CN116496396B - 抗cd70纳米抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及抗CD70纳米抗体及其用途。本发明提供一种CD70结合分子，包含抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗CD70纳米抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3。本发明还提供含有所述CD70结合分子的嵌合抗原受体及其表达细胞。本文所述抗体和细胞具有良好的安全性以及靶向CD70的治疗效果。

Description

抗CD70纳米抗体及其用途
技术领域
本发明涉及生物免疫治疗技术领域，具体涉及抗CD70纳米抗体及其用途。
背景技术
CD70属于肿瘤坏死因子(TNF)超家族成员，正常组织中CD70是一种II型跨膜糖蛋白，仅仅短暂地表达在活化的T细胞、B细胞及成熟的树突状细胞中，CD27是其受体。在病理状态下，研究发现CD70高表达于多种肿瘤细胞中。目前以CD70为靶点的免疫治疗药物已经在临床前期研究中应用。
研究表明CD70在多种恶性肿瘤中表达均异常升高，包括肾细胞癌、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤及其它肿瘤等，是一个有前景的肿瘤免疫治疗靶标。
嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cell，CAR-T)是一种针对肿瘤细胞表面特异性抗原的新型免疫治疗方法。现在，许多研究人员正在开发治疗实体瘤的CAR-T细胞。
抗体作为CAR中重要的组成部分，其对于CAR-T发挥特异性高效杀伤作用、降低毒性具有决定性影响。因此能够以高特异性结合目标抗原、同时具有低免疫原性的抗体是开发CAR-T产品的重点。羊驼体内能够产生特异性、亲和力高的VHH抗体，同时由于VHH抗体本身的特性使其能够识别传统scFv抗体不能识别的抗原表位，另外羊驼VHH基因与人VH基因具有较高的同源性，所以免疫原性比较低也利于人源化改造。本领域尚无含抗CD70纳米抗体的CAR-T细胞报道。
发明内容
本发明提供一种CD70结合分子，包含抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗CD70纳米抗体的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，其中CDR1包括SEQ ID NO:1-7中任一所示的序列、CDR2包括SEQ ID NO:8-13中任一所示的序列、和CDR3包括SEQ ID NO:14-20中任一所示的序列。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD70纳米抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:21-28中任一所示。
在一个或多个实施方案中，所述抗CD70纳米抗体的FR1可选自SEQ ID NO:21-28中任一所示的VHH的FR1，FR2可选自SEQ ID NO:21-28中任一所示的VHH的FR2，FR3可选自SEQID NO:21-28中任一所示的VHH的FR3，FR4可选自SEQ ID NO:21-28中任一所示的VHH的FR4，
在一个或多个实施方案中，所述CD70结合分子是包含一条、两条或多条抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段的单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体。
在一个或多个实施方案中，所述多价结合分子或多特异性结合分子通过连接子连接多个抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段。所述连接子由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
在一个或多个实施方案中，所述纳米抗体是骆驼重链抗体或软骨鱼重链抗体。
在一个或多个实施方案中，所述纳米抗体还包含重链恒定区。
在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是骆驼重链抗体的恒定区，包含CH2和CH3。在一个或多个实施方案中，所述CH2和CH3是人IgG Fc的CH2和CH3，例如IgG1的CH2和CH3。优选地，所述重链恒定区如SEQ ID NO:37所示。
在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是软骨鱼重链抗体的恒定区，包含CH1、CH2、CH3、CH4和CH5。
在一个或多个实施方案中，本发明任一实施方案所述的CD70结合分子为嵌合抗体或完全人抗体；优选为完全人抗体。
本发明另一方面提供一种嵌合抗原受体，包含任选的信号肽序列、本文任一实施方案所述的CD70结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。
在一个或多个实施方案中，胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。
在一个或多个实施方案中，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、本文任一实施方案所述的CD70结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。
本发明还提供核酸分子，其具有选自以下任一项的序列：
(1)本文任一实施方案所述CD70结合分子或嵌合抗原受体的编码序列；
(2)(1)的互补序列；
(3)(1)或(2)中任一序列的5-50bp的片段。
在一个或多个实施方案中，所述片段是引物。
本发明还提供一种核酸构建物，包含本文所述的核酸分子。
在一个或多个实施方案中，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。
本发明还提供一种宿主细胞，选自：
(1)表达和/或分泌本文任一实施方案所述CD70结合分子或嵌合抗原受体；
(2)包含本文所述的核酸分子；和/或
(3)包含本文所述的核酸构建物。
在一个或多个实施方案中，所述宿主细胞是免疫效应细胞，优选T细胞。
本发明还提供一种产生本文任一实施方案CD70结合分子的方法，包括：在适合产生CD70结合分子(例如纳米抗体或其抗原结合片段，单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体)的条件下培养本文所述的宿主细胞，和任选的从培养物中纯化所述CD70结合分子。
本发明还提供一种药物组合物，包含本文任一实施方案所述CD70结合分子、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞，和药学上可接受的辅料。
在一个或多个实施方案中，所述药物组合物用于治疗CD70表达相关的疾病或病况。
本发明还提供本文任一实施方案所述CD70结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在制备活化的免疫细胞(例如T细胞)中的用途。
本发明还提供本文任一实施方案所述CD70结合分子、嵌合抗原受体、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞在制备用于预防或治疗CD70表达相关的疾病或病况的药物中的用途。
在一个或多个实施方案中，所述疾病或病况选自以下的一种或多种：肾细胞癌、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤。
本发明还提供一种治疗或预防CD70表达相关的疾病或病况的方法，所述方法包括给予需要的患者治疗有效量的本发明任一实施方案所述的CD70结合分子或宿主细胞，或本发明任一实施方案所述的药物组合物。
本发明还提供一种检测CD70的试剂盒，用于例如评估药物治疗效果或诊断癌症，所述的试剂盒包含本文任一实施方案所述CD70结合分子、核酸分子、核酸构建物或宿主细胞。
在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还包括用于检测CD70与所述CD70结合分子的结合的试剂。例如通过酶联免疫反应法检测所述结合的试剂。
在一个或多个实施方案中，所述检测结合的试剂是能与CD70结合分子连接的可检测标记物，例如生物素。所述的可检测标记物被连接于所述CD70结合分子或分离地存在于试剂盒中。
本发明还提供一种检测样品中CD70存在情况的非诊断性方法，所述方法包括：以本文任一实施方案所述CD70结合分子与样品孵育，和检测CD70与所述CD70结合分子的结合，从而确定样品中CD70存在情况。所述检测是酶联免疫反应法检测。
本发明还提供本文任一实施方案所述CD70结合分子在制备用于检测样品中CD70、评估药物治疗效果或诊断癌症的试剂盒中的用途。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的特异性识别CD70的迷你抗体以及含有该抗体的CAR修饰细胞，该抗体和细胞具有良好的安全性以及靶向CD70的治疗效果，为与CD70表达相关的疾病提供了新的治疗或改善途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中重组人CD70-huFc重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果。
图2为实施例1中重组人CD70-huFc蛋白与重组人CD27蛋白结合曲线测定实验结果。
图3为实施例2中PCR扩增羊驼VH-CH2基因后DNA电泳结果。
图4为实施例2中PCR扩增羊驼VHH基因后DNA电泳结果。
图5为实施例2中VHH/pcomb3X连接效率检测实验DNA电泳结果。
图6为实施例3中重组VHH-huFc抗体蛋白SDS-PAGRE电泳结果。
图7为实施例4中重组VHH-huFc抗体/CD70-huFc重组蛋白结合曲线测定结果。
图8为实施例5中重组VHH-huFc抗体亲和力测定实验结果。
图9为实施例6中重组VHH-huFc阻断CD27/CD70结合实验结果。
图10为实施例7中CAR结构示意图。
图11为实施例8中不同克隆CD70 CAR-T细胞感染效率实验结果。
图12为实施例9中不同克隆CD70 CAR-T细胞CD107a激活实验结果。
图13为实施例9中不同克隆CD70 CAR-T细胞与靶细胞共孵育时释放IFN-γ实验结果。
图14为实施例9中不同克隆CD70 CAR-T细胞与靶细胞共孵育时释放IL-2实验结果。REST是NT细胞对照组。
图15为实施例9中不同克隆CD70 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤实验结果。
图16为实施例10中不同克隆CD70 CAR-T细胞感染效率实验结果。
图17为实施例11中不同克隆CD70 CAR-T细胞CD107a激活实验结果。
图18为实施例9中不同克隆CD70 CAR-T细胞对靶细胞的杀伤实验结果。
图19为实施例11中不同克隆CD70 CAR-T细胞体内药效试验的肿瘤体积监测结果。
图20为实施例11中不同克隆CD70 CAR-T细胞体内药效试验的T细胞存续结果。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入地研究，经过大量的筛选，发现一类抗CD70纳米抗体及其抗原结合片段，其能够特异性识别CD70，以高亲和力与CD70结合，能够阻断CD70与CD27的结合，具有良好的功能活性。
具体地，本发明利用CD70蛋白免疫羊驼，获得高质量的单域抗体基因文库。然后利用噬菌体展示技术筛选抗体基因库，从而获得了CD70特异性的单域抗体基因。再将此基因转至哺乳动物细胞中，从而获得了能在哺乳动物细胞中高效表达的、且特异性高的抗体株。然后通过ELISA、分子互作分析、阻断试验等方法鉴定出高亲合力、高特异性、高功能活性的纳米抗体。所述抗体或其抗原结合片段具有良好的安全性和靶向性，能够特异性结合人CD70的胞外域。
本发明还提供含有所述纳米抗体的嵌合抗原受体(CAR)。将包含该CAR的编码序列的载体用于感染免疫细胞，能够获得对过表达CD70的肿瘤细胞具有显著杀伤能力的免疫效应细胞，该免疫效应细胞能够应用于治疗或改善CD70表达相关的疾病，从而为CD70阳性肿瘤的治疗奠定了基础。
抗体
本文中，“CD70结合分子”是特异性结合CD70的蛋白质，包括但不仅限于，抗体、重链抗体、纳米抗体或它们的抗原结合片段。
本文中，术语“抗体”包括单克隆抗体(包括全长抗体，其具有免疫球蛋白Fc区)，具有多表位特异性的抗体组合物，多特异性抗体(例如，双特异性抗体)，双抗体和单链分子，以及抗体片段，尤其是抗原结合片段，例如，Fab，F(ab’)2和Fv。本文中，“抗体”与“免疫球蛋白”可互换使用。
传统的“抗体”含有基本的4链抗体单元，是由两条相同的轻链(L)和两条相同的重链(H)构成的异四聚体糖蛋白。每条重链在N-末端具有可变结构域(VH)，接着是三个(对于每种α和γ链，CH1、CH2和CH3)和四个(对于μ和ε同种型，CH1、CH2、CH3和CH4)恒定结构域(CH)以及位于CH1结构域与CH2结构域之间的绞链区(Hinge)。每条轻链在N-末端具有可变结构域(VL)，接着是其另一端的恒定结构域(CL)。成对的VH和VL一起形成一个抗原结合位点。关于不同类别抗体的结构和性质，参见如Basic and Clinical Immunology，第八版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr和Tristram G.Parsolw编辑，Appleton&Lange，Norwalk，CT，1994，第71页和第6章。来自任何脊椎动物物种的轻链，根据其恒定结构域氨基酸序列，可归入两种称作κ和λ的截然不同型中的一种。根据CH序列和功能的相对较小差异，γ和α类可进一步分为亚类，例如人表达下列亚类：IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
本文所述“重链抗体”是源自骆驼科生物或软骨鱼科生物的抗体。相比上述4链抗体，重链抗体缺失轻链和重链恒定区1(CH1)，仅包含2条由可变区(VHH)和其他恒定区组成重链，可变区通过类似铰链区结构与恒定区相连。骆驼科重链抗体的每条重链包含1个可变区(VHH)和2个恒定区(CH2和CH3)，软骨鱼科重链抗体的每条重链含有1个可变区和5个恒定区(CH1-CH5)。重链抗体的抗原结合片段包括VHH和单链重链抗体。通过与人IgG Fc的恒定区融合，重链抗体可以具有人IgG Fc的CH2和CH3。
如本文所用，术语“单域抗体”、“抗CD70单域抗体”、“重链抗体的重链可变区结构域”、“VHH”可互换使用，均指特异性识别和结合于CD70的单域抗体。单域抗体是重链抗体的可变区。通常，单域抗体含有三个CDR和四个FR。优选地，本发明的单域抗体具有SEQ ID NO:1-7中任一项所示的CDR1、SEQ ID NO:8-13中任一项所示的CDR2、和SEQ ID NO:14-20中任一项所示的CDR3。单域抗体是最小的功能性抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体。
本文中，“纳米抗体”是指含有本文所述VHH的抗体。其可以是如上所述的重链抗体，还可以是含有多条VHH的多价或多特异性抗体，也可以是将VHH和抗体Fc(例如CH2和CH3或CH2、CH3和CH4)重组获得的重组抗体。
包含两条或多条单域抗体的结合分子是多价单域抗体；包含两条或多条不同特异性单域抗体的结合分子是多特异性单域抗体。多价单域抗体或多特异性单域抗体通过连接子连接多个单域抗体。所述连接子通常由选自G和S的1-15个氨基酸组成。
本文中，重链抗体和抗体(传统四链抗体)旨在区分抗体的不同组合方式。由于二者的结构具有相似性，下述针对抗体的结构描述除涉及轻链外也均适用于重链抗体。
抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基末端结构域。重链和轻链的可变结构域可分别称为“VH”和“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分(相对于相同类型的其它抗体)并含有抗原结合位点。
术语“可变的”指可变结构域中的某些区段在抗体序列中差异广泛的情况。可变结构域介导抗原结合并限定特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，变异性并非均匀分布于可变结构域跨越的全部氨基酸。相反，其集中在三个称为高变区(HVR)的区段(在轻链和重链可变结构域中均有)，即分别为重链可变区的HCDR1、HCDR2、HCDR3(重链抗体中可简称为CDR1、CDR2、CDR3)以及轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。可变结构域中更为高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR区(FR1、FR2、FR3和FR4)，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。通常，轻链可变区的结构为FR1-LCDR1-FR2-LCDR2-FR3-LCDR3-FR4，重链可变区的结构为FR1-HCDR1-FR2-HCDR2-FR3-HCDR3-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如在抗体依赖性细胞介导的细胞毒性中抗体的参与。抗体的有多种可变区标注方案，包括：Chothia、Kabat、IMGT和Contact。本文示例性使用IMGT标注方案。
“Fc区”(可结晶片段区域)或“Fc结构域”或“Fc”是指抗体重链的C-末端区域，其介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括与位于免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)上的Fc受体的结合，或者与经典补体***的第一组分(C1q)的结合。在IgG，IgA和IgD抗体同种型中，Fc区由来自抗体两条重链的CH2结构域和CH3结构域的两个相同的蛋白片段构成；IgM和IgE的Fc区在每个多肽链中包含三个重链恒定结构域(CH结构域2-4)。虽然免疫球蛋白重链的Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为从重链位置C226或P230的氨基酸残基到羧基端的序列段，其中该编号是根据EU索引，如在Kabat中一样。如本文所使用的，Fc区可以是天然序列Fc或变体Fc。
“抗体片段”包含完整抗体的一部分，优选完整抗体的抗原结合区和/或可变区。抗体片段优选为抗体的抗原结合片段。抗体片段的例子包括Fab、Fab’、F(ab’)、F(ab’)2、Fd、和Fv片段、二硫键连接的Fv；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；scFv-Fc片段；由抗体片段形成的多特异性抗体；以及通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段。抗原结合片段可以通过多种技术制备，包括但不限于将完整的抗体蛋白水解消化，以及由包含抗原结合片段的宿主细胞表达产生。
“Fv”是含有完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密、非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中突出了六个高变环(重链和轻链各3个环)，贡献出抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变结构域(或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲合力低于完整结合位点。“单链Fv”也可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含抗体VH和VL结构域的连接成一条多肽链的抗体片段。优选的是，sFv多肽在VH和VL结构域之间还包含多肽接头，使得sFv形成期望的抗原结合结构。对于重链抗体或纳米抗体而言，scFv即为VHH。
本文中，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即除了可能以少量存在的可能的天然出现的突变和/或翻译后修饰(例如异构化、酰胺化)之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。与多克隆抗体制剂(其典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体)相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除它们的特异性外，单克隆抗体的优势在于它们通过杂交瘤培养合成，未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将根据本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法、噬菌体展示法、重组DNA法、及用于从具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物生成人或人样抗体的技术、单细胞测序法。
单克隆抗体在本文中也包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性。
非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。因此，“人源化抗体”通常指可变结构域构架区与在人抗体中发现的序列交换的非人抗体。通常在人源化抗体中，整个抗体(除CDR以外)由人来源的多核苷酸编码或与这种抗体相同(除CDR以外)。CDR(其中一些或全部由源自非人生物体的核酸编码)被移植到人抗体可变区的β-折叠骨架中以产生抗体，其特异性由被移植的CDR来决定。这类抗体的产生方法本领域周知，例如使用具有基因工程免疫***的小鼠而产生。本发明中，抗体、单域抗体、重链抗体等均包括各所述抗体的经人源化的变体。
“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库。
在一些实施方案中，本发明还提供与本发明的任何抗CD70纳米抗体的抗原接合区结合人CD70上相同表位的纳米抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段(例如单域抗体VHH)，即能够与本发明的任何纳米抗体的抗原结合区交叉竞争与CD70的结合的纳米抗体、重链抗体、抗体或其抗原结合片段。
本发明中，抗CD70单域抗体具有SEQ ID NO:1-7中任一项所示的CDR1、SEQ ID NO:8-13中任一项所示的CDR2、和SEQ ID NO:14-20中任一项所示的CDR3。优选地，抗CD70单域抗体含有(a)-(h)中任一组所示的CDR1、CDR2和CDR3：
(a)序列如SEQ ID NO:1所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:8所示的CDR2、序列如SEQID NO:14所示的CDR3；
(b)序列如SEQ ID NO:2所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:8所示的CDR2、序列如SEQID NO:14所示的CDR3；
(c)序列如SEQ ID NO:3所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:8所示的CDR2、序列如SEQID NO:15所示的CDR3；
(d)序列如SEQ ID NO:4所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:9所示的CDR2、序列如SEQID NO:16所示的CDR3；
(e)序列如SEQ ID NO:5所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:10所示的CDR2、序列如SEQID NO:14所示的CDR3；
(f)序列如SEQ ID NO:6所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:11所示的CDR2、序列如SEQID NO:18所示的CDR3；
(g)序列如SEQ ID NO:6所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:12所示的CDR2、序列如SEQID NO:19所示的CDR3；
(h)序列如SEQ ID NO:7所示的CDR1、序列如SEQ ID NO:13所示的CDR2、序列如SEQID NO:20所示的CDR3。
本文所述的抗CF70单域抗体的FR1、FR2、FR3和FR4可分别独立选自SEQ ID NO:21-28中任一所示的单域抗体的FR1、FR2、FR3和FR4。优选地，抗CF70单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:21-28中任一所示。
当单域抗体与重链恒定区连接时，纳米抗体是包含本文所述单域抗体的重链抗体。重链恒定区可以是骆驼重链抗体的恒定区，包含CH2和CH3。优选地，所述抗体恒定区源自：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE和IgD中的任意一者的恒定区，更优选源自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4中的任意一者的恒定区。在一个或多个实施方案中，所述重链恒定区是人IgG Fc的CH2和CH3，例如IgG1的CH2和CH3，如SEQ ID NO:37所示。
本文所述CF70结合分子可以是包含一条、两条或多条本文所述的抗CD70纳米抗体或单域抗体的单价或多价纳米抗体或单域抗体、或多特异性纳米抗体或单域抗体。多特异性可以是针对CD70和另一种抗原，也可以是针对CD70的两种不同表位。
本发明还包括所述抗体衍生物和类似物。“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的衍生物或类似物可以是(i)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(ii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iii)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的抗体序列改变一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段序列的变体。这些变体包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、***和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质的功能。如在FR和/或Fc区中将具有类似性质的氨基酸进行取代。可进行保守性取代的氨基酸残基为本领域所周知。这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。
本文所述抗体的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。在一些实施方案中，本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。本发明还包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。
可采用本领域常规的方法制备本发明的抗体，如杂交瘤技术。可采用本领域常规的方法制备本发明的纳米抗体，如本领域熟知的噬菌体展示技术。或者，本发明的抗体或纳米抗体可在其他细胞系中表达。可用编码本发明抗体的序列转化合适的哺乳动物宿主细胞，然后培养宿主细胞并纯化抗体。转化可采用任何已知的方法进行，例如包括将多核苷酸包装在病毒(或病毒载体中)并用病毒(或载体)转导宿主细胞。所用的转化程序取决于将转化的宿主。用于将异源多核苷酸引入哺乳动物细胞中的方法为本领域所熟知，包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封在脂质体中和将DNA直接微注射至核中等。可用作用于表达的宿主的哺乳动物细胞系为本领域所熟知，包括但不限于可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的多种永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(例如，HepG2)等。
CAR
本发明还提供一种靶向CD70的嵌合抗原受体(CAR)。该CAR含有任选的信号肽序列、抗原识别区即本文所述的抗CD70结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。其中胞内区包含一个或多个胞内共刺激域和/或一个或多个胞内信号域。本文中的“铰链区”、“跨膜区”和“胞内区”均可选自已知的CAR-T技术中的铰链区、跨膜区和胞内区的序列。
CAR上任选的信号肽可以根据需要选择。一般而言，信号肽是使多肽靶向细胞中的所需部位的肽序列。信号肽使多肽靶向细胞的分泌通路，并且将允许多肽整合和锚定至脂双层；信号肽还可以是膜定位信号肽。示例性的信号肽例如CD8信号肽、CD28信号肽、CD4信号肽或轻链信号肽，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8信号肽可以是本领域常用于CAR的各种人CD8信号肽序列。在某些实施方案中，所述人CD8信号肽的氨基酸序列包含SEQ ID NO:38所示序列。
嵌合抗原受体的铰链区位于胞外抗原结合区和跨膜区之间，铰链区是通常在蛋白质的两个域之间存在的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和两个域的彼此相对运动。铰链区可以是天然存在的蛋白质的铰链区或其部分。抗体(诸如IgG、IgA、IgM、IgE或IgD抗体)的铰链区也可用于本文所述的嵌合抗原受体。非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合抗原受体的铰链区。示例性地，CAR的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1 FcCH2CH3铰链区或IgG4 Fc CH2CH3铰链区，其序列在本领域技术人员的知识范围内。适用于本发明的CD8α铰链区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8α铰链区序列。在某些实施方案中，所述人CD8α铰链区包含SEQ ID NO:39所示序列。
嵌合抗体受体的跨膜区可以形成α螺旋、多于一个α螺旋的复合物、β桶或能够跨域细胞磷脂双层的任何其它稳定结构。跨膜区可以是天然或合成来源的。跨膜区可选自以下蛋白的跨膜区：CD3ε、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、T细胞受体的α、β或ζ链。适用于本发明的人CD8α跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8α跨膜区序列。在某些实施方案中，所述人CD8α跨膜区的氨基酸序列包含SEQ ID NO:40所示序列。
胞内信号区(或胞内信号传导区)负责表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的至少一种正常效应子功能的活化。例如，T细胞的效应子功能可以是细胞裂解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。虽然通常可以利用整个胞内信号传导区，但是在很多情况下，使用整个链是不必要的。就使用胞内信号传导区的截短部分而言，只要其转导效应子功能信号，就可以使用这种截短部分代替完整链。因此，胞内信号传导区包括足以转导效应子功能信号的胞内信号传导区的任何截短形式。CAR的胞内信号域可以根据需要选择，包括但不限于来源于CD3ζ、FcRγ(FCER1G)、FcRβ(FcεRib)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d中的至少一种的胞内信号域。优选地，所述胞内信号区来源于人CD3ζ胞内信号区。进一步地，所述人CD3ζ胞内信号区具有SEQ ID NO:41所示氨基酸序列。
在抗原特异性信号的刺激以外，很多免疫效应细胞还需要共刺激来促进细胞增殖、分化和存活，以及活化细胞的效应子功能。“共刺激域”可以是共刺激分子的胞质部分。术语“共刺激分子”是指免疫细胞(诸如T细胞)上的关联结合伴侣，该关联结合伴侣与共刺激配体特异性结合，从而由免疫细胞介导共刺激响应，诸如但不限于增殖和存活。可以根据需要选择适合的胞内共刺激域，包括具有共刺激信号分子的胞内结构域，例如源自4-1BB，CARD11，CD2，CD7，CD27，CD28，CD30，CD40，CD54，CD83，OX40，CD137，CD134，CD150，CD152，CD223，CD270，PD-L2，PD-L1，CD278，DAP10，LAT，NKD2C，SLP76，TRIM，FcεRIγ，MyD88，和41BBL的胞内结构域的至少一种。在某些实施方案中，4-1BB共刺激域的氨基酸序列包含SEQID NO:42所示序列。
形成本发明的嵌合抗原受体的上述各部分，如CD8信号肽、抗MSLN纳米抗体、CD8铰链区、CD28跨膜区、CD28共刺激域、CD3ζ胞内信号域等，相互之间可直接连接，或者可通过接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。例如，该基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG。优选地，该基序在接头序列中是相邻的，在重复之间没有***氨基酸残基。接头序列可以包含1、2、3、4或5个重复基序组成。接头的长度可以是3～25个氨基酸残基，例如3～15、5～15、10～20个氨基酸残基。在某些实施方案中，接头序列是多甘氨酸接头序列。接头序列中甘氨酸的数量无特别限制，通常为2～20个，例如2～15、2～10、2～8个。除甘氨酸和丝氨酸来，接头中还可含有其它已知的氨基酸残基，例如丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、苏氨酸(T)、谷氨酸(E)、苯丙氨酸(F)、精氨酸(R)、谷氨酰胺(Q)等。在某些实施方案中，接头序列为(GGGGS)n连接，其中n为1～5的整数。
在示例性实施方案中，CAR从N端到C端依次含有CD8信号肽、本文所述的抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段、CD8α铰链区、CD8α跨膜区、CD3ζ胞内信号域、4-1BB共刺激域。在具体实施例中，具有上述结构的示例性CAR如SEQ ID NO:29-36中任一所示。
应理解，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的氨基酸序列末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的序列的活性。为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。因此，本发明的CAR的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本文。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。
本发明的CAR中的抗原识别区可以是前述的抗CD70纳米抗体或其功能性片段序列的变体。此外，CAR的的其他部分也可以发生序列变化，得到的突变体与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。
突变体还包括：在任一实施方案所述的CAR的氨基酸序列中具有一个或数个突变(***、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。
核酸
本发明还提供了编码上述抗体或CAR的多核苷酸。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明也包括编码融合蛋白的多核苷酸序列的简并变异体，即编码相同的氨基酸序列但核苷酸序列有所不同的核苷酸序列。
所以，本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严谨条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严谨条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。CAR的序列也可以如上获得。或者，可以如上得到CAR的各部分(信号肽、抗原识别区、铰链区、跨膜区或胞内区)的序列后再连接得到CAR的全长。
一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。CAR各部分可以顺序克隆到载体中或者可以整合为全长CAR后再克隆。
本发明也涉及核酸构建物，该核酸构建物含有本文所述的多核苷酸序列，以及与这些序列操作性连接的一个或多个调控序列。本发明所述的多核苷酸序列可以多种方式***作以保证所述抗体或CAR的表达。在将核酸构建物***载体之前可根据表达载体的不同或要求而对核酸构建物进行操作。利用重组DNA方法来改变多核苷酸序列的技术是本领域已知的。
调控序列可以是合适的启动子序列。启动子序列通常与待表达蛋白的编码序列操作性连接。启动子可以是在所选择的宿主细胞中显示转录活性的任何核苷酸序列，包括突变的、截短的和杂合启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、EB病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，也可考虑使用诱导型启动子。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够在期限表达时打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，而在当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
调控序列也可以是合适的转录终止子序列，由宿主细胞识别以终止转录的序列。终止子序列与编码该多肽的核苷酸序列的3’末端操作性连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。调控序列也可以是合适的前导序列，对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。前导序列与编码该多肽的核苷酸序列的5′末端可操作连接。在选择的宿主细胞中有功能的任何终止子都可用于本发明。
在某些实施方案中，所述核酸构建物是载体，例如克隆载体、表达载体和整合载体。通常通过可操作地连接本发明的多核苷酸序列至表达载体，实现本发明多核苷酸序列的表达。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。整合载体含有将靶序列整合到细胞基因组上的组件。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。载体通常含有用于质粒维系和用于克隆与表达外源性核苷酸序列的序列。所述序列(在某些实施方案中总称为“侧翼序列”)通常包括一个或多个以下核苷酸序列：启动子、一个或多个增强子序列、复制起点、转录终止序列、含有供体和受体剪接位点的完全内含子序列、编码用于多肽分泌的前导序列的序列、核糖体结合位点、聚腺苷酸化序列、用于***编码将要表达的抗体的核酸的多连接子区和可选标记元件。
此外，载体的类型不受限制，例如，质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒，可根据待导入的宿主细胞而改变。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，NewYork)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。
细胞
适用于导入本文所述核酸构建物的宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞，特别是免疫细胞，优选免疫效应细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。
“免疫效应细胞”是可执行免疫效应功能的免疫细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞表达至少FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的免疫效应细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。优选地，免疫效应细胞选自：由多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞、T淋巴细胞、NK细胞、外周血单个核细胞(PBMC)和造血干细胞中的至少一种。更优选地，所述免疫效应细胞为T淋巴细胞(同T细胞)。在一些实施方案中，T细胞可以为CD4+/CD8-、CD4-/CD8+、CD4+/CD8+、CD4-/CD8-或它们的组合。在一些实施方案中，T细胞在表达嵌合抗原受体并结合至靶细胞时产生IL-2、IFN和/或TNF。在一些实施方案中，CD8+T细胞在表达嵌合抗原受体并结合至靶细胞时裂解抗原特异性靶细胞。
适用于本发明的T细胞可以是各种来源的各种类型的T细胞。例如，T细胞可来源于B细胞恶性肿瘤患者的PBMC。在某些实施方案中，获得T细胞后，可先用适量的(例如30～80ng/ml，如50ng/ml)的CD3抗体刺激活化，然后在含有适量的(例如30～80IU/ml，如50IU/ml)的IL2培养基进行培养备用。
将核酸或载体引入哺乳动物细胞的方法是本领域已知的，所述载体可以通过物理、化学或生物方法转入细胞。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。在一些实施方案中，转导的或转染的免疫效应细胞在引入核酸或载体之后离体繁殖。
获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的抗体或CAR。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
用途和方法
通过构建纳米抗体文库，发明人筛选了可以结合CD70的纳米抗体及其变体。通过蛋白水平结合检测、亲和力检测和竞争阻断实验和组织交叉反应验证了这些抗体的对抗原的结合能力。利用这些纳米抗体，发明人构建了CAR以及CAR-T细胞，经分子水平和细胞水平实验验证，所述CAR-T有很强的免疫功能，更优的CD107a表达、IFN-γ和IL-2分泌以及对靶细胞的特异性杀伤功能，体内药效显著。
本文所述的抗体、CAR、编码序列、核酸构建物、和细胞的所有方面都可用于制备用以预防或治疗本文所述各种病况和疾病的药物，所述病况和疾病是与CD70表达相关的疾病或病况，指由CD70表达异常所直接或间接导致的疾病，通常是指由CD70过表达所导致的疾病，例如癌症，包括但不限于：肾细胞癌、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤。
本发明还包括一类细胞疗法，包括在免疫细胞(例如T细胞)中表达本文所述的CAR，和对需要其的接受者施用治疗有效量的细胞，细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。相比抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。由CAR-T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。
本发明的抗体、核酸或CAR-修饰的细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如相关的细胞因子或细胞群结合施用。在此方面，药物组合物可以通过使具有所需纯度的活性药剂与任选的药学上可接受的载剂混合以冻干制剂或水溶液的形式制备。药学上可接受的载剂在所用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，可包括缓冲剂(例如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水)、抗氧化剂、防腐剂、等渗剂、稳定剂、螯合剂(例如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如氢氧化铝)和表面活性剂中的至少一种。此外，为了使药物组合物可用于体内施用，它们必须是无菌的。可以通过无菌过滤膜过滤使药物组合物无菌。
在一些实施方案中，药物组合物可以含有：细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、免疫抑制剂、生长抑制剂以及待治疗的具体适应症所需的活性药剂中的至少一种添加剂。添加剂的具体添加量可根据实际需要进行调整。
本发明的药物组合物可以以“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”的量施用。“治疗”指向受试者采用本文所述治疗方案以达到至少一种阳性治疗效果(比如，癌症细胞数目减少、肿瘤体积减小、癌细胞浸润至周边器官的速率降低或肿瘤转移或肿瘤生长的速率降低)。当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。通常，包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，New Eng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方案中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方案中，本发明的T细胞组合物优选通过静脉注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、***或感染位置。
在本发明的一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞或其组合物可与本领域已知的其它疗法结合。所述疗法包括但不限于化疗、放疗和免疫抑制剂。例如，可结合本领域周知的治疗间皮素介导的疾病的放疗或化疗制剂进行治疗。
本文中，“抗肿瘤效应”指一种生物学效应，其可由肿瘤体积的减少、肿瘤细胞数的减少、转移数的减少、预期寿命的增加或与癌相关的各种生理症状的改善表示。
“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，指可引起免疫应答的活有机体，如哺乳动物。例子包括但不限于人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
诊断、检测和试剂盒
本发明的结合分子因其与CD70的高亲合力可用于测定，例如结合测定来检测和/或定量在组织或细胞中表达的CD70。结合分子例如单域抗体可用在进一步研究CD70在疾病中的作用的研究中。检测CD70的方法大致如下：获得细胞和/或组织样本；检测样本中CD70的水平。
本发明的CD70结合分子可用于诊断目的，用来检测、诊断或监控与CD70相关的疾病和/或病况。本发明提供使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法检测样本中CD70的存在。可以体内或体外进行CD70的检测。适用于检测CD70的存在的方法实例包括ELISA、FACS、RIA等。
对于诊断应用来说，通常用可检测的标记基团来标记结合分子例如单域抗体。合适的标记基团包括(但不限于)以下：放射性同位素或放射性核素(例如，3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I)、荧光基团(例如，FITC、罗丹明、镧系元素磷光体)、酶促基团(例如，辣根过氧化物酶、β根半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶)、化学发光基团、生物素基基团或由二级报导体识别的预定多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列、用于二级抗体的结合位点、金属结合结构域、表位标签)、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂。用于标记蛋白质的各种方法在本领域中已知且可用来进行本发明。
本发明的另一方面提供检测与本发明的抗体竞争结合CD70的测试分子的存在的方法。一种所述测定的实例将涉及在存在或不存在测试分子的情形下检测含有一定量CD70的溶液中的游离抗体的量。游离抗体(即，未结合CD70的抗体)的量增加将表示测试分子能与该抗体竞争结合CD70。在一个实施方案中，用标记基团标记抗体。或者，标记测试分子并在存在或不存在抗体的情形下监控游离测试分子的量。
本发明还提供了用于检测CD70水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别CD70蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的材料和方法。
实施例
实施例1：重组人CD70蛋白表达载体构建与真核表达。
1.CD70的39位至193位氨基酸区间的基因序列的合成及蛋白的表达载体的构建。
将CD70的第39位至193位氨基酸序列(uniprot accession No：P32970-1)导入在线密码子优化工具(http://www.jcat.de/#opennewwindow)，得到密码子优化后的核酸序列，然后通过化学合成的方式得到基因序列，同时在该基因序列的3’端添加羊驼IgG1-Fc(氨基酸序列如SEQ ID NO:51所示)的编码序列。通过分子克隆，拼接产物用TaKaRa无缝克隆试剂盒克隆到pCDNA3.1(Thermo)中，获得表达载体。
2.重组人CD70蛋白的表达、纯化及活性鉴定。
以获得的表达载体转染293T细胞(ATCC)5天后，收集培养上清，用AKTA explorer100(GE)纯化重组人CD70-alFc蛋白。由于糖基化修饰等原因，重组人CD70-alFc蛋白经还原SDS-PAGE电泳后通过考马斯亮蓝染色显示其大小约50千道尔顿左右，结果如图1所示。
用商业化CD27对重组人CD70-alFc蛋白进行ELISA活性鉴定：在ELISA板中4倍梯度稀释包被重组人CD70-alFc蛋白，第一个孔包被100ng，依次稀释4倍(100uL/well)，4℃孵育过夜，次日200uL PBST清洗3次，加入1％BSA/PBS封闭1小时。去除封闭液，每孔加入100μL0.1μg/mL的重组人CD27-his蛋白，37℃孵育1小时。200μL PBST清洗3次后加入1:4000稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗his-tag抗体(每孔100μL)，37℃孵育1小时。200μL PBST清洗3次后加入100μL TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL 1M盐酸终止显色，并读取OD450，分析结果如图2和表1所示。
表1分析结果
EC50(ng/mL) 8.689
R square 0.9962
实施例2：抗人CD70羊驼VHH抗体的制备
1.免疫羊驼
将2mg/mL CD70-alIgG1 Fc融合蛋白作为抗原与等体积的完全弗氏佐剂(Sigma-Aldrich)混合乳化，对成年羊驼进行皮下免疫，每只500μg抗原。在初次免疫后，每二十天时间进行一次加强免疫，共执行四次皮下免疫，第四次免疫七天后静脉采全血100mL，分离PBMC。
2.血清效价检测
每次加强免疫前静脉取血10mL，离心去除细胞，保留血清。向ELISA微孔板中加入CD70-his蛋白(ACRO Biosystems)50ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200μL/孔，37℃封闭1小时。加入梯度稀释的羊驼血清，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100μL 1:5000稀释的HRP-山羊抗羊驼IgG1-Fc(Jackson ImmunoResearch)37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100μL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值。血清效价检测结果如表2所示。
表2.羊驼免疫后血清效价检测
稀释倍数 阴性 二次免疫 三次免疫 四次免疫
1:2K 0.043 1.2551 1.411 2.1077
1:4K 0.0423 0.6624 0.9337 1.2117
1:8K 0.0418 0.391 0.5955 0.8136
1:16K 0.0429 0.2568 0.276 0.3979
1:32K 0.0444 0.1311 0.152 0.1965
1:64K 0.0443 0.1056 0.1077 0.1505
1:128K 0.0439 0.0733 0.0728 0.0858
空白 0.0461 0.0442 0.0434 0.0508
3.构建免疫文库
3.1羊驼PBMC总cDNA获取
使用Trizol RNA提取试剂盒抽提羊驼PBMC总RNA。以所述RNA为模板，使用SuperScriptTMIV First-Strand Synthesis System试剂盒合成第一链cDNA。
3.2VHH基因扩增
以所述cDNA为模板，使用重链可变域上游引物和下游恒定区CH2引物(VH-F、CH2-R)PCR扩增重链基因。在50μL反应体系中，分别加入25μL PrimeSTAR MAX master mix(Takara)，上游引物2.5μL(25pmol)，下游引物2.5μL(25pmol)，1.5μL DMSO，0.5μL cDNA和18μL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性110秒，60℃退火15秒，72℃延伸30分钟，循环25次，72℃最终延伸10分钟。
使用DNA胶回收试剂盒回收扩增得到的VHH-CH2基因，电泳结果如图3所示。取100ng VHH-CH2为模板，利用上游引物VH-F和下游引物VH-R PCR扩增VHH基因。在50μL反应体系中，分别加入25μL PrimeSTAR MAX master mix(Takara)，上游引物2.5μL(25pmol)，下游引物2.5μL(25pmol)，1.5μL DMSO，0.5μL VH-CH2 DNA和18μL ddH2O。按以下程序进行PCR反应：98℃预变性1分钟后进入温度循环，98℃变性110秒，60℃退火15秒，72℃延伸30分钟，循环25次，72℃最终延伸10分钟。胶回收试剂盒回收扩增得到的VHH基因片段，电泳结果如图4示。
3.3构建免疫文库
分别使用SfiI DNA内切酶消化VHH基因片段和pcomb3X-TT载体(美国Scripps研究所)。在50μL反应体系中，分别加入SfiI 2μL，10x缓冲液5μL，DNA 3μg，加ddH2O至50μL。充分混匀后，50℃孵育3小时。
使用DNA胶回收试剂盒回收酶切后的VHH基因片段和pcomb3X载体。使用T4连接酶环化酶切后的VHH基因片段和酶切后的pcomb3X载体。在50μL反应体系中，分别加入T4连接酶1μL，10x缓冲液5μL，VHH基因150ng，pComb3X载体1000ng，加ddH2O至50μL。充分混匀后，4℃孵育16小时。取少量产物通过琼脂糖凝胶电泳验证连接效率，电泳结果如图5示。
将10μL上述连接环化产物加入自制的TG1电转化感受态中，然后使用电转仪进行电击转化。取出10μL电转化后的细菌通过合理的稀释并在含有氨苄青霉素的平板上划线，以此计数并统计噬菌体抗体文库的大小。剩余的电转化后的细菌加入含100μg/mL氨苄青霉素和2％葡萄糖的2xYT培养基，置于加热培养箱培养。培养结束后在4℃以4000G离心10分钟，在沉淀菌中补充适量甘油储存于-80℃作为抗体菌种库。通过多次电转化积累获得超过9E+9库容的scFv免疫文库。
4.筛选CD70抗体
4.1重组人CD70蛋白偶联到链霉亲和素磁珠
用生物素化试剂盒(易锦生物)按试剂盒说明书，将重组人CD70蛋白的avi-tag进行生物素修饰，得到生物素化的CD70蛋白。取10μg上述生物素修饰的重组蛋白加入到经PBS洗涤3次的100μL链霉亲和素磁珠(DynaBeads 280)中，置于旋转摇床上，速度18转每分钟，室温偶联30分钟，然后PBS洗涤3次。
4.2封闭噬菌体文库及磁珠。
向0.5mL噬菌体文库中加入0.5mL 1％BSA/PBS，置于旋转摇床上，速度18转每分钟，室温旋转封闭1小时，这些噬菌体为Input1。同时取100μL未偶联蛋白的DynaBeads 280，PBS洗涤3次后，加入1mL 1％BSA/PBS，按上述条件旋转孵育1小时。另外向上述偶联CD70的磁珠中加入1mL 1％BSA/PBS按上述条件旋转封闭1小时。
4.3阴性淘选。
为去除与磁珠相互作用的抗体，有必要进行阴性淘选。将经BSA封闭的噬菌体文库和未偶联抗原的磁珠混合，按上述条件旋转孵育1小时。孵育结束后将噬菌体磁珠混合物置于磁力架上，待磁珠都贴壁之后，将上清转移至新的EP管中。
4.4阳性淘选。
将上述封闭后的偶联有CD70蛋白的磁珠加入到阴性淘选后的噬菌体上清中进行阳性淘选，按上述条件室温旋转孵育1小时。孵育结束后用1mL PBST(0.1％Tween-20inPBS)洗涤磁珠，重复洗涤10次。洗涤结束后加入1mL 100mM甘氨酸(pH2.0)，置于旋转摇床上速度设定18转每分钟，旋转洗脱10分钟。洗脱结束后将EP管置于磁力架上，待磁珠都贴壁后将洗脱液转移至新的EP管中。向洗脱液中加入0.2mL 1M Tris-HCl溶液(pH 8.0)进行中和。将中和后的洗脱液加入到30mL OD600约为0.6的TG1菌液中静置侵染30分钟，然后加入20倍于菌体数的M13KO7噬菌体，静置侵染30分钟，最后加入100mL 2YT培养基及终浓度为100μg/mL的氨苄霉素和卡那霉素，30℃、220rpm培养过夜。第二天按上述收获噬菌体文库之方法收获噬菌体，此时得到的噬菌体为Input2。
4.5重复阳性淘选。
按上述淘选方法进行2次重复，即将Input2进行下一轮阴性淘选和阳性淘选得到Input3。不同之处在于Input3进行淘选得到的洗脱液侵染TG1后，不加M13KO7，而是取10μL菌液进行梯度稀释，取103、104、105三个稀释梯度各100μL菌液涂布2YT/amp平板，30℃培养过夜；剩余的菌液30℃、220rpm培养过夜。
4.6ELISA筛选阳性抗体。
用牙签随机挑取上述平板中的TG1单克隆到含600μL 2YT/amp的深孔板中，深孔板粘覆透气膜，37℃、220rpm培养3小时后，揭开透气膜，向孔内加入终浓度为1mM的IPTG，30℃、220rpm培养过夜。ELISA板中包被重组人CD70蛋白，每孔100ng。次日，将深孔板4000rpm离心10分钟，去除孔内培养基保留菌体沉淀，每孔加入100μL TES溶液(20％蔗糖、0.1mMEDTA、50mM Tris-HCl，pH 8.0)，震荡使菌体重新悬浮后冰浴30分钟，加入200μL超纯水震荡混匀，4000rpm离心10分钟，此时深孔板中的上清溶液即为含有抗体的周质腔提取物。用洗板机清洗ELISA板三次，然后中加入200μL 1％BSA/PBS，37℃封闭1小时。去除ELISA板中的封闭液，加入100μL上述周质腔提取物，37℃孵育1小时，用洗板机清洗3次，加入HRP-conjugated-Goat anti HA(辣根过氧化物酶标记的羊抗HA抗体)溶液，37℃孵育1小时，用洗板机清洗3次，加入100μL TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL 1M盐酸终止。用酶标仪读取OD450值，将读值高于背景值3倍的克隆进行桑格测序，获得抗体的基因序列。
4.7验证阳性克隆。
根据测序结果，选取抗体CDR3氨基酸序列差异较大的克隆重新接种并诱导过夜，按上述ELISA方法再次验证所选克隆能否结合CD70。最终得到CD70-11C9、CD70-8E1、CD70-8F9、CD70-9D8、CD70-2A5、CD70-5C10和CD70-8A6、CD70-8B4八条VHH抗体序列。
CD70-2A5的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示。
CD70-5C10的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。
CD70-8A6的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示。
CD70-8B4的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。
CD70-8E1的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示。
CD70-8F9的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。
CD70-9D8的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示。
CD70-11C9的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：28所示。
实施例3：表达重组VHH抗体
CD70-2A5、CD70-5C10、CD70-8A6、CD70-8B4、CD70-8E1、CD70-8F9、CD70-9D8、CD70-11C9八条VHH抗体基因通过同源重组方法构建到pcDNA3.1-huIgG1-Fc中，得到重组VHH-huIgG1-Fc。用上述载体瞬转293F细胞进行真核表达，收获上清后用HiTrap Protein A HP/AKTA pure100纯化，纯化后的蛋白用超滤管浓缩并将缓冲液替换为PBS，SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度，电泳结果如图6所示。
实施例4：测定重组人CD70蛋白与8个VHH抗体的结合曲线
ELISA实验具体操作如下：酶标板中加入上文制备的重组人CD70蛋白100ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200μL/孔，37℃封闭1小时。100μL PBS洗板后加入梯度稀释的上述4个scFv蛋白，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100μL 1:5000稀释的HRP-山羊抗人IgG(Fab特异性的)37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100μL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值，结果如图7和表3所示。
表3，检测结果
实施例5：亲和力测定
利用Octet K2分子互作分析仪分析CD70-2A5、CD70-8B4、CD70-9D8、CD70-11C9四个VHH-huFc抗体对人CD70的亲和力。使用200μL 100nM生物素化的重组人CD70蛋白进行SA探针固化，固化高度1nM。纯化四个VHH-huFc抗体的作为分析物，设置200nM、100nM、50nM、25nM 4个浓度，进行亲和力测定，结果如图8和表4所示。
表4，VHH-huFc亲和力测定结果
名称 KD(M) Kon(1/Ms) Koff(1/s)
CD70-2A5 <1E-12 3.67E+4 <1.0E-7
CD70-8B4 <1E-12 4.55E+4 <1.0E-7
CD70-9D8 1.83E-9 1.29E+5 2.35E-4
CD70-11C9 <1E-12 2.64E+5 <1.0E-7
实施例6：VHH-huFc阻断CD27/CD70结合
ELISA实验具体操作如下：酶标板中加入重组人CD27蛋白100ng/孔，4℃包被过夜。PBS清洗三遍，加入1％BSA/PBS，200μL/孔，37℃封闭1小时。将100ng生物素化的CD70重组蛋白分别和1μg、500ng、250ng、125ng的上述VHH-huFc抗体孵育1小时。200μL PBS洗板后加上述CD70/VHH-Fc混合液，37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100μL 1:200稀释的SA-HRP 37℃结合1小时。PBST清洗三遍，加入100μL/孔TMB显色液，37℃显色10分钟，加入100μL/孔ELISA终止液，酶标仪读取OD450数值，结果如图9和表5所示。
实施例7：含抗人CD70嵌合抗原受体元件的逆转录病毒原液制备。
1.靶向人CD70抗原的嵌合抗原受体的制备
基因合成或克隆含抗人CD70抗原的单链抗体scFv，铰链区、跨膜区和胞内信号段的嵌合抗原受体序列，其结构如图10所示。根据装载VHH的不同，将嵌合抗原受体分别命名为CD70-2A5-BBz、CD70-5C10-BBz、CD70-8A6-BBz、CD70-8B4-BBz、CD70-8E1-BBz、CD70-8F9-BBz、CD70-9D8-BBz和CD70-11C9-BBz，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:29-36所示，核苷酸序列分别如SEQ ID NO:42-49所示。同时选择文献报道的已知CD70抗体(克隆号:ARGX110)的scFv构建嵌合抗原受体作为对照，命名为ARGX-BBz，其核酸序列如SEQ ID NO:52所示。
以逆转录载体MSGV为骨架载体，构建了表达CD70-2A5-BBz、CD70-5C10-BBz、CD70-8A6-BBz、CD70-8B4-BBz、CD70-8E1-BBz、CD70-8F9-BBz、CD70-9D8-BBz和CD70-11C9-BBz和ARGX-BBz克隆的嵌合抗原受体的逆转录病毒质粒。挑选测序正确的克隆，接种菌液至300mLLB培养基中，过夜摇菌，并按照NucleoBond Xtra Maxi EF试剂盒说明书完成大提质粒。
2.逆转录病毒包装。
用阳离子聚合物PEI(Polyplus)包装逆转录病毒，流程如下：分别用无血清DMEM稀释PEI和逆转录病毒包装质粒(病毒主质粒、Gag-pol、10A1)；然后将PEI/DMEM加入质粒/DMEM混合物，涡旋震荡混匀，在室温下静置15分钟；将质粒-PEI复合物加入预先铺板的293T细胞。转染后16h换液，在48h后收集病毒上清，0.45um滤器过滤，15mL离心管分装原液，-80℃保存备用。
实施例8：CD70 CAR-T细胞的制备和CAR阳性率测定
1.PBMC分离与活化。
采集志愿者外周血，用Ficoll分离液分离获得PBMC，用含5％AB血清X-VIVO(LONZA)培养基调整细胞密度为1x106/mL。预先用1mL含50ng/mL抗人CD3抗体(北京同立海元)和50ng/mL CD28抗体(北京同立海元)的包被液37℃孵育2h包被TC处理的6孔板，使用前除去包被液。将细胞以1mL/孔接种到已包被抗体的6孔板中，再加入100IU/mL的IL2(北京双鹭)，刺激培养48小时后病毒感染。
2.病毒原液感染与培养。
将活化后的T细胞调整为5x105/mL，在24孔板中分别加入1mL T细胞和1mL病毒原液，每孔加1μL polybrene，32℃，2500rpm，离心1.5h。弃去上清液，每孔加入1mL T细胞培养基(含IL-2 100IU/mL)。将培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养。感染后24h，转至6孔板，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100IU/mL的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在1x106/mL左右，使细胞扩增。
3.CAR阳性率检测。
逆转录病毒感染的T淋巴细胞在病毒感染72h后检测CAR阳性率。针对含CD70-2A5-BBz、CD70-5C10-BBz、CD70-8A6-BBz、CD70-8B4-BBz、CD70-8E1-BBz、CD70-8F9-BBz、CD70-9D8-BBz和CD70-11C9-BBz和ARGX-BBz克隆的嵌合抗原受体组和阴性未感染对照组NT，分别取1×106个细胞离心去除培养基，PBS洗细胞一次后100μL重悬置于流式上样管中(BD)。加入Fc-标记的CD70抗原(1:100)四度孵育30分钟。PBS洗细胞一次后按推荐比例加入二抗PE-Fc四度避光孵育30分钟。PBS洗细胞一次后200μL PBS重悬细胞并上机检测，CAR-T阳性率流式分析结果如图11所示。
实施例9：基于抗人CD70 CAR-T细胞功能分析。
1.抗人CD70 CAR-T细胞CD107a表达分析。
将含不同抗体克隆的CAR-T细胞以及NT细胞分别与靶细胞(CD70阳性表达的细胞系MOLM13)按1:1的效靶比(效应细胞和靶细胞均为3x105个)共孵育后，流式检测其CD107a表达情况来评价CAR-T细胞在受到靶细胞刺激后的脱颗粒反应。将效应细胞和靶细胞混合置于37℃，5％CO2培养箱中共孵育4小时后，流式检测各组样品中表达CD107a的细胞分别占CD3+细胞数的比例。CD107a表达的流式分析结果如图12所示。
2.抗人CD70 CAR-T细胞细胞因子分泌能力检测。
将含不同抗体克隆的CAR-T细胞分别与靶细胞(CD70阳性表达的细胞系MOLM13)按1:1的效靶比(效应细胞和靶细胞均为1x105个)共孵育24小时后，收集其上清，利用ELISA(酶联免疫)方法检测IFN-γ和IL-2的分泌情况。IFN-γ检测采用BD IFN-γ和IL-2试剂盒检测，实验步骤依据产品说明书进行。IFN-γ分泌的检测结果如图13所示。IL-2分泌的检测结果如图14所示。
3.抗人CD70 CAR-T细胞毒性实验。
CAR-T杀伤毒性实验通过检测CAR-T细胞体外对靶细胞的杀伤效果来评估CAR-T细胞的体外功能。以不同效靶比(以3x104个靶细胞为基准，效靶比分别为10:1,5:1和2.5:1)将T细胞分别与稳定表达萤火虫荧光素酶的CD70阳性靶细胞MOLM13-LUC-GFP共同培养，同时设置靶细胞和未转染CAR元件T细胞混合的阴性对照组(NT)。过夜孵育后在培养体系中加入萤光素酶反应底物，检测荧光值，通过以下公式计算杀伤效率：杀伤效率＝(1-实验孔荧光值/对照孔荧光值)x100％。实验分组及分析结果如图15所示。
实施例10：抗人CD70 CAR-T细胞注射液体内药效试验。
按本发明实施例8所述方法制备用于动物体内药效试验的CD70-2A5/8B4/9D8/11C9四个克隆的CAR-T细胞，并检测CAR-T阳性率、检测制备的CAR-T细胞体外杀伤ACHN细胞(人肾癌细胞系，表达CD70)效率，同时以MOLM13细胞为对照，具体如下：
1.CAR阳性率检测
逆转录病毒感染的T淋巴细胞在病毒感染72h后检测CAR阳性率。针对含CD70-2A5-BBz、CD70-8B4-BBz、CD70-9D8-BBz、CD70-11C9-BBz和ARGX-BBz克隆的嵌合抗原受体组和阴性未感染对照组NT，分别取1×106个细胞离心去除培养基，PBS洗细胞一次后100μL重悬置于流式上样管中(BD)。加入Fc-标记的CD70抗原(1:100)四度孵育30分钟。PBS洗细胞一次后按推荐比例加入二抗PE-Fc四度避光孵育30分钟。PBS洗细胞一次后200μL PBS重悬细胞并上机检测，CAR-T阳性率流式分析结果如图16所示。
2.抗人CD70 CAR-T细胞CD107a表达分析。
将含CD70-2A5、CD70-8B4、CD70-9D8、CD70-11C9的CAR-T细胞以及NT细胞分别与ACHN、MOLM13细胞(肾癌细胞系ACHN、早幼粒白血病细胞系MOLM13)按1:1的效靶比(效应细胞和靶细胞均为3x105个)共孵育后，流式检测其CD107a表达情况来评价CAR-T细胞在受到靶细胞刺激后的脱颗粒反应。将效应细胞和靶细胞混合置于37℃，5％CO2培养箱中共孵育4小时后，流式检测各组样品中表达CD107a的细胞分别占CD3+细胞数的比例。CD107a表达的流式分析结果如图17所示。
3.抗人CD70 CAR-T细胞杀伤ACHN、MOLM13细胞实验。
将含CD70-2A5、CD70-8B4、CD70-9D8、CD70-11C9的CAR-T细胞以及NT细胞以不同效靶比(以3x104个靶细胞为基准，效靶比分别为10:1,5:1和2.5:1)分别与稳定表达萤火虫荧光素酶的CD70阳性ACHN、MOLM13靶细胞(ACHN-LUC-GFP、MOLM13-LUC-GFP)共同培养。过夜孵育后在培养体系中加入萤光素酶反应底物，检测荧光值，通过以下公式计算杀伤效率：杀伤效率＝(1-实验孔荧光值/对照孔荧光值)x100％。实验分组及分析结果如图18所示。
4.小鼠体内药效实验
实验用NOG荷瘤(皮下接种人肾癌细胞系ACHN细胞)雌性小鼠48只，待肿瘤体积长至约100mm3时，按照肿瘤体积大小随机分成6组，分别静脉给予NT细胞注射液以及5种不同克隆的CD70 CAR-T细胞注射液，代号分别为P376、2A5、11C9、8B4、9D8。每组给药200μL/只，剂量为3×107总细胞/只。试验期间每天一次临床观察；各组小鼠分别于1D、7D、16D、22D经眼眶取抗凝血约100μL进行流式检测，检测小鼠体内T细胞存留情况；约每周2次测量肿瘤体积并记录小鼠生存状况进行记录(小鼠肿瘤体积达2000mm3，需及时安乐死)。试验观察至D24，肿瘤体积监测结果如图19所示，T细胞百分比检测结果如图20所示。
以上结果表明，本发明提供的基于新的特异性结合CD70的VHH抗体构建的靶向CD70的CAR-T细胞有很强的免疫功能，与对照CAR-T(克隆号ARGX110)细胞相比，表现为较优的CD107a表达、IFN-γ和IL-2分泌以及对靶细胞的特异性杀伤功能，体内药效显著。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海恒润达生生物科技股份有限公司
<120> 抗CD70纳米抗体及其用途
<130> 219639
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Met Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ala Gly Ala Gly Arg Ala Phe Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser
115
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH
<400> 23
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
Ser Gly Ala Gly Arg Ala Phe Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH
<400> 24
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Gly Tyr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ile Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Asp Val Leu Thr Ser Cys Arg Ser Asp Arg Trp Leu Glu Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<220>
<223> VHH
<400> 25
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Leu Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
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100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<220>
<223> VHH
<400> 26
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
35 40 45
Ala Val Ile Gly Trp Ser Gly Gly Arg Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Lys Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Ser
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Glu Gln Ser Ser Ser Ser Glu Gly Gln Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<213> Artificial Sequence
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<223> VHH
<400> 27
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
35 40 45
Ala Val Ile Thr Trp Ser Gly Gly Arg Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ala Lys Asp Ser Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Ser Glu Val Ser Ser Ser Ser Glu Gly Gln Tyr Gly Tyr
100 105 110
Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> VHH
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
50 55 60
Val Leu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asn Asn Ala Glu Asn Thr Val
65 70 75 80
Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
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100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Gly
115 120
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 29
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Asn
85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
145 150 155 160
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
165 170 175
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
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Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 30
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Met Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
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Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
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100 105 110
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Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
145 150 155 160
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
165 170 175
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val
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Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
195 200 205
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
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Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
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305 310 315 320
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
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<211> 346
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 31
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Arg Ser Ile Phe Ser Ile Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Gly Gly Ser Thr Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu
65 70 75 80
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Ser Gly Ala Gly Arg Ala Phe Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
115 120 125
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
145 150 155 160
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
165 170 175
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val
180 185 190
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
195 200 205
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
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Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
275 280 285
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
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Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
305 310 315 320
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
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Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 32
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Phe Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Gly Tyr
20 25 30
Ala Val Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ile Asp Ser Val
50 55 60
Gln Gly Arg Phe Thr Ile Thr Arg Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Asp Val Leu Thr Ser Cys Arg Ser Asp Arg Trp Leu Glu Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
115 120 125
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
130 135 140
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
145 150 155 160
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
165 170 175
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
180 185 190
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
195 200 205
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210 215 220
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
225 230 235 240
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
245 250 255
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
260 265 270
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
275 280 285
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
290 295 300
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
305 310 315 320
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
325 330 335
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Thr Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Asn Ile Phe Ser Asn Asn
20 25 30
Ala Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Ala Ile Thr Ser Asp Gly Ser Thr Asn Tyr Val Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Leu Leu
65 70 75 80
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Ala Gly Ala Gly Arg Ala Phe Pro Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
115 120 125
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
145 150 155 160
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
165 170 175
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val
180 185 190
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
195 200 205
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
210 215 220
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
275 280 285
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
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Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
305 310 315 320
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
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Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 34
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr Tyr
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Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
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Ala Val Ile Gly Trp Ser Gly Gly Arg Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val
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65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys
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Ala Ala Asp Ser Glu Gln Ser Ser Ser Ser Glu Gly Gln Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Glu Asp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr
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Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
130 135 140
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
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Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
165 170 175
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
180 185 190
Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
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Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
210 215 220
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
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Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
245 250 255
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
260 265 270
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
275 280 285
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
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Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 35
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Arg Thr Ser Ser Thr Tyr
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Ala Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
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65 70 75 80
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Glu Ser Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
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Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
130 135 140
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
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His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
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Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
180 185 190
Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
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Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
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Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
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Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
245 250 255
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
260 265 270
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
275 280 285
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
290 295 300
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
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Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
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Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
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Arg
<210> 36
<211> 352
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
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Ala Val Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Ser Ser Ser Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Val Asp Ser
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Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CH
<400> 37
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
1 5 10 15
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
20 25 30
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
35 40 45
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
50 55 60
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
85 90 95
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
100 105 110
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
115 120 125
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys
130 135 140
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
145 150 155 160
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
165 170 175
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
195 200 205
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230
<210> 38
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 SP
<400> 38
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 39
<211> 47
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 hinge
<400> 39
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 40
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD8 TM
<400> 40
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 41
<211> 111
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CD3zeta cytoplasmic domain
<400> 41
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
1 5 10 15
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
20 25 30
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
35 40 45
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
50 55 60
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
85 90 95
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 42
<211> 48
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 41BB cytoplasmic domain
<400> 42
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
35 40 45
<210> 43
<211> 1038
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 43
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcagt atcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagct attactagtg gtggtagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaatgc aggagcgggg 300
cgggcctttc ccggggacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctcaactaca 360
actccagcac ccagaccccc tacacctgct ccaactatcg caagtcagcc cctgtcactg 420
cgccctgaag cctgtcgccc tgctgccggg ggagctgtgc atactcgggg actggacttt 480
gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca 540
ctggttatca ccctttactg caggttcagt gtcgtgaaga gaggccggaa gaagctgctg 600
tacatcttca agcagccttt catgaggccc gtgcagacta cccaggagga agatggatgc 660
agctgtagat tccctgaaga ggaggaagga ggctgtgagc tgagagtgaa gttctcccga 720
agcgcagatg ccccagccta tcagcaggga cagaatcagc tgtacaacga gctgaacctg 780
ggaagacggg aggaatacga tgtgctggac aaaaggcggg gcagagatcc tgagatgggc 840
ggcaaaccaa gacggaagaa cccccaggaa ggtctgtata atgagctgca gaaagacaag 900
atggctgagg cctactcaga aatcgggatg aagggcgaaa gaaggagagg aaaaggccac 960
gacggactgt accaggggct gagtacagca acaaaagaca cctatgacgc tctgcacatg 1020
caggctctgc caccaaga 1038
<210> 44
<211> 1038
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 44
caggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaag catcttcagt atgaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagct attactagtg gtggtagcac aaactatgta 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaatgc aggagcgggg 300
cgggcctttc ccggggacta ctggggccag gggacccagg tcaccgtctc ctcaactaca 360
actccagcac ccagaccccc tacacctgct ccaactatcg caagtcagcc cctgtcactg 420
cgccctgaag cctgtcgccc tgctgccggg ggagctgtgc atactcgggg actggacttt 480
gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca 540
ctggttatca ccctttactg caggttcagt gtcgtgaaga gaggccggaa gaagctgctg 600
tacatcttca agcagccttt catgaggccc gtgcagacta cccaggagga agatggatgc 660
agctgtagat tccctgaaga ggaggaagga ggctgtgagc tgagagtgaa gttctcccga 720
agcgcagatg ccccagccta tcagcaggga cagaatcagc tgtacaacga gctgaacctg 780
ggaagacggg aggaatacga tgtgctggac aaaaggcggg gcagagatcc tgagatgggc 840
ggcaaaccaa gacggaagaa cccccaggaa ggtctgtata atgagctgca gaaagacaag 900
atggctgagg cctactcaga aatcgggatg aagggcgaaa gaaggagagg aaaaggccac 960
gacggactgt accaggggct gagtacagca acaaaagaca cctatgacgc tctgcacatg 1020
caggctctgc caccaaga 1038
<210> 45
<211> 1038
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 45
gaggtgcagg tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctcgaag catcttcagt atcaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaaac agcgcgagtt ggtcgcagct attactagtg gtggtagcac aaactatgca 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgtatctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaattc aggagcgggg 300
cgggcctttc ccggggacta ctggggccag gggaccctgg tcaccgtctc ctcaactaca 360
actccagcac ccagaccccc tacacctgct ccaactatcg caagtcagcc cctgtcactg 420
cgccctgaag cctgtcgccc tgctgccggg ggagctgtgc atactcgggg actggacttt 480
gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca 540
ctggttatca ccctttactg caggttcagt gtcgtgaaga gaggccggaa gaagctgctg 600
tacatcttca agcagccttt catgaggccc gtgcagacta cccaggagga agatggatgc 660
agctgtagat tccctgaaga ggaggaagga ggctgtgagc tgagagtgaa gttctcccga 720
agcgcagatg ccccagccta tcagcaggga cagaatcagc tgtacaacga gctgaacctg 780
ggaagacggg aggaatacga tgtgctggac aaaaggcggg gcagagatcc tgagatgggc 840
ggcaaaccaa gacggaagaa cccccaggaa ggtctgtata atgagctgca gaaagacaag 900
atggctgagg cctactcaga aatcgggatg aagggcgaaa gaaggagagg aaaaggccac 960
gacggactgt accaggggct gagtacagca acaaaagaca cctatgacgc tctgcacatg 1020
caggctctgc caccaaga 1038
<210> 46
<211> 1053
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 46
gaggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc tttgtgcagc cgggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttggat ggctatgccg tagcctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaaag agcgcgaggg ggtctcatgt attagtagta gtgatggtag cacatactat 180
atagactccg tacagggccg attcaccatc acaagaaaca atgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtac gacagatgtc 300
cttacgagct gccggagcga caggtggctc gaagtttggg gccagggcac cctggtcact 360
gtctcctcaa ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 420
cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 480
cggggactgg actttgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 540
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 600
cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 660
gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgagctgaga 720
gtgaagttct cccgaagcgc agatgcccca gcctatcagc agggacagaa tcagctgtac 780
aacgagctga acctgggaag acgggaggaa tacgatgtgc tggacaaaag gcggggcaga 840
gatcctgaga tgggcggcaa accaagacgg aagaaccccc aggaaggtct gtataatgag 900
ctgcagaaag acaagatggc tgaggcctac tcagaaatcg ggatgaaggg cgaaagaagg 960
agaggaaaag gccacgacgg actgtaccag gggctgagta cagcaacaaa agacacctat 1020
gacgctctgc acatgcaggc tctgccacca aga 1053
<210> 47
<211> 1038
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 47
caagtgcagc tggtggagac tgggggaggc ttggtgcagg ctggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggaaa catcttcagt aacaatgcca tgggctggta ccgccaggct 120
ccagggaagc agcgcgagtt ggtcgcagct attactagtg atggtagcac aaactatgta 180
gactccgtga agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaacac ggtgcttctg 240
caaatgaaca gcctgaaacc tgaggacaca gccgtctatt actgtaatgc aggagcgggg 300
cgggcctttc ccggggacta ctggggccag gggaccctgg tcactgtctc ctcaactaca 360
actccagcac ccagaccccc tacacctgct ccaactatcg caagtcagcc cctgtcactg 420
cgccctgaag cctgtcgccc tgctgccggg ggagctgtgc atactcgggg actggacttt 480
gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca 540
ctggttatca ccctttactg caggttcagt gtcgtgaaga gaggccggaa gaagctgctg 600
tacatcttca agcagccttt catgaggccc gtgcagacta cccaggagga agatggatgc 660
agctgtagat tccctgaaga ggaggaagga ggctgtgagc tgagagtgaa gttctcccga 720
agcgcagatg ccccagccta tcagcaggga cagaatcagc tgtacaacga gctgaacctg 780
ggaagacggg aggaatacga tgtgctggac aaaaggcggg gcagagatcc tgagatgggc 840
ggcaaaccaa gacggaagaa cccccaggaa ggtctgtata atgagctgca gaaagacaag 900
atggctgagg cctactcaga aatcgggatg aagggcgaaa gaaggagagg aaaaggccac 960
gacggactgt accaggggct gagtacagca acaaaagaca cctatgacgc tctgcacatg 1020
caggctctgc caccaaga 1038
<210> 48
<211> 1062
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 48
cagttgcagc tcgtggagtc tgggggagga ttggtgcagg ctgggggctc tctaagactc 60
tcctgtgcag tttctggacg cacctcaagt acttatgcca tggcctggtt ccgccaggct 120
ccaggcaagg agcgtgagat tgtagcagtt attggatgga gtggtggtag gacggcctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcactatc gccaaagaca acgccaagaa cacggtgtct 240
ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acgggcgttt attactgtgc agcagattct 300
gaacaaagta gctcgtccga aggccaggcg tatggctatg aggactgggg ccaggggacc 360
ctggtcactg tctcctcaac tacaactcca gcacccagac cccctacacc tgctccaact 420
atcgcaagtc agcccctgtc actgcgccct gaagcctgtc gccctgctgc cgggggagct 480
gtgcatactc ggggactgga ctttgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 540
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaggtt cagtgtcgtg 600
aagagaggcc ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ctttcatgag gcccgtgcag 660
actacccagg aggaagatgg atgcagctgt agattccctg aagaggagga aggaggctgt 720
gagctgagag tgaagttctc ccgaagcgca gatgccccag cctatcagca gggacagaat 780
cagctgtaca acgagctgaa cctgggaaga cgggaggaat acgatgtgct ggacaaaagg 840
cggggcagag atcctgagat gggcggcaaa ccaagacgga agaaccccca ggaaggtctg 900
tataatgagc tgcagaaaga caagatggct gaggcctact cagaaatcgg gatgaagggc 960
gaaagaagga gaggaaaagg ccacgacgga ctgtaccagg ggctgagtac agcaacaaaa 1020
gacacctatg acgctctgca catgcaggct ctgccaccaa ga 1062
<210> 49
<211> 1059
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 49
cagttgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag tttctggacg cacctcaagt acttatgcca tggcctggtt ccgccaggct 120
ccaggcaagg agcgtgagat tgtagcagtt attacatgga gtggtggtag gacggcctat 180
gcagactccg tgaagggccg attcactatc gccaaagaca gcgccaagaa cacggtgtat 240
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggat acggccgttt attactgtgc agcagattct 300
gaagtaagca gctcgtccga aggccagtat ggctatgagt cctggggcca ggggacccag 360
gtcaccgtct cctcaactac aactccagca cccagacccc ctacacctgc tccaactatc 420
gcaagtcagc ccctgtcact gcgccctgaa gcctgtcgcc ctgctgccgg gggagctgtg 480
catactcggg gactggactt tgcctgtgat atctacatct gggcgccctt ggccgggact 540
tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc accctttact gcaggttcag tgtcgtgaag 600
agaggccgga agaagctgct gtacatcttc aagcagcctt tcatgaggcc cgtgcagact 660
acccaggagg aagatggatg cagctgtaga ttccctgaag aggaggaagg aggctgtgag 720
ctgagagtga agttctcccg aagcgcagat gccccagcct atcagcaggg acagaatcag 780
ctgtacaacg agctgaacct gggaagacgg gaggaatacg atgtgctgga caaaaggcgg 840
ggcagagatc ctgagatggg cggcaaacca agacggaaga acccccagga aggtctgtat 900
aatgagctgc agaaagacaa gatggctgag gcctactcag aaatcgggat gaagggcgaa 960
agaaggagag gaaaaggcca cgacggactg taccaggggc tgagtacagc aacaaaagac 1020
acctatgacg ctctgcacat gcaggctctg ccaccaaga 1059
<210> 50
<211> 1056
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CAR
<400> 50
caggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc cgggggggtc tctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt cactttggat tattatgccg taggctggtt ccgccaggcc 120
ccagggaagg agcgcgaggg ggtctcatgt attagtagta gtagtgatgg tagcacatac 180
tatgtagact ccgtgctggg ccgattcacc atctccagaa acaatgccga gaacacggtg 240
tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggccg tttattactg ttcgacagat 300
gtccttacga gctgccggag cgacaggtat ctcgaagttt ggggccaggg caccctggtc 360
actgtctcag gcactacaac tccagcaccc agacccccta cacctgctcc aactatcgca 420
agtcagcccc tgtcactgcg ccctgaagcc tgtcgccctg ctgccggggg agctgtgcat 480
actcggggac tggactttgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 540
ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca ggttcagtgt cgtgaagaga 600
ggccggaaga agctgctgta catcttcaag cagcctttca tgaggcccgt gcagactacc 660
caggaggaag atggatgcag ctgtagattc cctgaagagg aggaaggagg ctgtgagctg 720
agagtgaagt tctcccgaag cgcagatgcc ccagcctatc agcagggaca gaatcagctg 780
tacaacgagc tgaacctggg aagacgggag gaatacgatg tgctggacaa aaggcggggc 840
agagatcctg agatgggcgg caaaccaaga cggaagaacc cccaggaagg tctgtataat 900
gagctgcaga aagacaagat ggctgaggcc tactcagaaa tcgggatgaa gggcgaaaga 960
aggagaggaa aaggccacga cggactgtac caggggctga gtacagcaac aaaagacacc 1020
tatgacgctc tgcacatgca ggctctgcca ccaaga 1056
<210> 51
<211> 238
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> IgG1Fc
<400> 51
Glu Leu Lys Thr Pro Gln Pro Gln Ser Gln Pro Glu Cys Arg Cys Pro
1 5 10 15
Lys Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe
20 25 30
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Ser Ile Ser Gly Arg Pro Glu Val
35 40 45
Thr Cys Val Val Val Asp Val Gly Gln Glu Asp Pro Glu Val Ser Phe
50 55 60
Asn Trp Tyr Ile Asp Gly Ala Glu Val Arg Thr Ala Asn Thr Lys Pro
65 70 75 80
Lys Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro
85 90 95
Ile Arg His Gln Asp Trp Leu Thr Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val
100 105 110
Asn Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Ala
115 120 125
Lys Gly Gln Thr Arg Glu Pro Gln Val Tyr Ala Leu Ala Pro His Arg
130 135 140
Glu Glu Leu Ala Lys Asp Thr Val Ser Val Thr Cys Leu Val Lys Asp
145 150 155 160
Phe Tyr Pro Val Asp Ile Asn Ile Glu Trp Gln Arg Asn Gly Gln Pro
165 170 175
Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Ala Thr Thr Pro Pro Gln Leu Asp Asn Asp
180 185 190
Gly Thr Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Gly Lys Asn Thr Trp
195 200 205
Gln Arg Gly Glu Thr Phe Thr Cys Val Val Met His Glu Ala Leu Pro
210 215 220
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Thr Gln Ser Ser Gly Lys
225 230 235
<210> 52
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ARGXBBz
<400> 52
gttgtgaccc aggagccttc cctgacagtg tctccaggag ggacggtcac gctcacctgc 60
ggcctcaaat ctgggtctgt cacttccgat aacttcccca cttggtacca gcagacacca 120
ggccaggctc cccgattgct tatctacaac acaaacaccc gtcactctgg cgtccccgac 180
cgcttctccg gatccatcct gggcaacaaa gccgccctca ccatcacggg ggcccaggcc 240
gacgacgagg ccgaatattt ctgtgctctg ttcataagta atcctagtgt tgagttcggc 300
ggagggaccc aactgaccgt cctaggtggc agcaccagcg gctccggcaa gcctggatct 360
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgcag ctcgtggagt ctgggggagg cttggtgcag 420
cctggggggt ctctgagact ctcctgtgca gcctctggat tcaccttcag tgtctactac 480
atgaactggg tccgccaggc tccagggaag gggctcgagt gggtctcaga tattaataat 540
gaaggtggta ctacatacta tgcagactcc gtgaagggcc gattcaccat ctccagagac 600
aactctaaga acagcctgta tctgcaaatg aacagcctgc gcgccgagga cacggccgtg 660
tactactgcg cgagagatgc cggatatagc aaccatgtac ccatctttga ttcttggggc 720
cagggcacta caactccagc acccagaccc cctacacctg ctccaactat cgcaagtcag 780
cccctgtcac tgcgccctga agcctgtcgc cctgctgccg ggggagctgt gcatactcgg 840
ggactggact ttgcctgtga tatctacatc tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc 900
cttctcctgt cactggttat caccctttac tgcaggttca gtgtcgtgaa gagaggccgg 960
aagaagctgc tgtacatctt caagcagcct ttcatgaggc ccgtgcagac tacccaggag 1020
gaagatggat gcagctgtag attccctgaa gaggaggaag gaggctgtga gctgagagtg 1080
aagttctccc gaagcgcaga tgccccagcc tatcagcagg gacagaatca gctgtacaac 1140
gagctgaacc tgggaagacg ggaggaatac gatgtgctgg acaaaaggcg gggcagagat 1200
cctgagatgg gcggcaaacc aagacggaag aacccccagg aaggtctgta taatgagctg 1260
cagaaagaca agatggctga ggcctactca gaaatcggga tgaagggcga aagaaggaga 1320
ggaaaaggcc acgacggact gtaccagggg ctgagtacag caacaaaaga cacctatgac 1380
gctctgcaca tgcaggctct gccaccaaga 1410

Claims (20)

1.一种CD70结合分子，包含抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段，所述抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段的互补决定区CDR包含CDR1、CDR2和CDR3，所述CD70结合分子是包含一条、两条或多条抗CD70纳米抗体或其抗原结合片段的单价或多价纳米抗体或单域抗体，其中，
CDR1如SEQ ID NO:4所示、CDR2如SEQ ID NO:9所示、和CDR3如SEQ ID NO:16所示，或者
CDR1如SEQ ID NO:7所示、CDR2如SEQ ID NO:13所示、和CDR3如SEQ ID NO:20所示。
2.如权利要求1所述的CD70结合分子，其特征在于，所述CD70结合分子还具有选自以下一项或多项的特征：
所述抗CD70纳米抗体的重链可变区序列如SEQ ID NO:24或28所示，
所述纳米抗体是骆驼重链抗体，
所述纳米抗体还包含重链恒定区。
3.一种嵌合抗原受体，包含权利要求1或2所述的CD70结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。
4.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含信号肽序列、权利要求1或2所述的CD70结合分子、铰链区、跨膜区和胞内区。
5.如权利要求3或4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内区包括胞内共刺激域和/或胞内信号域。
6.如权利要求3或4所述的嵌合抗原受体，其特征在于，从N端到C端，该嵌合抗原受体依次含有信号肽、权利要求1或2所述的CD70结合分子、铰链区、跨膜区、胞内共刺激域和胞内信号域。
7.一种核酸分子，其序列选自以下任一项：
（1）权利要求1或2所述CD70结合分子或权利要求3-6中任一项所述的嵌合抗原受体的编码序列；
（2）（1）的互补序列。
8.一种核酸构建物，包含权利要求7所述的核酸分子。
9.如权利要求8所述的核酸构建物，其特征在于，所述核酸构建物是克隆载体、表达载体或整合载体。
10.一种宿主细胞，选自：
（1）表达和/或分泌权利要求1或2所述CD70结合分子或权利要求3-6中任一项所述的嵌合抗原受体；
（2）包含权利要求7所述的核酸分子；和/或
（3）包含权利要求8或9所述的核酸构建物。
11.如权利要求10所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是免疫效应细胞。
12.如权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是T细胞。
13.一种产生权利要求1或2所述的CD70结合分子或权利要求3-6中任一项所述的嵌合抗原受体的方法，包括：在适合产生CD70结合分子的条件下培养权利要求10-12中任一项所述的宿主细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其特征在于，所述方法包括：从培养物中纯化所述CD70结合分子或嵌合抗原受体。
15.一种药物组合物，包含：权利要求3-6中任一项所述的嵌合抗原受体或其编码序列、包含所述编码序列的核酸构建物或宿主细胞，和药学上可接受的辅料，所述宿主细胞表达和/或分泌所述嵌合抗原受体、包含所述编码序列、或包含所述核酸构建物。
16.权利要求1或2所述CD70结合分子、权利要求3-6中任一项所述的嵌合抗原受体、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8或9所述的核酸构建物或权利要求10-12中任一项所述的宿主细胞在制备活化的免疫细胞中的用途，或在制备用于预防或治疗CD70阳性肿瘤的药物中的用途，所述CD70阳性肿瘤选自以下的一种或多种：肾细胞癌、急性骨髓性白血病、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、胰腺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤。
17.一种检测CD70的试剂盒，所述的试剂盒包含权利要求1或2所述CD70结合分子。
18.如权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括用于检测CD70与所述CD70结合分子的结合的试剂。
19.如权利要求18所述的试剂盒，其特征在于，所述检测结合的试剂是能与CD70结合分子连接的可检测标记物。
20.权利要求1或2所述CD70结合分子在制备用于检测样品中CD70的试剂盒、制备评估药物治疗效果的试剂盒或制备诊断CD70阳性肿瘤的试剂盒中的用途。
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