WO2021251734A1 - O-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 - Google Patents

O-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 o-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법 Download PDF

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seq
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박혜민
김소연
심희진
이진남
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씨제이제일제당 (주)
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    • C12Y301/03—Phosphoric monoester hydrolases (3.1.3)
    • C12Y301/03003—Phosphoserine phosphatase (3.1.3.3)

Definitions

  • the present application relates to an O-phosphoserine (OPS) excreting protein variant and a method for producing O-phosphoserine, cysteine and derivatives of cysteine using the same.
  • OPS O-phosphoserine
  • L-cysteine is an important amino acid for sulfur metabolism in all living things. It is used not only for the synthesis of in vivo proteins such as hair keratin, glutathione, biotin, methionine and other sulfur-containing metabolites, but also as a precursor for coenzyme A biosynthesis. do.
  • O-phosphoserine O- A method of fermenting and producing phosphoserine (hereinafter “OPS”) and then reacting it with a sulfide under the catalysis of O-phosphoserine sulfhydrylase (hereinafter “OPSS”) to convert it to L-cysteine (USA) US 8557549 B2) is known.
  • OPS O-phosphoserine
  • the present inventors completed the present application by identifying a variant with increased activity in the release factor capable of smoothly draining the OPS produced in the OPS-producing strain out of the cell, and confirming that OPS release is improved due to the variant. .
  • One object of the present application is to provide a polypeptide exhibiting O-phosphoserine (OPS) excretion activity.
  • OPS O-phosphoserine
  • Another object of the present application is to provide a polynucleotide encoding the polypeptide of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a vector comprising the polynucleotide of the present application.
  • Another object of the present application is to provide an O-phosphoserine-producing microorganism comprising any one or more of the polypeptide of the present application, the polynucleotide of the present application, and the vector of the present application.
  • Another object of the present application is to provide a method for producing O-phosphoserine, comprising the step of culturing the O-phosphoserine-producing microorganism of the present application in a medium.
  • Another object of the present application is a) O-phosphoserine-producing microorganisms comprising any one or more of a) a polypeptide of the present application, a polynucleotide encoding the polypeptide of the present application, and a vector comprising the polynucleotide of the present application culturing in a medium to produce O-phosphoserine or a medium containing the same; And b) in the presence of O-phosphoserine sulfliydrylase (O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) or a microorganism expressing the same, reacting the O-phosphoserine produced in step a) or a medium containing the same with sulfide
  • O-phosphoserine sulfliydrylase O-phosphoserine sulfliydrylase
  • isoleucine (I) at position 241 is threonine (T)
  • position corresponding to position 246 of aspartic acid (D) is valine (V)
  • valine (V) at position 330 is replaced with isoleucine (I)
  • the amino acid at position 88 is phenylalanine
  • It provides a polypeptide exhibiting O-phosphoserine (OPS) excretion activity, having a sequence in which the amino acid at the position corresponding to position 207 is lysine (K).
  • OPS O-phosphoserine
  • OPS OPS sulfhydrylase
  • polypeptide exhibiting OPS excretion activity refers to a membrane protein having an activity capable of excreting OPS out of a cell.
  • the membrane protein may be derived from E. coli.
  • the polypeptide exhibiting the O-phosphoserine excretion activity of the present application may be a YhhS major facilitator superfamily (MFS) transporter or a variant thereof.
  • MFS major facilitator superfamily
  • the polypeptide of the present application exhibits enhanced OPS excretion activity than the wild-type YhhS MFS (major facilitator superfamily) transporter, which has been identified as a protein exhibiting OPS excretion activity from E. coli whose growth inhibition is released under conditions in which an excess of OPS is present. It may be a variant of the YhhS MFS transporter shown.
  • variant means that one or more amino acids differ from the recited sequence in conservative substitution and/or modification, but the function of the protein ( Functions) or properties (properties) are maintained.
  • a variant differs from the identified sequence by several amino acid substitutions, deletions or additions.
  • Such variants can generally be identified by modifying one or more amino acids in the amino acid sequence of the protein and evaluating the properties of the modified protein. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the native protein.
  • some variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, have been removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • variant may include terms such as mutant, modified, mutated protein, mutant polypeptide, and mutant (in English, modified, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant, etc.) may be used, If it is a term used in a mutated meaning, it is not limited thereto.
  • the mutant may have increased activity of the mutated protein compared to the natural wild-type or unmodified protein, but is not limited thereto.
  • conservative substitution refers to substituting one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such variants may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarity in the polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues. For example, among amino acids with electrically charged amino acids, positively charged (basic) amino acids are arginine, lysine, and histidine, and negatively charged (acidic) amino acids are glutamic acid and arpartate.
  • nonpolar amino acids include glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, methionine, phenylalanine, tryptophan and proline
  • polar or hydrophilic ( hydrophilic) amino acids include serine, threonine, cysteine, tyrosine, asparagine and glutamine
  • aromatic amino acids among the amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine.
  • variants may contain deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • the polypeptide may be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein involved in the transfer of the protein either co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • polypeptide exhibiting OPS excretion activity of the present application a) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, isoleucine (I) at position 241 is threonine (T), and aspartic acid at position 246 (D) comprises a substitution of valine (V), the valine (V) at the position corresponding to position 330 with isoleucine (I), b) the amino acid at the position 88 is phenylalanine, c) 207 A polypeptide exhibiting OPS excretion activity comprising a sequence in which the amino acid at the position corresponding to the position is lysine (K) or a) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 isoleucine (I) at the position 241 corresponding to threonine (T) wherein aspartic acid (D) at position 246 is replaced with valine (V) and valine (V) at position 330 is replaced with isoleucine (I), b) corresponding to position
  • the valine (V) at the position corresponding to position 330 comprises a substitution with isoleucine (I), b) the amino acid at the position corresponding to position 88 is phenylalanine, c) corresponding to position 207
  • a polypeptide exhibiting OPS excretion activity comprising a sequence in which the amino acid at the position of comprising the substitution of aspartic acid (D) in the position corresponding to the position to valine (V) and the valine (V) in the position corresponding to position 330 to isoleucine (I), b) the position corresponding to position 88;
  • the amino acid may be phenylalanine
  • c) may be a polypeptide exhibiting OPS excretion activity consisting
  • polypeptide having an amino acid sequence substantially exhibiting OPS excretion ability as a sequence having such identity, the amino acid position other than the 88th, 207th, 241th, 246th, and 330th amino acid positions of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 It is apparent that polypeptide variants in which some sequences of are deleted, modified, substituted or added are also included within the scope of the present application.
  • polypeptide exhibiting OPS excretion activity may be a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, described as the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity consisting essentially of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, or O-phosphoserine consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may be a polypeptide that exhibits excretion activity.
  • the polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity of the present application does not exclude the addition of meaningless sequences before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • SEQ ID NO: 1 may refer to an amino acid sequence exhibiting OPS excretion activity.
  • SEQ ID NO: 1 may be an amino acid sequence constituting a variant of the YhhS MFS transporter, which is a protein exhibiting OPS excretion activity encoded by the yhhS gene.
  • the amino acid sequence of the YhhS MFS transporter which is a protein exhibiting OPS excretion activity encoded by the yhhS gene, can be obtained from a known database, GenBank of NCBI.
  • the amino acid sequence of the YhhS MFS transporter may be, for example, SEQ ID NO: 11.
  • the amino acid sequence of MFS transporters YhhS E. coli (Escherichia coli, E. coli) may be an amino acid sequence derived from, but not limited thereto.
  • a) isoleucine (I) at position 241 is threonine (T), and aspartic acid (D) at position 246 ) is valine (V), valine (V) at position 330 contains a substitution with isoleucine (I), b) the amino acid at position 88 is phenylalanine, c) at position 207 Having a sequence in which the amino acid at the corresponding position is lysine (K), a polypeptide exhibiting O-phosphoserine (OPS) excretion activity or a poly having O-phosphoserine excretion activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • a polynucleotide encoding a peptide is provided.
  • polypeptides exhibiting SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, O-phosphoserine and O-phosphoserine excretion activity are the same as described above.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or more as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are connected in a long chain form by covalent bonds.
  • the polynucleotide may be included without limitation as long as it is a polynucleotide encoding a polypeptide exhibiting OPS excretion activity of the present application.
  • the gene encoding the amino acid sequence of the OPS excretion protein may be a yhhS gene.
  • the gene may be derived from E. coli ( Escherichia coli , E. coli ), but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide exhibiting the OPS excretion activity of the present application may have or include a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the polynucleotide encoding the polypeptide exhibiting the OPS excretion activity of the present application may consist of or consist essentially of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • various modifications may be made to the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in the organism in which the polypeptide is to be expressed.
  • the polynucleotide of the present application may include or have, for example, a nucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide of the present application may consist of or consist essentially of a nucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is limited thereto doesn't happen
  • the polynucleotide of the present application is hybridized with a probe that can be prepared from a known gene sequence, for example, a complementary sequence to all or part of the base sequence under stringent conditions, thereby obtaining the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 Any coding sequence may be included without limitation.
  • the "stringent condition” means a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. Such conditions are described in, for example, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; FM Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc., New York).
  • polynucleotides having high homology or identity with each other 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, especially 99% or more homology or identity with each other
  • Conditions under which polynucleotides hybridize with each other and polynucleotides with lower homology or identity do not hybridize, or wash conditions of conventional southern hybridization at 60° C., 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically 60° C. , 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically at a salt concentration and temperature equivalent to 68° C., 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, washing conditions once, specifically two to three times.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • the term "complementary" is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
  • adenosine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the polynucleotides of the present application may also include substantially similar nucleic acid sequences as well as isolated nucleic acid fragments complementary to the overall sequence.
  • the term 'homology' or 'identity' refers to a degree related to two given amino acid sequences or base sequences, and may be expressed as a percentage.
  • the terms homology and identity can often be used interchangeably.
  • Sequence homology or identity of a conserved polypeptide or polynucleotide is determined by standard alignment algorithms, with default gap penalties established by the program used may be used.
  • Substantially, homologous or identical sequences generally have moderate or high stringency conditions along at least about 50%, 60%, 70%, 80% or 90% of the entire or full-length sequence. It can hybridize under stringent conditions. Hybridization is also contemplated for polynucleotides containing degenerate codons instead of codons in the polynucleotides.
  • a GAP program can be defined as the total number of symbols in the shorter of two sequences divided by the number of similarly aligned symbols (ie, nucleotides or amino acids).
  • Default parameters for the GAP program are: (1) a binary comparison matrix (containing values of 1 for identity and 0 for non-identity) and Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation , pp. 353-358 (1979), Gribskov et al (1986) Nucl. Acids Res. 14: weighted comparison matrix of 6745 (or EDNAFULL (EMBOSS version of NCBI NUC4.4) substitution matrix); (2) a penalty of 3.0 for each gap and an additional 0.10 penalty for each symbol in each gap (or a gap opening penalty of 10, a gap extension penalty of 0.5); and (3) no penalty for end gaps.
  • polypeptide or polynucleotide sequences have homology, similarity or identity can be confirmed by comparing the sequences by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions, and the defined appropriate hybridization conditions are within the scope of the art. , and can be determined by a method well known to those skilled in the art (eg, J. Sambrook et al., supra).
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60°C, 63°C, or 65°C, but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the purpose.
  • a) isoleucine (I) at position 241 is threonine (T), and aspartic acid (D) at position 246 ) is valine (V), valine (V) at position 330 contains a substitution with isoleucine (I), b) the amino acid at position 88 is phenylalanine, c) at position 207
  • a vector comprising a polynucleotide encoding a polypeptide exhibiting shedding activity is provided.
  • Polypeptides and polynucleotides exhibiting SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, O-phosphoserine, and O-phosphoserine excretion activity are the same as described above.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide or protein operably linked to a suitable regulatory sequence so that the target polypeptide or protein can be expressed in a suitable host.
  • suitable regulatory sequences may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a suitable mRNA ribosome binding site sequence, and sequences regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into an appropriate host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited as long as it is capable of replication in a host cell, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include natural or recombinant plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as a phage vector or a cosmid vector
  • pBR-based, pUC-based, pBluescriptII-based plasmid vectors may be used.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based, pSK-based, pSKH-based and pET-based and the like can be used.
  • pCL, pSK, pSKH130, pDZ, pACYC177, pACYC184, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like may be used.
  • Insertion of the polynucleotide into the chromosome may be achieved by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule is inserted, and selectable such as drug resistance, auxotrophic resistance, resistance to cytotoxic agents, or expression of a surface variant protein. Markers that confer a phenotype can be used. In an environment treated with a selective agent, only the cells expressing the selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that the transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target polypeptide or protein into a host cell so that the polypeptide or protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell. it means. As long as the transformed polynucleotide can be expressed in the host cell, it may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome. In addition, the polynucleotide may include DNA and RNA encoding a target polypeptide or protein.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell and expressed in any form, as long as it can be expressed.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • operably linked means that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target polypeptide or protein of the present application and the gene sequence are functionally linked.
  • a) isoleucine (I) at position 241 is threonine (T), and aspartic acid (D) at position 246 ) is valine (V), valine (V) at position 330 contains a substitution with isoleucine (I), b) the amino acid at position 88 is phenylalanine, c) at position 207 Having a sequence in which the amino acid at the corresponding position is lysine (K), a polypeptide exhibiting O-phosphoserine (OPS) excretion activity or a poly having O-phosphoserine excretion activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It provides an O-phosphoserine-producing microorganism comprising any one or more of a vector comprising a peptide, a polynucleotide encoding the polypeptide of the present application, and a polynucleotide encoding the
  • Polypeptides, polynucleotides and vectors exhibiting SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, O-phosphoserine, and O-phosphoserine excretion activity are the same as described above.
  • O-phosphoserine (OPS) producing microorganism refers to a microorganism having a naturally weak OPS-producing ability or a microorganism to which OPS-producing ability is endowed by natural or artificial genetic modification in a parent strain without OPS-producing ability means Specifically, the microorganism may be a microorganism expressing a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto.
  • the "OPS-producing microorganism” may be used interchangeably with "a microorganism having an OPS-producing ability", "OPS-producing strain", and "OPS-producing strain”.
  • the microorganism is a vector comprising a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity of the present application, a polynucleotide encoding the polypeptide of the present application, and a polynucleotide of the present application
  • a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity of the present application a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity of the present application
  • a polynucleotide encoding the polypeptide of the present application and a polynucleotide of the present application
  • the production of OPS may be increased compared to the wild-type or pre-modified microorganism.
  • the term "enhanced compared to intrinsic activity” means that the activity of the original microorganism is increased when compared with the activity of the protein in its natural state.
  • the term “to be expressed” refers to a state in which a target polypeptide or protein is introduced into a microorganism or modified to be expressed in the microorganism.
  • the target polypeptide or protein is a polypeptide or protein existing in a microorganism, it may mean a state in which its activity is enhanced compared to before endogenous or modified.
  • the term “enhancement” of polypeptide or protein activity means that the activity of the polypeptide or protein is increased compared to the intrinsic activity.
  • the "intrinsic activity” refers to the activity of a specific polypeptide or protein originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before the transformation when the trait is changed due to genetic mutation caused by natural or artificial factors. This may be used interchangeably with “activity before modification”.
  • “Enhancement” or “increase” in the activity of a polypeptide or protein compared to the intrinsic activity means that it is improved compared to the activity of a specific polypeptide or protein originally possessed by the parent strain or unmodified microorganism before transformation.
  • the "increase in activity” may be achieved by introducing an exogenous polypeptide or protein or enhancing the activity of the endogenous polypeptide or protein, but specifically, it may be achieved through enhancing the activity of the endogenous polypeptide or protein. have. Whether the activity of the polypeptide or protein is enhanced can be confirmed from an increase in the activity level, expression level, or amount of a product discharged from the corresponding polypeptide or protein.
  • the polypeptide or protein that is, the target polypeptide or protein to be strengthened in the activity, may be a mutant of the YhhS MFS transporter, specifically, it exhibits enhanced OPS excretion activity than the wild-type YhhS MFS transporter. It may be a variant of the YhhS MFS transporter shown, but is not limited thereto.
  • the product excreted from the corresponding polypeptide or protein may be O-phosphoserine, but is not limited thereto.
  • the enhancement of the activity of the polypeptide or protein can be applied by various methods well known in the art, and may not be limited as long as the activity of the target polypeptide or protein can be enhanced compared to the microorganism before modification.
  • the method is not limited thereto, but may be one using genetic engineering or protein engineering.
  • the method for enhancing polypeptide or protein activity using the genetic engineering is, for example,
  • the method for enhancing polypeptide or protein activity using the protein engineering may be performed by, for example, a method of selecting an exposed site by analyzing the tertiary structure of the polypeptide or protein and modifying or chemically modifying it, etc. It is not limited thereto.
  • the increase in the intracellular copy number of the gene or polynucleotide encoding the polypeptide or protein can be performed by any method known in the art, for example, the gene or polynucleotide encoding the polypeptide or protein is operable. This can be accomplished by introducing a linked, host-independently replicated and functional vector into a host cell. Alternatively, a vector capable of inserting the gene or polynucleotide into a chromosome in the host cell, to which the gene is operably linked, may be introduced into the host cell, but is not limited thereto. The vector is the same as described above.
  • the method of replacing a gene expression control sequence on a chromosome encoding a polypeptide or protein with a sequence with strong activity is any method known in the art, for example, a nucleic acid to further enhance the activity of the expression control sequence Deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the sequence, or by inducing a mutation in the sequence through a combination thereof, or by replacing the sequence with a nucleic acid sequence having a stronger activity.
  • the expression control sequence is not particularly limited thereto, but may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, a sequence for controlling termination of transcription and translation, and the like.
  • the method may specifically be to link a strong heterologous promoter instead of the original promoter, but is not limited thereto.
  • CJ7 promoter (US 7662943 B2)
  • CJ1 promoter (US 7662943 B2)
  • lac promoter Trp promoter
  • trc promoter tac promoter
  • lambda phage PR promoter PL promoter
  • tet Promoters may be included, but are not limited thereto.
  • the method of modifying the nucleotide sequence of the initiation codon or 5'-UTR region of the polypeptide or protein is any method known in the art, for example, the intrinsic initiation of the intrinsic initiation codon of the polypeptide or protein. It may be substituted with another initiation codon having a higher polypeptide or protein expression rate than the codon, but is not limited thereto.
  • the method for modifying a polynucleotide sequence on a chromosome to increase the polypeptide or protein activity is any method known in the art, for example, a nucleic acid sequence to further enhance the activity of the polynucleotide sequence. Deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution or a combination thereof may be performed by inducing a mutation in the expression control sequence, or replacing it with an improved polynucleotide sequence to have stronger activity. The replacement may specifically be to insert the gene into the chromosome by homologous recombination, but is not limited thereto.
  • the vector used may further include a selection marker for confirming whether or not the chromosome is inserted.
  • the selection marker is the same as described above.
  • the introduction of a foreign polynucleotide exhibiting the activity of the polypeptide or protein can be performed by any method known in the art, for example, encoding a polypeptide or protein exhibiting the same/similar activity as the polypeptide or protein. It can be carried out by introducing a foreign polynucleotide, or a polynucleotide having a codon-optimized variant thereof into a host cell.
  • the foreign polynucleotide may be used without limitation in its origin or sequence as long as it exhibits the same/similar activity as the polypeptide or protein.
  • the introduced foreign polynucleotide can be introduced into the host cell by optimizing its codon so that the optimized transcription and translation are performed in the host cell.
  • the introduction can be carried out by appropriately selecting a known transformation method by those skilled in the art, and by expressing the introduced polynucleotide in a host cell, a polypeptide or protein is produced and its activity can be increased.
  • the combination of the methods may be performed by applying any one or more methods of 1) to 5) together.
  • Such enhancement of the polypeptide or protein activity is, the activity or concentration of the corresponding polypeptide or protein is increased relative to the activity or concentration of the polypeptide or protein expressed in the wild-type or pre-modified microbial strain, or the polypeptide or protein
  • the amount of the product produced from the protein may be increased, but is not limited thereto.
  • strain before modification or "microbe before modification” does not exclude strains containing mutations that may occur naturally in microorganisms, and is either a natural strain itself, or genetic variation caused by natural or artificial factors may mean the strain before the trait is changed.
  • pre-modified strain or "pre-modified microorganism” may be used interchangeably with “unmodified strain”, “unmodified strain”, “unmodified microorganism”, “unmodified microorganism” or “reference microorganism”.
  • the reference microorganism is a known microorganism that produces OPS, CA07-0012, endogenous SerA (D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase) and SerC (3-phosphoserine).
  • Strain CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-serC (KCCM11103P, US Patent Publication No.
  • US 8557549 B2) with enhanced activity of aminotransferase, 3-phosphoserine aminotransferase and endogenous phosphoserine phosphatase (SerB) ) may be strain CA07-0012 (KCCM 11121P, US 8557549 B2) with weakened activity, but is not limited thereto.
  • the microorganism of the present application may be a recombinant microorganism produced by transformation with a vector containing a polynucleotide encoding the polypeptide, but is not limited thereto.
  • the type of the microorganism of the present application is not particularly limited as long as it can produce OPS, and both prokaryotic and eukaryotic cells are possible, but specifically prokaryotic cells.
  • the prokaryotic cells are, for example, Escherichia genus, Erwinia genus, Serratia genus, Providencia genus, Corynebacterium genus and Brevibacterium. ( Brevibacterium ) It may include a microbial strain belonging to the genus, specifically, a microorganism of the genus Escherichia, more specifically Escherichia coli , but may be, but is not limited thereto.
  • OPS and L-serine can be produced through SerA, SerC and SerB, which are enzymes in the biosynthetic pathway of L-serine (Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol. 3, 2012 October; Wendisch VF et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74;Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;7 1(ll):7 139 -44.).
  • the OPS-producing microorganism of the present application may additionally have a weakened activity of phosphoserine phosphatase (SerB) compared to its intrinsic activity.
  • SerB phosphoserine phosphatase
  • SerB of the present application has an activity of converting OPS into L-serine (L-serine), the microorganism mutated so that the SerB activity is weakened has a characteristic of accumulating OPS and can be usefully used in the production of OPS.
  • SerB of the present application may be a protein having or comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, or a protein consisting of or essentially consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the SerB of the present application may have or include an amino acid sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3 as long as it exhibits SerB activity. .
  • the SerB of the present application may consist of or consist essentially of an amino acid sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the SerB may have or include a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide encoding the SerB may consist of or consist essentially of a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide encoding SerB of the present application may contain a variety of coding regions within a range that does not change the amino acid sequence of the SerB protein due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred in an organism to express the SerB protein. Variations can be made.
  • the polynucleotide encoding the SerB of the present application may have or include a nucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4, and less than 100%.
  • polynucleotide encoding the SerB of the present application consists of or consists essentially of a nucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% or more, and less than 100% homology or identity to the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4 may be, but is not limited thereto.
  • the term "weakened compared to intrinsic activity” means that the expression of the enzyme or protein is not expressed at all compared to the natural wild-type strain, the parent strain, or the unmodified strain of the protein, or even if it is expressed, the activity is absent or reduced. means it has been In this case, the decrease is when the activity of the protein is decreased compared to the activity of the protein of the original microorganism due to mutation of the gene encoding the protein, modification of the expression control sequence, deletion of part or all of the gene, and the gene encoding it When the overall protein activity level in the cell is lower than that of the native strain or the strain before transformation due to inhibition of expression or translation inhibition, the concept also includes a combination thereof.
  • This attenuation of protein activity can be accomplished in a variety of ways well known in the art.
  • Examples of the method include modification of a gene sequence encoding the protein on a chromosome so that the activity of the protein is removed or weakened; a method of modifying an expression control sequence to decrease the expression of the gene encoding the protein; a method of deleting all or part of a gene on a chromosome encoding the protein; a method of introducing an antisense oligonucleotide (eg, antisense RNA) that complementarily binds to the transcriptome of a gene on the chromosome and inhibits translation from the mRNA into a protein; A method of making the attachment of a ribosome impossible by artificially adding a sequence complementary to a Shine-Dalgarno sequence to the front end of the Shine-Dalgarno sequence of the gene encoding the protein to form a secondary structure ; and a method of adding a promoter transcribed in the opposite
  • the method for modifying the gene sequence on the chromosome is performed by inducing a laceration mutation such as deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the gene sequence, or a combination thereof to further weaken the activity of the protein, or It can be carried out by replacing a gene sequence modified to have activity or a gene sequence modified to not have activity.
  • the method of modifying the expression control sequence is performed by inducing a mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, of a nucleic acid sequence to further weaken the activity of the expression control sequence, or a weaker It can be carried out by replacing it with a nucleic acid sequence having activity.
  • the expression control sequence may include a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence controlling the termination of transcription and translation.
  • the method of deleting part or all of the gene encoding the protein is performed by replacing a polynucleotide encoding an endogenous target protein in a chromosome with a polynucleotide or a marker gene in which some nucleic acid sequences are deleted through a vector for chromosome insertion in bacteria.
  • a method of deleting a gene by homologous recombination may be used.
  • "some" is different depending on the type of polynucleotide in the above, it may be specifically 1 to 300, preferably 1 to 100, more preferably 1 to 50, but is not particularly limited thereto. .
  • the method of modifying the expression control sequence is performed by inducing mutation in the expression control sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, of the nucleic acid sequence to further weaken the activity of the expression control sequence, or by replacing it with a nucleic acid sequence with weak activity.
  • the expression control sequence includes a promoter, an operator sequence, a sequence encoding a ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the method of modifying the gene sequence on the chromosome is performed by inducing the mutation of the laceration by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution of the gene sequence, or a combination thereof to further weaken the activity of the protein, or to exhibit weaker activity. It can be carried out by replacing it with a gene sequence improved to have or a gene sequence improved to have no activity.
  • the microorganism producing the OPS of the present application may additionally have enhanced activity of phosphoglycerate dehydrogenase (SerA) or phosphoserine aminotransferase (SerC) compared to the intrinsic activity. have.
  • SerA phosphoglycerate dehydrogenase
  • SerC phosphoserine aminotransferase
  • the SerA is a protein having an activity of converting 3-phosphoglycerate to 3-phospho-hydroxypymvate, and the SerC is 3-phosphohydroxypymvate. It is a protein having the activity of converting rubate into OPS. Therefore, the microorganisms with enhanced SerA or/and SerC activity can be usefully used as OPS-producing strains.
  • the SerA is not limited thereto, but may be a protein having or comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 6, or a protein consisting of or consisting essentially of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 6.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 is a sequence of wild-type SerA
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 is a sequence of a SerA mutant in which feedback to serine is canceled.
  • the SerA of the present application has at least 80%, 90%, homology or identity with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 or 6, as long as the activity of wild-type SerA or the activity of a SerA mutant in which feedback to serine is canceled, It may have or include, but is not limited to, 95% or 99% or more, and less than 100% amino acid sequence.
  • the SerA of the present application has at least 80%, 90% homology or identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO. It may consist of or consist essentially of at least 95% or 99% and less than 100% of the amino acid sequence.
  • the SerA mutant in which the feedback to serine has been canceled introduces a mutation by inserting the nucleotide of the gene encoding SerA or substituting the gene encoding the wild-type SerA, and its activity from feedback inhibition by serine or glycine It refers to the case of maintaining or enhancing the serine, and SerA variants in which the feedback to serine is canceled are already well known (Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA). et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276:17844-17850, 2001; Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 60:37-441, 2002; US Publication No. 6258573 B1).
  • polynucleotide encoding the wild-type SerA or the SerA variant in which feedback for serine is canceled may have or include a nucleotide sequence encoding any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 to 6.
  • polynucleotide encoding the wild type of SerA or the SerA variant in which feedback for serine has been canceled may consist of or consist essentially of a nucleotide sequence encoding any one of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NOs: 5 to 6, It is not limited thereto.
  • the polynucleotide encoding the wild type of SerA or the SerA variant in which feedback for serine is canceled is due to codon degeneracy or considering codons preferred in an organism to express the polypeptide, wild type or serine of the SerA Various modifications may be made to the coding region within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide encoding the SerA variant for which feedback for the SerA variant has been canceled.
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 may be a nucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95%, or 99% or more homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7, and SEQ ID NO: 6
  • the nucleotide sequence encoding the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 8 may be a nucleotide sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8, but is not limited thereto.
  • the SerC may be, for example, a protein having or comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, or a protein consisting of or essentially consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, but is not limited thereto.
  • the SerC has or comprises an amino acid sequence that is at least 80%, 90%, 95% or 99% or more and less than 100% homology or identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9. can, but is not limited thereto.
  • the SerC consists of an amino acid sequence having at least 80%, 90%, 95% or 99% or more, and less than 100% homology or identity to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9, or may be compulsory.
  • polynucleotide encoding the SerC may have a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 9.
  • various modifications can be made to the coding region within the range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or in consideration of codons preferred by the organism to express the polypeptide.
  • the polynucleotide encoding the SerC may have or include, for example, a nucleotide sequence having 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10, but is not limited thereto. .
  • polynucleotide encoding SerC of the present application may consist of or consist essentially of a nucleotide sequence having 80%, 90%, 95% or 99% or more homology or identity with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 10.
  • microorganism may be a microorganism that further reduces the ability of OPS to enter cells or degrade.
  • a) isoleucine (I) at position 241 is threonine (T), and aspartic acid (D) at position 246 ) is valine (V), valine (V) at position 330 contains a substitution with isoleucine (I), b) the amino acid at position 88 is phenylalanine, c) at position 207 A polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity having a sequence in which the amino acid at the corresponding position is lysine (K) or a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, the polypeptide of the present application It provides a method for producing O-phosphoserine, comprising the step of culturing an O-phosphoserine-producing microorganism in a medium, comprising any one or more of the encoding polynucleotide and the vector
  • Polypeptides, polynucleotides, vectors and microorganisms exhibiting SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, O-phosphoserine, and O-phosphoserine excretion activity are as described above.
  • the term "cultivation” means growing the microorganism in an appropriately controlled environmental condition.
  • the culture process of the present application may be made according to a suitable medium and culture conditions known in the art. Such a culture process can be easily adjusted and used by those skilled in the art according to the selected strain.
  • the culture may be a batch type, a continuous type, and a fed-batch type, but is not limited thereto.
  • Glycine may be provided in the form of purified glycine, yeast extract containing glycine, tryptone, and the concentration contained in the culture medium may be usually 0.1 to 10 g/L, specifically 0.5 to 3 g/L.
  • serine may be provided in the form of purified serine, yeast extract containing serine, tryptone, etc., and the concentration contained in the culture medium may be usually 0.1 to 5 g/L, specifically 0.1 to 1 g/L.
  • Carbon sources included in the medium include glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, starch, sugars and carbohydrates such as cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, fatty acids such as stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid, and these substances may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • sugars and carbohydrates such as cellulose, oils and fats such as soybean oil, sunflower oil, castor oil, coconut oil, palmitic acid, fatty acids such as stearic acid and linoleic acid, alcohols such as glycerol and ethanol, and organic acids such as acetic acid, and these substances may be used individually or as a mixture, but are not limited thereto.
  • organic nitrogen sources such as peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor and soybean wheat and inorganic nitrogen sources such as urea, ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, anmonium carbonate and ammonium nitrate are included. and these nitrogen sources may be used alone or in combination, but are not limited thereto.
  • potassium hydrogen phosphate dipotassium hydrogen phosphate and the corresponding sodium-containing salt may be included, but the present invention is not limited thereto.
  • the medium may contain a metal salt such as magnesium sulfate or iron sulfate, and in addition, amino acids, vitamins and appropriate precursors may be included. These media or precursors may be added to the culture in a batch or continuous manner, but is not limited thereto.
  • chemicals such as ammonium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia, phosphoric acid and sulfuric acid can be added to the culture in an appropriate manner to adjust the pH of the culture.
  • an antifoaming agent such as fatty acid polyglycol ester can be used to suppress foaming.
  • oxygen or oxygen-containing gas may be injected into the culture, or nitrogen, hydrogen or carbon dioxide gas may be injected with or without gas to maintain anaerobic and microaerobic conditions.
  • the temperature of the culture may be usually 25 °C to 40 °C, specifically 30 °C to 35 °C.
  • the incubation period of the culture may be continued until the desired production of useful substances is obtained, and specifically may be 10 to 100 hours. However, it is not limited to these examples.
  • the present application may additionally include the step of preparing a medium before the culturing step in the method of the present application, but is not limited thereto.
  • the present application may further include the step of recovering the OPS produced in the culturing step in the method of the present application after the culturing step, and the method is a culture method, for example, a batch, continuous or fed-batch culture method. Accordingly, the desired OPS may be isolated and purified from the culture medium using a suitable method known in the art and collected, but is not limited thereto.
  • the present application relates to a) in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11, a) isoleucine (I) at position 241 is threonine (T), and aspartic acid at position 246 is (D) comprises a substitution of valine (V), the valine (V) at the position corresponding to position 330 with isoleucine (I), b) the amino acid at the position 88 is phenylalanine, c) 207 Polypeptide showing O-phosphoserine excretion activity having a sequence in which the amino acid at the position corresponding to the second is lysine (K) or O-phosphoserine excretion activity having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, poly of the present application Culturing the O-phosphoserine-producing microorganism comprising any one or more of a vector comprising a polynucleotide encoding a peptide and a polynucleotide of the present application in a medium
  • Polypeptides, polynucleotides, vectors and microorganisms exhibiting SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 1, O-phosphoserine, and O-phosphoserine excretion activity are as described above.
  • derivative refers to a similar compound obtained by chemically changing a part of a certain compound, and usually refers to a compound in which a hydrogen atom or a specific atomic group is substituted with another atom or atomic group.
  • cyste derivative refers to a compound in which a hydrogen atom or a specific atomic group of cysteine is substituted with another atom or atomic group.
  • it may be a form in which another atom or group is attached to a nitrogen atom of an amine group (-NH 2 ) of cysteine or a sulfur atom of a thiol group (-SH), for example, NAC (N-acetylcysteine), SCMC (S -Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2- Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Sel
  • cysteine As long as cysteine is produced according to the method of the present application, the conversion to a cysteine derivative can be easily converted into various cysteine derivatives by a method well known in the art.
  • the method for producing the cysteine derivative may further include the step of converting the cysteine produced in step b) into a cysteine derivative, for example, by reacting cysteine with an acetylation agent to form NAC ( N-acetylcysteine) or by reacting cysteine with haloacetic acid under basic conditions to synthesize S-Carboxymetylcysteine (SCMC), but is not limited thereto.
  • NAC N-acetylcysteine
  • SCMC S-Carboxymetylcysteine
  • the cysteine derivative is mainly used as a pharmaceutical raw material as an antitussive, a cough reliever, bronchitis, bronchial asthma and sore throat, but is not limited thereto.
  • OPS O-phosphoserine sulfhydrylase
  • the OPSS includes not only the wild-type OPSS protein, but also a mutant protein in which some of the polynucleotide sequences encoding the OPSS are deleted, substituted, or added, and exhibiting an activity equal to or higher than that of the wild-type OPSS protein. and OPSS protein disclosed in US Patent Publication No. US 8557549 B2 and US Registration Publication US 9127324 B2, and mutant proteins thereof may also be included.
  • the sulfide is provided in the form of a liquid or gas due to differences in pH, pressure, and solubility, as well as a solid commonly used in the art, so that sulfide (S 2- ), thiosulfate (thiosulfate, S 2 0 3 ) If it is a sulfide that can be converted to a thiol group (SH group) in the form of 2- ), etc., it can be used without limitation. Specifically, Na 2 S, NaSH, H 2 S, (NH 4 ) 2 S, NaSH, and Na 2 S 2 0 3 that provide a thiol group to the OPS may be used, but are not limited thereto.
  • the reaction is a reaction for preparing one cysteine or cysteine derivative by providing one thiol group to one OPS reactor, and the amount of sulfide added in the reaction may be 0.1 to 3 times the molar concentration of OPS, specifically, 1 to 2 It may be a ship, but is not limited thereto.
  • the present application may further include the step of recovering the cysteine produced through the reaction step.
  • the desired cysteine may be isolated and purified from the reaction solution and collected using a suitable reaction known in the art.
  • a) isoleucine (I) at position 241 is threonine (T)
  • aspartic acid (D) at position 246 ) is valine (V)
  • valine (V) at position 330 contains a substitution with isoleucine (I)
  • the amino acid at position 88 is phenylalanine
  • c) at position 207 It provides a use for producing a derivative of O-phosphoserine, cysteine or cysteine of a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity having a sequence in which the amino acid at the corresponding position is lysine (K) do.
  • a) isoleucine (I) at position 241 is threonine (T)
  • aspartic acid at position 246 ( D) comprises a substitution for valine (V), the valine (V) at position 330 corresponding to isoleucine (I)
  • the amino acid at position 88 is phenylalanine
  • c) 207 It provides the use of excreting O-phosphoserine of a polypeptide having an amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a polypeptide exhibiting O-phosphoserine excretion activity having a sequence in which the amino acid at a position corresponding to lysine (K) is lysine (K) from a microorganism. .
  • SEQ ID NO: 11 SEQ ID NO: 1, O-phosphoserine, cysteine, and cysteine are as described above.
  • Example 1 Preparation of yhhS major facilitator superfamily (MFS) transporter variants
  • OPS O-phosphoserine
  • the pCL_PrhtB vector was prepared. PCR was performed with specific primer pairs (SEQ ID NOs: 16 and 17) to secure the rhtB promoter (SEQ ID NO: 15) fragment. For PCR, denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • pCL_PrhtB was obtained by inserting the rhtB promoter fragment into the pCL1920 vector (GeneBank No AB236930) cut with SacI and SmaI. After the pCL_PrhtB vector was cut with SmaI and PstI, the mutant gene fragments obtained through the PCR were cloned using an in-fusion cloning kit (Clontech Laboratories, Inc.). Cloning was performed by reacting at 50° C. for 60 minutes, thereby preparing a pCL_PrhtB-yhhS gene mutant plasmid library.
  • the primer sequences used herein are shown in Table 1 below.
  • primer vector 13 CACCGGGAGCCCGGGAtgCCCGAACCCGTAGCCGA pCL_PrhtB-yhhS library 14 CTTGCATGCCTGCAGttaAGATGATGAGGCGGCCT 16 CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA pCL_PrhtB 17 TACGGGTTCGGGcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
  • Recombinant plasmid libraries prepared by the above process were screened using high throughput screening (HTS).
  • HTS high throughput screening
  • strain CA07-0012 KCCM 11121P, US 8557549 B2 in which the activity of endogenous phosphoserine phosphatase (serB) was weakened in E. coli wild-type strain W3110 was used.
  • the prepared pCL_PrhtB-yhhS gene mutant plasmid library was transformed into the base strain CA07-0012 by electroporation, and then an excess of OPS was added medium condition. 3 types of colonies from which growth degradation was canceled were selected by culturing in Then, plasmids were obtained from three selected colonies, and nucleotide sequences were analyzed through sequencing techniques.
  • the yhhS gene mutant involved in releasing the growth degradation under the excessive OPS addition condition is selected, and the yhhS gene mutant yhhS M45 having the existing increased OPS excretion activity (U.S. Publication No. 2019-0233859) A1) A better variant was obtained, and it was named yhhS453.
  • YhhS453 has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Example 1 One mutant plasmid pCL_PrhtB-yhhS453 identified in Example 1 was transformed into OPS-producing strain CA07-0012 by electroporation commonly used in the art. Through this, CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS453, an OPS-producing strain into which the yhhS gene mutant yhhS453 was introduced, was prepared, and its O-phosphoserine-producing ability was evaluated.
  • each strain was plated on LB solid medium, and then cultured overnight in an incubator at 33°C.
  • the strain cultured overnight in LB solid medium was inoculated into the 25mL titer medium shown in Table 2 below, and then incubated for 48 hours in an incubator at 200rpm at 33°C, and the results are shown in Table 3.
  • the CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS453 was named Escherichia coli CA07-0352.
  • the CA07-0352 strain was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on May 14, 2020 under the Budapest Treaty and was given an accession number KCCM 12720P.
  • serA D-3-phosphoglycerate dehydrogenase, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase
  • serC 3-phospho Strain CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-serC (KCCM11103P, US Publication No. US 8557549 B2) with enhanced activity of porcelain aminotransferase, 3-phosphoserine aminotransferase
  • yhhS453 was cloned into the HindIII restriction enzyme site of the pCL_Prmf-serA*(G336V)-serC vector.
  • yhhS453 gene fragment was obtained through PCR using the primer pair of SEQ ID NOs: 18 and 19. For PCR, denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • the yhhS453 gene fragment obtained through the PCR was cloned using an infusion cloning kit. Cloning was performed by reaction at 50° C. for 60 minutes, and through this, pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453 mutant plasmid was prepared.
  • primer vector 18 CACGGTTAAAAGCTTCGATGGTCGATGATTAAGAC pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453 19 GATTACGCCAAGCTTttaAGATGATGAGGCGGCCT
  • Each of the plasmids prepared above was transformed into an OPS producing strain CA07-0022 by an electroporation method commonly used in the art.
  • CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453 an OPS-producing strain into which the yhhS gene mutant yhhS453 was introduced, was prepared, and its O-phosphoserine-producing ability was evaluated.
  • Each strain was plated on LB solid medium, and then cultured overnight in an incubator at 33°C.
  • the strain cultured overnight in LB solid medium was inoculated into the 25ml titer medium of Table 2, and then cultured for 48 hours in an incubator at 200rpm at a temperature of 33°C, and the results are shown in Table 5 below.
  • the CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453 was named Escherichia coli CA07-0353.
  • the CA07-0353 strain was deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on May 14, 2020 under the Budapest Treaty and was given an accession number KCCM 12721P.
  • pSKH130 vector SEQ ID NO: 30
  • the vector contains R6K replicon, SacB (Levansucrase) gene, and kanamycin resistance gene that are dependent on PI protein (pir gene), and R6K and kanamycin are produced in the first crossover using the vector.
  • pSKH130_yhhS453 vector was constructed to replace autologous yhhS in strain CA07-0022 with yhhS453.
  • pSKH130-yhhS453 pCL_PrhtB-yhhS453 obtained in Example 1 was used as a template, and PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NOs: 20 and 21 to obtain a yhhS453 gene fragment.
  • the transformed strain was selected by recombination (crossover), and the strain introduced into the chromosome in LB solid medium with kanamycin was selected, and then excision of the plasmid site from the chromosome was performed through secondary recombination (replacement) in medium with sucrose. .
  • the strain CA07-0022::yhhS453 strain was prepared through PCR and sequencing analysis using the primer pair of SEQ ID NOs: 22 and 23 for the strain in which the secondary recombination was completed.
  • pSKH130-Ptrc-yhhS453' was prepared. Specifically, using the E. coli wild-type strain W3110 as a template, PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NOs: 24 and 25 to obtain a yhhSUP DNA fragment. For PCR, denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NOs: 26 and 27 to obtain a DNA fragment of Ptrc.
  • denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NOs: 28 and 29 using pCL_PrhtB-yhhS453 as a template to obtain a yhhS453 fragment.
  • PCR For PCR, denaturation at 94°C for 5 minutes, denaturation at 94°C for 30 seconds, annealing at 55°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute were repeated 30 times, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • pSKH_yhhSUP_Ptrc-yhhS453 was obtained by performing IST with the pSKH130 vector treated with EcoRV. The obtained plasmid was transformed into CA7-0022::yhhS453 strain by electroporation.
  • the strain introduced into the chromosome on LB solid medium with kanamycin was selected by primary crossover, and then excision of the plasmid site from the chromosome occurred through secondary recombination (replacement) in medium with sucrose.
  • the strain in which the secondary recombination was completed was confirmed using the primer pair of SEQ ID NOs: 22 and 23.
  • the prepared strain was named CA07-0022::Ptrc-yhhS453.
  • the primer sequences used herein are shown in Table 6 below.
  • CA07-0022::Ptrc-yhhS As a control, CA07-0022::Ptrc-yhhS, CA07-0022::Ptrc-yhhS M25, CA07-0022::Ptrc-yhhS M45 strains prepared in the same manner as above were used.
  • the nucleotide sequence of the primer used for PCR was the same as above.
  • the OPS-producing ability was confirmed.
  • each strain was spread on LB solid medium, it was cultured overnight in an incubator at 33° C., and the cultured strains were inoculated into the 25ml titer medium of Table 1 above. Thereafter, the inoculated strain was cultured for 48 hours in an incubator at a temperature of 33° C. at 200 rpm, and the results are shown in Table 7 below.

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Abstract

본 출원은 O-포스포세린((O-phosphoserine, OPS) 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.

Description

O-포스포세린 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 이의 유도체의 생산방법
본 출원은 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 단백질 변이체 및 이를 이용한 O-포스포세린, 시스테인 및 시스테인의 유도체의 생산방법에 관한 것이다.
L-시스테인은 모든 생물체의 황 대사에 있어서 중요한 아미노산으로, 모발의 케라틴 등 생체 내 단백질, 글루타치온, 바이오틴, 메치오닌 및 기타 황을 함유한 대사산물의 합성에 사용될 뿐만 아니라 코엔자임 A 생합성의 전구 물질로 사용된다.
미생물을 이용하여 L-시스테인을 생산하는 방법으로 1) 미생물을 이용하여 D,L-ATC(D,L-2-aminothiazoline-4-carboxylic acid)를 생물학적으로 전환하는 방법, 2) 대장균을 이용한 L-시스테인을 생산하는 직접 발효 방법(미국공개공보 US 5972663 A; Wada M andTakagi H , Appl. Microbiol. Biochem., 73:48-54, 2006), 3) 미생물을 이용하여 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")을 발효 생산한 후, O-포스포세린 설피드릴라아제(O-phosphoserine sulfhydrylase, 이하 "OPSS")의 촉매 작용 하에 황화물과 반응시켜 L-시스테인으로 전환시키는 방법(미국등록공보 US 8557549 B2)이 공지되어 있다.
이 때, 상기 3) 방법으로 고수율의 시스테인을 생산하기 위해서는 전구체인 OPS를 과량 생산하여야 할 필요가 존재하였다.
본 발명자들은 OPS 생산 균주에서 생산된 OPS를 세포 밖으로 원활하게 배출시킬 수 있는 배출 인자에 있어서, 이의 활성이 증대된 변이체를 규명하고, 상기 변이체로 인하여 OPS 배출이 향상됨을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
본 출원의 하나의 목적은 O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 폴리펩타이드, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 하나의 목적은 본 출원의 O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 하나의 목적은 a) 본 출원의 폴리펩타이드, 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 이용하여, O-포스포세린 생산능을 갖는 미생물을 배양하는 경우, 기존 비변형 또는 변이체 단백질을 이용한 경우에 비해 고수율의 O-포스포세린 생산이 가능하다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태로, 본 출원은 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 제공한다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")"은 세린의 인산(phosphoric acid) 에스테르로서, 여러 단백질의 구성요소이다. 상기 OPS는 L-시스테인의 전구체로서, OPS 설피드릴라아제(OPS sulfhydrylase, OPSS)의 촉매 작용 하에 황화물과 반응하여 시스테인으로 전환될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다(미국등록공보 US 8557549 B2).
본 출원에서 용어, "OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드"는 OPS를 세포 밖으로 배출할 수 있는 활성을 가지는 막 단백질을 의미한다. 상기 막 단백질은 대장균 유래일 수 있다. 본 출원에 있어서, 상기 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 본 출원의 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 YhhS MFS(major facilitator superfamily) 트랜스포터 또는 이의 변이체일 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 폴리펩타이드는 과량의 OPS가 존재하는 조건하에서 생육 저해가 해제된 대장균으로부터 OPS 배출 활성을 나타내는 단백질로 규명된 야생형 YhhS MFS(major facilitator superfamily) 트랜스포터 보다 증진된 OPS 배출 활성을 나타내는 YhhS MFS 트랜스포터의 변이체일 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 단백질을 지칭한다. 변이체는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 단백질의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 단백질의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이된 단백질, 변이형 폴리펩티드, 변이 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified protein, modified polypeptide, mutant, mutein, divergent, variant 등)가 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상, 상기 변이체는 천연의 야생형 또는 비변형 단백질 대비 변이된 단백질의 활성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이체는 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 전하를 띠는 곁사슬(electrically charged amino acid)을 갖는 아미노산 중 양으로 하전된(염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을, 음으로 하전된(산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 전하를 띠지 않는 곁사슬(uncharged amino acid)을 갖는 아미노산 중 비극성 아미노산(nonpolar amino acid)은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판 및 프롤린을 포함하고, 극성(polar) 또는 친수성(hydrophilic) 아미노산은 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함하고, 상기 아미노산 중 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신을 포함한다.
또한, 변이체는 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널(또는 리더) 서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 포함하는 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 포함하는 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 출원의 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 포함하는 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드일 수 있다.
또한, 본 출원의 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는 폴리펩타이드이면서, 서열번호 11 또는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만의 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 가지고, 실질적으로 상기 폴리펩타이드와 동일하거나 상응하는 OPS 배출능을 나타내는 폴리펩타이드라면 제한없이 포함할 수 있다. 더불어, 이러한 동일성을 갖는 서열로서 실질적으로 OPS 배출능을 나타내는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드라면, 서열번호 11의 아미노산 서열의 88번째, 207번째, 241번째, 246번째, 330번째에 상응하는 아미노산 위치 이외의 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 폴리펩타이드 변이체도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
구체적으로, 본 출원에 따른 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드일 수 있다.
본 출원에서 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열로 기재된 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 서열번호 1의 아미노산 서열로 필수적으로 구성되는(consisting essentially of) O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드일 수 있다. 또한, 본 출원의 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가를 제외하는 것이 아니다.
본 출원에서 상기 서열번호 1은 OPS 배출 활성을 나타내는 아미노산 서열을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1은 yhhS 유전자에 의해 코딩되는 OPS 배출 활성을 나타내는 단백질인 YhhS MFS 트랜스포터의 변이체를 이루는 아미노산 서열일 수 있다.
상기 yhhS 유전자에 의해 코딩되는 OPS 배출 활성을 나타내는 단백질인 YhhS MFS 트랜스포터의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 상기 YhhS MFS 트랜스포터의 아미노산 서열은 일 예로, 서열번호 11일 수 있다. 또한, YhhS MFS 트랜스포터의 아미노산 서열은 대장균(Escherichia coli, E. coli) 유래의 아미노산 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
상기 서열번호 11, 서열번호 1, O-포스포세린 및 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥을 의미한다.
상기 폴리뉴클레오타이드는, 본 출원의 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 OPS 배출 단백질의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 yhhS 유전자일 수 있다. 또한, 상기 유전자는 대장균(Escherichia coli, E. coli) 유래일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 OPS의 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 또한, 본 출원의 OPS의 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 1로 기재한 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 서열번호 2의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 염기서열을 포함하거나 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구현예로, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오타이드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 폴리뉴클레오타이드끼리, 40% 이상, 구체적으로 90% 이상, 보다 구체적으로 95% 이상, 더욱 구체적으로 97% 이상, 특히 구체적으로 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 폴리뉴클레오타이드끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ХSSC, 0.1% SDS, 구체적으로 60℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로 68℃, 0.1ХSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원의 폴리뉴클레오타이드는 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 '상동성(homology)' 또는 '동일성(identity)'은 두 개의 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 관련된 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 용어 상동성 및 동일성은 종종 상호교환적으로 이용될 수 있다.
보존된(conserved) 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 서열 상동성 또는 동일성은 표준 배열 알고리즘에 의해 결정되며, 사용되는 프로그램에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티가 함께 이용될 수 있다. 실질적으로, 상동성을 갖거나(homologous) 또는 동일한(identical) 서열은 일반적으로 서열 전체 또는 전체-길이의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%를 따라 중간 또는 높은 엄격한 조건(stringent conditions)에서 하이브리드할 수 있다. 하이브리드화는 폴리뉴클레오타이드에서 코돈 대신 축퇴 코돈을 함유하는 폴리뉴클레오타이드 또한 고려된다.
임의의 두 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는, 예를 들어, Pearson et al (1988)[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하여 "FASTA" 프로그램과 같은 공지의 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다. 또는, EMBOSS 패키지의 니들만 프로그램(EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277)(버전 5.0.0 또는 이후 버전)에서 수행되는 바와 같은, 니들만-운치(Needleman-Wunsch) 알고리즘(Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453)이 사용되어 결정될 수 있다(GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994, 및 [CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073을 포함한다). 예를 들어, 국립 생물공학 정보 데이터베이스 센터의 BLAST, 또는 ClustalW를 이용하여 상동성, 유사성 또는 동일성을 결정할 수 있다.
폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 상동성, 유사성 또는 동일성은, 예를 들어, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482 에 공지된 대로, 예를 들면, Needleman et al. (1970), J Mol Biol. 48:443과 같은 GAP 컴퓨터 프로그램을 이용하여 서열 정보를 비교함으로써 결정될 수 있다. 요약하면, GAP 프로그램은 두 서열 중 더 짧은 것에서의 기호의 전체 수로, 유사한 배열된 기호(즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산)의 수를 나눈 값으로 정의할 수 있다. GAP 프로그램을 위한 디폴트 파라미터는 (1) 이진법 비교 매트릭스(동일성을 위해 1 그리고 비-동일성을 위해 0의 값을 함유함) 및 Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)에 의해 개시된 대로, Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745의 가중된 비교 매트릭스(또는 EDNAFULL(NCBI NUC4.4의 EMBOSS 버전) 치환 매트릭스); (2) 각 갭을 위한 3.0의 페널티 및 각 갭에서 각 기호를 위한 추가의 0.10 페널티(또는 갭 개방 패널티 10, 갭 연장 패널티 0.5); 및 (3) 말단 갭을 위한 무 페널티를 포함할 수 있다.
또한, 임의의 두 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열이 상동성, 유사성 또는 동일성을 갖는지 여부는 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)으로 결정될 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오타이드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오타이드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 제공한다.
상기 서열번호 11, 서열번호 1, O-포스포세린, O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pSK계, pSKH계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로 pCL, pSK, pSKH130, pDZ, pACYC177, pACYC184, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동 재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 변이형 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오타이드가 코딩하는 폴리펩타이드 또는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오타이드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오타이드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오타이드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오타이드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 유전자 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미한다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물을 제공한다.
상기 서열번호 11, 서열번호 1, O-포스포세린, O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 벡터에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어 "O-포스포세린(OPS) 생산 미생물"은, 자연적으로 약한 OPS 생산능을 가지고 있는 미생물 혹은 OPS 생산능이 없는 모균주에 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어나 OPS 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 구체적으로 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드를 발현하는 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서 상기 "OPS 생산 미생물"은 "OPS 생산능을 갖는 미생물", "OPS 생산균주", "OPS 생산주"과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 출원의 목적상, 상기 OPS 생산 미생물의 경우, 상기 미생물은 본 출원의 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함함으로써, 이로부터 발현되는 상기 폴리펩타이드의 활성이 강화됨에 따라, OPS의 생산량이 야생형 또는 변형 전 미생물에 비해 증가한 것일 수 있다. 이는 야생형 미생물이 OPS를 생산하지 못하거나, OPS를 생산하더라도 극미량을 생산할 수 있는 것에 반해, 본 출원의 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 도입하고 이의 활성을 강화함으로써 OPS 생산량을 증가시킬 수 있다는 것에 의의가 있을 수 있다. 즉, 본 출원의 OPS 생산 미생물은 본 출원의 OPS 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "내재적 활성에 비해 강화" 는 본래 미생물이 천연의 상태에서 가지고 있는 단백질의 활성과 비교하였을 때, 그 활성이 증가된 것을 의미한다.
본 출원에서 용어, "발현되도록/되는"은 목적 폴리펩타이드 또는 단백질이 미생물 내에 도입되거나, 미생물 내에서 발현되도록 변형된 상태를 의미한다. 상기 목적 폴리펩타이드 또는 단백질이 미생물 내 존재하는 폴리펩타이드 또는 단백질인 경우, 내재적 또는 변형 전에 비하여 그 활성이 강화된 상태를 의미할 수 있다.
본 출원에서 용어, 폴리펩타이드 또는 단백질 활성의 "강화"는, 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 증가되는 것을 의미한다. 상기 "내재적 활성"은 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화하는 경우, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성을 의미한다. 이는 "변형 전 활성"과 혼용되어 사용될 수 있다. 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성이 내재적 활성에 비하여 "강화" 또는 "증가"한다는 것은, 형질 변화 전 모균주 또는 비변형 미생물이 본래 가지고 있던 특정 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성에 비하여 향상된 것을 의미한다.
상기 "활성 증가"는 외래의 폴리펩타이드 또는 단백질을 도입하거나, 내재적인 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성 강화를 통해 달성할 수 있으나, 구체적으로는 내재적인 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성 강화를 통해 달성하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성의 강화 여부는 해당 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성 정도, 발현량 또는 해당 단백질로부터 배출되는 산물의 양의 증가로부터 확인할 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 활성 강화의 대상이 되는 폴리펩타이드 또는 단백질, 즉, 목적 폴리펩타이드 또는 단백질은 YhhS MFS 트랜스포터의 변이체일 수 있고, 구체적으로는 야생형 YhhS MFS 트랜스포터 보다 증진된 OPS 배출 활성을 나타내는 YhhS MFS 트랜스포터의 변이체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 출원에 있어서, 상기 해당 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 배출되는 산물은 O-포스포세린일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성의 강화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용이 가능하며, 목적 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성을 변형전 미생물보다 강화시킬 수 있는 한, 제한되지 않을 수 있다. 상기 방법은 이로 제한되는 것은 아니나, 유전자 공학 또는 단백질 공학을 이용한 것일 수 있다.
상기 유전자 공학을 이용하여 폴리펩타이드 또는 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면,
1) 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가,
2) 상기 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법,
3) 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법,
4) 상기 폴리펩타이드 또는 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티스 서열을 변형시키는 방법,
5) 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드의 도입, 또는
6) 상기 방법들의 조합 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단백질 공학을 이용하여 폴리펩타이드 또는 단백질 활성을 강화하는 방법은, 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 단백질의 삼차구조를 분석하여 노출 부위를 선택하여 변형하거나 화학적으로 수식하는 방법 등에 의하여 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 1) 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내 카피수 증가는, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 해당 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드가 작동가능하게 연결된, 숙주와 무관하게 복제되고 기능할 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있다. 또는, 상기 유전자가 작동가능하게 연결된, 숙주세포 내의 염색체 내로 상기 유전자 또는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있는 벡터가 숙주세포 내에 도입됨으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 2) 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자 발현 조절 서열을 활성이 강력한 서열로 교체하는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 가지는 핵산 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 발현 조절 서열은, 특별히 이에 제한되지 않으나 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열 등을 포함할 수 있다. 상기 방법은 구체적으로 본래의 프로모터 대신 강력한 이종 프로모터를 연결시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
공지된 강력한 프로모터의 예에는 CJ7 프로모터(미국등록공보 US 7662943 B2), CJ1 프로모터(미국등록공보 US 7662943 B2), lac 프로모터, Trp 프로모터, trc 프로모터, tac 프로모터, 람다 파아지 PR 프로모터, PL 프로모터 및 tet 프로모터가 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 3) 폴리펩타이드 또는 단백질의 개시코돈 또는 5'-UTR 지역의 염기서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 내재적 개시코돈을 상기 내재적 개시코돈에 비해 폴리펩타이드 또는 단백질 발현율이 더 높은 다른 개시코돈으로 치환하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 4) 상기 폴리펩타이드 또는 단백질 활성이 증가되도록 염색체 상의 폴리뉴클레오티스 서열을 변형시키는 방법은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 활성을 더욱 강화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 강한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함에 의하여 수행될 수 있다. 상기 교체는 구체적으로 상동재조합에 의하여 상기 유전자를 염색체내로 삽입하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 사용되는 벡터는 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커 (selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선별 마커는 전술한 바와 같다.
상기 5) 상기 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성을 나타내는 외래 폴리뉴클레오티드의 도입은, 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상기 폴리펩타이드 또는 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 단백질을 코딩하는 외래 폴리뉴클레오티드, 또는 이의 코돈 최적화된 변이형 폴리뉴클레오티드를 숙주세포 내로 도입하여 수행될 수 있다. 상기 외래 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩타이드 또는 단백질과 동일/유사한 활성을 나타내는 한 그 유래나 서열에 제한 없이 사용될 수 있다. 또한 도입된 상기 외래 폴리뉴클레오티드가 숙주세포 내에서 최적화된 전사, 번역이 이루어지도록 이의 코돈을 최적화하여 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 상기 도입은 공지된 형질전환 방법을 당업자가 적절히 선택하여 수행될 수 있으며, 숙주 세포 내에서 상기 도입된 폴리뉴클레오티드가 발현됨으로써 폴리펩타이드 또는 단백질이 생성되어 그 활성이 증가될 수 있다.
마지막으로, 6) 상기 방법들의 조합은 상기 1) 내지 5) 중 어느 하나 이상의 방법을 함께 적용하여 수행될 수 있다.
이와 같은 폴리펩타이드 또는 단백질 활성의 강화는, 상응하는 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 농도가 야생형이나 변형 전 미생물 균주에서 발현된 폴리펩타이드 또는 단백질의 활성 또는 농도를 기준으로 하여 증가되거나, 해당 폴리펩타이드 또는 단백질로부터 생산되는 산물의 양의 증가되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원에서 용어, "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 미생물에 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이를 포함하는 균주를 제외하는 것이 아니며, 천연형 균주 자체이거나, 자연적 또는 인위적 요인에 의한 유전적 변이로 형질이 변화되기 전 균주를 의미할 수 있다. 상기 "변형 전 균주" 또는 "변형 전 미생물"은 "비변이 균주", "비변형 균주", "비변이 미생물", "비변형 미생물" 또는 "기준 미생물"과 혼용될 수 있다.
본 출원에 있어서, 상기 기준 미생물은 OPS를 생산하는 알려진 미생물인 CA07-0012, 내재적 SerA(D-3-포스포글리세레이트디하이드로제네이즈, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase) 및 SerC(3-포스포세린아미노트랜스퍼레이즈, 3-phosphoserine aminotransferase)의 활성을 강화시킨 균주 CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-serC(KCCM11103P, 미국등록공보 US 8557549 B2) 및 내재적 포스포세린 포스포타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성을 약화시킨 균주 CA07-0012(KCCM 11121P, 미국등록공보 US 8557549 B2)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 제조되는 재조합 미생물일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 미생물은 OPS를 생산할 수 있다면 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 원핵세포 또는 진핵세포 모두 가능하나, 구체적으로 원핵세포일 수 있다. 상기 원핵세포는, 일예로 에스케리키아(Escherichia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 세라티아(Seratia) 속, 프로비덴시아(Providencia)속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 및 브레비박테리움(Brevibacterium) 속에 속하는 미생물 균주를 포함할 수 있으며, 구체적으로 에스케리키아 속 미생물, 보다 구체적으로 대장균(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 출원의 에스케리키아 속 미생물의 경우, L-세린의 생합성 경로의 효소인 SerA, SerC 및 SerB를 통해, OPS 및 L-세린을 생산할 수 있다(Ahmed Zahoor, Computational and structural biotechnology journal, vol 3, 2012 October; Wendisch V F et al., Curr Opin Microbiol. 2006 Jun;9(3):268-74; Peters-Wendisch P et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;7 1( l l):7 139-44.).
본 출원의 OPS 생산 미생물은 추가적으로 포스포세린 포스포타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 것일 수 있다.
본 출원의 SerB는 OPS를 L-세린(L-serine)으로 전환시키는 활성을 지니므로, 상기 SerB 활성이 약화되도록 변이된 미생물은 OPS를 축적하는 특징을 지녀 OPS의 생산에 유용하게 사용될 수 있다. 본 출원의 SerB는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 출원의 SerB는 SerB의 활성을 나타내는 한, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB는 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 상기 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 3에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 SerB 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, SerB 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 본 출원의 SerB를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 4의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "내재적 활성에 비해 약화"는 효소 또는 단백질의 발현이 천연의 야생형 균주, 모균주 또는 해당 단백질이 비변형된 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 변이, 발현조절 서열의 변형, 유전자 일부 또는 전체의 결손 등으로 단백질의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질의 활성 정도가 천연형 균주 또는 변형전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.
이러한 단백질 활성의 약화는, 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 염색체상의 상기 단백질을 암호화하는 유전자 서열의 변형; 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현 조절 서열을 변형하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 염색체상의 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 상기 염색체상의 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하여 상기 mRNA로부터 단백질로의 번역을 저해하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)를 도입하는 방법; 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 인위적으로 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착이 불가능하게 만드는 방법; 및 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE); 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 상기 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
구체적으로, 상기 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로서 열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다.
상기 단백질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 세균 내 염색체 삽입용 백터를 통해 염색체내 내재적 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오타이드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이의 일례로 상동재조합에 의하여 유전자를 결실시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기에서 "일부"란 폴리뉴클레오타이드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로 1 내지 300개, 바람직하게는 1 내지 100개, 더욱 바람직하게는 1 내지 50개 일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 발현 조절서열을 변형하는 방법은 상기 발현 조절서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.
아울러, 염색체상의 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로서 열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다.
또한, 본 출원의 OPS를 생산하는 미생물은 추가적으로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된 것 일 수 있다.
상기 SerA는 3-포스포글리세라이트(3-phosphoglycerate)를 3-포스포하이드록시피루베이트(3-phospho-hydroxypymvate)로 전환하는 활성을 가지는 단백질이며, 상기 SerC는 3-포스포하이드록시피루베이트를 OPS로 전환하는 활성을 가지는 단백질이다. 따라서, 상기 SerA 또는/및 SerC의 활성이 강화된 미생물은 OPS 생산 균주로서 유용하게 사용될 수 있다.
상기 SerA는 이에 제한되지는 않으나, 서열번호 5 또는 6으로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 5 또는 6으로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있다. 상기 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열은 야생형 SerA의 서열이며, 서열번호 6으로 기재되는 아미노산 서열은 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체의 서열이다. 또한, 야생형 SerA의 활성 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체의 활성을 나타내는 한, 본 출원의 SerA는 서열번호 5 또는 6으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만의 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더불어, 야생형 SerA의 활성 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체의 활성을 나타내는 한, 본 출원의 SerA는 서열번호 5 또는 6으로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만의 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다. 상기 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체는, SerA를 코딩하는 유전자의 뉴클레오타이드를 삽입, 또는 야생형 SerA를 코딩하는 유전자를 치환하는 등의 방법으로 변이를 도입하여 세린 혹은 글리신에 의한 피드백 저해로부터 그 활성을 유지하거나, 강화된 경우를 의미하며, 상기 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체는 이미 잘 알려져 있다(Grant GA et al., J. Biol. Chem., 39: 5357-5361, 1999; Grant GA et al., Biochem., 39: 7316-7319, 2000; Grant GA et al., J. Biol. Chem., 276:17844-17850, 2001;Peters-Wendisch P et al., Appl. Microbiol. BiotechnoL, 60:37-441, 2002;미국등록공보 US 6258573 B1).
또한, 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 5 내지 6에 기재된 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가지거나 포함할 수 있다. 더불어, 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 5 내지 6에 기재된 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 상기 SerA의 야생형 또는 세린에 대한 피드백이 해제된 SerA 변이체를 코딩하는 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 예를 들면 서열번호 5에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 7의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 염기서열일일 수 있고, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열은 서열번호 8의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 염기서열일 수 으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 SerC는 예를 들어서 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열을 가지거나 포함하는 단백질, 또는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성되는 단백질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, SerC의 활성을 나타내는 한, 상기 SerC는 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 아미노산 서열을 가지거나 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 더불어, SerC의 활성을 나타내는 한, 상기 SerC는 상기 서열번호 9로 기재되는 아미노산 서열과 상동성 또는 동일성이 적어도 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상, 그리고 100% 미만인 아미노산 서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다.
또한, 상기 SerC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 상기 서열번호 9에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 가질 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 폴리펩타이드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어 질 수 있다. 상기 SerC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 서열번호 10의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 염기서열을 가지거나 포함할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 더불어, 본 출원의 SerC를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 10의 염기서열과 상동성 또는 동일성이 80%, 90%, 95% 또는 99% 이상인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 구성될 수 있다.
본 출원에서 용어, "내재적 활성에 비해 강화" 및 강화 방법은 전술한 바와 같다.
또한, 상기 미생물은 추가로 OPS의 세포 안으로의 유입 또는 분해 능력을 감소시킨 미생물일 수 있다.
상기와 같은 OPS 생산 미생물에 대한 내용은 상기에서 기술된 내용 외에도 미국등록공보 US 8557549 B2 등에 개시된 내용이 본 출원의 참고자료로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법을 제공한다.
상기 서열번호 11, 서열번호 1, O-포스포세린, O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "배양"은 상기 미생물을 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 균주에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다. 구체적으로 상기 배양은 회분식, 연속식 및 유가식 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 SerB 활성이 내재적 활성에 비해 약화된 재조합 미생물의 배양은, 상기 미생물의 세린 요구성이 유도되어 배지에 글리신 또는 세린이 추가로 포함될 수 있다. 글리신은 정제된 글리신, 글리신을 포함하는 이스트 추출물, 트립톤의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 10g/L, 구체적으로 0.5 내지 3g/L일 수 있다. 또한 세린은 정제된 세린, 세린을 함유하는 이스트 추출물, 트립톤 등의 형태로 제공될 수 있으며 배양액에 포함되는 농도는 보통 0.1 내지 5g/L, 구체적으로 0.1 내지 1g/L 일 수 있다.
상기 배지에 포함되는 탄소원은 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산을 포함할 수 있으며, 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 질소원으로서 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액 및 대두밀과 같은 유기 질소원 및 요소, 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 질소원이 포함될 수 있으며, 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지에 포함되는 인원으로서 인사이수소칼륨, 인산수소이칼륨 및 대응되는 소듐 함유염이 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 배지는 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 포함할 수 있고, 그 외에 아미노산, 비타민 및 적절한 전구체등이 포함될 수 있다. 이들 배지 또는 전구체는 배양물에 회분식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
배양 중에 수산화암모늄, 수산화칼륨, 암모니아, 인산 및 황상과 같은 화학물을 배양물에 적절한 방식으로 첨가하여, 배양물의 pH를 조정할 수 있다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리클리콜에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포생성을 억제할 수 있다. 또한 배양물의 호기 상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 25℃ 내지 40℃, 구체적으로 30℃ 내지 35℃ 일 수 있다. 배양물의 배양기간은 원하는 유용물질의 생산량이 수득될 때까지 계속될 수 있으며, 구체적으로 10 내지 100 시간일 수 있다. 그러나 이들 예시에 제한되는 것은 아니다.
본 출원은 본 출원의 방법에서 상기 배양하는 단계 이전, 배지를 준비하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원은 본 출원의 방법에서 상기 배양단계에서 생산된 OPS를 회수하는 단계를 상기 배양하는 단계 이후 추가로 포함할 수 있으며, 그 방법은 배양 방법, 예를 들어서 회분식, 연속식 또는 유가식 배양 방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 OPS를 분리 및 정제하여 수집할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 a) 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 본 출원의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 본 출원의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및 b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법을 제공한다.
상기 서열번호 11, 서열번호 1, O-포스포세린, O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 벡터 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물로서, 대개 화합물 중 수소원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다.
본 출원에서 용어, "시스테인 유도체"는 시스테인의 수소 원자 또는 특정 원자단이 다른 원자 또는 원자단에 의하여 치환된 화합물을 의미한다. 그 예로, 시스테인의 아민기(-NH2)의 질소 원자 또는 티올 기(-SH)의 황 원자에 다른 원자 또는 원자단이 부착된 형태일 수 있으며, 그 예로 NAC(N-acetylcysteine), SCMC(S-Carboxymetylcysteine), BOC-CYS(ME)-OH,(R)-S-(2-Amino-2-carboxyethyl)-L-homocysteine, (R)-2-Amino-3-sulfopropionic acid, D-2-Amino-4-(ethylthio)butyric acid, 3-sulfino-L-alanine, Fmoc-Cys(Boc-methyl)-OH, Seleno-L-cystine, S-(2-Thiazolyl)-L-cysteine, S-(2-Thienyl)-L-cysteine, S-(4-Tolyl)-L-cysteine 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 방법에 따라 시스테인을 생산하기만 한다면, 시스테인 유도체로의 전환은 당업계에 널리 알려진 방법으로 용이하게 다양한 시스테인 유도체로의 전환이 가능할 수 있다.
구체적으로, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있으며, 그 예로 시스테인을 아세틸레이션에이젼트(acetylation agent)와 반응시켜 NAC(N-acetylcysteine)를 합성하거나, 시스테인을 염기성 조건에서 할로아세틱에시드(haloacetic acid)와 반응시킴으로써 SCMC(S-Carboxymetylcysteine)를 합성할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 시스테인 유도체는 주로 제약원료로서 진해제, 기침 완화제, 기관지염, 기관지 천식과 인후염 등의 치료제로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어, "O-포스포세린설피드릴라제(O-phosphoserine sulfhydrylase, OPSS)"는 OPS에 티올그룹(thiol, group, SH 기)을 제공하여 상기 OPS를 시스테인으로 전환하는 반응을 촉매하는 효소를 의미한다. 상기 효소는 애로피룸 페닉스(Aeropymm pernix), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 메그마틱스(Mycobacterium megmatics), 트리코모나스 배기날리스(Trichomonas vaginalis)(Mino K and Ishikawa K , FEBSletters, 551:133-138, 2003; Bums K E et al., J. Am. Chem. Soc, 127: 11602-11603, 2005)에서 처음으로 밝혀진 것일 수 있다. 또한, 상기 OPSS는 야생형 OPSS 단백질뿐만 아니라, 상기 OPSS를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열 중 일부 서열이 결실, 치환 또는 부가된 서열로서, 야생형 OPSS 단백질의 생물학적 활성과 동등 또는 그 이상의 활성을 나타내는 변이체 단백질도 포함하며, 미국등록공보 US 8557549 B2 및 미국등록공보 US 9127324 B2 에 개시된 OPSS 단백질 및 이의 변이체 단백질도 모두 포함할 수 있다.
상기 황화물은 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 고형뿐 아니라, pH, 압력, 용해도의 차이로 인해 액체 또는 기체의 형태로 제공되어 설파이드(sulfide, S2-), 티올설페이트(thiosulfate, S203 2-)등의 형태로 티올그룹(thiol group, SH 기)으로 전환될 수 있는 황화물이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 티올 그룹을 OPS에 제공하는 Na2S, NaSH, H2S, (NH4)2S, NaSH 및 Na2S203를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 반응은 하나의 OPS 반응기에 하나의 티올기를 제공하여 하나의 시스테인 또는 시스테인 유도체를 제조하는 반응으로, 상기 반응 시 황화물의 첨가량은 OPS 몰농도의 0.1 내지 3배일 수 있으며, 구체적으로, 1 내지 2배일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 출원에서는 추가로 상기 반응 단계를 통하여 생산된 시스테인을 회수하는 단계를 포함할 수 있다. 이 때, 당해 분야에 공지된 적합한 반응을 이용하여 반응액으로부터 목적하는 시스테인을 분리 및 정제하여 수집할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태로, 본 출원은 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드의 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인의 유도체 생산 용도를 제공한다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태로, 본 출원은 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드의 O-포스포세린을 미생물로부터 배출하는 용도를 제공한다.
상기 서열번호 11, 서열번호 1, O-포스포세린, 시스테인, 시스테인의 유도체 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하 본 출원을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 출원을 예시하기 위한 바람직한 실시양태에 불과한 것이며 따라서, 본 출원의 권리범위를 이에 한정하는 것으로 의도되지는 않는다. 한편, 본 명세서에 기재되지 않은 기술적인 사항들은 본 출원의 기술 분야 또는 유사 기술 분야에서 숙련된 통상의 기술자이면 충분히 이해하고 용이하게 실시할 수 있다.
실시예 1: yhhS major facilitator superfamily(MFS) 트랜스포터 변이체 제조
O-포스포세린 생산 균주에서 O-포스포세린(O-phosphoserine, 이하 "OPS")의 배출 활성의 증가를 위하여 OPS 배출 단백질의 활성을 증가시키고자, OPS 배출 단백질인 YhhS MFS(major facilitator superfamily) 트랜스포터(서열번호 11)와 이를 코딩하는 유전자 yhhS(서열번호 12)에 대하여 변이체를 제작하였다. 구체적인 과정은 하기와 같다.
먼저, yhhS 유전자 변이체 라이브러리를 제작하고자 하였다. 이를 위해 대장균 야생형 균주(Escherichia coli K12-W3110, ATGG27325)의 게노믹 DNA를 주형으로 하여, 유전자 특이적 프라이머 쌍(서열번호 13 및 14)을 이용하여 임의 돌연변이 유발 PCR(JENA error prone PCR)을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 20회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 이와 같은 과정으로 제작한 돌연변이 유전자 단편들을 rhtB 프로모터가 있는 pCL1920 벡터에 넣기 위해서 우선, pCL_PrhtB 벡터를 제작하였다. rhtB 프로모터(서열번호 15) 단편을 확보하기 위해 특이적 프라이머 쌍(서열번호 16 및 17)으로 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. SacI과 SmaI으로 잘려진 pCL1920 벡터(GeneBank No AB236930)에 rhtB 프로모터 단편을 삽입하여 pCL_PrhtB를 확보하였다. pCL_PrhtB 벡터를 SmaI과 PstI으로 자른 후, 상기 PCR을 통해 수득한 돌연변이 유전자 단편들을 인퓨전 클로닝 키트(in-fusion cloning kit, Clontech Laboratories, Inc.)를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝은 50℃에서 60분간 반응시켜 이루어졌으며, 이를 통해 pCL_PrhtB-yhhS 유전자 변이체 플라스미드 라이브러리를 제작하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
서열번호 프라이머 벡터
13 CACCGGGAGCCCGGGatgCCCGAACCCGTAGCCGA pCL_PrhtB-yhhS library
14 CTTGCATGCCTGCAGttaAGATGATGAGGCGGCCT
16 CGGGGATCCTCTAGACGCTTGCTGCAACTCTCTCA pCL_PrhtB
17 TACGGGTTCGGGcatGATATCTTTCCTGTGTGAAA
상기와 같은 과정으로 제작한 재조합 플라스미드 라이브러리들은 HTS(high Throughtput Screening)를 이용하여 스크리닝하였다. 이때, 스크리닝 기반 균주로는 대장균 야생형 균주 W3110에서 내재적 포스포세린 포스포타아제(phosphoserine phosphatase, serB)의 활성을 약화시킨 균주 CA07-0012(KCCM 11121P, 미국등록공보 US 8557549 B2)를 사용하였다.
다음으로, OPS 배출 활성이 증가된 변이체를 수득하기 위하여, 상기 제작한 pCL_PrhtB-yhhS 유전자 변이체 플라스미드 라이브러리들을 상기 기반 균주 CA07-0012에 전기천공법으로 형질전환 시킨 다음, 과량의 OPS가 첨가된 배지 조건에서 배양하여 생육 저하가 해제되는 콜로니 3종을 선별하였다. 그 다음, 선별된 콜로니 3종으로부터 플라스미드를 획득하여 시퀸싱 기법을 통해 염기서열을 분석하였다.
상기와 같은 과정을 통하여, 과량의 OPS 첨가조건에서 생육 저하를 해제시키는데 관여하는 yhhS 유전자 변이체를 선별하여, 기존의 증가된 OPS 배출 활성을 갖는 yhhS 유전자 변이체인 yhhS M45(미국공개공보 US 2019-0233859 A1) 보다 우수한 변이체를 확보하였고, 이를 yhhS453으로 명명하였다.
상기 yhhS453이 코딩하는 폴리펩티드에 대하여 아미노산 서열을 분석한 결과, YhhS453은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 것을 확인하였다.
실시예 2: yhhS 유전자 변이체 yhhS453의 OPS 배출 활성 확인
2-1. OPS 생산주를 이용한 yhhS453 도입 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
상기 실시예 1에서 동정한 1종의 변이체 플라스미드 pCL_PrhtB-yhhS453를 OPS 생산주인 CA07-0012에 당업계에서 통상적으로 이용하는 전기천공법으로 형질전환하였다. 이를 통해, yhhS 유전자 변이체 yhhS453가 도입된 OPS 생산 균주인 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS453를 제작하고, 이의 O-포스포세린 생산능을 평가하였다.
구체적으로, 각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후, 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체 배지에서 밤새 배양한 균주를 하기 표 2의 25mL 역가배지에 접종한 다음, 이를 33℃ 온도에서 200rpm으로 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 이 결과를 표 3에 나타내었다.
배지성분 조제량
포도당 40g
KH2PO4(KP1) 6g
(NH4)2SO4 17g
MgSO4.7H2O 1g
MnSO4.4H2O 5mg
FeSO4.7H2O 10mg
L-글리신 2.5g/L
호모액기스 3g/L
CaCO3 30g/L
pH 6.8
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0012/pCL1920 45 40 1.4
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS 42.7 40 1.7
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS M45 32 40 2.3
CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS453 30 40 3.1
상기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 본 출원의 yhhS 유전자 변이체를 도입한 균주의 경우, 야생형 yhhS 유전자를 도입한 균주에 비하여 OPS 생산량이 증가함을 확인하였고, 기존의 yhhS 유전자 변이체인 yhhS M45보다도 OPS 생산량이 증가함을 확인하였다. 구체적으로 yhhS453은 OPS 농도가 야생형 yhhS 대비 82%, 기존의 yhhS 유전자 변이체인 yhhS M45 대비 35% 증가된 결과를 보였다.
상기 CA07-0012/pCL_PrhtB-yhhS453는 Escherichia coli CA07-0352로 명명하였다. 상기 CA07-0352 균주는 부다페스트 조약 하에 한국미생물센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2020년 05월 14일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 12720P를 부여받았다.
2-2. serA 및 serC 강화 균주를 이용한 yhhS453 도입 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
yhhS453의 활성을 재확인하기 위하여, OPS 생산능이 증가된 OPS 생산균주로서, OPS 생합성 경로인 serA(D-3-포스포글리세레이트디하이드로제네이즈, D-3-phosphoglycerate dehydrogenase) 및 serC(3-포스포세린아미노트랜스퍼레이즈, 3-phosphoserine aminotransferase)의 활성을 강화시킨 균주 CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-serC(KCCM11103P, 미국공개공보 US 8557549 B2)를 이용하였다.
pCL_Prmf-serA*(G336V)-serC 벡터의 HindIII 제한효소 위치에 yhhS453를 클로닝하였다. 먼저, pCL_PrhtB-yhhS453을 주형으로 하고, 서열번호 18 및 19의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 통해 yhhS453 유전자 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 상기 PCR을 통해 수득한 yhhS453 유전자 단편을 인퓨전 클로닝 키트를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝은 50℃에서 60분간 반응시켜 이루어졌으며, 이를 통해 pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453 변이체 플라스미드를 제작하였다. 대조군으로 pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS(wt), CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS M25, CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS M45를 사용하였다(미국공개공보 US 2019-0233859 A1). 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 4와 같다.
서열번호 프라이머 벡터
18 CACGGTTAAAAGCTTCGATGGTCGATGATTAAGAC pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453
19 GATTACGCCAAGCTTttaAGATGATGAGGCGGCCT
상기 제작된 각 플라스미드를 OPS 생산주인 CA07-0022에 당업계에서 통상적으로 이용하는 전기천공법으로 형질전환하였다. 이를 통해, yhhS 유전자 변이체 yhhS453가 도입된 OPS 생산 균주인 CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453를 제작하고, 이의 O-포스포세린 생산능을 평가하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 다음, 33℃ 배양기에서 밤새 배양하였다. LB 고체배지에서 밤새 배양한 균주를 상기 표 2의 25ml 역가 배지에 접종한 다음, 이를 33℃의 온도에서 200rpm으로, 배양기에서 48시간 배양하였으며, 이의 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS(wt) 30 40 4.01
CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS M25 26.3 40 6.01
CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS M45 25.4 40 4.8
CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453 25.1 40 7.5
상기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 본 출원의 yhhS453을 OPS 생합성 경로의 유전자가 강화된 OPS 생산 균주에 도입한 경우, OPS 생산량을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 이 결과는 본 출원의 yhhS453를 OPS 생산에 유용하게 사용할 수 있음을 시사한다.
상기 CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC_PrhtB-yhhS453는 Escherichia coli CA07-0353로 명명하였다. 상기 CA07-0353 균주는 부다페스트 조약 하에 한국미생물센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2020년 05월 14일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM 12721P를 부여받았다.
2-3. 염색체상의 프로모터 세기에 따른 yhhS453 도입 균주 제작 및 OPS 생산능 평가
염색체상에 yhhS453를 도입하는 경우에도 OPS 배출 활성이 향상되는지 확인해보기 위해, 미생물의 자가 프로모터를 trc 프로모터로 치환하고, 본 출원의 yhhS453를 도입한 균주를 제작하여 O-포스포세린의 생산능을 평가하였다. 구체적으로, Trc 프로모터를 대장균의 염색체상에 삽입하기 위해 pSKH130 벡터(서열번호 30)를 이용하였다. 상기 벡터는 PI 단백질(pir 유전자)에 의존성을 가지는 R6K 리플리콘(replicon), SacB(Levansucrase) 유전자 및 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 포함하고 있으며, 상기 벡터를 이용하여 1차 교차에서 R6K 및 카나마이신을 이용하여 원하는 균주를 확보한 후, 수크로스(sucrose)가 있는 배지에서 항생제를 제거하여 균주를 제작하였다. 구체적으로, CA07-0022 균주 내 자가 yhhS를 yhhS453으로 교체하기 위해서 pSKH130_yhhS453 벡터를 제작하였다. pSKH130-yhhS453을 제작하기 위해 상기 실시예 1에서 확보한 pCL_PrhtB-yhhS453을 주형으로 사용하고, 서열번호 20 및 21의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 진행하여 yhhS453 유전자 단편을 확보하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 증폭된 유전자 단편은 EcoRV로 제한효소 처리된 pSKH130 벡터와 인퓨전 클로닝 키트(in-fusion cloning kit, Clontech Laboratories, Inc.)를 사용하여 클로닝하여 pSK-yhhS453을 확보하였다. 확보된 플라스미드는 CA7-0022 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 균주는 재조합(교차)에 의해 카나마이신 있는 LB 고체배지에서 염색체에 도입된 균주가 선택이 된 후, 수크로스가 있는 배지에서 2차 재조합(교체)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 균주는 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR 및 염기서열 분석을 통해 CA07-0022::yhhS453 균주를 제작하였다.
제작한 CA07-0022::yhhS453 균주에서 yhhS453의 프로모터를 강화하기 위해 pSKH130-Ptrc-yhhS453'를 제작하였다. 구체적으로, 대장균 야생형 균주 W3110를 주형으로 하고, 서열번호 24 및 25의 프라이머 쌍을 이용한 PCR를 수행하여 yhhSUP DNA 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. pCL_Ptrc-gfp(미국공개공보 US 2017-0247727 A1)를 주형으로 하고, 서열번호 26 및 27의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 Ptrc의 DNA 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 또한, pCL_PrhtB-yhhS453을 주형으로 하고, 서열번호 28 및 29의 프라이머 쌍을 이용한 PCR을 수행하여 yhhS453 단편을 수득하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 증폭된 각 유전자 단편들은 EcoRV로 제한효소처리된 pSKH130 벡터와 IST를 진행하여 pSKH_yhhSUP_Ptrc-yhhS453을 확보하였다. 확보된 플라스미드는 CA7-0022::yhhS453 균주에 전기천공법으로 형질전환시켰다. 형질전환된 균주는 1차 교차에 의해 카나마이신 있는 LB 고체배지에서 염색체에 도입된 균주가 선택이 된 후, 수크로스가 있는 배지에서 2차 재조합(교체)을 통해 염색체로부터 플라스미드 부위의 절제가 일어났다. 상기 2차 재조합이 완료된 균주는 서열번호 22 및 23의 프라이머 쌍을 이용하여 확인하였다. 제작한 균주는 CA07-0022::Ptrc-yhhS453로 명명하였다. 여기에서 사용된 프라이머 서열은 하기 표 6과 같다.
서열번호 프라이머 벡터
20 CAGGAATTCGATATCATGCCCGAACCCGTAGCCGA pSK-yhhS453
21 GACTAGCGTGATATCTTAAGATGATGAGGCGGCCT
22 ATGTGAATCTGTGGATTATT yhhS-out
23 GTTATGGCCGTTTATCGAAA
24 CAGGAATTCGATATCTCGCTCCGGCGACATATGCA pSKH130-Ptrc-yhhS453'
25 CAGCAAGCGGGTACCGAGGATCACCACATTTTTAC
26 AATGTGGTGATCCTCGGTACCCGCTTGCTGCAACT
27 TACGGGTTCGGGCATGATATCTTTCCTGTGTGAAA
28 CACAGGAAAGATATCATGCCCGAACCCGTAGCCGA
29 GACTAGCGTGATATCGCACCCATCGCCATCGCCCC
대조군으로 상기와 동일한 방법으로 제작한 CA07-0022::Ptrc-yhhS, CA07-0022::Ptrc-yhhS M25, CA07-0022::Ptrc-yhhS M45 균주를 사용하였다. PCR을 위해 사용한 프라이머의 염기서열은 상기와 동일하였다. 제작된 균주에 당업계에서 통상적으로 이용하는 전기천공법으로 serA와 serC가 강화된 벡터 pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC를 도입하여 형질전환한 후, OPS 생산능을 확인하였다.
각각의 균주를 LB 고체 배지에 도말한 후, 33℃ 배양기에서 밤새 배양하고, 배양한 균주를 상기 표 1의 25ml 역가 배지에 접종하였다. 이후, 접종한 균주를 33℃의 온도에서 200rpm으로 배양기에서 48시간 동안 배양하였으며, 이의 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
균주명 OD562nm 소모당(g/L) O-포스포세린(g/L)
CA07-0022/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC 32 40 1.7
CA07-0022::Ptrc-yhhS/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC 33 40 2.0
CA07-0022::Ptrc-yhhS M25/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC 35 40 3.2
CA07-0022::Ptrc-yhhS M45/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC 25.4 40 2.7
CA07-0022::Ptrc-yhhS453/pCL_Prmf-serA*(G336V)-(RBS)serC 25.1 40 5.0
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 염색체상에서 프로모터 강화를 통해 yhhS453의 활성을 증가시켰을 경우, 야생형 yhhS 도입 균주 대비 OPS 생산량이 2배 이상 증가하는 것을 확인하였고, 다른 yhhS 유전자 변이체인 M45 및 M25 대비하여서도 OPS 농도가 현저히 증가한 것을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 및 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2021007172-appb-I000001
Figure PCTKR2021007172-appb-I000002

Claims (14)

  1. 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열 및 이와 90% 이상의 서열 동일성을 가지는, O-포스포세린(O-phosphoserine, OPS) 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드.
  3. 제1항의 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제1항의 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포세린 포스파타아제(phosphoserine phosphatase, SerB)의 활성이 내재적 활성에 비해 약화된, 미생물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 추가로 포스포글리세라이트 디하이드로게나제(phosphoglycerate dehydrogenase, SerA) 또는 포스포세린 아미노트랜스퍼라제(phosphoserine aminotransferase, SerC)의 활성이 내재적 활성에 비해 강화된, 미생물.
  7. 제4항에 있어서, 상기 미생물은 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)인, 미생물.
  8. 제1항의 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 O-포스포세린을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, O-포스포세린의 생산 방법.
  10. a) 제1항의 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 및 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터 중 어느 하나 이상을 포함하는, O-포스포세린 생산 미생물을 배지에서 배양하여 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 생산하는 단계; 및
    b) O-포스포세린 설프하이드릴라아제(O-phosphoserine sulfliydrylase, OPSS) 또는 이를 발현하는 미생물의 존재 하에, 상기 a) 단계에서 생산된 O-포스포세린 또는 이를 포함하는 배지를 황화물과 반응시키는 단계를 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 시스테인 유도체의 생산 방법은 상기 b) 단계에서 생성된 시스테인을 시스테인 유도체로 전환시키는 단계를 추가로 포함하는, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 황화물은 Na2S, NaSH, (NH4)2S, H2S 및 Na2S2O3로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 시스테인 또는 이의 유도체의 생산 방법.
  13. 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드의 O-포스포세린, 시스테인 또는 시스테인의 유도체 생산 용도.
  14. 서열번호 11의 아미노산 서열의 a) 241번째에 상응하는 위치의 이소류신(I)이 트레오닌(T)으로, 246번째에 상응하는 위치의 아스파르트산(D)이 발린(V)으로, 330번째에 상응하는 위치의 발린(V)이 이소류신(I)으로의 치환을 포함하고, b) 88번째에 상응하는 위치의 아미노산이 페닐알라닌이고, c) 207번째에 상응하는 위치의 아미노산이 라이신(K)인 서열을 가지는 O-포스포세린 배출 활성을 나타내는 폴리펩타이드 또는 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드의 O-포스포세린을 미생물로부터 배출하는 용도.
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