WO2021153866A1 - 시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 신규한 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 - Google Patents

시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 신규한 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 l-아미노산 생산 방법 Download PDF

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김주은
배현정
이임상
이지혜
이하윤
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Definitions

  • the present application relates to a novel mutant polypeptide in which the activity of citrate synthase is weakened, a microorganism comprising the mutant polypeptide, and a method for producing L-amino acids using the microorganism.
  • Corynebacterium genus (the genus Corynebacterium )
  • Microorganisms particularly Corynebacterium glutamicum (Corynebacterium glutamicum) is a gram-positive microorganism that is widely used for the production of L-amino acids and other useful substances.
  • Corynebacterium glutamicum is a gram-positive microorganism that is widely used for the production of L-amino acids and other useful substances.
  • various studies for the development of high-efficiency production microorganisms and fermentation process technology are being conducted.
  • a target substance-specific approach such as increasing the expression of a gene encoding an enzyme involved in L-lysine biosynthesis or removing a gene unnecessary for biosynthesis is mainly used (US 8048650 B2).
  • L-amino acids L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, and L-glycine are amino acids derived from aspartate, and the synthesis level of oxaloacetate, a precursor of aspartate, is the same as above. It may affect the level of synthesis of L-amino acids.
  • Citrate synthase is an enzyme that produces citrate by polymerizing acetyl-CoA and oxaloacetate produced in the glycolysis of microorganisms, and is also an important enzyme that determines carbon influx into the TCA pathway.
  • the present inventors have completed the present invention by confirming that the production of L-amino acids is increased when a novel mutant polypeptide in which citrate synthase activity is attenuated to a specific level is used.
  • the present application provides a variant polypeptide having citrate synthase activity in which the amino acid corresponding to the 312th position from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid.
  • the present application provides a polynucleotide encoding the variant polypeptide.
  • the present application provides a vector comprising the polynucleotide.
  • the present application provides a microorganism for producing L-amino acids, including the variant polypeptide, a polynucleotide encoding the variant polypeptide, or a vector including the polynucleotide.
  • the present application provides a method for producing L-amino acids, comprising culturing a microorganism comprising the mutant polypeptide, a polynucleotide encoding the mutant polypeptide, or a vector including the polynucleotide in a medium.
  • One aspect of the present application is a variant polypeptide having citrate synthase activity in which the amino acid corresponding to the 312th position from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid may be to provide
  • the sequence of SEQ ID NO: 1 may be an amino acid sequence having citrate synthase activity.
  • the sequence of SEQ ID NO: 1 may be a protein sequence having citrate synthase activity encoded by the gltA gene.
  • the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 can be obtained from GenBank of NCBI, a known database. As an example, it may be derived from Corynebacterium glutamicun , but is not limited thereto, and any amino acid sequence of a protein having the same activity as a protein including the amino acid sequence may be included without limitation.
  • the protein having citrate synthase activity in the present application may be a protein including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, insignificant sequence addition before and after the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a naturally occurring mutation, or It does not exclude its latent mutation, and if it has the same or corresponding activity as the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, it corresponds to the protein having the citrate synthase activity of the present application.
  • the protein having citrate synthase activity of the present application is the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or more thereof.
  • It may be a protein composed of an amino acid sequence having homology or identity.
  • it is an amino acid sequence having such homology or identity and exhibiting efficacy corresponding to the protein
  • a protein having an amino acid sequence in which some sequence is deleted, modified, substituted or added is also included within the scope of the protein subject to mutation of the present application. is self-evident
  • citrate synthase is an enzyme that produces citrate by polymerizing acetyl-CoA and oxaloacetate produced in the glycolysis of microorganisms, and is an enzyme that determines carbon inflow into the TCA pathway. It is an important enzyme. Specifically, as a citric acid synthase, it may play a rate-regulating role in the first step of the TCA cycle. The enzyme is also capable of catalyzing the condensation reaction of acetyl coei with a 2-carbon acetate moiety from a molecule of 4-carbon oxaloacetate to form 6-carbon acetate.
  • the citrate synthase may be used in combination with citrate synthase, CS, GltA protein or GltA.
  • variant means that one or more amino acids differ from the recited sequence in conservative substitution and/or modification, but the function of the protein Refers to a polypeptide in which functions or properties are maintained.
  • a variant polypeptide differs from the identified sequence by several amino acid substitutions, deletions or additions.
  • Such variants can generally be identified by modifying one of the polypeptide sequences and evaluating the properties of the modified polypeptide. That is, the ability of the variant may be increased, unchanged, or decreased compared to the native protein.
  • variants can generally be identified by modifying one of the polypeptide sequences and evaluating the reactivity of the modified polypeptide.
  • variants may include variants in which one or more portions, such as an N-terminal leader sequence or a transmembrane domain, are removed.
  • variants may include variants in which a portion is removed from the N- and/or C-terminus of the mature protein.
  • conservative substitution means substituting one amino acid with another amino acid having similar structural and/or chemical properties. Such variants may have, for example, one or more conservative substitutions while still retaining one or more biological activities. Such amino acid substitutions may generally occur based on similarity in polarity, charge, solubility, hydrophobicity, hydrophilicity and/or amphipathic nature of the residues.
  • positively charged (basic) amino acids include arginine, lysine, and histidine
  • negatively charged (acidic) amino acids include glutamic acid and aspartic acid
  • Aromatic amino acids include phenylalanine, tryptophan and tyrosine
  • hydrophobic amino acids include alanine, valine, isoleucine, leucine, methionine, phenylalanine, proline, glycine and tryptophan.
  • conservative substitutions have little or no effect on the activity of the resulting polypeptide.
  • variants may include deletions or additions of amino acids that have minimal effect on the properties and secondary structure of the polypeptide.
  • the polypeptide can be conjugated with a signal (or leader) sequence at the N-terminus of the protein that is involved in the transfer of the protein either co-translationally or post-translationally.
  • the polypeptide may also be conjugated with other sequences or linkers to enable identification, purification, or synthesis of the polypeptide.
  • mutant polypeptide having citrate synthase activity refers to a polypeptide having a weakened citrate synthase activity compared to the wild type by substituting a portion of the amino acid sequence of the polypeptide having citrate synthase activity.
  • one or more amino acids are mutated in the amino acid sequence of a polypeptide having citrate synthase activity, so that the activity is weakened compared to that of the wild type, and thus it may refer to a mutant polypeptide that efficiently balances carbon flow.
  • the variant polypeptide may be a variant polypeptide in which the amino acid corresponding to the 312th position of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid in the various proteins having the above citrate synthase activity.
  • the 'other amino acid' refers to an amino acid different from that before the substitution, and is not limited as long as it is an amino acid other than the amino acid before the substitution.
  • the variant polypeptide may be a variant polypeptide in which methionine corresponding to position 312 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid in the various proteins having the above-mentioned citrate synthase activity.
  • the methionine is alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamic acid, glutamine, glycine, histidine ), isoleucine, leucine, lysine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine (valine) may be substituted with any one or more amino acids selected from the group consisting of, and more specifically, may be a variant sequence substituted with isoleucine, but is not limited thereto.
  • the substituted amino acid residue may include not only natural amino acids but also non-natural amino acids.
  • the unnatural amino acid can be, for example, a D-amino acid, a homo-amino acid, a beta-homo-amino acid, an N-methyl amino acid, an alpha-methyl amino acid, an unconventional amino acid (such as citrulline or naph thylalanine, etc.), but is not limited thereto.
  • a specific amino acid is substituted' in the present application, it is obvious that the amino acid is substituted with an amino acid different from the amino acid before the substitution, even if it is not separately indicated that it is substituted with another amino acid.
  • corresponding to refers to an amino acid residue at a position listed in a protein or peptide, or an amino acid residue similar to, identical to, or homologous to a residue listed in a protein or peptide.
  • corresponding region generally refers to a similar position in a related protein or reference protein.
  • specific numbering may be used for amino acid residue positions in the polypeptides used in this application. For example, by aligning the polypeptide sequence of the present application with the target polypeptide to be compared, it is possible to renumber the position corresponding to the amino acid residue position of the polypeptide of the present application.
  • mutant polypeptide having citrate synthase activity provided in the present application, amino acids at specific positions in the aforementioned citrate synthase are substituted, so that the ability to produce L-amino acids can be increased compared to the polypeptide before the mutation.
  • the variant polypeptide may have 80% or more and less than 100% sequence homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, but is not limited thereto. Specifically, the variant polypeptide of the present application may be one having at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is apparent that proteins having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added in addition to the amino acid sequence at position 312 are included within the scope of the present application as long as the amino acid sequence has homology and exhibits efficacy corresponding to the protein.
  • mutant polypeptide in addition to the specific 312-th mutation that imparts a specific activity, a meaningless sequence before and after the amino acid sequence of the corresponding SEQ ID NO: Addition or naturally occurring mutation, or a mutation thereof It is apparent that latent mutations are not excluded, and that such sequence additions or mutations fall within the scope of the present application.
  • the mutant polypeptide in which the amino acid corresponding to the 312th position in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. More specifically, the mutant polypeptide in which methionine corresponding to position 312 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with isoleucine may consist of SEQ ID NO: 3. In addition, the variant polypeptide may include the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or an amino acid sequence having 80% or more and less than 100% homology thereto, but is not limited thereto.
  • the variant polypeptide of the present application may include SEQ ID NO: 3 and a polypeptide having at least 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% homology to SEQ ID NO: 3 there is.
  • a protein having an amino acid sequence in which some sequences are deleted, modified, substituted or added is also included within the scope of the present application. can be self-evident
  • L-amino acid production can be increased through an appropriate balance between the carbon flow into the TCA pathway and the supply of oxaloacetate used as a precursor of L-amino acid biosynthesis through regulation of citrate synthase activity.
  • homology refers to the percent identity between two polynucleotide or polypeptide moieties. It refers to the degree of correspondence with a given amino acid sequence or base sequence and may be expressed as a percentage. In the present specification, a homologous sequence having the same or similar activity to a given amino acid sequence or base sequence may be expressed as "% homology". Homology between sequences from one moiety to another can be determined by known art. For example, using standard software that calculates parameters such as score, identity and similarity, specifically BLAST 2.0, or by Southern hybridization experiments under defined stringent conditions. appropriate hybridization conditions is to check, by comparing the definition is within the skill of a method well known to those skilled in the art (e.g., J.
  • Another aspect of the present application is that the amino acid corresponding to the 312th position from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid, a variant having citrate synthase activity
  • a polynucleotide encoding a polypeptide may be provided.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, citrate synthase and variant polypeptides are the same as described above.
  • polynucleotide refers to a DNA or RNA strand of a certain length or longer as a polymer of nucleotides in which nucleotide monomers are linked in a long chain by covalent bonds, and more specifically, encoding the variant. polynucleotide fragments.
  • the polynucleotide of the present application may be included without limitation as long as it is a polynucleotide sequence encoding a variant polypeptide having citrate synthase activity of the present application.
  • the gene encoding the amino acid sequence of citrate synthase is a gltA gene, and the gene may be derived from Corynebacterium glutamicum, but is not limited thereto.
  • the gene may be a nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, more specifically, may be a sequence including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • the polynucleotide of the present application may contain a variety of coding regions within a range that does not change the amino acid sequence of the polypeptide due to codon degeneracy or considering codons preferred in an organism to express the polypeptide. Deformation can be made. Specifically, any polynucleotide sequence encoding a variant polypeptide in which the amino acid corresponding to position 312 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid may be included without limitation.
  • the variant polypeptide of the present application may be a polynucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, but is not limited thereto. More specifically, it may be composed of the polynucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 4, but is not limited thereto.
  • the 312th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is a different amino acid Any sequence encoding a protein having a substituted citrate synthase activity may be included without limitation.
  • the "stringent condition” means a condition that enables specific hybridization between polynucleotides. These conditions are specifically described in the literature (eg, J. Sambrook et al., supra).
  • 40% or more, specifically 90% or more, more specifically 95% or more, more specifically 97% or more, particularly specifically 99% or more homology between genes with high homology or identity, or Genes having the same identity are hybridized and genes having homology or identity lower than that are not hybridized, or washing conditions of normal Southern hybridization at 60°C, 1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, specifically At a salt concentration and temperature equivalent to 60°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more specifically 68°C, 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, conditions for washing once, specifically 2 to 3 times can be listed. there is.
  • Hybridization requires that two nucleic acids have complementary sequences, although mismatch between bases is possible depending on the stringency of hybridization.
  • complementary is used to describe the relationship between nucleotide bases capable of hybridizing to each other.
  • adenosine is complementary to thymine
  • cytosine is complementary to guanine.
  • the present application may also include isolated nucleic acid fragments that are complementary to substantially similar nucleic acid sequences as well as the entire sequence.
  • polynucleotides having homology or identity can be detected using hybridization conditions including a hybridization step at a Tm value of 55° C. and using the above-described conditions.
  • the Tm value may be 60° C., 63° C. or 65° C., but is not limited thereto and may be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the purpose.
  • Another aspect of the present application is that the amino acid corresponding to the 312th position from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid, a variant having citrate synthase activity
  • Vectors comprising a polynucleotide encoding a polypeptide can be provided.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, citrate synthase, variant polypeptides and polynucleotides are the same as described above.
  • the term "vector” refers to a DNA preparation containing the nucleotide sequence of a polynucleotide encoding the target polypeptide operably linked to a suitable regulatory sequence so that the target polypeptide can be expressed in a suitable host.
  • suitable regulatory sequences may include a promoter capable of initiating transcription, an optional operator sequence for regulating such transcription, a sequence encoding a suitable mRNA ribosome binding site, and a sequence regulating the termination of transcription and translation.
  • the vector After transformation into a suitable host cell, the vector can replicate or function independently of the host genome, and can be integrated into the genome itself.
  • the vector used in the present application is not particularly limited, and any vector known in the art may be used.
  • Examples of commonly used vectors include plasmids, cosmids, viruses and bacteriophages in a natural or recombinant state.
  • pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, and Charon21A may be used as phage vectors or cosmid vectors
  • pBR-based, pUC-based, and pBluescriptII-based plasmid vectors may be used.
  • pGEM-based, pTZ-based, pCL-based and pET-based and the like can be used.
  • pCR2.1, pDC, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC vectors and the like can be used.
  • the vector usable in the present application is not particularly limited, and a known expression vector may be used.
  • a polynucleotide encoding a target polypeptide can be inserted into a chromosome through a vector for intracellular chromosome insertion.
  • the insertion of the polynucleotide into the chromosome may be performed by any method known in the art, for example, homologous recombination, but is not limited thereto.
  • it may further include a selection marker (selection marker) for confirming whether the chromosome is inserted.
  • the selection marker is used to select cells transformed with the vector, that is, to determine whether a target nucleic acid molecule has been inserted, and has a selectable phenotype such as drug resistance, auxotrophy, resistance to cytotoxic agents, or expression of a surface polypeptide. Markers to be given can be used. In an environment treated with a selective agent, only cells expressing a selectable marker survive or exhibit other expression traits, so that transformed cells can be selected.
  • the term "transformation” refers to introducing a vector including a polynucleotide encoding a target protein into a host cell so that the protein encoded by the polynucleotide can be expressed in the host cell.
  • the transformed polynucleotide may include all of them regardless of whether they are inserted into the chromosome of the host cell or located outside the chromosome, as long as they can be expressed in the host cell.
  • polynucleotide may include DNA and RNA encoding a target protein.
  • the polynucleotide may be introduced in any form as long as it can be introduced and expressed into a host cell.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in the form of an expression cassette, which is a gene construct including all elements necessary for self-expression.
  • the expression cassette may include a promoter operably linked to the polynucleotide, a transcription termination signal, a ribosome binding site, and a translation termination signal.
  • the expression cassette may be in the form of an expression vector capable of self-replication.
  • the polynucleotide may be introduced into a host cell in its own form and operably linked to a sequence required for expression in the host cell, but is not limited thereto.
  • the transformation method includes any method of introducing a polynucleotide into a cell, and may be performed by selecting a suitable standard technique as known in the art depending on the host cell. For example, electroporation, calcium phosphate (Ca(H 2 PO 4 ) 2 , CaHPO 4 , or Ca 3 (PO 4 ) 2 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, Polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method and lithium acetate-DMSO method, but are not limited thereto.
  • electroporation calcium phosphate (Ca(H 2 PO 4 ) 2 , CaHPO 4 , or Ca 3 (PO 4 ) 2 ) precipitation, calcium chloride (CaCl 2 ) precipitation, microinjection, Polyethylene glycol (PEG) method, DEAE-dextran method, cationic liposome method and lithium acetate-DMSO method, but are not limited thereto.
  • operably linked may mean that a promoter sequence that initiates and mediates transcription of a polynucleotide encoding a target protein of the present application and the polynucleotide sequence are functionally linked.
  • the operable linkage may be prepared using a genetic recombination technique known in the art, and site-specific DNA cleavage and ligation may be made using a cleavage and ligation enzyme in the art, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application is that the amino acid corresponding to the 312th position from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid, a variant having citrate synthase activity It is possible to provide a microorganism for producing L-amino acids, including a polypeptide, a polynucleotide encoding the variant polypeptide, or a vector including the polynucleotide.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, citrate synthase, variant polypeptides, polynucleotides and vectors are as described above.
  • the microorganism may include a polynucleotide encoding the variant polypeptide or provide a microorganism transformed with a vector containing a polynucleotide encoding the variant polypeptide, but is not limited thereto.
  • the microorganism can improve the production capacity of L-amino acids without inhibiting the growth or sugar consumption rate of the microorganisms compared to the microorganisms containing the wild-type polypeptide, and L-amino acids can be obtained from these microorganisms in high yield. there is.
  • the term "microorganism comprising a variant polypeptide” refers to a microorganism in which L-amino acid-producing ability is conferred to a microorganism having a naturally weak L-amino acid-producing ability or a parent strain without L-amino acid-producing ability. .
  • the microorganism is a microorganism expressing a variant polypeptide comprising one or more amino acid mutations in a polypeptide having citrate synthase activity, wherein the amino acid mutation is at position 312 from the N-terminus of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 It may include substitution of the corresponding amino acid with another amino acid.
  • the variant polypeptide having a citrate synthase activity expressed from the microorganism may have a weakened activity, but is not limited thereto.
  • the microorganism is a cell or microorganism capable of expressing a variant polypeptide by being transformed with a vector containing a polynucleotide encoding a variant polypeptide or a polynucleotide encoding a variant polypeptide, for the purpose of the present application Phase
  • the host cell or microorganism may be any microorganism capable of producing L-amino acids including the variant polypeptide.
  • the term "microorganism that produces L-amino acids” includes all microorganisms in which genetic modification has occurred, either naturally or artificially, and specific As a microorganism with an enhanced or weakened mechanism, it may be a microorganism in which genetic mutation or activity is weakened for the production of a desired L-amino acid.
  • the microorganism producing the L-amino acid refers to a microorganism capable of producing the desired L-amino acid from a carbon source in the medium, including the mutant polypeptide, in excess compared to the wild-type or unmodified microorganism.
  • the "microorganism producing L-amino acid” may be used interchangeably with "a microorganism having L-amino acid producing ability" or "a microorganism producing L-amino acid”.
  • the L-amino acid produced by the L-amino acid producing microorganism may be any one or more selected from the group consisting of leucine, lysine, valine, isoleucine and O-acetyl homoserine, but is not limited thereto.
  • Microorganism producing the L- amino acid is specifically exemplified by, Escherichia (Escherichia) genus, Serratia marcescens (Serratia), An air Winiah (Erwinia) genus, Enterobacter bacteria (Enterobacteria) genus, Salmonella (Salmonella) genus Streptomyces (Streptomyces) genus Pseudomonas (Pseudomonas), a can include microbial strains such as Brevibacterium (Brevibacterium) in or Corynebacterium (Corynebacterium) genus. Specifically, it may be a microorganism of the genus Corynebacterium, and a more specific example may be Corynebacterium glutamicum , but is not limited thereto.
  • the microorganism producing L-amino acid is a strain of CJL-8100 having L-leucine production ability by introducing a mutant [leuA_(R558H, G561D)] of isopropyl malate synthase into a microorganism of the genus Corynebacterium, Coryne. Corynebacterium CJ3P (Binder et al.
  • Genome Biology 2012, 13 having L-lysine-producing ability by introducing three types of mutations [pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)] into the microorganisms of the genus Bacterium :R40), Corynebacterium KCCM11201P (US 8465962 B2), a valine-producing strain, Corynebacterium KCCM11248P (Republic of Korea Patent No.
  • an acetyl-homoserine degradation pathway O-acetyl by introducing a mutation (L377K) (US 10662450 B2) for canceling feedback inhibition of L-lysine and L-Threonine in the lysC gene encoding aspartokinase - It may be Corynebacterium glutamicum having a homoserine-producing ability, but is not limited thereto.
  • the microorganism producing the L-amino acid may further include the mutant polypeptide, thereby increasing the production ability of the desired
  • Corynebacterium genus microorganism is specifically Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum ( Brevibacterium lactofermentum ), Brevibacterium flavum ( Brevibacterium flavum ), Corynebacterium thermoaminogenes ), Corynebacterium efficiens ), etc., but are not necessarily limited thereto.
  • the Corynebacterium genus microorganism increases the yield of L-amino acids even if the citrate synthase activity is weakened compared to the unmodified microorganism, and the sugar consumption rate is similar Corynebacterium glutamicum ( Corynebacterium glutamicum ).
  • Another aspect of the present application is that the amino acid corresponding to the 312th position from the N-terminus of the polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with another amino acid, a variant having citrate synthase activity It is possible to provide a method for producing L-amino acids, comprising culturing a microorganism comprising a polypeptide, a polynucleotide encoding the variant polypeptide, or a vector comprising the polynucleotide in a medium.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, citrate synthase, variant polypeptides, polynucleotides, vectors and microorganisms are as described above.
  • the microbial culture is not particularly limited, but may be performed by a known batch culture method, a continuous culture method, a fed-batch culture method, and the like.
  • the culture conditions are not particularly limited thereto, but use a basic compound (eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia) or an acidic compound (eg, phosphoric acid or sulfuric acid) to an appropriate pH (eg, pH 5 to 9, specifically can control pH 6 to 8, most specifically pH 6.8) and maintain aerobic conditions by introducing oxygen or an oxygen-containing gas mixture into the culture.
  • a basic compound eg, sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia
  • an acidic compound eg, phosphoric acid or sulfuric acid
  • the culture temperature may be maintained at 20 to 45° C., specifically 25 to 40° C., and may be cultured for about 10 to 160 hours, but is not limited thereto.
  • the L-amino acids produced by the culture may be secreted into the medium or remain in the cells.
  • the culture medium used is a carbon source that includes sugars and carbohydrates (eg, glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose), oils and fats (eg, soybean oil, sunflower seeds). Oil, peanut oil and coconut oil), fatty acids (eg palmitic acid, stearic acid and linoleic acid), alcohols (eg glycerol and ethanol), and organic acids (eg acetic acid) may be used individually or in combination. , but not limited thereto.
  • sugars and carbohydrates eg, glucose, sucrose, lactose, fructose, maltose, molasses, starch and cellulose
  • oils and fats eg, soybean oil, sunflower seeds. Oil, peanut oil and coconut oil
  • fatty acids eg palmitic acid, stearic acid and linoleic acid
  • alcohols eg glycerol and ethanol
  • organic acids eg acetic acid
  • Nitrogen sources include nitrogen-containing organic compounds (e.g., peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soy meal and urea), or inorganic compounds (e.g., ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate) may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • organic compounds e.g., peptone, yeast extract, broth, malt extract, corn steep liquor, soy meal and urea
  • inorganic compounds e.g., ammonium sulfate, ammonium chloride, ammonium phosphate, ammonium carbonate and ammonium nitrate
  • potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, sodium-containing salt corresponding thereto, etc. may be used individually or in combination, but is not limited thereto.
  • the medium may contain essential growth-promoting substances such as, but not limited to, other metal salts (eg
  • the method may further include the step of recovering L-amino acids from the culture medium or microorganisms after the culturing step, but is not limited thereto.
  • the desired amino acid may be collected from the culture medium using a suitable method known in the art according to the culture method. For example, centrifugation, filtration, anion exchange chromatography, crystallization, HPLC, etc. may be used, and the desired L-amino acid may be recovered from the medium or microorganism using a suitable method known in the art.
  • the recovery step may include a purification process, and may be performed using a suitable method known in the art. Accordingly, the recovered L-amino acid may be in a purified form or a microbial fermentation broth containing L-amino acid.
  • the L-amino acid may be any one or more selected from the group consisting of leucine, lysine, valine, isoleucine and O-acetyl homoserine, but is not limited thereto.
  • compositions for the production of L-amino acids comprising a microorganism of the genus Corynebacterium or a culture thereof comprising the mutant polypeptide having the citrate synthase activity.
  • the microorganism may be of the genus Corynebacterium, specifically Corynebacterium glutamicum, but is not limited thereto. This is the same as described above.
  • the composition for producing L-amino acid may refer to a composition capable of producing L-amino acid by the mutant polypeptide having citrate synthase activity of the present application.
  • the composition may include, without limitation, the variant polypeptide having citrate synthase activity or a composition capable of activating the variant polypeptide having citrate synthase activity.
  • the mutant polypeptide having the citrate synthase activity may be in a form included in a vector so that the operably linked gene can be expressed in the introduced host cell.
  • the composition may further comprise a cryoprotectant or an excipient.
  • the cryoprotectant or excipient may be a non-naturally occurring material or a naturally occurring material, but is not limited thereto.
  • the cryoprotectant or excipient may be a material that the microorganism does not naturally contact, or a material that is not naturally included with the microorganism at the same time, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present application provides a use for the production of L-amino acids in a microorganism of the genus Corynebacterium comprising a variant polypeptide having the citrate synthase activity.
  • a recombinant vector including a part of gltA was first prepared.
  • the amino acid sequence and nucleotide sequence of wild-type gltA are the same as SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, respectively.
  • Corynebacterium glutamicun Corynebacterium glutamicun
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 using the wild line chromosome as a template, and the amplified product was obtained by using the TOPO cloning kit (Invitrogen) for E. coli vector pCR2 cloned into .1 to obtain pCR-gltA.
  • a gltA mutation library was prepared based on the vector constructed in Example 1-1.
  • the library was constructed using an error-prone PCR kit (clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit). Under conditions in which mutations can occur, a PCR reaction was performed using SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 as primers. Specifically, after 30 seconds of pre-heating at 94°C under the condition that 0 to 3 mutations occur per 1000bp, the process of 30 seconds at 94°C and 1 minute and 30 seconds at 68°C was repeated 25 times. .
  • the primers used in this Example are shown in Table 1 below.
  • the pTOPO-gltA-library prepared in Example 1-2 was transformed into Corynebacterium glutamicun ATCC13032 by electroporation, and then plated on a nutrient medium containing 25 mg/L of kanamycin to transform 10,000 colonies of the strain into which the gene was inserted were secured, and each colony was named from ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)1 to ATCC13032/pTOPO_gltA(mt) 10000.
  • Fermentation potency was evaluated in the following manner for each colony in order to confirm the colonies with increased leucine production among the secured 10,000 colonies.
  • Each colony was inoculated into a 250 ml corner-barpool flask containing 25 ug/ml of kanamycin in 25 ml of autoclaved production medium using platinum, and then cultured with shaking at 30° C. for 60 hours at 200 rpm. After completion of the culture, leucine production was measured by a method using high-performance liquid chromatography (HPLC, SHIMAZDU LC20A), and one strain having the most improved leucine production capacity compared to the wild-type Corynebacterium glutamicum strain was selected. The leucine concentrations produced in the selected strains are shown in Table 2 below.
  • PCR was performed in ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)3142 strain using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 to confirm the genetic mutation of the mutant strain and sequencing was performed to compare the gltA gene with the wild-type ATCC13032 and it was confirmed that the above strain contains a mutation in the gltA gene.
  • an insertion vector was prepared.
  • a site directed mutagenesis method was used to construct a vector for introducing gltA(M312I) mutations.
  • PCR was performed using the primer pair of SEQ ID NOs: 9 and 10, and the primer pair of SEQ ID NOs: 11 and 12 using the chromosome of the Corynebacterium glutamicum wild-type as a template. After denaturing at 94°C for 5 minutes, PCR was repeated 30 times at 94°C for 30 seconds, at 55°C for 30 seconds, and at 72°C for 1 minute and 30 seconds, followed by polymerization at 72°C for 5 minutes.
  • the resultant gene fragment was cloned by linking the homologous sequence of the 15 bases at the terminal between the DNA fragments using a linear pDC vector digested with SmaI restriction enzyme and an In-Fusion enzyme and cloning. Methionine, the 312th amino acid, was replaced with isoleucine.
  • a vector pDC-gltA (M312I) was constructed.
  • the strain into which the pDC-gltA(M312I) vector prepared in Example 3-1 was transformed into ATCC13032 and the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • the selected primary strain was again subjected to secondary cross-over, and a strain into which the mutation of the target gene was introduced was selected. Whether or not the gltA gene mutation was introduced in the final transformed strain was confirmed that the mutation was introduced in the strain by performing PCR using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and then analyzing the nucleotide sequence.
  • the produced strain was named ATCC13032_gltA_M312I.
  • IPMS isopropylmalate synthase
  • the strain into which the pDC-leuA (R558H, G561D) vector containing the leuA mutation was transformed into ATCC13032 and the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • the selected primary strain was again subjected to a secondary crossover, and a strain into which a mutation of the leuA gene was introduced was selected. Whether or not the mutation was introduced into the final transformed strain was confirmed that the mutation was introduced by performing PCR using the primers of SEQ ID NO: 13 and SEQ ID NO: 14 and then analyzing the nucleotide sequence.
  • the ATCC13032_leuA_(R558H, G561D) strain transformed with the pDC-leuA(R558H, G561D) vector was named CJL-8100.
  • the strain CJL-8100 a leucine-producing strain, was transformed with the pDC-gltA (M312I) vector prepared in Example 3-1, and the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence, containing 25 mg/L of kanamycin. Selected in one medium. The selected primary strain was again subjected to secondary crossover, and a strain into which the mutation of the target gene was introduced was selected. To determine whether the gltA gene mutation was introduced into the final transformed strain, PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8, and then the nucleotide sequence was analyzed to confirm that the gltA mutation was introduced into the strain.
  • CJL8100_gltA_M312I was named CA13-8104 and deposited with the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM), an international depository under the Budapest Treaty, as of December 20, 2019, and was given a deposit number KCCM12649P.
  • KCCM Korean Culture Center of Microorganisms
  • the leucine-producing ability of the prepared CA13-8104 strain was evaluated. Flask culture was carried out in the same manner as in Example 2, and leucine production was measured by the method using HPLC after the end of the culture, and the culture results are shown in Table 4 below.
  • the leucine-producing ability of the prepared CJL8100/pTOPO_gltA(mt)3142 strain was evaluated. Flask culture was carried out in the same manner as in Example 2, and leucine production was measured by a method using HPLC after completion of the culture, and the culture results are shown in Table 5 below.
  • amino acid at position 312 in the amino acid sequence of gltA is an important position for gltA enzymatic activity.
  • Example 5 Preparation of CJ3P strain introduced with gltA mutant (M312I) and analysis of lysine production
  • each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of a seed medium, and cultured with shaking at 30° C. for 20 hours at 200 rpm. Then, a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of production medium was inoculated with 1 ml of the seed culture and cultured with shaking at 32° C. for 72 hours at 200 rpm.
  • the composition of the species medium and the production medium is as follows, respectively. After completion of the culture, the concentration of L-lysine was measured using HPLC (Waters 2478), and it is shown in Table 6.
  • the CJ3P::gltA(M312I) strain introduced with the gltA(M312I) mutation in the Corynebacterium glutamicum CJ3P strain, which is a lysine-producing strain, improved lysine production by 127% compared to the parent strain. did.
  • KCCM11201P was transformed with the pDC-gltA(M312I) vector prepared in Example 3-1, and the vector into which the vector was inserted into the chromosome by recombination of the homologous sequence was selected in a medium containing 25 mg/L of kanamycin. The selected primary strain was again subjected to secondary crossover, and a strain into which the mutation of the target gene was introduced was selected. Whether the gltA gene mutation was introduced in the final transformed strain was confirmed that the gltA mutation was introduced in the strain by performing PCR using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and then analyzing the nucleotide sequence. The produced strain was named KCCM11201P-gltA (M312I).
  • valine-producing ability of the KCCM11201P-gltA (M312I) strain prepared above was evaluated. Flask culture was carried out in the same manner as in Example 2-2, and valine production was measured by the method using HPLC after completion of the culture, and the culture results are shown in Table 7 below.
  • amino acid at position 312 in the amino acid sequence of gltA is an important position for gltA enzyme activity.
  • Example 7 Confirmation of L-isoleucine-producing ability of gltA selection mutation in isoleucine-producing strains
  • Example 4 the recombinant plasmid pDC-gltA (M312I) prepared in Example 3-1 was added to Corynebacterium glutamicum KCCM11248P (Korean Patent No. 10-1335789), which is an L-isoleucine-producing strain. Strains introduced by homologous recombination on chromosomes were prepared and named KCCM11248P::gltA(M312I), respectively. The produced strain was cultured in the following manner to compare isoleucine-producing ability.
  • Each strain was inoculated in a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the seed medium, and incubated at 30° C. for 20 hours with shaking at 200 rpm. Then, 1 ml of the seed culture solution was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 24 ml of the production medium and cultured with shaking at 30° C. for 48 hours at 200 rpm.
  • the composition of the species medium and the production medium is as follows, respectively.
  • Glucose 50 g (NH 4 ) 2 SO 4 12.5 g, Soy Protein 2.5 g, Corn Steep Solids 5 g, Urea 3 g, KH 2 PO 4 1 g, MgSO 4 7H 2 O 0.5 g, Biotin 100 ⁇ g, Thiamine Hydrochloride 1000 ⁇ g, Calcium-Pantothenic Acid 2000 ⁇ g, Nicotinamide 3000 ⁇ g, CaCO3 30 g (Based on 1 Liter of Distilled Water)
  • PCR was performed using SEQ ID NOs: 15 and 16 or SEQ ID NOs: 17 and 18 primers.
  • the sequences of the primers used are shown in Table 9 below.
  • PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 30 seconds, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes.
  • a 509 bp DNA fragment in the 5' upper region and a 520 bp DNA fragment in the 3' lower region were obtained based on the mutation of the lysC gene, respectively.
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NOs: 15 and 18. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 60 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes.
  • a 1011 bp DNA fragment containing a mutation in the lysC gene encoding an aspartokinase variant in which leucine at position 377 was substituted with lysine was amplified.
  • pDZ-lysC L377K
  • the pDZ-lysC (L377K) vector obtained above was introduced into the WT strain by an electric pulse method (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999, 52:541-545)) and then transformed in a selective medium containing 25 mg/L of kanamycin. strains were obtained.
  • WT::lysC (L377K) a strain in which nucleotide mutations were introduced into the lysC gene by the DNA fragment inserted on the chromosome, was obtained.
  • the gene into which the nucleotide mutation was introduced was finally confirmed by comparison with the sequence of the wild-type lysC gene through PCR using the primers of SEQ ID NOs: 15 and 18 and then sequencing.
  • PCR was performed using primers of SEQ ID NOs: 19 and 20 and SEQ ID NOs: 21 and 22 using WT genomic DNA as a template.
  • the sequences of the primers used are shown in Table 10 below.
  • PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 30 seconds, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes.
  • a 220 bp DNA fragment at the 5' upper end and a 220 bp DNA fragment at the 3' lower end were obtained centering on the mutation of the hom gene.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 5 and 8 using these two PCR products as templates.
  • the obtained pDZ-hom (R407H) vector was introduced into the WT::lysC (L377K) strain by an electric pulse method, and then the transformed strain was obtained in a selective medium containing 25 mg/L of kanamycin.
  • the recombinant plasmid pDC-gltA(M312I) prepared in Example 3-1 was introduced into the WT::lysC(L377K)-hom(R407H) strain by homologous recombination on the chromosome in the same manner as in the above Example. and WT::lysC(L377K)-hom(R407H)-gltA(M312I).
  • a pair of primers for amplifying the 5' upper region around the mutation site and the 3' lower region are amplified
  • a pair of primers (SEQ ID NOs: 25 and 26) was designed for In the primers of SEQ ID NOs: 23 and 26, BamHI restriction enzyme sites (indicated by an underline) were inserted at each end, and the primers of SEQ ID NOs: 24 and 25 were designed to cross each other so that nucleotide substitution mutations (indicated by an underline) were located. did.
  • the sequences of the primers were shown in Table 11 below.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 26 using the WT chromosome as a template. PCR conditions were repeated 30 times of denaturation at 95° C. for 5 minutes, then denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 30 seconds, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes. As a result, a 627 bp DNA fragment at the 5' upper end and a 608 bp DNA fragment at the 3' lower end were obtained centering on the mutation of the ilvA gene.
  • PCR was performed with primers of SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 26. After denaturation at 95° C. for 5 minutes, denaturation at 95° C. for 30 seconds, annealing at 55° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 60 seconds were repeated 30 times, followed by polymerization at 72° C. for 7 minutes.
  • a 1217 bp DNA fragment containing a mutation in the ilvA gene encoding the IlvA variant in which valine at position 323 was substituted with alanine was amplified.
  • the pECCG117 (Republic of Korea Patent No. 10-0057684) vector and a DNA fragment of 1011 bp were treated with a restriction enzyme BamHI, ligated using a DNA conjugation enzyme, and then cloned to obtain a plasmid, which was called pECCG117- ilvA (V323A). named.
  • a strain introduced into the pECCG117-ilvA(V323A) vector was prepared in ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)-gltA(M312I) of the above example.
  • a strain in which only ilvA(V323A) mutation was introduced into ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K) as its control was also prepared.
  • the strain prepared above was cultured in the same manner as in the flask culture method shown in Example 4-1, and the L-isoleucine concentration in the culture solution was analyzed, and the results are shown in Table 12 below.
  • ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A) mutation introduced ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K) compared to wild-type strain ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A) )- In gltA(M312I)/pECCG117-ilvA(V323A), it was confirmed that the concentration of L-isoleucine increased by about 43%.
  • Example 8 Production of strains having improved O-acetyl homoserine-producing ability and evaluation of O-acetyl homoserine-producing ability
  • metB encoding cystathionine gamma-synthase of the O-acetyl homoserine degradation pathway genes were obtained.
  • the nucleotide sequence information of the metB gene (NCBI registration number Ncgl2360, SEQ ID NO: 27) was obtained from the National Institutes of Health (NIH GenBank), and based on this, a primer (sequence) including the N-terminal portion and the linker portion of the metB gene Nos. 28 and 29), primers (SEQ ID NOs: 30 and 31) comprising a C-terminal portion and a linker portion were synthesized. Primer sequences are shown in Table 13 below.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 28 and 29 and SEQ ID NOs: 30 and 31.
  • Polymerase PfuUltra TM high-confidence DNA polymerase (Stratagene) was used, and PCR conditions were 30 seconds of denaturation at 96°C, annealing at 53°C for 30 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute, repeated 30 times.
  • a 558 bp amplified gene including the N-terminal portion and linker portion of the metB gene and 527 bp amplified gene including the C-terminal portion and linker portion of the metB gene were obtained, respectively.
  • PCR was performed using the two amplified genes obtained above as a template, and PCR conditions were SEQ ID NO: 2 and 10 repetitions of denaturation at 96 ° C. for 60 seconds, annealing at 50 ° C. for 60 seconds, and polymerization at 72 ° C. for 1 minute. 5 was added and the polymerization was repeated 20 more times.
  • a 1064bp inactivation cassette including the N-terminal-linker-C-terminus of the metB gene was obtained.
  • Restriction enzymes XbaI and SalI contained at the end of the PCR fragment obtained through the PCR were treated, and ligation was performed to pDZ (US 9109242 B2) vector treated with restriction enzymes XbaI and SalI.
  • metB inactivation cassette was performed by cloning. A cloned pDZ- ⁇ metB recombinant vector was constructed.
  • the prepared pDZ- ⁇ metB vector was transformed into ATCC13032 by an electric pulse method, and through a secondary crossover process, ATCC13032 ⁇ metB in which the metB gene was inactivated was obtained on the chromosome.
  • the inactivated metB gene was finally confirmed by comparison with ATCC13032 in which the metB gene was not inactivated after PCR using the primers of SEQ ID NOs: 28 and 31.
  • nucleotide sequence information of the metY gene was obtained from the National Institutes of Health's GenBank (NIH GenBank), and based on this, a primer containing the N-terminal portion and the linker portion of the metY gene (sequence) Nos. 33 and 34), primers (SEQ ID NOs: 35 and 36) comprising a C-terminal portion and a linker portion were synthesized. Primer sequences are shown in Table 14 below.
  • PCR was performed using the primers of SEQ ID NOs: 33 and 34 and SEQ ID NOs: 35 and 36.
  • PfuUltra TM high-confidence DNA polymerase (Stratagene) was used as the polymerase, and PCR conditions were repeated 30 times: denaturation at 96° C. for 30 seconds, annealing at 53° C. for 30 seconds, and polymerization at 72° C. for 1 minute.
  • a 548 bp amplified gene including the N-terminal portion and linker portion of the metY gene and 550 bp amplified gene including the C-terminal portion and linker portion of the metY gene were obtained.
  • PCR was performed using the two amplified genes obtained above as a template, and PCR conditions were denaturation at 96°C for 60 seconds, annealing at 50°C for 60 seconds, and polymerization at 72°C for 1 minute repeated 10 times, followed by SEQ ID NOs: 33 and 34 was added and the polymerization reaction was repeated 20 more times.
  • an inactivation cassette of 1077 bp including the N-terminal-linker-C-terminus of the metY gene was obtained.
  • Restriction enzymes XbaI and SalI contained at the end of the PCR fragment obtained through the PCR were treated, and ligation was performed to pDZ (US 9109242 B2) vector treated with restriction enzymes XbaI and SalI.
  • the metY inactivation cassette was performed by cloning. A cloned pDZ- ⁇ metY recombinant vector was constructed.
  • the prepared pDZ- ⁇ metY vector was transformed into ATCC13032 ⁇ metB strain by an electric pulse method, and through a secondary crossover process, ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY in which the metY gene was inactivated was obtained on the chromosome.
  • the inactivated metY gene was finally confirmed by comparison with ATCC13032 in which the metY gene was not inactivated after PCR using the primers of SEQ ID NOs: 7 and 10.
  • L-lysine and L-threonine of the lysC gene to the lysC gene SEQ ID NO: 11
  • the pDZ-lysC (L377K) vector prepared in Example 7-2 was transferred to ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY strain Transformed by a pulse method, and through a secondary crossover process, Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY lysC (L377K) in which a nucleotide mutation was introduced into the lysC gene on the chromosome was obtained.
  • the gene into which the nucleotide mutation was introduced was finally confirmed by comparison with the sequence of the wild-type lysC gene through PCR
  • the pDC-gltA (M312I) vector prepared in Example 3-1 was transformed into ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY lysC (L377K) strain by an electric pulse method, and nucleotide mutations in the gltA gene were detected on the chromosome through a secondary crossover process.
  • the introduced Corynebacterium glutamicum ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY lysC (L377K) gltA (M312I) was obtained. Whether or not the gltA gene mutation was introduced in the final transformed strain was confirmed that the mutation was introduced in the strain by performing PCR using the primers of SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8 and then analyzing the nucleotide sequence.
  • the strain was inoculated into a 250 ml corner-baffle flask containing 25 ml of the following medium (inoculation loop), and cultured with shaking at 37° C. for 20 hours at 200 rpm.
  • the concentration of O-acetyl homoserine was analyzed using HPLC, and the analyzed concentrations were shown in Table 15 below.
  • strain name O-AH (g/L) ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY lysC(L377K) 0.70 ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY lysC (L377K) gltA (M312I) 0.92
  • the ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY lysC(L377K) gltA(M312I) strain introduced with gltA(M312I) mutation was O-acetyl-L-homo compared to the ATCC13032 ⁇ metB ⁇ metY lysC(L377K) strain. It was confirmed that the serine production capacity was improved by 31%.
  • amino acid at position 312 in the amino acid sequence of gltA is an important position for gltA enzyme activity.

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Abstract

본 출원은 신규한 시트레이트 신타아제(Citrate synthase)의 활성이 약화된 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여 류신을 생산하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것이다.

Description

시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 신규한 변이형 폴리펩티드 및 이를 이용한 L-아미노산 생산 방법
본 출원은 시트레이트 신타아제(Citrate synthase)의 활성이 약화된 신규한 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물 및 상기 미생물을 이용한 L-아미노산 생산 방법에 관한 것이다.
코리네박테리움 속(the genus Corynebacterium) 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 및 기타 유용물질 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. 상기 L-아미노산 및 기타 유용물질을 생산하기 위하여, 고효율 생산 미생물 및 발효공정기술 개발을 위한 다양한 연구들이 수행되고 있다. 예를 들어, L-리신 생합성에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적 접근 방법이 주로 이용되고 있다(US 8048650 B2).
한편, L-아미노산 중에서 L-리신, L-쓰레오닌, L-메티오닌, L-이소류신, L-글리신은 아스파테이트 유래 아미노산이며, 아스파테이트의 전구체인 옥살로아세테이트(oxaloacetate)의 합성 수준이 상기 L-아미노산의 합성수준에 영향을 미칠 수 있다.
시트레이트 신타아제(Citrate synthase; CS)는 미생물의 해당과정에서 생성되는 아세틸 코에이와 옥살로아세테이트를 중합하여 시트레이트를 생성하는 효소이며, 또한 TCA 경로로의 탄소유입을 결정하는 중요한 효소이다.
시트레이트 신타아제를 코딩하는 gltA 유전자 결손에 따른 L-리신 생산 균주의 phenotype 변화에 관한 내용은 선행문헌에 보고되어 있다 (Ooyen et al., Biotechnol. Bioeng., 109(8):2070-2081, 2012). 그러나 gltA 유전자 결손 균주의 경우 균주의 생장이 저해될 뿐만 아니라, 당 소모속도가 대폭 감소되어 단위시간당 리신 생산량이 낮은 단점이 있다. 따라서, 효과적인 L-아미노산의 생산능 증가 및 균주의 생장을 함께 고려한 연구가 여전히 필요한 실정이다.
본 발명자들은 특정한 수준으로 시트레이트 신타아제 활성을 약화시킨 신규한 변이형 폴리펩티드를 이용할 경우 L-아미노산의 생산량이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 출원은 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제(citrate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 출원은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 미생물을 제공한다.
본 출원은 상기 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산 방법을 제공한다.
본 출원의 시트레이트 신타아제의 기질에 대한 활성이 변화된, L-아미노산을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 배양하는 경우, 기존 비변형 폴리펩티드를 갖는 미생물에 비해 고수율의 L-아미노산 생산이 가능하다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
본 출원의 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제(citrate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 제공하는 것일 수 있다.
본 출원에서 상기 서열번호 1의 서열은 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 아미노산 서열일 수 있다. 구체적으로, 상기 서열번호 1의 서열은 gltA 유전자에 의해 코딩되는 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 단백질 서열일 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 일 예로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicun) 유래일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 상기 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 동일한 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열이라면 제한 없이 포함될 수 있다. 또한, 본 출원에서의 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 단백질은 비록 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질일 수 있으나, 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤로의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질과 서로 동일 또는 상응하는 활성을 가지는 경우라면 본 출원의 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 단백질에 해당됨은 당업자에게 자명하다. 구체적인 예를 들어, 본 출원의 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 아미노산 서열로 구성되는 단백질일 수 있다. 또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 변이 대상이 되는 단백질의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 출원에서 용어, "시트레이트 신타아제(Citrate synthase)"는 미생물의 해당과정에서 생성되는 아세틸 코에이와 옥살로아세테이트를 중합하여 시트레이트를 생성하는 효소이며, TCA 경로로의 탄소유입을 결정하는 중요한 효소이다. 구체적으로, 시트르산 합성 효소로서 TCA 회로의 첫 단계에서 속도 조절 역할을 할 수 있다. 또한, 상기 효소는 아세틸 코에이와 4-탄소 옥살로아세테이트의 분자로부터의 2-탄소 아세테이트 잔기의 축합 반응을 촉매하여 6-탄소 아세테이트를 형성할 수 있다. 본 출원에서 상기 시트레이트 신타아제는 시트레이트 합성효소, CS, GltA 단백질 또는 GltA로 혼용하여 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어, "변이형(variant)"은 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)에 있어서 상기 열거된 서열 (the recited sequence)과 상이하나, 상기 단백질의 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 변이형 폴리펩티드는 수 개의 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 식별되는 서열(identified sequence)과 상이하다. 이러한 변이형은 일반적으로 상기 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 식별될 수 있다. 즉, 변이형의 능력은 본래 단백질(native protein)에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 이러한 변이형은 일반적으로 상기 폴리펩티드 서열 중 하나를 변형하고, 변형된 폴리펩티드의 반응성을 평가하여 식별될 수 있다. 또한, 일부 변이형은 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다. 다른 변이형은 성숙 단백질 (mature protein)의 N- 및/또는 C- 말단으로부터 일부분이 제거된 변이형을 포함할 수 있다.
본 출원에서 용어 "보존적 치환(conservative substitution)"은 한 아미노산을 유사한 구조적 및/또는 화학적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환시키는 것을 의미한다. 상기 변이형은 하나 이상의 생물학적 활성을 여전히 보유하면서, 예를 들어 하나 이상의 보존적 치환을 가질 수 있다. 이러한 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성(amphipathic nature)에서의 유사성에 근거하여 발생할 수 있다. 예를 들면, 양으로 하전된 (염기성) 아미노산은 알지닌, 리신, 및 히스티딘을 포함하고; 음으로 하전된 (산성) 아미노산은 글루탐산 및 아르파르트산을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 트립토판 및 타이로신을 포함하고, 소수성 아미노산은 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 글리신 및 트립토판을 포함한다. 통상적으로, 보존성 치환은 생성된 폴리펩티드의 활성에 거의 영향을 미치지 않거나 또는 영향을 미치지 않는다.
또한, 변이형은 폴리펩티드의 특성과 2차 구조에 최소한의 영향을 갖는 아미노산들의 결실 또는 부가를 포함할 수 있다. 예를 들면 폴리펩티드는 번역-동시에(co-translationally) 또는 번역-후에(post-translationally) 단백질의 이전(transfer)에 관여하는 단백질 N-말단의 시그널 (또는 리더)서열과 컨쥬게이트 할 수 있다. 또한 상기 폴리펩티드는 폴리펩티드를 확인, 정제, 또는 합성할 수 있도록 다른 서열 또는 링커와 컨쥬게이트 될 수 있다.
본 출원에서 용어, "시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드"는 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열 일부가 치환됨으로써 야생형에 비해 약화된 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 폴리펩티드를 의미한다. 본 출원에서는 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 폴리펩티드의 아미노산 서열상에서 하나 이상의 아미노산이 변이되어 그 활성이 야생형과 비교하여 약화되어 탄소흐름이 효율적으로 균형을 이루게 하는 변이형 폴리펩티드를 의미할 수 있다.
구체적으로 상기 변이형 폴리펩티드는 상기의 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 다양한 단백질에서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 상기 '다른 아미노산'은 치환 전과는 다른 아미노산을 의미하며, 치환 전의 아미노산을 제외한 아미노산이면 제한되지 않는다.
더욱 구체적으로 상기 변이형 폴리펩티드는 상기의 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 다양한 단백질에서, 서열번호 1의 아미노산 서열의 312번째 위치에 상응하는 메티오닌이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드일 수 있다. 상기 메티오닌은 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine), 아스파라긴(asparagine), 아스파트르산(aspartic acid), 시스테인(cysteine), 글루탐산(glutamic acid), 글루타민(glutamine), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine), 리신(lysine), 페닐알라닌(phenylalanine), 프롤린(proline), 세린(serine), 쓰레오닌(threonine), 트립토판(tryptophan), 티로신(tyrosine) 및 발린(valine)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 아미노산으로 치환된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 이소류신으로 치환된 변이형 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 치환된 아미노산 잔기에는 천연 아미노산뿐만 아니라 비천연 아미노산 역시 포함될 수 있다. 상기 비천연 아미노산은 예를 들어, D-아미노산, 호모(Homo)-아미노산, 베타-호모(Beta-homo)-아미노산, N-메틸 아미노산, 알파-메틸 아미노산, 비통상 아미노산 (예컨대, 시트룰린 또는 나프틸알라닌 등) 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 한편, 본 출원에서 '특정 아미노산이 치환되었다'고 표현하는 경우, 다른 아미노산으로 치환되었다고 별도로 표기하지 않더라도 치환 전의 아미노산과 다른 아미노산으로 치환되는 것임은 자명하다.
본 출원에서 용어 "상응하는(corresponding to)"은, 단백질 또는 펩타이드에서 열거되는 위치의 아미노산 잔기이거나, 또는 단백질 또는 펩타이드에서 열거되는 잔기와 유사하거나 동일하거나 상동한 아미노산 잔기를 지칭한다. 본 출원에 사용된 "상응 영역"은 일반적으로 관련 단백질 또는 레퍼런스 단백질에서의 유사한 위치를 지칭한다.
본 출원에서, 본 출원에 사용되는 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 위치에 특정 넘버링이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비교하고자 하는 대상 폴리펩티드와 본 출원의 폴리펩티드 서열을 정렬함으로써, 본 출원의 폴리펩티드의 아미노산 잔기 위치에 상응하는 위치에 대해 재넘버링 하는 것이 가능하다.
본 출원에서 제공하는 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는, 전술한 시트레이트 신타아제에서 특이적 위치의 아미노산이 치환되어, L-아미노산의 생산능이 변이 전 폴리펩티드 대비 증가될 수 있다.
상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 구체적으로 본 출원의 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 것일 수 있으며 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 312번째 위치의 아미노산 서열 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
또한, 본 출원에서 '특정 서열번호로 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질또는 폴리펩티드'라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원에서 사용될 수 있음은 자명하다. 예를 들어, 상기 변이형 폴리펩티드와 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 특정 활성을 부여하는 상기 특정 312번째 변이 이외에 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열에서 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다. 보다 구체적으로는 서열번호 1의 아미노산 서열에서 312번째 위치에 상응하는 메티오닌이 이소류신으로 치환된 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열 또는 이와 80% 이상, 100% 미만의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로 본 출원의 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3 및 상기 서열번호 3과 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 또한, 이러한 상동성을 가지며 상기 단백질에 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면 312번째 위치의 아미노산 서열 이외에, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질도 본 출원의 범위 내에 포함됨은 자명할 수 있다.
본 출원의 목적상 상기 시트레이트 신타아제의 활성이 약화된 변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물의 경우, L-아미노산의 수율은 증가하나 당 소모속도는 대조군과 유사한 것을 특징으로 할 수 있다. 이는 시트레이트 신타아제 활성 조절을 통해 TCA 경로로의 탄소 흐름과 L-아미노산 생합성의 전구체로 사용되는 옥살로아세테이트 공급량 사이의 적절한 균형을 통해 L-아미노산 생산량을 증가시킬 수 있다는 것을 시사한다.
상기 "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이어티(moiety) 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 염기 서열과 동일하거나 유사한 활성을 가지는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시될 수 있다. 하나의 모이어티로부터 다른 하나의 모이어티까지의 서열 간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 점수(score), 동일성(identity) 및 유사도(similarity) 등의 매개 변수(parameter)들을 계산하는 표준 소프트웨어, 구체적으로 BLAST 2.0을 이용하거나, 정의된 엄격한 조건하에서 써던 혼성화 실험에 의해 서열을 비교함으로써 확인할 수 있으며, 정의되는 적절한 혼성화 조건은 해당 기술 범위 내이고, 당업자에게 잘 알려진 방법(예컨대, J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989; F.M. Ausubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York)으로 결정될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제(citrate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 시트레이트 신타아제 및 변이형 폴리펩티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 용어, "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미할 수 있다.
본 출원의 폴리뉴클레오티드는, 본 출원의 시트레이트 신타아제 활성을 갖는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 본 출원에서 시트레이트 신타아제의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자는 gltA 유전자이며, 상기 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 유래일 수 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열일 수 있으며, 보다 구체적으로는 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 본 출원의 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 폴리펩티드를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있다. 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이라면 제한 없이 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 구체적으로는 서열번호 4로 기재된 폴리뉴클레오티드 서열로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한 공지의 유전자 서열로부터 조제될 수 있는 프로브, 예를 들면, 상기 염기 서열의 전체 또는 일부에 대한 상보 서열과 엄격한 조건 하에 하이드리드화하여, 서열번호 1의 아미노산 서열에서 312번째 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 서열이라면 제한없이 포함될 수 있다. 상기 "엄격한 조건(stringent condition)"이란 폴리뉴클레오티드 간의 특이적 혼성화를 가능하게 하는 조건을 의미한다. 이러한 조건은 문헌(예컨대, J. Sambrook et al., 상동)에 구체적으로 기재되어 있다. 예를 들어, 상동성 또는 동일성이 높은 유전자끼리, 40% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상, 특히 구체적으로는 99% 이상의 상동성 또는 동일성을 갖는 유전자끼리 하이브리드화하고, 그보다 상동성 또는 동일성이 낮은 유전자끼리 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 써던 하이브리드화(southern hybridization)의 세척 조건인 60℃, 1ΥSSC, 0.1% SDS, 구체적으로는 60℃, 0.1ΥSSC, 0.1% SDS, 보다 구체적으로는 68℃, 0.1ΥSSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도 및 온도에서, 1회, 구체적으로는 2회 내지 3회 세정하는 조건을 열거할 수 있다.
혼성화는 비록 혼성화의 엄격도에 따라 염기 간의 미스매치(mismatch)가 가능할지라도, 두 개의 핵산이 상보적 서열을 가질 것을 요구한다. 용어, "상보적"은 서로 혼성화가 가능한 뉴클레오티드 염기 간의 관계를 기술하는데 사용된다. 예를 들면, DNA에 관하여, 아데노신은 티민에 상보적이며 시토신은 구아닌에 상보적이다. 따라서, 본 출원은 또한 실질적으로 유사한 핵산 서열뿐만 아니라 전체 서열에 상보적인 단리된 핵산 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로, 상동성 또는 동일성을 가지는 폴리뉴클레오티드는 55℃의 Tm 값에서 혼성화 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용하고 상술한 조건을 사용하여 탐지할 수 있다. 또한, 상기 Tm 값은 60℃, 63℃ 또는 65℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니고 그 목적에 따라 당업자에 의해 적절히 조절될 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 혼성화하는 적절한 엄격도는 폴리뉴클레오티드의 길이 및 상보성 정도에 의존하고 변수는 해당기술분야에 잘 알려져 있다(Sambrook et al., supra, 9.50-9.51, 11.7-11.8 참조).
본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제(citrate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 시트레이트 신타아제, 변이형 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바와 같다.
본 출원에서 사용된 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 폴리펩티드를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 출원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pCR2.1, pDC, pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 염색체 내로 삽입할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합(homologous recombination)에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 폴리펩티드의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 출원에서 용어 "형질전환"은 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다.
또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함할 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로도 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트(expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터(promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 제한되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(Ca(H2PO4)2, CaHPO4, 또는 Ca3(PO4)2) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기에서 용어 "작동 가능하게 연결"된 것이란 본 출원의 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 매개하도록 하는 프로모터 서열과 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 의미할 수 있다. 작동 가능한 연결은 당업계의 공지된 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당업계의 절단 및 연결 효소 등을 사용하여 제작할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제(citrate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 미생물을 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 시트레이트 신타아제, 변이형 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 벡터에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 미생물은 야생형 폴리펩티드를 포함하는 미생물에 비하여 미생물의 생육 저해 또는 당 소모속도의 저해함이 없이 L-아미노산의 생산능이 향상될 수 있으며, 이들 미생물로부터 L-아미노산을 고수율로 수득할 수 있다.
본 출원에서 용어 "변이형 폴리펩티드를 포함하는 미생물"이란, 자연적으로 약한 L-아미노산 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-아미노산 생산능이 없는 모균주에 L-아미노산 생산능이 부여된 미생물을 의미할 수 있다. 구체적으로, 상기 미생물은 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 폴리펩티드 내 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 변이형 폴리펩티드를 발현하는 미생물로서, 상기 아미노산 변이는 서열번호 1의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산의 다른 아미노산으로의 치환을 포함하는 것일 수 있다. 상기 미생물로부터 발현되는 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는 약화된 활성을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미생물은, 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하거나, 또는 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터로 형질전환되어 변이형 폴리펩티드를 발현할 수 있는 세포 또는 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 숙주세포 또는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여 L-아미노산을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능할 수 있다.
본 출원에서 용어, "L-아미노산을 생산하는 미생물"은 자연적 또는 인위적으로 유전적 변형이 일어난 미생물을 모두 포함하며, 외부 유전자가 삽입되거나 내재적 유전자의 활성이 강화되거나 약화되는 등의 원인으로 인해서 특정 기작이 강화되거나 약화된 미생물로서, 목적하는 L-아미노산 생산을 위하여 유전적 변이가 일어나거나 활성을 약화시킨 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 포함하여, 배지 중의 탄소원으로부터 목적하는 L-아미노산을 야생형이나 비변형 미생물과 비교하여 과량으로 생산할 수 있는 미생물을 의미할 수 있다. 본 출원에서 상기 "L-아미노산을 생산하는 미생물"은 "L-아미노산 생산능을 갖는 미생물" 또는 "L-아미노산 생산 미생물"과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 L-아미노산 생산 미생물이 생산하는 L-아미노산은 류신, 리신, 발린, 이소류신 및 O-아세틸 호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라 (Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있다. 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있고, 보다 구체적인 예로는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로 L-아미노산을 생산하는 미생물은 코리네박테리움 속 미생물에 이소프로필말레이트 신타제의 변이체[leuA_(R558H, G561D)]를 도입하여 L-류신 생산능을 가지는 CJL-8100 균주, 코리네박테리움 속 미생물에 3종의 변이[pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)]를 도입하여 L-리신 생산능을 가지는 코리네박테리움 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40), 발린 생산 균주인 코리네박테리움 KCCM11201P(US 8465962 B2), L-이소류신 생산 균주인 코리네박테리움 KCCM11248P(대한민국 등록특허 제 10-1335789호) 또는 코리네박테리움 속 미생물에 O-아세틸-호모세린 분해 경로인 시스타치오닌 감마-신타제를 암호화하는 metB 유전자와 O-아세틸호모세린 (티올)-라이아제를 암호화하는 metY 유전자를 결손하고 O-아세틸-호모세린 생합성을 증대 하기 위하여 아스파토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자의 L-리신(L-Lysine) 및 L-쓰레오닌(L-Threonine)에 대한 피드백 저해 해제를 위한 변이(L377K)(US 10662450 B2)를 도입하여 O-아세틸-호모세린 생산능을 가지는 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 L-아미노산을 생산하는 미생물은 상기 변이형 폴리펩티드를 추가로 포함하여, 목적하는 L-아미노산의 생산능이 증가된 것일 수 있다.
본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 구체적으로는 코리네박테리움 글루타미쿰, 코리네박테리움 암모니아게네스, 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum), 브레비박테리움 플라범(Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 코리네박테리움 에피션스(Corynebacterium efficiens) 등이나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로는, 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물은 시트레이트 신타아제 활성이 비변형 미생물에 비하여 약화되더라도 L-아미노산의 수율은 증가하고, 당 소모속도는 유사한 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.
본 출원의 또 하나의 양태는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제(citrate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산 방법을 제공할 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열, 시트레이트 신타아제, 변이형 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 미생물에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 당업계에 공지된 최적화된 배양 조건 및 효소 활성 조건 에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 구체적으로, 미생물 배양은 특별 히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내 지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45℃, 구체적으로는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 L-아미노산은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방법은 상기 배양 단계 이후 배양된 배지 또는 미생물에서 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 배양 단계에서 생산된 L-아미노산을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-아미노산을 회수할 수 있다.
또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 따라서, 상기의 회수되는 L-아미노산은 정제된 형태 또는 L-아미노산을 함유한 미생물 발효액일 수 있다.
상기 L-아미노산은 류신, 리신, 발린, 이소류신 및 O-아세틸 호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물 또는 이의 배양액을 포함하는, L-아미노산 생산용 조성물을 제공한다.
상기 미생물은 코리네박테리움 속일 수 있고, 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 L-아미노산 생산용 조성물은 본 출원의 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드에 의해 L-아미노산을 생산할 수 있는 조성물을 의미할 수 있다. 상기 조성물은 상기 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드 또는 상기 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 작동시킬 수 있는 구성을 제한없이 포함할 수 있다. 상기 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드는 도입된 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있도록 벡터 내에 포함된 형태일 수 있다.
상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 또는 부형제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 동결보호제 또는 부형제는 상기 미생물이 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 미생물과 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 또 하나의 양태는 상기 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드를 포함하는 코리네박테리움 속 미생물의 L-아미노산의 생산용도를 제공한다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: gltA 변이 발굴
1-1. gltA를 포함하는 벡터 제작
시트레이트 신타아제 활성을 가지는 gltA 변이 라이브러리를 제작하기 위해 우선 gltA의 일부를 포함하는 재조합 벡터를 제작하였다. 야생형 gltA의 아미노산 서열 및 뉴클레오티드 서열은 각각 서열번호 1 및 서열번호 2와 같다. 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicun) 야생주의 염색체를 주형으로 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였으며, 상기 증폭산물을 TOPO 클로닝 키트(Invitrogen)를 이용하여 대장균 벡터 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-gltA를 얻었다.
1-2. gltA 변이 라이브러리 제작
상기 실시예 1-1에서 제작된 벡터를 기반으로 gltA 변이 라이브러리를 제작하였다. 라이브러리는 에러-프론(error-prone) PCR 키트(clontech Diversify® PCR Random Mutagenesis Kit)를 이용하여 제작하였다. 변이가 발생할 수 있는 조건에서, 서열번호 5 및 서열번호 6을 프라이머로 하여 PCR 반응을 수행하였다. 구체적으로는, 1000bp 당 0에서 3개의 변이가 발생하는 조건으로 94℃에서 30초 전가열(pre-heating) 후, 94℃에서 30초, 68℃에서 1분 30초의 과정을 25회 반복 수행하였다. 이 때 얻어진 PCR 산물을 메가프라이머(megaprimer, 500~125ng)로 하여 95℃에서 50초, 60℃에서 50초, 68℃에서 12분의 과정을 25회 반복 수행한 후 DpnI 처리하여, 대장균 DH5α에 형질전환하여 카나마이신(kanamycin) 25mg/L이 포함된 LB 고체배지에 도말 하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후 플라스미드를 획득하여 폴리뉴클레오티드 서열을 분석한 결과 2개 변이/kb 빈도로 서로 다른 위치에 변이가 도입된 것을 확인하였다. 약 20,000개의 형질전환된 대장균 콜로니를 취하여 플라스미드를 추출하였고, 이를 pTOPO-gltA-라이브러리로 명명하였다.
본 실시예에서 사용된 프라이머는 하기 표 1과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
5 pCR-gltA F CTAATCTCGAGGTCACCCATGTTTGAAAGG
6 pCR-gltA R TCGCGAGGAGCGCTAAAACCGGTTGAT
7 gltA F CAATGCTGGCTGCGTACGC
8 gltA R CTCCTCGCGAGGAACCAACT
9 gltA M312I Up F GTGAATTCGAGCTCGGTACCCGCGGGAATCCTGCGTTACCGC
10 gltA M312I Up R TGTAAACGCGGTGTCCGAAGCCGATGAGGCGGACGCCGTCTT
11 gltA M312I Down F AAGACGGCGTCCGCCTCATCGGCTTCGGACACCGCGTTTACA
12 gltA M312I Down R GGTCGACTCTAGAGGATCCCCTTAGCGCTCCTCGCGAGGAAC
13 leuA F ACCGAAATTGGCTTGGGTGCCAGCCCAGCTGATGCCTAC
14 leuA R AAGCTTGCATGCCTGCAGCTTAAAGTCACCTACGTTTTGTAC
실시예 2: 제작한 라이브러리 평가 및 변이체 선별
상기 실시예 1-2에서 제작된 pTOPO-gltA-라이브러리를 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicun) ATCC13032에 전기천공법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 영양배지에 도말하여 변이 유전자가 삽입된 균주 10,000개의 콜로니를 확보하였으며, 각 콜로니를 ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)1부터 ATCC13032/pTOPO_gltA(mt) 10000까지로 명명하였다.
확보된 10,000개의 콜로니 중 류신 생산이 늘어나는 콜로니를 확인하기 위해 각각의 콜로니에 대해 하기와 같은 방법으로 발효역가 평가를 진행하였다.
- 생산배지: 포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질(Soy Protein) 2.5 g, 옥수수 침지고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1,000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3,000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준), pH 7.0
가압 살균한 생산배지 25 ㎖에 25 ug/ml의 카나마이신을 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 각 콜로니를 백금이를 이용하여 접종한 후, 30℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 배양 종료 후 고속액체크로마토그래피(HPLC, SHIMAZDU LC20A)를 이용한 방법에 의해 류신 생산량을 측정하여 야생형 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 대비 류신 생산능이 가장 향상된 균주 1종을 선별하였다. 선별된 균주에서 생산된 류신 농도는 하기 표 2와 같다.
균주명 류신 (g/L)
ATCC13032 0.87
ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)3142 1.54
다음으로는 상기 돌연변이 균주의 유전자 변이를 확인하기 위하여 서열번호 7 및 서열번호 8 의 프라이머를 이용하여 ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)3142 균주에서 PCR을 수행하고 시퀀싱을 진행하여, gltA 유전자를 야생형 ATCC13032와 비교하였고 상기의 균주는 gltA 유전자에 변이를 포함하고 있다는 것을 확인하였다.
구체적으로, ATCC13032/pTOPO_gltA(mt)3142 균주는 gltA 유전자의 936번째 뉴클레오티드인 G가 C로 치환되어 있음을 확인하였다. 이는 gltA의 아미노산 서열에서 312번째 메티오닌이 이소류신으로 치환되는 변이이다. 따라서, 이하 실시예에서는, 상기 변이가 코리네박테리움 속 미생물의 류신 생산량에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다.
실시예 3: gltA 선별 변이의 류신 생산능 확인
3-1. gltA 변이를 포함하는 삽입 벡터 제작
상기 실시예 2에서 선별된 변이를 균주 내로 도입하기 위해 삽입용 벡터를 제작하고자 하였다. gltA(M312I) 변이 도입용 벡터 제작은 위치 지정 돌연변이 생성(Site directed mutagenesis) 방법을 사용하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 야생형의 염색체를 주형으로 서열번호 9 및 10의 프라이머 쌍, 서열번호 11 및 12의 프라이머 쌍을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 변성 후, 94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 1분 30초를 30회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 얻어진 유전자 단편을 SmaI 제한효소로 절단시킨 선상의 pDC 벡터와 인퓨전(In-Fusion) 효소를 이용해 DNA 단편간의 말단 15개 염기의 상동서열을 결합시켜 클로닝하여 312번째 아미노산인 메티오닌을 이소류신으로 치환하는 벡터 pDC-gltA(M312I)를 제작하였다.
3-2. ATCC13032 균주 내 변이체 도입 및 평가
상기 실시예 3-1에서 제작한 pDC-gltA(M312I)벡터를 ATCC13032에 형질전환하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차(cross-over)를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 gltA 유전자 변이 도입의 여부는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 염기서열을 분석함으로써 균주 내 변이가 도입되었음을 확인하였다. 제작된 균주는 ATCC13032_gltA_M312I로 명명하였다.
상기 제작된 ATCC13032_gltA_M312I 균주의 류신 생산능을 평가하기 위해 역시 플라스크 발효역가 평가를 진행하였다. 실시예 2의 생산배지를 각각 25 ㎖ 함유하는 250 ㎖ 코너-바풀 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 및 상기 제작한 ATCC13032_gltA_M312I을 각각 1백금이 접종한 후, 30℃에서 60 시간 동안 200 rpm으로 진탕 배양하여 류신을 생산하였다. 배양종료 후 HPLC로 류신의 생산량을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 류신 농도는 하기 표 3과 같다.
균주명 류신 (g/L)
ATCC13032 0.87
ATCC13032_gltA_M312I 1.25
실시예 4: 류신 생산주에서 gltA 선별 변이의 류신 생산능 확인
코리네박테리움 속 야생형의 균주는 류신을 생산하더라도 아주 극미량이 생산될 뿐이다. 이에 ATCC13032 유래의 류신 생산 균주를 제작하고, 선별한 변이를 도입하여 류신 생산능을 확인하는 실험을 진행하였다. 구체적인 실험은 다음과 같다.
4-1. 류신 생산주 CJL-8100 균주 제작
ATCC13032 유래의 고농도의 류신 생산 균주를 제작하기 위해 이소프로필말레이트 신타제(isopropylmalate synthase, 이하, "IPMS"로 지칭함) 변이체를 도입한 CJL-8100 균주를 제작하였다. 해당 변이는 IPMS를 암호화하는 leuA 유전자의 1673 번째 뉴클레오티드인 G가 A로 치환되어 IPMS 단백질의 558 번째 아미노산인 알지닌이 히스티딘으로 치환되는 변이와 1682 번째, 1683 번째 뉴클레오티드인 GC가 AT로 치환되어 561 번째 아미노산인 글리신이 아스파르트산으로 치환되는 변이를 포함한다.
상기의 leuA 변이를 포함하는 pDC-leuA(R558H, G561D) 벡터를 ATCC13032에 형질전환하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차를 거쳐, leuA 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 변이 도입 여부는 서열번호 13 및 서열번호 14의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 염기서열을 분석함으로써 변이가 도입 되었음을 확인하였다. 상기 pDC-leuA(R558H, G561D) 벡터로 형질전환된 ATCC13032_leuA_(R558H, G561D) 균주를 CJL-8100으로 명명하였다.
4-2. CJL-8100 균주 내 gltA 변이체 도입 및 평가
류신 생산 균주인 CJL-8100을 상기 실시예 3-1에서 제작한 pDC-gltA(M312I)벡터로 형질전환하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 gltA 유전자 변이 도입의 여부는 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 염기서열을 분석함으로써 균주 내 gltA 변이가 도입 되었음을 확인하였다. 제작된 CJL8100_gltA_M312I를 CA13-8104로 명명하고 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korean CultureCenter of Microorganisms, KCCM)에 2019년 12월 20일자로 기탁하여 기탁번호 KCCM12649P를 부여 받았다.
상기 제작된 CA13-8104 균주의 류신 생산능을 평가하였다. 실시예 2와 같은 방식으로 플라스크 배양을 진행하였고 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 류신 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 하기 표 4와 같다.
균주명 류신 (g/L)
ATCC13032 0.87
ATCC13032_leuA_(R558H, G561D) : CJL-8100 2.7
CJL8100_gltA_M312I : CA13-8104 3.0
상기 표 4에 나타난 바와 같이, 류신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJL8100은 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 비해 류신 생산능이 상당히 향상됨을 확인하였다. 류신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJL8100 균주 내 gltA M312I 변이를 도입한 CJL8104 균주는 모균주 CJL8100 대비 류신 생산능이 10 % 향상됨을 확인하였다.
또한, 류신 생산 균주인 CJL-8100에 실시예 1-2에서 제작된 pTOPO-gltA-라이브러리 중 pTOPO-gltA(mt)3142를 전기천공법으로 형질전환한 후, 카나마이신 25mg/L를 함유한 배지에서 상기 벡터가 형질전환된 균주를 선별하였다. 선별된 균주는 CJL8100/pTOPO_gltA(mt)3142로 명명하였다.
상기 제작된 CJL8100/pTOPO_gltA(mt)3142 균주의 류신 생산능을 평가하였다. 실시예 2와 같은 방식으로 플라스크 배양을 진행하였고 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 류신 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 하기 표 5와 같다.
균주명 류신 (g/L)
CJL8100 2.6
CJL8100/pTOPO_gltA(mt)3142 2.8
상기 실시예의 결과를 통해, 시트레이트 신타아제인 gltA의 아미노산 서열 중 상기 312 번째 위치의 아미노산이 gltA 효소 활성에 중요한 위치임을 확인할 수 있다.
실시예 5: gltA 변이주(M312I)가 도입된 CJ3P 균주 제작 및 리신 생산량 분석
L-리신을 생산하는 코리네박테리움 글루타미쿰에 속하는 균주에서도 시트레이트 신타아제 활성 변화의 효과가 있는지를 확인하기 위하여, 야생주에 3종의 변이[pyc(P458S), hom(V59A), lysC(T311I)]를 도입하여 L-리신 생산능을 갖게된 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P(Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40)를 대상으로, 실시예 3과 같은 방법으로 gltA(M312I) 변이가 도입된 균주를 제작하였다. 상기 제작된 균주는 CJ3P::gltA(M312I)으로 명명하였다. 대조군인 CJ3P균주와 CJ3P::gltA(M312I)를 아래와 같은 방법으로 리신 생산량을 측정하였다. 먼저, 종 배지 25 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ml을 함유하는 250 ml 코너-바플 플라스크에 1 ml의 종 배양액을 접종하고 32℃에서 72 시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다. 배양 종료 후 HPLC(Waters 2478)를 이용하여 L-리신의 농도를 측정하고 이를 표 6에 나타내었다.
<종배지 (pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 100 g, (NH4)2SO4 40 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준).
균주명 리신 (g/L)
CJ3P 8.8
CJ3P::gltA(M312I) 11.2
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 리신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CJ3P 균주 내 gltA(M312I) 변이를 도입한 CJ3P::gltA(M312I) 균주는 모균주 대비 리신 생산량이 127% 향상됨을 확인하였다.
실시예 6: 발린 생산주에서 gltA 선별 변이의 발린 생산능 확인
류신과 같은 대표적인 분지쇄아미노산 발린에 대하여도 선별된 변이가 효과를 나타내는지를 확인하고자 코리네박테리움 속 발린 생산 균주 KCCM11201P(US 8465962 B2)에도 선별한 변이를 도입하여 발린 생산능을 확인하는 실험을 진행하였다.
KCCM11201P를 상기 실시예 3-1에서 제작한 pDC-gltA(M312I)벡터로 형질전환하고 상동성 서열의 재조합에 의해 염색체 상에 벡터가 삽입된 균주는 카나마이신 25mg/L를 함유한 배지에서 선별하였다. 선별된 1차 균주는 다시 2차 교차를 거쳐, 목표 유전자의 변이가 도입된 균주를 선정하였다. 최종 형질전환된 균주의 gltA 유전자 변이 도입의 여부는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 염기서열을 분석함으로써 균주내 gltA 변이가 도입되었음을 확인하였다. 제작된 균주를 KCCM11201P -gltA(M312I)로 명명 하였다.
상기 제작된 KCCM11201P -gltA(M312I) 균주의 발린 생산능을 평가하였다. 실시예 2-2와 같은 방식으로 플라스크 배양을 진행하였고 배양 종료 후 HPLC를 이용한 방법에 의해 발린 생산량을 측정하였으며, 배양 결과는 하기 표 7과 같다.
균주명 발린 (g/L)
KCCM11201P -gltA(M312I) 2.6
KCCM11201P -gltA(M312I) 2.8
상기 표 7에 나타난 바와 같이, 발린 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11201P 균주 내 gltA M312I 변이를 도입한 KCCM11201P -gltA(M312I) 균주는 모균주인 KCCM11201P 대비 발린 생산능이 7 % 향상됨을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 시트레이트 신타아제인 gltA의 아미노산 서열 중 상기 312 번째 위치의 아미노산이 gltA 효소 활성에 중요한 위치임을 확인할 수 있다.
실시예 7: 이소류신 생산주에서 gltA 선별 변이의 L-이소류신 생산능 확인
7-1. L-이소류신 생산 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P 에서의 gltA(M312I) ORF 변이가 도입된 L-이소류신 균주의 제작 및 L-이소류신 생산능 평가
상기 실시예 4와 동일한 방법으로 L-이소류신 생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM11248P(대한민국 등록특허 제 10-1335789호)에 실시예 3-1에서 제작한 재조합 플라스미드 pDC-gltA(M312I)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 도입된 균주를 제작하고 각각 KCCM11248P::gltA(M312I)라 명명하였다. 제작된 균주를 아래와 같은 방법으로 배양하여 이소류신 생산능을 비교하였다.
종 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 각 균주들을 접종하고, 30℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1 ㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 48시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.
<종 배지(pH 7.0)>
포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH2PO4 4 g, K2HPO4 8 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 2000 ㎍ (증류수 1 리터 기준)
<생산배지 (pH 7.0)>
포도당 50 g, (NH4)2SO4 12.5 g, 대두 단백질 2.5 g, 옥수수 침지 고형분(Corn Steep Solids) 5 g, 요소 3 g, KH2PO4 1 g, MgSO4·7H2O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 염산염 1000 ㎍, 칼슘-판토텐산 2000 ㎍, 니코틴아미드 3000 ㎍, CaCO3 30 g (증류수 1리터 기준)
배양종료 후 HPLC로 L-이소류신의 생산능을 측정하였다. 실험한 각 균주에 대한 배양액 중의 L-이소류신 농도는 하기 표 8과 같다.
균주명 L-이소류신 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 KCCM11248P 1.2 1.6 1.4 1.4
실험군 KCCM11248P-gltA(M312I) 2.0 1.8 1.8 1.9
상기 표 8에서 나타난 바와 같이 L-이소류신 생산 균주 KCCM11248P에 비하여 gltA(M312I) 변이가 도입된 KCCM11248P::gltA(M312I)에서는 L-이소류신의 농도가 약 36% 증가함을 확인하였다. 이를 통해 gltA(M312I) 유전자의 변이를 통해서 L-이소류신의 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.
상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-이소류신 생산 균주에서 gltA(M312I)변이의 도입이 L-이소류신 생산에 효과적임을 나타낸다.
7-2. 코리네박테리움 글루타미쿰 야생주 ATCC13032에서의 gltA(M312I) ORF 변이가 도입된 L-이소류신 균주의 제작 및 L-이소류신 생산능 평가
gltA(M312I) 변이 도입이 L-이소류신 생산능에 미치는 효과를 확인하고자 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032(이하 WT) 균주 기반으로 lysC(L377K) 변이체(대한민국 특허 제 10-2011994호)와 hom(R407H) 변이체(US 10662450 B2)를 도입하여 균주를 제작하고, 기 공지된 쓰레오닌 디하이드라타제(L-threonine dehydratase)를 코딩하는 유전자에 ilvA(V323A) 변이(Appl. Enviro. Microbiol., Dec. 1995, p.4315-4320)를 도입하여 L-이소류신 생산능을 비교하였다.
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 15 및 16 혹은 서열번호 17 및 18 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 9와 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
15 lysC up F tcctctagaGCTGCGCAGTGTTGAATACG
16 lysC up R TGGAAATCttTTCGATGTTCACGTTGACAT
17 lysC down F ACATCGAAaaGATTTCCACCTCTGAGATTC
18 lysC down R gactctagaGTTCACCTCAGAGACGATTA
PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 lysC 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 509 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 520 bp의 DNA 단편을 각각 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 15 및 18의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 377번째 루신이 리신으로 치환된 아스파토키나제 변이체를 암호화하는 lysC 유전자의 변이를 포함하는 1011 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(한국 등록특허 제0924065호)와 1011 bp의 DNA 단편들을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-lysC(L377K)라 명명하였다.
위에서 획득한 pDZ-lysC(L377K) 벡터를 WT 균주에 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999, 52:541-545))으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 교차를 거쳐, 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주인 WT::lysC(L377K)를 획득하였다. 뉴클레오티드 변이가 도입된 유전자는 서열번호 15 과 18의 프라이머를 이용한 PCR을 후 시퀀싱을 통해 야생형 lysC 유전자의 서열과 비교를 통하여 최종 확인하였다.
또한 hom(R407H)가 도입된 벡터를 제작하기 위하여 WT 게놈 DNA를 주형으로 서열번호 19와 20, 서열번호 21과 22의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 사용된 프라이머의 서열은 하기 표 10과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
19 hom up F tcctctagaCTGGTCGCCTGATGTTCTAC
20 hom up R CACGATCAGATGTGCATCATCAT
21 hom down F ATGATGATGCACATCTGATCGTG
22 hom down R gactctagaTTAGTCCCTTTCGAGGCGGA
PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 hom 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 220 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 220 bp의 DNA 단편을 수득하였다. 이 두 개의 PCR product를 주형으로 서열번호 5와 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, hom 유전자의 변이를 포함하는 440 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
앞서 사용된 pDZ 벡터와 440 bp의 DNA 단편을 제한효소 XbaI으로 처리한 뒤, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pDZ-hom(R407H)라 명명하였다.
획득한 pDZ-hom(R407H) 벡터를 WT::lysC(L377K) 균주에 전기펄스법으로 도입한 후 카나마이신 25mg/L를 함유한 선별배지에서 형질전환 균주를 획득하였다. 2차 재조합과정(cross-over)으로 염색체상에 삽입된 DNA 단편에 의하여 hom 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 균주, WT::lysC(L377K)-hom(R407H)를 획득하였다.
상기 실시예와 동일한 방법으로 WT::lysC(L377K)-hom(R407H) 균주에 실시예 3-1에서 제작한 재조합 플라스미드 pDC-gltA(M312I)를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 도입된 균주를 제작하고 WT::lysC(L377K)-hom(R407H)-gltA(M312I)라 명명하였다.
ilvA 유전자를 대상으로 기 공지된 ilvA(V323A) 변이가 도입된 벡터를 제작하기 위하여 변이 위치를 중심으로 5' 상단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 23 및 24)과 3' 하단 부위를 증폭하기 위한 프라이머 한쌍(서열번호 25 및 26)을 고안하였다. 서열번호 23 및 26의 프라이머는 각 말단에 BamHI 제한 효소 부위(밑줄로 표시)를 삽입하였고, 서열번호 24 및 25의 프라이머는 서로 교차되도록 고안한 부위에 뉴클레오티드 치환 변이(밑줄로 표시)가 위치하도록 하였다. 상기 프라이머의 서열은 하기 표 11과 같았다
서열번호 명칭 서열(5'→3')
23 ilvA V323A up F ACGGATCCCAGACTCCAAAGCAAAAGCG
24 ilvA V323A up R ACACCACGgCAGAACCAGGTGCAAAGGACA
25 ilvA V323A down F CTGGTTCTGcCGTGGTGTGCATCATCTCTG
26 ilvA V323A down R ACGGATCCAACCAAACTTGCTCACACTC
WT의 염색체를 주형으로 하여 서열번호 23 및 서열번호 24, 서열번호 25 및 서열번호 26의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 30초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과 ilvA 유전자의 변이를 중심으로 5' 상단 부위의 627 bp DNA 단편과 3' 하단 부위의 608 bp의 DNA 단편을 수득하였다.
증폭된 두 가지의 DNA 절편을 주형으로 하여, 서열번호 23 및 서열번호 26의 프라이머로 PCR을 수행하였다. 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 55℃ 30초 어닐링, 72℃ 60초 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 수행하였다. 그 결과, 323번째 발린이 알라닌으로 치환된 IlvA 변이체를 암호화하는 ilvA 유전자의 변이를 포함하는 1217 bp의 DNA 단편이 증폭되었다.
pECCG117(대한민국 등록특허 제10-0057684호) 벡터와 1011 bp의 DNA 단편을 제한 효소 BamHI으로 처리하고, DNA 접합 효소를 이용하여 연결한 후, 클로닝함으로써 플라스미드를 획득하였고 이를 pECCG117- ilvA(V323A)라 명명하였다.
pECCG117-ilvA(V323A)벡터를 위 실시예의 ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)- gltA(M312I) 에 도입된 균주를 제작하였다. 또한 이의 대조군으로 ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)에 ilvA(V323A) 변이만 도입된 균주도 제작하였다.
상기에서 제작한 균주를 실시예 4-1에 나타낸 플라스크 배양법과 동일한 방법으로 배양하여 배양액 중의 L-이소류신 농도를 분석하고, 그 결과를 하기 표 12에 나타내었다.
균주명 L-이소류신 (g/L)
배치 1 배치 2 배치 3 평균
대조군 ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A) 4.4 4.5 4.3 4.4
실험군 ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)- gltA(M312I)/pECCG117-ilvA(V323A) 6.3 6.7 5.9 6.3
상기 표 12에서 나타난 바와 같이 야생형 균주 ATCC13032::-hom(R407H)-lysC(L377K)/pECCG117-ilvA(V323A)에 비하여 gltA(M312I) 변이가 도입된 ATCC13032::hom(R407H)-lysC(L377K)- gltA(M312I)/pECCG117-ilvA(V323A)에서는 L-이소류신의 농도가 약 43% 증가함을 확인하였다.
상기의 결과는 코리네박테리움 속 L-이소류신 생산 균주에서 gltA(M312I) 변이의 도입이 L-이소류신 생산에 효과적임을 나타낸다
실시예 8: 향상된 O-아세틸 호모세린 생산능을 가지는 균주 제작 및 O-아세틸 호모세린 생산능 평가
gltA(M312I)변이 도입에 의한 O-아세틸-호모세린의 생산에 미치는 영향을 파악하기 위해 O-아세틸-호모세린 분해 경로인 시스타치오닌 감마-신타제를 암호화하는 metB 유전자와 O-아세틸호모세린 (티올)-라이아제를 암호화하는 metY 유전자를 결손하고 O-아세틸-호모세린 생합성을 증대하기 위하여 아스파토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자(서열번호 11)에 lysC 유전자의 L-리신(L-Lysine) 및 L-쓰레오닌(L-Threonine)에 대한 피드백 저해 해제를 위한 변이(L377K)(US 10662450 B2)를 도입하여 O-아세틸-호모세린 생산 균주를 제작하였다.
먼저 metB 유전자를 결손하기 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸 호모세린 분해경로의 시스타치오닌 감마 신타제(cystathionine gamma-synthase)를 코딩하는 metB 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)에서 metB 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 Ncgl2360, 서열번호 27)를 확보하고, 이에 근거하여 metB 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 28 및 29), C-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 30 및 31)를 합성하였다. 프라이머 서열은 하기 표 13과 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 28 metB_N_del F TCTAGACGCCCGCATACTGGCTTC
서열번호 29 metB_N_del R CCCATCCACTAAACTTAAACAGATGTGATCGCCCGGC
서열번호 30 metB_C_del F TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGGAAGAACCACCCAGGCC
서열번호 31 metB_C_del R GTCGACCAATCGTCCAGAGGGCG
ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 28 및 29, 서열번호 30 및 31의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 53℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, metB 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함한 558bp의 증폭된 유전자와 metB 유전자의 C-말단 부분과 링커 부분을 포함한 527bp의 증폭된 유전자를 각각 획득하였다.
상기에서 획득한, 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서 60초 변성, 50℃에서 60초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 10회 반복 후 서열번호 2 및 5를 첨가하고 중합반응을 20회 더 반복하였다. 그 결과 metB 유전자의 N-말단-링커-C-말단을 포함하는 1064bp의 불활성화 카세트를 획득하였다. 상기 PCR을 통하여 획득한 PCR 단편 말단에 포함된 제한효소 XbaI, SalI을 처리하고, 제한효소 XbaI, SalI가 처리된 pDZ(US 9109242 B2) 벡터에 접합(ligation)하여 클로닝함으로써 최종적으로 metB 불활성화 카세트가 클로닝된 pDZ-△metB 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-△metB 벡터를 ATCC13032에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metB 유전자가 불활성화된 ATCC13032 △metB을 수득하였다. 불활성화된 metB 유전자는 서열번호 28과 31의 프라이머를 이용한 PCR 후 metB 유전자가 불활성화되지 않은 ATCC13032와 비교하여 최종 확인하였다.
O-아세틸-호모세린의 또 하나의 분해경로인 metY 유전자를 결손하기 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 한 PCR을 통하여, O-아세틸 호모세린 분해경로의 O-아세틸 호모세린 티올 리아제(O-acetylhomoserine (thiol)-lyase)를 코딩하는 metY 유전자를 확보하였다. 미국 국립 보건원의 유전자은행(NIH GenBank)에서 metY 유전자의 염기서열 정보(NCBI 등록번호 Ncgl0625, 서열번호 32)를 확보하고, 이에 근거하여 metY 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 33 및 34), C-말단 부분과 링커 부분을 포함하는 프라이머(서열번호 35 및 36)를 합성하였다. 프라이머 서열은 하기 표 14와 같다.
서열번호 명칭 서열(5'→3')
서열번호 33 metY_N_del F TCTAGACCATCCTGCACCATTTAG
서열번호 34 metY_N_del R CCCATCCACTAAACTTAAACACGCTCCTGCCAGGTTC
서열번호 35 metY_C_del F TGTTTAAGTTTAGTGGATGGGCTTGGTACGCAACCAAGG
서열번호 36 metY_C_del R GTCGACGATTGCTCCGGCTTCGG
ATCC13032의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 상기 서열번호 33 및 34, 서열번호 35 및 36의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. 중합효소는 PfuUltraTM 고-신뢰 DNA 폴리머라제(Stratagene)를 사용하였으며, PCR 조건은 96℃에서 30초 변성, 53℃에서 30초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 30회 반복하였다. 그 결과, metY 유전자의 N-말단 부분과 링커 부분을 포함한 548bp의 증폭된 유전자와 metY 유전자의 C-말단 부분과 링커 부분을 포함한 550bp의 증폭된 유전자를 획득하였다. 상기에 획득한 증폭된 두 유전자를 주형으로 하여 PCR을 수행하였으며, PCR 조건은 96℃에서 60초 변성, 50℃에서 60초 어닐링 및 72℃에서 1분 중합을 10회 반복 후 서열번호 33 및 34를 첨가하고 중합반응을 20회 더 반복하였다. 그 결과 metY 유전자의 N-말단-링커-C-말단을 포함하는 1077bp의 불활성화 카세트를 획득하였다. 상기 PCR을 통하여 획득한 PCR 단편 말단에 포함된 제한효소 XbaI, SalI을 처리하고, 제한효소 XbaI, SalI가 처리된 pDZ(US 9109242 B2) 벡터에 접합(ligation)하여 클로닝함으로써 최종적으로 metY 불활성화 카세트가 클로닝된 pDZ-△metY 재조합 벡터를 제작하였다.
제작된 pDZ-△metY벡터를 ATCC13032 △metB 균주에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 metY 유전자가 불활성화된 ATCC13032 △metB △metY을 수득하였다. 불활성화된 metY 유전자는 서열번호 7과 10의 프라이머를 이용한 PCR 후 metY 유전자가 불활성화되지 않은 ATCC13032와 비교하여 최종 확인하였다.
O-아세틸 호모세린 생성 증대를 위하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 유래의 아스파토키나아제를 코딩하는 lysC 유전자(서열번호 11)에 lysC 유전자의 L-리신(L-Lysine) 및 L-쓰레오닌(L-Threonine)에 대한 피드백 저해 해제를 위한 변이(L377K)(US 10662450 B2)를 도입하기 위해 상기 실시예 7-2에서 제작된 pDZ-lysC(L377K) 벡터를 ATCC13032 △metB △metY 균주에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 lysC 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K)을 수득하였다. 뉴클레오티드 변이가 도입된 유전자는 서열번호 15 과 18의 프라이머를 이용한 PCR을 후 시퀀싱을 통해 야생형 lysC 유전자의 서열과 비교를 통하여 최종 확인하였다.
상기 실시예 3-1에서 제작한 pDC-gltA(M312I) 벡터를 ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K) 균주에 전기펄스법으로 형질전환하고, 2차 교차 과정을 거쳐 염색체 상에서 gltA 유전자에 뉴클레오티드 변이가 도입된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K) gltA(M312I)을 수득하였다. 최종 형질전환된 균주의 gltA 유전자 변이 도입의 여부는 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행한 후 염기서열을 분석함으로써 균주 내 변이가 도입되었음을 확인하였다.
상기에 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K)와 ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K) gltA(M312I) 균주들의 O-아세틸 호모세린 생산능을 비교하고자 아래와 같은 방법으로 배양하여 배양액 중 O-아세틸 호모세린를 분석하였다.
하기의 배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 균주를 1백금이(inoculation loop) 접종하고, 37℃에서 20 시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. HPLC를 이용하여 O-아세틸 호모세린 농도를 분석하였으며, 분석된 농도는 하기 표 15와 같았다.
L-O-아세틸호모세린 생산배지(pH 7.2)
포도당 30 g, KH2PO4 2 g, 요소 3 g, (NH4)2SO4 40 g, 펩톤 2.5 g, CSL(Sigma) 5 g(10 ml), MgSO4.7H2O 0.5 g, 메티오닌 400 mg, CaCO3 20 g (증류수 1 리터 기준)
균주명 O-AH (g/L)
ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K) 0.70
ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K) gltA(M312I) 0.92
상기 표 15의 결과에서 나타낸 바와 같이 gltA(M312I) 변이를 도입한 ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K) gltA(M312I) 균주는 ATCC13032 △metB △metY lysC(L377K) 균주 대비 O-아세틸-L-호모세린 생산능이 31% 향상되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 결과를 통해, 시트레이트 신타아제인 gltA의 아미노산 서열 중 상기 312 번째 위치의 아미노산이 gltA 효소 활성에 중요한 위치임을 확인할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Figure PCTKR2020010243-appb-I000001

Claims (14)

  1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제(citrate synthase) 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 상기 312번째 위치에 상응하는 아미노산은 이소류신 (isoleucine)으로 치환된, 변이형 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상, 100% 미만의 서열 상동성을 가지는, 변이형 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 변이형 폴리펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 변이형 폴리펩티드.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제5항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 미생물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 L-아미노산은 류신, 리신, 발린, 이소류신 및 O-아세틸 호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 미생물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 미생물은 코리네박테리움 속(Corynebacterium sp.)인, L-아미노산을 생산하는 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 코리네박테리움 속 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)인, L-아미노산을 생산하는 미생물.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는 미생물을 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, L-아미노산 생산 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 방법은 배양된 배지 또는 미생물에서 L-아미노산을 회수하는 단계를 추가로 포함하는 것인, L-아미노산 생산 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 상기 L-아미노산은 류신, 리신, 발린, 이소류신 및 O-아세틸 호모세린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, L-아미노산 생산 방법.
  14. 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 폴리펩티드의 N-말단으로부터 312번째 위치에 상응하는 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된, 시트레이트 신타아제 활성을 가지는 변이형 폴리펩티드, 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 포함하는, L-아미노산을 생산하는 미생물의 L-아미노산의 생산용도.
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