WO2022255839A1 - 신규한 yhhs 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 - Google Patents

신규한 yhhs 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 Download PDF

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WO2022255839A1
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amino acid
yhhs
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박혜민
심희진
정휘민
이진남
최진근
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12Y205/01065—O-Phosphoserine sulfhydrylase (2.5.1.65)
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    • C40B40/08—Libraries containing RNA or DNA which encodes proteins, e.g. gene libraries

Definitions

  • the present application relates to YhhS variants and methods for producing O-phosphoserine, cysteine and cysteine derivatives using the same.
  • L-cysteine is an important amino acid in the sulfur metabolism of all organisms. It is used in the synthesis of proteins, glutathione, biotin, methionine and other sulfur-containing metabolites in vivo, such as keratin in hair, and is used as a precursor for coenzyme A biosynthesis. do.
  • the present inventors have completed the present application by identifying a variant of a membrane protein having an activity capable of excreting OPS produced in an OPS-producing strain to the outside of the cell, and confirming that the variant improves OPS excretion.
  • One object of the present application is to provide a YhhS variant in which the amino acid corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.
  • Another object of the present application is to provide a YhhS variant in which isoleucine, an amino acid corresponding to position 241 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with glutamine.
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the variant of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a microorganism of the genus Escherichia comprising the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing O-phosphoserine, comprising culturing a microorganism containing the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant in a medium.
  • Another object of the present application is a) culturing an O-phosphoserine-producing microorganism comprising the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant in a medium to produce O-phosphoserine or a medium containing the same. ; And b) contacting O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) or a microorganism expressing the same, O-phosphoserine produced in step a) or a medium containing the same and a sulfide , To provide a method for producing cysteine or a derivative thereof.
  • O-phosphoserine-producing microorganism comprising the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant in a medium to produce O-phosphoserine or a medium containing the same.
  • One aspect of the present application provides a YhhS variant in which the amino acid corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.
  • YhhS refers to a polypeptide exhibiting an O-phosphoserine (OPS) excretion activity, specifically a membrane protein having an activity capable of excreting OPS out of the cell.
  • OPS O-phosphoserine
  • the YhhS may be a YhhS MFS (major facilitator superfamily) transporter, which is a membrane protein having an activity capable of excreting OPS out of cells.
  • the YhhS has been identified as a protein exhibiting an activity of releasing OPS from E. coli in which growth inhibition is released under conditions in which an excessive amount of OPS is present.
  • OPS O-phosphoserine
  • OPSS OPS sulfhydrylase
  • YhhS of the present application may be used in combination with the YhhS MFS transporter.
  • the amino acid sequence of YhhS can be obtained from NCBI's GenBank, a known database.
  • the amino acid sequence may be a polypeptide having YhhS activity encoded by the yhhS gene, and more specifically SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the amino acid corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be a polar amino acid.
  • the polar amino acid may be, for example, serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine or glutamine, and may be specifically serine.
  • the variant of the present application may be one in which a polar amino acid corresponding to position 129 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with a non-polar amino acid.
  • the non-polar amino acid may be, for example, glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan or proline, specifically glycine or alanine.
  • the variant has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97% of the amino acid sequence in which the amino acid corresponding to position 129 is glycine or alanine based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • sequence additions or deletions naturally occurring mutations, silent mutations or conservations to the amino acid sequence N-terminus, C-terminus and/or within that do not alter the function of the variants of the present application. This is the case with redundant substitution.
  • conservative substitution means the substitution of one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such variants may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities.
  • amino acid substitutions can generally occur based on similarities in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and arpartic acid.
  • Nonpolar amino acids among amino acids with uncharged side chains include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan, and proline, and are polar or hydrophilic ( hydrophilic) amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine, and aromatic amino acids among the amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine.
  • variant means that one or more amino acids have been subjected to conservative substitution and/or modification, which is different from the amino acid sequence before the mutation, but the functions or properties refers to a polypeptide that is maintained.
  • variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide and evaluating the properties of the modified polypeptide. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or reduced compared to the polypeptide before the mutation.
  • some variants may include variants in which one or more portions such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain are removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant may be used interchangeably with terms such as variant, variant, variant polypeptide, mutated protein, mutation and variant (in English, modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent, etc.) And, if the term is used in a mutated sense, it is not limited thereto.
  • the variant may be a polypeptide comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in which serine, an amino acid corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with glycine or alanine.
  • Variants may also include deletions or additions of amino acids that have minimal impact on the secondary structure and properties of the polypeptide.
  • a signal (or leader) sequence involved in protein translocation may be conjugated to the N-terminus of the variant, either co-translationally or post-translationally.
  • the variant may be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis.
  • homology means the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage.
  • identity means the degree of similarity between two given amino acid sequences or base sequences and can be expressed as a percentage.
  • homology and identity are often used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of conserved polynucleotides or polypeptides can be determined by standard alignment algorithms, together with default gap penalties established by the program used. Substantially homologous or identical sequences are generally capable of hybridizing with all or part of the sequence under moderate or high stringent conditions. It is obvious that hybridization also includes hybridization with polynucleotides containing common codons or codons in consideration of codon degeneracy in polynucleotides.
  • GAP program can define the total number of symbols in the shorter of the two sequences divided by the number of similarly arranged symbols (i.e., nucleotides or amino acids).
  • the default parameters for the GAP program are (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional penalty of 0.10 for each symbol in each gap (or 10 gap opening penalty, 0.5 gap extension penalty); and (3) no penalty for end gaps.
  • corresponding to refers to an amino acid residue at a recited position in a polypeptide, or an amino acid residue that is similar, identical, or homologous to a recited residue in a polypeptide. Identification of the amino acid at the corresponding position may be determining the specific amino acid in the sequence that references the specific sequence.
  • corresponding region generally refers to a similar or corresponding position in a related or reference protein.
  • any amino acid sequence can be aligned with SEQ ID NO: 1, and based on this, each amino acid residue of the amino acid sequence can be numbered with reference to the numerical position of the amino acid residue corresponding to the amino acid residue of SEQ ID NO: 1.
  • sequence alignment algorithms such as those described herein, can identify the location of amino acids, or locations where modifications such as substitutions, insertions, or deletions occur, compared to a query sequence (also referred to as a “reference sequence”).
  • Such alignments include, for example, the Needleman-Wunsch algorithm (Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), the Needleman program in the EMBOSS package (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al. , 2000), Trends Genet. 16: 276-277) may be used, but it is not limited thereto, and a sequence alignment program known in the art, a pairwise sequence comparison algorithm, and the like may be appropriately used.
  • Another aspect of the present application is to provide a YhhS variant in which isoleucine, an amino acid corresponding to position 241 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with glutamine or threonine.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 "YhhS” and “mutant” are as described in the other embodiments.
  • isoleucine an amino acid corresponding to position 241 based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, may be substituted with glutamine or threonine.
  • the variant has at least 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% of the amino acid sequence in which the amino acid corresponding to position 241 is glutamine or threonine based on the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. , 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7%, or may include an amino acid sequence having 99.9% or more homology or identity, as described in the other embodiments above.
  • variant of the present application may be one in which the amino acid corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid, and isoleucine, an amino acid corresponding to position 241, is substituted with glutamine or threonine.
  • the variant of the present application is an amino acid corresponding to the 246th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, aspartic acid is added to valine. substitution, and/or valine, an amino acid corresponding to position 330 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, may be further substituted with isoleucine.
  • amino acid corresponding to position 88 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be phenylalanine
  • amino acid corresponding to position 207 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 may be lysine.
  • the variant of the present application is SEQ ID NO: 2 in which serine, an amino acid corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, is substituted with glycine, and serine, an amino acid corresponding to position 129 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Isoleucine, an amino acid corresponding to position 241 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 1 substituted with alanine, isoleucine, an amino acid corresponding to position 241 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 1 substituted with glutamine Isoleucine, an amino acid corresponding to position 241 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 1 substituted with threonine, is substituted with threonine, aspartic acid, an amino acid corresponding to position 246, is substituted with valine, and position 330 Seq.
  • valine for aspartic acid corresponding to the 246th position
  • SEQ ID NO: 34 in which valine, the amino acid corresponding to the 330th position is substituted with isoleucine, or SEQ ID NO: 1 corresponding to the 129th position of the amino acid sequence It may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 in which serine, an amino acid, is substituted with glycine, and isoleucine, an amino acid corresponding to position 241, is substituted with glutamine.
  • the variant of the present application may be a polypeptide consisting of, or comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36.
  • the variant of the present application has 99% or more sequence identity (homology or identity) with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36 It may have, but at least 90% or more, 91% or more, 92% or more of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36 , 93% or more, 94% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, 99.1% or more, 99.2% or more, 99.3% or more, 99.4% or more, 99.5% or more, 99.6 % or greater, 99.7% or greater, 99.8% or greater, 99.9% or greater, or less than 100% sequence identity.
  • the variant of the present application may have YhhS activity.
  • the variants of the present application may have an activity to increase OPS excretion compared to the wild-type polypeptide.
  • the YhhS is as described in the other aspects above.
  • Another aspect of the present application is to provide a polynucleotide encoding a variant of the present application.
  • polynucleotide is a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are covalently linked in a long chain shape, and is a DNA or RNA strand of a certain length or more, more specifically, encoding the variant means a polynucleotide fragment.
  • the polynucleotide encoding the variant of the present application may include a base sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36 have.
  • the polynucleotide of the present application may have or include the sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 37.
  • polynucleotide of the present application may consist of or consist essentially of the sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 37.
  • polynucleotides of the present application are various in the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the variants of the present application in consideration of codon degeneracy or preferred codons in organisms intended to express the variants of the present application. Transformations can be made.
  • the polynucleotide of the present application has 70% or more, 75% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 37 has or comprises at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, and less than 100% of the sequence, or SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 7 or at least 70%, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95% homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 8 or SEQ ID NO: 9 or SEQ ID NO: 17 or SEQ ID NO: 35 or SEQ ID NO: 37 Or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and may consist of or essentially consist of a base sequence of less than 100%, but is not limited thereto.
  • the codon encoding the amino acid corresponding to the 129th position of SEQ ID NO: 1 may be one of the codons encoding glycine or alanine, encoding the amino acid corresponding to the 241st position
  • the codon to be may be one of the codons encoding glutamine or threonine
  • the codon encoding the amino acid corresponding to position 246 may be one of the codons encoding valine
  • the codon to do may be one of the codons encoding isoleucine.
  • the polynucleotide of the present application is not limited as long as it is a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a sequence that can hybridize under stringent conditions with a sequence complementary to all or part of the polynucleotide sequence of the present application.
  • the "stringent condition” means a condition that allows specific hybridization between polynucleotides. These conditions are described in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8).
  • polynucleotides with high homology or identity 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, Or a condition in which polynucleotides having 99% or more homology or identity hybridize and polynucleotides having lower homology or identity do not hybridize, or 60 ° C., which is a washing condition for normal southern hybridization, 1XSSC, 0.1% SDS, specifically 60 ° C, 0.1XSSC, 0.1% SDS, more specifically 68 ° C, 0.1XSSC, 0.1% SDS, at a salt concentration and temperature equivalent to 1 time, specifically 2 to 3 times washing conditions can be enumerated.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatches between bases are possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases that are capable of hybridizing to each other. For example, with respect to DNA, adenine is complementary to thymine and cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the entire sequence.
  • a polynucleotide having homology or identity to the polynucleotide of the present application can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55°C and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60 ° C, 63 ° C or 65 ° C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art according to the purpose.
  • Appropriate stringency for hybridizing the polynucleotides depends on the length of the polynucleotides and the degree of complementarity, parameters well known in the art (e.g., J. Sambrook et al., supra).
  • Another aspect of the present application is to provide a vector comprising the polynucleotide of the present application.
  • the vector may be an expression vector for expressing the polynucleotide in a host cell, but is not limited thereto.
  • the vector of the present application may include a DNA product containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable expression control region (or expression control sequence) so as to express the target polypeptide in a suitable host.
  • the expression control region may include a promoter capable of initiating transcription, an arbitrary operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome and can integrate into the genome itself.
  • Vectors used in the present application are not particularly limited, and any vectors known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A can be used as phage vectors or cosmid vectors, and pDZ-based, pBR-based, and pUC-based plasmid vectors , pBluescriptII-based, pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pSK-based, pSKH-based, pET-based, etc.
  • pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide may be inserted into a chromosome through a vector for chromosomal insertion into a cell. Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • a selection marker for determining whether the chromosome is inserted may be further included.
  • the selectable marker is used to select cells transformed with a vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule has been inserted, and can exhibit selectable phenotypes such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or surface polypeptide expression. markers may be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” means introducing a vector containing a polynucleotide encoding a target polypeptide into a host cell or microorganism so that the polypeptide encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it may be inserted into and located in the chromosome of the host cell or located outside the chromosome.
  • the polynucleotide includes DNA and/or RNA encoding a polypeptide of interest.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a genetic construct containing all elements required for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence necessary for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that the polynucleotide sequence is functionally linked to a promoter sequence that initiates and mediates the transcription of the polynucleotide encoding the target variant of the present application.
  • Another aspect of the present application is to provide a microorganism of the genus Escherichia comprising the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant.
  • the microorganism of the present application may include the mutant polypeptide of the present application, a polynucleotide encoding the polypeptide, or a vector containing the polynucleotide of the present application.
  • strain or microorganism
  • strain includes both wild-type microorganisms and naturally or artificially genetically modified microorganisms, and causes such as insertion of foreign genes or enhancement or inactivation of endogenous gene activity.
  • a microorganism whose specific mechanism is attenuated or enhanced due to, it may be a microorganism containing genetic modification for the production of a desired polypeptide, protein or product.
  • the microorganism of the present application includes a microorganism comprising any one or more of a vector comprising a variant of the present application, a polynucleotide of the present application, and a polynucleotide of the present application; microorganisms modified to express a variant of the present application or a polynucleotide of the present application; a microorganism (eg, a recombinant microorganism) expressing a variant of the present application or a polynucleotide of the present application; Or it may be a microorganism (eg, recombinant microorganism) having a variant activity of the present application, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application may be a microorganism capable of producing O-phosphoserine.
  • the microorganism of the present application is a microorganism naturally having YhhS or O-phosphoserine-producing ability, or a parent strain having no YhhS or O-phosphoserine-producing ability, or a variant of the present application or a polynucleotide encoding the same (or including the polynucleotide) vector) may be introduced and/or a microorganism endowed with O-phosphoserine-producing ability, but is not limited thereto.
  • the strain of the present application is a cell or microorganism that is transformed with a vector containing a polynucleotide of the present application or a polynucleotide encoding a variant of the present application and expresses the variant of the present application, and for the purpose of the present application
  • the strains of the application may include all microorganisms capable of producing O-phosphoserine, including the variants of the present application.
  • a polynucleotide encoding the variant of the present application is introduced into a natural wild-type microorganism or a microorganism that produces O-phosphoserine, whereby the YhhS variant is expressed, resulting in increased O-phosphoserine-producing ability. It may be a strain.
  • the recombinant strain with increased O-phosphoserine-producing ability is a natural wild-type microorganism or YhhS unmodified microorganism (i.e., a microorganism expressing wild-type YhhS (SEQ ID NO: 1) or a mutant YhhS (SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or sequence Microorganisms that do not express SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36) may have increased O-phosphoserine-producing ability, but are not limited thereto.
  • the target strain for comparing the increase in O-phosphoserine production ability, a microorganism into which wild-type YhhS has been introduced is CA07-0012 (KCCM 11121P, Republic of Korea Registered Patent No. 10-1381048 and US Patent Publication No. 10-2012-0190081), but is not limited thereto.
  • the recombinant strain with increased production capacity is about 1% or more, specifically about 1% or more, about 10% or more, about 20% or more, About 29% or more, about 30% or more, about 40% or more, about 50% or more, about 60% or more, about 70% or more, about 80% or more, about 90% or more, about 100% or more, about 110% or more, About 120% or more, about 130% or more, about 140% or more, about 144% or more, about 150% or more, about 160% or more, about 170% or more, about 180% or more, about 190% or more, about 200% or more, About 210% or more, about 220% or more, about 230% or more, about 233% or more, about 240% or more, about 250% or more, about 252% or more, about 260% or more, about 267% or more, about 270% or more, About 280% or more, about 290% or more, about 300% or more, about 310% or more, about 320% or more, about 330% or more or about 338% or more (the upper),
  • the recombinant strain having increased production capacity has an IMP production capacity of about 1.01 times or more, about 1.1 times or more, about 1.2 times or more, about 1.29 times or more, or about 1.3 times or more, compared to the parental strain or unmodified microorganisms before mutation.
  • about 1.4 times or more about 1.5 times or more, about 1.6 times or more, about 1.7 times or more, about 1.8 times or more, about 1.9 times or more, about 2.0 times or more, about 2.1 times or more, about 2.2 times or more, about 2.3 times or more , about 2.4 times or more, about 2.44 times or more, about 2.5 times or more, about 2.6 times or more, about 2.7 times or more, about 2.8 times or more, about 2.9 times or more, about 3.0 times or more, about 3.1 times or more, about 3.2 times or more , about 3.3 times or more, about 3.33 times or more, about 3.4 times or more, about 3.5 times or more, about 3.52 times or more, about 3.6 times or more, about 3.67 times or more, about 3.7 times or more, about 3.8 times or more, about 3.9 times or more , about 4.0 times or more, about 4.1 times or more, about 4.2 times or more, about 4.3 times or more, or about 4.38 times or more (the upper limit is not particularly limited
  • the term "unmodified microorganism” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and are wild-type strains or wild-type strains themselves, or are genetically modified by natural or artificial factors. It may mean a strain before change.
  • the non-modified microorganism may mean a strain before or without introduction of the YhhS variant described herein.
  • the "unmodified microorganism” may be used interchangeably with "strain before transformation", “microorganism before transformation”, “non-mutated strain”, “unmodified strain", “non-mutated microorganism” or "reference microorganism".
  • the microorganism of the present application may be a microorganism capable of producing O-phosphoserine, and the type is not particularly limited.
  • the microorganism of the present application may be either a prokaryotic cell or a eukaryotic cell, but may specifically be a prokaryotic cell.
  • the prokaryotic cells are, for example, Escherichia genus, Erwinia genus, Seratia genus, Providencia genus, Corynebacterium genus, and Brevibacterium genus.
  • Brevibacterium may include microbial strains belonging to the genus, specifically Escherichia genus microorganisms, more specifically Escherichia coli ( Escherichia coli ), but may be, but is not limited thereto.
  • OPS and L-serine can be produced through SerA, SerC and SerB, which are enzymes of the biosynthetic pathway of L-serine (Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October;Wendisch VF et al., Curr Opin Microbiol.2006 Jun;9(3):268-74;Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol.2005 Nov;7 1(ll):7 139 -44.).
  • the activity of phosphoserine phosphatase may be further weakened compared to the intrinsic activity.
  • the SerB of the present application has an activity that converts O-phosphoserine into L-serine, microorganisms mutated to weaken the SerB activity are characterized by accumulating O-phosphoserine.
  • the SerB of the present application may be a protein having or including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, or a protein consisting of or essentially consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10, but is not limited thereto.
  • the SerB of the present application has or contains an amino acid sequence having at least 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 as long as it exhibits SerB activity. can do.
  • the SerB of the present application may consist of or consist essentially of an amino acid sequence having at least 70%, 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10.
  • the polynucleotide encoding the SerB may have or include a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
  • the polynucleotide encoding the SerB may consist of or essentially consist of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 10.
  • the polynucleotide encoding the SerB of the present application may vary in the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the SerB protein due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in organisms intended to express the SerB protein. Transformations can be made.
  • the polynucleotide encoding the SerB of the present application may have or contain a nucleotide sequence with at least 70%, 80%, 90%, 95% or 99% homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and less than 100%.
  • polynucleotide encoding the SerB of the present application consists of a nucleotide sequence with at least 70%, 80%, 90%, 95% or 99% homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11, and less than 100%, or It may be configured as essential, but is not limited thereto.
  • the term "attenuation" of a polypeptide is a concept that includes both decreased activity or no activity compared to intrinsic activity.
  • the attenuation may be used interchangeably with terms such as inactivation, deficiency, down-regulation, decrease, reduce, and attenuation.
  • the attenuation is when the activity of the polypeptide itself is reduced or eliminated compared to the activity of the polypeptide originally possessed by the microorganism due to mutation of the polynucleotide encoding the polypeptide, inhibition of gene expression of the polynucleotide encoding it, or translation into a polypeptide.
  • the overall level and/or concentration (expression level) of the polypeptide in the cell is lower than that of the native strain due to inhibition of translation, etc., when the polynucleotide is not expressed at all, and/or when the polynucleotide is expressed Even if there is no activity of the polypeptide, it may also be included.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by a parent strain, wild-type or unmodified microorganism before transformation when a character is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activation before transformation”. "Inactivation, depletion, reduction, downregulation, reduction, attenuation" of the activity of a polypeptide compared to its intrinsic activity means that it is lower than the activity of a specific polypeptide originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation.
  • Attenuation of the activity of such a polypeptide may be performed by any method known in the art, but is not limited thereto, and may be achieved by applying various methods well known in the art (e.g., Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • an antisense oligonucleotide eg, antisense RNA
  • an antisense oligonucleotide that binds complementarily to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • It may be a combination of two or more selected from 1) to 8), but is not particularly limited thereto.
  • Deletion of part or all of the gene encoding the polypeptide may include removal of the entire polynucleotide encoding the endogenous target polypeptide in the chromosome, replacement with a polynucleotide in which some nucleotides are deleted, or replacement with a marker gene.
  • Modification of the expression control region is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, resulting in mutations in the expression control region (or expression control sequence), or weaker activity. It may be replaced with a sequence having The expression control region includes, but is not limited to, a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence controlling termination of transcription and translation.
  • Modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 3) and 4) above is a deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to weaken the activity of the polypeptide, or these
  • the combination of may be a mutation in the sequence, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have weaker activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have no activity, but is not limited thereto.
  • expression of a gene may be inhibited or attenuated by introducing a mutation in a polynucleotide sequence to form a stop codon, but is not limited thereto.
  • Modification of the nucleotide sequence encoding the initiation codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a nucleotide sequence encoding another initiation codon with a lower polypeptide expression rate compared to the endogenous initiation codon. It may be substituted, but is not limited thereto.
  • antisense oligonucleotide e.g., antisense RNA
  • antisense RNA complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide
  • Weintraub, H. et al. Antisense-RNA as a molecular tool. for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986].
  • a promoter transcribed in the opposite direction to the 3' end of the ORF (open reading frame) of the gene sequence encoding the polypeptide (Reverse transcription engineering, RTE) is complementary to the transcript of the gene encoding the polypeptide. It may be to attenuate the activity by making antisense nucleotides that are antisense.
  • the term "enhancement" of polypeptide activity means that the activity of the polypeptide is increased relative to the intrinsic activity.
  • the enhancement may be used interchangeably with terms such as activation, up-regulation, overexpression, and increase.
  • activation, enhancement, upregulation, overexpression, and increase may include those that exhibit an activity that was not originally possessed, or those that exhibit enhanced activity compared to intrinsic activity or activity before modification.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide originally possessed by a parent strain or unmodified microorganism before transformation when a character is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activation before transformation”.
  • “Enhancement”, “upregulation”, “overexpression” or “increase” of the activity of a polypeptide compared to the intrinsic activity means that the activity and/or concentration (expression amount) is improved.
  • the enhancement can be achieved by introducing a foreign polypeptide or by enhancing the activity and/or concentration (expression level) of an endogenous polypeptide. Whether or not the activity of the polypeptide is enhanced can be confirmed from an increase in the activity level, expression level, or amount of a product released from the corresponding polypeptide.
  • Enhancement of the activity of the polypeptide can be applied by various methods well known in the art, and is not limited as long as the activity of the target polypeptide can be enhanced compared to the microorganism before transformation. Specifically, it may be using genetic engineering and / or protein engineering, which is well known to those skilled in the art, which is a routine method of molecular biology, but is not limited thereto (e.g., Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012, etc.).
  • modification of the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide eg, modification of the polynucleotide sequence of the polypeptide gene to encode the modified polypeptide to enhance the activity of the polypeptide
  • It may be a combination of two or more selected from 1) to 8), but is not particularly limited thereto.
  • the increase in the intracellular copy number of the polynucleotide encoding the polypeptide is achieved by introducing into the host cell a vector capable of replicating and functioning independently of the host, to which the polynucleotide encoding the corresponding polypeptide is operably linked. it may be Alternatively, it may be achieved by introducing one copy or two or more copies of a polynucleotide encoding the corresponding polypeptide into the chromosome of the host cell.
  • the introduction into the chromosome may be performed by introducing a vector capable of inserting the polynucleotide into the chromosome of the host cell into the host cell, but is not limited thereto.
  • the vector is as described above.
  • the expression control region may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating termination of transcription and translation.
  • the original promoter may be replaced with a strong promoter, but is not limited thereto.
  • Examples of known strong promoters include the CJ1 to CJ7 promoter (US Patent US 7662943 B2), lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, tet promoter, gapA promoter, SPL7 promoter, SPL13 (sm3) promoter (US Patent US 10584338 B2), O2 promoter (US Patent US 10273491 B2), tkt promoter, yccA promoter, etc., but are not limited thereto.
  • Modification of the nucleotide sequence encoding the initiation codon or 5'-UTR region of the gene transcript encoding the polypeptide is, for example, a nucleotide sequence encoding another initiation codon with a higher polypeptide expression rate than the endogenous initiation codon. It may be substituted, but is not limited thereto.
  • Modification of the amino acid sequence or polynucleotide sequence of 4) and 5) above may include deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the amino acid sequence of the polypeptide or the polynucleotide sequence encoding the polypeptide to enhance the activity of the polypeptide.
  • the combination thereof may be a sequence mutation, or replacement with an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to have stronger activity, or an amino acid sequence or polynucleotide sequence improved to increase activity, but is not limited thereto.
  • the replacement may be specifically performed by inserting the polynucleotide into a chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used at this time may further include a selection marker for checking whether the chromosome is inserted.
  • the selectable marker is as described above.
  • Introduction of a foreign polynucleotide exhibiting the activity of the polypeptide may be introduction of a foreign polynucleotide encoding a polypeptide exhibiting the same/similar activity as the polypeptide into a host cell.
  • the foreign polynucleotide is not limited in origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide.
  • the method used for the introduction can be performed by appropriately selecting a known transformation method by a person skilled in the art, and expression of the introduced polynucleotide in a host cell can generate a polypeptide and increase its activity.
  • the codon optimization of the polynucleotide encoding the polypeptide is codon optimization of the endogenous polynucleotide to increase transcription or translation in the host cell, or optimization of the transcription or translation of the foreign polynucleotide in the host cell. It may be that the codons of this have been optimized.
  • Analyzing the tertiary structure of the polypeptide to select and modify or chemically modify the exposed site for example, by comparing the sequence information of the polypeptide to be analyzed with a database in which sequence information of known proteins is stored, depending on the degree of sequence similarity. It may be to determine a template protein candidate according to the method, confirm the structure based on this, and modify or modify an exposed portion to be chemically modified to be modified or modified.
  • Such enhancement of polypeptide activity is an increase in the activity or concentration of the corresponding polypeptide based on the activity or concentration of the polypeptide expressed in the wild-type or unmodified microbial strain, or an increase in the amount of the product produced from the corresponding polypeptide. It may be, but is not limited thereto.
  • Modification of some or all of the polynucleotides in the microorganism of the present application is (a) genome editing using homologous recombination or genetic scissors (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9) using a vector for chromosomal insertion into the microorganism and / or (b) It may be induced by light and/or chemical treatment, such as ultraviolet light and radiation, but is not limited thereto.
  • a method of modifying part or all of the gene may include a method using DNA recombination technology.
  • a part or all of a gene may be deleted by injecting a nucleotide sequence or vector containing a nucleotide sequence homologous to a target gene into the microorganism to cause homologous recombination.
  • the injected nucleotide sequence or vector may include a dominant selection marker, but is not limited thereto.
  • microorganism may be a microorganism that has further reduced the ability to enter and degrade OPS into cells.
  • Another aspect of the present application is to provide a method for producing O-phosphoserine, comprising culturing a microorganism comprising the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant in a medium.
  • the production method of O-phosphoserine of the present application may include culturing a microorganism containing the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant in a medium.
  • the term "culture” means growing the microorganisms of the present application under appropriately controlled environmental conditions.
  • the culturing process of the present application may be performed according to appropriate media and culture conditions known in the art. This culturing process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be batch, continuous and fed-batch, but is not limited thereto.
  • the term "medium” refers to a material in which nutrients necessary for culturing the microorganisms of the present application are mixed as main components, and supplies nutrients and growth factors, including water essential for survival and growth.
  • the medium and other culture conditions used for culturing the microorganisms of the present application can be any medium without particular limitation as long as it is a medium used for culturing ordinary microorganisms, but the microorganisms of the present application are suitable as carbon sources, nitrogen sources, personnel, and inorganic materials. It can be cultured while controlling temperature, pH, etc. under aerobic conditions in a conventional medium containing compounds, amino acids, and/or vitamins.
  • Examples of the carbon source in the present application include carbohydrates such as glucose, saccharose, lactose, fructose, sucrose, and maltose; sugar alcohols such as mannitol and sorbitol; organic acids such as pyruvic acid, lactic acid, citric acid and the like; Amino acids such as glutamic acid, methionine, lysine, and the like may be included.
  • natural organic nutrients such as starch hydrolysate, molasses, blackstrap molasses, rice winter, cassava, sorghum pomace and corn steep liquor can be used, specifically glucose and sterilized pretreated molasses (i.e. converted to reducing sugar).
  • Carbohydrates such as molasses
  • various other carbon sources in appropriate amounts may be used without limitation. These carbon sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • nitrogen source examples include inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate; Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc., organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine, meat extract, yeast extract, malt extract, corn steep liquor, casein hydrolysate, fish or degradation products thereof, defatted soybean cake or degradation products thereof, etc. can be used These nitrogen sources may be used alone or in combination of two or more, but are not limited thereto.
  • inorganic nitrogen sources such as ammonia, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium acetate, ammonium phosphate, ammonium carbonate, and ammonium nitrate
  • Amino acids such as glutamic acid, methionine, glutamine, etc.
  • organic nitrogen sources such as peptone, NZ-amine,
  • the number of persons may include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, or a sodium-containing salt corresponding thereto.
  • the inorganic compound sodium chloride, calcium chloride, iron chloride, magnesium sulfate, iron sulfate, manganese sulfate, calcium carbonate, etc. may be used, and amino acids, vitamins, and/or appropriate precursors may be included. These components or precursors may be added to the medium either batchwise or continuously. However, it is not limited thereto.
  • the medium may contain metal salts such as magnesium sulfate or iron sulfate, and may also contain amino acids, vitamins, and appropriate precursors. These media or precursors may be added to the culture in batches or continuously, but are not limited thereto.
  • glycine or serine may be additionally included in the medium.
  • Glycine may be provided in the form of purified glycine, yeast extract containing glycine, and tryptone, and the concentration contained in the culture medium may be usually 0.1 to 10 g/L, specifically 0.5 to 3 g/L.
  • serine may be provided in the form of purified serine, serine-containing yeast extract, tryptone, etc., and the concentration contained in the culture medium may be usually 0.1 to 5 g/L, specifically 0.1 to 1 g/L.
  • the pH of the medium can be adjusted by adding compounds such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid, sulfuric acid and the like to the medium in an appropriate manner during the cultivation of the microorganism of the present application.
  • an antifoaming agent such as a fatty acid polyglycol ester.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the medium, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected without gas injection or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected to maintain the anaerobic and non-aerobic state. It is not.
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45 ° C, specifically 25 to 40 ° C, and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • O-phosphoserine produced by the culture of the present application may be secreted into the medium or remain in the cells.
  • the O-phosphoserine production method of the present application includes preparing the microorganism of the present application, preparing a medium for culturing the microorganism, or a combination thereof (in any order), for example , Prior to the culturing step, it may be further included.
  • the method for producing O-phosphoserine of the present application may further include a step of recovering O-phosphoserine from the cultured medium (cultured medium) or microorganism.
  • the recovering step may be further included after the culturing step.
  • the recovery may be to collect the desired O-phosphoserine using a suitable method known in the art according to the culture method of the microorganism of the present application, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method.
  • a suitable method known in the art for example, centrifugation, filtration, treatment with a precipitating agent for crystallized proteins (salting out method), extraction, sonic disruption, ultrafiltration, dialysis, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity It may be used in combination with various chromatography, HPLC, or these methods, such as doe chromatography, and the desired O-phosphoserine may be recovered from a medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the method for producing O-phosphoserine of the present application may additionally include a purification step.
  • the purification may be performed using suitable methods known in the art.
  • the recovery step and the purification step are performed continuously or discontinuously regardless of order, simultaneously or in one step. It may be performed in an integrated manner, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application is culturing an O-phosphoserine-producing microorganism containing a variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant in a medium to produce O-phosphoserine or a medium containing the same; And b) contacting O-phosphoserine sulfhydrylase (OPSS) or a microorganism expressing the same, O-phosphoserine produced in step a) or a medium containing the same and a sulfide , To provide a method for producing cysteine or a derivative thereof.
  • O-phosphoserine-producing microorganism containing a variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant in a medium to produce O-phosphoserine or a medium containing the same
  • OPSS O-phosphoserine sulfhydrylase
  • the method comprises a polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 12 or SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 36, having O-phosphoserine release activity;
  • An amino acid sequence having at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% or 99.9% or more homology or identity with Polypeptides, including; i) position 129 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; ii) the 241st; iii) positions 129 and 241; iv) positions 241, 246 and 330; and v) a mutant polypeptide having an amino acid sequence in which a part of the sequence is deleted, modified, substituted or added while the amino acids corresponding to the 129th, 241st, 246th, and 330th positions are fixed; polyn
  • derivative refers to a similar compound obtained by chemically changing a part of a compound, usually a compound in which a hydrogen atom or a specific atomic group is substituted by another atom or atomic group.
  • cyste derivative refers to a compound in which a hydrogen atom or a specific atomic group of cysteine is substituted with another atom or atomic group.
  • other atoms or atomic groups may be attached to the nitrogen atom of the amine group (-NH 2 ) of cysteine or the sulfur atom of the thiol group (-SH), for example NAC (N-acetylcysteine), SCMC (S -Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2- Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cys
  • cysteine is produced according to the method of the present application, conversion to cysteine derivatives can be easily converted into various cysteine derivatives by methods widely known in the art.
  • the method for producing the cysteine derivative may further include converting the cysteine produced in step b) into a cysteine derivative, for example, by reacting cysteine with an acetylation agent to obtain NAC ( N-acetylcysteine) may be synthesized or SCMC (S-Carboxymetylcysteine) may be synthesized by reacting cysteine with haloacetic acid under basic conditions, but is not limited thereto.
  • NAC N-acetylcysteine
  • SCMC S-Carboxymetylcysteine
  • the cysteine derivative is mainly used as a pharmaceutical raw material for antitussives, cough relievers, bronchitis, bronchial asthma and sore throat, but may be used as a treatment, but is not limited thereto.
  • O-phosphoserine sulfhydrylase provides a thiol group (thiol, group, SH group) to O-phosphoserine to convert the O-phosphoserine into cysteine
  • An enzyme that catalyzes a reaction The enzymes are Aeropymm pernix , Mycobacterium tuberculosis , Mycobacterium megmatics , Trichomonas vaginalis (Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums KE et al. J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005).
  • the O-phosphoserine sulfhydrylase is a wild-type O-phosphoserine sulfhydrylase, as well as a sequence in which some of the polynucleotide sequences encoding the O-phosphoserine sulfhydrylase are deleted, substituted or added, It also includes variants exhibiting the same or higher activity than the biological activity of O-phosphoserine sulfhydrylase, and all of the O-phosphoserine sulfhydrylase and variants thereof disclosed in U.S. Publication No. US 8557549 B2 and US Publication No. 9127324 B2 can include
  • the sulfide is provided in the form of a liquid or gas due to a difference in pH, pressure, and solubility as well as a solid commonly used in the art, and thus sulfide (S 2- ), thiosulfate (S 2 0 3 Any sulfide that can be converted to a thiol group (SH group) in the form of 2- ) can be used without limitation. Specifically, Na 2 S, NaSH, H 2 S, (NH 4 ) 2 S, and Na 2 S 2 O 3 providing a thiol group to O-phosphoserine may be used, but are not limited thereto.
  • the reaction is a reaction in which one thiol group is provided to one O-phosphoserine reactive group to produce one cysteine or cysteine derivative.
  • the amount of sulfide added may be 0.1 to 3 times the molarity of O-phosphoserine, Specifically, it may be 1 to 2 times, but is not limited thereto.
  • the present application may further include a step of recovering cysteine produced through the reaction step.
  • the desired cysteine may be separated and purified from the reaction solution using a suitable reaction known in the art and collected.
  • Another aspect of the present application is a variant of the present application, a polynucleotide encoding the variant, a vector comprising the polynucleotide, a microorganism or any of these, including the variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant. It is to provide a composition for producing O-phosphoserine comprising a combination of two or more.
  • composition of the present application may further include any suitable excipient commonly used in compositions for the production of O-phosphoserine, such excipients include, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffers, stabilizers, or isotonic agents. It may be a topic, etc., but is not limited thereto.
  • composition of the present application "variant”, “polynucleotide”, “vector”, “microorganism”, “medium” and “O-phosphoserine”, etc. are as described in the other embodiments above.
  • Another aspect of the present application is a variant of the present application, a polynucleotide encoding the variant, a vector comprising the polynucleotide, or a variant of the present application or a polynucleotide encoding the variant, comprising a microbial O- To provide a use for the production of phosphoserine, cysteine or derivatives of cysteine.
  • Another aspect of the present application is to provide a use for releasing O-phosphoserine from microorganisms using the variant of the present application.
  • a yhhS gene variant plasmid library was constructed. The specific process is as follows.
  • Escherichia coli Escherichia coli , E.coli Using the genomic DNA of K12 W3110 as a template, random mutagenesis PCR was performed using a pair of primers having base sequences of SEQ ID NOs: 13 and 14 shown in Table 1 below. The performance was performed using a diversity PCR random mutation kit (Takara), PCR was denatured at 94 ° C for 5 minutes, denatured at 94 ° C for 30 seconds, annealed at 55 ° C for 30 seconds, and polymerization was repeated 20 times at 72 ° C for 1 minute, followed by 72 ° C. The polymerization reaction was carried out for 5 minutes.
  • pCL_PrhtB was first constructed.
  • PCR was performed using SEQ ID NOs: 15 and 16 using the genomic DNA of E. coli K12 W3110 as a template. PCR was denatured at 94°C for 5 minutes, denatured at 94°C for 30 seconds, annealed at 55°C for 30 seconds, and polymerization was repeated 30 times at 72°C for 1 minute, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • the rhtB promoter fragment was cloned into the pCL1920 vector (GeneBank No. AB236930) digested with EcoRI and SalI using an infusion cloning kit, and pCL_PrhtB was obtained.
  • the mutant gene fragments obtained through the PCR were cloned using an infusion cloning kit. Cloning was performed at 50° C. for 60 minutes, and through this, a pCL_PrhtB-yhhS gene variant plasmid library was prepared. Then, CA07-0012 (KCCM 11121P, Korean Registered Patent No. 10-1381048 and US Patent Publication No. 10-2012-0190081) was transformed by electroporation.
  • the selected variants were those in which serine at the 129th amino acid residue was substituted with glycine, isoleucine at the 241st amino acid residue in the amino acid sequence of wild-type YhhS was substituted with glutamine, and isoleucine at the 241st amino acid residue was substituted with threonine. and the 246th amino acid residue aspartic acid was substituted with valine, and the 330th amino acid residue valine was substituted with isoleucine.
  • the three strains were named CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (S129G), CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (I241Q) and CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (I241T/D246V/V330I), respectively.
  • the CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (I241T/D246V/V330I) strain also known as Escherichia coli CA07-0352, was deposited at the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on May 14, 2020 under the Budapest Treaty. and was given the accession number KCCM 12720P.
  • the upper fragment of yhhS (S129A) was obtained through PCR using E.coli K12 W3110 genomic DNA as a template using SEQ ID NOs: 13 and 18, and SEQ ID NO: 19 shown in Table 2 below and 14, the yhhS (S129A) subfragment was obtained through PCR using E. coli K12 W3110 genomic DNA as a template. PCR was denatured at 94°C for 5 minutes, denatured at 94°C for 30 seconds, annealed at 55°C for 30 seconds, and polymerization was repeated 30 times at 72°C for 1 minute, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • the obtained yhhS(S129A) upper fragment and yhhS(S129A) lower fragment were cloned using an in-fusion cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.). Cloning was carried out at 50 ° C. for 60 minutes, through which pCL_PrhtB-yhhS (S129A) was obtained.
  • the obtained plasmid was transformed into CA07-0012 by electroporation to obtain strain CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (S129A).
  • sequence number (' -> 3') 18 TCCCGTTCCGGCAAAcgcTTGCCCAATCCCAAGGA 19 CTTGGGATTGGGCAAgcgTTTGCCGGAACGGGATC
  • trc was used as a promoter and the position of the mgsA gene was used as the insertion site.
  • pSKH130 vector (US Patent Publication No. 2020-0048619, SEQ ID NO: 38) was used for chromosomal insertion.
  • the vector includes an R6K replicon dependent on the PI protein (pir gene), a Levansucrase (SacB) gene, and a kanamycin resistance gene. After securing a desired strain by using, antibiotics were removed from a medium containing sucrose to prepare a strain.
  • pSKH130 ⁇ mgsA is a vector for deleting the mgsA ORF (open reading frame), and is a plasmid containing nucleotide sequences 5' and 3' outside the ORF of mgsA.
  • PCR was performed using SEQ ID NOs: 24 and 25 shown in Table 4 below.
  • the upper and lower fragments of the two variants were secured using the primer pairs shown in Table 5, respectively, and the obtained two kinds of upper and lower fragments contained the trc promoter fragment and pSKH130 ⁇ mgsA
  • Two types of plasmids were obtained using an infusion cloning kit with a vector cut with ScaI.
  • pSKH130 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS plasmid was constructed to secure a strain in which wild-type yhhS was introduced at the mgsA position.
  • PCR was performed using a pair of oligonucleotides having SEQ ID NOs: 26 and 27, and a plasmid was obtained using an infusion cloning kit with a vector cut from a trc promoter fragment and pSKH130 ⁇ mgsA with ScaI.
  • the secured plasmid was transformed into CA07-0012 strain by electroporation. After selecting a strain in which the mutation was inserted into the chromosome by recombination (crossover) in kanamycin-containing LB solid medium, secondary recombination (replacement) was performed in a medium containing sucrose to excise the plasmid region from the chromosome.
  • the strains for which the secondary recombination was completed were two strains (CA07-0012 ⁇ mgsA :: Ptrc-yhhS (I241T) in which the yhhS variant was inserted at the mgsA position of the chromosome through PCR and sequencing using SEQ ID NOs: 20 and 27 , CA07-0012 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS (I241Q)) was obtained, and the control strain (CA07-0012 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS) was also obtained through the same method.
  • a strain in which the 129th amino acid residue serine was replaced with glycine was prepared based on the yhhS (I241Q) variant. At this time, the rhtB promoter was used as the promoter.
  • PCR was performed using pCL_PrhtB-yhhS (I241Q) as a template using SEQ ID NOs: 32 and 33 (PCR_129G time point for all plasmids) shown in Table 6 below.
  • the obtained PCR fragment was cloned using an infusion cloning kit.
  • the obtained plasmid was transformed into CA07-0012 by electroporation to obtain strain CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (S129G/I241Q).
  • the promoter used trc, and the mgsA gene was deleted and S129G/I241T/D246V/V330I mutations were inserted.
  • Example 2-2 the pSKH130 ⁇ mgsA plasmid prepared in Example 2-2 was used to introduce the I241T, D246V and V330I mutations into the mgsA gene of strain CA07-0012.
  • Example 2-2 To prepare pSKH130 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS (I241T/D246V/V330I), the trc promoter fragment obtained in Example 2-2 was identically used. To obtain the yhhS(I241T/D246V/V330I) ORF fragment, PCR was performed using SEQ ID NOs: 26 and 27 using the pCL_Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I) plasmid as a template to secure the fragment.
  • the trc promoter fragment and the yhhS453 fragment were obtained as a plasmid pSKH130 ⁇ mgsA :: Ptrc-yhhS (I241T/D246V/V330I) using an infusion cloning kit together with a vector cut from pSKH130 ⁇ mgsA with ScaI.
  • PCR was performed using the pSKH130 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS (I241T/D246V/V330I) as a template using SEQ ID NOs: 32 and 33 (PCR_129G time point for the entire plasmid).
  • PCR was denatured at 94°C for 5 minutes, denatured at 94°C for 30 seconds, annealed at 55°C for 30 seconds, and polymerization was repeated 30 times at 72°C for 7 minutes, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • a plasmid pSKH130 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS (129G/I241T/D246V/V330I) was obtained using an infusion cloning kit.
  • the secured plasmid was transformed into CA07-0012 strain by electroporation.
  • Transformed strains were selected by recombination (crossover) in LB solid medium with kanamycin, and then excised from the chromosome through secondary recombination (replacement) in medium with sucrose. .
  • the secondary recombination was completed in the strains in which yhhS (I241T / D246V / V330I) and yhhS (129G / I241T / D246V / V330I) were inserted at the mgsA position of the chromosome through PCR and sequencing using SEQ ID NOs: 20 and 27
  • Two strains (CA07-0012/pSKH130 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I), CA07-0012/pSKH130 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS(129G/I241T/D246V/V330I)) were obtained.
  • the culture was cultured overnight in a 33 ° C. incubator after plating each strain on LB solid medium.
  • Strains cultured overnight in LB solid medium were inoculated into 25mL titer medium of Table 7 below, and then cultured for 48 hours in an incubator at 33° C. and 200 rpm, and the results are shown in Tables 8 to 11.
  • strain name OPS concentration (g/L) CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS 2.1 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (S129A) 2.7 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS (S129G) 5.3
  • strain CA07-0012 ⁇ mgsA :: Ptrc-yhhS introduced with wild-type yhhS strain CA07-0012 ⁇ mgsA :: Ptrc-yhhS (I241Q) introduced with YhhS (I241Q) variant
  • strain CA07-0012 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS(I241T) which had an increase rate of about 425% and introduced the YhhS (I241T) variant
  • strain CA07 introduced the YhhS (I241T/D246V/V330I) variant and an increase rate of about 233%
  • -0012 ⁇ mgsA::Ptrc-yhhS (I241T/D246V/V330I it was confirmed that the increase rate was about 267% (Table 9).
  • Ptrc-yhhS 129G/I241T/D246V/V330I

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Abstract

본 출원은 신규한 YhhS 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

Description

신규한 YHHS 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
본 출원은 YhhS 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로, 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임 A 생합성의 전구 물질로 사용된다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 미생물을 이용하여 D,L-ATC(D,L-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid)를 생물학적으로 전환하는 방법, 2) 대장균을 이용한 L-시스테인을 생산하는 직접 발효 방법(유럽 등록특허 EP0885962B; Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006), 3) 미생물을 이용하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)를 발효 생산한 후, O-포스포세린 설피드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응시켜 L-시스테인으로 전환시키는 방법(미국등록공보 US 8557549 B2)이 공지되어 있다.
이 때, 상기 3) 방법으로 고수율의 시스테인을 생산하기 위해서는 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 할 필요가 존재한다.
본 발명자들은 OPS 생산 균주에서 생산된 OPS를 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 막 단백질에 있어서, 이의 변이체를 규명하고, 상기 변이체로 인하여 OPS 배출이 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, YhhS 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열의 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민으로 치환된, YhhS 변이체를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 에스케리키아 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은 a) 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지 및 황화물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원은 신규한 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 이용하여, OPS 생산능을 갖는 미생물을 배양하는 경우, 기존 비변형 또는 변이체 단백질을 이용한 경우에 비해 고수율의 OPS 생산이 가능하다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, YhhS 변이체를 제공한다.
본 출원에서 용어, "YhhS"는 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩티드, 구체적으로는 OPS를 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 막 단백질을 의미한다. 본 출원에 있어서, 상기 YhhS는 OPS를 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 막 단백질인 YhhS MFS(major facilitator superfamily) 트랜스포터일 수 있다. 상기 YhhS는 과량의 OPS가 존재하는 조건하에서 생육 저해가 해제된 대장균으로부터 OPS 배출 활성을 나타내는 단백질로 규명된 바 있다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS)"은 세린의 인산(phosphoric acid) 에스테르로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, OPS 설피드릴라아제(OPS sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(미국등록공보 US 8557549 B2).
구체적으로, 본 출원의 YhhS는 YhhS MFS 트랜스포터와 혼용하여 사용될 수 있다. 본 출원에서 상기 YhhS의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로 상기 아미노산 서열은 yhhS 유전자에 의해 코딩되는 YhhS 활성을 갖는 폴리펩티드일 수 있고, 보다 구체적으로 서열번호 1일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산은 극성 아미노산일 수 있다. 상기 극성 아미노산은, 예를 들면, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 또는 글루타민일 수 있으며, 구체적으로 세린일 수 있다.
본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 129번째 위치에 상응하는 극성 아미노산이 비극성 아미노산으로 치환된 것일 수 있다. 상기 비극성 아미노산은, 예를 들면, 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 또는 프롤린일 수 있으며, 구체적으로 글리신 또는 알라닌일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 129번째 위치에 상응하는 아미노산이 글리신 또는 알라닌인 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
예를 들어, 상기 아미노산 서열 N-말단, C-말단 그리고/또는 내부에 본 출원의 변이체의 기능을 변경하지 않는 서열 추가 또는 결실, 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 잠재성 돌연변이 (silent mutation) 또는 보존적 치환을 가지는 경우이다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 글리신 또는 알라닌으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 변이체의 N-말단에는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이동(translocation)에 관여하는 시그널(또는 리더) 서열이 컨쥬게이트 될 수 있다. 또한 상기 변이체는 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, "상동성 (homology)" 또는 "동일성 (identity)"은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열 상호간 유사한 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 일부분과 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오티드에서 일반 코돈 또는 코돈 축퇴성을 고려한 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오티드와의 하이브리드화 역시 포함됨이 자명하다.
임의의 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스 (또는 EDNAFULL (NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티 (또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 폴리펩티드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 폴리펩티드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 상응하는 위치의 아미노산을 확인하는 것은 특정 서열을 참조하는 서열의 특정 아미노산을 결정하는 것일 수 있다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 참조 (reference) 단백질에서의 유사하거나 대응되는 위치를 지칭한다.
예를 들어, 임의의 아미노산 서열을 서열번호 1과 정렬(align)하고, 이를 토대로 상기 아미노산 서열의 각 아미노산 잔기는 서열번호 1의 아미노산 잔기와 상응하는 아미노산 잔기의 숫자 위치를 참조하여 넘버링 할 수 있다. 예를 들어, 본 출원에 기재된 것과 같은 서열 정렬 알고리즘은, 쿼리 시퀀스("참조 서열"이라고도 함)와 비교하여 아미노산의 위치, 또는 치환, 삽입 또는 결실 등의 변형이 발생하는 위치를 확인할 수 있다.
이러한 정렬에는 예를 들어 Needleman-Wunsch 알고리즘 (Needleman 및 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), EMBOSS 패키지의 Needleman 프로그램 (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000), Trends Genet. 16: 276-277) 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않고 당업계에 알려진 서열 정렬 프로그램, 쌍 서열(pairwise sequence) 비교 알고리즘 등을 적절히 사용할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열의 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민 또는 쓰레오닌으로 치환된, YhhS 변이체를 제공하는 것이다.
상기 "서열번호 1의 아미노산 서열", "YhhS" 및 "변이체"에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민 또는 쓰레오닌으로 치환된 것일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 기준으로 241번째 위치에 상응하는 아미노산이 글루타민 또는 쓰레오닌인 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 이에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
또한, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되고 추가적으로 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민 또는 쓰레오닌으로 치환된 것일 수 있다.
또한, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치 또는 241번째 위치에 상응하는 아미노산의 치환 외에, 서열번호 1의 아미노산 서열의 246번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 발린으로 추가로 치환, 및/또는 서열번호 1의 아미노산 서열의 330번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 이소류신으로 추가로 치환되는 것을 포함할 수 있다.
더하여, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 88번째 위치에 상응하는 아미노산이 페닐알라닌이고, 서열번호 1의 아미노산 서열의 207번째 위치에 상응하는 아미노산이 라이신일 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 글리신으로 치환된 서열번호 2, 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 알라닌으로 치환된 서열번호 3, 서열번호 1의 아미노산 서열의 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민으로 치환된 서열번호 4, 서열번호 1의 아미노산 서열의 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 쓰레오닌으로 치환된 서열번호 5, 서열번호 1의 아미노산 서열의 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 쓰레오닌으로 치환, 246번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 발린으로 치환, 및 330번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 이소류신으로 치환된 서열번호 12, 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 글리신으로 치환, 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 쓰레오닌으로 치환, 246번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 발린으로 치환, 및 330번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 이소류신으로 치환된 서열번호 34, 또는 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산인 세린이 글리신으로 치환, 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민으로 치환된 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 변이체는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 12 또는 서열번호 34 또는 서열번호 36의 아미노산 서열로 이루어지거나, 상기 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드일 수 있다.
또한, 본 출원의 변이체는 상기 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 12 또는 서열번호 34 또는 서열번호 36의 아미노산 서열과 99% 이상의 서열 동일성(상동성 또는 동일성)을 가지는 것일 수 있으나, 상기 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 12 또는 서열번호 34 또는 서열번호 36의 아미노산 서열과 적어도 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.1% 이상, 99.2% 이상, 99.3% 이상, 99.4% 이상, 99.5% 이상, 99.6% 이상, 99.7% 이상, 99.8% 이상, 99.9% 이상 또는 100% 미만의 서열 동일성을 가지는 것일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 본 출원의 변이체에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원의 일 예로, 본 출원의 변이체는 YhhS 활성을 가질 수 있다. 또한, 본 출원의 변이체는 야생형 폴리펩티드에 비해 OPS 배출이 증가되도록 하는 활성을 가질 수 있다.
상기 YhhS에 대해서는 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
상기 "변이체"에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.
본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 12 또는 서열번호 34 또는 서열번호 36으로 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 출원의 일 예로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 서열번호 9 또는 서열번호 17 또는 서열번호 35 또는 서열번호 37의 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 서열번호 9 또는 서열번호 17 또는 서열번호 35 또는 서열번호 37의 서열로 이루어지거나, 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy) 또는 본 출원의 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 출원의 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 6 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 서열번호 9 또는 서열번호 17 또는 서열번호 35 또는 서열번호 37의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 6 또는 서열번호 7 또는 서열번호 8 또는 서열번호 9 또는 서열번호 17 또는 서열번호 35 또는 서열번호 37의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때, 상기 상동성 또는 동일성을 갖는 서열에서, 서열번호 1의 129번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 글리신 또는 알라닌을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있고, 241번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 글루타민 또는 쓰레오닌을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있고, 246번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 발린을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있고, 330번째 위치에 상응하는 아미노산을 코딩하는 코돈은 이소류신을 코딩하는 코돈 중 하나일 수 있다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 공지의 유전자 서열로부터 제조될 수 있는 프로브, 예를 들면, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화할 수 있는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오티드끼리, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오티드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1XSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1XSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데닌은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드와 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(예컨대, J. Sambrook et al., 상동).
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
상기 벡터는 상기 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에서 발현시키기 위한 발현 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 벡터는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 발현조절영역(또는 발현조절서열)에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 포함하는 DNA 제조물을 포함할 수 있다. 상기 발현조절영역은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pDZ계, pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pDC, pDCM2, pACYC177, pACYC184, pCL, pSK, pSKH130, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
일례로 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 혹은 미생물 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 폴리펩티드가 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 및/또는 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 에스케리키아 속 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 변이형 폴리펩티드, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "균주(또는, 미생물)"는 야생형 미생물이나 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 불활성화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 약화되거나 강화된 미생물로서, 목적하는 폴리펩티드, 단백질 또는 산물의 생산을 위하여 유전적 변형(modification)을 포함하는 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 본 출원의 변이체, 본 출원의 폴리뉴클레오티드 및 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는 미생물; 본 출원의 변이체 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하도록 변형된 미생물; 본 출원의 변이체, 또는 본 출원의 폴리뉴클레오티드를 발현하는 미생물(예컨대, 재조합 미생물); 또는 본 출원의 변이체 활성을 갖는 미생물(예컨대, 재조합 미생물)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 O-포스포세린 생산능을 가진 미생물일 수 있다.
본 출원의 미생물은 자연적으로 YhhS 또는 O-포스포세린 생산능을 가지고 있는 미생물, 또는 YhhS 또는 O-포스포세린 생산능이 없는 모균주에 본 출원의 변이체 또는 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 (또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터)가 도입되거나 및/또는 O-포스포세린 생산능이 부여된 미생물일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 출원의 균주는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 또는 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어, 본 출원의 변이체를 발현하는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 본 출원의 균주는 본 출원의 변이체를 포함하여 O-포스포세린을 생산할 수 있는 미생물을 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 균주는 천연의 야생형 미생물 또는 O-포스포세린을 생산하는 미생물에 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 도입됨으로써 YhhS 변이체가 발현되어, O-포스포세린 생산능이 증가된 재조합 균주일 수 있다. 상기 O-포스포세린 생산능이 증가된 재조합 균주는, 천연의 야생형 미생물 또는 YhhS 비변형 미생물 (즉, 야생형 YhhS(서열번호 1)를 발현하는 미생물 또는 변이형 YhhS(서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 12 또는 서열번호 34 또는 서열번호 36)을 발현하지 않는 미생물)에 비하여 O-포스포세린 생산능이 증가된 미생물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그 예로, 상기 O-포스포세린 생산능의 증가 여부를 비교하는 대상 균주인, 야생형 YhhS가 도입된 미생물은 SerB의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 미생물인 CA07-0012(KCCM 11121P, 대한민국 등록특허 제10-1381048호 및 미국 공개특허 제10-2012-0190081호)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 O-포스포세린 생산능에 비하여 약 1% 이상, 구체적으로는 약 1% 이상, 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 29% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 100% 이상, 약 110% 이상, 약 120% 이상, 약 130% 이상, 약 140% 이상, 약 144% 이상, 약 150% 이상, 약 160% 이상, 약 170% 이상, 약 180% 이상, 약 190% 이상, 약 200% 이상, 약 210% 이상, 약 220% 이상, 약 230% 이상, 약 233% 이상, 약 240% 이상, 약 250% 이상, 약 252% 이상, 약 260% 이상, 약 267% 이상, 약 270% 이상, 약 280% 이상, 약 290% 이상, 약 300% 이상, 약 310% 이상, 약 320% 이상, 약 330% 이상 또는 약 338% 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 300% 이하, 약 200% 이하, 약 100% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하 또는 약 15% 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물의 생산능에 비해 +값의 증가량을 갖는 한, 이에 제한되지 않는다. 다른 예에서, 상기 생산능이 증가된 재조합 균주는 변이 전 모균주 또는 비변형 미생물에 비하여, IMP 생산능이 약 1.01배 이상, 약 1.1배 이상, 약 1.2배 이상, 약 1.29배 이상, 약 1.3배 이상, 약 1.4배 이상, 약 1.5배 이상, 약 1.6배 이상, 약 1.7배 이상, 약 1.8배 이상, 약 1.9배 이상, 약 2.0배 이상, 약 2.1배 이상, 약 2.2 배 이상, 약 2.3배 이상, 약 2.4배 이상, 약 2.44배 이상, 약 2.5배 이상, 약 2.6배 이상, 약 2.7배 이상, 약 2.8배 이상, 약 2.9배 이상, 약 3.0배 이상, 약 3.1배 이상, 약 3.2배 이상, 약 3.3배 이상, 약 3.33배 이상, 약 3.4배 이상, 약 3.5배 이상, 약 3.52배 이상, 약 3.6배 이상, 약 3.67배 이상, 약 3.7배 이상, 약 3.8배 이상, 약 3.9배 이상, 약 4.0배 이상, 약 4.1배 이상, 약 4.2배 이상, 약 4.3배 이상 또는 약 4.38배 이상 (상한값은 특별한 제한은 없으며, 예컨대, 약 10배 이하, 약 5배 이하, 약 3배 이하, 또는 약 2배 이하일 수 있음) 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "비변형 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 야생형 균주 또는 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 비변형 미생물은 본 명세서에 기재된 YhhS 변이체가 도입되지 않거나 도입되기 전의 균주를 의미할 수 있다. 상기 "비변형 미생물"은 "변형 전 균주", "변형 전 미생물", "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 일 예로, 본 출원의 미생물은 O-포스포세린을 생산할 수 있는 미생물 일 수 있으며, 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 본 출원의 미생물은 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일 예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주를 포함할 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 속 미생물, 보다 구체적으로 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 출원의 에스케리키아 속 미생물의 경우, L-세린의 생합성 경로의 효소인 SerA, SerC 및 SerB를 통해, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October; Wendisch V F et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;7 1( l l):7 139-44.).
본 출원의 O-포스포세린 생산 미생물은 추가적으로 포스포세린 포스포타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것일 수 있다.
본 출원의 SerB는 O-포스포세린을 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 O-포스포세린을 축적하는 특징을 지녀 O-포스포세린의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원의 SerB는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원의 SerB는 SerB의 활성을 나타내는 한, 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB는 서열번호 10으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 상기 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 10에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 SerB 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, SerB 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 11의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드의 "약화"는 내재적 활성에 비하여 활성이 감소되거나 또는 활성이 없는 것을 모두 포함하는 개념이다. 상기 약화는 불활성화(inactivation), 결핍(deficiency), 하향조절(down-regulation), 감소(decrease), 저하(reduce), 감쇠(attenuation) 등의 용어와 혼용될 수 있다.
상기 약화는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 변이 등으로 폴리펩티드 자체의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 폴리펩티드의 활성에 비해 감소 또는 제거된 경우, 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 유전자의 발현 저해 또는 폴리펩티드로의 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 폴리펩티드 활성 정도 및/또는 농도(발현량)가 천연형 균주에 비하여 낮은 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 전혀 이루어지지 않은 경우, 및/또는 폴리뉴클레오티드의 발현이 되더라도 폴리펩티드의 활성이 없는 경우 역시 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주, 야생형 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "불활성화, 결핍, 감소, 하향조절, 저하, 감쇠"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성에 비하여 낮아진 것을 의미한다.
이러한 폴리펩티드의 활성의 약화는, 당업계에 알려진 임의의 방법에 의하여 수행될 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니며, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다(예컨대, Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 약화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전체 또는 일부의 결손;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형;
3) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 구성하는 아미노산 서열의 변형(예컨대, 아미노산 서열 상의 1 이상의 아미노산의 삭제/치환/부가);
4) 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 제거 또는 약화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 핵산염기 서열 상의 1 이상의 핵산염기의 삭제/치환/부가);
5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입;
7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가;
8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE); 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
예컨대,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자 일부 또는 전체의 결손은, 염색체 내 내재적 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 전체의 제거, 일부 뉴클레오티드가 결실된 폴리뉴클레오티드로의 교체 또는 마커 유전자로 교체일 수 있다.
상기 2) 발현조절영역(또는 발현조절서열)의 변형은, 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절영역(또는 발현조절서열) 상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 3) 및 4)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은 폴리펩티드의 활성을 약화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 없도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열 내 변이를 도입하여 종결 코돈을 형성시킴으로써, 유전자의 발현을 저해하거나 약화시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 5) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 낮은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 6) 폴리펩티드를 코딩하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입은 예를 들어 문헌 [Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986]을 참고할 수 있다.
상기 7) 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능한 2차 구조물을 형성시키기 위하여 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열의 부가는 mRNA 번역을 불가능하게 하거나 속도를 저하시키는 것일 수 있다.
또한, 상기 8) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터의 부가(Reverse transcription engineering, RTE)는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 전사체에 상보적인 안티센스 뉴클레오티드를 만들어 활성을 약화하는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩티드 활성의 "강화"는, 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 강화는 활성화(activation), 상향조절(up-regulation), 과발현(overexpression), 증가(increase) 등의 용어와 혼용될 수 있다. 여기서 활성화, 강화, 상향조절, 과발현, 증가는 본래 가지고 있지 않았던 활성을 나타내게 되는 것, 또는 내재적 활성 또는 변형 전 활성에 비하여 향상된 활성을 나타내게 되는 것을 모두 포함할 수 있다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화", "상향조절", "과발현" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩티드의 활성 및/또는 농도(발현량)에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 강화는 외래의 폴리펩티드를 도입하거나, 내재적인 폴리펩티드의 활성 강화 및/또는 농도(발현량)를 통해 달성할 수 있다. 상기 폴리펩티드의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩티드의 활성 정도, 발현량 또는 해당 폴리펩티드로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
상기 폴리펩티드의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩티드의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않는다. 구체적으로, 분자생물학의 일상적 방법인 당업계의 통상의 기술자에게 잘 알려진 유전자 공학 및/또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있으나, 이로 제한되지 않는다(예컨대, Sitnicka et al. Functional Analysis of Genes. Advances in Cell Biology. 2010, Vol. 2. 1-16, Sambrook et al. Molecular Cloning 2012 등).
구체적으로, 본 출원의 폴리펩티드의 강화는
1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가;
2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역의 변형(예를 들어, 발현조절영역 내 변이 발생, 더욱 강한 활성을 갖는 서열로의 교체, 또는 더욱 강한 활성을 갖는 서열 삽입);
3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열의 변형;
4) 폴리펩티드 활성이 강화되도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변형;
5) 폴리펩티드 활성이 강화도록 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형 (예를 들어, 폴리펩티드의 활성이 강화되도록 변형된 폴리펩티드를 코딩하도록 상기 폴리펩티드 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 변형);
6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리펩티드 또는 이를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입;
7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화;
8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식; 또는
9) 상기 1) 내지 8) 중 선택된 2 이상의 조합일 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.
보다 구체적으로,
상기 1) 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터의 숙주세포 내로의 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 또는, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내의 염색체 내에 1 카피 또는 2 카피 이상 도입에 의해 달성되는 것일 수 있다. 상기 염색체 내에 도입은 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩티드를 코딩하는 염색체상의 유전자 발현조절영역(또는 발현조절서열)을 활성이 강력한 서열로 교체는, 예를 들면, 상기 발현조절영역의 활성을 더욱 강화하도록 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 가지는 서열로의 교체일 수 있다. 상기 발현조절영역은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 그리고 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 일 예로, 본래의 프로모터를 강력한 프로모터로 교체시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ1 내지 CJ7 프로모터(미국등록특허 US 7662943 B2), lac 프로모터, trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터, tet 프로모터, gapA 프로모터, SPL7 프로모터, SPL13(sm3) 프로모터(미국등록특허 US 10584338 B2), O2 프로모터(미국등록특허 US 10273491 B2), tkt 프로모터, yccA 프로모터 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 전사체의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역을 코딩하는 염기서열 변형은, 예를 들면, 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩티드 발현율이 더 높은 다른 개시코돈을 코딩하는 염기 서열로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 및 5)의 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 변형은, 폴리펩티드의 활성을 강화하도록 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 상기 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보존적 또는 보존적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이 발생, 또는 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열 또는 활성이 증가하도록 개량된 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열로의 교체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 염색체내로 삽입함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 6) 폴리펩티드의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드의 숙주세포 내 도입일 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드와 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한이 없다. 상기 도입에 이용되는 방법은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩티드가 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
상기 7) 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화는, 내재 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 전사 또는 번역이 증가하도록 코돈 최적화한 것이거나, 또는 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화한 것일 수 있다.
상기 8) 폴리펩티드의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 것은, 예를 들어 분석하고자 하는 폴리펩티드의 서열정보를 기지 단백질들의 서열정보가 저장된 데이터베이스와 비교함으로써 서열의 유사성 정도에 따라 주형 단백질 후보를 결정하고 이를 토대로 구조를 확인하여, 변형하거나 화학적으로 수식할 노출 부위를 선택하여 변형 또는 수식하는 것일 수 있다.
이와 같은 폴리펩티드 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩티드의 활성 또는 농도 발현량이 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩티드의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩티드로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 미생물에서 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 변형은 (a) 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 이용한 상동 재조합 또는 유전자가위 (engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9)을 이용한 유전체 교정 및/또는 (b) 자외선 및 방사선 등과 같은 빛 및/또는 화학물질 처리에 의해 유도될 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 상기 유전자 일부 또는 전체의 변형 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함될 수 있다. 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 유전자 일부 또는 전체의 결손이 이루어질 수 있다. 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터는 우성 선별 마커를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 미생물은 추가로 OPS의 세포 안으로의 유입 및 분해 능력을 감소시킨 미생물일 수 있다
상기와 같은 OPS 생산 미생물에 대한 내용은 상기에서 기술된 내용 외에도 미국등록공보 US 8557549 B2 또는 미국공개공보 제2012-0190081호 등에 개시된 내용이 본 출원의 참고자료로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물에서, "변이체", "폴리뉴클레오티드" 및 "O-포스포세린" 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 O-포스포세린의 생산 방법은 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어, "배양"은 본 출원의 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원에서 용어, "배지"는 본 출원의 미생물을 배양하기 위해 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 혼합한 물질을 의미하며, 생존 및 발육에 불가결한 물을 비롯하여 영양물질 및 발육인자 등을 공급한다. 구체적으로, 본 출원의 미생물의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미생물의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있으나, 본 출원의 미생물을 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
본 출원에서 상기 탄소원으로는 글루코오스, 사카로오스, 락토오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스 등과 같은 탄수화물; 만니톨, 소르비톨 등과 같은 당 알코올, 피루브산, 락트산, 시트르산 등과 같은 유기산; 글루탐산, 메티오닌, 리신 등과 같은 아미노산 등이 포함될 수 있다. 또한, 전분 가수분해물, 당밀, 블랙스트랩 당밀, 쌀겨울, 카사버, 사탕수수 찌꺼기 및 옥수수 침지액 같은 천연의 유기 영양원을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코오스 및 살균된 전처리 당밀(즉, 환원당으로 전환된 당밀) 등과 같은 탄수화물이 사용될 수 있으며, 그 외의 적정량의 탄소원을 제한 없이 다양하게 이용할 수 있다. 이들 탄소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 질산암모늄 등과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민 등과 같은 아미노산, 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해 생성물 등과 같은 유기 질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독으로 사용되거나 2 종 이상이 조합되어 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 인원으로는 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨, 또는 이에 대응되는 소디움-함유 염 등이 포함될 수 있다. 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간, 탄산칼슘 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 아미노산, 비타민 및/또는 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 구성성분 또는 전구체는 배지에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있다. 그러나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배지는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체 등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예로, SerB 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 재조합 미생물의 배양은, 상기 미생물의 세린 요구성이 유도되어 배지에 글리신 또는 세린이 추가로 포함될 수 있다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10g/L, 구체적으로 0.5 내지 3g/L일 수 있다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트 추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5g/L, 구체적으로 0.1 내지 1g/L 일 수 있다.
또한, 본 출원의 미생물의 배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산, 황산 등과 같은 화합물을 배지에 적절한 방식으로 첨가하여, 배지의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 또한, 배지의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배지 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에서 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 배양에 의하여 생산된 O-포스포세린은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
본 출원의 O-포스포세린 생산 방법은, 본 출원의 미생물을 준비하는 단계, 상기 미생물을 배양하기 위한 배지를 준비하는 단계, 또는 이들의 조합(순서에 무관, in any order)을, 예를 들어, 상기 배양하는 단계 이전에, 추가로 포함할 수 있다.
본 출원의 O-포스포세린 생산 방법은, 상기 배양에 따른 배지(배양이 수행된 배지) 또는 미생물로부터 O-포스포세린을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 회수하는 단계는 상기 배양하는 단계 이후에 추가로 포함될 수 있다.
상기 회수는 본 출원의 미생물의 배양 방법, 예를 들어 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법 등에 따라 당해 기술 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 O-포스포세린을 수집(collect)하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 결정화 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 추출, 초음파 파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피, HPLC 또는 이들의 방법을 조합하여 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 O-포스포세린을 회수할 수 있다.
또한, 본 출원의 O-포스포세린 생산 방법은, 추가적으로 정제 단계를 포함할 수 있다. 상기 정제는 당해 기술분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여, 수행할 수 있다. 일 예에서, 본 출원의 O-포스포세린 생산 방법이 회수 단계와 정제 단계를 모두 포함하는 경우, 상기 회수 단계와 정제 단계는 순서에 상관없이 연속적 또는 비연속적으로 수행되거나, 동시에 또는 하나의 단계로 통합되어 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 방법에서, "변이체", "폴리뉴클레오티드", "벡터" 및 "미생물" 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지 및 황화물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
구체적으로, 상기 방법은 O-포스포세린 배출 활성을 가지면서 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4 또는 서열번호 5 또는 서열번호 12 또는 서열번호 34 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 이와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.7% 또는 99.9% 이상의 상동성 또는 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드; 서열번호 1의 아미노산 서열에서 i) 129번째; ii) 241번째; iii) 129번째 및 241번째; iv) 241번째, 246번째 및 330번째; 및 v) 129번째, 241번째, 246번째, 및 330번째 위치에 상응하는 아미노산이 변이된 것을 고정된 채, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 변이형 폴리펩티드; 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및 본 출원의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 O-포스포세린 설프하이드릴라아제 또는 이를 발현하는 미생물, 상기 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법일 수 있다.
본 출원에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.
본 출원에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다. 그 예로, 시스테인의 아민기 (-NH2)의 질소 원자 또는 티올 기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 방법에 따라 시스테인을 생산하기만 한다면, 시스테인 유도체로의 전환은 당업계에 널리 알려진 방법으로 용이하게 다양한 시스테인 유도체로의 전환이 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 그 예로 시스테인을 아세틸레이션에이젼트(acetylation agent)와 반응시켜 NAC(N-acetylcysteine)를 합성하거나, 시스테인을 염기성 조건에서 할로아세틱에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)를 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로서 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린 설피드릴라제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 O-포스포세린에 티올그룹(thiol, group, SH 기)을 제공하여 상기 O-포스포세린을 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropymm pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 메그마틱스(Mycobacterium megmatics), 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K, FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums K E et al. J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005) 에서 처음으로 밝혀진 것일 수 있다. 또한, 상기 O-포스포세린 설피드릴라제는 야생형 O-포스포세린 설피드릴라제 뿐만 아니라, 상기 O-포스포세린 설피드릴라제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 O-포스포세린 설피드릴라제의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 변이체도 포함하며, 미국등록공보 US 8557549 B2 및 미국등록공보 US 9127324 B2에 개시된 O-포스포세린 설피드릴라제 및 이의 변이체도 모두 포함할 수 있다.
상기 황화물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S2-), 티올설페이트(thiosulfate, S203 2-)등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH 기)으로 전환될 수 있는 황화물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 티올 그룹을 O-포스포세린에 제공하는 Na2S, NaSH, H2S, (NH4)2S, 및 Na2S203를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 반응은 하나의 O-포스포세린 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 또는 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 O-포스포세린 몰농도의 0.1 내지 3배일 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 2배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원에서는 추가로 상기 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 당해 분야에 공지된 적합한 반응을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 수집할 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 미생물 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는 O-포스포세린 생산용 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 조성물은 O-포스포세린 생산용 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 출원의 조성물에서, "변이체", "폴리뉴클레오티드", "벡터", "미생물", "배지" 및 "O-포스포세린" 등은 상기 다른 양태에서 기재한 바와 같다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체, 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 또는 본 출원의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 미생물의 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인의 유도체 생산 용도를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 본 출원의 변이체를 이용하여 O-포스포세린을 미생물로부터 배출하는 용도를 제공하는 것이다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: YhhS 변이체 선별
OPS 배출 활성이 증가된 YhhS 변이체를 선정하기 위하여 yhhS 유전자 변이체 플라스미드 라이브러리를 제작하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli, E.coli) K12 W3110의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 하기 표 1에 나타낸 서열번호 13 및 14의 염기서열 가진 프라이머 쌍을 이용하여 임의 돌연변이 유발 PCR을 수행하였다. 수행은 다양성 PCR 무작위 돌연변이 키트(Takara)를 이용하였으며, PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
이와 같은 과정으로 제작된 돌연변이 유전자 단편들을 rhtB 프로모터가 있는 pCL1920 벡터에 넣기 위해서 우선, pCL_PrhtB를 제작하였다.
rhtB 프로모터 단편을 확보하기 위해 상기 E.coli K12 W3110의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 15 및 16를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. EcoRI과 SalI으로 잘려진 pCL1920 벡터(GeneBank No. AB236930)에 rhtB 프로모터 단편을 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하였고, pCL_PrhtB를 확보하였다. 확보한 벡터 pCL_PrhtB 벡터를 ScaI으로 자른 후, 상기 PCR을 통해 수득한 돌연변이 유전자 단편들을 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝은 50℃에서 60분간 반응시켜 이루어졌으며, 이를 통해 pCL_PrhtB-yhhS 유전자 변이체 플라스미드 라이브러리를 제작하였다. 이후, CA07-0012(KCCM 11121P, 대한민국 등록특허 제10-1381048호 및 미국 공개특허 제10-2012-0190081호)에 전기천공법으로 형질 전환시켰다.
이 중 변이체를 포함하는 균주 3종을 선별하였고, 이로부터 플라스미드를 획득하여 시퀸싱 기법을 통해 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석 결과, 선별된 변이체는 야생형 YhhS의 아미노산 서열에서 129번째 아미노산 잔기 세린이 글리신으로 치환된 변이체, 241번째 아미노산 잔기 이소류신이 글루타민으로 치환된 변이체, 241번째 아미노산 잔기 이소류신이 쓰레오닌으로 치환되고, 246번째 아미노산 잔기 아스파르트산이 발린으로 치환되고, 330번째 아미노산 잔기 발린이 이소류신으로 치환된 변이체임을 확인하였다. 상기 균주 3종은 각각 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129G), CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(I241Q) 및 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(I241T/D246V/V330I)로 명명하였다. 상기 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(I241T/D246V/V330I) 균주는 Escherichia coli CA07-0352로도 통칭되며, 부다페스트 조약 하에 한국미생물센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2020년 05월 14일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 12720P를 부여받았다.
서열번호 서열(5' -> 3')
13 GGAGTTCATCagtATGCCCGAACCCGTAGCC
14 CTGCAGGTCGAagtTTAAGATGATGAGGCGGC
15 CGACGGCCAGTGAATTCGATGGTCGATGATTAAGACATC
16 ATGCCTGCAGGTCGAAGTACTGATGAACTCCCGGTGTGTCT
실시예 2: 추가 YhhS 변이체 발현을 위한 벡터 제작
2-1. YhhS(S129A) 변이체 발현 벡터 및 발현 균주 제작
yhhS(S129A) 단편을 확보하기 위해, 서열번호 13 및 18를 이용하여 E.coli K12 W3110 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 yhhS(S129A) 상위 단편을 확보하였고, 하기 표 2에 나타낸 서열번호 19 및 14를 이용하여 동일하게 E.coli K12 W3110 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR을 통해 yhhS(S129A) 하위 단편을 확보하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다.
pCL_PrhtB 벡터를 ScaI으로 자른 후, 상기 확보한 yhhS(S129A) 상위 단편과 yhhS(S129A) 하위 단편을 인퓨전 클로닝 키트(in-fusion cloning kit, Clontech Laboratories, Inc.)를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝은 50℃에서 60분간 반응시켜 이루어졌으며, 이를 통해 pCL_PrhtB-yhhS(S129A) 확보하였다. 확보한 플라스미드는 CA07-0012에 전기천공법으로 형질 전환하여 균주 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129A)를 확보하였다.
서열번호 서열(5' -> 3')
18 TCCCGTTCCGGCAAAcgcTTGCCCAATCCCAAGGA
19 CTTGGGATTGGGCAAgcgTTTGCCGGAACGGGATC
2-2. YhhS(I241Q) 변이체 발현 벡터, YhhS(I241T) 변이체 발현 벡터 및 변이체 발현 균주 제작
라이브러리를 통해 확보한 yhhS 241번째 아미노산 잔기 이소류신이 글루타민 외 쓰레오닌으로 치환되었을 때의 OPS 생산능을 확인하기 위해서 균주를 제작하여 평가를 진행하였다.
CA07-0012 염색체상에 yhhS 241번째 아미노산 변이를 삽입하기 위해서 프로모터로는 trc를 이용하였고, 삽입 위치는 mgsA 유전자 위치를 이용하였다.
구체적으로, 염색체상 삽입을 위해서 pSKH130 벡터(미국 공개특허 제2020-0048619호, 서열번호 38)를 이용하였다. 상기 벡터는 PI 단백질(pir 유전자)에 의존성을 가지는 R6K 리플리콘(replicon), SacB(Levansucrase) 유전자 및 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하고 있으며, 상기 벡터를 이용하여 1차 교차에서 R6K 및 카나마이신을 이용하여 원하는 균주를 확보한 후, 수크로스(sucrose)가 있는 배지에서 항생제를 제거하여 균주를 제작하였다.
CA07-0012 균주의 mgsA 유전자 위치에 yhhS 241번째 아미노산 잔기가 다른 아미노산들로 치환된 형태를 도입하기 위해서 pSKH130△mgsA 플라스미드를 확보코자 하였다. pSKH130△mgsA은 mgsA ORF(open reading frame)를 결손하기 위한 벡터로 mgsA의 ORF의 양쪽 바깥쪽인 5'과 3'의 염기서열을 포함하고 있는 플라스미드이다.
하기 표 3에 나타낸 프라이머 쌍을 이용하여 각각 5' 단편과 3' 단편을 확보하였고, pSKH130 벡터를 BamHI로 자른 후, 인퓨전 클로닝 키트를 이용하여 플라스미드를 확보하였다.
서열번호 서열(5' -> 3')
mgsA 상위 단편 프라이머 쌍 20 CCTGCCATCGGATCCGGTATCCGTTTTTGCCACCA
21 ACCTGTGCAATAAGTACTAATGTACATCCGTAGTT
mgsA 하위 단편 프라이머 쌍 22 CGGATGTACATTAGTACTTATTGCACAGGTGGCAA
23 TGATATCGAATTCCTTCGCTGTTGGTGATGACTGG
trc 프로모터 단편을 확보하기 위해서 하기 표 4에 나타낸 서열번호 24 및 25를 이용하여 PCR를 수행하였다. 2종의 변이체 yhhS ORF를 확보하기 위해서 표 5에서 나타낸 프라이머 쌍을 이용하여 2종의 변이체 상위 및 하위 단편을 각각 확보하였고, 확보된 2종의 상위 및 하위 단편은 trc 프로모터 단편과 pSKH130△mgsA를 ScaI으로 자른 벡터와 함께 인퓨전 클로닝 키트를 이용하여 2종의 플라스미드를 확보하였다. 또한, 대조군으로 야생형 yhhS가 mgsA 위치에 도입된 균주를 확보하기 위해서 pSKH130△mgsA::Ptrc-yhhS 플라스미드를 제작하였다. yhhS ORF를 확보하기 위해서 서열번호 26 및 27을 가진 올리고뉴클레오티드 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였고, trc 프로모터 단편과 pSKH130△mgsA를 ScaI으로 자른 벡터와 함께 인퓨전 클로닝 키트를 이용하여 플라스미드를 확보하였다.
서열번호 서열(5' -> 3')
24 CGGATGTACATTAGTCGCTTGCTGCAACTCTCTCA
25 GATAGCTCTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCAC
서열번호 서열(5' -> 3')
I241Q 상위 단편 프라이머
쌍		 26 CACAGGAAAGATATCATGCCCGAACCCGTAGCCGA
28 GCCGGATTTGGCGTCATCGCCACCTTTcagACGCTGTTTTATGACGCT
I241Q 하위 단편 프라이머
쌍		 29 CCAACCTTTAGCGTCATAAAACAGCGTctgAAAGGTGGCGATGACGCC
27 ACCTGTGCAATAAGTTTAAGATGATGAGGCGGCCT
I241T 상위 단편 프라이머
쌍		 26 CACAGGAAAGATATCATGCCCGAACCCGTAGCCGA
30 TCATAAAACAGCGTGGTAAAGGTGGCGATGACGCC
I241T 하위 단편 프라이머
쌍		 31 TCATCGCCACCTTTACCACGCTGTTTTATGACGCT
27 ACCTGTGCAATAAGTTTAAGATGATGAGGCGGCCT
확보된 플라스미드는 CA07-0012 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 재조합(교차)에 의해 염색체에 변이가 삽입된 균주를 카나마이신 있는 LB 고체배지에서 선택한 후, 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제가 일어나도록 수크로스가 있는 배지에서 2차 재조합(교체)을 진행하였다. 상기 2차 재조합이 완료된 균주는 서열번호 20 및 27을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 통해 염색체의 mgsA 위치에 yhhS 변이체가 삽입된 균주 2종(CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T), CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241Q))을 확보하였고, 대조군이 도입된 균주(CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS)도 동일한 방법을 통해 확보하였다.
2-3. YhhS(S129G/I241Q) 변이체 발현 벡터 및 발현 균주 제작
yhhS(I241Q) 변이체 기반으로 129번째 아미노산 잔기 세린이 글리신으로 교체된 균주를 제작하였다. 이 때 프로모터는 rhtB 프로모터를 이용하였다.
구체적으로는 하기 표 6에 나타낸 서열번호 32 및 33(플라스미드 전체로 PCR_129G 시점)를 이용하여 pCL_PrhtB-yhhS(I241Q)를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 확보한 PCR 단편은 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 클로닝 하였다.
확보한 플라스미드는 CA07-0012에 전기천공법으로 형질 전환하여 균주 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129G/I241Q)를 확보하였다.
서열번호 서열(5' -> 3')
32 ATTGGGCAAgGTTTTGCCGG
33 CCGGCAAAACcTTGCCCAAT
2-4. YhhS(S129G/I241T/D246V/V330I) 변이체 발현 벡터 및 발현 균주 제작
프로모터는 trc를 이용하였고, mgsA 유전자를 결손하고 S129G/I241T/D246V/V330I 변이 삽입을 진행하였다.
구체적으로, CA07-0012 균주의 mgsA 유전자 위치에 I241T, D246V 및 V330I 변이를 도입하기 위해서 상기 실시예 2-2에서 제작한 pSKH130△mgsA 플라스미드를 이용하였다.
pSKH130△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I)를 제작하기 위해서 상기 실시예 2-2에서 확보한 trc 프로모터 단편을 동일하게 사용하였다. yhhS(I241T/D246V/V330I) ORF 단편을 확보하기 위해서 상기 pCL_Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I) 플라스미드를 주형으로 하여 서열번호 26 및 27을 이용하여 PCR을 진행하여 단편을 확보하였다. trc 프로모터 단편과 yhhS453 단편은 pSKH130△mgsA를 ScaI으로 자른 벡터와 함께 인퓨전 클로닝 키트를 이용하여 플라스미드 pSKH130△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I)를 확보하였다.
이후, 서열번호 32 및 33(플라스미드 전체로 PCR_129G 시점)를 이용하여 상기 pSKH130△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I)를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 7분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 확보한 단편은 인퓨전 클로닝 키트를 이용하여 플라스미드 pSKH130△mgsA::Ptrc-yhhS(129G/I241T/D246V/V330I)를 확보하였다.
확보된 플라스미드는 CA07-0012 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 균주는 재조합(교차)에 의해 카나마이신 있는 LB 고체배지에서 염색체에 도입된 균주가 선택이 된 후, 수크로스가 있는 배지에서 2차 재조합(교체)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제가 일어났다.
상기 2차 재조합이 완료된 균주는 서열번호 20 및 27을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 통해 염색체의 mgsA 위치에 yhhS(I241T/D246V/V330I) 및 yhhS(129G/I241T/D246V/V330I)가 삽입된 균주 2종(CA07-0012/pSKH130△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I), CA07-0012/pSKH130△mgsA::Ptrc-yhhS(129G/I241T/D246V/V330I))을 확보하였다.
실시예 3: YhhS 변이체 도입 균주의 OPS 생산능 평가
YhhS 변이체가 도입된 균주의 포스포세린(O-phosphoserine) 생산능을 평가하기 위해서 하기 배지(표 7)를 이용하여 평가하였다.
구체적으로, 배양은 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후, 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 7의 25mL 역가배지에 접종한 다음, 이를 33℃에서 200rpm으로 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 그 결과를 표 8 내지 표 11에 나타내었다.
배지성분 조제량
포도당 40g
KH2PO4(KP1) 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4.7H2O 1g
MnSO4.4H2O 5mg
FeSO4.7H2O 10mg
L-글리신 2.5g/L
호모액기스 3g/L
CaCO3 30g/L
pH 6.8
3-1: YhhS의 129번째 아미노산 치환 변이체 도입 균주의 OPS 생산능 평가
YhhS(S129G) 변이체를 도입한 균주인 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129G)의 경우 증가율이 약 252%, YhhS(S129A) 변이체를 도입한 균주인 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129A)의 경우 증가율이 약 29%임을 확인하였다(표 8).
균주 이름 OPS 농도(g/L)
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS 2.1
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129A) 2.7
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129G) 5.3
3-2: yhhS의 241번째 아미노산 잔기 치환 변이체 도입 균주의 OPS 생산능 평가
야생형 yhhS가 도입된 균주 CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS에 비해 OPS 배출능 증가율을 확인한 결과, YhhS(I241Q) 변이체를 도입한 균주 CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241Q)의 경우 증가율이 약 425%, YhhS(I241T) 변이체를 도입한 균주 CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T)의 경우 증가율이 약 233%, YhhS(I241T/D246V/V330I) 변이체를 도입한 균주 CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I)의 경우 증가율이 약 267%임을 확인하였다(표 9).
균주 이름 OPS 농도(g/L)
CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS 1.2
CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T) 2.8
CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241Q) 5.1
CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I) 3.2
3-3: YhhS의 129번째 아미노산 잔기 치환 및 yhhS 241번째 아미노산 잔기 치환 변이체 도입 균주의 OPS 생산능 평가
야생형 yhhS가 도입된 균주 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS에 비해 OPS 배출능 증가율을 확인한 결과, YhhS(I241Q) 변이체를 도입한 균주 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129G/I241Q)의 경우 증가율이 약 338%임을 확인하였다(표 10).
균주 이름 OPS 농도(g/L)
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS 2.1
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS(S129G/I241Q) 7.1
더불어, CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I)에 비해 OPS 배출능 증가율을 확인한 결과, YhhS(129G/I241T/D246V/V330I) 변이체를 도입한 균주 CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(129G/I241T/D246V/V330I)의 경우 증가율이 약 144%임을 확인하였다(표 11).
균주 이름 OPS 농도(g/L)
CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(I241T/D246V/V330I) 3.2
CA07-0012△mgsA::Ptrc-yhhS(129G/I241T/D246V/V330I) 4.6
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 및 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2022007930-appb-img-000001

Claims (17)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, YhhS 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열의 129번째 위치에 상응하는 아미노산은 극성 아미노산인, YhhS 변이체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 극성 아미노산은 세린인, YhhS 변이체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 다른 아미노산은 비극성 아미노산인, YhhS 변이체.
  5. 제4항에 있어서, 상기 비극성 아미노산은 글리신 또는 알라닌인, YhhS 변이체.
  6. 서열번호 1의 아미노산 서열의 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민으로 치환된, YhhS 변이체.
  7. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 241번째 위치에 상응하는 아미노산인 이소류신이 글루타민 또는 쓰레오닌으로 치환된, YhhS 변이체.
  8. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열의 246번째 위치에 상응하는 아미노산인 아스파르트산이 발린으로 추가로 치환, 및/또는 서열번호 1의 아미노산 서열의 330번째 위치에 상응하는 아미노산인 발린이 이소류신으로 추가로 치환된, YhhS 변이체.
  9. 제1항 또는 제6항에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 2 내지 5, 34 및 36중 선택되는 아미노산 서열과 90% 이상의 서열 동일성을 가지는, YhhS 변이체.
  10. 제1항 또는 제6항의 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제1항 또는 제6항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 에스케리키아 속 미생물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된, 미생물.
  13. 제1항 또는 제6항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  14. a) 제1항 또는 제6항의 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및
    b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지 및 황화물을 접촉시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  15. 제1항 또는 제6항의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 상기 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물; 또는 이들 중 2 이상의 조합을 포함하는, O-포스포세린 생산용 조성물.
  16. 제1항 또는 제6항의 변이체; 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드; 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 또는 상기 변이체 또는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 미생물의 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인의 유도체 생산 용도.
  17. 제1항 또는 제6항의 변이체를 이용하여 O-포스포세린을 미생물로부터 배출하는 용도.
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