RU2764021C1 - METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD - Google Patents
METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD Download PDFInfo
- Publication number
- RU2764021C1 RU2764021C1 RU2021128585A RU2021128585A RU2764021C1 RU 2764021 C1 RU2764021 C1 RU 2764021C1 RU 2021128585 A RU2021128585 A RU 2021128585A RU 2021128585 A RU2021128585 A RU 2021128585A RU 2764021 C1 RU2764021 C1 RU 2764021C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- cov
- sars
- rna
- virus
- detection
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnical field
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) РНК вируса SARS-CoV-2, а также к диагностическим способам и наборам.The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to the number of guide RNA tools that can be used in CRISPR-Cas12 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of SARS-CoV-2 virus RNA, as well as to diagnostic methods and sets.
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2.EFFECT: invention allows to detect single copies of SARS-CoV-2 virus RNA in vitro.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции РНК вируса SARS-CoV-2 после проведения специфической амплификации фрагментов генома SARS-CoV-2. Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (ТМА); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.The guide RNAs described in this application can be used to detect SARS-CoV-2 virus RNA after specific amplification of fragments of the SARS-CoV-2 genome. Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); nicking enzyme mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний, в том числе для разработки методов диагностики вновь возникающих инфекций.The guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech next-generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to improve methods for diagnosing infectious diseases, including the development of methods for diagnosing newly emerging infections.
Уровень техникиState of the art
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.To solve the epidemiological problems of deciphering outbreaks of infectious diseases, identifying and identifying the pathogen, as well as detecting specific bacterial and viral genes, it is necessary to develop and implement modern technologies of molecular epidemiology into the practice of surveillance and monitoring services. One such technology is the use of genetic editing elements of the CRISPR/CAS system. This technology is developing quite effectively in relation to the creation of drugs for the treatment of certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence of unforeseen mutations. With in-depth studies in the field of application of the CRISPR / CAS system, it was found that it can be used for subtle diagnostic procedures in identifying the pathogen / her infection in humans, as well as their genotyping.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов (Chen J.S., Ma Е., Harrington L.B., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018; 360(6387): 436-9. doi: 10.1126/science.aar6245).In 2018, it was shown that one of the enzymes of the CRISPR system, Cas12, after recognizing its target DNA target, begins to nonspecifically hydrolyze single-stranded DNA. This property of Cas12 can be used as an indicator of the presence of a specific target, such as the genome of a virus or bacteria. The researchers used this discovery to create a nucleic acid detection technology platform known as DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). The proposed platform combines the Cas12a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. For the first time, DETECTR technology was used to detect and genotype the human papillomavirus. DETECTR allowed differentiation of HPV16 and HPV18 in crude DNA extracts from cultured human cells and clinical specimens within 1 h. At the same time, DETECTR correctly (comparable to the results of PCR analysis) identified HPV16 in 25 and HPV18 in 23 out of 25 clinical samples (Chen JS, Ma E., Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity Science 2018 360(6387): 436-9 doi: 10.1126/science.aar6245).
He менее важным приложением системы CRISPR/Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге (Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Lee J.W., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017; 356(6336): 438-42. doi: 10.1126/science.aam9321).An equally important application of the CRISPR/Cas system is the identification of pathogens and the detection of specific bacterial genes using the SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) platform. The proposed platform combines the Cas13a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. The Cas13a complex binds and cleaves the pre-amplified target nucleic acid with high specificity. Using SHERLOCK, it was possible to correctly differentiate closely related Zika and Dengue virus strains (Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017; 356(6336): 438-42. doi: 10.1126/science.aam9321).
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках (Gootenberg J.S., Abudayyeh О.О., Kellner M.J., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018; 360(6387): 439-44. doi: 10.1126/science.aaq0179).SHERLOCK has been improved (SHERLOCKv2) and allowed to detect up to 4 targets in one analysis. Multiplexing was achieved by combining several Cas13 nucleases and a Cas12 nuclease with specific fluorescent reporter complexes that allowed signal detection at different wavelengths. Quantitative detection was achieved by optimizing the concentrations of oligonucleotides used in the pre-amplification step so that input signal and signal intensity are closely correlated over a wide range of sample concentrations. Increased sensitivity was achieved by adding Csm6 to increase the intensity of fluorescent reporter cleavage. It should be noted that SHERLOCKv2 is a portable analysis due to the fact that the detection of fluorescence readings in the proposed technology is replaced by visual detection on test strips (Gootenberg JS, Abudayyeh O.O., Kellner MJ, et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6 Science 2018 360(6387): 439-44 doi: 10.1126/science.aaq0179).
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ (Myhrvold С., Freije С.А., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Casl3. Science. 2018; 360(6387): 444-8. doi: 10.1126/science.aas8836).Based on SHERLOCK, the HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) technology was developed, which eliminates the need for extraction of nucleic acids and allows the detection of pathogens directly in patient biological samples (blood, serum or plasma sample, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials). At HUDSON, heat and chemical reduction inactivate nucleases present in high concentrations in patient biological samples, after which the viral particles are lysed, releasing nucleic acids into solution. HUDSON allows detection of Dengue virus within 2 hours with high sensitivity in samples of whole blood, serum and saliva of patients. In addition, HUDSON allows you to differentiate four Dengue virus serotypes and identify the 6 most common HIV reverse transcriptase mutations (Myhrvold C., Freije C.A., Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Casl3. Science. 2018; 360(6387): 444-8 doi: 10.1126/science.aas8836).
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/Cas.In this regard, the task of developing new effective methods for detecting nucleic acids of pathogens of infectious diseases based on genetic technologies, such as CRISPR/Cas, is extremely urgent.
В ходе изучения уровня техники были найдены научные статьи, описывающие разработку технологий для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro, основанных на применении белков систем направленного редактирования генома.During the study of the prior art, scientific articles were found describing the development of technologies for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA in vitro, based on the use of proteins of directed genome editing systems.
J.P. Broughton и соавторы описали технологию DETECTR для выявления РНК вируса SARS-CoV-2, где в качестве мишени для амплификации методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), служили гены N и Е SARS-CoV-2, а детекция проходила с помощью Cas12a в формате тест-полоски. Чувствительность описанного метода варьировала от 70 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [J.P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C.L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, et al., CRISPR Casl2-based detection of SARS-CoV-2, Nature Biotechnology 38 (2020) 870-874, https://doi.org/10.1038/s41587-020-0513-4].J.P. Broughton and co-authors described the DETECTR technology for detecting SARS-CoV-2 virus RNA, where the N and E genes of SARS-CoV-2 served as a target for amplification by the method of isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-LAMP), and the detection took place with Cas12a in test strip format. The sensitivity of the described method varied from 70 to 300 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [J.P. Broughton, X. Deng, G. Yu, C.L. Fasching, V. Servellita, J. Singh, et al., CRISPR Casl2-based detection of SARS-CoV-2, Nature Biotechnology 38 (2020) 870-874, https://doi.org/10.1038/s41587-020- 0513-4].
Cas12a также был использован для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в методе, названном AIOD-CRISPR. В качестве мишени был выбран ген N, амплификация фрагмента которого проводилась в ходе изотермической реакции, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA). Чувствительность AIOD-CRISPR составляла 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [X. Ding, К. Yin, Z. Li, R. Lalla, E. Ballesteros, M Sfeir, C. Liu, Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Casl2a assay. Nat. Commun. 2020 (18) (2020) https://doi.org/10.1038/s41467-020-18575-6].Cas12a has also been used to detect SARS-CoV-2 virus RNA in a method called AIOD-CRISPR. The N gene was chosen as a target, the amplification of a fragment of which was carried out in the course of an isothermal reaction combined with reverse transcription (RT-RPA). The sensitivity of AIOD-CRISPR was 10-100 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [X. Ding, K. Yin, Z. Li, R. Lalla, E. Ballesteros, M Sfeir, C. Liu, Ultrasensitive and visual detection of SARS-CoV-2 using all-in-one dual CRISPR-Casl2a assay. Nat. commun. 2020 (18) (2020) https://doi.org/10.1038/s41467-020-18575-6].
Кроме того, была разработана технология ENHANCE, позволяющая выявлять от 3 до 300 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию, в которой предварительная амплификация фрагмента гена N осуществлялась методом изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-LAMP), с последующей детекцией продуктов амплификации с помощью модифицированного Cas12a [L.T. Nguyen, В.М. Smith, Р.K. Jain, Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection, Nat. Commun. 11 (4906) (2020), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-l].In addition, the ENHANCE technology was developed, which makes it possible to detect from 3 to 300 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction, in which the preliminary amplification of the N gene fragment was carried out by the method of isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-LAMP), followed by detection amplification products with modified Cas12a [LT Nguyen, V.M. Smith, R.K. Jain, Enhancement of trans-cleavage activity of Cas12a with engineered crRNA enables amplified nucleic acid detection, Nat. commun. 11 (4906) (2020), https://doi.org/10.1038/s41467-020-18615-l].
L.U. Guo и соавторы в совей работе описали технологию CASdetec, которая позволяла выявлять 100-500 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию. В основе технологии лежала изотермическая амплификация с помощью рекомбиназы, совмещенная с обратной транскрипцией (RT-RAA). Мишенью для амплификации служил фрагмент гена RdRp SARS-CoV-2. Детекцию продуктов амплификации проводили с помощью Cas12b [L.u. Guo, X. Sun, X. Wang, С.Liang, H. Jiang, Q. Gao, et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discov 6 (1) (2020), https://doi.org/10.1038/s41421-020-0174-y].L.U. Guo and co-authors in their work described the CASdetec technology, which made it possible to detect 100-500 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction. The technology was based on isothermal amplification using recombinase coupled with reverse transcription (RT-RAA). The SARS-CoV-2 RdRp gene fragment served as the target for amplification. Amplification products were detected using Cas12b [L.u. Guo, X. Sun, X. Wang, C. Liang, H. Jiang, Q. Gao, et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discov 6 (1) (2020), https:// doi.org/10.1038/s41421-020-0174-y].
При использовании платформы SHERLOCK для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в качестве мишени были описаны гены S и Orflab. Предварительная амплификация проводилась с применением изотермической амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (RT-RPA), перед детекцией с помощью Cas13a проводили дополнительный этап in vitro транскрипции. Технология SHERLOCK позволяла выявить 10-100 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [F. Zhang, О.О. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, С.Sciences, L. Mathers, A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Bioarchive. (2020) 1 8].When using the SHERLOCK platform to detect the RNA of the SARS-CoV-2 virus, the S and Orflab genes were described as a target. Preamplification was performed using isothermal amplification combined with reverse transcription (RT-RPA), before detection with Cas13a, an additional step of in vitro transcription was performed. The SHERLOCK technology made it possible to detect 10-100 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [F. Zhang, O.O. Abudayyeh, J.S. Gootenberg, C. Sciences, L. Mathers, A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, Bioarchive. (2020) 1 8].
Кроме методов, перечисленных выше, для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 была предложена диагностическая платформа FELUDA. Выявление РНК вируса S ARS-CoV-2 (гены NSP8 и N) происходило после обратной транскрипции с помощью Cas9. Чувствительность метода оценивалась в 3,16-10 копий РНК вируса SARS-CoV-2 на реакцию [S.M. Mohd. Azhar, Rhythm Phutela, Asgar Hussain Ansari, Dipanjali Sinha, Namrata Sharma, Manoj Kumar, Meghali Aich, Saumya Sharma, Khushboo Singhal, Harsha Lad, Pradeep K. Patra, Govind Makharia, Giriraj Ratan Chandak, Debojyoti Chakraborty, Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, BioRxiv. (2020). doi:: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167].In addition to the methods listed above, the FELUDA diagnostic platform was proposed for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA. Detection of ARS-CoV-2 virus S RNA (NSP8 and N genes) occurred after reverse transcription with Cas9. The sensitivity of the method was estimated at 3.16-10 copies of SARS-CoV-2 virus RNA per reaction [S.M. Mohd. Azhar, Rhythm Phutela, Asgar Hussain Ansari, Dipanjali Sinha, Namrata Sharma, Manoj Kumar, Meghali Aich, Saumya Sharma, Khushboo Singhal, Harsha Lad, Pradeep K. Patra, Govind Makharia, Giriraj Ratan Chandak, Debojyoti Chakraborty, Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, BioRxiv. (2020). doi:: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167].
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости получения направляющих РНК для выявления единичных копий (менее 3 копий РНК на реакцию) РНК вируса SARS-CoV-2 in vitro с помощью Casl2 и разработке соответствующих способов выявления РНК вируса SARS-CoV-2.Based on this, a technical problem arises, which consists in the need to obtain guide RNAs to detect single copies (less than 3 copies of RNA per reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA in vitro using Casl2 and to develop appropriate methods for detecting SARS-CoV-2 virus RNA .
Раскрытие сущностиEssence disclosure
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR/Cas, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.The proposed technology is promising for a variety of applications, including DNA/RNA quantification, fast multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, such as detection of sample contamination with nucleic acids. CRISPR/Cas based technology is a feature rich, error tolerant DNA detection technology suitable for rapid diagnosis including infectious diseases, genotyping of infectious agents, and detection of antibiotic resistance genes in bacterial pathogens.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:The application of the proposed technology makes it possible to create a new generation of diagnostic systems that will have the following properties:
Изобретение относится к новым средствам направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции РНК вируса SARS-CoV-2 в биологических образцах.The invention relates to novel guide RNA tools that can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of SARS-CoV-2 virus RNA in biological samples.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Casl2, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2.The technical objective of the proposed invention is the development of new tools - guide RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems with Casl2 proteins, for example, LbCpf1 from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of SARS-CoV-2 virus RNA.
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до единичных (1,64) копий РНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления РНК вируса SARS-CoV-2 до 10 раз.When implementing the present invention, according to the set of essential features given in the claims, an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of SARS-CoV-2 virus RNA up to single (1.64) copies of RNA in one reaction. EFFECT: invention provides up to 10 times higher efficiency of SARS-CoV-2 virus RNA detection.
Технический результат достигается за счет:The technical result is achieved due to:
Направляющие РНК, согласно настоящему изобретению, соответствуют высоко консервативным фрагментам генома вируса SARS-CoV-2. Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:The guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the SARS-CoV-2 virus genome. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA-guided DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и одной РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae), пригодные для использования для выявления РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях (единичные копии).According to the proposed invention, ribonucleoprotein complexes (RPK) are obtained, consisting of at least one guide RNA and one RNA-directed DNA endonuclease of the CRISPR/Cas system (LbCpf1 from Lachnospiraceae), suitable for use to detect SARS-CoV-2 virus RNA in ultra-low concentrations (single copies).
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1-5, объединенную с белком системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.PRP preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1-5 combined with a CRISPR/Cas system protein (LbCpf1 from Lachnospiraceae) or freeze-dried PRP.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2, с инструкцией по применению.The resulting guide RNAs can be used as part of a SARS-CoV-2 virus RNA detection kit, with instructions for use.
Способ обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2:SARS-CoV-2 virus RNA detection method:
i) проведение предварительной амплификации материала образца от пациента, предположительно содержащего вирус SARS-CoV-2 с использованием одного или нескольких специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-9, с целью получения мишени предварительно амплифицированного фрагмента генома вируса SARS-CoV-2,i) performing pre-amplification of the sample material from a patient suspected of containing the SARS-CoV-2 virus using one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 6-9, in order to obtain a target of a pre-amplified fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus ,
ii) приготовление реакционной смеси для детекции, содержащей мишень, полученную на стадии (i); рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-5; флюоресцентный зонд и буфер для детекции,ii) preparing a detection reaction mixture containing the target obtained in step (i); a ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system formed from the RNA-guided DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae and at least one guide RNA with SEQ ID NOs: 1-5; fluorescent probe and detection buffer,
iii) проведение 30-60 циклов детекции в реакционной смеси, полученной на стадии (ii), в амплификаторе, с обнаружением таким образом РНК вируса SARS-CoV-2.iii) carrying out 30-60 detection cycles in the reaction mixture obtained in step (ii) in a cycler, thus detecting SARS-CoV-2 virus RNA.
Предварительно амплифицированные фрагменты генома вируса SARS-CoV-2, согласно предложенному способу, могут быть представлены фрагментами размером 260 п. о. генома вируса SARS-CoV-2.Pre-amplified fragments of the genome of the SARS-CoV-2 virus, according to the proposed method, can be represented by fragments of 260 bp in size. genome of the SARS-CoV-2 virus.
Предложенный способ обеспечивает выявление РНК вируса SARS-CoV-2 в ультранизких концентрациях, вплоть до единичных копий.The proposed method ensures the detection of SARS-CoV-2 virus RNA at ultra-low concentrations, down to single copies.
Специфический олигонуклеотид для использования в способе выбирается из группы SEQ ID NO: 6-9 и используется для предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса SARS-CoV-2, которые распознаются рибонуклеопротеиновыми комплексами.The specific oligonucleotide for use in the method is selected from the group SEQ ID NO: 6-9 and is used for pre-amplification of highly conserved fragments of the SARS-CoV-2 virus genome that are recognized by ribonucleoprotein complexes.
Набор для использования в способе обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 содержит рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas, сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК с SEQ ID NO: 1-5; флюоресцентный зонд, буфер для детекции и инструкцию по применению.The kit for use in the method for detecting RNA of the SARS-CoV-2 virus contains a ribonucleoprotein complex of the CRISPR/Cas system formed from the RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, and at least one guide RNA with SEQ ID NO: 1-5; fluorescent probe, detection buffer and instructions for use.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса SARS-CoV-2, в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 6-9.The kit may additionally include components for pre-amplification of highly conserved fragments of the SARS-CoV-2 virus genome, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NOs: 6-9.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/Cas (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.At the same time, at least one guide RNA in the kit can be complexed with a protein of the CRISPR/Cas system (LbCpf1 from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2, в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус SARS-CoV-2. Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, спинномозговой жидкости, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие РНК вируса SARS-CoV-2.The proposed technology makes it possible to determine single copies of SARS-CoV-2 virus RNA in biological samples of a patient selected from fluid and/or tissue suspected to contain the SARS-CoV-2 virus. The biological sample can be a sample of blood, blood serum or plasma, cerebrospinal fluid, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials from a patient that can be used to analyze for the presence of SARS-CoV-2 virus RNA .
Краткое описание чертежейBrief description of the drawings
Фиг. 1. Визуализация амплифицированного фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 (размером 260 п. о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:Fig. 1. Visualization of the amplified fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus (260 bp in size) after preliminary amplification by agarose gel electrophoresis, where the numbers 1-8 indicate:
1 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2000 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;1 - The product obtained during the amplification of 2000 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
2 - Продукт, полученный в ходе амплификации 200 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;2 - The product obtained during the amplification of 200 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
3 - Продукт, полученный в ходе амплификации 20 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;3 - The product obtained during the amplification of 20 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
4 - Продукт, полученный в ходе амплификации 2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;4 - The product obtained during the amplification of 2 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
5 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,2 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;5 - The product obtained during the amplification of 0.2 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
6 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,02 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;6 - The product obtained during the amplification of 0.02 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
7 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;7 - The product obtained during the amplification of 0.002 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
8 - Продукт, полученный в ходе амплификации 0,0002 фг модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;8 - The product obtained during the amplification of 0.0002 fg of the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
9 - Отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-SARS-CoV-2;9 - Negative control, not containing the pGEM-T-SARS-CoV-2 model matrix;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (
Фиг. 2. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 и белок LbCpf1.Fig. 2. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #26333 guide RNA and LbCpf1 protein.
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26413 и белок LbCpf1.Fig. 3. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2 crRNA #26413 guide RNA and LbCpf1 protein.
Фиг.4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26432 и белок LbCpf1.Fig.4. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2
Фиг. 5. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26451 и белок LbCpf1.Fig. 5. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2
Фиг. 6. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpf1.Fig. 6. Real-time fluorescence profile of a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with a ribonucleoportein complex containing SARS-CoV-2
Фиг. 7. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2, обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 №26413, crRNA SARS-CoV-2 №26432, crRNA SARS-CoV-2 №26451, crRNA SARS-CoV-2 №26460 соответственно.Fig. Figure 7. Fluorescence values at the end point (60 assay cycle, 60 minutes) for a pre-amplified SARS-CoV-2 target treated with ribonucleoportein complexes containing the LbCpf1 protein and guide RNA SARS-CoV-2 crRNA #26333, SARS-CoV-2 crRNA No. 26413, SARS-CoV-2 crRNA No. 26432, SARS-CoV-2 crRNA No. 26451, SARS-CoV-2 crRNA No. 26460, respectively.
Фиг. 8. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием 10 клинических образцов, где М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).Fig. Fig. 8. Visualization of amplification products obtained during the amplification of SARS-CoV-2 fragments using 10 clinical samples, where M is the molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 , 1200, 1500, 2000, 3000 bp (
Фиг. 9. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 №26413, crRNA SARS-CoV-2 №26432, crRNA SARS-CoV-2 №26451, crRNA SARS-CoV-2 №26460 соответственно.Fig. 9. Endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for a pre-amplified SARS-CoV-2 target (10 independent clinical specimens) treated with ribonucleoportein complexes containing the LbCpf1 protein and SARS-CoV-2 crRNA guide RNA #26333, SARS-CoV-2 crRNA #26413, SARS-CoV-2
Фиг. 10. Визуализация продуктов амплификации, полученных в ходе амплификации фрагментов SARS-CoV-2 с использованием десятикратных разведениий препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента, где М стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).Fig. Fig. 10. Visualization of the amplification products obtained during the amplification of SARS-CoV-2 fragments using tenfold dilutions of the RNA preparation isolated from the clinical sample of the patient, where M molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700 , 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 bp (
Фиг. 11. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированной мишени SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанной рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими белок LbCpf1 и направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 №26413, crRNA SARS-CoV-2 №26432, crRNA SARS-CoV-2 №26451, crRNA SARS-CoV-2 №26460 соответственно.Fig. 11. Fluorescence values at the endpoint (60 assay cycle, 60 minutes) for a pre-amplified SARS-CoV-2 target (ten-fold dilutions of an RNA preparation isolated from a clinical patient specimen) treated with ribonucleoportein complexes containing the LbCpf1 protein and SARS- crRNA guide RNAs. CoV-2 #26333, SARS-CoV-2 crRNA #26413, SARS-CoV-2
Примеры осуществления изобретенияEXAMPLES OF CARRYING OUT THE INVENTION
ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА SARS-COV-2 ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНКEXAMPLE 1: SELECTION OF TARGET SEQUENCES IN THE SARS-COV-2 VIRUS GENOME TO GENERATE GUIDE RNA
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса SARS-CoV-2 для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1. Перечень участков генома вируса SARS-CoV-2 с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpf1 из Lachnospiraceae).For the selection of target sequences in the genome of the SARS-CoV-2 virus, modern algorithms for in silico analysis of nucleotide sequences and programs that are in the public domain, including Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology) were used to create guide RNAs. /). A list of regions in the genome of the SARS-CoV-2 virus was compiled with a theoretically calculated probability of their cleavage in highly conserved regions (Table 1. List of regions of the SARS-CoV-2 virus genome with a theoretically calculated probability of their cleavage by LbCpf1 from Lachnospiraceae).
Направляющие РНК, специфически узнающие фрагменты в геноме вируса SARS-CoV-2, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.Guide RNAs specifically recognizing fragments in the genome of the SARS-CoV-2 virus are represented by unique sequences of SEQ ID NOs: 1-5.
ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИEXAMPLE 2: PREPARATION OF MATERIAL FOR SARS-COV-2 VIRUS RNA DETECTION BY THE PRE-AMPLIFICATION METHOD
Подготовку материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 проводят методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). В качестве модельной матрицы фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 биологического образца используют синтетическую РНК, полученную методом in vitro транскрипции. В качестве матрицы для синтеза модельной РНК используют плазмидную ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащую в своем составе фрагмент гена, кодирующего Е белок вируса SARS-CoV-2 (размером 260 п. о.).Preparation of material for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA is carried out by the method of preliminary amplification combined with reverse transcription (RT-PCR). Synthetic RNA obtained by in vitro transcription is used as a model template for a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus of a biological sample. As a template for the synthesis of model RNA, plasmid DNA pGEM-T-SARS-CoV-2 is used, which contains a fragment of the gene encoding the E protein of the SARS-CoV-2 virus (260 bp in size).
Синтез кДНК фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят методом обратной транскрипции с использованием специфического олигонуклеотида E-pr_Revl с SEQ ID NO: 7 (Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2) и обратной транскриптазы Superscript™ II (Thermo Fisher Scientific, США) при температуре 42°С.Synthesis of the cDNA fragment of the SARS-CoV-2 virus genome is carried out by reverse transcription using the specific oligonucleotide E-pr_Revl with SEQ ID NO: 7 (Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments) and Superscript™ reverse transcriptase II (Thermo Fisher Scientific, USA) at 42°С.
Предварительную амплификацию фрагмента генома вируса SARS-CoV-2 проводят с использованием специфических олигонуклеотидов Е-pr_Forl и Е-pr_Revl с SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 7 соответственно, приведенных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Продукты амплификации, кодирующие фрагмент генома вируса S ARS-CoV-2, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Размер амплифицированных фрагментов составляет 260 пар нуклеотидов. Температурный профиль амплификации:Pre-amplification of a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus is carried out using specific oligonucleotides E-pr_Forl and E-pr_Revl with SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 7, respectively, shown in Table 2. Specific oligonucleotides for pre-amplification of fragments of the SARS virus genome -CoV-2. Amplification products encoding a fragment of the ARS-CoV-2 virus S genome are obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides (GenTerra, Russia) listed in Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments. The size of the amplified fragments is 260 base pairs. Temperature profile of amplification:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1. denaturation: 95°C for 3 minutes;
2. 35 циклов амплификации:2. 35 amplification cycles:
95°С- 15 сек,95°C - 15 sec,
55°С-45 сек,55°C-45 sec,
72°С - 30 сек;72°C - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72°C for 5 minutes.
В ходе подготовки материала для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 методом предварительной амплификации, совмещенной с обратной транскрипцией, проводят титрование модельной РНК, синтезированной на матрице pGEM-T-SARS-CoV-2, путем приготовления серийных разведений (Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной РНК-матрицы, содержащей фрагмент генома вируса SARS-CoV-2).During the preparation of the material for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA by the method of pre-amplification combined with reverse transcription, the model RNA synthesized on the pGEM-T-SARS-CoV-2 matrix is titrated by preparing serial dilutions (Table 3. Serial dilutions model RNA template samples containing a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome).
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1).To assess the efficiency of pre-amplification, the resulting products corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 1).
Подготовленный описанным способом материал без предварительной очистки используют для экспериментов по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-5.The material prepared by the described method without preliminary purification is used for experiments on the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using LbCpf1 ribonucleoprotein complexes from Lachnospiraceae containing guide RNAs with unique sequences SEQ ID NO: 1-5.
ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ РНК ВИРУСА SARS-COV-2EXAMPLE 3: PRODUCTION OF GUIDE RNA AND CREATION OF RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES FOR SARS-COV-2 VIRUS RNA DETECTION
Для получения направляющих РНК для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2.To obtain guide RNAs for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA, a set of specific oligonucleotides has been developed, shown in Table 4. Specific oligonucleotides for obtaining a PCR product encoding guide RNAs specific for SARS-CoV-2 virus RNA.
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:Obtaining guide RNA is carried out in several stages:
1. получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к РНК вируса SARS-CoV-2), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым фрагментом генома вируса SARS-CoV-2, содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;1. obtaining a PCR product using a set of specific oligonucleotides (Table 4. Specific oligonucleotides for obtaining a PCR product encoding guide RNAs specific to SARS-CoV-2 virus RNA) encoding a guide RNA capable of binding to a target fragment of the SARS virus genome -CoV-2 containing a hairpin RNA that is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae;
2. очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2;2. purification of a PCR product encoding a guide RNA specific to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus;
3. синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2;3. synthesis of a guide RNA specific to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus;
4. очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2.4. Purification of a guide RNA specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome.
ПНР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 26333 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA S ARS-CoV-2 №26333, составляет 62 пары нуклеотидов.The NDP product encoding SARS-CoV-2 crRNA no. The size of the amplified fragment encoding crRNA S ARS-CoV-2 No. 26333 is 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26413, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 26413 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №26413, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA no. 26413 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and crRNA 26413 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 26413 is 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26432, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 26432 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA S ARS-CoV-2 №26432, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 26432 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and crRNA 26432 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding crRNA S ARS-CoV-2 No. 26432 is 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26451, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 26451 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA SARS-CoV-2 №26451, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA guide RNA no. 26451 was obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and crRNA 26451 (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding SARS-CoV-2 crRNA No. 26451 is 62 bp.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК crRNA SARS-CoV-2 №26460, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и crRNA 26460 (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего crRNA S ARS-CoV-2 №26460, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding SARS-CoV-2 crRNA no. The size of the amplified fragment encoding crRNA S ARS-CoV-2 No. 26460 is 62 bp.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, содержащие РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae:Amplification temperature profile for obtaining PCR products encoding guide RNAs containing an RNA hairpin that is recognized by the RNA-guided DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae:
1. денатурация: 95°С в течение 3 минут;1. denaturation: 95°C for 3 minutes;
2. 35 циклов амплификации:2. 35 amplification cycles:
95°С 15 сек,95°С 15 sec,
55°С-45 сек,55°C-45 sec,
72°С - 30 сек;72°C - 30 sec;
3. финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. final elongation: 72°C for 5 minutes.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле.PCR products encoding guide RNAs specific for a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome are visualized by agarose gel electrophoresis.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса вируса SARS-CoV-2, проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.Purification of PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome is carried out using a commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified PCR products encoding guide RNAs specific for a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome are used as a template for guide RNA synthesis.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ Т7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.Synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the SARS-CoV-2 virus genome is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions. The reaction products of in vitro transcription are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 mM and an equal volume of isopropyl alcohol. Such modifications of the manufacturer's protocol introduced by the authors allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
Создание готовых рибонуклеопротеиновых комплексов, содержащих белок семейства CRISPR/Cas LbCpfl из Lachnospiraceae, и соответствующую направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (ш vitro enzymology of Cas9 // Anders С, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).The creation of ready-made ribonucleoprotein complexes containing the CRISPR/Cas LbCpfl family protein from Lachnospiraceae and the corresponding guide RNA is carried out by the authors according to a standard protocol with some modifications (w vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1- 20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.Immediately before combining with the Cas protein, the guide RNA preparation (250 ng) is heated at 90°C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). Such heating is necessary for the formation of the correct hairpin conformation contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial Cas protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную соответствующую направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления фрагментов генома вируса SARS-CoV-2.To form the finished ribonucleoprotein complex, 250 ng of the LbCpf1 Cas protein from Lachnospiraceae and the prepared appropriate guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for detection of fragments of the SARS-CoV-2 virus genome.
ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫEXAMPLE 4: DETECTION OF SINGLE COPIES OF SARS-COV-2 VIRUS RNA USING CRISPR/CAS RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES ON THE EXAMPLE OF A MODEL MATRIX
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.The pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 is used as a template for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Для обнаружения РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, содержащих LbCpfl из Lachnospiraceae, готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:To detect SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes containing LbCpfl from Lachnospiraceae, prepare a reaction mixture containing the following components:
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задают следующие параметры реакции:The reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a
60 циклов:60 cycles:
37°С - 35 сек,37°С - 35 sec,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.37°C - 25 sec, fluorescence recording.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной РНК, синтезированной на основе плазмидной ДНК pGEM-T-SARS-CoV-2, содержащей в своем составе фрагмент геном вируса SARS-CoV-2 размером 260 п. о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2. Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных фрагментов, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 или crRNA SARS-CoV-2 №26413 или crRNA SARS-CoV-2 №26432 или crRNA SARS-CoV-2 №26451 или crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpfl, на Фиг. 2-6 соответственно. Отметим, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 10-ом цикле анализа (10 минут), и более чем в 50 раз в среднем на на 25-ом цикле анализа (25 минут).First of all, experiments were carried out to detect single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae, using model RNA synthesized on the basis of pGEM-T-SARS plasmid DNA as a target. -CoV-2, containing in its composition a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus with a size of 260 bp. CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes have been shown to be able to detect single copies of SARS-CoV-2 virus RNA. Typical assay results are shown using examples of real-time fluorescence profiles of pre-amplified fragments treated with ribonucleoportein complexes containing SARS-CoV-2 crRNA #26333 guide RNA or SARS-CoV-2 crRNA #26413 or SARS-CoV-2
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса SARS-CoV-2, содержащегося в составе модельной РНК матрицы, с использованием различных направляющих РНК (Фиг. 7). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса SARS-CoV-2 с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: crRNA SARS-CoV-2 №26413>crRNA SARS-CoV-2 №26333>crRNA SARS-CoV-2 №26432>crRNA SARS-CoV-2 №26451 ≈ crRNA SARS-CoV-2 №26460.In the course of the work, the efficiency of detecting single copies of the SARS-CoV-2 virus genome contained in the model RNA matrix was evaluated using various guide RNAs (Fig. 7). It has been shown that CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae and guide RNAs detect single copies of the SARS-CoV-2 virus genome with different efficiency, and they can be arranged in the following order of decreasing activity: SARS-CoV- crRNA 2 #26413>crRNA SARS-CoV-2 #26333>crRNA SARS-CoV-2 #26432>crRNA SARS-CoV-2 #26451 ≈ crRNA SARS-CoV-2 #26460.
ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ РНК ВИРУСА SARS-COV-2 С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВEXAMPLE 5: DETECTION OF SINGLE COPIES OF SARS-COV-2 VIRUS RNA USING CRISPR/CAS RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES IN A LIMITED PANEL OF CLINICAL SPECIMENS
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (10 шт. ), содержащих вирус SARS-CoV-2 (ранее подтверждено с помощью ПЦР в реальном времени).The developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (10 pcs.) containing the SARS-CoV-2 virus (previously confirmed by real-time PCR).
Для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и соответствующих направляющих РНК, была проведена предварительная амплификация фрагментов генома вируса SARS-CoV-2. Для проведения предварительной амплификации из клинических образцов 10 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя были выделены препараты РНК.To detect single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae and corresponding guide RNAs, preliminary amplification of SARS-CoV-2 virus genome fragments was carried out. For preliminary amplification, RNA preparations were isolated from clinical samples of 10 patients using a commercially available RIBO-prep kit (Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) according to the manufacturer's instructions.
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.Amplification products encoding fragments of the genome of the SARS-CoV-2 virus are obtained in the amplification reaction as described in Example 2, using the described temperature profile and duration of the amplification reaction.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 8).To assess the efficiency of pre-amplification, the resulting products corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus are visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 8).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.The material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Обнаружение единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.Detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes is carried out by the method described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью выявлять единичные копии (1,64 копии/реакция) вируса SARS-CoV-2 в препаратах РНК, выделенных из клинических образцов. Стоит отметить, что значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, crRNA SARS-CoV-2 №26413 и crRNA SARS-CoV-2 №26432, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 23-ем цикле анализа (23 минуты) и более чем в 50 раз в среднем на 40-ом цикле (40 минут). Значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (1,64 копий/реакция) РНК вируса SARS-CoV-2 с применением рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpfl из Lachnospiraceae и направляющих РНК crRNA SARS-CoV-2 №26451 и crRNA SARS-CoV-2 №26460, превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего последовательности-мишени) более чем в 5 раз в среднем на 37-ом цикле анализа (37 минут) и более чем в 50 раз в среднем на 48-ом цикле (48 минут). На Фиг. 9 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (10 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 или crRNA SARS-CoV-2 №26413 или crRNA SARS-CoV-2 №26432 или crRNA SARS-CoV-2 №26451 или crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpf1.The analysis showed that the CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae and the corresponding guide RNAs have the ability to detect single copies (1.64 copies/reaction) of the SARS-CoV-2 virus in RNA preparations isolated from clinical samples. It is worth noting that the value of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae and SARS-CoV- crRNA guide RNAs 2 No. 26333, SARS-CoV-2 crRNA No. 26413 and SARS-CoV-2 crRNA No. 26432, exceeded the “noise” value (non-specific fluorescence of the control sample that does not contain the target sequence) by more than 5 times on average at the 23rd analysis cycle (23 minutes) and more than 50 times on average at the 40th cycle (40 minutes). The value of the signal obtained during the detection of single copies (1.64 copies/reaction) of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpfl from Lachnospiraceae and SARS-CoV-2 crRNA guide RNA No. 26451 and crRNA SARS-CoV-2 No. 26460, exceeded the “noise” value (non-specific fluorescence of a control sample that did not contain a target sequence) by more than 5 times on average at the 37th analysis cycle (37 minutes) and by more than 50 times in average on the 48th cycle (48 minutes). On FIG. Figure 9 shows typical assay results using examples of endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of SARS-CoV-2 virus genome fragments (10 independent clinical specimens) treated with ribonucleoportein complexes containing SARS-CoV crRNA guide RNAs. -2 #26333 or SARS-CoV-2 crRNA #26413 or SARS-CoV-2
В заключение были проведены эксперименты по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 в последовательных разведениях препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента. Для этого были подготовлены серийные десятикратные разведения препарата РНК от 1:10 до 1:100 000 000 (Таблица 5. Серийные разведения РНК вируса SARS-CoV-2, выделенной из клинического образца).In conclusion, experiments were carried out to detect SARS-CoV-2 virus RNA in serial dilutions of an RNA preparation isolated from a patient's clinical sample. For this, serial tenfold dilutions of the RNA preparation were prepared from 1:10 to 1:100,000,000 (Table 5. Serial dilutions of SARS-CoV-2 virus RNA isolated from a clinical sample).
Продукты амплификации, кодирующие фрагменты генома вируса SARS-CoV-2, получают в реакции амплификации как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.Amplification products encoding fragments of the genome of the SARS-CoV-2 virus are obtained in the amplification reaction as described in Example 2, using the described temperature profile and duration of the amplification reaction.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные продукты, соответствующие фрагменту генома вируса SARS-CoV-2, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 10).To assess the efficiency of pre-amplification, the resulting products corresponding to a fragment of the genome of the SARS-CoV-2 virus, visualized using agarose gel electrophoresis (Fig. 10).
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.The material obtained in this way is used as a template for the detection of single copies of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Обнаружение РНК вируса SARS-CoV-2 с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.Detection of SARS-CoV-2 virus RNA using CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes is carried out by the method described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и соответствующих направляющих РНК, обладают способностью выявлять РНК вируса SARS-CoV-2 в препарате РНК, разведенном в 100 000 раз. При этом при использовании направляющей РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333, обладающей наибольшей эффективностью, значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в 49 раз. На Фиг. 11 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов генома вируса SARS-CoV-2 (десятикратные разведения препарата РНК, выделенного из клинического образца пациента), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК crRNA SARS-CoV-2 №26333 или crRNA SARS-CoV-2 №26413 или crRNA SARS-CoV-2 №26432 или crRNA SARS-CoV-2 №26451 или crRNA SARS-CoV-2 №26460 и белок LbCpfl.The analysis showed that CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae and corresponding guide RNAs are able to detect SARS-CoV-2 virus RNA in an RNA preparation diluted 100,000 times. At the same time, when using the guide RNA crRNA SARS-CoV-2 No. 26333, which has the highest efficiency, the signal value exceeded the “noise” value (nonspecific fluorescence of the control sample that did not contain the target) by 49 times. On FIG. Figure 11 shows typical assay results using examples of endpoint fluorescence values (60 assay cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of SARS-CoV-2 virus genome fragments (ten-fold dilutions of an RNA preparation isolated from a patient clinical specimen) treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA SARS-CoV-2 crRNA #26333 or SARS-CoV-2 crRNA #26413 or SARS-CoV-2
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas систем CRISPR-Cas12 ультрачувствительно выявлять единичные копии РНК вируса SARS-CoV-2 в реакции после предварительной амплификации в препаратах РНК (в том числе разведенных в 100 000), выделенных из клинических образцов, содержащих вирус SARS-CoV-2.Thus, the developed guide RNAs make it possible, as part of the CRISPR/Cas ribonucleoprotein complexes of the CRISPR-Cas12 systems, to detect ultrasensitively single copies of SARS-CoV-2 virus RNA in the reaction after preliminary amplification in RNA preparations (including those diluted in 100,000) isolated from clinical trials. samples containing the SARS-CoV-2 virus.
--->--->
Перечень последовательностейSequence listing
<110> ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора<110> Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor
<120> <120>
<160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 9 <160> NUMBER OF SEQ ID NO: NOS: 9
<210> SEQ ID NO: NO 1 <210> SEQ ID NO: NO 1
<211> 40 <211> 40
<212> RNA <212>RNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 1 (crRNA SARS-CoV-2 №26333): <400> SEQUENCE 1 (crRNA SARS-CoV-2 #26333):
aau uuc uac uaa gug uag aug ugg uau ucu ugc uag uua c 40 aau uuc uac uaa gug uag aug ugg uau ucu ugc uag uua
<210> SEQ ID NO: NO 2 <210> SEQ ID NO: NO 2
<211> 40 <211> 40
<212> RNA <212>RNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 2 (crRNA SARS-CoV-2 №26413): <400> SEQUENCE 2 (crRNA SARS-CoV-2 #26413):
aau uuc uac uaa gug uag auu aac acg aga gua aac gua a 40 aau uuc uac uaa gug uag auu aac acg aga gua aac gua a 40
<210> SEQ ID NO: NO 3 <210> SEQ ID NO: NO 3
<211> 40 <211> 40
<212> RNA <212>RNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 3 (crRNA SARS-CoV-2 №26432): <400> SEQUENCE 3 (crRNA SARS-CoV-2 #26432):
aau uuc uac uaa gug uag auu acg uuu acu cuc gug uua a 40 aau uuc uac uaa gug uag auu acg uuu acu cuc gug uua a 40
<210> SEQ ID NO: NO 4 <210> SEQ ID NO: NO 4
<211> 40 <211> 40
<212> RNA <212>RNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 4 (crRNA SARS-CoV-2 №26451): <400> SEQUENCE 4 (crRNA SARS-CoV-2 #26451):
aau uuc uac uaa gug uag aug acc aga aga uca gga acu c 40 aau uuc uac uaa gug uag aug acc aga aga uca gga acu
<210> SEQ ID NO: NO 5 <210> SEQ ID NO: NO 5
<211> 40 <211> 40
<212> RNA <212>RNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 5 (crRNA SARS-CoV-2 №26460): <400> SEQUENCE 5 (crRNA SARS-CoV-2 #26460):
aau uuc uac uaa gug uag aug uuc guu uag acc aga aga u 40 aau uuc uac uaa gug uag aug uuc guu uag acc
<210> SEQ ID NO: NO 6 <210> SEQ ID NO: NO 6
<211> 32 <211> 32
<212> DNA <212> DNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 6 (E-pr_For1): <400> SEQUENCE 6 (E-pr_For1):
gga aga gac agg tac gtt aat agt taa tag cg 32 gga aga gac agg tac gtt aat agt taa tag cg 32
<210> SEQ ID NO: NO 7 <210> SEQ ID NO: NO 7
<211> 37 <211> 37
<212> DNA <212> DNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 7 (E-pr_Rev1): <400> SEQUENCE 7 (E-pr_Rev1):
gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat ata a 37 gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat ata a 37
<210> SEQ ID NO: NO 8 <210> SEQ ID NO: NO 8
<211> 34 <211> 34
<212> DNA <212> DNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 8 (E-pr_For2): <400> SEQUENCE 8 (E-pr_For2):
cgt taa tag tta ata gcg tac ttc ttt ttc ttg c 34 cgt taa tag tta ata gcg tac ttc ttt ttc ttg c 34
<210> SEQ ID NO: NO 9 <210> SEQ ID NO: NO 9
<211> 34 <211> 34
<212> DNA <212> DNA
<213> artificial <213> artificial
<400> SEQUENCE 9 (E-pr_Rev2): <400> SEQUENCE 9 (E-pr_Rev2):
gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat a 34gct aaa att aaa gtt cca aac aga aaa act aat a 34
<---<---
Claims (9)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021128585A RU2764021C1 (en) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2021128585A RU2764021C1 (en) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2764021C1 true RU2764021C1 (en) | 2022-01-12 |
Family
ID=80040260
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2021128585A RU2764021C1 (en) | 2021-09-30 | 2021-09-30 | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2764021C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2779189C1 (en) * | 2022-01-25 | 2022-09-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации | REAGENT KIT FOR SARS-CoV-2 RNA DETECTION BY REAL-TIME LOOP ISOTHERMAL AMPLIFICATION (COVIGEN-LAMP) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (en) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | METHOD OF PRODUCING A RECOMBINANT NUCLEASE CAS ESSENTIALLY FREE OF BACTERIAL ENDOTOXINS, THE PREPARATION OBTAINED BY THIS METHOD AND CONTAINING A KIT FOR USE IN A CRISPR/Cas SYSTEM |
-
2021
- 2021-09-30 RU RU2021128585A patent/RU2764021C1/en active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2707542C1 (en) * | 2019-03-28 | 2019-11-27 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | METHOD OF PRODUCING A RECOMBINANT NUCLEASE CAS ESSENTIALLY FREE OF BACTERIAL ENDOTOXINS, THE PREPARATION OBTAINED BY THIS METHOD AND CONTAINING A KIT FOR USE IN A CRISPR/Cas SYSTEM |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| FENG ZHANG et al., A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, 2020, pp.1-8. * |
| FENG ZHANG et al., A protocol for detection of COVID-19 using CRISPR diagnostics, 2020, pp.1-8. HOSSEIN RAHIMI et al., CRISPR Systems for COVID-19 Diagnosis, ACS Sensors, January 27, 2021, Vol.6, N.4, pp.1430-1445. LU GUO et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discovery, 2020, Vol.6, N.34. MOHD. AZHAR et al., Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, 2020, doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167. * |
| HOSSEIN RAHIMI et al., CRISPR Systems for COVID-19 Diagnosis, ACS Sensors, January 27, 2021, Vol.6, N.4, pp.1430-1445. * |
| LU GUO et al., SARS-CoV-2 detection with CRISPR diagnostics, Cell Discovery, 2020, Vol.6, N.34. * |
| MOHD. AZHAR et al., Rapid, field-deployable nucleobase detection and identification using FnCas9, 2020, doi: https://doi.org/10.1101/2020.04.07.028167. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2779189C1 (en) * | 2022-01-25 | 2022-09-05 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "48 Центральный научно-исследовательский институт Министерства обороны Российской Федерации | REAGENT KIT FOR SARS-CoV-2 RNA DETECTION BY REAL-TIME LOOP ISOTHERMAL AMPLIFICATION (COVIGEN-LAMP) |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN111593145A (en) | CRISPR/Cas12 one-step nucleic acid detection method and novel coronavirus detection kit | |
| US11078507B2 (en) | Probability-directed isolation of nucleotide sequences (PINS) | |
| CN111500792A (en) | Novel coronavirus detection kit | |
| RU2764021C1 (en) | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD | |
| RU2764023C1 (en) | CRISPR-Cas 12 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764015C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE CRISPR/Cas 12 RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX AND PREPARATION FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764022C1 (en) | METHOD FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN THE METHOD | |
| RU2764020C1 (en) | CRISPR-CAS14 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2764024C1 (en) | METHOD FOR OBTAINING A PREPARATION OF THE RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEX CRISPR / Cas14 AND A PREPARATION FOR DETECTING THE RNA OF THE SARS-CoV-2 VIRUS IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| JP2016500276A5 (en) | ||
| RU2745637C1 (en) | Method for obtaining the crispr/cas ribonucleoprotein complex preparation and preparation for detection of the blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene in ultra-low concentrations | |
| RU2800421C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting hepatitis c virus rna genotypes 1b and 3a at ultra-low concentrations | |
| RU2800420C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2802079C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2802783C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations in ultra-low concentrations | |
| RU2799430C1 (en) | Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex crispr-cas and a preparation for detecting hepatitis c virus rna of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations | |
| RU2802781C1 (en) | Method of obtaining a preparation of the ribonucleoprotein complex crispr-cas12 and a preparation for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations | |
| RU2782951C1 (en) | Method for detecting the dna of the hepatitis b virus at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2747880C1 (en) | Method for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in method | |
| RU2747820C1 (en) | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations | |
| RU2747819C1 (en) | Method for obtaining preparation of ribonucleoprotein complex crispr / cas and preparation for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) in ultra-low concentrations | |
| RU2782700C1 (en) | Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations | |
| RU2791880C1 (en) | Method for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa at ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2791879C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa, at ultra-low concentrations | |
| RU2734520C1 (en) | Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |