、パスツレラ属（Pasteurella）、フランシセラ属（Francisella）、ボルデテラ属（Bordetella）（具体例として、百日咳菌）、エイケネラ属（Eikenella）、ブルセラ属（Brucella）、ストレプトバチラス属（Streptobacillus）、アクチノバチラス属（Actinobacillus）、レジオネラ属（Legionella）（具体例として、レジオネラ・ニューモフィラ）、バシラス属（Bacillus）（具体例として、枯草菌、炭疽菌、セレウス菌）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）（具体例として、ジフテリア菌）、ラクトバシラス属（Lactobacillus）、リステリア属（Listeria）、エリジペロスリックス属（Erysipelothrix）、ノカルジア属（Nocardia）、放線菌属（Actinomyces）、クロストリジウム属（Clostridium）（具体例として、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・スポロゲネス）、バクテロイデス属（Bacteroides）（具体例として、バクテオリデス・フラジリス）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）（具体例として、結核菌）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ヘリコバクター属（Helicobacter）（具体例として、ピロリ菌）、スピリルム属（Spirillum）、トレポネーマ属（Treponema）、ボレリア属（Borrelia）、レプトスピラ属（Leptospira）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）（具体例として、肺炎マイコプラズマ）、アスペルギルス属（Aspergillus）（具体例として、クロコウジカビ、アスペルギルス・ブラジリエンシス（Aspergillus brasiliensis））、酵母（具体例として、カンジダ・アルビカンス）などの細菌および真菌が含まれるが、これら以外の微生物も捕集対象となり得る。
血液試料は、血球を含む試料であれば特に限定されるものではない。特に、生体に由来する生体試料や微生物による汚染が疑われる試料などが含まれる。例えば、血液、尿、骨髄液、母乳、羊水、生検組織、細胞培養液、細胞培養上清などの様々な試料とすることができる。また、血液試料の由来も特に限定されるものではなく、任意の生物種に由来するものとすることができる。例えば、動物、植物、昆虫などの様々な種類の生物の少なくとも１種に由来する血液試料を被検試料とする。血液試料が液体試料である場合には、そのまま、または溶媒で希釈もしくは濃縮して使用することができる。血液試料が固体試料である場合には、溶媒に懸濁するか、粉砕機などによりホモジナイズするか、あるいは溶媒と共に攪拌して得られる上清を使用してもよい。血液試料は、適当な培地、生理食塩水により希釈されてもよいし、または前処理などが施されてもよい。
「捕集」とは、血球を含む溶液から微生物を分離すること、溶液に含まれる微生物を濃縮することなどを意味する。試料に含まれる可能性のある微生物の濃度は、特に限定されるものではない。
＜容器＞
図１を参照して、実施例１の容器１の構成を説明する。容器１は、血液試料が導入可能な第１の収容部１００と、固体状の細菌を捕集するための第２の収容部１０１と、液体状の細菌を捕集するための第３の収容部１０２と、を備える。
図１を参照して、実施例１の容器１の構成を説明する。容器１は、血液試料が導入可能な第１の収容部１００と、固体状の細菌を捕集するための第２の収容部１０１と、液体状の細菌を捕集するための第３の収容部１０２と、を備える。
第１の収容部１００には、血液成分が含まれた血液試料が導入される。具体的には、血液培養検査で陽性になった試料が導入される。従って、導入される試料の構成成分は、赤血球、白血球及び血小板などの血液成分、細菌増殖のための培地、及び、細菌が含まれる可能性がある。
第１の収容部１００の側面には、第１の流路１０３と第２の流路１０４とが設けられる。第１の収容部１００は、第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１と接続される。また、第１の収容部１００は、第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２と接続される。第１の流路１０３は、第２の流路１０４よりも高い位置にある。これにより、第１の流路１０３より高い位置にある血液試料は、第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１に移動可能となる。また、第２の流路１０４より高い位置にある血液試料は、第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２に移動可能となる。
第２の収容部１０１には、ろ過フィルタ１０５が設けられる。第２の収容部１０１は、ろ過フィルタ１０５を設置する部分を有する。このろ過フィルタ１０５は、第１の収容部１００から第２の収容部１０１に移動した溶液を微生物と液体成分とに分離するろ過部材である。また、第２の収容部１０１には、廃液リザーバ１０６が形成される。ろ過フィルタ１０５は、個体状の細菌成分のみを捕集し、第２の収容部１０１に収容された溶液の液体成分は、廃液リザーバ１０６まで移動する。
コンタミネーションを防止するため、収容部１００、１０１及び１０２は、封止されていることが好ましい。実施例１の容器１では、例えば、第１の収容部１００は、蓋１０７で覆われる。第１の収容部１００には、血液培養ボトルから取得した血液試料が導入されるため、蓋１０７は、例えば、ゴム栓やシール栓のような蓋が好ましい。また、第２の収容部１０１及び第３の収容部１０２は、蓋１０８で覆われる。第２の収容部１０１及び第３の収容部１０２には、捕集された細菌が溜まる。捕集された細菌は、先端部の鋭利な針又は棒、及び、ピペットチップ又はシリンジで回収されるので、容易に剥がすことができる材質の蓋、例えばシール状の蓋が好ましい。
＜微生物捕集方法＞
図２を参照して、血液試料から微生物（実施例１では、細菌）を捕集する微生物捕集方法を説明する。
図２を参照して、血液試料から微生物（実施例１では、細菌）を捕集する微生物捕集方法を説明する。
図２（ａ）に示すように、容器１の第１の収容部１００に血液試料２００を導入する。第１の収容部１００への血液試料２００の導入は、ユーザが行ってもよいし、ロボットが行ってもよい。血液試料２００は、第１の流路１０３の位置よりも十分に高い位置まで導入されていることが好ましい。次に、第３の収容部１０２に赤血球を破壊するための試薬（例えば、血球破壊試薬）２０１を導入する。第３の収容部１０２への試薬２０１の導入は、ユーザが行ってもよいし、ロボットが行ってもよい。試薬２０１は、例えば、界面活性剤である。界面活性剤の濃度は、細菌の細胞膜には影響しないが、赤血球の細胞膜を破壊するような組成および濃度のものが好ましい。界面活性剤は、血液試料２００を導入した後に導入してもよいし、血液試料２００を導入する前に第３の収容部１０２の中に導入してもよい。
血液試料２００が導入された容器１は、遠心装置に搭載される。その後、図２（ｂ）～（ｅ）の順番に従って、容器１は、種々の遠心加速度で遠心される。遠心された容器１は、徐々に傾斜し、最終的には、容器１の底面に向かって遠心力が加わるように配置される。このとき、容器１の第１の流路１０３及び第２の流路１０４の方向は、遠心力が加わる方向とは異なる。なお、容器１に加わる遠心加速度および遠心時間については、後述の図３により詳細が示される。
初めに、容器１に収容された血液試料２００は、低加速度で遠心分離が行われる。すると、図２（ｂ）に示されるように、血液試料２００は、細菌（第１の成分）を含む菌液（第１の溶液）２０２と、赤血球や白血球など（第２の成分）の質量の重い粒子を含む溶液（第２の溶液）２０３とに分離される。菌液２０２には、細菌の他に、血漿や培地などが含まれ、場合によっては完全に分離されなかった赤血球や白血球が含まれることがある。
次に、血液試料２００は、初めの低加速度の遠心分離よりも僅かに高い加速度で遠心分離が行われる。すると、図２（ｃ）に示されるように、第１の流路１０３における液体の圧力よりも遠心力が上回り、菌液２０２が、第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１に移動する。その後、菌液２０２は、ろ過フィルタ１０５に接し、固体成分である細菌（第１の試料）２０４は、ろ過フィルタ１０５の上に捕集される。ろ過フィルタ１０５は、どのようなものであってもよいが、例えば、口径０．１μｍ以下のメンブレンフィルタが好ましく、より好ましくは親水性のフィルタで、例えばＰＶＤＦなどの材料が好ましい。なお、ろ過フィルタ１０５の口径は、細菌２０４を捕集できるものであれば良く、数μｍ以下のものであれば本用途に適する。ろ過フィルタ１０５を通過した液体成分２０５は、血漿や培地、および細菌よりも十分に小さいタンパク質等を含み、廃液リザーバ１０６に移動する。このようにして、第２の収容部１０１に収容された菌液２０２に含まれる細菌２０４は、ろ過フィルタ１０５上に捕集される。
次に、溶液２０３は、初めと同じ低加速度で遠心分離が行われる。すると、図２（ｄ）に示されるように、第１の収容部１００の溶液２０３は、細菌を含む菌液（第３の溶液）２０６と、赤血球や白血球などの質量の重い粒子を含む血球成分（第４の溶液）２０７とに分離される。
最後に、溶液２０３は、最も高い加速度で遠心分離が行われる。すると、図２（ｅ）に示されるように、第２の流路１０４における液体の圧力よりも遠心力が上回り、菌液２０６が第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２に移動する。第３の収容部１０２に移動した菌液２０６は、試薬２０１と混合され、遠心では分離されずに残存した微量な血球成分が破壊される。その後、引き続く遠心分離によって、第３の収容部１０２に移動した菌液２０６は、液体成分２０８と細菌（第２の試料）２０９とに分離される。細菌２０９は、第３の収容部１０２の底面に溜まり、捕集が可能となる。
なお、分析の精度を向上させる方法として次のようなものが考えられる。例えば、第２の収容部１０１において捕集された細菌２０４や第３の収容部１０２において捕集された細菌２０９には、血液試料２００中に含まれる不純物が混入する可能性がある。その場合には、例えば、図２（ｅ）の状態から、まず液体成分２０８を除去する。その後、細菌２０４及び細菌２０９に対して界面活性剤や生理食塩水を適量滴下し、再度高加速度で遠心分離して洗浄することによって、より純度の高い細菌の試料を煩雑な操作なく取得することができる。
次に、図３を参照して、容器１に加わる遠心加速度と遠心時間との関係を説明する。図３の（ａ）～（ｅ）の時間における容器１の状態の各々は、図２の（ａ）～（ｅ）の状態と対応している。
初めに、血液試料２００は、ｔ１の時間だけ遠心加速度（第１の遠心力）ｘ１で遠心分離が行われる。このとき、第１の収容部１００の血液試料２００が第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１に移動しないように、第１の流路１０３における圧力が遠心力よりも大きくなるように遠心加速度ｘ１が設定される必要がある。また、菌液２０２と溶液２０３との界面位置が、第１の流路１０３の高さよりも低くなるまで遠心分離を行う必要があるため、遠心時間ｔ１は、血球の沈降速度と第１の流路１０３の高さとに基づいて決定される。具体的には、第１の流路１０３の直径、容器１の材質、及び血液試料２００の物性（例えば、粘性等）にも影響されるが、遠心加速度ｘ１は、例えば２０～１００Ｇが好ましい。
次に、血液試料２００は、ｔ２の時間だけ遠心加速度（第２の遠心力）ｘ２で遠心分離が行われる。遠心加速度ｘ２は、遠心加速度ｘ１よりも大きい遠心加速度である必要がある。遠心加速度ｘ２は、第１の流路１０３における圧力よりも遠心力が大きくなるように設定される。すると、第１の流路１０３では、液体を保持することはできなくなり、菌液２０２は、第２の収容部１０１に移動する。なお、第１の流路１０３における圧力は、第１の流路１０３の直径や長さの他に表面張力で決まる。図２（ｂ）の状態においては、第１の流路１０３と第２の流路１０４とでは接する液体が異なる。第１の流路１０３は、血球をほとんど含まない菌液２０２と接し、第２の流路１０４は、血球を含む溶液２０３と接する。このように、第１の流路１０３が接する液体と第２の流路１０４が接する液体とでは表面張力が異なるため、表面張力が大きい液体と接する第２の流路１０４からは溶液２０３は移動しない。
次に、溶液２０３は、ｔ３の時間だけ遠心加速度（第３の遠心力）ｘ１で遠心分離が行われる。このとき、第１の収容部１００から第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２に液体が移動しないように、第２の流路１０４における圧力が遠心力よりも大きくなるように遠心加速度ｘ１が設定される必要がある。また、菌液２０６と血球成分２０７との界面位置が、第２の流路１０４の高さよりも低くなるまで遠心分離を行う必要があるため、遠心の時間ｔ３は、血球の沈降速度と第２の流路１０４の高さとに基づいて決定される。
最後に、溶液２０３は、ｔ４の時間だけ遠心加速度（第４の遠心力）ｘ３で遠心分離が行われる。菌液２０６を第２の流路１０４から第３の収容部１０２へ迅速に移動させるために、遠心加速度ｘ３は十分高い値であることが好ましい。しかし、菌液２０６中の細菌の発育に影響が出る可能性があることも考慮して、１０４Ｇ以下の範囲でできる限り高い遠心加速度とすることが好ましい。遠心加速度ｘ３で遠心分離が行われると、第２の収容部１０１と第３の収容部１０２のそれぞれには、細菌２０４及び細菌２０９が捕集される。第２の収容部１０１に設けられたろ過フィルタ１０５の上には固体状の細菌２０４が、第３の収容部１０２の底面には高濃度の細菌２０９が捕集される。
＜容器１に形成される流路の高さ＞
図４を参照して、容器１に形成される第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さについて説明する。第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さは異なる。この理由は、異なる検査に用いる異なる形態の細菌を自動で捕集するためである。検査としては、ＭＡＬＤＩによる同定検査と感受性検査との２つを考える。例えば、ＭＡＬＤＩによる同定検査の場合には、１０５～１０６ＣＦＵ以上の細菌が必要である。感受性検査では１０５～１０６ＣＦＵ／ｍＬの菌液が必要であり、例えば、マクファーランド比濁法により１．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ（０．５マクファーランド相当）に濃度調整された数百μＬの菌液を用意し、その後百～数百倍に希釈して検査に使う。
図４を参照して、容器１に形成される第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さについて説明する。第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さは異なる。この理由は、異なる検査に用いる異なる形態の細菌を自動で捕集するためである。検査としては、ＭＡＬＤＩによる同定検査と感受性検査との２つを考える。例えば、ＭＡＬＤＩによる同定検査の場合には、１０５～１０６ＣＦＵ以上の細菌が必要である。感受性検査では１０５～１０６ＣＦＵ／ｍＬの菌液が必要であり、例えば、マクファーランド比濁法により１．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ（０．５マクファーランド相当）に濃度調整された数百μＬの菌液を用意し、その後百～数百倍に希釈して検査に使う。
第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さについて考えるために、血液培養陽性試料について考える。第１の収容部１００に導入される血液培養陽性試料の液量は、１０ｍＬとした。血液培養陽性試料に含まれている細菌の濃度は、血液培養陽性までの時間および陽性後からの経過時間、菌種、菌株によって様々に異なるが１０７～１０９ＣＦＵ／ｍＬの範囲であることが一般的である。そこで、最も前処理が難しくなると予想される細菌濃度が１０７ＣＦＵ／ｍＬの場合を考えた。
前提として、第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さは、図４に示した通りである。ｙ１は、第１の収容部１００の底面から第２の流路１０４までの高さである。ｙ２は、第２の流路１０４から第１の流路１０３までの高さである。ｙ３は、第１の流路１０３から規定値を示す目盛り線４００までの高さである。ｙ１＋ｙ２＋ｙ３は、想定される血液試料２００が全量すなわち１０ｍＬ入れられた場合の血液試料２００の高さである。容器１には、ｙ１＋ｙ２＋ｙ３の高さの位置に、視認できる上記した目盛り線４００が設けられる。第１の収容部１００には、少なくとも規定値以上の血液試料２００が導入される必要がある。
まず初めに、第１の収容部１００の底面から第２の流路１０４までの高さｙ１は、次のように決められる。第１の収容部１００には、遠心分離された赤血球が堆積するため、第１の収容部１００の底面からｙ１の高さまでの第１の収容部１００の容積は、血液試料２００中の赤血球の体積以上でなければならない。ここで、血液中の赤血球の比率を示すヘマトクリット値は性別や健康状態にもよるが３０～５５％の範囲である。また、第１の収容部１００に導入される血液試料２００には、患者の血液の他に、予め導入されている培地成分が全容量の２／３程度含まれている。従って、血液培養陽性試料中の赤血球の比率は最大でも約１／６だと言える。従って、より効率的に血液試料を前処理するためには、ｙ１の高さは血液試料２００の投入量の規定高さに対して１６．７％以上であることが好ましく、例えば２０％と定められる。
次に、ｙ３の高さは次のように決められる。細菌濃度が１０７ＣＦＵ／ｍＬの場合には、試料が１ｍＬあれば１０７ＣＦＵの細菌を抽出できる。これはＭＡＬＤＩにおける必要な細菌量の１０倍以上であり、十分な細菌量を抽出できると考えられる。従って、ｙ３の高さは、血液試料２００の投入量の規定高さに対して１０％程度であることが好ましい。
以上の計算より、ｙ２の高さは、自動的に決まる。つまり、ｙ２の高さは、血液試料２００の投入量の規定高さに対して７０％程度となる。この場合には、第３の収容部１０２の底面付近に抽出される細菌量は、１０７ＣＦＵ／ｍＬ×７ｍＬ＝７×１０７ＣＦＵとなる。実際の操作では、このような微量の高濃度の細菌液を数百μＬ、例えば２００μＬの液に希釈し濃度調整を行い、１．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ（０．５マクファーランド相当）とする。この計算によると、１．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの菌液が必要なところに対して、３．５×１０８ＣＦＵ／ｍＬの菌液が抽出できるため、分離中における細菌のロスを考慮しても十分量を抽出することが可能である。
この計算の一例は、血液培養陽性試料の細菌濃度が低い場合の想定であり、実際には、血液培養陽性試料中の細菌濃度は１０８ＣＦＵ／ｍＬ以上であることが多く、余裕をもって細菌を抽出することができる。
第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さ以外に、容器１を特徴づける要素は次のようなものがある。
容器１は、血液試料２００を導入して遠心分離に供することができる容器を使用することができる。例えば、第１の収容部１００の容積は、１～２０ｍＬ、好ましくは８～１５ｍＬとすることができる。第２の収容部１０１の容積と第３の収容部１０２の容積との合計は、第１の収容部１００の容積以上であればよい。また、第３の収容部１０２で捕集される細菌量は、第２の収容部１０１よりも多いため、第３の収容部１０２の容積が多い方が好ましい。また、容器１の材質は、遠心分離などの操作に適した材質であれば特に限定されるものではない。例えば、容器１は、疎水性の材質で作製されていることが好ましい。これは容器１と血液試料２００との親和性が良好な場合には、表面張力により血液試料２００が遠心分離前に第１の流路１０３や第２の流路１０４から移動される可能性があるためである。例えば、容器１は、アクリル系樹脂、ＡＢＳ樹脂、ポリプロピレン、ポリスチレンまたはポリエチレンなどの材質で作製されることが好ましく、３Ｄプリンタや射出成型を利用して作製される。他にも、アルミやステンレスを用いて切削加工により容器１を作製してもよい。疎水性にするために容器１に化学処理を行い、表面改質を行ってもよい。なお、容器１は、不透明であってもよいが、透明の場合には、内部の状態を視認もしくは装置による光学測定、撮像が容易となる。液量の過不足検知、試料の詰まり、及び、試料中の異物の検出を容易にするため、容器１は、透明であることが好ましい。コンタミネーションの観点から容器１は使い捨てが好ましいが、例えば、洗浄及び殺菌処理を行った後に繰り返し、使用しても問題ない。
容器１の外形は、遠心分離可能な形状であれば、どのような形状であっても構わない。第２の収容部１０１のろ過フィルタ１０５が設置される底面部分及び第３の収容部１０２の試薬を収容する底面部分は、細菌２０４及び２０９を効率的に捕集するため、すり鉢状の形状であることが好ましい。
第１の流路１０３及び第２の流路１０４は、どのような形状でもよい。第１の流路１０３及び第２の流路１０４は、例えば、断面形状が円形の円柱状、又は、断面形状が長方形の直方体形状である。第１の流路１０３及び第２の流路１０４の径は次のように考えられる。血液中には、赤血球や白血球、血小板が含まれ、その中で大きさが最大のものは白血球で直径は６～３０μｍとなる。第１の流路１０３及び第２の流路１０４の直径がこれよりも小さい場合にはキャピラリーバルブの効果でなく、血球が第１の流路１０３及び第２の流路１０４を詰まらせ、液体が放出されない場合もある。従って、血液試料２００と容器１の表面親和性にもよるが、血球と液体成分との分離および第１の流路１０３及び第２の流路１０４からの移動を連続的に行う上で、現実的な第１の流路１０３及び第２の流路１０４の径の最適値の範囲は、１０～１００μｍである。また、第１の流路１０３の径と第２の流路１０４の径は、異なってもよいが、好ましくは同じ径である。
第３の収容部１０２に導入される試薬２０１は、微生物の発育に影響を与えずに血球を破壊することができる試薬であれば特に限定されるものではない。例えば、試薬２０１は、少なくとも１種の界面活性剤を含むものが好ましい。界面活性剤としては、限定されるものではないが、例えば親水性および疎水性部分を有し前記疎水性部分が鎖状炭化水素である陰イオン性界面活性剤、または親水性および疎水性部分を有し前記疎水性部分が環状炭化水素を有する界面活性剤、あるいは両者の組み合わせが挙げられる。具体的には、前者として、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸リチウム、およびＮ－ラウロイルサルコシンナトリウムが挙げられ、後者として、サポニン、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－１－プロパンスルホナート、および３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホナートが挙げられる。
＜検査システム＞
図５を参照して、細菌検査を自動で行う検査システム５００を説明する。検査システム５００は、遠心装置５０１、分取装置５０２、塗布装置５０３、濃度計測装置５０４、同定検査装置５０５、感受性検査装置５０６、及び、制御ＰＣ５０８を備える。各装置は、信号線５０７によって接続され、制御ＰＣ５０８が各装置の動作を制御する。
図５を参照して、細菌検査を自動で行う検査システム５００を説明する。検査システム５００は、遠心装置５０１、分取装置５０２、塗布装置５０３、濃度計測装置５０４、同定検査装置５０５、感受性検査装置５０６、及び、制御ＰＣ５０８を備える。各装置は、信号線５０７によって接続され、制御ＰＣ５０８が各装置の動作を制御する。
遠心装置５０１は、上記した１又は複数の容器１が搭載可能であって、搭載された容器１の第１の収容部１００に導入された血液試料２００を遠心し、同定検査装置５０５で使用される細菌２０４及び感受性検査装置５０６で使用される細菌２０９を分離する。遠心装置５０１は、血液試料２００の遠心分離、第２の収容部１０１への菌液２０２の移動、及び、第３の収容部１０２への菌液２０６の移動のために設定された少なくとも３つの加速度で、血液試料２００を遠心する。容器１は、搬送機構５０９によって分取装置５０２に搬送される。ユーザが、容器１を遠心装置５０１から分取装置５０２に搬送してもよい。
分取装置５０２は、例えば、先端の鋭利な検体採取棒５１０を用いて容器１の第２の収容部１０１に捕集された細菌２０４を取得し、シリンジ５１１を用いて容器１の第３の収容部１０２に捕集された細菌２０９を取得する。取得された細菌２０４及び細菌２０９は、それぞれ異なる装置に送られる。
塗布装置５０３では、同定検査のための質量分析で用いられるＭＡＬＤＩのターゲットプレートに固体状の細菌塗布、およびマトリックス試薬の塗布が実施される。
濃度計測装置５０４では、例えば、マクファーランド濁度の計測により、菌液の濃度が計測される。
上記した遠心装置５０１、分取装置５０２、塗布装置５０３及び濃度計測装置５０４を兼ね備えたものが前処理装置５１２となる。但し、必ずしも塗布装置５０３は、必要な構成要素として存在しなくてもよい。例えば、分取装置５０２が細菌２０４を取得した検体採取棒５１０をユーザに返却し、ユーザ自身でターゲットプレートへの塗布を行ってもよい。
前処理装置５１２にて計測した濃度値は、制御ＰＣ５０８に付随される表示器などに表示しユーザに知らせてもよい。濃度値が目標値以上となる場合には、例えば、ユーザに通知し、ユーザが濃度を目標値に調整することにより、検査の信頼性を保つことができる。また、濃度が目標値以下の場合には、エラーのフラグを表示し、再度前処理を実施しなおすことや菌液を追加で培養した後に検査に使用する方法をとってもよい。
他には、付随的な機能として、分取装置５０２は、例えば濃度計測や画像計測を用いて容器１の外観情報を取得し、前段の処理が正常に実行できているかを確認する機能があってもよい。例えば、正常に前段の処理が実施されている場合には、図２（ｅ）のように第１の収容部１００中の血液試料２００の液面高さは、第２の流路１０４の高さと同程度になる。しかし、前段の処理が途中で停止している場合には、第１の収容部１００中の血液試料２００の液面高さは、第２の流路１０４の高さよりも十分高くなる。分取装置５０２は、このような情報に基づいて、前段の処理が正常に終了したかどうかの妥当性検証が可能である。
前処理装置５１２により処理された試料は、一度ユーザに返却され、必要に応じて追加の処理工程などを行った後、同定検査装置５０５及び感受性検査装置５０６によって検査される。同定検査装置５０５は、細菌２０４から得られた試料を用いて細菌の種類を判定する。また、感受性検査装置５０６は、細菌２０９から得られた試料を用いて細菌の増殖度を判定する。同定検査の場合には、場合によってはユーザ自身でのターゲットプレートへの細菌およびマトリックス試薬の塗布を行った後、装置により菌種の同定が実施される。感受性検査の場合には、例えば目的濃度への菌液の調整および９６穴プレートなどに分注が行われ、感受性検査装置５０６により増殖やＭＩＣの判定が行われる。菌種の同定や感受性検査の判定の進行状況や判定結果は、制御ＰＣ５０８に付随の表示器に表示され、ユーザに結果が通知される。その他に、制御ＰＣ５０８は、血液試料２００に応じて、遠心装置５０１における遠心分離の加速度や時間、濃度計測装置５０４における細菌の濃度の目標値などの各装置のパラメータを入力し、その値に応じて処理内容を変更できるようにすることが好ましい。
＜遠心装置＞
図６を参照して、遠心装置５０１の詳細を説明する。図６に示すように、遠心装置５０１は、容器搭載部６０１と、駆動部６０２と、制御基板６０３と、を備える。容器搭載部６０１には、１又は複数の容器１が搭載される。駆動部６０２は、容器搭載部６０１に搭載された容器１内の血液試料２００に遠心力を加えるアクチュエータである。制御基板６０３は、駆動部６０２の動作を制御する制御部である。制御基板６０３は、プロセッサ６１０と、主記憶装置６１１と、補助記憶装置６１２と、入出力Ｉ／Ｆ６１３と、制御基板６０３の各部を通信可能に接続するバス６１４と、を備える。入出力Ｉ／Ｆ６１３は、信号線５０７を介して制御ＰＣ５０８と通信可能に接続されており、制御ＰＣ５０８からの指示を受信する。プロセッサ６１０は、制御ＰＣ５０８からの指示に従い、駆動部６０２を駆動する駆動信号を生成する。入出力Ｉ／Ｆ６１３は、駆動部６０２と通信可能に接続されており、プロセッサ６１０によって生成された駆動信号を駆動部６０２に出力する。駆動部６０２は、駆動信号に従い、容器１を種々の遠心加速度で遠心する。
図６を参照して、遠心装置５０１の詳細を説明する。図６に示すように、遠心装置５０１は、容器搭載部６０１と、駆動部６０２と、制御基板６０３と、を備える。容器搭載部６０１には、１又は複数の容器１が搭載される。駆動部６０２は、容器搭載部６０１に搭載された容器１内の血液試料２００に遠心力を加えるアクチュエータである。制御基板６０３は、駆動部６０２の動作を制御する制御部である。制御基板６０３は、プロセッサ６１０と、主記憶装置６１１と、補助記憶装置６１２と、入出力Ｉ／Ｆ６１３と、制御基板６０３の各部を通信可能に接続するバス６１４と、を備える。入出力Ｉ／Ｆ６１３は、信号線５０７を介して制御ＰＣ５０８と通信可能に接続されており、制御ＰＣ５０８からの指示を受信する。プロセッサ６１０は、制御ＰＣ５０８からの指示に従い、駆動部６０２を駆動する駆動信号を生成する。入出力Ｉ／Ｆ６１３は、駆動部６０２と通信可能に接続されており、プロセッサ６１０によって生成された駆動信号を駆動部６０２に出力する。駆動部６０２は、駆動信号に従い、容器１を種々の遠心加速度で遠心する。
＜細菌の検査方法＞
図７を参照して、実施例１の細菌の検査方法を説明する。図７のＳ７１～Ｓ７４の各処理は、遠心装置５０１のコンピュータシステムである制御基板６０３からの指令によって、遠心装置５０１で実行される。
図７を参照して、実施例１の細菌の検査方法を説明する。図７のＳ７１～Ｓ７４の各処理は、遠心装置５０１のコンピュータシステムである制御基板６０３からの指令によって、遠心装置５０１で実行される。
始めに、ステップＳ７０では、容器１の第１の収容部１００に血液試料２００が導入される。容器１に血液試料２００を導入する処理は、ユーザが行ってもよいし、ロボットが行ってもよい。なお、血球を破壊する界面活性剤などの試薬２０１は、ステップＳ７０で第３の収容部１０２に導入してもよいし、ステップＳ７０の前に第３の収容部１０２に導入してもよい。
図７では、ステップＳ７１～Ｓ７４が個別に記載されているが、ステップＳ７１～Ｓ７４の一連の処理は、遠心装置５０１によって自動的に連続で実施される。ステップＳ７１では、血液試料２００が収容された容器１を低加速度で遠心し、血液試料２００を菌液２０２と溶液２０３とに分離する。ステップＳ７２では、血液試料２００が収容された容器１を中加速度で遠心し、菌液２０２を第１の収容部１００から第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１へ移動させる。そして、第２の収容部１０１に移動した菌液２０２は、ろ過フィルタ１０５によって液体成分２０５が除かれて、細菌２０４が捕集される。ステップＳ７３では、溶液２０３が収容された容器１を低加速度で遠心し、溶液２０３を菌液２０６と血球成分２０７とに分離する。そして、ステップＳ７４では、溶液２０３が収容された容器１を高加速度で遠心し、菌液２０６を第１の収容部１００から第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２へ移動させる。第３の収容部１０２では、試薬２０１により菌液２０６中に残存する赤血球が破壊され、液体中に溶出される。その結果、細菌成分のみが第３の収容部１０２の底面に溜まる。
ステップＳ７５では、同定検査装置５０５は、第２の収容部１０１で捕集された細菌２０４を用いて、同定検査を行う。例えば、ＭＡＬＤＩによる同定検査のためには、第２の収容部１０１のろ過フィルタ１０５上に捕集された固体状の細菌２０４の塊を取得し、ターゲットプレートに塗布した後、適切なマトリックス試薬を滴下、乾燥させて同定検査を行えばよい。同定検査の検出感度を向上させるためには、通常のＭＡＬＤＩの手法と同じくエタノールやギ酸、アセトニトリル等によるタンパク質抽出処理を行っても問題ない。
ステップＳ７６では、感受性検査装置５０６は、第３の収容部１０２の底面に溜まった高濃度の菌液を取得し、感受性検査を行う。具体的には、ピペットチップなどで底面に溜まった高濃度の細菌２０９を取得するか、もしくは上清を除いた後に底面に溜まった高濃度の細菌２０９を取得する。そして、例えばマクファーランド比濁法により菌液の濃度を調整し、その菌液を用いて感受性検査を行う。
ステップＳ７７では、細菌検査結果の報告を行う。具体的には、Ｓ７５で行われた同定検査により、細菌種や判定スコアの情報が報告される。また、Ｓ７６で行われた感受性検査により、薬剤名とその薬剤のＭＩＣ（Ｍｉｎｕｍｕｍ Ｉｎｈｉｂｉｔｒｙ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｉｏｎ）や感性／耐性などの情報などが検査技師および医師に報告される。
＜実施例１の効果＞
実施例１では、側面に高さの異なる第１の流路１０３及び第２の流路１０４を有する第１の収容部１００と、第１の収容部１００と第１の流路１０３を介して接続された第２の収容部１０１と、第１の収容部１００と第２の流路１０４を介して接続された第３の収容部１０２と、を備える容器１を種々の遠心加速度で遠心分離する。これにより、第１の収容部１００に導入された血液試料２００から血球と細菌とを分離することが可能となる。そして、第１の収容部１００に収容された血液試料２００を遠心することにより、第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１に菌液２０２を移動させることができ、且つ、第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２に菌液２０６を移動させることができる。これにより、第２の収容部１０１及び第３の収容部１０２のそれぞれに形態が異なる固体状の細菌２０４及び液体状の細菌２０９を捕集することが可能となる。このように、実施例１では、簡便で安定的な方法で、同定検査及び感受性検査で使用される異なる形態の細菌試料を一度に取得することが可能となる。
実施例１では、側面に高さの異なる第１の流路１０３及び第２の流路１０４を有する第１の収容部１００と、第１の収容部１００と第１の流路１０３を介して接続された第２の収容部１０１と、第１の収容部１００と第２の流路１０４を介して接続された第３の収容部１０２と、を備える容器１を種々の遠心加速度で遠心分離する。これにより、第１の収容部１００に導入された血液試料２００から血球と細菌とを分離することが可能となる。そして、第１の収容部１００に収容された血液試料２００を遠心することにより、第１の流路１０３を介して第２の収容部１０１に菌液２０２を移動させることができ、且つ、第２の流路１０４を介して第３の収容部１０２に菌液２０６を移動させることができる。これにより、第２の収容部１０１及び第３の収容部１０２のそれぞれに形態が異なる固体状の細菌２０４及び液体状の細菌２０９を捕集することが可能となる。このように、実施例１では、簡便で安定的な方法で、同定検査及び感受性検査で使用される異なる形態の細菌試料を一度に取得することが可能となる。
上記したように、血液試料を導入した後、予め決められた遠心加速度で一連の遠心分離操作を１回行えば異なる形態の細菌試料が抽出される。液体成分の少ない固体状の細菌試料はＭＡＬＤＩによる質量分析向けの利用に適しており、液体状の細菌試料は感受性検査向けの利用に適している。抽出される細菌量は、第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さによって制御できるため、ユーザは煩雑な操作なしでそれぞれの検査に適した規定量以上の細菌試料を自動で取得することが可能である。
通常、一昼夜程度を要する分離培養後のコロニーからの細菌取得および菌液作成と同等の試料調製を、１回の前処理数十分程度で実現可能である。公知の方法では、複数回の分離や破壊処理および洗浄工程により繰り返しの遠心分離が必要であり、また同定検査や感受性検査用の異なった試料を一度の前処理で得ることはできなかったが、本発明では一連の工程が連続的に実施されることで迅速な検査が可能となる。
また、実施例１では、第２の収容部１０１のろ過フィルタ１０５によって固体状の細菌２０４を捕集することができる。これにより、同定検査で必要な固体状の細菌を取得することができる。
また、実施例１では、第３の収容部１０２に導入された試薬２０１によって、菌液２０６中の細菌の細胞膜には影響しないが、赤血球の細胞膜を破壊することが可能となる。これにより、遠心では分離されずに残存した菌液２０６中の微量な血球成分を破壊することが可能となる。
また、実施例１では、第１の流路１０３及び第２の流路１０４の高さは、第１の収容部１００の底面から規定値までの高さの１/６以上であり、且つ、第１の流路１０３の高さと第２の流路１０４の高さとの差（ｙ２）は、第１の収容部１００の底面から規定値までの高さの１/２以上である。患者の血液の他に、培地成分が全容量の２／３程度含まれている血液試料２００から同定検査及び感受性検査で必要な量の細菌試料を取得することが可能となる。
また、実施例１では、溶液２０３を遠心加速度ｘ２より十分大きな遠心加速度ｘ３で遠心することによって、菌液２０６を第２の流路１０４から第３の収容部１０２へ迅速に移動させることが可能となる。
また、実施例１では、細菌２０４を用いて細菌の種類を判定することができ、且つ、細菌２０９を用いて細菌の増殖度を判定することができる。
また、実施例１では、容器１の第２の収容部１０１及び第３の収容部１０２の各々の底面がすり鉢状の形状であるので、捕集された細菌２０４や２０９を鋭利な針又は棒、及びピペットチップやシリンジで効率的に取得することができる。
（実施例２）
実施例１では、第２の収容部１０１に捕集された細菌や２０４第３の収容部１０２に捕集された細菌２０９をユーザが針やピペットチップを使って手動で取得する例について説明した。実施例２では、第２の収容部１０１に捕集された細菌２０４を自動的に分取し塗布する、また、第３の収容部１０２に捕集された細菌２０９を自動的に分取し、希釈し、濃度測定する。
実施例１では、第２の収容部１０１に捕集された細菌や２０４第３の収容部１０２に捕集された細菌２０９をユーザが針やピペットチップを使って手動で取得する例について説明した。実施例２では、第２の収容部１０１に捕集された細菌２０４を自動的に分取し塗布する、また、第３の収容部１０２に捕集された細菌２０９を自動的に分取し、希釈し、濃度測定する。
実施例２の検査システム８００は、実施例１と同様に、遠心装置５０１、分取装置５０２、塗布装置５０３、同定検査装置５０５、感受性検査装置５０６、及び、制御ＰＣ５０８を備える。そして、実施例２の検査システム８００は、濃度計測及び希釈装置８０１、駆動機構８０２、駆動制御機構８０３、把持機構８０４、及び、搬送装置８０９を備える。
駆動機構８０２は、駆動制御機構８０３によって制御される。駆動機構８０２は、把持機構８０４を遠心装置５０１から分取装置５０２まで移動させる。把持機構８０４は、容器１を把持可能に構成されており、遠心装置５０１で遠心された容器１を把持する。また、駆動機構８０２は、検体採取棒５１０を分取装置５０２から塗布装置５０３まで移動させる。さらに、駆動機構８０２は、シリンジ５１１を分取装置５０２から濃度計測及び希釈装置８０１に移動させる。塗布装置５０３で作製された試料は、搬送装置８０９によって同定検査装置５０５まで搬送される。また、濃度計測及び希釈装置８０１によって濃度計測及び希釈された試料は、搬送装置８０９によって感受性検査装置５０６まで搬送される。
＜実施例２の効果＞
実施例２の検査システム８００は、遠心装置５０１での遠心から同定検査装置５０５での検査及び感受性検査装置５０６での検査までを自動的に実施することができる。
実施例２の検査システム８００は、遠心装置５０１での遠心から同定検査装置５０５での検査及び感受性検査装置５０６での検査までを自動的に実施することができる。
なお、本発明は、上記の実施例に限定されるものではなく、様々な変形例が含まれる。上記の実施例は本発明を分かりやすく説明するために詳細に説明したものであり、必ずしも説明した全ての構成を有するものに限定されるものではない。また、ある実施例の構成の一部を他の実施例の構成に置き換えることも可能であり、また、ある実施例の構成に他の実施例の構成を加えることも可能である。また、各実施例の構成の一部について、他の構成の追加・削除・置換をすることも可能である。
１…容器、１００…第１の収容部、１０１…第２の収容部、１０２…第３の収容部、１０３…第１の流路、１０４…第２の流路、１０５…ろ過フィルタ、１０６…廃液リザーバ、１０７…蓋、１０８…蓋、２００…血液試料、２０１…試薬、２０２…菌液、２０３…溶液、２０４…細菌、２０５…液体成分、２０６…菌液、２０７…血球成分、２０８…液体成分、２０９…細菌、４００…目盛り線、５００…検査システム、５０１…遠心装置、５０２…分取装置、５０３…塗布装置、５０４…濃度計測装置、５０５…同定検査装置、５０６…感受性検査装置、５０７…信号線、５０８…制御ＰＣ、５０９…搬送機構、５１０…検体採取棒、５１１…シリンジ、５１２…前処理装置、６０１…容器搭載部、６０２…駆動部、６０３…制御基板、６１０…プロセッサ、６１１…主記憶装置、６１２…補助記憶装置、６１３…入出力Ｉ／Ｆ、６１４…バス、８００…検査システム、８０１…濃度計測および希釈装置、８０２…駆動機構、８０３…駆動制御機構、８０４…把持機構、８０９…搬送装置
Claims (13)
- 側面に高さの異なる第１の流路及び第２の流路を有する第１の収容部と、前記第１の収容部と前記第１の流路を介して接続された第２の収容部と、前記第１の収容部と前記第２の流路を介して接続された第３の収容部とを備える容器の前記第１の収容部に試料を導入すること、
前記第１の収容部に導入された前記試料を、第１の遠心力にて遠心し、第１の成分を含む第１の溶液と第２の成分を含む第２の溶液とに分離させること、
前記第１の収容部に収容される前記試料を、前記第１の遠心力より大きい第２の遠心力にて遠心し、前記第１の溶液を前記第１の流路を介して前記第２の収容部に移動させること、
前記第１の収容部に収容される前記第２の溶液を、第３の遠心力にて遠心し、前記第１の成分を含む第３の溶液と前記第２の成分を含む第４の溶液とに分離させること、及び、
前記第１の収容部に収容される前記第２の溶液を、前記第３の遠心力より大きい第４の遠心力にて遠心し、前記第３の溶液を前記第２の流路を介して前記第３の収容部に移動させること、
を有することを特徴とする捕集方法。 - 請求項１に記載の捕集方法において、
前記第２の収容部内に設けられたろ過部材によって、前記第１の溶液を前記第１の成分と液体成分とに分離すること、
をさらに有することを特徴とする捕集方法。 - 請求項１に記載の捕集方法において、
前記第３の収容部に収容された試薬によって、前記第３の溶液に含まれる前記第２の成分の細胞膜を破壊すること、
をさらに有することを特徴とする捕集方法。 - 請求項１に記載の捕集方法において、
前記第１の流路は、前記第２の流路よりも高い位置に設けられており、
前記第１の収容部に前記試料を導入することは、前記第１の収容部に前記第１の流路よりも高い規定値以上に前記試料を導入することを含み、
前記第１の溶液を前記第２の収容部に移動させることは、前記第１の収容部に導入された前記試料の高さと前記第１の流路の高さとの差に基づいて決定される量の前記第１の溶液を前記第１の流路を介して前記第２の収容部に移動させることを含み、
前記第３の溶液を前記第３の収容部に移動させることは、前記第１の流路の高さと前記第２の流路の高さとの差に基づいて決定される量の前記第３の溶液を前記第２の流路を介して前記第３の収容部に移動させることを含む、
ことを特徴とする捕集方法。 - 請求項４に記載の捕集方法において、
前記第１の流路及び前記第２の流路の高さは、前記第１の収容部の底面から前記規定値までの高さの１/６以上であり、
前記第１の流路の高さと前記第２の流路の高さとの差は、前記第１の収容部の底面から前記規定値までの高さの１/２以上である、
ことを特徴とする捕集方法。 - 請求項１に記載の捕集方法において、
前記第４の遠心力は、前記第２の遠心力より大きい、
ことを特徴とする捕集方法。 - 請求項１に記載の捕集方法によって前記第２の収容部に移動された前記第１の溶液から第１の試料を取得すること、
請求項１に記載の捕集方法によって前記第３の収容部に移動された前記第３の溶液から第２の試料を取得すること、
前記第１の試料を用いて前記第１の成分の種類を判定すること、及び、
前記第２の試料を用いて前記第１の成分の増殖度を判定すること、
を有することを特徴とするの検査方法。 - 遠心装置に搭載される容器であって、
試料を導入可能であって、側面に高さの異なる第１の流路及び第２の流路を有する第１の収容部と、
前記第１の収容部と前記第１の流路を介して接続された第２の収容部と、
前記第１の収容部と前記第２の流路を介して接続された第３の収容部と、
を備えることを特徴とする容器。 - 請求項８に記載の容器において、
前記第２の収容部は、前記第１の収容部から前記第２の収容部に移動した溶液を第１の成分と液体成分とに分離するろ過部材を設置する部分を有する、
ことを特徴とする容器。 - 請求項８に記載の容器において、
前記第３の収容部は、前記第１の収容部から前記第３の収容部に移動した溶液に含まれる第２の成分の細胞膜を破壊する試薬を収容する部分を有する、
ことを特徴とする容器。 - 請求項８に記載の容器と、
前記容器の前記第１の収容部に導入された前記試料を遠心する駆動部と、
前記駆動部が前記試料に加える遠心力を制御する制御部と、を備え、
前記制御部は、
前記第１の収容部に導入された前記試料を第１の遠心力にて遠心するように前記駆動部を制御し、前記試料を、第１の成分を含む第１の溶液と第２の成分を含む第２の溶液とに分離させ、
前記第１の収容部に収容される前記試料を、前記第１の遠心力より大きい第２の遠心力にて遠心するように前記駆動部を制御し、前記第１の溶液を前記第１の流路を介して前記第２の収容部に移動させ、
前記第１の収容部に収容される前記第２の溶液を、第３の遠心力にて遠心するように前記駆動部を制御し、前記第１の成分を含む第３の溶液と前記第２の成分を含む第４の溶液とに分離させ、
前記第１の収容部に収容される前記第２の溶液を、前記第３の遠心力より大きい第４の遠心力にて遠心するように前記駆動部を制御し、前記第３の溶液を前記第２の流路を介して前記第３の収容部に移動させる、
ことを特徴とする遠心装置。 - 請求項１１に記載の遠心装置において、
前記制御部は、
前記第４の遠心力が前記第２の遠心力より大きくなるように前記駆動部を制御する、
ことを特徴とする遠心装置。 - 請求項１１に記載の遠心装置と、
前記容器の前記第２の収容部に収容される前記第２の溶液から第１の試料を取得し、前記第３の収容部に収容される前記第３の溶液から第２の試料を取得する分取装置と、
前記分取装置によって取得された前記第１の試料を用いて前記第１の成分の種類を判定する同定検査装置と、
前記分取装置によって取得された前記第２の試料を用いて前記第１の成分の増殖度を判定する感受性検査装置と、
を備えることを特徴とする検査システム。
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| PCT/JP2022/000884 WO2023135704A1 (ja) | 2022-01-13 | 2022-01-13 | 捕集方法、検査方法、容器、遠心装置および検査システム |
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|---|---|
| WO2023135704A1 true WO2023135704A1 (ja) | 2023-07-20 |
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- 2022-01-13 WO PCT/JP2022/000884 patent/WO2023135704A1/ja active Application Filing
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