WO2023055255A1 - Crispr-cas14 system for detecting sars-cov-2 virus rna at ultra-low concentrations - Google Patents
Crispr-cas14 system for detecting sars-cov-2 virus rna at ultra-low concentrations Download PDFInfo
- Publication number
- WO2023055255A1 WO2023055255A1 PCT/RU2022/050165 RU2022050165W WO2023055255A1 WO 2023055255 A1 WO2023055255 A1 WO 2023055255A1 RU 2022050165 W RU2022050165 W RU 2022050165W WO 2023055255 A1 WO2023055255 A1 WO 2023055255A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- cov
- sars
- rna
- virus
- crispr
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title abstract description 5
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims abstract description 205
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 108020005004 Guide RNA Proteins 0.000 claims abstract description 87
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 238000010453 CRISPR/Cas method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 22
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 241000617156 archaeon Species 0.000 claims description 26
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 claims description 13
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 claims description 13
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 67
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 65
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 52
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 33
- 239000000047 product Substances 0.000 description 30
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 20
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 15
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 13
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 description 9
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 description 9
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 8
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 6
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 6
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 3
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000494545 Cordyline virus 2 Species 0.000 description 2
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 102000018120 Recombinases Human genes 0.000 description 2
- 108010091086 Recombinases Proteins 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 108091027967 Small hairpin RNA Proteins 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000011896 sensitive detection Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 241000202362 uncultured archaeon Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000203069 Archaea Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000025721 COVID-19 Diseases 0.000 description 1
- 238000013382 DNA quantification Methods 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108010078851 HIV Reverse Transcriptase Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 101800000509 Non-structural protein 8 Proteins 0.000 description 1
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013381 RNA quantification Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101500025257 Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 RNA-directed RNA polymerase nsp12 Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 241000907316 Zika virus Species 0.000 description 1
- 208000020329 Zika virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012405 in silico analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
Definitions
- the invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to the number of means - guide RNAs that can be used in the CRISPR-Casl4 system as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of SARS-CoV-2 virus RNA.
- EFFECT invention allows in vitro detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA.
- the guide RNAs described in this application can be used to detect SARS-CoV-2 virus RNA after specific amplification of fragments of the SARS-CoV-2 genome.
- Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); peaking enzyme mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
- PCR polymerase chain reaction
- LAMP loop isothermal amplification
- HDA helicase-dependent amplification
- RPA recombinase-mediated amplification
- SDA strand displacement amplification
- NASBA nucleic acid sequence based amplification
- TMA transcription-mediated amplification
- NEAR peak
- the guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech next-generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to improve methods for diagnosing infectious diseases, including the development of methods for diagnosing newly emerging infections.
- DETECTR allowed differentiation of HPV16 and HPV18 in crude DNA extracts from cultured human cells and clinical specimens within 1 h. At the same time, DETECTR correctly (comparable to the results of PCR analysis) identified HPV16 in 25 and HPV18 in 23 out of 25 clinical samples (Chen J.S., Ma E., Harrington L.B., et al. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity Science 2018 360(6387): 436-9 doi:
- the proposed platform combines the Casl3a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule.
- the Casl3a complex binds and cleaves the pre-amplified target nucleic acid with high specificity.
- SHERLOCK it was possible to correctly differentiate closely related Zika and Dengue virus strains (Gootenberg JS, Abudayyeh O. O., Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Casl3a/C2c2. Science.
- SHERLOCK has been improved (SHERLOCKv2) and allowed to detect up to 4 targets in one analysis. Multiplexing was achieved by combining several Casl3 nucleases and a Casl2 nuclease with specific fluorescent reporter complexes that provided signal detection at different wavelengths. Quantitative detection was achieved by optimizing the concentrations of oligonucleotides used in the pre-amplification step so that input signal and signal intensity are closely correlated over a wide range of sample concentrations. Increased sensitivity was achieved by adding Csm6 to increase the intensity of fluorescent reporter cleavage.
- SHERLOCKv2 is a portable analysis due to the fact that the detection of fluorescence readings in the proposed technology is replaced by visual detection on test strips (Gootenberg JS, Abudayyeh O. O., Kellner MJ, et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Casl3, Casl2a, and Csm6 Science 2018 360(6387): 439-44 doi: 10.1126/science.aaq0179).
- the HUDSON heat and chemical reduction inactivate nucleases present in high concentrations in patient biological samples, after which the viral particles are lysed, releasing nucleic acids into solution.
- HUDSON allows detection of Dengue virus within 2 hours with high sensitivity in samples of whole blood, serum and saliva of patients.
- HUDSON allows you to differentiate four Dengue virus serotypes and detect the 6 most common HIV reverse transcriptase mutations (Myhrvold C., Freije C.A., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Casl3. Science. 2018; 360(6387): 444-8 doi: 10.1126/science.aas8836).
- CRISPR-Cas of uncultivated archaea were described that contain Casl4 proteins - a family of exceptionally compact RNA- controlled nucleases (from 400 to 700 amino acids). Despite their small size, Casl4 proteins are capable of targeted cleavage of single-stranded DNA and double-stranded DNA. Moreover, target recognition by Casl4 triggers non-specific hydrolysis (cleavage) of the fluorescent reporter molecule, an activity that allows Casl4 to be used for detection of human infectious agent(s), their genotyping, and also for highly accurate detection of single nucleotide polymorphisms.
- the proposed platform was named Casl4-DETECTR (Harrington LB, Burstein D., Chen JS, Paez-Espino D., Ma E., Witte IP, Cofsky JC, Kyrpides NC, Banfield JF, Doudna JA Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Casl4 enzymes Science 2018 362(6416):839-842 doi: 10.1126/science.aav4294).
- J.P. Broughton and co-authors described the DETECTR technology for detecting SARS-CoV-2 virus RNA, where the N and E genes of SARS-CoV-2 served as a target for amplification by the method of isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-LAMP), and the detection took place with Casl2a in test strip format.
- the sensitivity of the described method varied from 70 to 300 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [J.P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C.L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, et al., CRISPR-Cas 12-based detection of SARS-CoV-2, Nature Biotechnology 38 (2020) 870-874, https://doi.org/10.1038/s41587- 020-0513-4].
- Casl2a has also been used to detect SARS-CoV-2 RNA in a method called AIOD-CRISPR.
- the N gene was chosen as a target, the amplification of a fragment of which was carried out in the course of an isothermal reaction combined with reverse transcription (RT-RPA).
- the sensitivity of AIOD-CRISPR was 10-100 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [X. Ding, K. Yin, Z. Li, R. Lalla, E. Ballesteros, M Sfeir, C. Liu, Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Casl2a assay. Nat. commun.
- ENHANCE technology was developed, which makes it possible to detect from 3 to 300 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction, in which the preliminary amplification of the N gene fragment was carried out by the method of isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-LAMP), followed by detection amplification products using modified Casl2a [LT Nguyen, V.M. Smith, R.K. Jain, Enhancement of trans-cleavage activity of Casl2a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection, Nat. commun. 11 (4906) (2020), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-1].
- the SHERLOCK platform When using the SHERLOCK platform to detect the RNA of the SARS-CoV-2 virus, the S and Orflab genes were described as a target. Pre-amplification was performed using isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-RPA), before detection with Casl3a, an additional step of in vitro transcription was performed.
- RT-RPA reverse transcription
- the SHERLOCK technology made it possible to detect 10-100 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [F. Zhang, O.O. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, C. Sciences, L. Mathers, A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Bioarchive. (2020) 1-8].
- the FELUDA diagnostic platform was proposed for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA. Detection of SARS-CoV-2 virus RNA (NSP8 and N genes) occurred after reverse transcription with Cas9. The sensitivity of the method was estimated at 3.16-10 SARS-CoV-2 virus RNA copies per reaction [SM Mohd. Azhar, Rhythm Phutela, Asgar Hussain Ansari, Dipanjali Sinha, Namrata Sharma, Manoj Kumar, Meghali Aich, Saumya Sharma, Khushboo Singhal, Harsha Lad, Pradeep K.
- CRISPR/Cas based technology is a feature rich, error tolerant DNA detection technology suitable for rapid diagnosis including infectious diseases, genotyping of infectious agents, and detection of antibiotic resistance genes in bacterial pathogens.
- the invention relates to new tools - guide RNA, which can be used in the CRISPR-Casl4 system for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of SARS-CoV-2 virus RNA in biological samples.
- the technical objective of the proposed invention is the development of new tools - guide RNA, which can be used in the CRISPR- Casl4 with Casl4 proteins, such as Casl4al from uncultivated archaeon, for ultrasensitive detection of SARS-CoV-2 virus RNA.
- guide RNA molecules that can be used in CRISPR-Casl4 systems for ultra-sensitive detection of RNA of the SARS-CoV-2 virus, where these guide RNAs are selected from the sequences of SEQ ID NO: 1-4, are able to bind to target highly conserved RNA regions of the SARS-CoV-2 virus contain a hairpin RNA, which is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease Casl4al from a non-cultivated archaeon, ensuring the detection of single copies of the SARS-CoV-2 virus RNA.
- RNA-directed DNA endonuclease Casl4al from a non-cultivated archaeon obtained according to the method developed by the authors earlier (Patent RU No. 2707542, priority date 03/28/2019), to create ribonucleoprotein complexes (RNA) of the CRISPR/Cas system suitable for virus RNA detection SARS-CoV-2 at ultra low concentrations (single copies).
- a guide RNA molecule of the CRISPR/Cas system has been proposed, which is capable of binding to target highly conserved regions of the SARS-CoV-2 virus genome.
- the nucleotide sequence of the guide RNA disclosed herein is selected from the sequences of SEQ ID NOs: 1-4.
- the guide RNA molecule contains an RNA hairpin, which is recognized by the RNA-guided DNA endonuclease Casl4al from an uncultivated archaeon.
- the guide RNA molecule ensures the detection of single copies of SARS-CoV-2 RNA.
- the guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the SARS-CoV-2 virus genome. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-guided DNA endonuclease Casl4al from a non-cultivated archaeon, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- RNA ribonucleoprotein complexes
- RNA consisting of at least one guide RNA and one RNA-directed DNA endonuclease of the CRISPR/Cas system (Casl4al from non-cultivated archaeon), suitable for use to detect SARS-CoV-2 virus RNA in ultra-low concentrations (single copies).
- Ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system for detection of SARS-CoV-2 virus RNA formed from one of the RNA-guided DNA endonuclease (Casl4al from a non-cultivated archaeon) and at least one guide RNA.
- the proposed ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system is suitable for detecting single copies of SARS-CoV-2 virus RNA.
- RNA preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1-4 combined with a CRISPR/Cas system protein (Casl4al from non-culturable archaeon) or freeze-dried RNA.
- the resulting guide RNAs can be used as part of a SARS-CoV-2 virus RNA detection kit, with instructions for use.
- a kit for detecting SARS-CoV-2 virus RNA may contain a ribonucleoprotein complex and instructions for use.
- At least one guide RNA in the kit can be complexed with a protein of the CRISPR/Cas system (Casl4al from non-cultivated archaeon) in one container or separately in different containers.
- a protein of the CRISPR/Cas system Casl4al from non-cultivated archaeon
- the kit may additionally include components for pre-amplification of highly conserved fragments of the SARS-CoV-2 virus genome, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 5-8.
- oligonucleotides for pre-amplification of a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus correspond to highly conserved regions of the genome of the SARS-CoV-2 virus. Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- the proposed technology makes it possible to determine single copies of SARS-CoV-2 virus RNA in biological samples of a patient selected from fluid and/or tissue suspected to contain the SARS-CoV-2 virus.
- the biological sample can be a sample of blood, blood serum or plasma, cerebrospinal fluid, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials from a patient that can be used to analyze for the presence of SARS-CoV-2 virus RNA .
- M - molecular weight standards from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
- Fig. 2 Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #135 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 3 Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #157 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 4 Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #166 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 5 Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #215 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 6 Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #135 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 7 Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #157 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 8 Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #166 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 9 Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #215 guide RNA and Casl4al protein.
- Fig. 10 Fluorescence values at the end point (60 assay cycle, 60 minutes) at 37°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and guide RNA SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS crRNA -CoV-2 #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
- Fig. 11 Fluorescence values at the endpoint (60 assay cycle, 60 minutes) at 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and guide RNAs SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
- Fig. 12 Comparison of endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) at 37°C and 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and SARS-CoV-2 crRNA guide RNAs #135 (A), SARS-CoV-2 crRNA #157 (B), SARS-CoV-2 crRNA #166 (C), SARS-CoV-2 crRNA #215 (D), respectively.
- A SARS-CoV-2 crRNA #157
- B SARS-CoV-2 crRNA #166
- D SARS-CoV-2 crRNA #215
- Fig. Fig. 13 Visualization of amplification products obtained during amplification of SARS-CoV-2 fragments using 10 clinical samples, where M are molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 , 1200, 1500, 2000, 3000 bp (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
- Fig. 14 Endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) at 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target (10 independent clinical specimens) treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and SARS-CoV- crRNA guide RNAs. 2 #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
- Fig. Fig. 15. Visualization of the amplification products obtained during the amplification of SARS-CoV-2 fragments using tenfold dilutions of the RNA preparation isolated from the clinical sample of the patient, where M is the molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
- Fig. 16 Fluorescence values at the end point (60 assay cycle, 60 minutes) at 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target (ten-fold dilutions of an RNA preparation isolated from a clinical patient sample) treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and guides SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
- Embodiments of the invention Example 1. Selection of target sequences in the genome of the SARS-CoV-2 virus to create guide RNAs
- Table 1 List of regions of the SARS-CoV-2 virus genome with the theoretically calculated probability of their cleavage by Casl4al from an uncultivated archaeon.
- RNAs specifically recognizing fragments in the genome of the SARS-CoV-2 virus are represented by unique sequences SEQ ID N0: 1-4.
- Example 2 Preparation of material for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA by the pre-amplification method.
- Preparation of material for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA is carried out by the method of preliminary amplification combined with reverse transcription (RT-PCR).
- Synthetic RNA obtained by in vitro transcription is used as a model template for a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus of a biological sample.
- plasmid DNA pGEM-T-SARS-CoV-2 is used, which contains a fragment of the gene encoding the E protein of the SARS-CoV-2 virus (260 bp in size).
- Synthesis of cDNA fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus is carried out by reverse transcription using a specific oligonucleotide E-pr_Revl with SEQ ID NO: 6 (Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of fragments of the genome of the SARS-CoV-2 virus) and SuperScriptTM reverse transcriptase II (Thermo Fisher Scientific, USA) at 42°C.
- Pre-amplification of a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus is carried out using specific oligonucleotides E-pr_Forl and E-pr_Revl with SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively, shown in Table 2.
- Specific oligonucleotides for pre-amplification of fragments of the SARS virus genome -CoV-2 are obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Federal Budgetary Institution of Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides (GenTerra, Russia) listed in Table 2.
- Specific oligonucleotides for preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments The size of the amplified fragments is 260 base pairs. Temperature profile of amplification:
- the model RNA synthesized on the pGEM-T-SARS-CoV-2 matrix is titrated by preparing serial dilutions (Table 3. Serial dilutions samples of a model matrix containing a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus).
- Table 3 Serial dilutions of model RNA template samples containing a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome.
- the resulting products corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
- the material prepared by the described method without preliminary purification is used for experiments on the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using Casl4al ribonucleoprotein complexes from non-cultivated archaeon containing guide RNAs with unique sequences SEQ ID NO: 1-4.
- Example 3 Preparation of guide RNAs and creation of ribonucleoprotein complexes for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA.
- the PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 135 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a# 3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#135 (GenTerra, Russia).
- the size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 135 is 247 base pairs.
- the PCR product encoding SARS-CoV-2 no. 157 crRNA guide RNA was obtained in an amplification reaction using PCR mix-2 blue Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a#3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#157 (GenTerra, Russia).
- the size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 157 is 247 base pairs.
- the PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 166 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a# 3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#166 (GenTerra, Russia).
- the size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 166 is 247 base pairs.
- the PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 215 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a# 3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#215 (GenTerra, Russia).
- the size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 215 is 247 bp.
- PCR products encoding guide RNAs specific for a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome are visualized by agarose gel electrophoresis.
- PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome is carried out using commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified NCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome are used as a template for guide RNA synthesis.
- Synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribeTM T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions.
- the reaction products of in vitro transcription are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 shM and an equal volume of isopropyl alcohol.
- Such modifications of the manufacturer's protocol introduced by the authors allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
- the guide RNA preparation (250 ng) is heated at 90°C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). Such heating is necessary for the formation of the correct hairpin conformation contained in the guide RNA.
- Many manufacturers of commercial Cas protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
- ribonucleoprotein complex 250 ng Cas-protein Casl4al from a non-culturable archaeon and the prepared corresponding guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature.
- the ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for detection of fragments of the SARS-CoV-2 virus genome.
- Example 4 Detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes using a model matrix as an example.
- the pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
- reaction mixture is prepared containing the following components:
- ribonucleoprotein complex (Casl4al from non-cultivated archaeon and guide RNAs SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215);
- reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a QuantStudio 5 cycler (Thermo Fisher Scientific, USA) and the following reaction parameters are set:
- Typical results of analysis performed at 37°C are shown using examples of real-time fluorescence profiles of pre-amplified fragments treated with ribonucleoportein complexes containing SARS-CoV-2 crRNA #135 or SARS-CoV-2 crRNA #157 or SARS- CoV-2 #166 or SARS-CoV-2 crRNA #215 and Casl4al protein, FIG. 2-5 respectively.
- the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence of the control sample that did not contain the target sequence) by more than 5 times on average on the 7th analysis cycle (7 minutes).
- Example 5 Detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes in a limited panel of clinical specimens.
- the developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (10 pcs.) containing the SARS-CoV-2 virus (previously confirmed using real-time PCR).
- RNA preparations were isolated from clinical samples of 10 patients using a commercially available RIBO-prep kit (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) according to the manufacturer's instructions.
- Amplification products encoding fragments of the SARS-CoV-2 virus genome were prepared in the amplification reaction as described in Example 2 using the temperature profile and duration of the amplification reaction described. To evaluate the efficiency of pre-amplification, the resulting products, corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus, visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 13).
- the material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
- Detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes is carried out by the method described in Example 4.
- CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archaeon and corresponding guide RNAs have the ability to ultra-sensitively detect fragments of the SARS-CoV-2 virus in RNA preparations isolated from clinical samples.
- CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archaeon and guide RNAs have different efficiencies, and they can be arranged in the following order in order of decreasing activity: SARS-CoV-2 crRNA no. 215 > SARS-CoV-2 crRNA no. 166 > SARS-CoV-2 crRNA #135 > SARS-CoV-2 crRNA #157.
- the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from uncultivated archaeon and SARS-CoV crRNA guide RNAs -2 No. 135 and crRNA SARS-CoV-2 No. 157 exceeded the “noise” value (non-specific fluorescence of a control sample that does not contain a target sequence) by more than 5 times on average at the 30th analysis cycle (30 minutes).
- FIG. 14 shows typical analysis results using examples of fluorescence values in endpoint (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of SARS-CoV-2 virus genome fragments (10 independent clinical specimens) treated with ribonucleoportein complexes containing SARS-CoV-2 crRNA guide RNA #135 or SARS-CoV- crRNA 2 #157 or SARS-CoV-2 crRNA #166 or SARS-CoV-2 crRNA #215 and Casl4al protein from non-cultivated archaeon.
- Table 5 Serial dilutions of SARS-CoV-2 virus RNA isolated from a clinical sample.
- Amplification products encoding fragments of the SARS-CoV-2 virus genome were prepared in the amplification reaction as described in Example 2 using the temperature profile and duration of the amplification reaction described.
- the material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3. Detection of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes is carried out by the method described in Example 4.
- Figure 16 shows typical assay results using examples of endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of fragments of the SARS-CoV-2 virus genome (ten-fold dilutions of an RNA preparation isolated from a clinical sample of a patient) treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA SARS-CoV-2 crRNA #135 or SARS-CoV-2 crRNA #157 or SARS-CoV-2 crRNA #166 or SARS-CoV-2 crRNA #215 and Casl4al protein from uncultured archaeon.
- the developed guide RNAs make it possible, as part of the CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes of the CRISPR-Casl4 system, to detect ultrasensitively single copies of SARS-CoV-2 virus RNA in the reaction after preliminary amplification in RNA preparations (including those diluted 100,000,000 times) isolated from clinical specimens containing the SARS-CoV-2 virus.
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, and more particularly to guide RNAs and ribonucleoprotein complexes of a CRISPR/Cas system which contain said guide RNAs, and to kits containing said ribonucleoprotein complexes of the CRISPR/Cas system and specific oligonucleotides for the preliminary amplification of a highly conserved region of the SARS-CoV-2 virus genome. The invention makes it possible to efficiently detect SARS-CoV-2 virus RNA following specific amplification of a fragment of the virus genome. The invention allows the detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA.
Description
СИСТЕМА CRISPR-CAS14 ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 В УЛЬТРАНИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ CRISPR-CAS14 SYSTEM FOR SARS-COV-2 VIRUS RNA DETECTION IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS
Область техники Technical field
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Casl4 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) РНК вируса SARS-CoV-2. The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to the number of means - guide RNAs that can be used in the CRISPR-Casl4 system as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of SARS-CoV-2 virus RNA.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии РНК вируса SARS- CoV-2. EFFECT: invention allows in vitro detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции РНК вируса SARS-CoV-2 после проведения специфической амплификации фрагментов генома SARS-CoV-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная пикирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации. The guide RNAs described in this application can be used to detect SARS-CoV-2 virus RNA after specific amplification of fragments of the SARS-CoV-2 genome. Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); peaking enzyme mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний, в том числе для разработки методов диагностики вновь возникающих инфекций. The guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech next-generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to improve methods for diagnosing infectious diseases, including the development of methods for diagnosing newly emerging infections.
Предшествующий уровень техники Prior Art
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением
непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования. To solve the epidemiological problems of deciphering outbreaks of infectious diseases, identifying and identifying the pathogen, as well as detecting specific bacterial and viral genes, it is necessary to develop and introduce modern technologies of molecular epidemiology into the practice of surveillance and monitoring services. One such technology is the use of genetic editing elements of the CRISPR/CAS system. This technology is developing quite effectively in relation to the creation of drugs for the treatment of certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence unexpected mutations. With in-depth studies in the field of application of the CRISPR / CAS system, it was found that it can be used for subtle diagnostic procedures in identifying the pathogen / her infection in humans, as well as their genotyping.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы — Casl2 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Casl2 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter — ДНК- нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Casl2a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 — в 23 из 25 клинических образцов (Chen J.S., Ma Е., Harrington L.B., et al. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018; 360(6387): 436-9. doi:In 2018, it was shown that one of the enzymes of the CRISPR system, Casl2, after recognizing its target DNA target, begins to nonspecifically hydrolyze single-stranded DNA. This property of Casl2 can be used as an indicator of the presence of a specific target, such as the genome of a virus or bacteria. The researchers used this discovery to create a nucleic acid detection technology platform known as DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). The proposed platform combines the Casl2a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. For the first time, DETECTR technology was used to detect and genotype the human papillomavirus. DETECTR allowed differentiation of HPV16 and HPV18 in crude DNA extracts from cultured human cells and clinical specimens within 1 h. At the same time, DETECTR correctly (comparable to the results of PCR analysis) identified HPV16 in 25 and HPV18 in 23 out of 25 clinical samples (Chen J.S., Ma E., Harrington L.B., et al. CRISPR-Casl2a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity Science 2018 360(6387): 436-9 doi:
10.1126/science.aar6245). 10.1126/science.aar6245).
He менее важным приложением системы CRISPR/Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking — ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Casl3a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Casl3a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту- мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге (Gootenberg J.S., Abudayyeh О. О., Lee J.W., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Casl3a/C2c2. Science. 2017; 356(6336): 438-42. doi: 10.1126/science.aam9321).
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Casl3 и нуклеазы Casl2 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках (Gootenberg J.S., Abudayyeh О. О., Kellner M.J., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Casl3, Casl2a, and Csm6. Science. 2018; 360(6387): 439-44. doi: 10.1126/science.aaq0179). An equally important application of the CRISPR/Cas system is the identification of pathogens and the detection of specific bacterial genes using the SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) platform. The proposed platform combines the Casl3a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. The Casl3a complex binds and cleaves the pre-amplified target nucleic acid with high specificity. Using SHERLOCK, it was possible to correctly differentiate closely related Zika and Dengue virus strains (Gootenberg JS, Abudayyeh O. O., Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Casl3a/C2c2. Science. 2017; 356(6336): 438-42 doi: 10.1126/science.aam9321). SHERLOCK has been improved (SHERLOCKv2) and allowed to detect up to 4 targets in one analysis. Multiplexing was achieved by combining several Casl3 nucleases and a Casl2 nuclease with specific fluorescent reporter complexes that provided signal detection at different wavelengths. Quantitative detection was achieved by optimizing the concentrations of oligonucleotides used in the pre-amplification step so that input signal and signal intensity are closely correlated over a wide range of sample concentrations. Increased sensitivity was achieved by adding Csm6 to increase the intensity of fluorescent reporter cleavage. It should be noted that SHERLOCKv2 is a portable analysis due to the fact that the detection of fluorescence readings in the proposed technology is replaced by visual detection on test strips (Gootenberg JS, Abudayyeh O. O., Kellner MJ, et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Casl3, Casl2a, and Csm6 Science 2018 360(6387): 439-44 doi: 10.1126/science.aaq0179).
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases — нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ (Myhrvold С., Freije С. А., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Casl3. Science. 2018; 360(6387): 444-8. doi: 10.1126/science.aas8836). Based on SHERLOCK, the HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) technology was developed, which eliminates the need for extraction of nucleic acids and allows the detection of pathogens directly in patient biological samples (blood, serum or plasma sample, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials). At HUDSON, heat and chemical reduction inactivate nucleases present in high concentrations in patient biological samples, after which the viral particles are lysed, releasing nucleic acids into solution. HUDSON allows detection of Dengue virus within 2 hours with high sensitivity in samples of whole blood, serum and saliva of patients. In addition, HUDSON allows you to differentiate four Dengue virus serotypes and detect the 6 most common HIV reverse transcriptase mutations (Myhrvold C., Freije C.A., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Casl3. Science. 2018; 360(6387): 444-8 doi: 10.1126/science.aas8836).
Также в 2018 году были описаны CRISPR-Cas некультивируемых архей, которые содержат белки Casl4 - семейство исключительно компактных РНК-
управляемых нуклеаз (от 400 до 700 аминокислот). Несмотря на свой небольшой размер, белки Casl4 способны к целевому расщеплению одноцепочечной ДНК и двуцепочечной ДНК. Более того, распознавание мишени с помощью Casl4 запускает неспецифический гидролиз (расщепление) флуоресцентной репортерной молекулы - активности, которая делает возможным применение Casl4 для выявления возбудителя/ей инфекции у человека, их генотипирования, а также для высокоточное выявления однонуклеотидных полиморфизмов. Предложенная платформа получила название Casl4-DETECTR (Harrington L.B., Burstein D., Chen J.S., Paez-Espino D., Ma E., Witte I.P., Cofsky J.C., Kyrpides N.C., Banfield J.F., Doudna J. A. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Casl4 enzymes. Science. 2018; 362(6416):839-842. doi: 10.1126/science.aav4294). Also in 2018, CRISPR-Cas of uncultivated archaea were described that contain Casl4 proteins - a family of exceptionally compact RNA- controlled nucleases (from 400 to 700 amino acids). Despite their small size, Casl4 proteins are capable of targeted cleavage of single-stranded DNA and double-stranded DNA. Moreover, target recognition by Casl4 triggers non-specific hydrolysis (cleavage) of the fluorescent reporter molecule, an activity that allows Casl4 to be used for detection of human infectious agent(s), their genotyping, and also for highly accurate detection of single nucleotide polymorphisms. The proposed platform was named Casl4-DETECTR (Harrington LB, Burstein D., Chen JS, Paez-Espino D., Ma E., Witte IP, Cofsky JC, Kyrpides NC, Banfield JF, Doudna JA Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Casl4 enzymes Science 2018 362(6416):839-842 doi: 10.1126/science.aav4294).
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/Cas. In this regard, the task of developing new effective methods for detecting nucleic acids of pathogens of infectious diseases based on genetic technologies, such as CRISPR/Cas, is extremely urgent.
В ходе изучения уровня техники были найдены научные статьи, описывающие разработку технологий для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro, основанных на применении белков систем направленного редактирования генома. During the study of the prior art, scientific articles were found describing the development of technologies for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA in vitro, based on the use of proteins of directed genome editing systems.
J.P. Broughton и соавторы описали технологию DETECTR для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, где в качестве мишени для амплификации методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), служили гены N и Е SARS-CoV-2, а детекция проходила с помощью Casl2a в формате тест-полоски. Чувствительность описанного метода варьировала от 70 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [J.P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C.L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, et al., CRISPR-Cas 12-based detection of SARS-CoV-2, Nature Biotechnology 38 (2020) 870-874, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4]. J.P. Broughton and co-authors described the DETECTR technology for detecting SARS-CoV-2 virus RNA, where the N and E genes of SARS-CoV-2 served as a target for amplification by the method of isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-LAMP), and the detection took place with Casl2a in test strip format. The sensitivity of the described method varied from 70 to 300 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [J.P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C.L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, et al., CRISPR-Cas 12-based detection of SARS-CoV-2, Nature Biotechnology 38 (2020) 870-874, https://doi.org/10.1038/s41587- 020-0513-4].
Casl2a также был использован для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в методе, названном AIOD-CRISPR. В качестве мишени был выбран ген N, амплификация фрагмента которого проводилась в ходе изотермической реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA). Чувствительность AIOD-CRISPR составляла 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [X. Ding, К. Yin, Z. Li, R. Lalla, E. Ballesteros, M Sfeir, C. Liu, Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV- 2 using all-in-one dual CRISPR-Casl2a assay. Nat. Commun. 2020 (18) (2020) https://doi.org/10.1038/s41467-020- 18575-6] .
Кроме того, была разработана технология ENHANCE, позволяющая выявлять от 3 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию, в которой предварительная амплификация фрагмента гена N осуществлялась методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью модифицированного Casl2a [L.T. Nguyen, В.М. Smith, Р.К. Jain, Enhancement of trans-cleavage activity of Casl2a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection, Nat. Commun. 11 (4906) (2020), https ://doi.org/10.1038/s41467-020- 18615-1]. Casl2a has also been used to detect SARS-CoV-2 RNA in a method called AIOD-CRISPR. The N gene was chosen as a target, the amplification of a fragment of which was carried out in the course of an isothermal reaction combined with reverse transcription (RT-RPA). The sensitivity of AIOD-CRISPR was 10-100 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [X. Ding, K. Yin, Z. Li, R. Lalla, E. Ballesteros, M Sfeir, C. Liu, Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Casl2a assay. Nat. commun. 2020(18)(2020) https://doi.org/10.1038/s41467-020-18575-6]. In addition, the ENHANCE technology was developed, which makes it possible to detect from 3 to 300 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction, in which the preliminary amplification of the N gene fragment was carried out by the method of isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-LAMP), followed by detection amplification products using modified Casl2a [LT Nguyen, V.M. Smith, R.K. Jain, Enhancement of trans-cleavage activity of Casl2a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection, Nat. commun. 11 (4906) (2020), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-1].
L.U. Guo и соавторы в совей работе описали технологию CASdetec, которая позволяла выявлять 100-500 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию. В основе технологии лежала изотермическая амплификация с помощью рекомбиназы, совмещенная с обратной транскрипцией (RT-RAA). Мишенью для амплификации служил фрагмент гена RdRp SARS-CoV-2. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью Casl2b [L.u. Guo, X. Sun, X. Wang, C. Liang, H. Jiang, Q. Gao, et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discov 6 (1) (2020), https://doi.org/10.1038/s41421-020-0174-y]. L.U. Guo and co-authors in their work described the CASdetec technology, which made it possible to detect 100-500 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction. The technology was based on isothermal amplification using recombinase coupled with reverse transcription (RT-RAA). The SARS-CoV-2 RdRp gene fragment served as the target for amplification. Amplification products were detected using Casl2b [L.u. Guo, X. Sun, X. Wang, C. Liang, H. Jiang, Q. Gao, et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discov 6 (1) (2020), https:// doi.org/10.1038/s41421-020-0174-y].
При использовании платформы SHERLOCK для выявления РНК вируса SARS- CoV-2 в качестве мишени были описаны гены S и Orflab. Предварительная амплификация проводилась с применением изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA), перед детекцией с помощью Casl3a проводили дополнительный этап in vitro транскрипции. Технология SHERLOCK позволяла выявить 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [F. Zhang, О.О. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, C. Sciences, L. Mathers, A protocol for detection of COVID- 19 using CRISPR diagnostics, Bioarchive. (2020) 1-8]. When using the SHERLOCK platform to detect the RNA of the SARS-CoV-2 virus, the S and Orflab genes were described as a target. Pre-amplification was performed using isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-RPA), before detection with Casl3a, an additional step of in vitro transcription was performed. The SHERLOCK technology made it possible to detect 10-100 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [F. Zhang, O.O. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, C. Sciences, L. Mathers, A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Bioarchive. (2020) 1-8].
Кроме методов, перечисленных выше, для выявления РНК вируса SARS-CoV- 2 была предложена диагностическая платформа FELUDA. Выявление РНК вируса SARS-CoV-2 (гены NSP8 и N) происходило после обратной транскрипции с помощью Cas9. Чувствительность метода оценивалась в 3,16-10 копий РНК вируса SARS-CoV- 2 на реакцию [S.M. Mohd. Azhar, Rhythm Phutela, Asgar Hussain Ansari, Dipanjali Sinha, Namrata Sharma, Manoj Kumar, Meghali Aich, Saumya Sharma, Khushboo Singhal, Harsha Lad, Pradeep K. Patra, Govind Makharia, Giriraj Ratan Chandak, Debojyoti Chakraborty, Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, BioRxiv. (2020). doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167].
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий (менее 3 копий РНК на реакцию) РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro с помощью Casl4. In addition to the methods listed above, the FELUDA diagnostic platform was proposed for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA. Detection of SARS-CoV-2 virus RNA (NSP8 and N genes) occurred after reverse transcription with Cas9. The sensitivity of the method was estimated at 3.16-10 SARS-CoV-2 virus RNA copies per reaction [SM Mohd. Azhar, Rhythm Phutela, Asgar Hussain Ansari, Dipanjali Sinha, Namrata Sharma, Manoj Kumar, Meghali Aich, Saumya Sharma, Khushboo Singhal, Harsha Lad, Pradeep K. Patra, Govind Makharia, Giriraj Ratan Chandak, Debojyoti Chakraborty, Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, BioRxiv. (2020). doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167]. Based on this, a technical problem arises, which consists in the need to develop and obtain guide RNAs to detect single copies (less than 3 RNA copies per reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA in vitro using Casl4.
Раскрытие изобретения Disclosure of invention
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология основанная на CRISPR/Cas является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов. The proposed technology is promising for a variety of applications, including DNA/RNA quantification, fast multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, such as detection of sample contamination with nucleic acids. CRISPR/Cas based technology is a feature rich, error tolerant DNA detection technology suitable for rapid diagnosis including infectious diseases, genotyping of infectious agents, and detection of antibiotic resistance genes in bacterial pathogens.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами: The application of the proposed technology makes it possible to create a new generation of diagnostic systems that will have the following properties:
- высокая чувствительность; - high sensitivity;
- возможность проведения диагностики у постели больного; - Possibility of carrying out diagnostics at the patient's bedside;
- возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования; - the possibility of carrying out diagnostics in the field without the use of specialized high-tech equipment;
- скорость и простота анализа; - speed and simplicity of analysis;
- сниженная стоимость анализа; - reduced cost of analysis;
- отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием; - no need to equip the diagnostic laboratory with expensive equipment;
- отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя. - no need to isolate the nucleic acids of the pathogen.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-Casl4 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции РНК вируса SARS-CoV-2 в биологических образцах. The invention relates to new tools - guide RNA, which can be used in the CRISPR-Casl4 system for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of SARS-CoV-2 virus RNA in biological samples.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системе CRISPR-
Casl4 с белками Casl4, например, Casl4al из некультивируемого археона, для ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2. The technical objective of the proposed invention is the development of new tools - guide RNA, which can be used in the CRISPR- Casl4 with Casl4 proteins, such as Casl4al from uncultivated archaeon, for ultrasensitive detection of SARS-CoV-2 virus RNA.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до единичных (1,64) копий РНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до 10 раз. When implementing the present invention, according to the set of essential features given in the claims, an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of SARS-CoV-2 virus RNA up to single (1.64) copies of RNA in one reaction. EFFECT: invention provides up to 10 times higher efficiency of SARS-CoV-2 virus RNA detection.
Технический результат достигается за счет: The technical result is achieved due to:
- разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Casl4 для ультра чувствительного выявления РНК вируса SARS- CoV-2, где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1-4, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками РНК вируса SARS-CoV-2, содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Casl4al из некультивируемого археона, с обеспечением выявления единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2. - development of guide RNA molecules that can be used in CRISPR-Casl4 systems for ultra-sensitive detection of RNA of the SARS-CoV-2 virus, where these guide RNAs are selected from the sequences of SEQ ID NO: 1-4, are able to bind to target highly conserved RNA regions of the SARS-CoV-2 virus contain a hairpin RNA, which is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease Casl4al from a non-cultivated archaeon, ensuring the detection of single copies of the SARS-CoV-2 virus RNA.
- применения РНК-направляемой ДНК -эндонуклеазы Casl4al из некультивируемого археона, полученной согласно способу, разработанному авторами ранее (Патент RU № 2707542, дата приоритета 28.03.2019), для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РНК) системы CRISPR/Cas, пригодных для детекции РНК вируса SARS-CoV-2 в ультра низких концентрациях (единичные копии). - the use of RNA-directed DNA endonuclease Casl4al from a non-cultivated archaeon, obtained according to the method developed by the authors earlier (Patent RU No. 2707542, priority date 03/28/2019), to create ribonucleoprotein complexes (RNA) of the CRISPR/Cas system suitable for virus RNA detection SARS-CoV-2 at ultra low concentrations (single copies).
- разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 5-8, для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. - development of a set of specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 5-8 for preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments.
- оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. - optimization of conditions for preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments.
- определения условий проведения ультрачувствительной детекции РНК вируса SARS-CoV-2 и установления последовательности стадий метода. - determining the conditions for ultrasensitive detection of SARS-CoV-2 virus RNA and establishing the sequence of the method steps.
Предложена молекула направляющей РНК системы CRISPR/Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками генома вируса SARS-CoV-2. Нуклеотидная последовательность раскрытой в настоящей заявке направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-4.
Молекула направляющей РНК содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК- направляемой ДНК-эндонуклеазой Casl4al из некультивируемого археона. A guide RNA molecule of the CRISPR/Cas system has been proposed, which is capable of binding to target highly conserved regions of the SARS-CoV-2 virus genome. The nucleotide sequence of the guide RNA disclosed herein is selected from the sequences of SEQ ID NOs: 1-4. The guide RNA molecule contains an RNA hairpin, which is recognized by the RNA-guided DNA endonuclease Casl4al from an uncultivated archaeon.
Молекула направляющей РНК обеспечивает выявление единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2. The guide RNA molecule ensures the detection of single copies of SARS-CoV-2 RNA.
Направляющие РНК, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным фрагментам генома вируса SARS-CoV-2. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК- эндонуклеазой Casl4al из некультивируемого археона, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из: The guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the SARS-CoV-2 virus genome. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-guided DNA endonuclease Casl4al from a non-cultivated archaeon, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- SEQ ID NO: 1; - SEQ ID NO: 1;
- SEQ ID NO: 2; - SEQ ID NO: 2;
- SEQ ID NO: 3; - SEQ ID NO: 3;
- SEQ ID NO: 4; - SEQ ID NO: 4;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,- or at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 identical to any of them %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%,
- или комплементарной любой из них, - or complementary to any of them,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях. - or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РНК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR/Cas (Casl4al из некультивируемого археона), пригодные для использования для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях (единичные копии). According to the proposed invention, ribonucleoprotein complexes (RNA) are obtained, consisting of at least one guide RNA and one RNA-directed DNA endonuclease of the CRISPR/Cas system (Casl4al from non-cultivated archaeon), suitable for use to detect SARS-CoV-2 virus RNA in ultra-low concentrations (single copies).
Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, сформированный из одной из РНК-направляемой ДНК- эндонуклеазы (Casl4al из некультивируемого археона), и по меньшей мере одной направляющей РНК. Ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system for detection of SARS-CoV-2 virus RNA, formed from one of the RNA-guided DNA endonuclease (Casl4al from a non-cultivated archaeon) and at least one guide RNA.
Предложенный рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas пригоден для выявления единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2. The proposed ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system is suitable for detecting single copies of SARS-CoV-2 virus RNA.
Препараты РНК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-4, объединенную с белком системы CRISPR/Cas (Casl4al из некультивируемого археона) или лиофильно высушенные РНК.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, с инструкцией по применению. RNA preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1-4 combined with a CRISPR/Cas system protein (Casl4al from non-culturable archaeon) or freeze-dried RNA. The resulting guide RNAs can be used as part of a SARS-CoV-2 virus RNA detection kit, with instructions for use.
Набор для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, может содержать рибонуклеопротеиновый комплекс и инструкцию по применению. A kit for detecting SARS-CoV-2 virus RNA may contain a ribonucleoprotein complex and instructions for use.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/Cas (Casl4al из некультивируемого археона) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах. At the same time, at least one guide RNA in the kit can be complexed with a protein of the CRISPR/Cas system (Casl4al from non-cultivated archaeon) in one container or separately in different containers.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса SARS-CoV-2, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 5-8. The kit may additionally include components for pre-amplification of highly conserved fragments of the SARS-CoV-2 virus genome, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 5-8.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента генома вируса SARS-CoV-2, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным участкам генома вируса SARS- CoV-2. Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из: Specific oligonucleotides for pre-amplification of a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus, according to the present invention, correspond to highly conserved regions of the genome of the SARS-CoV-2 virus. Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
- SEQ ID NO: 5; - SEQ ID NO: 5;
- SEQ ID NO: 6; - SEQ ID NO: 6;
- SEQ ID NO: 7; - SEQ ID NO: 7;
- SEQ ID NO: 8; - SEQ ID NO: 8;
- или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%,- or at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 identical to any of them %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%,
- или комплементарной любой из них, - or complementary to any of them,
- или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях. - or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус SARS-CoV-2. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, спинномозговой жидкости, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие РНК вируса SARS-CoV-2. The proposed technology makes it possible to determine single copies of SARS-CoV-2 virus RNA in biological samples of a patient selected from fluid and/or tissue suspected to contain the SARS-CoV-2 virus. The biological sample can be a sample of blood, blood serum or plasma, cerebrospinal fluid, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials from a patient that can be used to analyze for the presence of SARS-CoV-2 virus RNA .
Краткое описание чертежей
Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса SARS- CoV-2 (размером 260 и. о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены: Brief description of the drawings Fig. 1. Visualization of the amplified fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus (size 260 b.p.) after preliminary amplification by electrophoresis in agarose gel, where the numbers 1-8 indicate:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 1 - The product obtained during the amplification of 2000 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 2 - The product obtained during the amplification of 200 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 3 - The product obtained during the amplification of 20 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 4 - The product obtained during the amplification of 2 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 5 - The product obtained during the amplification of 0.2 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 6 - The product obtained during the amplification of 0.02 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 7 - The product obtained during the amplification of 0.002 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
8 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,0002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2; 8 - The product obtained during the amplification of 0.0002 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
9 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T- SARS-CoV-2; 9 - negative control, not containing the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США). M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
Фиг. 2. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 и белок Casl4al. Fig. 2. Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #135 guide RNA and Casl4al protein.
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №157 и белок Casl4al.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №166 и белок Casl4al. Fig. 3. Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #157 guide RNA and Casl4al protein. Fig. 4. Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #166 guide RNA and Casl4al protein.
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Casl4al. Fig. 5. Real-time fluorescence profile at 37°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #215 guide RNA and Casl4al protein.
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 и белок Casl4al. Fig. 6. Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #135 guide RNA and Casl4al protein.
Фиг. 7. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №157 и белок Casl4al. Fig. 7. Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #157 guide RNA and Casl4al protein.
Фиг. 8. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №166 и белок Casl4al. Fig. 8. Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #166 guide RNA and Casl4al protein.
Фиг. 9. Профиль флуоресценции в реальном времени при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Casl4al. Fig. 9. Real-time fluorescence profile at 46°C of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #215 guide RNA and Casl4al protein.
Фиг. 10. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 37°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Casl4al и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно. Fig. 10. Fluorescence values at the end point (60 assay cycle, 60 minutes) at 37°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and guide RNA SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS crRNA -CoV-2 #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Casl4al
и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно. Fig. 11. Fluorescence values at the endpoint (60 assay cycle, 60 minutes) at 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and guide RNAs SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
Фиг. 12. Сравнение значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 37°С и 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Casl4al и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 (А), crRNA SARS-CoV-2 №157 (Б), crRNA SARS-CoV-2 №166 (В), crRNA SARS-CoV-2 №215 (Г) соответственно. Fig. 12. Comparison of endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) at 37°C and 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and SARS-CoV-2 crRNA guide RNAs #135 (A), SARS-CoV-2 crRNA #157 (B), SARS-CoV-2 crRNA #166 (C), SARS-CoV-2 crRNA #215 (D), respectively.
Фиг. 13. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием 10 клинических образцов, где М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США). Fig. Fig. 13. Visualization of amplification products obtained during amplification of SARS-CoV-2 fragments using 10 clinical samples, where M are molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 , 1200, 1500, 2000, 3000 bp (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
Фиг. 14. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Casl4al и направляющие РНК crRNA SARS-CoV- 2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно. Fig. 14. Endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) at 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target (10 independent clinical specimens) treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and SARS-CoV- crRNA guide RNAs. 2 #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
Фиг. 15. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием десятикратных разведениий препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента, где М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США). Fig. Fig. 15. Visualization of the amplification products obtained during the amplification of SARS-CoV-2 fragments using tenfold dilutions of the RNA preparation isolated from the clinical sample of the patient, where M is the molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, USA).
Фиг. 16. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) при 46°С для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок Casl4al и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215 соответственно. Fig. 16. Fluorescence values at the end point (60 assay cycle, 60 minutes) at 46°C for a pre-amplified SARS-CoV-2 target (ten-fold dilutions of an RNA preparation isolated from a clinical patient sample) treated with ribonucleoportein complexes containing the Casl4al protein and guides SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215, respectively.
Варианты осуществления изобретения
Пример 1. Подбор последовательностей-мишеней в геноме вируса SARS-CoV-2 для создания направляющих РНК Embodiments of the invention Example 1. Selection of target sequences in the genome of the SARS-CoV-2 virus to create guide RNAs
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса SARS-CoV-2 для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1. Перечень участков генома вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления Casl4al из некультивируемого археона). For the selection of target sequences in the genome of the SARS-CoV-2 virus, modern algorithms for in silico analysis of nucleotide sequences and programs that are in the public domain, including Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology) were used to create guide RNAs. /). A list of regions in the genome of the SARS-CoV-2 virus was compiled with a theoretically calculated probability of their cleavage in highly conserved regions (Table 1. List of regions of the SARS-CoV-2 virus genome with a theoretically calculated probability of their cleavage by Casl4al from an uncultivated archaeon).
Таблица 1. Перечень участков генома вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления Casl4al из некультивируемого археона.
Table 1. List of regions of the SARS-CoV-2 virus genome with the theoretically calculated probability of their cleavage by Casl4al from an uncultivated archaeon.
Направляющие РНК, специфически узнающие фрагменты в геноме вируса SARS-CoV-2, представлены уникальными последовательностями SEQ ID N0: 1-4. Guide RNAs specifically recognizing fragments in the genome of the SARS-CoV-2 virus are represented by unique sequences SEQ ID N0: 1-4.
Пример 2. Подготовка материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 методом предварительной амплификации. Example 2. Preparation of material for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA by the pre-amplification method.
Подготовку материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 проводят методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В качестве модельной матрицы фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 биологического образца используют синтетическую РНК, полученную методом in vitro транскрипции. В качестве матрицы для синтеза модельной РНК используют плазмидную ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащую в своем составе фрагмент гена, кодирующего Е белок вируса SARS-CoV-2 (размером 260 и. о.).
Синтез кДНК фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят методом обратной транскрипции с использованием специфического олигонуклеотида Е- pr_Revl с SEQ ID NO: 6 (Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2) и обратной транскриптазы SuperScript™ II (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 42°С. Preparation of material for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA is carried out by the method of preliminary amplification combined with reverse transcription (RT-PCR). Synthetic RNA obtained by in vitro transcription is used as a model template for a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus of a biological sample. As a template for the synthesis of model RNA, plasmid DNA pGEM-T-SARS-CoV-2 is used, which contains a fragment of the gene encoding the E protein of the SARS-CoV-2 virus (260 bp in size). Synthesis of cDNA fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus is carried out by reverse transcription using a specific oligonucleotide E-pr_Revl with SEQ ID NO: 6 (Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of fragments of the genome of the SARS-CoV-2 virus) and SuperScript™ reverse transcriptase II (Thermo Fisher Scientific, USA) at 42°C.
Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2.
Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments.
Предварительную амплификацию фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят с использованием специфических олигонуклеотидов E-pr_Forl и E-pr_Revl с SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 6 соответственно, приведенных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Продукты амплификации, кодирующие фрагмент генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР- смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Размер амплифицированных фрагментов составляет 260 пар нуклеотидов. Температурный профиль амплификации: Pre-amplification of a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus is carried out using specific oligonucleotides E-pr_Forl and E-pr_Revl with SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6, respectively, shown in Table 2. Specific oligonucleotides for pre-amplification of fragments of the SARS virus genome -CoV-2. Amplification products encoding a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus are obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Federal Budgetary Institution of Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides (GenTerra, Russia) listed in Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments. The size of the amplified fragments is 260 base pairs. Temperature profile of amplification:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут; 1. denaturation: 95°C for 3 minutes;
2. 35 циклов амплификации: 2. 35 amplification cycles:
95°С - 15 сек,
55°C - 45 сек, 95°С - 15 sec, 55°C - 45 sec,
72°C - 30 сек; 72°C - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут. 3. final elongation: 72°C for 5 minutes.
В ходе подготовки материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, проводят титрование модельной РНК, синтезированной на матрице pGEM-T-SARS- CoV-2, путем приготовления серийных разведений (Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей фрагмент генома вируса SARS-CoV-2). During the preparation of material for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA by pre-amplification combined with reverse transcription, the model RNA synthesized on the pGEM-T-SARS-CoV-2 matrix is titrated by preparing serial dilutions (Table 3. Serial dilutions samples of a model matrix containing a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus).
Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной РНК-матрицы, содержащей фрагмент генома вируса SARS-CoV-2.
Table 3. Serial dilutions of model RNA template samples containing a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1). To assess the efficiency of pre-amplification, the resulting products corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
Подготовленный описанным способом материал без предварительной очистки используют для экспериментов по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов Casl4al из некультивируемого археона, содержащих направляющие РНК с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-4. The material prepared by the described method without preliminary purification is used for experiments on the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using Casl4al ribonucleoprotein complexes from non-cultivated archaeon containing guide RNAs with unique sequences SEQ ID NO: 1-4.
Пример 3. Получение направляющих РНК и создание рибонуклеопротеиновых комплексов для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2. Example 3 Preparation of guide RNAs and creation of ribonucleoprotein complexes for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA.
Для получения направляющих РНК для обнаружения РНК вируса SARS-CoV- 2 разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ППР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2.
Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2.
To obtain guide RNAs for detection of SARS-CoV-2 virus RNA, a set of specific oligonucleotides has been developed. Table 4. Specific oligonucleotides for obtaining a PCR product encoding guide RNAs specific for SARS-CoV-2 virus RNA.
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов: Obtaining guide RNA is carried out in several stages:
1. получение ППР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ППР- продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV- 2), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым фрагментом генома вируса SARS-CoV-2, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК- направляемой ДНК-эндонуклеазой Casl4al из некультивируемого археона; 1. Obtaining an SPR product using a set of specific oligonucleotides (Table 4. Specific oligonucleotides for obtaining an SPR product encoding guide RNAs specific to SARS-CoV-2 virus RNA) encoding a guide RNA capable of binding to a target fragment of the SARS virus genome -CoV-2 containing a hairpin RNA that is recognized by RNA-directed DNA endonuclease Casl4al from an uncultivated archaeon;
2. очистка ППР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2; 2. purification of the SPR product encoding a guide RNA specific to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS- CoV-2; 3. synthesis of a guide RNA specific to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2. 4. Purification of a guide RNA specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a#3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 и tailCasl4a#6-crRNA#135 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №135, составляет 247 пары нуклеотидов. The PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 135 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a# 3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#135 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 135 is 247 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №157, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН
ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a#3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 и tailCasl4a#6-crRNA#157 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №157, составляет 247 пары нуклеотидов. The PCR product encoding SARS-CoV-2 no. 157 crRNA guide RNA was obtained in an amplification reaction using PCR mix-2 blue Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a#3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#157 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 157 is 247 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №166, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a#3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 и tailCasl4a#6-crRNA#166 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №166, составляет 247 пары нуклеотидов. The PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 166 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a# 3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#166 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 166 is 247 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №215, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a#3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 и tailCasl4a#6-crRNA#215 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №215, составляет 247 пары нуклеотидов. The PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 215 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr-tail Casl4a, tailCasl4a#2, tailCasl4a# 3, tailCasl4a#4, tailCasl4a#5 and tailCasl4a#6-crRNA#215 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 215 is 247 bp.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, содержащие РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой Casl4al из некультивируемого археона: Amplification temperature profile for obtaining PCR products encoding guide RNAs containing an RNA hairpin that is recognized by the Casl4al RNA-guided DNA endonuclease from an uncultured archaeon:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут; 1. denaturation: 95°C for 3 minutes;
2. 35 циклов амплификации: 2. 35 amplification cycles:
95°С - 15 сек, 95°С - 15 sec,
55°С - 45 сек, 55°С - 45 sec,
72°С - 30 сек; 72°C - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут. 3. final elongation: 72°C for 5 minutes.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле. PCR products encoding guide RNAs specific for a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome are visualized by agarose gel electrophoresis.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса вируса SARS-CoV-2, проводят с использованием
коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные НЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК. Purification of PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome is carried out using commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified NCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome are used as a template for guide RNA synthesis.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса SARS- CoV-2, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 шМ и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК. Synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions. The reaction products of in vitro transcription are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 shM and an equal volume of isopropyl alcohol. Such modifications of the manufacturer's protocol introduced by the authors allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
Создание готовых рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих белок семейства CRISPR/Cas Casl4al из некультивируемого археона, и соответствующую направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5). The creation of ready-made ribonucleoprotein complexes containing the CRISPR/Cas Casl4al family protein from an uncultivated archeon and the corresponding guide RNA is carried out by the authors according to a standard protocol with some modifications (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1 -20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 иг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса. Immediately before combining with the Cas protein, the guide RNA preparation (250 ng) is heated at 90°C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). Such heating is necessary for the formation of the correct hairpin conformation contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial Cas protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 иг Cas- белка Casl4al из некультивируемого археона и подготовленную соответствующую направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления фрагментов генома вируса SARS-CoV-2.
Пример 4. Обнаружение единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas на примере модельной матрицы. To form a ready-made ribonucleoprotein complex, 250 ng Cas-protein Casl4al from a non-culturable archaeon and the prepared corresponding guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for detection of fragments of the SARS-CoV-2 virus genome. Example 4. Detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes using a model matrix as an example.
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3. The pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, содержащих Casl4al из некультивируемого археона, готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты: To detect SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes containing Casl4al from uncultivated archaeon, a reaction mixture is prepared containing the following components:
- 10* буфер (200 шМ HEPES pH 7,0, 250 М NaCl, 100 mM MgC12, 10 mM DTT);- 10* buffer (200 sM HEPES pH 7.0, 250 M NaCl, 100 mM MgC12, 10 mM DTT);
- 250 иг рибонуклеопротеинового комплекса (Casl4al из некультивируемого археона и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135, crRNA SARS-CoV-2 №157, crRNA SARS-CoV-2 №166, crRNA SARS-CoV-2 №215); - 250 g of ribonucleoprotein complex (Casl4al from non-cultivated archaeon and guide RNAs SARS-CoV-2 crRNA #135, SARS-CoV-2 crRNA #157, SARS-CoV-2 crRNA #166, SARS-CoV-2 crRNA #215);
- 10 pmol флуоресцентный зонд (FAM-TTT-TTT-TTT-TTT-BHQ1); - 10 pmol fluorescent probe (FAM-TTT-TTT-TTT-TTT-BHQ1);
- мишень (предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса вируса SARS-CoV-2); - target (preliminarily amplified fragment of the SARS-CoV-2 virus genome);
- вода niQ. - niQ water.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задают следующие параметры реакции: The reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a QuantStudio 5 cycler (Thermo Fisher Scientific, USA) and the following reaction parameters are set:
60 циклов: 60 cycles:
37°С - 35 сек, 37°С - 35 sec,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции; или 37°C - 25 sec, fluorescence recording; or
60 циклов: 60 cycles:
46°С - 35 сек, 46°С - 35 sec,
46°С - 25 сек, съемка флуоресценции. 46°C - 25 sec, fluorescence imaging.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Casl4al из некультивируемого археона, с использованием в качестве мишени модельной РНК, синтезированной на основе
плазмидной ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащей в своем составе фрагмент геном вируса SARS-CoV-2 размером 260 п.о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2. Типичные результаты анализа, проведенного при 37°С, приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных фрагментов, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие crRNA SARS- CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Casl4al, на Фиг. 2-5 соответственно. Отметим, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 7-ом цикле анализа (7 минут). First of all, experiments were carried out to detect single copies of the SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archeon, using as a target a model RNA synthesized on the basis of pGEM-T-SARS-CoV-2 plasmid DNA containing a 260 bp SARS-CoV-2 virus genome fragment. CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes have been shown to be able to detect single copies of SARS-CoV-2 virus RNA. Typical results of analysis performed at 37°C are shown using examples of real-time fluorescence profiles of pre-amplified fragments treated with ribonucleoportein complexes containing SARS-CoV-2 crRNA #135 or SARS-CoV-2 crRNA #157 or SARS- CoV-2 #166 or SARS-CoV-2 crRNA #215 and Casl4al protein, FIG. 2-5 respectively. Note that the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence of the control sample that did not contain the target sequence) by more than 5 times on average on the 7th analysis cycle (7 minutes).
Типичные результаты анализа, проведенного при 46°С, приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных фрагментов, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие crRNA SARS-CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Casl4al, на Фиг. 6-9 соответственно. Отметим, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 9-ом цикле анализа (9 минут). Representative results of analysis performed at 46°C are shown using examples of real-time fluorescence profiles of pre-amplified fragments treated with ribonucleoportein complexes containing SARS-CoV-2 #135 crRNA or SARS-CoV-2 #157 crRNA or SARS- CoV-2 #166 or SARS-CoV-2 crRNA #215 and Casl4al protein, FIG. 6-9 respectively. Note that the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence of the control sample that did not contain the target sequence) by more than 5 times on average on the 9th analysis cycle (9 minutes).
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием различных направляющих РНК при 37°С (Фиг. 10). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Casl4al из некультивируемого археона и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса SARS-CoV-2 с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №215 > crRNA SARS-CoV-2 №166 > crRNA SARS-CoV-2 №135 > crRNA SARS-CoV-In the course of the work, the efficiency of detecting single copies of the SARS-CoV-2 virus genome contained in the model RNA matrix was evaluated using various guide RNAs at 37°C (Fig. 10). It has been shown that CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archaeon and guide RNAs detect single copies of the SARS-CoV-2 virus genome with different efficiency, and they can be arranged in the following order of decreasing activity: SARS-CoV crRNA -2 #215 > SARS-CoV-2 crRNA #166 > SARS-CoV-2 crRNA #135 > SARS-CoV- crRNA-
2 №157.
В ходе работ также была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием различных направляющих РНК при 46°С (Фиг. 11). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Casl4al из некультивируемого археона и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса SARS-CoV-2 с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №215 > crRNA SARS-CoV-2 №166 > crRNA SARS-CoV-2 №135 > crRNA SARS-CoV- 2 №157. 2 #157. In the course of the work, the efficiency of detecting single copies of the SARS-CoV-2 virus genome contained in the model RNA matrix was also evaluated using various guide RNAs at 46°C (Fig. 11). It has been shown that CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archaeon and guide RNAs detect single copies of the SARS-CoV-2 virus genome with different efficiency, and they can be arranged in the following order of decreasing activity: SARS-CoV crRNA -2 #215 > SARS-CoV-2 crRNA #166 > SARS-CoV-2 crRNA #135 > SARS-CoV-2 crRNA #157.
Также в ходе проведенных экспериментов было показано, что выявление единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Casl4al из некультивируемого археона и направляющих РНК, проходит эффективнее при температуре 46°С (Фиг. 12). Also, in the course of the experiments, it was shown that the detection of single copies of the SARS-CoV-2 virus genome contained in the model RNA matrix using the CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archeon and guide RNAs is more efficient at a temperature 46°C (Fig. 12).
Пример 5. Обнаружение единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas на ограниченной панели клинических образцов. Example 5 Detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes in a limited panel of clinical specimens.
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт.), содержащих вирус SARS-CoV-2 (ранее подтверждено с помощью ПНР в реальном времени). The developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (10 pcs.) containing the SARS-CoV-2 virus (previously confirmed using real-time PCR).
Для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Casl4al из некультивируемого археона и соответствующих направляющих РНК, была проведена предварительная амплификация фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты РНК. To detect single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from uncultivated archeon and corresponding guide RNAs, preliminary amplification of fragments of the SARS-CoV-2 virus genome was carried out. For preliminary amplification, RNA preparations were isolated from clinical samples of 10 patients using a commercially available RIBO-prep kit (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) according to the manufacturer's instructions.
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV- 2, получают в реакции амплификации как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации. Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты,
соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 13). Amplification products encoding fragments of the SARS-CoV-2 virus genome were prepared in the amplification reaction as described in Example 2 using the temperature profile and duration of the amplification reaction described. To evaluate the efficiency of pre-amplification, the resulting products, corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus, visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 13).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3. The material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Обнаружение единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4. Detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes is carried out by the method described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Casl4al из некультивируемого археона и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью ультра чувствительно выявлять фрагменты вируса SARS-CoV-2 в препаратах РНК, выделенных из клинических образцов. При этом рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Casl4al из некультивируемого археона и направляющих РНК, обладают различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №215 > crRNA SARS-CoV-2 №166 > crRNA SARS-CoV-2 №135 > crRNA SARS-CoV- 2 №157. Стоит отметить, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Casl4al из некультивируемого археона и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 и crRNA SARS-CoV-2 №157, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 30-ом цикле анализа (30 минут). Значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе Casl4al из некультивируемого археона и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №215 и crRNA SARS-CoV-2 №166, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 5 -ом цикле анализа (5 минут) и более чем в 50 раз в среднем на 42-ом цикле (42 минуты). На Фиг. 14 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в
конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Casl4al из некультивируемого археона. The analysis showed that CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archaeon and corresponding guide RNAs have the ability to ultra-sensitively detect fragments of the SARS-CoV-2 virus in RNA preparations isolated from clinical samples. At the same time, CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archaeon and guide RNAs have different efficiencies, and they can be arranged in the following order in order of decreasing activity: SARS-CoV-2 crRNA no. 215 > SARS-CoV-2 crRNA no. 166 > SARS-CoV-2 crRNA #135 > SARS-CoV-2 crRNA #157. It should be noted that the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from uncultivated archaeon and SARS-CoV crRNA guide RNAs -2 No. 135 and crRNA SARS-CoV-2 No. 157, exceeded the “noise” value (non-specific fluorescence of a control sample that does not contain a target sequence) by more than 5 times on average at the 30th analysis cycle (30 minutes). Significance of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from a non-cultivated archeon and guide RNAs of SARS-CoV-2 crRNA No. 215 and crRNA SARS-CoV-2 No. 166, exceeded the value of "noise" (non-specific fluorescence of a control sample that does not contain a target sequence) by more than 5 times on average at the 5th analysis cycle (5 minutes) and more than 50 times on average on the 42nd cycle (42 minutes). On FIG. 14 shows typical analysis results using examples of fluorescence values in endpoint (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of SARS-CoV-2 virus genome fragments (10 independent clinical specimens) treated with ribonucleoportein complexes containing SARS-CoV-2 crRNA guide RNA #135 or SARS-CoV- crRNA 2 #157 or SARS-CoV-2 crRNA #166 or SARS-CoV-2 crRNA #215 and Casl4al protein from non-cultivated archaeon.
В заключение были проведены эксперименты по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 в последовательных разведениях препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента. Для этого были подготовлены серийные десятикратные разведения препарата РНК от 1 :10 до 1 : 100 000 000 (Таблица 5. Серийные разведения РНК вируса SARS-CoV-2, выделенной из клинического образца). In conclusion, experiments were carried out to detect SARS-CoV-2 virus RNA in serial dilutions of an RNA preparation isolated from a patient's clinical sample. For this, serial tenfold dilutions of the RNA preparation from 1:10 to 1:100,000,000 were prepared (Table 5. Serial dilutions of SARS-CoV-2 virus RNA isolated from a clinical sample).
Таблица 5. Серийные разведения РНК вируса SARS-CoV-2, выделенной из клинического образца.
Table 5. Serial dilutions of SARS-CoV-2 virus RNA isolated from a clinical sample.
* - пороговый цикл (Ct), значение которого получено в ходе ПНР исследования. Остальные Ct расчетные. * - threshold cycle (Ct), the value of which was obtained during the commissioning of the study. The remaining Ct are calculated.
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV- 2, получают в реакции амплификации как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации. Amplification products encoding fragments of the SARS-CoV-2 virus genome were prepared in the amplification reaction as described in Example 2 using the temperature profile and duration of the amplification reaction described.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 15). To assess the efficiency of pre-amplification, the resulting products corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 15).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.
Обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4. The material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3. Detection of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes is carried out by the method described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе Casl4al из некультивируемого археона и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в препарате РНК, разведенном в 100 000 000 раз. При этом при использовании направляющей РНК crRNA SARS-CoV-2 №215, обладающей наибольшей эффективностью, значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в 9 раз. На Фиг. 16 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №135 или crRNA SARS-CoV-2 №157 или crRNA SARS-CoV-2 №166 или crRNA SARS-CoV-2 №215 и белок Casl4al из некультивируемого археона. The analysis showed that CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of Casl4al from an uncultivated archeon and corresponding guide RNAs are able to detect SARS-CoV-2 virus RNA in an RNA preparation diluted 100,000,000 times. At the same time, when using the guide RNA crRNA SARS-CoV-2 No. 215, which has the highest efficiency, the signal value exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence of the control sample that did not contain the target) by 9 times. On FIG. Figure 16 shows typical assay results using examples of endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of fragments of the SARS-CoV-2 virus genome (ten-fold dilutions of an RNA preparation isolated from a clinical sample of a patient) treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA SARS-CoV-2 crRNA #135 or SARS-CoV-2 crRNA #157 or SARS-CoV-2 crRNA #166 or SARS-CoV-2 crRNA #215 and Casl4al protein from uncultured archaeon.
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas системы CRISPR-Casl4 ультрачувствительно выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2 в реакции после предварительной амплификации в препаратах РНК (в том числе разведенных в 100 000 000 раз), выделенных из клинических образцов, содержащих вирус SARS- CoV-2.
Thus, the developed guide RNAs make it possible, as part of the CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes of the CRISPR-Casl4 system, to detect ultrasensitively single copies of SARS-CoV-2 virus RNA in the reaction after preliminary amplification in RNA preparations (including those diluted 100,000,000 times) isolated from clinical specimens containing the SARS-CoV-2 virus.
Claims
1. Молекула направляющей РНК системы CRISPR/Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками генома вируса SARS- CoV-2, где нуклеотидная последовательность направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1-4. 1. A guide RNA molecule of the CRISPR/Cas system that is capable of binding to target highly conserved regions of the SARS-CoV-2 virus genome, where the nucleotide sequence of the guide RNA is selected from the sequences of SEQ ID NOs: 1-4.
2. Молекула направляющей РНК по п.1, отличающаяся тем, что содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК- эндонуклеазой Casl4al из некультивируемого археона. 2. A guide RNA molecule according to claim 1, characterized in that it contains an RNA hairpin, which is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease Casl4al from an uncultivated archaeon.
3. Молекула направляющей РНК по п.1-2, отличающаяся тем, что обеспечивает выявление единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2. 3. The guide RNA molecule according to claim 1-2, characterized in that it ensures the detection of single copies of the RNA of the SARS-CoV-2 virus.
4. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, сформированный из РНК-направляемой ДНК -эндонуклеазы Casl4al из некультивируемого археона, и по меньшей мере одной направляющих РНК из п. 1-3. 4. The ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system for detecting SARS-CoV-2 virus RNA, formed from the Casl4al RNA-guided DNA endonuclease from a non-culturable archaeon, and at least one guide RNA from paragraphs 1-3.
5. Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas по п.4, пригодный для выявления единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2. 5. Ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system according to claim 4, suitable for detecting single copies of SARS-CoV-2 virus RNA.
6. Набор для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, содержащий 6. SARS-CoV-2 virus RNA detection kit containing
(i) (а) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/Cas по любому из и. и. 1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу Casl4al из некультивируемого археона; или (i) (a) a CRISPR/Cas guide RNA molecule according to any one of i. And. 1-3 and directed DNA endonuclease Casl4al from non-cultivated archaeon; or
(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из и.4-5, и (i) (b) a ribonucleoprotein complex according to any one of 4-5, and
(и) инструкцию по применению. (i) instructions for use.
7. Набор для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, содержащий 7. SARS-CoV-2 virus RNA detection kit containing
(i) (а) молекулу направляющей РНК системы CRISPR/Cas по любому из и. и. 1-3 и направляемую ДНК-эндонуклеазу Casl4al из некультивируемого археона; или (i) (a) a CRISPR/Cas guide RNA molecule according to any one of i. And. 1-3 and directed DNA endonuclease Casl4al from non-cultivated archaeon; or
(i) (b) рибонуклеопротеиновый комплекс по любому из и.4-5; и (i) (b) a ribonucleoprotein complex according to any one of i.4-5; And
(и) один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8, и (i) one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, and
(iii) инструкцию по применению. (iii) instructions for use.
26
26
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021128589 | 2021-09-30 | ||
| RU2021128589A RU2764020C1 (en) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | CRISPR-CAS14 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2023055255A1 true WO2023055255A1 (en) | 2023-04-06 |
Family
ID=80040285
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2022/050165 WO2023055255A1 (en) | 2021-09-30 | 2022-05-24 | Crispr-cas14 system for detecting sars-cov-2 virus rna at ultra-low concentrations |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2764020C1 (en) |
| WO (1) | WO2023055255A1 (en) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (en) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | METHOD OF PRODUCING A RECOMBINANT NUCLEASE CAS ESSENTIALLY FREE OF BACTERIAL ENDOTOXINS, THE PREPARATION OBTAINED BY THIS METHOD AND CONTAINING A KIT FOR USE IN A CRISPR/Cas SYSTEM |
-
2021
- 2021-09-30 RU RU2021128589A patent/RU2764020C1/en active
-
2022
- 2022-05-24 WO PCT/RU2022/050165 patent/WO2023055255A1/en unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (en) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | METHOD OF PRODUCING A RECOMBINANT NUCLEASE CAS ESSENTIALLY FREE OF BACTERIAL ENDOTOXINS, THE PREPARATION OBTAINED BY THIS METHOD AND CONTAINING A KIT FOR USE IN A CRISPR/Cas SYSTEM |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| BROUGHTON JAMES P ET AL.: "CRISPR-Cas12-based detection of SARS-CoV-2", NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 38, 2020, pages 870 - 874, XP037187541, DOI: https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4 * |
| GUO LU ET AL.: "SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics", CELL DISCOVERY, vol. 6, 2020, pages 34, XP055815836, DOI: 10.1038/s41421-020-0174-y * |
| HARRINGTON LUCAS B ET AL.: "Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes", SCIENCE, vol. 362, no. 6416, 2018, pages 839 - 842, XP055614750, DOI: 10.1126/ science .aav4294 * |
| XIAO RENJIAN ET AL.: "Structural basis for substrate recognition and cleavage by the dimerization-dependent CRISPR-Cas12f nuclease", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 49, no. 7, 2021, pages 4120 - 4128, XP055926469, DOI: 10.1093/nar/gkab179 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2764020C1 (en) | 2022-01-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11078507B2 (en) | Probability-directed isolation of nucleotide sequences (PINS) | |
| CN114214455B (en) | Quick quantitative primer probe for hepatitis B virus DNA and CRISPR/Cas12b detection system thereof | |
| RU2764020C1 (en) | CRISPR-CAS14 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764022C1 (en) | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD | |
| RU2764023C1 (en) | CRISPR-Cas 12 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764024C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR / Cas14 AND A PREPARATION FOR DETECTING THE RNA OF THE SARS-CoV-2 VIRUS IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764021C1 (en) | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD | |
| RU2764015C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE CRISPR/Cas 12 RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX AND PREPARATION FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2745637C1 (en) | Method for obtaining the crispr/cas ribonucleoprotein complex preparation and preparation for detection of the blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene in ultra-low concentrations | |
| RU2800421C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting hepatitis c virus rna genotypes 1b and 3a at ultra-low concentrations | |
| RU2800420C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2802079C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2802783C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations in ultra-low concentrations | |
| RU2802781C1 (en) | Method of obtaining a preparation of the ribonucleoprotein complex crispr-cas12 and a preparation for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations | |
| RU2799430C1 (en) | Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex crispr-cas and a preparation for detecting hepatitis c virus rna of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations | |
| RU2782700C1 (en) | Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations | |
| RU2747880C1 (en) | Method for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in method | |
| RU2782951C1 (en) | Method for detecting the dna of the hepatitis b virus at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2747820C1 (en) | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations | |
| RU2747819C1 (en) | Method for obtaining preparation of ribonucleoprotein complex crispr / cas and preparation for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) in ultra-low concentrations | |
| Zeng et al. | Rapid and sensitive Cas12a-based one-step nucleic acid detection with ssDNA-modified crRNA | |
| RU2734520C1 (en) | Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2743861C1 (en) | Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations | |
| RU2791879C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa, at ultra-low concentrations | |
| RU2791880C1 (en) | Method for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa at ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 22877005 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |