TWI419970B - 使成體幹細胞產生為一球體細胞群體的方法 - Google Patents

Description

使成體幹細胞產生為一球體細胞群體的方法

本發明係關於一種成體幹細胞之培養方法，尤其是有關一種應用生物相容性高分子使成體幹細胞聚集成球體且分化能力提升的方法。

幹細胞為一種尚未分化完全的細胞，具有自我更新(self-renew)與分化的可塑性，在組織工程以及再生醫學的應用上極具潛力；幹細胞根據分化的潛能，分為全能幹細胞(totipotent stem cells)、三胚層多能幹細胞(multipotent stem cells)、單胚層多潛能幹細胞(pluripotent stem cells)與單能幹細胞(unipotent stem cells)，例如：桑椹胚(morula)之前的每個細胞都保有全能性，也就是將任一個細胞放在子宮中都可以發育成一個完整的個體，具這種潛能的細胞稱為全能幹細胞。單獨只有內細胞團塊(inner cell mass)的細胞，雖然無法發育成整個個體(因為缺乏分化成滋養外胚層的能力，滋養外胚層之後會分化成羊膜和胎盤)，但具有發展成個體過程中分化為各種細胞的能力，稱為三胚層多能幹細胞。間葉幹細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)能分化成硬骨、軟骨、脂肪和其他結締組織或轉分化為神經細胞、肝臟細胞等，稱為單胚層多潛能幹細胞。神經幹細胞(neural stem cell)只能分化成神經元或是神經膠細胞，稱為單能幹細胞。

幹細胞又可依來源分為胚胎幹細胞(embryonic stem cells,ESCs)和成體幹細胞(adult stem cells)。胚胎幹細胞通常是指來自囊胚內細胞團的細胞，成體幹細胞一般係指取自嬰兒出生後的幹細胞。成體幹細胞包括但不限於造血幹細胞(hematopoietic stem cell)、間葉幹細胞、神經幹細胞(neural stem cells,NSCs)、肝幹原細胞(oval cell)等。其中間葉幹細胞又依來源包括但不限於骨髓間葉幹細胞(BMSCs)、胎盤幹細胞(placenta-derived mesenchymal stem cells,PDMSCs)、脂肪幹細胞(adipose-derived adult stem cells,ADASs)、牙齦幹細胞(Human gingival fibroblasts,HGF)等等。

胚胎幹細胞具有無限次的複製能力和多潛能性的分化潛能，然而其臨床應用上卻有許多待克服的問題，例如道德上的爭議以及移植時會產生免疫排斥等等。成體幹細胞則因臨床上多採自體移植的應用方式，可避免移植時產生免疫排斥的問題及道德上的爭議之優點，然而成體幹細胞也因***次數有限，通常僅能分化成少數幾種細胞，如神經幹細胞經適當的條件下可分化為神經元(neurons)、星狀膠質細胞(astrocytes)以及寡樹突膠質細胞(oligodendrocytes)，且成體幹細胞在體外增殖培養過程中，常會產生不易維持分化活性及功能性的問題。

另一方面，一般習知適合培養幹細胞的材料以聚苯乙烯(polystyrene)、明膠(gelatin)、聚-α-羥基酸、聚乳酸乙醇酸等，其具有穩定生物適應性的優點，但該些材料用於成體幹細胞的增殖培養過程，有不易分化及或喪失功能的缺點，影響成體幹細胞增殖分化的成效。

目前研究已發現細胞形態可調節幹細胞治療前分化因子的譜系，而球體的細胞形態已被證實與分化潛能有關，例如胚胎幹細胞聚集的群落自緊密的細胞-細胞接觸可以細胞自我更新；胚胎體(Embryoid bodies,EB)為胚胎幹細胞三度空間細胞聚集，可在模擬的正常胚胎生長環境下初始分化，但目前仍未有成體幹細胞聚集為球體之有效方法。

為解決習知成體幹細胞體外培養不易維持幹性(stemness)及分化之問題，本發明之目的係提供一種使成體幹細胞產生為一球體細胞群體的方法，包含體外培養成體幹細胞於一生物相容性高分子形成的一薄膜上，其中該生物相容性高分子係為幾丁聚醣、褐藻酸鹽、透明質酸、聚己內酯、銀耳多醣或其任一組合；以及收集由成體幹細胞聚集成之一球體細胞群體，其中該球體細胞群體會擴大且具有自我更新及分化為一體細胞的能力；該成體幹細胞選自由神經幹細胞、神經前驅細胞、脂肪幹細胞、牙齦幹細胞、骨髓間葉幹細胞、肺幹細胞及胎盤幹細胞所組成之群組，而生物相容性高分子可為幾丁聚醣與透明質酸的組合，且幾丁聚醣與透明質酸的比例(w/w)約為3/0.177至3/4.425，因本發明使用0.1mg/cm² ,0.5mg/cm² ,2.5 mg/cm² ,因為一個玻片1.77 cm² ,所以是3 mg(chitosan):0.177mg(HA),3 mg(chitosan):0.885 mg(HA),3 mg(chitosan):4.425 mg(HA)都有效，是利用透明質酸負電吸附在幾丁醣(正電)表面的雙層材料，否則透明質酸抓不住表面會溶到水中，該體細胞可為一神經細胞。另一方面，由成體幹細胞產生的該球體細胞群體進一步具有轉分化(transdifferentiation)為一心肌細胞或一軟骨細胞的能力，其中當該球體細胞群體為脂肪幹細胞時，使脂肪幹細胞與5-azacytidine接觸會轉分化為心肌細胞；而當該球體細胞群體為牙齦幹細胞、脂肪幹細胞、或胎盤幹細胞時，使前述細胞與一轉型生長因子β3(TGF-β3)接觸會轉分化為軟骨細胞。

本發明之另一目的為提供一種具有分化能力的成體幹細胞，係由以下方法所製成，包含使一成體幹細胞與一生物相容性高分子形成的一薄膜接觸一段有效時間，其中該生物相容性高分子係為幾丁聚醣、褐藻酸鹽、透明質酸或其任一組合；其中該成體幹細胞會形成一球體細胞群體，該球體細胞群體會擴大並具有轉分化為一軟骨細胞或一心肌細胞的能力；該成體幹細胞選自由神經幹細胞、神經前驅細胞、脂肪幹細胞、牙齦幹細胞、及胎盤幹細胞所組成之群組，而生物相容性高分子可進一步包含一具有如SEQ ID NO:1胺基酸序列之纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(cellulose binding domain-RGD,CBD-RGD)能提昇球體細胞群體的轉分化能力；生物相容性高分子或可為幾丁聚醣與透明質酸的組合，且幾丁聚醣與透明質酸的比例約為3：0.177至3：4.425(w/w)；可為幾丁聚醣與銀耳多醣的組合，且幾丁聚醣與銀耳多醣的比例約為3：0.4至3：4.5(w/w)；亦可為聚己內酯與透明質酸的組合；該體細胞可為一神經細胞。

本發明之又一目的為提供一種醫藥組合物，包含前述之成體幹細胞及一藥學上可接受載體。載體可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。本發明醫藥組成物可依一般習知幹細胞療法藥劑之製備方法生產製造，將本發明成體幹細胞與一種以上之載體相混合，製備出所需之劑型，此劑型可包括錠劑、粉劑、粒劑、膠囊或其他液體製劑，但未以此為限。本發明的醫藥組合物可應用於臨床上幹細胞療法，以促進神經細胞、心肌細胞或軟骨細胞的再生，亦可藉此包含成體幹細胞的醫藥組合物來避免胚胎幹細胞取得不易及倫理上的考量。

本發明之優點為提供一新穎的哺乳動物多能成體幹細胞、其醫藥組合物、以及用於生產該成體幹細胞的方法，係藉由生物相容性高分子接觸而達到自我更新及維持幹性(stemness)的突出效果。

以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明，並非用以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

本發明實施例使用的天然生物相容性高分子為幾丁聚醣、褐藻酸鹽、透明質酸或其任一組合，其中幾丁聚醣(chitosan)由胺基多醣類(amino-polysaccharide)所組成，幾丁聚醣包含與細胞外間質相同成分的葡萄糖胺多醣(glycosamino-glycan)，所以生物相容性高且為生物可分解的材料。褐藻酸鹽(alginate)為一可增進神經軸突再生的天然軟質聚合物，褐藻酸鹽可在生理條件(於室溫或是體溫、生理pH值以及等滲透壓)下與鈣離子交聯；褐藻酸鈣(calcium alginate)為一生物可相容性和無致免疫性，所以為高穩定性以及高生物相容性的材料。透明質酸(hyaluronic acid,HA)可增進細胞遷移(migration)、增殖以及間質分泌的材料，且為水溶性不會形成薄膜，在本發明中是與幾丁聚糖組合形成一薄膜。因此，本發明係揭露前述生物相容性高分子應用於成體幹細胞培養的新穎方法。

本發明實施例使用的成體幹細胞為神經幹細胞、神經前驅細胞、脂肪幹細胞、牙齦幹細胞、及胎盤幹細胞，經與前述的生物相容性高分子形成之薄膜接觸，會使該些成體幹細胞聚集形成一球體細胞群體，且本發明的球體細胞群體以胰蛋白酶(trypsin)處理是會整粒球由薄膜上脫離，若只是先前文獻提及的幹細胞聚集現象，用胰蛋白酶(trypsin)處理是一顆一顆細胞分開脫離。

本發明的各實施例中，實施例1及2為利用不同分子量的幾丁聚醣和不同M/G比的褐藻酸鹽製成二度空間(2D)薄膜，比較神經幹細胞培養於其上和其他習知材料(ex.TCPS)之形態及分化結果比較。實施例3-5為利用不同分子量的幾丁聚醣、改質之幾丁聚醣、或與透明質酸結合的幾丁聚醣膜分別培養脂肪幹細胞、牙齦幹細胞、***纖維母細胞或是胎盤幹細胞，與培養於其他習知材料(ex.TCPS)之形態以及分化結果比較。實施例6為利用幾丁聚醣-銀耳多醣培養脂肪幹細胞與神經幹細胞，觀察其形態。

本發明之一實施例係藉由分析神經幹細胞及神經前驅細胞在不同材料上之型態與分化，判斷其自我更新及幹性維持與否；其中不同材料係以去乙醯度、表面電位、及水接觸角分析各材料產生出球體細胞群體的效果。進一步並確認球體細胞群體的細胞型態以及分化的效果，其中F1B-螢光綠蛋白(F1B-GFP)在未分化的神經幹細胞會表現出綠色螢光，因此神經幹細胞分化的分析係偵測F1B-螢光綠蛋白的表現，進而配合免疫螢光偵測神經幹細胞的標記nestin及未發育完全神經元的標記β3-tubulin。

在本發明中所使用者，”一神經幹細胞”或"一神經前驅細胞”係指未分化的中樞神經(CNS)多能幹細胞。

“一具有分化能力的成體幹細胞”係指一成體幹細胞容易分化為多種類的體細胞。依照本發明的方法處理成體幹細胞，能使成體幹細胞具有自我更新及分化的能力，提升成體幹細胞的可塑性。

“一段有效時間”係指生物相容性高分子與本發明的成體幹細胞形成一球體細胞群體所必需的一段時間，例如神經幹細胞與幾丁聚糖接觸一段時間使其聚集形成球體。關於與生物相容性高分子接觸的一段有效時間，在本說明書中可為4個小時到14日或更多，較佳為1日到4日。

“一藥學上可接受載體”係指用於達成或增進本發明醫藥組合物成功遞送的物質，可為賦形劑(如水)、填充劑(如蔗糖或澱粉)、黏合劑(如纖維素衍生物)、稀釋劑、崩解劑、吸收促進劑或甜味劑，但並未僅限於此。

“約”、”約略”或”近似地”一般係指20%，較佳為10%，最佳為5%的範圍內。本文中的數值係為近似值，在未明確定義的情況下可隱含「約」「約略」或「近似地」之含義。

“一”係指一個或一個以上(即是至少一個)的冠詞文法受詞。舉例而言，“一細胞”係指一個細胞或一個以上的細胞。

本發明實施例中測量生物相容性高分子表面電位之分析方法，準備4 cm×1.5 cm的薄膜，利用表面電位分析儀(Beckman Coulter)測其表面電位(mV，Surface zeta potential)。

本發明實施例所用之神經幹細胞免疫螢光染色方法，為量測幾丁聚醣膜上神經幹細胞球的分化狀態，細胞標記(nestin,標記於神經幹細胞；β3-tubulin,標記於神經元)用於免疫螢光染色。在細胞培養不同週期時間被固定於4%仲甲醛(paraformaldehyde)中。以磷酸鹽緩衝液潤洗三次。加入0.5% Triton X-100(t-octylphenoxypolyethoxyethanol,Sigma,USA)500μl 10分鐘以破壞細胞膜及核膜。以磷酸鹽緩衝液潤洗樣本幾次，加入20μl一級抗體於暗室37℃培養置放1小時。為將細胞染色，加入0.1%之4,6-聯脒-3-苯吲哚二鹽酸鹽(4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)(購於DAPI,Sigma,D9542,USA)200μl於暗室30分鐘。最後，潤洗樣本後將其架於顯微鏡載玻片上，以甘油凝膠密封。樣本於正立式螢光顯微鏡觀察(購於Nikon,80i)。一級抗體稀釋比例如下：anti-nestin(R-20) goat-poly IgG抗體(購於Santa Cruz,USA;1:1000)以及anti-β3-tublin mouse-mono IgG(購於Santa Cruz,USA;1:1000)。二級抗體稀釋比例為FITC-conjugated goat anti-mouse IgG(以馬血清蛋白稀釋；1:100；購於Chemicon,CA)以及goat anti-rabbit IgG-horeseradish peroxidase(HRP)(購於Santa Cruz,USA;1:100)。

本發明實施例對於心肌分化能力的分析係利用正立螢光顯微鏡(NIKON)：樣品以磷酸鹽緩衝液潤洗，加入4% paraformaldehyde室溫下固定20分鐘，以磷酸鹽緩衝液清洗3次，每次10分鐘，加入3% BSA/磷酸鹽緩衝液室溫下30分鐘後，吸出，加入3% BSA配製的一抗，稀釋倍率為下表，以parafilm封住後放入4℃冰箱過夜；隔天，將一抗吸出，以磷酸鹽緩衝液潤洗三次(以下步驟全程避光)，加入3% BSA配製的二抗，以鋁箔紙蓋住避光後放入37℃培養箱1小時；將二抗吸出，磷酸鹽緩衝液潤洗三次，加入3% BSA配製的DAPI染劑3分鐘，吸出，磷酸鹽緩衝液清洗三次後，加入磷酸鹽緩衝液，利用針頭與夾子將材料從24孔培養板取出，放置於載玻片上以正立螢光顯微鏡(購於NIKON)觀察之。

本發明實施例所分析細胞表面蛋白特徵，係使用之流式細胞儀分析方法，利用流式細胞儀(購於FACScan,BD,USA)。首先，將細胞從培養盤上取下來，取5×10⁵ cells/ml以磷酸鹽緩衝液清洗，以1000rpm離心5分鐘，重複三次後收集細胞，加入100μl磷酸鹽緩衝液回溶細胞後，在細胞液中加入10μl一抗，反應30~60分鐘，磷酸鹽緩衝液潤洗三次後，避光下加入10μl二抗反應30~60分鐘，以磷酸鹽緩衝液清洗，1000 rpm離心5分鐘，重複三次以移除未反應之抗體，最後加入500μl磷酸鹽緩衝液回溶細胞，即可移至流式細胞儀進行分析。

前述該些分析結果係以平均值±標準差表示之，並使用t檢定(t-test)作統計數據分析，當p值小於0.05則具有統計上意義的差異性。

以下，本發明將結合各種實例詳細敘述。這些實例僅提供作為例示目的，並非推斷本發明限於這些實例。另外，儘管在實例中例示成體幹細胞中的神經幹細胞、神經前驅細胞及脂肪幹細胞自鼠分離而來；牙齦幹細胞、胎盤幹細胞自人類分離而來，但本發明不可侷限於此，而是可應用於自包含人類、大鼠、小鼠及猴等哺乳類動物分離而來者。

實施例1

以二種分子量之幾丁聚醣薄膜培養成體神經幹細胞/神經前驅細胞

1.1　幾丁聚醣薄膜製備

利用二種幾丁聚醣-1(購於Fluka,USA)及幾丁聚醣-2(購於Sigma,USA)各自配製濃度為1%的幾丁聚醣，係秤取0.5g幾丁聚醣粉末溶入於49.5ml二次水，室溫下攪拌半小時後加入0.5ml乙酸，並於室溫中輕拌12小時。隔天使用濾網過濾雜質即為1%幾丁聚醣溶液，其中幾丁聚醣-1的分子量約為510kDa，幾丁聚醣-2的分子量約為400kDa。將所得溶液以100μm的網目過濾，再塗佈於玻璃蓋玻片上(每片直徑15mm玻片塗佈100μl溶液)，並晾乾兩天。將幾丁聚醣膜浸入0.5N NaOH溶液中5分鐘，再以蒸餾去離子水大面積潤洗直到薄膜附近的水之酸鹼值達到中性(neutral)。最後，將該幾丁聚醣膜充分晾乾。

1.2　鼠腦神經幹細胞萃取及培養

由基因轉殖鼠含啟動子F1B-螢光綠蛋白(F1B-GFP)基因的腦部分離出神經幹細胞。兩個月大的小白鼠整個腦部絞碎再輕磨成更小碎塊，取得單一細胞懸浮液。絞碎的細胞植入35-mm無補充基質和附著力因子的培養皿中，以DMEM/F-12培養基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium and Ham’s F-12,購於Giboco,USA) 1:1培養液含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(購於Gibco,USA)。兩天後，每個培養皿有將近10-20個細胞進行細胞***。以胰蛋白酶處理後將其集中，並繼續培養2-3天。進一步用由200μg/ml的糖甘類抗生素geneticin(G418,購於Gibco)挑選出穩定的細胞系(cell line)。以流式細胞儀(FACS Aria,購於BD Biosciences)重複純化GFP-陽性的鼠腦細胞至純度達95%以上。

1.3　神經幹細胞/神經前驅細胞於幾丁聚醣薄膜之形態分析與分化為神經細胞的情形

將神經幹細胞植入培養材料前，玻璃蓋玻片上之幾丁聚醣膜浸於75%乙醇，再以磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline,PBS)潤洗，然後放進24孔培養板的每一孔中。神經幹細胞植入密度為每孔5×10⁴ 個細胞。用DMEM/F-12培養基添加10%的胎牛血清(購於Gibco,USA)，400μg/ml糖甘類抗生素(G418)以及鏈黴素-青黴素(100U/ml)作為培養液。培養於溫度37℃，5% CO₂ 的加濕培養箱，每週更換培養液兩次；另外並以未加生長因子的聚苯乙烯組織培養板(tissue culture polystyrene surface,TCPS)及明膠(gelatin)作為對照組，結果如第一圖及第二圖所示。

第一圖顯示神經幹細胞培養於TCPS和明膠上三天的形態，在TCPS和明膠上無觀察到任何細胞聚集，且細胞貼於TCPS和明膠。另一方面，培養於幾丁聚醣薄膜上的細胞在1-2天開始聚集，最終聚集為球狀，剛開始24小時，大部分的細胞形狀為圓形；48小時內多數細胞聚集形成球體。於幾丁聚醣-1上球體的數量和大小皆大致比幾丁聚醣-2還要大(如第二圖所示)。

為確認本發明實施例所產生之球體為三度空間的立體球體而不只是聚集，由第三圖的掃描式電子顯微影像，球體的側視圖可清楚顯示其三度結構，而由光學影像顯示球體大小隨著時間增加，可達約100μm。

另外，第四至六圖則顯示神經幹細胞的分化程度。神經幹細胞的螢光強度，有綠色螢光顯現表示未分化。綠色螢光在15天之後開始消退，但仍然清晰(如第四圖6d所示)。在15天時，一些細胞開始從球內移出，因此，神經幹細胞球體的大小改變相當快速，而移出的細胞未顯現任何綠色螢光。球體在15天後螢光消沒除了顯示細胞的移出外，球體內的細胞也已經分化。

在免疫螢光染色試驗上，神經幹細胞的標示蛋白培養於幾丁聚醣-1的表示第五圖所示(nestin)和第六圖所示(β3-tubulin)。發現球體在21天時仍強烈顯示具有nestin陽性，顯示球體的細胞可維持神經幹細胞狀態達21天；Nestin的顯示在培養時間增加時些微降低。另一方面，整個過程中β3-tubulin的表現皆低。此結果顯示神經幹細胞培養於幾丁聚醣薄膜上可為一維持這些細胞自我更新能力和幹性(stemness)的方法，或用於自細胞群中純化神經幹細胞。

1.4　幾丁聚醣和組織培養板(TCPS)之去乙醯度、表面電位，以及水接觸角值列於表1。

表1不同的幾丁聚醣(幾丁聚醣-1(CS-1)和幾丁聚醣-2(CS-2))和組織培養板(TCPS)特性比較(a)去乙醯度(b)表面電位，和(c)表面水接觸角。

幾丁聚醣-1、幾丁聚醣-2的去乙醯度分別約為77.7%、86.0%。幾丁聚醣去乙醯度值越高，表面水接觸角越低，親水性越高，即親水性幾丁聚醣-2大於幾丁聚醣-1，而兩者幾丁聚醣表面親水性皆高於TCPS，因細胞在親水性高的基質中較容易貼附，神經幹細胞貼附於TCPS上比幾丁聚醣上來得好。而且，神經幹細胞在幾丁聚醣-2上的貼附比幾丁聚醣-1要好，且在幾丁聚醣-1上球體形成時間延遲。幾丁聚醣的去乙醯度提高，氨基群和分子內的氫鍵會增加，可能造成表面變硬和強結晶性，亦與我們的結果一致。幾丁聚醣-1與幾丁聚醣-2的表面電位皆為負值，但數值接近中性，表面電性較負之表面，在本實施例的結果中，神經幹細胞並沒有貼附得很好而呈現聚集的狀況。幾丁聚醣-1的表面硬度(壓痕深度約50nm)近似於內部(壓痕深度100-150)。另一方面，幾丁聚醣-2之表面硬度高於內部且亦高於幾丁聚醣-1，幾丁聚醣-2較幾丁聚醣-1粗糙且表面上更加密集的晶體結構。因更硬和結晶性更高的表面，神經幹細胞可能貼附於幾丁聚醣-2比幾丁聚醣-1更好且形成的球體較小。

實施例2

以二種褐藻酸鹽薄膜培養成體神經幹細胞/神經前驅細胞、脂肪幹細胞

2.1　褐藻酸鹽薄膜製備

利用兩種褐藻酸鹽製備薄膜，包括較低M/G比(β-D-mannuronic acid/α-L-guluronic acid ratio)的褐藻酸鹽A#1(M/G ratio=0.5，分子量110,000，購於Hayashi,Japan)和較高M/G比的褐藻酸鹽A#2(M/G ratio=1.59，分子量12,000-80,000,Sigma,USA)。褐藻酸鹽A#1及A#2先分別溶於9mg/ml氯化鈉溶液使溶液濃度為40mg/ml。調整溶液pH值至7，以高壓滅菌(125℃以及1.5atm)30分鐘後加入2-[4-(2-羥乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid，購於HEPES,Invitrogen)維持與人體相同的酸鹼值。本發明實施例使用的二種褐藻酸鹽皆可製作成平滑或是有皺褶的膜。褐藻酸鹽薄膜係在每孔加入400μl褐藻酸鹽至24孔培養板(購於Corning,USA)，經層流風乾60分鐘再沿孔緣緩慢滴入102mM氯化鈣製備。

2.2　大鼠脂肪幹細胞(rADASs)之萃取及培養

從大鼠(Spraque-Dawley rate,SD rate)皮下取得脂肪組織，使用磷酸鹽緩衝液清洗，剪成小碎塊，第一次離心(1500 rpm，5 mins)。將上層脂肪倒入新的離心管和加入少許磷酸鹽緩衝液，再盡量剪小塊，進行第二次離心(1500 rpm，5 mins)。取上層脂肪，同時配製消化液：1 mg/ml第一型膠原蛋白脢(collagenase type I，購於Sigma)/HBSS溶液(HBSS緩衝溶液配製如表4)。

表4 HBSS緩衝溶液成分

將脂肪與上述消化液混合，放入細胞培養箱震盪(100 rpm，1小時)。第三次離心(1500 rpm，10分鐘)。使用70 m細胞篩(購於Falcon，BD Bioscience)過濾細胞液，第四次離心(1500 rpm，5 mins)。將上面的油層吸走，後加入培養液，放入75T-flask培養皿(購於Falcon，BD Bioscience)。隔天細胞貼附培養材料，將上清液抽出，加入新的培養液。培養至脂肪細胞8分滿後以0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(購於Gibco)繼代細胞，細胞密度為50000 cells/T-flask。

2.3　神經幹細胞/神經前驅細胞於褐藻酸鹽薄膜之形態分析與分化為神經細胞的情形

鼠腦神經幹細胞/神經前驅細胞萃取步驟如實施例1所述。取得之細胞培養於2D褐藻酸鹽膜上，NSPCs植入含有核藻膠的24孔培養板中(2ml培養液中植入2.5×10⁴ 個細胞)。每隔一天更換一半的培養液。

12-24小時後發現NSPCs在褐藻酸鹽膜上聚集，三天後，發現褐藻酸鹽膜上的細胞團無一致的大小(第七圖)。

在分化的表現上，NSPCs培養於2D褐藻酸鹽膜上形成球體時，能表現出神經細胞與神經膠細胞的基因；而培養於TCPS上，呈現類纖維形態的NSPCs卻無法表現神經細胞與神經膠細胞的基因(見第八圖)。

脂肪幹細胞、神經幹細胞培養28天在A#1及A#2上成球的大小如表所示(培養14天時已有球體形成，且球體大小與28天時相似)：

實施例3

以二種分子量幾丁聚醣薄膜以及纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)改質之幾丁聚醣薄膜培養脂肪幹細胞

3.1　二種分子量的幾丁聚醣薄膜製備

本實施例係使用分子量不同於前述實施例的幾丁聚醣-3(購於Kiotec)，分子量約為170 kDa，及幾丁聚醣-1(購於Fluka)，分子量約為510 kDa。秤取0.5g幾丁聚醣粉末溶入於49.5ml二次水，室溫下攪拌半小時後加入0.5ml乙酸繼續攪拌一天。隔天使用濾網過濾雜質即為1%幾丁聚醣溶液。

表3　二種幾丁聚醣的去乙醯度與分子量

取1%幾丁聚醣溶液200μl均勻滴入1.5cm圓形玻片，在常溫下自然烘乾1-2天；確定膜乾之後，加入0.5N NaOH蓋過玻片5分鐘，之後用二次水清洗3次後，繼續泡在二次水至隔天；隔天把二次水倒掉，在室溫下自然陰乾存留的二次水後，即為幾丁聚醣-3及幾丁聚醣-1薄膜。另外並以未加生長因子的聚苯乙烯組織培養板(tissue culture polystyrene surface,TCPS)作為控制組之一。

另一對照組為聚乙烯醇(PVA)薄膜，因有文獻表示牙胚細胞在PVA膜上，細胞會聚集可行成細胞球幫助硬骨分化；其製備則是秤取2.5g聚乙烯醇(Poly vinyl alcohol,PVA，購於Sigma,Hot water soluble)粉末溶於50ml二次水，利用高溫高壓滅菌釜使之溶解後，溫度降至常溫即為5%聚乙烯醇溶液。取5%聚乙烯醇溶液150μl均勻滴入1.5 cm圓形玻片，放置60℃烘箱下一天即為聚乙烯醇膜。

3.2　以纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)改質之幾丁聚醣-1的薄膜製備

纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)為中興大學陳震漢教授所提供，來源為真菌Tricoderma konigii的纖維水解酶cellulobiohydrolase I(CBH I)的基因。CBH I的N端有一段36個胺基酸大小的cellulose binding domain(CBD)，利用聚合酵素連鎖反應的方法修改的第五個胺基酸的密碼，由原來的tyrosin改成了tryptophan，藉以提高CBD對纖維素的親和力，同時在CBD基因的3端加入一段PT linker及一段RGD序列基因。RGD是細胞貼壁因子(Fibronectin)中促進細胞貼附的最小功能位，纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)具有如SEQ ID NO:1胺基酸序列，因CBD-RGD有很高的分子量(25 KDa)，只需利用庫倫引力，便形成一種可以促進細胞貼附於纖維素上的雙功能蛋白質。

本發明實施例將幾丁聚醣-1形成的薄膜結合CBD-RGD，將該薄膜泡於75%酒精3小時後，使用磷酸鹽緩衝液清洗兩次，放置半小時等幾丁聚醣-1的薄膜乾；將CBD-RGD(4μg/20μl)均勻滴在幾丁聚醣-1的薄膜上(4μg CBD-RGD/1.77 cm2)，等1-2小時CBD-RGD乾後，用磷酸鹽緩衝液清洗一次即為以CBD-RGD改質之幾丁聚醣-1的薄膜。

3.3大鼠脂肪幹細胞(rADASs)之萃取及培養

大鼠脂肪幹細胞(rADASs)之萃取及培養如實施例2。

3.4　脂肪幹細胞在三種幾丁聚醣薄膜之形態分析與分化為心肌細胞的情形

本實施例分為兩部份，第一部分為比較組織培養板(T)、聚乙烯醇(P)、幾丁聚醣3(CS3)和幾丁聚醣1(CS1)。將T，P，CS3和CS1薄膜以75%酒精泡3小時，以磷酸鹽緩衝液潤洗後，放入24孔培養板內；使用0.25%胰蛋白酶(購於Gibco)將大鼠脂肪幹細胞(實驗室用細胞代數為2-6代)打下，收集在培養液內，每孔放入5x10⁴ 細胞液後，搖晃培養板，使細胞均勻分散，再放入細胞培養箱內培養。

5-azacytidine(5-aza)是DNA去甲基化的化合物，據研究顯示，藉著5-aza不規則地去甲基化，會誘導細胞成為心肌細胞，故在第四天換成含有10M 5-aza(5-azacytidine，Sigma)的培養液，實驗組別分為有添加5-aza(w 5-aza)與無添加5-aza(w/o 5-aza)的組別，所以w/o 5-aza的組別，依舊添加原本的培養液。第五天，將培養液吸出，再次換成不含5-aza的培養液，繼續培養1星期後(共11天)，利用反轉錄聚合酶連鎖反應(Reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR)，比較心肌分化的能力，結果如表5與第九、十圖所示。

第二部分為比較T、CS1與CS1結合CBD-RGD(CS1R)的心肌分化能力。第二部分與第一部分的實驗條件一致，實驗組改為T，CS1，CS1R，由RT-PCR和免疫螢光染色實驗分析分化心肌能力，結果如表5與第九、十圖所示。

表5脂肪幹細胞(rADASs)在不同材料上形成的細胞球大小

T: TCPS；P: PVA；CS3: Chitosanl；CS1: Chitosanl；CS1R: Chitosanl+CBD-RGD.

-：無添加5-aza；+：添加5-aza；X：無細胞球.

由表5與第九、十圖可發現培養於組織培養板之大鼠脂肪幹細胞皆無法成球，在聚乙烯醇上之大鼠脂肪幹細胞在第三天細胞會聚集最大，但之後不管有無加5-aza，細胞皆會從聚集的細胞球跑出，所以在第11天時細胞呈現形態與培養於組織培養板上雷同。在CS3中，第一天可發現細胞逐漸聚集成細胞球，球大小約35μm；第三天，可發現一顆顆的細胞球，大小比第一天大些，約70μm；但繼續培養，會發現較大顆細胞球會逐漸漂走，在第11天發現CS3(-)比CS3(+)的細胞球較小顆。在CS1中，第一天也可發現細胞逐漸聚集成細胞球，球大小約25μm；第三天，可發現一顆顆的細胞球，大小比第一天大些，約55μm；雖然CS1所形成的球比CS3形成的小要小，但球就不易漂走；CS1(-)和CS1(+)在第11天的細胞球都約55μm。在CS1R中，第一天發現細胞未成球，細胞攤開貼在材料上，與TCPS相似，但有逐漸聚集的趨勢；第三天，可發現一顆顆大的細胞球，最大顆有達到250μm；CS1R上形成的球都很大顆，但卻幾乎不會漂走；在第11天，CS1R所形成細胞球比CS3和CS1大100μm以上。在第11天，會發現CS3、CS1、CS1R細胞所聚集的球，有些細胞會跑出細胞球，未加5-aza的組別比有加5-aza的組別，細胞跑出細胞球的趨勢更盛。

因此，第一部分的實驗結果為CS1薄膜最佳，細胞球越大分化效果越好，但PVA聚集的大球會再跑出去貼回材料上，而CS3留不住大球，而使剩下的細胞球比CS1要小，所以分化效果較CS1差。

比較第一部分的實驗結果，脂肪幹細胞轉換為心肌細胞在材料PVA、CS3、CS1薄膜的基因表現上，由前期轉錄因子的基因GATA4來看，CS1(+)和CS1(-)比其他組有更好的表現；而後期心肌蛋白的基因α-MHC，CS1(+)有最好的表現。故第二部份的實驗以CBD-RGD改質CS1的CS1R及CS1為主。

第二部分的實驗在第三天細胞會逐漸聚集成球，細胞球大小比CS3和CS1大很多，卻不會像CS3形成的大球容易飄走影響分化。從實驗中看出，CS1R(+)和CS1R(-)在分化到第11天時，球的大小都在155μm左右，但添加5-aza的CS1R(+)分化能力較佳且與從細胞球跑出的細胞寡；以RT-PCR分析驗證，CS1R(+)在GATA4、α-MHC與Troponin I都呈現出比CS1R(-)分化能力較好的趨勢，所以有加5-aza能確實增加分化效果；球的大小與球的形成也決定了心肌分化效果，CS1R>CS1>TCPS。

由免疫染色也可發現，GATA4與α-MHC都只有在細胞球的地方表現，單一顆細胞幾乎無螢光表現，跑出細胞球的細胞也無螢光表現。CBD-RGD改質CS4的基因表現第十一圖可看出前期基因GATA4、後期基因α-MHC Troponin I，分化能力最好為CSR(+)，其次為CSR(-)，所以添加5-aza對於心肌分化是有幫助的。也由此可看出CBD-RGD改質CS1確實比未改質的CS1有更好的分化能力。因此，脂肪幹細胞在CS1薄膜和CS1R薄膜，在基因表現與免疫化學染色上都有突出的心肌分化效果。

另外，CBD-RGD改質之生物高分子包括但不限於幾丁聚醣，本發明提及之生物相容性高分子皆可用CBD-RGD改質以增進成體幹細胞成球狀。

實施例4

以二種幾丁聚醣膜培養牙齦幹細胞及***纖維母細胞

4.1　幾丁聚醣膜製備

利用中黏度的幾丁聚醣-1、去乙醯度77.7%、平均分子量約為510kDa的1%幾丁聚醣(購於Fluka)溶於1%乙酸(購於Showa)，過濾後塗佈於15mm蓋玻片(購於Marienfeld)。幾丁聚醣薄膜於室溫風乾，以0.5N氫氧化鈉溶液中和幾丁聚醣的酸性。再以二次蒸餾水清洗幾丁聚醣薄膜上多餘的氫氧化鈉。再將所有的幾丁聚醣膜浸於75%酒精和照射紫外線以達到殺菌效果。該幾丁聚醣膜最後以磷酸鹽緩衝液清洗掉多餘的75%酒精。為比較幾丁聚醣的結果，另以去乙醯度86%、分子量約400kDa的幾丁聚醣膜(購於Sigma)以上述相同方式製備。在本實施例中，以幾丁聚醣-1代表幾丁聚醣(Fluka)，以幾丁聚醣-2代表幾丁聚醣(Sigma)。

4.2　人類牙齦幹細胞及人類***纖維母細胞萃取和培養

由健康成人牙齦中取得人類牙齦組織。人類牙齦幹細胞培養於含有最低必須α培養液(α-MEM,購於Gibco)加10%胎牛血清和2%抗生素-抗真菌藥物(2 units/ml盤尼西林(基底)、2 μg/ml鏈黴素(基底)和5 ng/ml兩性黴素)(購於Gibco)的細胞培養瓶(Corning)中，培養於37℃，5% CO₂ 的培養箱中。每兩天更換基本培養液一次。在人類牙齦幹細胞覆蓋達60%到70%時以0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液(購於Gibco)收取。本實施例使用第三到七代的牙齦幹細胞。

經由取得健康成人的***纖維母細胞(Human foreskin fibroblasts,HSF)。人類***纖維母細胞以含高糖源之DMEM(購於Gibco)添加10%胎牛血清(購於Gibco),200 mM穀氨醯胺(購於Gibco),1% MEM非必需氨基酸100X溶液(購於Sigma)，和1%盤尼西林/鏈黴素(5000 units/mL盤尼西林(基底)和5000μg/mL鏈黴素(基底))培養於細胞培養瓶中。HSF培養於37℃，5% CO₂ 的培養箱中，每兩天更換基本培養液一次。在人類***纖維母細胞覆蓋達80%到90%時以0.25%胰蛋白酶/乙二胺四乙酸溶液(購於Gibco)收取。本實施例使用第28代的***纖維母細胞(HSF)。

4.3　人類牙齦幹細胞於幾丁聚醣薄膜上之形態分析與分化為軟骨細胞的情形

人類牙齦幹細胞(4×10⁴ cells/ml)植入每一置於24孔組織培養板中之幾丁聚醣膜，每兩天更換培養液一次。

細胞植入後三天，加入軟骨細胞誘導培養液以誘導二種幾丁聚醣膜和TCPS上人類牙齦幹細胞的軟骨形成。軟骨細胞誘導培養液含有含高糖源之DMEM(購於Gibco)、10ng/ml的TGF-β3(CytoLab/PeproTech,購於Rehovot,Israel)、10^-7 M的dexamethasome(購於Sigma)、50μg/ml的1-抗壞血酸-2-磷酸(購於Sigma)，40μg/ml的L-脯氨酸(購於Sigma)、10μg/ml的ITS-預混料10×(購於Sigma)、10%的胎牛血清(購於Gibco)，和2%的抗生素-抗真菌劑。人類牙齦幹細胞培養於含誘導培養液之培養箱中7天和14天，每兩天更換誘導培養液一次。人類牙齦幹細胞培養於幾丁聚醣-1、幾丁聚醣-2和TCPS薄膜上植入後三天的形態見第十二圖。

4.4　人類***纖維母細胞於幾丁聚醣薄膜上之形態分析與分化為軟骨細胞的情形

另以相同條件之人類***纖維母細胞做為對照組，人類***纖維母細胞(4×10⁴ cells/ml)植入每一置於24孔組織培養板中之幾丁聚醣薄膜和TCPS，繼續以基本生長培養液和軟骨細胞誘導培養液培養，每兩天更換培養液一次，人類***纖維母細胞培養於幾丁聚醣-1薄膜上植入後三天的形態見第十二圖。

請參閱第十二圖，培養於幾丁聚醣-1薄膜上之人類***纖維母細胞無球體形成(第十二圖A)。而培養於幾丁聚醣-1薄膜上之人類牙齦幹細胞有球體形成(第十二圖B)，此清楚顯示並非所有的細胞培養於幾丁聚醣-1薄膜上皆會形成球體，因為在本實施例中，本身並不會形成球體的人類牙齦幹細胞卻可於幾丁聚醣-1薄膜上形成球體，而人類***纖維母細胞並未形成。第十二圖D即顯示人類牙齦幹細胞培養於TCPS上無球體形成的情況。此外，人類牙齦幹細胞培養於不同分子量的幾丁聚醣薄膜時，形成球的比例也不相同；在第十二圖(B、C)，在人類牙齦幹細胞植入後三天，培養於幾丁聚醣-1薄膜形成之球體比在幾丁聚醣-2薄膜上來得多。這表示幾丁聚醣-1可能較幾丁聚醣-2容易誘導人類牙齦幹細胞球體的形成。

並可進一步參閱第十三圖，係顯示人類牙齦幹細胞培養於幾丁聚醣-1上在植入後12、14、16、18、20、22和24小時同一範圍的活細胞造影。培養於幾丁聚醣-1上之人類牙齦幹細胞於植入後12小時開始形成球體，24小時後初步形成球體。剛植入時人類牙齦幹細胞貼附於幾丁聚醣-1上呈現類纖維的形態。但隨著培養時間的增加，越來越多的人類牙齦幹細胞聚集成球，而貼附於幾丁聚醣-1的人類牙齦幹細胞越來越少。

另外，參閱第十四圖顯示培養於幾丁聚醣和TCPS，有無軟骨誘導培養液在植入後0到3天、加入軟骨誘導培養液後0、1、2、7和14天之人類牙齦幹細胞形態。人類牙齦幹細胞在整個培養過程中為類纖維的形態。隨著細胞培養時間增長，人類牙齦幹細胞形成相對越來越大的細胞球體。此外，許多人類牙齦幹細胞看似自細胞球中遷出，形成細胞團和細胞群。當在添加基本生長培養液之幾丁聚醣-1薄膜上之人類牙齦幹細胞細胞球數量隨時間漸增，大約在軟骨誘導後14天(或植入後17天)看起來似乎有自球體的分泌物。另一方面，培養於TCPS之人類牙齦幹細胞則完全沒有形成球狀。

由前述結果可知，不是所有培養於幾丁聚醣的細胞都會形成球體，例如人類***纖維母細胞，也不是所有類型的幾丁聚醣(例如幾丁聚醣-1和幾丁聚醣-2)都有相同誘導細胞成球的效果。培養於幾丁聚醣薄膜上之人類牙齦幹細胞比培養於TCPS之人類牙齦幹細胞有較高的軟骨分化潛能。特別重要的是，培養於無軟骨誘導之幾丁聚醣薄膜的人類牙齦幹細胞之軟骨細胞分化潛能竟能比培養於有軟骨誘導之TCPS上人類牙齦幹細胞要高。換句話說，人類牙齦幹細胞之軟骨細胞分化潛能可因單純培養於本發明幾丁聚醣薄膜上而提升。

在確定本發明人類牙齦幹細胞球具有多潛能性和幹性，係藉由NANOG和Oct 4兩種幹性標記決定未分化幹細胞的自我更新過程，因此，NANOG和Oct 4常被用來作為區別未分化細胞的標記，Oct 4特別用來防止細胞分化。另外，神經脊細胞為一短暫多能和遷移能力的細胞群。特定兩段神經脊SLUG和Sox10決定神經脊的規範及分化。本實施例中，我們發現SLUG、Sox 10、NANOG和Oct 4基因表現在培養於幾丁聚醣薄膜之人類牙齦幹細胞皆比培養於TCPS之人類牙齦幹細胞高。這表示只形成於幾丁聚醣上之人類牙齦幹細胞的球體與一般類纖維形態相比，有較高的神經脊基因表現和幹性基因表現。換句話說，形成球體的人類牙齦幹細胞與短暫多能、遷移能力且大多數皆為未分化的細胞相關。另外，在人類牙齦幹細胞球體時似乎在多能、遷移能力和幹性上有增加。這可在植入後0到3天人類牙齦幹細胞在幾丁聚醣薄膜上之球體在SLUG、Sox 10、NANOG和Oct 4基因表現上得到證實。因此，球體的形成幫助維持人類牙齦幹細胞的多潛能性、遷移能力以及幹性。另外，從活細胞成像中觀察上述人類牙齦幹細胞在幾丁聚醣上成球形，球形由人類牙齦幹細胞的連續細胞-基質交互作用和細胞-細胞交互作用導致動態運動而形成。這球體的動態狀態亦證實從神經脊基因表現指出球體中人類牙齦幹細胞的遷移能力。本研究中觀察到人類牙齦幹細胞形成的所有形態中，形成球體內的人類牙齦幹細胞持續進出球體。當人類牙齦幹細胞自球體內遷出，人類牙齦幹細胞會散出並以類纖維形態附著於幾丁聚醣上。因此，球體形態的人類牙齦幹細胞仍維持多潛能性和幹性，這是在類纖維形態的人類牙齦幹細胞所沒有的。

另外，將骨髓間葉幹細胞(bone marrow-derived MSCs)培養於幾丁聚醣-1膜上，亦會形成球形(見第十五圖)。

實施例5

以幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸膜培養胎盤、脂肪幹細胞

5.1　幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸(HA)薄膜製備

幾丁聚醣-1粉末分子量為510kDa(購於Fluka)溶於1%乙酸以取得1%幾丁聚醣溶液。溶液(300μl)塗佈於24孔培養板的每一孔中。樣本置於層流櫃24小時候溶劑蒸發後，即為幾丁聚醣膜。每孔加入氫氧化鈉(0.5N)停留30分鐘，再以磷酸鹽緩衝液清洗數次。

製備幾丁聚醣-透明質酸膜，透明質酸溶液(購於科研或資生堂皆有，效果皆相同)300μl以0.1、0.5或2.5mg/cm² 之不同的量加入幾丁聚醣膜中。透明質酸帶有很強的負電，會立刻與帶正電的幾丁聚醣膜結合。幾丁聚醣和不同透明質酸劑量的幾丁聚醣-透明質酸膜以C、CH0.1、CH0.5和CH2.5來簡稱。不同透明質酸量的幾丁聚醣-透明質酸膜以磷酸鹽緩衝液清洗5次以去除未鍵結的透明質酸然後凍乾。CH0.1、CH0.5和CH2.5的有效吸收率分別為94%、95%和89%。透明質酸被吸收的總量依初始添加透明質酸量增加而增加。另外並以未加生長因子的聚苯乙烯組織培養板(tissue culture polystyrene surface,TCPS)作為對照組。

5.2　人類胎盤幹細胞(hPDMSC)之萃取和培養

取健康母體懷孕後期(38-40周)捐贈之胎盤。將胎盤以磷酸鹽緩衝液清洗幾次然後將之打碎和在37℃以0.25%胰蛋白酶酵素處理約10分鐘。在打碎和酵素處理後，此勻漿培養於DMEM-LG(Dulbecco's Modified Eagle Medium-low glucose)(購於Gibco)完全培養基，添加10%胎牛血清(購於Gibco)、10 mg/l盤尼西林-鏈黴素和10 mg/l L-穀胺醯胺(購於Tedia)。細胞培養於37℃水氣飽和的空氣，以及5%的CO₂ 。每週更換培養液兩次。

5.3　脂肪幹細胞(hADAS)之萃取和培養

脂肪幹細胞可於脂肪組織中取得。從脂肪組織中以酶萃取出細胞。先將脂肪組織打碎成數塊再以200 U/ml第一型膠原酶(購於Sigma-Aldrich)磷酸鹽緩衝液中在37℃輕拌30分鐘。將勻漿培養於DMEM-LG(Dulbecco's Modified Eagle Medium-low glucose)(購於Gibco)完全培養基中，添加10%(v/v)胎牛血清(購於Gibco)、10 mg/l盤尼西林-鏈黴素。培養箱維持37℃/5% CO₂ 。每週更換培養液兩次。

5.4　胎盤幹細胞和脂肪幹細胞於幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸薄膜上的形態分析及分化為軟骨細胞的情形

脂肪幹細胞和胎盤幹細胞(3×10⁴ 個細胞)植入每一含基本培養液之幾丁聚醣膜培養三天後，將培養液更換為軟骨細胞誘導培養液。誘導培養液為DMEM-LG，含有10 ng/ml TGF-β3(購於CytoLab/Peprotech,Rehovot,Israel)、0.1 μM dexamethasome、50 μg/ml L-ascobate-2-磷酸,40 μg/ml L-脯氨酸(Sigma)、1%胰島素-轉鐵因子-硒補充劑(ITS+premix)100×(購於Sigma)以及1%盤尼西林-鏈黴素。誘導培養液每週更換兩次。另一組(植入後3天)仍以基本培養液培養作為控制組。

脂肪幹細胞在培養於幾丁聚醣-透明質酸薄膜上1天後，脂肪幹細胞聚集而成的三維球形成。隨著幾丁聚醣膜上的透明質酸增加，形成的球體越明顯，且數量和大小皆較大。脂肪幹細胞和胎盤幹細胞培養於TCPS、幾丁聚醣、幾丁聚醣-透明質酸膜上第3天的形態如第十六圖所示。培養於薄膜上3天後，培養於幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸薄膜之脂肪幹細胞和胎盤幹細胞皆形成球狀。不同細胞在這些膜上平均細胞球的大小列於表6。

表6胎盤幹細胞與脂肪幹細胞在不同膜上形成之球體平均大小

*每一平均值為至少20個球體直徑之平均

在確定本發明在培養期間脂肪幹細胞和胎盤幹細胞的幹性標記基因(Oct4、Sox2和Nanog)的表現。在基本培養液的脂肪幹細胞和胎盤幹細胞之Oct4、Sox2和Nanog的mRNA表現以即時RT-PCR分析。在第十七圖顯示脂肪幹細胞培養於不同材料和TCPS對照的Oct4、Sox2和Nanog之mRNA表現量化結果。在幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸之Oct4、Sox2和Nanog基因表現在第3天增加，然後在第7和第10天降低。在第一天和第三天，這些基因的表現在CH2.5薄膜上為最高(p<0.05)。

大致上，胎盤幹細胞的這些基因可被幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸膜上的向上調節可維持七天的時間。在脂肪幹細胞中，這些基因的向上調節可維持三天的時間。在脂肪幹細胞中，CH2.5比其他材料維持這些基因效果較好。在胎盤幹細胞中，CH 0.5與CH 2.5維持這些基因特性表現的效果一樣好。

脂肪幹細胞和胎盤幹細胞培養於幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸(與TCPS)在軟骨誘導後7天，以RT-PCR量化脂肪幹細胞和胎盤幹細胞的軟骨細胞基因表現，結果如第十八圖。在形成球體後，軟骨基因表現(Sox-9、aggrecan和collagen type Ⅱ)在軟骨誘導下顯著增加(第十八圖B、D、F)，與培養於基本培養液比較(第十八圖A、C、E)。當脂肪幹細胞培養於有基本培養液之幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸時，這些基因有高度的表現(與TCPS/基本培養液比較)。另一方面，當胎盤幹細胞培養於有基本培養液之幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸上時，這些基因呈低度表現(與TCPS/基本培養液比較)。培養於有基本培養液的幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸之脂肪幹細胞的軟骨分化能力比胎盤幹細胞要好，特別是幾丁聚醣-透明質酸。由上述結果顯示，胎盤幹細胞和脂肪幹細胞在有軟骨誘導液的情況下，培養於幾丁聚醣-透明質酸之軟骨基因表現為最高，其次為幾丁聚醣，最低為TCPS。因此，有吸收透明質酸之幾丁聚醣膜，可大幅增進胎盤幹細胞和脂肪幹細胞聚集形成一球體細胞群體，且維持胎盤幹細胞和脂肪幹細胞自我更新和幹性，以及往後增進軟骨的分化能力。

本發明實施例誘導胎盤幹細胞和脂肪幹細胞在薄膜上自發地形成立體球體，在塗佈透明質酸之幾丁聚醣上形成許多大球體，亦證實透明質酸能增進球體形成。

實施例6

以幾丁聚醣-銀耳多醣培養脂肪幹細胞、神經幹細胞

6.1　幾丁聚醣-銀耳多醣膜製備

利用實施例5之1%的幾丁聚醣-1(購於Fluka)做為基材，以實施例5的幾丁聚醣膜製備方法製備，先加入3mg的幾丁聚醣於24孔培養板的每一孔中，每孔再加入3mg銀耳多醣，比例為1：1。

6.2　萃取和培養脂肪幹細胞、神經幹細胞

脂肪幹細胞的萃取及培養同實施例5。

神經幹細胞的萃取及培養同實施例2。

6.3　脂肪幹細胞、神經幹細胞培養於幾丁聚醣-銀耳多醣膜上的形態

脂肪幹細胞培養於幾丁聚醣-銀耳多醣膜上24小時和48小時的形態如第十九圖，另外神經幹細胞亦成球形。

幾丁聚醣與銀耳多醣之比例包括但不限於1：1，約3：0.4至3：4.5皆可。

實施例7

以幾丁聚醣、幾丁聚醣-透明質酸、聚己內酯、聚己內酯-透明質酸膜培養肺幹細胞(lung stem cell,LSC)

7.1　幾丁聚醣、幾丁聚醣-透明質酸、聚己內酯(polycaprolactone,PCL)、聚己內酯-透明質酸膜製備

幾丁聚醣、幾丁聚醣-透明質酸脂製備與實施例5相同。

取分子量80kDa之聚己內酯(購於Sigma)，溶於1,4-二氧六環(1,4-dioxane)，即為11%之聚己內酯。將上述聚己內酯鑄於玻片，即為聚己內酯薄膜。然後以大氣電漿(能量1 kW,購於德國Plasmatreat)以距離10 mm速度6 m/min掃描後，將300 ul 2.95 mg/ml透明質酸水溶液滴在上面，隔夜後洗去，透明質酸就會電漿接枝於表面，密度為0.5 mg/cm² 。

7.2　小鼠肺幹細胞(lung stem cell,LSC)之萃取及培養

小鼠肺幹細胞係依據Ling TY,Kuo MD,Li CL,Yu AL,Huang YH,Wu TJ,Lin YC,Chen SH,Yu J. Identification of pulmonary Oct-4+ stem/progenitor cells and demonstration of their susceptibility to SARS coronavirus(SARS-CoV) infection in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Jun 20;103(25):9530-5. Epub 2006 Jun 13，由小鼠肺臟所取得。

7.3　肺幹細胞培養於幾丁聚醣、幾丁聚醣-透明質酸、聚己內酯及聚己內酯-透明質酸膜之結果

肺幹細胞在幾丁聚醣以及幾丁聚醣-透明質酸上會形成球狀，且nanog/oct4基因表現提升。

而在聚己內酯及聚己內酯-透明質酸膜上亦會成球(見第二十圖)，聚己內酯表面呈晶狀排列，故看得到圓晶(似表面龜裂)；且幹性基因nanog/oct4表現提升(第二十一圖)。

因此，該些結果顯示本發明提供之一多能成體幹細胞、其醫藥組合物、以及用於生產該成體幹細胞的方法，係藉由生物相容性高分子接觸，確實能達到細胞自我更新及維持幹性(stemness)的突出效果。

<110>　國立台灣大學

<120>　使成體幹細胞產生為一球體細胞群體的方法

<130>　990544-I1

<160>　1

<170>　PatentIn version 3.3

<210>　1

<211>　48

<212>　PRT

<213>　人工合成

<220>

<223>　纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)

<400>　1

第一圖係培養於a.明膠和b.組織培養板(TCPS)上三天之神經幹細胞；無任何球體形成。比例尺為100μm。

第二圖係為培養於不同幾丁聚醣(a.幾丁聚醣-1 b.幾丁聚醣-2)之神經幹細胞在第1、2、3天之形態；比例尺為100μm。

第三圖係為培養於幾丁聚醣-1之神經幹細胞五天後利用掃描式電子顯微鏡(SEM)結果：a.俯視圖b.側視圖。

第四圖係為第a. 3 b. 5 c. 7 d. 15 e. 20 f. 25天細胞形態(左)和F1B-螢光綠蛋白表現(右)；比例尺為200μm。

第五圖係為培養於幾丁聚醣-1之神經幹細胞在a. F1B-螢光綠蛋白和b. nestin(免疫染色)第1、4、21天的表現；比例尺為100μm。

第六圖係為培養於幾丁聚醣-1之a. DAPI(細胞核)和b. β3-tubulin(免疫染色)在第4、14、21天之球體形態；比例尺為100μm。

第七圖係為培養於四種2D褐藻酸鹽膜(a. A#1 b. A#2)之神經幹細胞/神經前驅細胞三天後的型態；比例尺為250μm。

第八圖係為NSPCs培養於褐藻酸鹽薄膜和TCPS上之分化能力比較；TuJ1為神經細胞、GFAP為神經膠細胞。

第九圖係為大鼠脂肪幹細胞在TCPS(T)、PVA(P)材料上培養第1天、3天和第11天的細胞球形態；-：無添加5-aza；+：添加5-aza

第十圖係為大鼠脂肪幹細胞(rADASs)在Chitosan3(CS3)、Chitosan 1(CS1)、Chitosan1+CBD-RGD(CS1R)材料上培養第1天、3天和第11天的細胞球形態；-：無添加5-aza；+：添加5-aza

第十一圖係為大鼠脂肪幹細胞(rADASs)在TCPS(T)、Chitosan 1(CS1)、Chitosan1+CBD-RGD(CS1R)材料上利用RT-PCR實驗後的毛細管電泳圖；Cardiomyocyte positive(CP)：無添加5-aza；+：添加5-aza。

第十二圖係為人類***纖維母細胞培養於A.幾丁聚醣-1，人類牙齦幹細胞培養於B.幾丁聚醣-1 C.幾丁聚醣-2 D. TCPS植入三天後之細胞形態；比例尺為100μm；放大倍率為10倍。

第十三圖係為人類牙齦幹細胞培養於幾丁聚醣膜上在植入後A. 12 B. 14 C. 16 D. 18 E. 20 F. 22 G. 24小時同一範圍之形態；比例尺為100μm，放大倍率為10倍。

第十四圖係為人類牙齦幹細胞培養於幾丁聚醣在植入後第A. 0 B.1 C. 2 D. 3天之形態；和培養於TCPS在植入後第E. 0 F. 1 G. 2 H. 3天之形態；人類牙齦幹細胞培養於I.含誘導培養液之幾丁聚醣J.含基本培養液之幾丁聚醣和K.含誘導培養液之TCPS L.含基本培養液之TCPS 1天後之形態；人類牙齦幹細胞培養於M.含誘導培養液之幾丁聚醣N.含基本培養液之幾丁聚醣和O.含誘導培養液之TCPS P.含基本培養液之TCPS在軟骨誘導後2天之形態；人類牙齦幹細胞培養於Q.含誘導培養液之幾丁聚醣R.含基本培養液之幾丁聚醣和S.含誘導培養液之TCPS T.含基本培養液之TCPS在軟骨誘導後7天之形態；人類牙齦幹細胞培養於U.含誘導培養液之幾丁聚醣V.含基本培養液之幾丁聚醣和W.含誘導培養液之TCPS X.含基本培養液之TCPS在軟骨誘導後14天之形態；比例尺為100μm，放大倍率為10倍。

第十五圖係為骨髓間葉幹細胞培養於幾丁聚醣膜上4天後之細胞形態。

第十六圖係為不同幹細胞培養於不同材料上。(A)培養於TCPS之細胞形態(B)培養於含基本培養液之幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸三天後之細胞形態。

第十七圖係為脂肪幹細胞培養於含基本培養液幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸和TCPS第10天的幹性基因(Oct4、Sox2和Nanog)之mRNA表現量化結果。

第十八圖係為培養於幾丁聚醣和幾丁聚醣-透明質酸膜(與TCPS比較)在軟骨誘導後7天以RT-PCR量化脂肪幹細胞和胎盤幹細胞的軟骨細胞基因表現。

第十九圖係為培養脂肪幹細胞於幾丁聚醣-銀耳多醣膜在(A) 24小時，及(B) 48小時後之形態。

第二十圖係為培養肺幹細胞於聚己內酯、聚己內酯-幾丁聚醣膜上第1、2天之形態。

第二十一圖係為肺幹細胞培養於聚己內酯、聚己內酯-幾丁聚醣膜上第1、3天幹性基因(actin、Oct4、Sox2和Nanog)之mRNA表現結果。

Claims (20)

1. 一種使成體幹細胞產生為一球體細胞群體的方法，包含：體外培養成體幹細胞於一生物相容性高分子形成的一薄膜上，其中該生物相容性高分子係為去乙醯度為60~100%之幾丁聚醣、分子量為9,600~132,000之褐藻酸鹽、分子量為64~96kDa之聚己內酯或其任一組合；以及收集由成體幹細胞聚集成之一球體細胞群體，其中該球體細胞群體會擴大且具有自我更新及分化(differentiation)為一體細胞的能力。
2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該成體幹細胞選自由神經幹細胞、神經前驅細胞、脂肪幹細胞、牙齦幹細胞、骨髓間葉幹細胞、肺幹細胞及胎盤幹細胞所組成之群組。
3. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該生物相容性高分子薄膜可由塗佈或接枝的方式被覆於任何基材上。
4. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該去乙醯度為60~100%之幾丁聚醣進一步與透明質酸結合，且幾丁聚醣與透明質酸的比例約為3：0.177至3：4.425(w/w)。
5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該去乙醯度為60~100%之幾丁聚醣進一步與銀耳多醣結合，且幾丁聚醣與銀耳多醣的比例約為3：0.4至3：4.5(w/w)。
6. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該分子量為64~96kDa之聚己內酯進一步與透明質酸結合。
7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該體細胞為一神經細胞。
8. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該球體細胞群體進一步具有 分化為一心肌細胞或一軟骨細胞的能力。
9. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中當該球體細胞群體為該脂肪幹細胞時，會分化為該心肌細胞。
10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，進一步包含使該脂肪幹細胞與5-azacytidine接觸，使脂肪幹細胞分化為該心肌細胞。
11. 如申請專利範圍第8項所述之方法，其中當該球體細胞群體為該牙齦幹細胞、該脂肪幹細胞、或該胎盤幹細胞時，會分化為該軟骨細胞。
12. 如申請專利範圍第11項所述之方法，進一步包含使該牙齦幹細胞、該脂肪幹細胞、或該胎盤幹細胞與一轉型生長因子β3(TGF-β3)接觸，使分化為該軟骨細胞。
13. 一種具有分化能力的成體幹細胞，係由以下方法所製成，包含：使一成體幹細胞與一生物相容性高分子形成的一薄膜接觸一段有效時間，其中該生物相容性高分子係為去乙醯度為60~100%之幾丁聚醣、分子量為9,600~132,000之褐藻酸鹽、分子量為64~96kDa之聚己內酯或其任一組合；其中該成體幹細胞會形成一球體細胞群體，該球體細胞群體會擴大並具有分化為一神經元細胞、神經膠細胞、軟骨細胞或心肌細胞的能力。
14. 如申請專利範圍第13項所述之成體幹細胞，其中該成體幹細胞選自由神經幹細胞、神經前驅細胞、脂肪幹細胞、牙齦幹細胞、骨髓間葉幹細胞、肺幹細胞及胎盤幹細胞所組成之群組。
15. 如申請專利範圍第13項所述之成體幹細胞，其中該生物相容性高分子進一步包含一具有如SEQ ID NO：1胺基酸序列之纖維素結合功能區域-RGD貼附序列(CBD-RGD)。
16. 如申請專利範圍第13項所述之成體幹細胞，其中該去乙醯度為60~100%之幾丁聚醣進一步與透明質酸結合，且幾丁聚醣與透明質酸 的比例約為3：0.177至3：4.425(w/w)。
17. 一種醫藥組合物，包含如申請專利範圍第13項所述之成體幹細胞及一藥學上可接受載體。
18. 一種篩選具有自我更新能力成體幹細胞的方法，包含使候選成體幹細胞與一生物相容性高分子形成的一薄膜接觸一段有效時間，然後判定具有形成球體細胞群體的成體幹細胞為具有自我更新能力的成體幹細胞，其中該生物相容性高分子係為去乙醯度為60~100%之幾丁聚醣、分子量為9,600~132,000之褐藻酸鹽、分子量為64~96kDa之聚己內酯或其任一組合。
19. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該有效時間較佳為1日到4日。
20. 如申請專利範圍第18項所述之方法，其中該生物相容性高分子薄膜可由塗佈或接枝的方式被覆於任何基材上。