RU2747820C1 - Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations - Google Patents
Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations Download PDFInfo
- Publication number
- RU2747820C1 RU2747820C1 RU2020139162A RU2020139162A RU2747820C1 RU 2747820 C1 RU2747820 C1 RU 2747820C1 RU 2020139162 A RU2020139162 A RU 2020139162A RU 2020139162 A RU2020139162 A RU 2020139162A RU 2747820 C1 RU2747820 C1 RU 2747820C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- jcpyv
- dna
- john cunningham
- cunningham virus
- crispr
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
Область техникиTechnology area
Изобретение относится к области генной инженерии и биотехнологии, а именно к числу средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 в составе рибонуклеопротеиновых комплексов для выявления (обнаружения, детекции) ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).The invention relates to the field of genetic engineering and biotechnology, namely to the number of means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems as part of ribonucleoprotein complexes for the detection (detection, detection) of John Cunningham virus DNA (JCPyV).
Изобретение позволяет in vitro выявлять единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).EFFECT: invention allows in vitro detection of single DNA copies of John Cunningham virus (JCPyV).
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) после проведения специфической амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV). Амплификация при этом может быть проведена различными способами, среди которых полимеразная цепная реакция (PCR); петлевая изотермическая амплификация (LAMP); геликаза-зависимая амплификация (HDA); рекомбиназа-опосредованная амплификация (RPA); амплификация со смещением цепи (SDA); амплификация, основанная на последовательности нуклеиновых кислот (NASBA); опосредованная транскрипцией амплификация (TMA); амплификация, опосредованная никирующим ферментом (NEAR); круговая амплификация (RCA) и многие другие виды амплификации.The guide RNAs described herein can be used to detect John Cunningham virus (JCPyV) DNA after specific amplification of John Cunningham virus (JCPyV) genome fragments. Amplification in this case can be carried out in various ways, including polymerase chain reaction (PCR); loop isothermal amplification (LAMP); helicase-dependent amplification (HDA); recombinase-mediated amplification (RPA); strand displacement amplification (SDA); nucleic acid sequence based amplification (NASBA); transcription-mediated amplification (TMA); dick enzyme-mediated amplification (NEAR); circular amplification (RCA) and many other types of amplification.
Направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, могут быть использованы для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.The guide RNAs described in this application can be used to develop highly sensitive and high-tech new generation diagnostic systems based on CRISPR technologies to improve methods for diagnosing infectious diseases.
Уровень техникиState of the art
Для решения эпидемиологических задач по расшифровке вспышек инфекционных болезней, выявления и идентификации возбудителя, а также детекции специфических бактериальных и вирусных генов необходимы разработка и внедрение в практику работы надзорных и мониторинговых служб современных технологий молекулярной эпидемиологии. Одной из таких технологий является использование элементов генетического редактирования системы CRISPR/CAS. Данная технология развивается достаточно эффективно в отношении создания средств лечения некоторых болезней, несмотря на ряд трудностей, связанных с возникновением непредвиденных мутаций. При углубленных исследованиях в области применения CRISPR/CAS системы, было выяснено, что она может быть использована для тонких диагностических процедур при выявлении возбудителя/ей инфекции у человека, а также их генотипирования.To solve epidemiological problems of decoding outbreaks of infectious diseases, identifying and identifying the pathogen, as well as detecting specific bacterial and viral genes, it is necessary to develop and introduce modern technologies of molecular epidemiology into the practice of supervisory and monitoring services. One of these technologies is the use of CRISPR / CAS genetic editing elements. This technology is developing quite effectively in relation to the creation of drugs for the treatment of certain diseases, despite a number of difficulties associated with the occurrence of unforeseen mutations. During in-depth studies in the field of application of the CRISPR / CAS system, it was found that it can be used for delicate diagnostic procedures in identifying the causative agent / her infection in humans, as well as their genotyping.
В 2018 г. было показано, что один из ферментов CRISPR системы - Cas12 после распознавания своей целевой ДНК-мишени начинает неспецифически гидролизовать одноцепочечную ДНК. Такое свойство Cas12 можно использовать в качестве индикатора присутствия определенной мишени, например, генома вируса или бактерии. Исследователи использовали это открытие для создания технологической платформы обнаружения нуклеиновых кислот, известной как DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter - ДНК-нацеленная эндонуклеаза CRISPR трансрепортер). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas12a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Впервые технология DETECTR была использована для выявления и генотипирования вируса папилломы человека. DETECTR в течение 1 ч позволила дифференцировать HPV16 и HPV18 в неочищенных экстрактах ДНК из культивируемых клеток человека и клинических образцов. При этом DETECTR корректно (сопоставимо с результатами ПЦР-анализа) идентифицировала HPV16 в 25 и HPV18 - в 23 из 25 клинических образцов (Chen J.S., Ma E., Harrington L.B., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 2018; 360(6387): 436-9. doi: 10.1126/science.aar6245).In 2018, it was shown that one of the enzymes of the CRISPR system, Cas12, after recognition of its target DNA target, begins to nonspecifically hydrolyze single-stranded DNA. This property of Cas12 can be used as an indicator of the presence of a specific target, for example, the genome of a virus or bacteria. The researchers used this discovery to create a technological platform for the detection of nucleic acids known as DETECTR (DNA Endonuclease Targeted CRISPR Trans Reporter). The proposed platform combines Cas12a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. For the first time, DETECTR technology was used for the detection and genotyping of the human papillomavirus. DETECTR for 1 h allowed the differentiation of HPV16 and HPV18 in crude DNA extracts from cultured human cells and clinical samples. At the same time, DETECTR correctly (comparable to the results of PCR analysis) identified HPV16 in 25 and HPV18 in 23 of 25 clinical samples (Chen JS, Ma E., Harrington LB, et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity Science 2018; 360 (6387): 436-9 doi: 10.1126 / science.aar6245).
Не менее важным приложением системы CRISPR/Cas является идентификация патогенов и детекция специфических бактериальных генов с помощью платформы SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking - ферментативная специфическая высокочувствительная разблокировка репортера). Предложенная платформа объединяет нуклеазу Cas13a, ее направляющую РНК, специфичную к нуклеиновой кислоте, и флуоресцентную репортерную молекулу. Комплекс Cas13a связывает и расщепляет предварительно амплифицированную нуклеиновую кислоту-мишень с высокой специфичностью. С помощью SHERLOCK удалось корректно дифференцировать близкородственные штаммы вируса Зика и Денге (Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Lee J.W., et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science. 2017; 356(6336): 438-42. doi: 10.1126/science.aam9321).An equally important application of the CRISPR / Cas system is the identification of pathogens and the detection of specific bacterial genes using the SHERLOCK platform (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking). The proposed platform combines Cas13a nuclease, its nucleic acid-specific guide RNA, and a fluorescent reporter molecule. The Cas13a complex binds and cleaves the pre-amplified target nucleic acid with high specificity. Using SHERLOCK, it was possible to correctly differentiate closely related strains of Zika and Dengue viruses (Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Lee JW, et al. Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a / C2c2. Science . 2017; 356 (6336): 438-42. Doi: 10.1126 / science.aam9321).
SHERLOCK была усовершенствована (SHERLOCKv2) и позволила выявлять в одном анализе до 4 мишеней. Мультиплексирование было достигнуто путем объединения нескольких нуклеаз Cas13 и нуклеазы Cas12 со специфичными флуоресцентными репортерными комплексами, которые обеспечивали детекцию сигнала на разных длинах волн. Количественное обнаружение было достигнуто путем оптимизации концентраций олигонуклеотидов, используемых на этапе предварительной амплификации, чтобы входной сигнал и интенсивность сигнала тесно коррелировали в широком диапазоне концентраций образца. Повышенная чувствительность была достигнута путем добавления Csm6 для увеличения интенсивности расщепления флуоресцентного репортера. Стоит отметить, что SHERLOCKv2 является портативным анализом за счет того, что обнаружение показаний флуоресценции в предложенной технологии заменено на визуальную детекцию на тест-полосках (Gootenberg J.S., Abudayyeh O.O., Kellner M.J., et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6. Science. 2018; 360(6387): 439-44. doi: 10.1126/science.aaq0179).SHERLOCK has been enhanced (SHERLOCKv2) to allow up to 4 targets to be detected in a single assay. Multiplexing was achieved by combining several Cas13 nucleases and Cas12 nucleases with specific fluorescent reporter complexes that provide signal detection at different wavelengths. Quantitative detection was achieved by optimizing the concentrations of oligonucleotides used in the pre-amplification step so that the input signal and signal intensity were closely correlated over a wide range of sample concentrations. Increased sensitivity was achieved by adding Csm6 to increase the cleavage rate of the fluorescent reporter. It should be noted that SHERLOCKv2 is a portable analysis due to the fact that the detection of fluorescence readings in the proposed technology is replaced by visual detection on test strips (Gootenberg JS, Abudayyeh OO, Kellner MJ, et al. Multiplexed and portable nucleic acid detection platform with Cas13, Cas12a, and Csm6 Science 2018; 360 (6387): 439-44.doi: 10.1126 / science.aaq0179).
На основе SHERLOCK была разработана технология HUDSON (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases - нагревание неэкстрагированных диагностических образцов для уничтожения нуклеаз), которая устраняет необходимость в экстракции нуклеиновых кислот и позволяет обнаруживать патогены непосредственно в биологических образцах пациента (образец крови, сыворотки или плазмы крови, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов). В HUDSON нагревание и химическое восстановление инактивируют нуклеазы, присутствующие в высоких концентрациях в биологических образцах пациента, после чего вирусные частицы лизируются, высвобождая нуклеиновые кислоты в раствор. HUDSON позволяет в течение 2 ч с высокой чувствительностью обнаружить вирус Денге в образцах цельной крови, сыворотки и слюны пациентов. Кроме того, HUDSON позволяет дифференцировать четыре серотипами вируса Денге и выявлять 6 наиболее распространенных мутаций обратной транскриптазы ВИЧ (Myhrvold C., Freije C.A., Gootenberg J.S., et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science. 2018; 360(6387): 444-8. doi: 10.1126/science.aas8836).Based on SHERLOCK, the HUDSON technology (heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases) was developed, which eliminates the need for nucleic acid extraction and allows pathogens to be detected directly in the patient's biological samples (blood sample, serum or blood plasma, cells of blood, saliva, sputum, lymphoid tissues, tissues of hematopoietic organs and other biological materials). In HUDSON, heating and chemical reduction inactivate nucleases, which are present in high concentrations in biological samples from a patient, after which the viral particles are lysed, releasing the nucleic acids into solution. HUDSON allows for high sensitivity detection of Dengue virus in whole blood, serum and saliva samples of patients within 2 hours. In addition, HUDSON allows the differentiation of four serotypes of the Dengue virus and the detection of the 6 most common HIV reverse transcriptase mutations (Myhrvold C., Freije CA, Gootenberg JS, et al. Field-deployable viral diagnostics using CRISPR-Cas13. Science . 2018; 360 (6387 ): 444-8.doi: 10.1126 / science.aas8836).
В связи с этим крайне актуальной является задача разработки новых эффективных методик выявления нуклеиновых кислот возбудителей инфекционных заболеваний, основанных на генетических технологиях, таких как CRISPR/Cas.In this regard, it is extremely urgent to develop new effective methods for detecting nucleic acids of infectious diseases pathogens based on genetic technologies such as CRISPR / Cas.
В ходе изучения уровня техники были найдены патенты на изобретения и научные статьи, описывающие разработку и получение терапевтических направляющих РНК для удаления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) из клетки-хозяина, инфицированной JCPyV, и устранения риска реактивации JCPyV с помощью технологии CRISPR/Cas (WO 2016070070 опубл. 06.05.2016, WO2018106268 опубл. 14.06.2018, WO2017100431 опубл 15.06.2017, WO2018140269 опубл 02.08.2018, WO2017210380 опубл. 07.12.2017, WO2020068643 опубл. 02.04.2020, Wollebo HS, Bellizzi A, Kaminski R, Hu W, White MK, Khalili K. CRISPR/Cas9 System as an Agent for Eliminating Polyomavirus JC Infection. PLoS One. 2015 Sep 11;10(9): e0136046. doi: 10.1371/journal.pone.0136046). Из перечисленных выше материалов ни один нельзя отнести к ближайшим аналогам настоящего изобретения в виду того, что направляющие РНК, описанные в настоящей заявке, предназначены для разработки высокочувствительных и высокотехнологичных диагностических (но не терапевтических) систем нового поколения на основе CRISPR технологий для совершенствования методов диагностики инфекционных заболеваний.In the course of studying the prior art, patents for inventions and scientific articles were found describing the development and production of therapeutic guide RNAs for removing John Cunningham virus (JCPyV) DNA from a host cell infected with JCPyV and eliminating the risk of JCPyV reactivation using CRISPR / Cas ( WO 2016070070 publ. 06/05/2016, WO2018106268 publ. 06/14/2018, WO2017100431 publ. 06/15/2017, WO2018140269 publ. 08/02/2018, WO2017210380 publ. 12/07/2017, WO2020068643 Bell Kamiinsk, 04/02/2020, Wollebo Hu W, White MK, Khalili K. CRISPR / Cas9 System as an Agent for Eliminating Polyomavirus JC Infection. PLoS One. 2015 Sep 11; 10 (9): e0136046.doi: 10.1371 / journal.pone.0136046). None of the materials listed above can be attributed to the closest analogs of the present invention in view of the fact that the guide RNAs described in this application are intended for the development of highly sensitive and high-tech diagnostic (but not therapeutic) new-generation diagnostic (but not therapeutic) systems based on CRISPR technologies to improve methods for diagnosing infectious diseases.
Исходя из этого, возникает техническая проблема, заключающаяся в необходимости разработки и получения направляющих РНК для выявления единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) in vitro.Based on this, a technical problem arises in the need to develop and obtain guide RNAs for the detection of single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA in vitro.
Раскрытие сущностиDisclosure of the essence
Предложенная технология перспективна для разнообразных применений, включая количественное определение ДНК/РНК, быструю мультиплексную детекцию экспрессии, другие виды чувствительной детекции, например, выявление загрязнения образцов нуклеиновыми кислотами. Технология, основанная на CRISPR/Cas, является многофункциональной, устойчивой к ошибкам технологией детекции ДНК, пригодной для быстрой постановки диагнозов, включая инфекционные заболевания, генотипирование инфекционных агентов и выявление генов антибиотикоустойчивости бактериальных патогенов.The proposed technology is promising for a variety of applications, including quantitative determination of DNA / RNA, rapid multiplex expression detection, and other types of sensitive detection, for example, detection of contamination of samples with nucleic acids. The CRISPR / Cas-based technology is a multifunctional, error-resistant DNA detection technology suitable for rapid diagnosis, including infectious diseases, genotyping of infectious agents, and detection of antibiotic resistance genes for bacterial pathogens.
Применение предложенной технологии делает возможным создание диагностических систем нового поколения, которые будут обладать следующими свойствами:The application of the proposed technology makes it possible to create a new generation of diagnostic systems that will have the following properties:
• высокая чувствительность;• high sensitivity;
• возможность проведения диагностики у постели больного;• the possibility of diagnostics at the patient's bedside;
• возможность проведения диагностики в полевых условиях без применения специализированного высокотехнологичного оборудования;• the ability to carry out diagnostics in the field without the use of specialized high-tech equipment;
• скорость и простота анализа;• speed and ease of analysis;
• сниженная стоимость анализа;• reduced cost of analysis;
• отсутствие необходимости оснащения диагностической лаборатории дорогостоящим оборудованием;• no need to equip the diagnostic laboratory with expensive equipment;
• отсутствие необходимости проведения выделения нуклеиновых кислот возбудителя.• no need for isolation of nucleic acids of the pathogen.
Изобретение относится к новым средствам - направляющим РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультрачувствительного выявления, идентификации, обнаружения или детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в биологических образцах.The invention relates to new means - guide RNAs, which can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultrasensitive detection, identification, detection or detection of John Cunningham virus (JCPyV) DNA in biological samples.
Технической задачей предложенного изобретения является разработка новых средств - направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 с белками Cas12, например, LbCpf1 из Lachnospiraceae, для ультрачувствительного выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).The technical objective of the proposed invention is the development of new means - guide RNAs that can be used in CRISPR-Cas12 systems with Cas12 proteins, for example, LbCpf1 from Lachnospiraceae, for ultrasensitive detection of John Cunningham virus DNA (JCPyV).
При осуществлении настоящего изобретения, согласно приведенной в формуле изобретения совокупности существенных признаков, достигается неожиданный технический результат - возможность ультрачувствительного выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) до единичных копий ДНК в одной реакции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с 500 до 100 копий/мл.When implementing the present invention, according to the set of essential features set forth in the claims, an unexpected technical result is achieved - the possibility of ultrasensitive detection of John Cunningham virus (JCPyV) DNA to single DNA copies in one reaction. EFFECT: increased efficiency of DNA detection of John Cunningham virus (JCPyV) from 500 to 100 copies / ml.
Технический результат достигается за счет:The technical result is achieved due to:
• разработки молекул направляющих РНК, которые могут быть использованы в системах CRISPR-Cas12 для ультра чувствительного выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), где указанные направляющие РНК выбраны из последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, способны связываться с целевыми высоко консервативными участками ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), содержат РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, с обеспечением выявления единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).• development of guide RNA molecules that can be used in CRISPR-Cas12 systems for ultrasensitive detection of John Cunningham virus (JCPyV) DNA, where said guide RNAs are selected from the sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, are able to bind to the target The highly conserved DNA regions of the John Cunningham virus (JCPyV) contain an RNA hairpin that is recognized by the RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, allowing for the detection of single copies of the John Cunningham virus (JCPyV) DNA.
• применения РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, полученной согласно способу по патенту № 2707542 (дата приоритета 28.03.2019), разработанному авторами заявляемого решения ранее, для создания рибонуклеопротеиновых комплексов (РПК) системы CRISPR/Cas, пригодных для детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультра низких концентрациях (единичные копии).• the use of RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, obtained according to the method according to patent No. 2707542 (priority date 03/28/2019), developed by the authors of the proposed solution earlier, to create ribonucleoprotein complexes (RPK) of the CRISPR / Cas system, suitable for the detection of virus DNA John Cunningham (JCPyV) at ultra low concentrations (single copies).
• разработки набора специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6, для предварительной амплификации фрагментов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).• development of a set of specific oligonucleotides, selected from SEQ ID NO: 3-6, for the preliminary amplification of DNA fragments of the John Cunningham virus (JCPyV).
• оптимизации условий проведения предварительной амплификации фрагментов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).• optimization of conditions for preliminary amplification of DNA fragments of the John Cunningham virus (JCPyV).
• определения условий проведения ультрачувствительной детекции ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) и установления последовательности стадий метода.• determining the conditions for ultrasensitive detection of DNA of the John Cunningham virus (JCPyV) and establishing the sequence of the steps of the method.
Предложена молекула направляющей РНК системы CRISPR/Cas, которая способна связываться с целевыми высококонсервативными участками генома вируса Джона Каннингема (JCPyV). Нуклеотидная последовательность раскрытой в настоящей заявке направляющей РНК выбрана из последовательностей SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.A targeting RNA molecule of the CRISPR / Cas system has been proposed, which is capable of binding to target highly conserved regions of the John Cunningham virus (JCPyV) genome. The nucleotide sequence of the guide RNA disclosed herein is selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
Молекула направляющей РНК содержит в своем составе РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae.The guide RNA molecule contains an RNA hairpin, which is recognized by the RNA guided DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae.
Молекула направляющей РНК обеспечивает выявление единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).The guide RNA molecule enables the detection of single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA.
Направляющие РНК согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным фрагментам генома ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV). Наиболее предпочтительны направляющие РНК, распознающиеся РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:The guide RNAs of the present invention correspond to highly conserved fragments of the John Cunningham Virus (JCPyV) DNA genome. Most preferred are guide RNAs recognized by the RNA directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
• SEQ ID NO: 1;• SEQ ID NO: 1;
• SEQ ID NO: 2;• SEQ ID NO: 2;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, • or identical to any of them at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%,
• или комплементарной любой из них,• or complementary to any of them,
• или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.• or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Согласно предложенному изобретению получают рибонуклеопротеиновые комплексы (РПК), состоящие из по меньшей мере одной направляющей РНК и РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы системы CRISPR/Cas LbCpf1 из Lachnospiraceae, пригодные для использования для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в ультранизких концентрациях (единичные копии).According to the proposed invention, ribonucleoprotein complexes (RPK) are obtained, consisting of at least one guide RNA and an RNA-guided DNA endonuclease of the CRISPR / Cas LbCpf1 system from Lachnospiraceae, suitable for use for detecting DNA of the John Cunningham virus (JCPyV) in ultra-low concentrations (single copies).
Рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas для выявления ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), сформированный из РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазы LbCpf1 из Lachnospiraceae, и по меньшей мере одной направляющей РНК.Ribonucleoprotein complex of the CRISPR / Cas system for detecting DNA of the John Cunningham virus (JCPyV), formed from RNA-directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae, and at least one guide RNA.
Предложенный рибонуклеопротеиновый комплекс системы CRISPR/Cas пригоден для выявления единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).The proposed ribonucleoprotein complex of the CRISPR / Cas system is suitable for detecting single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA.
Препараты РПК представляют собой растворы, содержащие направляющую РНК, выбранную из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2, объединенную с белком системы CRISPR/CAS (LbCpf1 из Lachnospiraceae) или лиофильно высушенные РПК.PKK preparations are solutions containing a guide RNA selected from SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 combined with a CRISPR / CAS protein (LbCpf1 from Lachnospiraceae) or freeze-dried PKK.
Полученные направляющие РНК могут быть использованы в составе набора для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), с инструкцией по применению. The resulting guide RNAs can be used as part of the John Cunningham Virus (JCPyV) DNA Detection Kit, with instructions for use.
Набор для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), может содержать рибонуклеопротеиновый комплекс и инструкцию по применению.John Cunningham Virus DNA Detection Kit (JCPyV), may contain a ribonucleoprotein complex and instructions for use.
При этом по меньшей мере одна направляющая РНК в составе набора может находиться в комплексе с белком системы CRISPR/CAS (LbCpf1 из Lachnospiraceae) в одном контейнере или отдельно в разных контейнерах.In this case, at least one guide RNA in the kit can be complexed with a CRISPR / CAS protein (LbCpf1 from Lachnospiraceae) in one container or separately in different containers.
Набор может дополнительно включать компоненты для проведения предварительной амплификации высококонсервативных фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), в том числе один или несколько специфических олигонуклеотидов, выбранных из SEQ ID NO: 3-6.The kit may additionally include components for performing preliminary amplification of highly conserved fragments of the John Cunningham virus (JCPyV) genome, including one or more specific oligonucleotides selected from SEQ ID NO: 3-6.
Специфические олигонуклеотиды для проведения предварительной амплификации фрагмента ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) согласно настоящему изобретению соответствуют высоко консервативным участкам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV). Наиболее предпочтительны олигонуклеотиды, характеризующиеся, имеющие или содержащие нуклеотидную последовательность, выбранную из:Specific oligonucleotides for preliminary amplification of a John Cunningham virus (JCPyV) DNA fragment according to the present invention correspond to highly conserved regions of the John Cunningham virus (JCPyV) genome. Most preferred are oligonucleotides characterized by having or containing a nucleotide sequence selected from:
• SEQ ID NO: 3;• SEQ ID NO: 3;
• SEQ ID NO: 4;• SEQ ID NO: 4;
• SEQ ID NO: 5;• SEQ ID NO: 5;
• SEQ ID NO: 6;• SEQ ID NO: 6;
• или идентичной любой из них по меньшей мере на 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, • or identical to any of them at least 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93 %, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% or 99%,
• или комплементарной любой из них,• or complementary to any of them,
или гибридизующейся с любой из них в строгих условиях.or hybridizing with any of them under stringent conditions.
Предложенная технология позволяет определить единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), в биологических образцах пациента, выбранных из жидкости и/или ткани, предположительно содержащих вирус Джона Каннингема (JCPyV). Биологическим образцом может быть образец крови, сыворотки или плазмы крови, спинномозговой жидкости, клеток крови, слюны, мокроты, лимфоидных тканей, тканей кроветворных органов и других биологических материалов от пациента, которые могут быть использованы для анализа на наличие ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).The proposed technology makes it possible to determine single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA in biological samples of a patient selected from fluid and / or tissue, presumably containing the John Cunningham virus (JCPyV). A biological sample can be a sample of blood, serum or blood plasma, cerebrospinal fluid, blood cells, saliva, sputum, lymphoid tissues, hematopoietic tissues, and other biological materials from a patient that can be used to test for the presence of John Cunningham Virus (JCPyV) DNA ...
Краткое описание чертежейBrief Description of Drawings
Фиг. 1. Визуализация фрагмента ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 (размером 195 п.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:FIG. 1. Visualization of a DNA fragment of the John Cunningham virus (JCPyV) # 518 (195 bp) after preliminary amplification using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:
1 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;1 - PCR product JCPyV No. 518, obtained during the amplification of 28 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
2 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 2,8 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;2 - PCR product JCPyV No. 518, obtained during the amplification of 2.8 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
3 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;3 - PCR product JCPyV No. 518, obtained during the amplification of 0.28 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
4 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;4 - PCR product JCPyV No. 518, obtained during the amplification of 0.028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
5 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,0028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;5 - PCR product JCPyV No. 518, obtained during the amplification of 0.0028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
6 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,00028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;6 - PCR product JCPyV No. 518, obtained during the amplification of 0.00028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
7 - ПЦР-продукт JCPyV №518, полученный в ходе амплификации 0,000028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;7 - PCR product JCPyV No. 518, obtained during the amplification of 0.000028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;8 - negative control containing no pGEM-T-JCPyV model matrix;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (
Фиг. 2. Визуализация фрагмента ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №4390 (размером 196 п.о.) после предварительной амплификации при помощи электрофореза в агарозном геле, где цифрами 1-8 обозначены:FIG. 2. Visualization of a DNA fragment of the John Cunningham virus (JCPyV) # 4390 (196 bp) after preliminary amplification using agarose gel electrophoresis, where numbers 1-8 indicate:
1 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;1 - PCR product JCPyV No. 4390, obtained during the amplification of 28 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
2 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 2,8 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;2 - PCR product JCPyV No. 4390 obtained during the amplification of 2.8 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
3 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,28 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;3 - PCR product JCPyV No. 4390 obtained during the amplification of 0.28 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
4 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;4 - PCR product JCPyV No. 4390 obtained during the amplification of 0.028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
5 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,0028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;5 - PCR product JCPyV No. 4390 obtained during the amplification of 0.0028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
6 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,00028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;6 - PCR product JCPyV No. 4390 obtained during the amplification of 0.00028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
7 - ПЦР-продукт JCPyV №4390, полученный в ходе амплификации 0,000028 пг модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;7 - PCR product JCPyV No. 4390 obtained during the amplification of 0.000028 pg of the pGEM-T-JCPyV model template;
8 - отрицательный контроль, не содержащий модельной матрицы pGEM-T-JCPyV;8 - negative control containing no pGEM-T-JCPyV model matrix;
М - стандарты молекулярных масс: снизу вверх 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 пар нуклеотидов (GeneRuler 100 bp Plus, Thermo Fisher Scientific, США).M - molecular weight standards: from bottom to top 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1500, 2000, 3000 base pairs (
Фиг. 3. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA JCPyV №518 и белок LbCpf1.FIG. 3. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified John Cunningham Virus (JCPyV) # 518 DNA target treated with a ribonucleoportein complex containing JCPyV # 518 sgRNA guide RNA and LbCpf1 protein.
Фиг. 4. Профиль флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированной мишени ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №4390, обработанной рибонуклеопортеиновым комплексом, содержащим направляющую РНК sgRNA JCPyV №4390 и белок LbCpf1.FIG. 4. Real-time fluorescence profile for a pre-amplified John Cunningham virus (JCPyV) # 4390 DNA target treated with a ribonucleoportein complex containing sgRNA guide RNA JCPyV # 4390 and LbCpf1 protein.
Фиг. 5. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 соответственно.FIG. 5. Endpoint fluorescence values (60 assay cycles, 60 minutes) for pre-amplified John Cunningham virus (JCPyV) DNA targets # 518 and # 4390 treated with ribonucleoportein complexes containing sgRNA JCPyV # 518 and sgRNA JCPyV # 4390 guide RNAs, respectively.
Фиг. 6. Значения флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных с клинических образцов мишеней ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 соответственно.FIG. 6. Endpoint fluorescence values (60 analysis cycle, 60 minutes) for pre-amplified from clinical samples of John Cunningham virus (JCPyV) DNA targets No. 518 and No. 4390, treated with ribonucleoportein complexes containing guide RNA sgRNA JCPyV No. 518 and sgRNA JCPyV No. 4390 respectively.
Примеры осуществления изобретенияExamples of implementation of the invention
ПРИМЕР 1: ПОДБОР ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ-МИШЕНЕЙ В ГЕНОМЕ ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) ДЛЯ СОЗДАНИЯ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНКEXAMPLE 1: SELECTION OF TARGET SEQUENCES IN THE GENOME OF THE JOHN CANNINGHAM VIRUS (JCPyV) TO CREATE GUIDE RNA
Для подбора последовательностей-мишеней в геноме вируса Джона Каннингема (JCPyV) для создания направляющих РНК были использованы современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology/). Был составлен перечень участков в геноме вируса Джона Каннингема (JCPyV) с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления в высоко консервативных участках (Таблица 1. Перечень участков генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpf1 из Lachnospiraceae). To select target sequences in the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) to create guide RNAs, modern algorithms for in silico analysis of nucleotide sequences and openly available programs were used, including Benchling (https://www.benchling.com/molecular-biology /). A list of regions in the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) was compiled with a theoretically calculated probability of their cleavage in highly conserved regions (Table 1. List of regions of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) with a theoretically calculated probability of their cleavage by LbCpf1 from Lachnospiraceae).
Таблица 1. Перечень участков генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) с теоретически рассчитанной вероятностью их расщепления LbCpf1 из Lachnospiraceae.Table 1. List of John Cunningham virus (JCPyV) genome regions with the theoretically calculated probability of their cleavage by LbCpf1 from Lachnospiraceae.
(кодирующая цепь)AGGTTCATGGGTGCCGCACT
(coding chain)
Направляющие РНК, специфически узнающие фрагменты в геноме вируса Джона Каннингема (JCPyV), представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2.Guide RNAs that specifically recognize fragments in the genome of John Cunningham virus (JCPyV) are represented by the unique sequences SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2.
ПРИМЕР 2: ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) МЕТОДОМ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ АМПЛИФИКАЦИИEXAMPLE 2: PREPARATION OF MATERIAL FOR DETECTING THE DNA OF THE JOHN CANNINGHAM VIRUS (JCPyV) BY THE PRELIMINARY AMPLIFICATION METHOD
Подготовку материала для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) проводят методом предварительной амплификации. В качестве модельной матрицы генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) биологического образца используют плазмидную ДНК pGEM-T-JCPyV, содержащую в своем составе полный геном вируса Джона Каннингема (JCPyV) (размером 5139 п.о.).The preparation of material for the detection of DNA of the John Cunningham virus (JCPyV) is carried out by the method of preliminary amplification. Plasmid DNA pGEM-T-JCPyV containing the complete genome of John Cunningham virus (JCPyV) (size 5139 bp) is used as a model matrix of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) of the biological sample.
Предварительную амплификацию участков, соответствующих фрагментам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, проводят с использованием специфических олигонуклеотидов с SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, приведенных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), соответственно. ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов (ГенТерра, Россия), перечисленных в Таблице 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV). Размер амплифицированных фрагментов №518 и №4390 составляет 195 пар нуклеотидов и 196 пар нуклеотидов соответственно.Pre-amplification of the regions corresponding to fragments of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) No. 518 and No. 4390 is carried out using specific oligonucleotides with SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 given in Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of fragments of the genome of John Cunningham virus (JCPyV), respectively. PCR products encoding fragments of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) No. 518 and No. 4390 are obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides (GenTerra, Russia) listed in Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of fragments of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV). The size of the amplified fragments # 518 and # 4390 is 195 base pairs and 196 base pairs, respectively.
Таблица 2. Специфические олигонуклеотиды для предварительной амплификации фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).Table 2. Specific oligonucleotides for preliminary amplification of fragments of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV).
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, соответствующих фрагментам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390:Temperature profile of amplification for obtaining PCR products corresponding to fragments of the genome of John Cunningham virus (JCPyV) # 518 and # 4390:
1. Денатурация: 95°С в течение 3 минут.1. Denaturation: 95 ° C for 3 minutes.
2. 40 циклов амплификации:2.40 amplification cycles:
95°С - 15 сек,95 ° С - 15 sec,
55°С - 45 сек,55 ° С - 45 sec,
72°С - 30 сек;72 ° С - 30 sec;
3. Финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. Final elongation: 72 ° C for 5 minutes.
В ходе подготовки материала для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) методом предварительной амплификации проводят титрование модельной матрицы pGEM-T-JCPyV путем приготовления серийных разведений (Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей геном вируса Джона Каннингема (JCPyV), и клинических образцов).During the preparation of material for the detection of DNA of the John Cunningham virus (JCPyV) by the method of preliminary amplification, titration of the model matrix pGEM-T-JCPyV is carried out by preparing serial dilutions (Table 3. Serial dilutions of samples of the model matrix containing the genome of John Cunningham virus (JCPyV) and clinical samples).
Таблица 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей геном вируса Джона Каннингема (JCPyV), и клинических образцов.Table 3. Serial dilutions of John Cunningham Virus (JCPyV) genome-containing model matrix samples and clinical samples.
Для оценки эффективности предварительной амплификации полученные ПЦР-продукты, соответствующие фрагментам генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле (Фиг. 1 и Фиг. 2 соответственно).To evaluate the efficiency of preliminary amplification, the obtained PCR products corresponding to genome fragments of John Cunningham virus (JCPyV) # 518 and # 4390 were visualized by agarose gel electrophoresis (Fig. 1 and Fig. 2, respectively).
Подготовленный описанным способом материал используют для экспериментов по выявлению ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов LbCpf1 из Lachnospiraceae, содержащих направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390, без предварительной очистки.The material prepared by the described method is used for experiments on the detection of DNA of the John Cunningham virus (JCPyV) using ribonucleoprotein complexes LbCpf1 from Lachnospiraceae containing guide RNA sgRNA JCPyV No. 518 and sgRNA JCPyV No. 4390, without preliminary purification.
ПРИМЕР 3: ПОЛУЧЕНИЕ НАПРАВЛЯЮЩИХ РНК И СОЗДАНИЕ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV)EXAMPLE 3: OBTAINING GUIDING RNA AND ESTABLISHING RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES FOR DETECTING THE DNA OF THE JOHN CANNINGHAM VIRUS (JCPyV)
Для получения направляющих РНК для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) разработан набор специфических олигонуклеотидов, приведенных в Таблице 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).To obtain guide RNAs for the detection of John Cunningham virus DNA (JCPyV), a set of specific oligonucleotides has been developed, shown in Table 4. Specific oligonucleotides for obtaining a PCR product encoding guide RNAs specific for John Cunningham virus DNA (JCPyV).
Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV).Table 4. Specific oligonucleotides for the production of a PCR product encoding guide RNAs specific for John Cunningham virus (JCPyV) DNA.
Получение направляющих РНК проводят в несколько этапов:The production of guide RNAs is carried out in several stages:
1. Получение ПЦР-продукта с использованием набора специфических олигонуклеотидов (Таблица 4. Специфические олигонуклеотиды для получения ПЦР-продукта, кодирующего направляющие РНК, специфичные к ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV)), кодирующего направляющую РНК, способную связываться с целевым фрагментом генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), содержащую РНК-шпильку, которая распознается РНК-направляемой ДНК-эндонуклеазой LbCpf1 из Lachnospiraceae;1. Obtaining a PCR product using a set of specific oligonucleotides (Table 4. Specific oligonucleotides for obtaining a PCR product encoding guide RNAs specific to DNA of John Cunningham virus (JCPyV)), encoding a guide RNA capable of binding to the target fragment of the John virus genome Cunningham (JCPyV) containing an RNA hairpin that is recognized by the RNA directed DNA endonuclease LbCpf1 from Lachnospiraceae;
2. Очистка ПЦР-продукта, кодирующего направляющую РНК, специфичную к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).2. Purification of the PCR product encoding a guide RNA specific to a fragment of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV).
3. Синтез направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).3. Synthesis of guide RNA specific to a fragment of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV).
4. Очистка направляющей РНК, специфичной к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).4. Purification of guide RNA specific to a fragment of the genome of John Cunningham virus (JCPyV).
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA JCPyV №518, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-JCPyV-518-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA JCPyV №518, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the guide RNA sgRNA JCPyV No. 518 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and sgRNA-JCPyV-518-Rev (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgRNA JCPyV # 518 is 62 base pairs.
ПЦР-продукт, кодирующий направляющую РНК sgRNA JCPyV №4390, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) и специфических олигонуклеотидов T7pr и sgRNA-JCPyV-4390-Rev (ГенТерра, Россия). Размер амплифицированного фрагмента, кодирующего sgRNA JCPyV №4390, составляет 62 пары нуклеотидов.The PCR product encoding the guide RNA sgRNA JCPyV No. 4390 is obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology, Rospotrebnadzor, Russia) and specific oligonucleotides T7pr and sgRNA-JCPyV-4390-Rev (GenTerra, Russia). The size of the amplified fragment encoding sgRNA JCPyV # 4390 is 62 base pairs.
Температурный профиль амплификации для получения ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК:Temperature profile of amplification for obtaining PCR products encoding guide RNAs:
1. Денатурация: 95°С в течение 3 минут.1. Denaturation: 95 ° C for 3 minutes.
2. 35 циклов амплификации:2.35 amplification cycles:
95°С - 15 сек,95 ° С - 15 sec,
55°С - 45 сек,55 ° С - 45 sec,
72°С - 30 сек;72 ° С - 30 sec;
3. Финальная элонгация: 72°С в течение 5 минут.3. Final elongation: 72 ° C for 5 minutes.
ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), визуализируют при помощи электрофореза в агарозном геле.PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the John Cunningham virus (JCPyV) genome are visualized by agarose gel electrophoresis.
Очистку ПЦР-продуктов, кодирующих направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), проводят с использованием коммерчески доступного набора ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, США) согласно инструкции производителя. Очищенные ПЦР-продукты, кодирующие направляющие РНК, специфичные к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), используют в качестве матрицы для синтеза направляющих РНК.Purification of PCR products encoding guide RNAs specific to a fragment of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) is carried out using a commercially available ISOLATE II PCR and Gel Kit (BioLine, USA) according to the manufacturer's instructions. Purified PCR products encoding guide RNAs specific for a fragment of the John Cunningham virus (JCPyV) genome are used as a template for the synthesis of guide RNAs.
Синтез направляющих РНК, специфичных к фрагменту генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), осуществляется методом in vitro транскрипции с использованием коммерчески доступных наборов реагентов (HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, США) согласно инструкции производителя. Продукты реакции in vitro транскрипции переосаждают из реакционной смеси добавлением хлорида натрия до конечной концентрации 400 mM и равного объема изопропилового спирта. Такие модификации протокола производителя, внесенные авторами, позволяют увеличить выход продукта реакции и получить желаемую концентрацию финального препарата направляющей РНК.The synthesis of guide RNAs specific to a fragment of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) is carried out by in vitro transcription using commercially available reagent kits (HiScribe ™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit, NEB, USA) according to the manufacturer's instructions. The products of the in vitro transcription reaction are reprecipitated from the reaction mixture by adding sodium chloride to a final concentration of 400 mM and an equal volume of isopropyl alcohol. Such modifications of the manufacturer's protocol, introduced by the authors, allow increasing the yield of the reaction product and obtaining the desired concentration of the final guide RNA preparation.
Создание готового рибонуклеопротеинового комплекса, содержащего белок семейства CRISPR/CAS LbCpf1 из Lachnospiraceae, и направляющую РНК авторы проводят по стандартному протоколу с некоторыми модификациями (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014;546:1-20. doi: 10.1016/B978-0-12-801185-0.00001-5).The creation of a ready-made ribonucleoprotein complex containing a protein of the CRISPR / CAS LbCpf1 family from Lachnospiraceae and a guide RNA was carried out by the authors according to the standard protocol with some modifications (In vitro enzymology of Cas9 // Anders C, Jinek M. Methods Enzymol. 2014; 546: 1-20 doi: 10.1016 / B978-0-12-801185-0.00001-5).
Непосредственно перед объединением с Cas-белком препарат направляющей РНК (в количестве 250 нг) прогревают при 90°С в течение 5 минут и позволяют медленно остыть до комнатной температуры (инкубация при комнатной температуре не менее 10 минут). Такое прогревание необходимо для формирования корректной конформации шпильки, содержащейся в направляющей РНК. Многие производители коммерческих препаратов Cas-белков пропускают данный этап при подготовке рибонуклеопротеинового комплекса.Immediately before combining with Cas protein, the guide RNA preparation (in an amount of 250 ng) is heated at 90 ° C for 5 minutes and allowed to cool slowly to room temperature (incubation at room temperature for at least 10 minutes). This heating is necessary for the formation of the correct conformation of the hairpin contained in the guide RNA. Many manufacturers of commercial Cas protein preparations skip this step when preparing the ribonucleoprotein complex.
Для формирования готового рибонуклеопротеинового комплекса 250 нг Cas-белка LbCpf1 из Lachnospiraceae и подготовленную направляющую РНК смешивают и инкубируют 15 минут при комнатной температуре. Полученный таким способом рибонуклеопротеиновый комплекс готов для выявления фрагментов генома вируса Джона Каннингема (JCPyV).To form the finished ribonucleoprotein complex, 250 ng of LbCpf1 Cas protein from Lachnospiraceae and the prepared guide RNA are mixed and incubated for 15 minutes at room temperature. The ribonucleoprotein complex obtained in this way is ready for the detection of fragments of the John Cunningham virus (JCPyV) genome.
ПРИМЕР 4: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ПРИМЕРЕ МОДЕЛЬНОЙ МАТРИЦЫEXAMPLE 4: DETECTION OF SINGLE COPIES OF DNA OF THE JOHN CANNINGHAM VIRUS (JCPyV) USING RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES CRISPR / CAS ON THE EXAMPLE OF A MODEL MATRIX
Предварительно амплифицированный материал, полученный способом, описанным в Примере 2, используют в качестве матрицы для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.The pre-amplified material obtained by the method described in Example 2 was used as a template for the detection of John Cunningham virus (JCPyV) DNA using the CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Для обнаружения ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas готовят реакционную смесь, содержащую следующие компоненты:For the detection of John Cunningham virus (JCPyV) DNA using CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes, a reaction mixture is prepared containing the following components:
• 10× буфер (100 mM TrisHCl pH 8,0, 1 M NaCl);• 10 × buffer (100 mM TrisHCl pH 8.0, 1 M NaCl);
• 50 mM MgCl2 (конечная концентрация в реакционной смеси 10 mM);• 50 mM MgCl2 (final concentration in the
• 250 нг рибонуклеопротеинового комплекса (LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390);• 250 ng of ribonucleoprotein complex (LbCpf1 from Lachnospiraceae and sgRNA JCPyV # 518 and sgRNA JCPyV # 4390 guide RNAs);
• 20 pmol флуоресцентный зонд (6FAM-TTATT-BHQ1);• 20 pmol fluorescent probe (6FAM-TTATT-BHQ1);
• мишень (предварительно амплифицированный фрагмент генома вируса Джона Каннингема (JCPyV));• target (pre-amplified fragment of the genome of John Cunningham virus (JCPyV));
• вода mQ.• water mQ.
Реакционные смеси, содержащие все необходимые компоненты, помещают в амплификатор QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific, США) и задают следующие параметры реакции:The reaction mixtures containing all the necessary components are placed in a
60 циклов:60 cycles:
37°С - 35 сек,37 ° С - 35 sec,
37°С - 25 сек, съемка флуоресценции.37 ° С - 25 sec, fluorescence shooting.
В первую очередь были проведены эксперименты по обнаружению единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, сформированных на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae, с использованием в качестве мишени модельной матрицы - плазмидной ДНК pGEM-T-JCPyV, содержащей в своем составе полный геном вируса Джона Каннингема (JCPyV) размером 5139 п.о. Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV). Типичные результаты анализа приведены на примерах профилей флуоресценции в реальном времени для предварительно амплифицированных мишенях №518 и №4390, обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 и белок LbCpf1, на Фиг. 3 и Фиг. 4 соответственно. Отметим, что уже на 5-ом цикле анализа (5 минут) значение сигнала, полученного в ходе детекции единичных копий (3,4 копий/реакция) ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV), превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) минимум в 10 раз.First of all, experiments were carried out to detect single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA using ribonucleoprotein complexes CRISPR / Cas, formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae, using as a target a model matrix - plasmid DNA pGEM-T-JCPyV containing in its composition is the complete genome of the John Cunningham virus (JCPyV) with a size of 5139 bp. CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes have been shown to be capable of detecting single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA. Typical assay results are shown by examples of real-time fluorescence profiles for pre-amplified targets # 518 and # 4390 treated with ribonucleoportein complexes containing sgRNA JCPyV guide RNA # 518 and sgRNA JCPyV # 4390 and LbCpf1 protein, in FIG. 3 and FIG. 4 respectively. Note that already on the 5th cycle of analysis (5 minutes) the value of the signal obtained during the detection of single copies (3.4 copies / reaction) of the John Cunningham virus (JCPyV) DNA exceeded the value of the "noise" (non-specific fluorescence of the control sample, not containing a target) at least 10 times.
В ходе работ была оценена эффективность выявления единичных копий генома вируса Джона Каннингема (JCPyV), содержащегося в составе модельной матрицы, с использованием различных направляющих РНК (Фиг. 5). Было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas, сформированные на основе LbCpf1 из Lachnospiraceae и направляющих РНК, выявляют единичные копии генома вируса Джона Каннингема (JCPyV) с различной эффективностью, и их можно расположить в следующем порядке по уменьшению активности: sgRNA JCPyV №4390 > sgRNA JCPyV №518.In the course of the work, the efficiency of detecting single copies of the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) contained in the model matrix was evaluated using various guide RNAs (Fig. 5). It has been shown that CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes formed on the basis of LbCpf1 from Lachnospiraceae and guide RNAs reveal single copies of the John Cunningham virus (JCPyV) genome with different efficiencies, and they can be arranged in the following order of decreasing activity: sgRNA JCPyV # 4390> sgRNA JCPyV # 518.
ПРИМЕР 5: ОБНАРУЖЕНИЕ ЕДИНИЧНЫХ КОПИЙ ДНК ВИРУСА ДЖОНА КАННИНГЕМА (JCPyV) С ПОМОЩЬЮ РИБОНУКЛЕОПРОТЕИНОВЫХ КОМПЛЕКСОВ CRISPR/CAS НА ОГРАНИЧЕННОЙ ПАНЕЛИ КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВEXAMPLE 5: DETECTION OF SINGLE COPIES OF DNA OF THE JOHN CANNINGHAM VIRUS (JCPyV) USING RIBONUCLEOPROTEIN COMPLEXES CRISPR / CAS ON A LIMITED PANEL OF CLINICAL SAMPLES
Разработанные направляющие РНК были апробированы на ограниченной панели клинических образцов (12 шт.), содержащих вирус Джона Каннингема (JCPyV) (ранее подтверждено с помощью ПЦР в реальном времени).The developed guide RNAs were tested on a limited panel of clinical samples (12 pieces) containing the John Cunningham virus (JCPyV) (previously confirmed by real-time PCR).
Для обнаружения единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas была проведена предварительная амплификация фрагментов №518 и №4390. Для проведения предварительной амплификации были подготовлены серийные (согласно Таблице 3. Серийные разведения образцов модельной матрицы, содержащей геном вируса Джона Каннингема (JCPyV), и клинических образцов) разведения препаратов ДНК, выделенных из клинических образцов 12 пациентов с помощью коммерчески доступного набора «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) согласно инструкции производителя.To detect single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA using ribonucleoprotein complexes CRISPR / Cas, preliminary amplification of fragments No. 518 and No. 4390 was carried out. To carry out preliminary amplification, serial (according to Table 3. Serial dilutions of samples of the model matrix containing the genome of the John Cunningham virus (JCPyV) and clinical samples) dilutions of DNA preparations isolated from clinical samples of 12 patients using the commercially available RIBO-prep "(FBUN TsNII Epidemiology Rospotrebnadzor, Russia) according to the manufacturer's instructions.
ПЦР-продукты, кодирующие фрагменты ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390, получают в реакции амплификации с использованием ПЦР-смеси-2 blue (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) как описано в Примере 2, применяя описанный температурный профиль и продолжительность реакции амплификации.PCR products encoding DNA fragments of the John Cunningham virus (JCPyV) # 518 and # 4390 are obtained in an amplification reaction using PCR mixture-2 blue (FBSI Central Research Institute of Epidemiology of Rospotrebnadzor, Russia) as described in Example 2, using the described temperature profile and the duration of the amplification reaction.
Полученный таким способом материал используют в качестве матрицы для обнаружения единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas, полученных способом, описанным в Примере 3.The material thus obtained was used as a template for detecting single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA using CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes obtained by the method described in Example 3.
Обнаружение единичных копий ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) с помощью рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas проводят способом, описанным в Примере 4.Detection of single copies of John Cunningham virus (JCPyV) DNA using CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes is performed by the method described in Example 4.
В ходе проведенного анализа было показано, что рибонуклеопротеиновые комплексы CRISPR/Cas обладают способностью выявлять единичные копии (2 копии/реакция) вируса Джона Каннингема (JCPyV) в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов. При этом уже на 5 цикле (5 минут) анализа значение сигнала превышало значение «шума» (неспецифической флуоресценции контрольного образца, не содержащего мишени) в десять раз, а к 20 циклу (20 минут) анализа - более чем в 100 раз. На Фиг. 6 приведены типичные результаты анализа на примерах значений флуоресценции в конечной точке (60 цикл анализа, 60 минут) для предварительно амплифицированных мишеней фрагментов ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) №518 и №4390 (12 независимых клинических образцов), обработанных рибонуклеопортеиновыми комплексами, содержащими направляющие РНК sgRNA JCPyV №518 и sgRNA JCPyV №4390 и белок LbCpf1.The analysis showed that CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes are capable of detecting single copies (2 copies / reaction) of the John Cunningham virus (JCPyV) in DNA preparations isolated from clinical samples. At the same time, already at the 5th cycle (5 minutes) of the analysis, the signal value exceeded the value of "noise" (nonspecific fluorescence of the control sample containing no target) ten times, and by the 20th cycle (20 minutes) of the analysis - more than 100 times. FIG. 6 shows typical results of analysis by examples of fluorescence values at the end point (60 analysis cycle, 60 minutes) for pre-amplified targets of DNA fragments of the John Cunningham virus (JCPyV) # 518 and # 4390 (12 independent clinical samples) treated with ribonucleoportein complexes containing targeting RNA sgRNA JCPyV # 518 and sgRNA JCPyV # 4390 and protein LbCpf1.
Таким образом, разработанные направляющие РНК позволяют в составе рибонуклеопротеиновых комплексов CRISPR/Cas ультрачувствительно выявлять единичные копии ДНК вируса Джона Каннингема (JCPyV) в реакции после предварительной амплификации в препаратах ДНК, выделенных из клинических образцов, содержащих вирус Джона Каннингема (JCPyV).Thus, the developed guide RNAs make it possible to ultrasensitively detect single DNA copies of the John Cunningham virus (JCPyV) in the reaction after preliminary amplification in DNA preparations isolated from clinical samples containing the John Cunningham virus (JCPyV) as part of the CRISPR / Cas ribonucleoprotein complexes.
Claims (19)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020139162A RU2747820C1 (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2020139162A RU2747820C1 (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2747820C1 true RU2747820C1 (en) | 2021-05-14 |
Family
ID=75919972
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2020139162A RU2747820C1 (en) | 2020-11-30 | 2020-11-30 | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2747820C1 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2782700C1 (en) * | 2021-12-27 | 2022-11-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017100431A2 (en) * | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Excision Biotherapeutics, Inc. | Gene editing methods and compositions for eliminating risk of jc virus activation and pml (progressive multifocal leukoencephalopathy) during immunosuppresive therapy |
| RU2017115838A (en) * | 2014-10-30 | 2018-11-30 | Темпл Юниверсити Оф Де Коммонвелт | RNA-directed destruction of human JC virus and other poliomaviruses |
-
2020
- 2020-11-30 RU RU2020139162A patent/RU2747820C1/en active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2017115838A (en) * | 2014-10-30 | 2018-11-30 | Темпл Юниверсити Оф Де Коммонвелт | RNA-directed destruction of human JC virus and other poliomaviruses |
| WO2017100431A2 (en) * | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Excision Biotherapeutics, Inc. | Gene editing methods and compositions for eliminating risk of jc virus activation and pml (progressive multifocal leukoencephalopathy) during immunosuppresive therapy |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| CHOU Y.Y. et al. Inhibition of JCPyV infection mediated by targeted viral genome editing using CRISPR/Cas9, Sci Rep., 2016, Volume 6, p. 36921. * |
| WOLLEBO H.S. et al. CRISPR/Cas9 System as an Agent for Eliminating Polyomavirus JC Infection, PLoS One, 2015, Volume 10, Issue 9, p. e0136046. * |
| WOLLEBO H.S. et al. CRISPR/Cas9 System as an Agent for Eliminating Polyomavirus JC Infection, PLoS One, 2015, Volume 10, Issue 9, p. e0136046. CHOU Y.Y. et al. Inhibition of JCPyV infection mediated by targeted viral genome editing using CRISPR/Cas9, Sci Rep., 2016, Volume 6, p. 36921. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2782700C1 (en) * | 2021-12-27 | 2022-11-01 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas12 system for detection of hepatitis b virus dna at ultra-low concentrations |
| RU2799430C1 (en) * | 2022-11-29 | 2023-07-05 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex crispr-cas and a preparation for detecting hepatitis c virus rna of genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations |
| RU2800421C1 (en) * | 2022-11-29 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Crispr-cas12 system for detecting hepatitis c virus rna genotypes 1b and 3a at ultra-low concentrations |
| RU2800420C1 (en) * | 2022-11-29 | 2023-07-21 | Федеральное бюджетное учреждение науки "Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| WO2006021131A1 (en) | Asymmetric pcr amplification, its special primer and application | |
| JP7374377B2 (en) | Test kit for Salmonella typhi, its manufacturing method, and its uses | |
| CN111635950A (en) | Kit and method for rapidly detecting bordetella pertussis | |
| CA2035471A1 (en) | Techniques for the amplification of nucleic acid | |
| EP2753629B1 (en) | Methods for detecting lyme disease | |
| RU2747820C1 (en) | Crispr-cas system for detection of john cunningham virus (jcpyv) dna at ultra-low concentrations | |
| RU2747880C1 (en) | Method for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in method | |
| RU2747819C1 (en) | Method for obtaining preparation of ribonucleoprotein complex crispr / cas and preparation for detecting dna of john cunningham virus (jcpyv) in ultra-low concentrations | |
| RU2745637C1 (en) | Method for obtaining the crispr/cas ribonucleoprotein complex preparation and preparation for detection of the blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa antibiotic resistance gene in ultra-low concentrations | |
| RU2743861C1 (en) | Crispr-cas system for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metallo-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa at ultra-low concentrations | |
| RU2802783C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations in ultra-low concentrations | |
| RU2734520C1 (en) | Method for detecting the antibiotic resistance gene blavim-2 (metal-beta-lactamase class b vim-2) pseudomonas aeruginosa in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2802781C1 (en) | Method of obtaining a preparation of the ribonucleoprotein complex crispr-cas12 and a preparation for detecting human immunodeficiency virus (hiv-1) rna in ultra-low concentrations | |
| RU2802079C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2791879C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa, at ultra-low concentrations | |
| RU2800420C1 (en) | Method of detection of rna of hepatitis c virus genotypes 1b and 3a in ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2720768C1 (en) | Crispr-cas system for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations | |
| RU2800421C1 (en) | Crispr-cas12 system for detecting hepatitis c virus rna genotypes 1b and 3a at ultra-low concentrations | |
| RU2764023C1 (en) | CRISPR-Cas 12 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS | |
| RU2791880C1 (en) | Method for detecting the exou gene encoding the type 3 secretion system exotoxin, pseudomonas aeruginosa at ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2720767C1 (en) | Method for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into human genome in ultralow concentrations and specific oligonucleotides for use in method | |
| RU2720769C1 (en) | Method of producing a preparation of a ribonucleoprotein complex of crispr / cas and a preparation for detecting proviral dna of human immunodeficiency virus integrated into a human genome in ultra-low concentrations | |
| RU2782951C1 (en) | Method for detecting the dna of the hepatitis b virus at ultra-low concentrations and specific oligonucleotides for use in the method | |
| RU2820306C1 (en) | METHOD FOR DETECTING ANTIBIOTIC RESISTANCE GENE bla-TEM-1B IN ULTRA-LOW CONCENTRATIONS AND SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDES FOR USE IN METHOD | |
| RU2764020C1 (en) | CRISPR-CAS14 SYSTEM FOR DETECTING SARS-CoV-2 VIRUS RNA AT ULTRA-LOW CONCENTRATIONS |