WO2022202985A1 - ペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物 - Google Patents

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WO2022202985A1
WO2022202985A1 PCT/JP2022/013912 JP2022013912W WO2022202985A1 WO 2022202985 A1 WO2022202985 A1 WO 2022202985A1 JP 2022013912 W JP2022013912 W JP 2022013912W WO 2022202985 A1 WO2022202985 A1 WO 2022202985A1
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WO
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peptide
present technology
amino acid
test
acid sequence
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PCT/JP2022/013912
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French (fr)
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耕作 大日向
暉 藤井
創 中田
昌樹 栗本
浩 越智
Original Assignee
森永乳業株式会社
国立大学法人京都大学
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Publication date
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    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention relates to peptides and compositions containing the peptides as active ingredients.
  • Patent Document 1 discloses peptides in which hydrophobic amino acids are adjacent to tyrosine, phenylalanine, tryptophan, or histidine as peptides having anxiolytic effects.
  • Patent Document 2 describes (i) amino acid sequence LSSTQAQQSY, (ii) amino acid sequence LSSTQAQQSW, or (iii) amino acid sequence as peptides for improving or treating low motivation, depression or depressive mood disorders or symptoms based on them. Peptides consisting of any of the sequences LSSTQAQQSF are disclosed.
  • the main purpose of the present technology is to provide a peptide having various actions, which can be easily ingested on a daily basis and has few side effects, and a composition containing the peptide as an active ingredient.
  • a peptide consisting of the following amino acid sequence (a) or (b) is provided.
  • the present technology also provides a composition containing the peptide as an active ingredient.
  • the composition according to the present technology may be food or drink.
  • a composition according to the present technology may be a pharmaceutical.
  • the composition according to the present technology may be used to treat, prevent and/or improve depression, bipolar disorder, schizophrenia, anxiety, or sleep disorders.
  • the peptide NLPPLT has excellent anti-anxiety effects, sleep-improving effects, anti-depressive effects, and improving effects on learning disorders and/or memory disorders
  • various An active peptide and a composition containing the peptide as an active ingredient can be provided. Note that the effects described here are not necessarily limited, and may be any of the effects described in this specification.
  • the peptide according to the present technology has an amino acid sequence (SEQ ID NO: 1) represented by Asn-Leu-Pro-Pro-Leu-Thr.
  • Asn (N) indicates an L-asparagine residue
  • Leu (L) an L-leucine residue
  • Pro (P) an L-proline residue
  • Thr (T) an L-threonine residue.
  • the peptide according to the present technology has an amino acid string in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1. In this case, the number of amino acids to be substituted, deleted or added is preferably 2 or less.
  • the peptide according to the present technology has one or more actions selected from anxiolytic action, sleep improvement action, antidepressant action, and action for improving learning impairment and/or memory impairment.
  • a single amino acid may be substituted, deleted, or added.
  • the peptide according to the present technology may be a salt of peptide NLPPLT. Examples of the salts include alkali metals such as potassium and sodium; alkaline earth metals such as calcium and magnesium;
  • Examples of methods for producing peptide NLPPLT include, but are not limited to, the following methods. Specifically, for example, a protein or peptide containing an amino acid sequence represented by Asn-Leu-Pro-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO: 1) is decomposed by hydrolysis or the like, and separated from the resulting decomposed product.
  • Method of obtaining by purification Method of synthesizing peptide NLPPLT by a peptide chemical synthesis method and then separating and purifying peptide NLPPLT from the resulting synthetic product; Plants and animals that produce peptide NLPPLT and peptides containing the same and a method of extracting from microorganisms and separating and purifying from the obtained extract.
  • Peptides according to the present technology can be produced, for example, by appropriately hydrolyzing proteins such as whey proteins with acids, alkalis, enzymes, or the like.
  • a method for obtaining the peptide NLPPLT by hydrolyzing the raw material protein with a hydrolase is exemplified below.
  • the protein is dissolved, dispersed or suspended in water before hydrolyzing the raw material protein with an enzyme.
  • the raw material protein is not particularly limited as long as it is a protein containing the peptide according to the present technology in its structure and can produce the peptide according to the present technology when appropriately digested with a hydrolase.
  • the protein include those derived from animals, plants, and microorganisms, and in the present technology, whey protein, which is available in large quantities, is preferred.
  • the whey protein may be a commercially available product, or a whey protein concentrate, a whey protein isolate, or a whey protein isolate separated and purified from whey protein by a conventional method (e.g., ultrafiltration, ion exchange method, etc.).
  • whey protein and whey eg, whey powder, desalted whey powder, etc.
  • the treatment method differs depending on the properties of the raw material protein. If the raw material protein is soluble, the raw material protein may be dispersed in water or warm water and dissolved. The protein may be homogenized by mixing and stirring.
  • an alkaline agent or an acid agent may be added to the solution containing the protein to adjust the pH. This pH is preferably adjusted to or near the optimum pH for the hydrolase to be used.
  • the alkali agent or acid agent is not particularly limited, and those acceptable for pharmaceuticals or food and drink may be used.
  • alkaline agents include hydroxides such as sodium hydroxide and calcium hydroxide; carbonates such as potassium carbonate; and these may be alkali metal salts or alkaline earth metal salts.
  • acid agents include inorganic acids such as hydrochloric acid and phosphoric acid; and organic acids such as citric acid, acetic acid and formic acid. In the present technology, one or more of these can be used as appropriate.
  • it is preferable to sterilize the solution containing the protein by heating at 70 to 90° C. for about 15 seconds to 10 minutes from the viewpoint of preventing spoilage due to contamination with various bacteria.
  • a predetermined amount of hydrolase is added to the solution containing the protein and reacted at a temperature of about 10 to 85° C. for 0.1 to 48 hours to obtain a hydrolyzate.
  • the solution is maintained at an appropriate temperature, for example, 30 to 60° C., preferably 45 to 55° C., depending on the type of enzyme, to initiate protein hydrolysis. do.
  • the reaction may be continued until the desired decomposition rate is reached while monitoring the decomposition rate of the enzymatic reaction.
  • the hydrolase reaction is terminated, for example, by deactivating the enzyme in the hydrolyzate, and can be performed by a conventional heat deactivation treatment.
  • the heating temperature and holding time of the heat deactivation treatment can be appropriately set in consideration of the thermal stability of the enzyme used, and the conditions that can be sufficiently deactivated can be set as appropriate.
  • the temperature range is 80 to 130 ° C. for 30 minutes. Hold times of ⁇ 2 seconds can be performed.
  • the hydrolase is not particularly limited, it is preferably an enzyme that can hydrolyze the raw material protein to generate the peptide according to the present technology. Moreover, you may use a hydrolase individually or in combination of 2 or more types. When using two or more enzymes, each enzymatic reaction may be carried out simultaneously or separately. Specifically, it is preferable to use endopeptidase, trypsin, and papain in combination as the enzymes that can be generated, and it is more preferable to use a mixture of these three types of enzymes.
  • endopeptidase examples include those derived from microorganisms and animals, and specific examples include protease derived from Bacillus subtilus and protease derived from animal pancreas.
  • Commercially available products can be used as the protease.
  • commercially available proteases include Bacillus-derived proteases such as Protease N Amano (manufactured by Amano Enzymes), Bioplase SP-20 (manufactured by Nagase & Co.), and Neutrase (manufactured by Novozymes Japan); Animal pancreas-derived proteases such as OS (manufactured by Novozymes Japan) and the like can be mentioned.
  • Examples of the trypsin include PTN6.0S (manufactured by Novozymes Japan) and the like, and examples of the papain include papain W-40 (manufactured by Amano Enzymes) and purified papain (manufactured by Mitsubishi Chemical). etc.
  • the decomposition rate of the raw material protein is calculated by measuring the total nitrogen content of the sample by the Kjeldahl method, measuring the formol nitrogen content of the sample by the formol titration method, and calculating the decomposition rate from these measured values by the following formula (1 ).
  • peptides according to the present technology it is preferable to isolate or purify the peptide according to the present technology from the hydrolyzate.
  • Purification of peptides according to the present technology can be performed by the same techniques as those usually used for oligopeptide purification, such as ion-exchange chromatography, adsorption chromatography, reversed-phase chromatography, partition chromatography, and gel filtration chromatography.
  • Various chromatographic methods such as solvent precipitation, salting out, and partitioning between two liquid phases can be appropriately combined.
  • the fraction containing the target substance can be determined using the aforementioned various actions as indicators. Also, the active components of those fractions can be identified by mass spectrometry.
  • Peptides according to the present technology can also be produced by chemical synthesis.
  • Chemical synthesis of peptides according to the present technology can be performed by a liquid-phase method or a solid-phase method that is commonly used for synthesis of oligopeptides.
  • the synthesized peptide is deprotected, if necessary, and unreacted reagents, by-products, etc. are removed to isolate the peptide according to the present technology.
  • Synthesis of such peptides can be performed, for example, using a commercially available peptide synthesizer or the like.
  • Obtaining the peptide of interest should be confirmed by using as an index any one or more actions selected from anxiolytic action, sleep improving action, antidepressant action, and improving action on learning and/or memory impairment. can be done.
  • Peptide NLPPLT has an anti-anxiety effect as shown in Test Example 1 described later, and also has an effect via activation of serotonin 5-HT 1A receptor as shown in Test Example 2 described later, thus improving sleep. also has an effect. In addition, as shown in Test Example 3 below, it also has an antidepressant effect.
  • the serotonin 5-HT 1A receptor is the most widely expressed of the various serotonin receptors and is involved in behaviors such as sleep, feeding, thermoregulation and anxiety. Therefore, it is conventionally known that activation of this serotonin 5-HT 1A receptor produces one or more actions selected from anxiolytic action, sleep improving action and antidepressant action. Therefore, the peptide according to the present technology can be used for anti-anxiety, sleep improvement, or anti-depression.
  • the peptides according to the present technology can prevent, ameliorate, or treat various diseases and symptoms associated with serotonin 5-HT 1A receptors. Therefore, the peptide according to the present technology is used for methods of preventing, ameliorating and/or treating diseases and symptoms associated with serotonin 5-HT 1A receptors by ingesting or administering to animals including humans. can be used as an active ingredient.
  • the term "improvement” refers to amelioration of a disease, symptom or condition; prevention or delay of worsening of a disease, symptom or condition; reversal, prevention or delay of progression of a disease or symptom; means preventing or delaying the onset of a disease or condition in an applicable subject, reducing the risk of a disease or symptom in an applicable subject, or maintaining health.
  • Various diseases and symptoms associated with the serotonin 5-HT 1A receptor include, for example, depression, bipolar disorder, schizophrenia, anxiety neurosis, and sleep disorders.
  • the peptide NLPPLT has an action mediated by AMPA receptor activation.
  • AMPA receptors are a kind of glutamate receptors, are widely distributed in the central nervous system, and are known to be greatly involved in memory and learning. Therefore, it is conventionally known that activation of the AMPA receptor not only produces an antidepressant effect but also an ameliorating effect on learning impairment and/or memory impairment. Therefore, the peptide according to the present technology can be used not only for anti-anxiety, sleep improvement, or anti-depression, but also for improving learning disorders and/or memory disorders.
  • non-therapeutic purpose is a concept that does not include medical practice, that is, treatment of the human body by treatment, and includes, for example, beauty practices and health promotion.
  • compositions also provides a composition containing the aforementioned peptide according to the present technology as an active ingredient.
  • the composition according to the present technology can be used as pharmaceuticals such as formulations, food and drink, feed, and the like.
  • the peptide according to the present technology can be used for producing these various compositions.
  • composition according to the present technology may be used in combination with any component, if necessary, in addition to the peptide according to the present technology.
  • ingredients that are allowed in pharmaceuticals, food and drink, feeds, and the like can be used as appropriate.
  • composition according to the present technology when used in pharmaceuticals, it can be prepared by adding the peptide according to the present technology to known pharmaceuticals, or new pharmaceuticals can be produced by mixing the peptides into raw materials for pharmaceuticals. can also In addition, when the peptide according to the present technology is used for pharmaceuticals, it may be used as it is, after being concentrated, or after being processed into a solid, liquid, granule, or powder form.
  • the drug can be appropriately formulated into a desired dosage form according to an administration method such as oral administration or parenteral administration.
  • the dosage form is not particularly limited, but in the case of oral administration, for example, solid preparations such as powders, granules, tablets, troches, and capsules; liquid preparations such as solutions, syrups, suspensions, emulsions, etc. can be
  • parenteral administration for example, it can be formulated into suppositories, sprays, inhalants, ointments, patches, injections, and the like.
  • formulation can be suitably implemented by a well-known method according to a dosage form.
  • a pharmaceutical carrier When formulating, it may be formulated by adding a pharmaceutical carrier as appropriate.
  • ingredients such as excipients, pH adjusters, colorants, and corrigents that are usually used for formulation can be used.
  • ingredients having known or future therapeutic, preventive and/or ameliorative effects on diseases and symptoms can also be used in combination.
  • organic or inorganic carriers can be used as pharmaceutical carriers depending on the dosage form.
  • carriers for solid preparations include excipients, binders, disintegrants, lubricants, stabilizers, flavoring agents and the like.
  • Excipients include, for example, sugar derivatives such as lactose, sucrose, glucose, mannitol, sorbitol; starch derivatives such as corn starch, potato starch, ⁇ -starch, dextrin, carboxymethyl starch; crystalline cellulose, hydroxypropyl cellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, carboxymethylcellulose, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose calcium; gum arabic; dextran; pullulan; silicate derivatives such as light silicic anhydride, synthetic aluminum silicate, and magnesium aluminometasilicate; phosphate derivatives such as calcium phosphate; carbonate derivatives such as calcium; sulfate derivatives such as calcium sulfate;
  • binders examples include gelatin; polyvinylpyrrolidone; macrogol, etc., in addition to the above excipients.
  • disintegrants include, in addition to the above excipients, chemically modified starch or cellulose derivatives such as croscarmellose sodium, carboxymethyl starch sodium, and crosslinked polyvinylpyrrolidone.
  • Lubricants include, for example, talc; stearic acid; metal stearates such as calcium stearate and magnesium stearate; colloidal silica; waxes such as pea gum and gairou; ; carboxylic acid sodium salts such as sodium benzoate; sulfates such as sodium sulfate; leucine; lauryl sulfates such as sodium lauryl sulfate and magnesium lauryl sulfate; silicic acid anhydride and silicic acid hydrate; be done.
  • stabilizers include paraoxybenzoic acid esters such as methylparaben and propylparaben; alcohols such as chlorobutanol, benzyl alcohol and phenylethyl alcohol; benzalkonium chloride; acetic anhydride; and sorbic acid.
  • Flavoring agents include, for example, sweeteners, acidulants, flavoring agents, and the like.
  • the carrier used includes a solvent such as water, a flavoring agent, and the like.
  • the peptide according to the present technology can be added to a known food or drink, or a new food or drink can be prepared by mixing the peptide with the ingredients of the food or drink. You can also manufacture products. Moreover, when the peptide according to the present technology is used in food and drink, it may be used as it is, after being concentrated, or after being processed into a solid, liquid, granule, or powder form.
  • Food and drink include tablets, liquid foods, feeds (including pets), regardless of whether they are liquid, paste, solid, or powder, as well as flour products, instant foods, processed agricultural products, and marine products.
  • Examples include processed products, processed livestock products, milk/dairy products, oils and fats, basic seasonings, compound seasonings/foods, frozen foods, confectionery, beverages, and other commercially available foods.
  • dairy products include fermented milk, milk drinks, lactic acid bacteria drinks, sweetened condensed milk, skim milk powder, sweetened milk powder, modified milk powder, cream, cheese, butter, and ice creams.
  • Wheat flour products include, for example, bread, macaroni, spaghetti, noodles, cake mixes, fried chicken flour, and bread crumbs.
  • instant foods include instant noodles, cup noodles, retort/cooked foods, cooked canned foods, microwave oven foods, instant soups/stews, instant miso soups/soup, canned soups, freeze-dried foods, and other instant foods. be done.
  • processed agricultural products include canned agricultural products, canned fruits, jams and marmalades, pickles, boiled beans, dried agricultural products, and cereals (processed grain products).
  • processed marine products include canned marine products, fish ham and sausages, fish paste products, marine delicacies, and tsukudani.
  • processed livestock products include canned livestock products, pastes, livestock hams, sausages, and the like.
  • Fats and oils include, for example, butter, margarines, and vegetable oils.
  • Basic seasonings include, for example, soy sauce, miso, sauces, processed tomato seasonings, mirin, and vinegars. Examples include dressings, noodle soups, spices, and other compound seasonings.
  • Frozen food includes, for example, material frozen food, half-cooked frozen food, cooked frozen food, and the like.
  • Confectionery includes, for example, caramels, candies, chewing gums, chocolates, cookies, biscuits, cakes, pies, snacks, crackers, Japanese confections, rice confections, bean confections, dessert confections, and other confectionery.
  • beverages include carbonated drinks, natural fruit juices, fruit juice drinks, soft drinks containing fruit juice, pulp drinks, fruit drinks containing fruit, vegetable drinks, soy milk, soy milk drinks, coffee drinks, tea drinks, powdered drinks, and concentrated drinks.
  • sports drinks, nutritional drinks, alcoholic beverages, and other beverages of choice include baby food, furikake, ochazuke seaweed, and the like.
  • the food and drink defined by the present technology are provided and provided as food and drink labeled with insurance uses (for example, for anti-anxiety, sleep improvement, anti-depression, learning disability and/or memory impairment improvement, etc.). can be sold.
  • insurance uses for example, for anti-anxiety, sleep improvement, anti-depression, learning disability and/or memory impairment improvement, etc.
  • the act of "display” includes all acts for informing the consumer of the above-mentioned use, and if it is an expression that can remind or analogize the above-mentioned use, the purpose of the display, the display Regardless of the content, the object or medium to be displayed, all fall under the "display" act of this technology.
  • the "indication" be expressed in such a way that the consumer can directly recognize the use.
  • the act of transferring, handing over, displaying for the purpose of transfer or delivery, importing products related to food and beverages or product packaging that describes the above-mentioned use, advertisements related to products, price lists or transaction documents Examples include the act of displaying or distributing information with the use described therein, or providing information containing such information with the use described therein by electromagnetic means (for example, the Internet, etc.).
  • the content of the display is a display approved by the government (for example, a display that is approved based on various systems established by the government and performed in a manner based on such approval).
  • a display that is approved based on various systems established by the government and performed in a manner based on such approval.
  • labeling includes health food, functional food, food for the sick, enteral nutritional food, food for special dietary uses, food with health claims, food for specified health use, food with function claims, food with nutrient function claims, and medical products. Display as an off-the-shelf item is also possible.
  • labeling approved by the Consumer Affairs Agency for example, labeling approved by the Foods for Specified Health Uses system, the Foods with Function Claims system, and similar systems can be mentioned. More specifically, labeling as food for specified health use, labeling as food for specified health use with certain conditions, labeling as food with function claims, labeling to the effect that it affects the structure and function of the body, labeling to reduce disease risk, etc. can be mentioned.
  • a typical example is labeling as a food for specified health use (especially, labeling of health use) specified in the Ordinance for Enforcement of the Health Promotion Law (Ministry of Health, Labor and Welfare Ordinance No. 86 of April 30, 2003). ), labeling as food with function claims stipulated in the Food Labeling Law (Law No. 70 of 2013) and similar labeling.
  • the words used to display the above-mentioned are only words such as "for anti-anxiety”, “for improving sleep”, “for anti-depression”, “for improving learning disorders and/or memory disorders”. It is not limited, and even if it is a word other than that, it is included in the scope of the present technology as long as it is a word that expresses an anti-anxiety effect, a sleep improvement effect, an antidepressant effect, a learning disability and / or a memory impairment improvement effect, etc. It goes without saying that Examples of such wording include indications based on various uses that make consumers aware of anti-anxiety effects, sleep-improving effects, anti-depressive effects, learning and/or memory-impairing effects, and the like. is.
  • composition according to the present technology when used in feed, it can be prepared by adding the peptide according to the present technology to a known feed, or a new feed can be produced by mixing the peptide into feed ingredients. can also In addition, when the peptide according to the present technology is used in feed, it may be used as it is, after being concentrated, or after being processed into a solid, liquid, granular or powdered form.
  • Raw materials for the feed include, for example, cereals such as corn, wheat, barley, and rye; brans such as bran, wheat bran, rice bran, and defatted rice bran; manufacturing lees such as corn gluten meal and corn jam meal; Animal feeds such as whey, fish meal, and bone meal; yeasts such as brewer's yeast; mineral feeds such as calcium phosphate and calcium carbonate; oils and fats; amino acids; Examples of the form of the feed include pet feed (for example, pet food), livestock feed, fish farm feed, and the like.
  • the content or amount of the peptide according to the present technology in the composition according to the present technology is not particularly limited. is preferred.
  • the administration or ingestion interval and the administration or ingestion period of the composition according to the present technology are not particularly limited.
  • the peptide according to the present technology is believed to be capable of preventing, improving, or treating various diseases and symptoms associated with the serotonin 5-HT 1A receptor.
  • the compositions can be used, for example, to treat, prevent and/or ameliorate depression, bipolar disorder, schizophrenia, anxiety, or sleep disorders.
  • the present technology can also employ the following configuration.
  • [1] Use of the following peptide (a) or (b) in an anti-anxiety composition.
  • anti-anxiety composition Use of the peptide of (a) or (b) above for the production of
  • [3] Use of the above peptide (a) or (b) for treatment, prevention and/or improvement of depression, bipolar disorder, schizophrenia, anxiety neurosis, or sleep disorder.
  • a method for treating, preventing and/or improving depression, bipolar disorder, schizophrenia, anxiety neurosis, or sleep disorders comprising the peptide of (a) or (b) above as an active ingredient.
  • Use of the above peptide (a) or (b) in a composition for improving learning disorders and/or memory disorders comprising the peptide of (a) or (b) above as an active ingredient.
  • Production Example 1 Production of Peptide NLPPLT by Enzymatic Degradation of Whey Protein 1 kg of a commercially available whey protein concentrate was dissolved in 9 kg of purified water and sterilized at 75° C. for 15 seconds in a plate-type sterilizer. After that, sodium hydroxide was added to adjust the pH of the solution to 9.0, and then a protease was added for hydrolysis to obtain a solution containing NLPPLT. Thereafter, the enzyme was deactivated, concentrated by a conventional method, and dried to obtain about 1 kg of powdered whey protein hydrolyzate (hereinafter referred to as "WPH”) containing the peptide NLPPLT.
  • WPH powdered whey protein hydrolyzate
  • Test Example 1 Elevated Plus Maze Test An elevated plus maze consisting of a cross where two flat plates (arms) of 25 cm ⁇ 5 cm intersect was set at a height of 50 cm from the floor.
  • One of the arms is a closed arm with a 15 cm high transparent enclosure, allowing mice to walk safely without fear of falling.
  • the other arm is an open arm without such an enclosure, and since it has an open perimeter, mice that are afraid of heights usually do not like the open arm.
  • anxiolytic treatment of mice tends to increase the time spent in open arms. Therefore, in the confirmation test of anxiolytic effects, the longer the mouse stays in the open arm or the more times the mouse enters the open arm, the higher the anxiolytic activity.
  • Test Results Table 1 below shows the test results.
  • the administration of WPH increased the time spent on the open arms and the number of times the animals entered the open arms, confirming that WPH has anxiolytic activity.
  • peptide NLPPLT Since the administration of peptide NLPPLT increased the residence time on the open arm compared to the control, it was confirmed that peptide NLPPLT has anxiolytic activity.
  • the dwell time on the open arms was reduced compared to administration of the peptide alone, at a rate comparable to the control. Became. Therefore, it was suggested that the action of the peptide NLPPLT was based on the action mediated by the activation of the serotonin 5-HT 1A receptor.
  • the peptide NLPPLT since the peptide NLPPLT has an action mediated by activation of the serotonin 5-HT 1A receptor, it is not only an anxiolytic action but also one of the actions based on the activation of the serotonin 5-HT 1A receptor. It was also suggested that it is thought to have a sleep-improving effect.
  • Test Example 2 Open field test An open field test was performed as a behavioral test used for screening anxiolytics. It utilizes the fact that administration of anxiolytics reduces the proportion of time that mice stay in the center of the field (hereinafter referred to as "staying time"). Behavior was observed for 5 minutes 30 minutes after administration.
  • a circular field consisting of a plurality of concentric circles with the same center and different radii was used. The circle closest to the center of the field is taken as the center of the field, and the time for the mouse placed in the center of the field to stay in the center of the field is measured.
  • the ratio (%) of staying time was calculated as an index of anxiolytic activity.
  • Test Results Table 4 below shows the test results.
  • peptide NLPPLT Since the administration of peptide NLPPLT increased the residence time compared to the control, it was confirmed that peptide NLPPLT has anxiolytic activity.
  • Tail Suspension Test A tail suspension test used for screening antidepressants was performed. It is thought that when a mouse is suspended by its tail and placed under conditions in which it cannot escape, it will initially try to escape and move around, but over time it will despair and become immobile. On the other hand, mice treated with antidepressants show increased escape time and decreased immobility time. That is, when the immobility time is reduced, it is evaluated as having an antidepressant effect. Behavior was observed for 6 minutes 30 minutes after administration.
  • Test Results Table 5 below shows the test results.
  • WPH has antidepressant properties, since the administration of WPH reduced the duration of immobile behavior compared to controls.
  • peptide NLPPLT Since the administration of peptide NLPPLT reduced the time of immobility manifestation compared to controls, it was confirmed that peptide NLPPLT has antidepressant properties.
  • the action of peptide NLPPLT is based on the action mediated by AMPA receptor activation.
  • AMPA receptors are known to be involved in antidepressant effects, which is consistent with the present peptide exhibiting antidepressant activity.
  • this peptide exhibits memory impairment improving action and learning impairment improving action.
  • the peptide according to the present technology can be used for anti-anxiety, sleep improvement, anti-depression, and improvement of learning and/or memory impairment.
  • a composition containing the peptide as an active ingredient is useful for reducing anxiety symptoms, reducing mental stress, treating, preventing and/or improving depression, bipolar disorder, schizophrenia, anxiety neurosis, or sleep disorders. It is possible to use it in a wide range of fields such as pharmaceuticals or food and drink for the purpose.

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Abstract

日常的に気軽に摂取可能で副作用が少ない、各種作用を有するペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物を提供すること。　下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる、ペプチドを提供する。 （ａ）配列番号１（Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ）に記載のアミノ酸配列 （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸列　また、前記ペプチドを有効成分として含有する組成物も提供する。

Description

ペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物
　本発明は、ペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物に関する。
　近年、生活環境や職場環境の多様化、人間関係の複雑化などによる種々のストレスから、現代社会に生きる人々の多くは、多くの不安感や精神的ストレスにさらされている。このような不安感や精神的ストレスに長期間さらされると、身体的健康の不調や精神障害、睡眠障害、学習障害、記憶障害などに発展することもある。このような障害を発症した場合には、副作用を有する投薬治療が長期間必要となる場合もあるため、不安感や精神的なストレスを適切に緩和する必要がある。
　しかしながら、日常的にストレスをケアするために、精神安定剤、睡眠導入剤、睡眠改善剤、抗うつ剤等の化学合成薬剤を用いることは、副作用の観点等から必ずしも適切ではない。したがって、日常的に気軽に摂取可能で副作用が少ない素材が求められている。
　ここで、特許文献１には、抗不安作用を有するペプチドとして、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン又はヒスチジンと疎水性アミノ酸が隣接しているペプチドが開示されている。また、特許文献２には、意欲低下、うつ病またはうつ的気分障害もしくはそれらに基づく症状を改善もしくは治療するペプチドとして、（ｉ）アミノ酸配列ＬＳＳＴＱＡＱＱＳＹ、（ｉｉ）アミノ酸配列ＬＳＳＴＱＡＱＱＳＷ、または（ｉｉｉ）アミノ酸配列ＬＳＳＴＱＡＱＱＳＦのいずれかからなるペプチドが開示されている。
　しかしながら、抗不安作用、睡眠改善作用、抗抑うつ作用、或いは学習障害及び／又は記憶障害の改善作用を有する素材への要求は多様であるため、依然として、新規素材への需要が存在する。
国際公開第２０１０／０８７４８０号パンフレット 国際公開第２０１６／１４０２７７号パンフレット
　したがって、本技術では、日常的に気軽に摂取可能で副作用が少ない、各種作用を有するペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物を提供することを主目的とする。
　本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、抗不安作用、睡眠改善作用、抗抑うつ作用、並びに学習障害及び／又は記憶障害改善作用を有するＡｓｎ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒのアミノ酸配列からなるペプチド（配列番号１、以下、「ペプチドＮＬＰＰＬＴ」ともいう）を見出し、本技術を完成するに至った。
　すなわち、本技術では、まず、下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる、ペプチドを提供する。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸列
　本技術に係るペプチドは、抗不安作用、睡眠改善作用、抗抑うつ作用、或いは学習障害及び／又は記憶障害改善作用を有していてよい。
　また、本技術では、前記ペプチドを有効成分として含有する組成物も提供する。
　本技術に係る組成物は、飲食品であってよい。
　本技術に係る組成物は、医薬品であってよい。この場合、本技術に係る組成物は、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安神経症、又は睡眠障害の治療、予防及び／又は改善に用いられてもよい。
　本技術では、ペプチドＮＬＰＰＬＴが優れた抗不安作用、睡眠改善作用、抗抑うつ作用、並びに学習障害及び／又は記憶障害の改善作用を有することから、日常的に気軽に摂取可能で副作用が少ない、各種作用を有するペプチド、及び該ペプチドを有効成分として含有する組成物を提供することができる。
　なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本明細書中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
　以下、本技術を実施するための好適な実施形態について説明する。
　なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
１．ペプチド
　本技術に係るペプチドは、Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列（配列番号１）を有する。本技術において、Ａｓｎ（Ｎ）はＬ－アスパラギン残基、Ｌｅｕ（Ｌ）はＬ－ロイシン残基、Ｐｒｏ（Ｐ）はＬ－プロリン残基、Ｔｈｒ（Ｔ）はＬ－トレオニン残基を示す。
　また、本技術に係るペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸列を有する。この場合、置換、欠失、又は付加されるアミノ酸の数は、２個以下であることが好ましい。
　また、本技術に係るペプチドは、抗不安作用、睡眠改善作用、抗抑うつ作用、並びに学習障害及び／又は記憶障害の改善作用から選択されるいずれか一以上の作用を有する範囲において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたものであってもよい。更に、本技術に係るペプチドは、ペプチドＮＬＰＰＬＴの塩類であってもよい。当該塩類としては、例えば、カリウム、ナトリウム等のアルカリ金属類；カルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属類等が挙げられ、このうち、適宜１種又は２種以上を用いることができる。
　ペプチドＮＬＰＰＬＴの製造方法については、例えば、以下の方法が例示されるが、これに特に限定されない。具体的には、例えば、Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒで表されるアミノ酸配列（配列番号１）を含む蛋白質やペプチドを加水分解等にて分解し、得られた分解物から分離精製して得る方法；ペプチドの化学合成方法にてペプチドＮＬＰＰＬＴを合成した後、得られた合成物からペプチドＮＬＰＰＬＴを分離精製して得る方法；ペプチドＮＬＰＰＬＴ及びこれを含むペプチド等を生産する植物、動物や微生物から抽出し、得られた抽出物から分離精製する方法等が挙げられる。
　本技術に係るペプチドは、例えば、ホエイ蛋白質等の蛋白質を、適宜、酸、アルカリや酵素等にて加水分解することで、製造することが可能である。以下、原料蛋白質を加水分解酵素で加水分解してペプチドＮＬＰＰＬＴを得る方法を例示する。
　まず、原料蛋白質を酵素で加水分解する前に、蛋白質を水に溶解、分散又は懸濁させる。
　原料蛋白質は、本技術に係るペプチドを構造上に含む蛋白質であって、適宜加水分解酵素で消化したときに本技術に係るペプチドが生成可能なものであれば、特に限定されない。前記蛋白質として、例えば、動物由来、植物由来や微生物由来のもの等が挙げられ、本技術では、これらの中でも、大量に入手可能なホエイ蛋白質が好ましい。
　前記ホエイ蛋白質は、市販品であってもよく、また、ホエイ蛋白質から常法（例えば、ウルトラフィルトレーション、イオン交換法等）により分離精製したホエイ蛋白質濃縮物、ホエイ蛋白質単離物、又はこれらのホエイ蛋白質及びホエイ等（例えば、ホエイ粉末、脱塩ホエイ粉末等）を混合し、ホエイ蛋白質の純度を調整した混合物であってもよい。
　このとき、原料蛋白質の性状により処法は異なるが、原料蛋白質が可溶性の場合には、原料蛋白質を水又は温水に分散し、溶解すればよく、また、難溶性の場合には、熱水に蛋白質を混合撹拌にてホモジナイズすればよい。
　そして、前記蛋白質を含有する溶液に、アルカリ剤又は酸剤を添加し、ｐＨを調整してもよい。このｐＨは使用する加水分解酵素の至適ｐＨ又はその付近に調整することが好ましい。
　前記アルカリ剤又は酸剤としては、特に限定されず、医薬品又は飲食品に許容されるものを使用すればよい。アルカリ剤としては、例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カルシウム等の水酸化物；炭酸カリウム等の炭酸塩などが挙げられ、これらは、アルカリ金属塩やアルカリ土類金属塩でもよい。また、酸剤としては、例えば、塩酸、リン酸等の無機酸；クエン酸、酢酸、ギ酸等の有機酸などが挙げられる。本技術では、これらのうち、適宜１種又は２種以上を用いることができる。
　また、前記蛋白質を含有する溶液を、７０～９０℃で１５秒～１０分間程度加熱殺菌することが、雑菌汚染による変敗防止の点から好ましい。
　次に、前記蛋白質を含有する溶液に、所定量の加水分解酵素を加え、温度１０～８５℃程度で０．１～４８時間反応を行い、加水分解物を得る。
　このとき、前記加水分解酵素を添加した後、当該溶液を、酵素の種類に応じて適当な温度、例えば、３０～６０℃、好ましくは４５～５５℃に保持して、蛋白質の加水分解を開始する。
　また、加水分解反応時間は、酵素反応の分解率をモニターしながら、好ましい分解率に達するまで反応を続ければよい。
　前記加水分解酵素反応の停止は、例えば、加水分解液中の酵素の失活により行われ、常法による加熱失活処理により実施することができる。加熱失活処理の加熱温度と保持時間は、使用した酵素の熱安定性を考慮し、十分に失活できる条件を適宜設定することができるが、例えば、８０～１３０℃の温度範囲で３０分間～２秒間の保持時間で行うことができる。
　前記加水分解酵素は、特に限定されないが、前記原料蛋白質を加水分解して本技術に係るペプチドを生成させ得る酵素であるのが好ましい。また、加水分解酵素は、単独で又は２種以上組み合わせて使用してもよい。２種以上の酵素を用いる場合には、それぞれの酵素反応は同時に又は別々に行ってもよい。前記生成させ得る酵素としては、具体的には、エンドペプチダーゼ、トリプシン、及びパパインを併用することが好ましく、これら３種類の酵素を混合して用いることがより好ましい。
　前記エンドペプチダーゼとしては、例えば、微生物由来や動物由来のものがあるが、具体的には、バシラス・サチリス（Bacillus subtilus）由来のプロテアーゼ、動物膵臓由来のプロテアーゼ等が挙げられる。前記プロテアーゼとしては、市販されているものを用いることができる。市販品のプロテアーゼとしては、例えば、プロテアーゼＮアマノ（天野エンザイム社製）、ビオプラーゼＳＰ－２０（長瀬産業社製）、ニュートラーゼ（ノボザイムズ・ジャパン社製）等のバチルス属細菌由来のプロテアーゼ；ＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ・ジャパン社製）等の動物膵臓由来のプロテアーゼ等が挙げられる。
　また、前記トリプシンとしては、例えば、ＰＴＮ６．０Ｓ（ノボザイムズ・ジャパン社製）等が挙げられ、前記パパインとしては、例えば、パパインＷ－４０（天野エンザイム社製）、精製パパイン（三菱ケミカル社製）等が挙げられる。
　なお、原料蛋白質の分解率の算出方法は、ケルダール法により試料の全窒素量を測定し、ホルモール滴定法により試料のホルモール態窒素量を測定し、これらの測定値から分解率を下記式（１）により算出する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　本技術では、前記加水分解液物から、本技術に係るペプチドを単離又は精製するのが好ましい。
　本技術に係るペプチドの精製は、通常、オリゴペプチドの精製に用いられているのと同様の手法、例えば、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、分配クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等の各種クロマトグラフィー、溶媒沈殿、塩析、２種の液相間での分配等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
　本技術に係るペプチドの単離又は精製に際しては、目的物質を含む画分は、前述した各種作用を指標として決定することができる。また、それらの画分の活性成分は質量分析法により同定することができる。
　また、本技術に係るペプチドは、化学合成によっても製造することができる。
　本技術に係るペプチドの化学合成は、オリゴペプチドの合成に通常用いられている液相法又は固相法によって行うことができる。合成されたペプチドは必要に応じて脱保護され、未反応試薬や副生物等を除去して、本技術に係るペプチドを単離することが可能である。
　このようなペプチドの合成は、例えば、市販のペプチド合成装置等を用いて行うことができる。目的とするペプチドが得られたことは、抗不安作用、睡眠改善作用、抗抑うつ作用、並びに学習障害及び／又は記憶障害の改善作用から選択されるいずれか一以上の作用を指標として確認することができる。
　ペプチドＮＬＰＰＬＴは、後述する試験例１に示すとおり、抗不安作用し、また、後述する試験例２に示すとおり、セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体の活性化を介した作用を有することから、睡眠改善作用をも有する。また、後述する試験例３に示すとおり、抗抑うつ作用をも有する。セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体は、種々のセロトニン受容体の中でも最も広く発現しており、睡眠、摂食、体温調節、不安などの行動に関与している。したがって、このセロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体を活性化させることで、抗不安作用、睡眠改善作用、及び抗抑うつ作用から選択されるいずれか一以上の作用が生じることは、従来公知である。このため、本技術に係るペプチドは、抗不安用、睡眠改善用、又は抗抑うつ用として用いることができる。
　加えて、本技術に係るペプチドによりセロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体に関連する各種疾患や症状の予防、改善又は治療が可能と考えられる。このため、本技術に係るペプチドは、ヒトを含む動物に摂取又は投与して、セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体に関連する疾患や症状等の予防、改善及び／又は治療を図るための方法のために、有効成分として使用することができる。
　なお、本明細書において、「改善」とは、疾患、症状又は状態の好転；疾患、症状又は状態の悪化防止、遅延；疾患又は症状の進行の逆転、防止又は遅延をいい、「予防」とは、適用対象における疾患若しくは症状の発症の防止や遅延、又は適用対象の疾患若しくは症状の危険性の低下、健康の維持をいう。
　前記セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体に関連する各種疾患や症状としては、例えば、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安神経症、又は睡眠障害等が挙げられる。
　また、ペプチドＮＬＰＰＬＴは、後述する試験例３に示すとおり、ＡＭＰＡ受容体の活性化を介した作用を有することから、本技術に係るペプチドによりＡＭＰＡ受容体に関連する各種疾患や症状の予防、改善又は治療が可能と考えられる。ＡＭＰＡ受容体は、グルタミン酸受容体の一種であり、中枢神経系に広く分布し、記憶や学習に大きく関与することが知られている。したがって、このＡＭＰＡ受容体を活性化させることで、抗抑うつ作用のみならず、学習障害及び／又は記憶障害の改善作用が生じることは、従来公知である。このため、本技術に係るペプチドは、抗不安用、睡眠改善用、又は抗抑うつ用の他、学習障害及び／又は記憶障害改善用として用いることができる。
　また、本技術に係るペプチドは、長期間摂取しても安全性が高いので、非治療目的の飲食品の含有成分にも使用することも可能である。
　なお、本明細書において、「非治療目的」とは、医療行為、すなわち、治療による人体への処置行為を含まない概念であり、例えば、美容行為、健康増進等が挙げられる。
２．組成物
　本技術では、前述した本技術に係るペプチドを有効成分として含有する組成物も提供する。本技術に係る組成物は、製剤等の医薬品、飲食品、飼料等として用いることができる。また、本技術に係るペプチドは、これら各種組成物等の製造のために用いることができる。
　本技術に係る組成物は、本技術に係るペプチドの他に、必要に応じて、任意の成分を組み合わせて使用してもよい。任意成分としては、医薬品、飲食品又は飼料等において許容される成分を適宜使用することができる。
　本技術に係る組成物を医薬品に利用する場合、公知の医薬品に本技術に係るペプチドを添加して調製することもできるし、医薬品の原料中に該ペプチドを混合して新たな医薬品を製造することもできる。
　また、本技術に係るペプチドを医薬品に利用する際には、そのまま、又は濃縮してから、或いは固体状、液体状、顆粒状又は粉末状に加工してから用いてもよい。
　前記医薬品は、経口投与や非経口投与等の投与方法に応じて、適宜、所望の剤形に製剤化することができる。その剤形は特に限定されないが、経口投与の場合、例えば、散剤、顆粒剤、錠剤、トローチ剤、カプセル剤等の固形製剤；溶液剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤等の液剤等に製剤化することができる。非経口投与の場合、例えば、座剤、噴霧剤、吸入剤、軟膏剤、貼付剤、注射剤等に製剤化することができる。本技術では、経口投与の剤形に製剤化することが好ましい。
　なお、製剤化は剤形に応じて、適宜、公知の方法により実施できる。
　製剤化に際しては、適宜、製剤担体を配合する等して製剤化してもよい。また、前記医薬品の他に、通常、製剤化に用いられている賦形剤、ｐＨ調整剤、着色剤、矯味剤等の成分を用いることができる。さらに、公知の又は将来的に見出される疾患や症状の治療、予防及び／又は改善の効果を有する成分を、適宜併用することもできる。
　製剤担体としては、剤形に応じて、各種有機又は無機の担体を用いることができる。
　固形製剤の場合の担体としては、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、安定剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
　賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、ブドウ糖、マンニット、ソルビット等の糖誘導体；トウモロコシデンプン、馬鈴薯デンプン、α－デンプン、デキストリン、カルボキシメチルデンプン等のデンプン誘導体；結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム等のセルロース誘導体；アラビアゴム；デキストラン；プルラン；軽質無水珪酸、合成珪酸アルミニウム、メタ珪酸アルミン酸マグネシウム等の珪酸塩誘導体；リン酸カルシウム等のリン酸塩誘導体；炭酸カルシウム等の炭酸塩誘導体；硫酸カルシウム等の硫酸塩誘導体等が挙げられる。
　結合剤としては、例えば、上記賦形剤の他、ゼラチン；ポリビニルピロリドン；マクロゴール等が挙げられる。
　崩壊剤としては、例えば、上記賦形剤の他、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、架橋ポリビニルピロリドン等の化学修飾されたデンプン又はセルロース誘導体等が挙げられる。
　滑沢剤としては、例えば、タルク；ステアリン酸；ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等のステアリン酸金属塩；コロイドシリカ；ピーガム、ゲイロウ等のワックス類；硼酸；グリコール；フマル酸、アジピン酸等のカルボン酸類；安息香酸ナトリウム等のカルボン酸ナトリウム塩；硫酸ナトリウム等の硫酸塩類；ロイシン；ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸マグネシウム等のラウリル硫酸塩；無水珪酸、珪酸水和物等の珪酸類；デンプン誘導体等が挙げられる。
　安定剤としては、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン等のパラオキシ安息香酸エステル類；クロロブタノール、ベンジルアルコール、フェニルエチルアルコール等のアルコール類；塩化ベンザルコニウム；無水酢酸；ソルビン酸等が挙げられる。
　矯味矯臭剤としては、例えば、甘味料、酸味料、香料等が挙げられる。
　なお、経口投与用の液剤の場合に使用する担体としては、水等の溶剤、矯味矯臭剤等が挙げられる。
　本技術に係る組成物を飲食品に利用する場合、公知の飲食品に本技術に係るペプチドを添加して調製することもできるし、飲食品の原料中に該ペプチドを混合して新たな飲食品を製造することもできる。
　また、本技術に係るペプチドを飲食品に利用する際には、そのまま、又は濃縮してから、或いは固体状、液体状、顆粒状又は粉末状に加工してから用いてもよい。
　飲食品としては、液状、ペースト状、固体、粉末等の形態を問わず、錠菓、流動食、飼料（ペット用を含む）等の他、例えば、小麦粉製品、即席食品、農産加工品、水産加工品、畜産加工品、乳・乳製品、油脂類、基礎調味料、複合調味料・食品類、冷凍食品、菓子類、飲料、これら以外の市販食品等が挙げられる。
　乳製品としては、例えば、発酵乳、乳飲料、乳酸菌飲料、加糖れん乳、脱脂粉乳、加糖粉乳、調整粉乳、クリーム、チーズ、バター、アイスクリーム類等が挙げられる。
　小麦粉製品としては、例えば、パン、マカロニ、スパゲッティ、めん類、ケーキミックス、から揚げ粉、パン粉等が挙げられる。
　即席食品類としては、例えば、即席めん、カップめん、レトルト・調理食品、調理缶詰め、電子レンジ食品、即席スープ・シチュー、即席みそ汁・吸い物、スープ缶詰め、フリーズ・ドライ食品、その他の即席食品等が挙げられる。
　農産加工品としては、例えば、農産缶詰め、果実缶詰め、ジャム・マーマレード類、漬物、煮豆類、農産乾物類、シリアル（穀物加工品）等が挙げられる。
　水産加工品としては、例えば、水産缶詰め、魚肉ハム・ソーセージ、水産練り製品、水産珍味類、つくだ煮類等が挙げられる。
　畜産加工品としては、例えば、畜産缶詰め・ペースト類、畜肉ハム・ソーセージ等が挙げられる。
　油脂類としては、例えば、バター、マーガリン類、植物油等が挙げられる。
　基礎調味料としては、例えば、しょうゆ、みそ、ソース類、トマト加工調味料、みりん類、食酢類等が挙げられ、前記複合調味料・食品類として、調理ミックス、カレーの素類、たれ類、ドレッシング類、めんつゆ類、スパイス類、その他の複合調味料等が挙げられる。
　冷凍食品としては、例えば、素材冷凍食品、半調理冷凍食品、調理済冷凍食品等が挙げられる。
　菓子類としては、例えば、キャラメル、キャンディー、チューインガム、チョコレート、クッキー、ビスケット、ケーキ、パイ、スナック、クラッカー、和菓子、米菓子、豆菓子、デザート菓子、その他の菓子等が挙げられる。
　飲料類としては、例えば、炭酸飲料、天然果汁、果汁飲料、果汁入り清涼飲料、果肉飲料、果粒入り果実飲料、野菜系飲料、豆乳、豆乳飲料、コーヒー飲料、お茶飲料、粉末飲料、濃縮飲料、スポーツ飲料、栄養飲料、アルコール飲料、その他の嗜好飲料等が挙げられる。
　前述した食品以外の市販食品としては、例えば、ベビーフード、ふりかけ、お茶漬けのり等が挙げられる。
　また、本技術で定義される飲食品は、保険用途（例えば、抗不安用、睡眠改善用、抗抑うつ用、学習障害及び／又は記憶障害改善用等）が表示された飲食品として、提供・販売されることが可能である。
　本技術において、「表示」行為には、需要者に対して前記用途を知らしめるための全ての行為が含まれ、前記用途を想起・類推させうるような表現であれば、表示の目的、表示の内容、表示する対象物・媒体等の如何に拘わらず、全て本技術の「表示」行為に該当する。
　また、「表示」は、需要者が前記用途を直接的に認識できるような表現により行われることが好ましい。具体的には、飲食品に係る商品又は商品の包装に前記用途を記載したものを譲渡し、引き渡し、譲渡若しくは引き渡しのために展示し、輸入する行為、商品に関する広告、価格表若しくは取引書類に前記用途を記載して展示し、若しくは頒布し、又はこれらを内容とする情報に前記用途を記載して電磁気的（例えば、インターネット等）方法により提供する行為等が挙げられる。
　一方、表示内容としては、行政等によって認可された表示（例えば、行政が定める各種制度に基づいて認可を受け、そのような認可に基づいた態様で行う表示等）であることが好ましい。また、そのような表示内容を、包装、容器、カタログ、パンフレット、ＰＯＰ（Point of purchase advertising）等の販売現場における宣伝材、その他の書類等へ付することが好ましい。
　また、「表示」には、健康食品、機能性食品、病者用食品、経腸栄養食品、特別用途食品、保健機能食品、特定保健用食品、機能性表示食品、栄養機能食品、医薬用部外品等としての表示も挙げられる。これら中でも特に、消費者庁によって認可される表示、例えば、特定保健用食品制度、機能性表示食品制度、これらに類似する制度にて認可される表示等が挙げられる。より具体的には、特定保健用食品としての表示、条件付き特定保健用食品としての表示、機能性表示食品としての表示、身体の構造や機能に影響を与える旨の表示、疾病リスク低減表示等を挙げることができる。この中でも典型的な例としては、健康増進法施行規則（平成１５年４月３０日日本国厚生労働省令第８６号）に定められた特定保健用食品としての表示（特に、保健の用途の表示）、食品表示法（平成２５年法律第７０号）に定められた機能性表示食品としての表示及びこれらに類する表示等が挙げられる。
　なお、前述したような表示を行うために使用する文言は、「抗不安用」、「睡眠改善用」、「抗抑うつ用」、「学習障害及び／又は記憶障害改善用」等の文言のみに限られるわけではなく、それ以外の文言であっても、抗不安効果、睡眠改善効果、抗抑うつ効果、学習障害及び／又は記憶障害改善効果等を表す文言であれば、本技術の範囲に包含されることは言うまでもない。そのような文言としては、例えば、需要者に対して、抗不安効果、睡眠改善効果、抗抑うつ効果、学習障害及び／又は記憶障害改善効果等を認識させるような種々の用途に基づく表示も可能である。
　本技術に係る組成物を飼料に利用する場合、公知の飼料に本技術に係るペプチドを添加して調製することもできるし、飼料の原料中に該ペプチドを混合して新たな飼料を製造することもできる。
　また、本技術に係るペプチドを飼料に利用する際には、そのまま、又は濃縮してから、或いは固体状、液体状、顆粒状又は粉末状に加工してから用いてもよい。
　前記飼料の原料としては、例えば、トウモロコシ、小麦、大麦、ライ麦等の穀類；ふすま、麦糠、米糠、脱脂米糠等の糠類；コーングルテンミール、コーンジャムミール等の製造粕類；脱脂粉乳、ホエイ、魚粉、骨粉等の動物性飼料類；ビール酵母等の酵母類；リン酸カルシウム、炭酸カルシウム等の鉱物質飼料；油脂類；アミノ酸類；糖類等が挙げられる。
　前記飼料の形態としては、例えば、愛玩動物用飼料（例えば、ペットフード等）、家畜飼料、養魚飼料等が挙げられる。
　本技術に係る組成物中の本技術に係るペプチドの含量又は使用量は特に制限されないが、抗不安効果又は睡眠改善効果が効率的に得られる範囲であって、無理なく摂取できる程度に含有することが好ましい。
　また、本技術に係る組成物の投与又は摂取間隔、投与又は摂取期間も、特に限定されない。
　前述の通り、本技術に係るペプチドは、セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体に関連する各種疾患や症状の予防、改善又は治療が可能であると考えられるため、これを有効成分とする本技術に係る組成物は、例えば、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安神経症、又は睡眠障害の治療、予防及び／又は改善に用いることができる。
本技術では、以下の構成を採用することも可能である。
〔１〕抗不安用組成物への、下記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸列
〔２〕抗不安用組成物の製造のための、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔３〕うつ病、双極性障害、統合失調症、不安神経症、又は睡眠障害の治療、予防及び／又は改善のための、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔４〕上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを有効成分とする、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安神経症、又は睡眠障害の治療、予防及び／又は改善方法。
〔５〕睡眠改善用組成物への、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔６〕睡眠改善用組成物の製造のための、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔７〕抗抑うつ用組成物への、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔８〕抗抑うつ用組成物の製造のための、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔９〕学習障害及び／又は記憶障害の改善用組成物への、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔１０〕学習障害及び／又は記憶障害の改善用組成物の製造のための、上記（ａ）又は（ｂ）のペプチドの使用。
〔１１〕下記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを用いた、不安、睡眠障害、抑うつ、学習障害、及び記憶障害からなる群より選ばれるいずれか１種以上の治療、予防及び／又は改善方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸列
〔１２〕下記（ａ）又は（ｂ）のペプチドを用いた、うつ病、双極性障害、統合失調症、及び不安神経症からなる群より選ばれるいずれか１種以上の疾患の治療、予防及び／又は改善方法。
（ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
（ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸列
　以下、実施例に基づいて本技術を更に詳細に説明する。
　なお、以下に説明する実施例は、本技術の代表的な実施例の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。
製造例１：ホエイ蛋白質の酵素分解によるペプチドＮＬＰＰＬＴの製造
　市販のホエイ蛋白質濃縮物１ｋｇを９ｋｇの精製水に溶解し、プレート型殺菌装置にて７５℃で１５秒間殺菌した。その後、水酸化ナトリウムを添加して溶液のｐＨを９．０に調整した後、たんぱく質分解酵素を添加して加水分解をして、ＮＬＰＰＬＴを含む溶液を得た。その後、酵素を失活させ、常法により濃縮し、乾燥し、ペプチドＮＬＰＰＬＴを含有する粉末状の乳清蛋白質分解物（以下、「ＷＰＨ」とする）約１ｋｇ得た。
製造例２：ペプチドＮＬＰＰＬＴの化学合成
　ＮＬＰＰＬＴはＦ－ｍｏｃ法により化学合成した。脱保護後に逆相ＨＰＬＣ（Waters 1525）で精製、凍結乾燥した。得られたペプチドはＬＣＭＳで分子量が合致していること
を確認した。
試験例１：高架式十字迷路試験
　２５ｃｍ×５ｃｍの２つの平板（アーム）が交差する十字路からなる高架式十字迷路を床から５０ｃｍの高さに設置した。アームの一方は、高さ１５ｃｍの透明の囲いがあるクローズドアームであり、マウスは落下の不安を感じることなく安全に歩行する事ができる。もう一方のアームは、このような囲いのないオープンアームであり、周囲が開放されているため、高い場所を怖がるマウスは通常オープンアームを好まない。しかしながら、マウスへの抗不安処置によりオープンアームでの滞在時間が長くなる傾向がある。したがって、抗不安作用の確認試験においては、オープンアームでのマウスの滞在時間が長いほど、あるいは進入回数が多いほど抗不安活性が高くなる。
＜１＞ＷＰＨ投与による試験
　本願発明者らは、まず、製造例１で調製したＷＰＨに関して、試験を行った。
＜１－１＞試験方法
　雄性ｄｄｙマウスに試験の３０分前に製造例１で調整したＷＰＨを体重１ｋｇ当たり１０ｍｇ、３０ｍｇ、又は１００ｍｇとなる用量でそれぞれ投与し、その３０分後にオープンアームとクローズドアームが交差する中央プラットフォーム上にマウスを置いて試験を行った（ＷＰＨ投与群、ｎ＝６）。開始後５分間、オープンアーム上にマウスが滞在した累積時間（time in open arms）、オープンアームに進入した回数（visit to open arms）、いずれかのアームに進入した回数の総数（total visits）を記録した。
　また、コントロールとして、試験物質である前記ＷＰＨを投与しない雄性ｄｄｙマウスでも同様の試験を実施した（コントロール群、ｎ＝６）。
　得られた結果から、抗不安活性の指標としてオープンアーム上の滞在時間の割合（％）、及びオープンアームに進入した回数の割合（％）を算出し、ｔ検定により統計学的有意差を検証した。
＜１－２＞試験結果
　下記表１に試験結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＷＰＨの投与によって、コントロールに比較して、オープンアーム上の滞在時間、及びオープンアームに進入した回数が増加したことから、ＷＰＨには、抗不安活性があることが確認された。
＜２＞ペプチドＮＬＰＰＬＴ投与による試験
　本発明者らは、前記＜１＞の結果から、前記ＷＰＨに含まれるペプチドＮＬＰＰＬＴに着目し、該ペプチドについても試験を行った。
＜２－１＞試験方法
　雄性ｄｄｙマウスに試験の３０分前に製造例２で合成したペプチドＮＬＰＰＬＴを体重１ｋｇ当たり３μｇ又は１０μｇとなる用量で投与し、その３０分後にオープンアームとクローズドアームが交差する中央プラットフォーム上にマウスを置いて試験を行った（ペプチドＮＬＰＰＬＴ投与群、ｎ＝６）。開始後５分間、オープンアーム上にマウスが滞在した累積時間（time in open arms）、オープンアームに進入した回数（visit to open arms）、いずれかのアームに進入した回数の総数（total visits）を記録した。
　また、コントロールとして、試験物質である前記ペプチドを投与しない雄性ｄｄｙマウスでも同様の試験を実施した（コントロール群、ｎ＝６）。
　更に、作用機序検討のため、製造例２で合成したペプチドＮＬＰＰＬＴ１０μｇ／ｋｇ体重に加えて、セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体のアンタゴニストＷＡＹ１００１３５（Tocris Bioscience社製）を１０ｍｇ／ｋｇ経口投与した雄性ｄｄｙマウスでも同様の試験を実施した（ペプチドＮＬＰＰＬＴ＋セロトニンアンタゴニスト投与群、ｎ＝５）。
　得られた結果から、抗不安活性の指標としてオープンアーム上の滞在時間の割合（％）、オープンアームに進入した回数の割合（％）を算出し、Tukey-Kramer法により統計学的有意差を検証した。
＜２－２＞試験結果
　下記表２及び表３に試験結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ペプチドＮＬＰＰＬＴの投与によって、コントロールに比較して、オープンアーム上の滞在時間が増加したことから、ペプチドＮＬＰＰＬＴには、抗不安活性があることが確認された。
　その一方で、ペプチドＮＬＰＰＬＴとセロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体のアンタゴニストを同時に投与した場合には、オープンアーム上の滞在時間が、ペプチド単独での投与に比較して低下し、コントロールと同程度の割合になった。したがって、ペプチドＮＬＰＰＬＴによる作用は、セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体の活性化を介した作用に基づくものであることが示唆された。
　また、ペプチドＮＬＰＰＬＴは、セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体の活性化を介した作用を有することから、抗不安作用のみならず、セロトニン５－ＨＴ１Ａ受容体の活性化に基づく作用の一つである睡眠改善作用をも有すると考えられることも示唆された。
試験例２：オープンフィールド試験
　抗不安薬のスクリーニングに用いられる行動試験としてオープンフィールド試験を実施した。抗不安薬投与によりマウスがフィールドの中央に滞在する時間（以下、「滞在時間」と記す）の割合が低下することを利用する。投与３０分後に５分間行動を観察した。なお、このオープンフィールド試験では、中心を同一とし半径が異なる複数の同心円からなる円形のフィールドを利用した。フィールドのうち最も中心側の円をフィールドの中央とし、このフィールドの中央に置かれたマウスが、フィールドの中央に滞在する時間が測定される。
＜１＞ペプチドＮＬＰＰＬＴ投与による試験
　本願発明者らは、ペプチドＮＬＰＰＬＴに着目して試験を行った。
＜２＞試験方法
　雄性ｄｄｙマウスに試験の３０分前に製造例２で合成したペプチドＮＬＰＰＬＴを体重１ｋｇ当たり１０μｇ、３０μｇ、又は１００μｇとなる用量でそれぞれ投与し、その３０分後にマウスをフィールドの中央に置いて試験を行った（ペプチドＮＬＰＰＬＴ投与群、ｎ＝５）。開始後５分間、滞在時間を記録した。
　また、コントロールとして、試験物質である前記ペプチドを投与しない雄性ｄｄｙマウスでも同様の試験を実施した（コントロール群、ｎ＝５－６）。
　得られた結果から、抗不安活性の指標として滞在時間の割合（％）を算出した。
＜３＞試験結果
　下記表４に試験結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　ペプチドＮＬＰＰＬＴの投与によって、コントロールに比較して、滞在時間が増加したことから、ペプチドＮＬＰＰＬＴには、抗不安活性があることが確認された。
試験例３：尾懸垂試験
　抗うつ薬のスクリーニングに用いられる尾懸垂試験を実施した。マウスの尾を固定して吊り下げ、逃避不可能な条件下に置くと、初めは逃避を試みて動き回るが、時間が経つにうれて絶望し動かなくなると考えられる。一方、抗うつ薬を処置したマウスでは逃避行動時間が増加し無動時間が減少する。すなわち、無動時間が減少した際に、抗抑うつ効果ありと評価する。投与３０分後に６分間行動を観察した。
＜１＞ＷＰＨ投与による試験
　本願発明者らは、まず、製造例１で調整したＷＰＨに関して、試験を行った。
＜１－１＞試験方法
　雄性ｄｄｙマウスに試験の３０分前に製造例１で合成したＷＰＨを体重１ｋｇ当たり１ｍｇ、１０ｍｇ又は１００ｍｇとなる用量でそれぞれ投与し、その３０分後にマウスの尾を固定して吊り上げ、試験を行った（ＷＰＨ投与群、ｎ＝９－１１）。開始後６分間、無動行動の発現時間を記録した。
　また、コントロールとして、試験物質である前記ペプチドを投与しない雄性ｄｄｙマウスでも同様の試験を実施した（コントロール群、ｎ＝９－１１）。
　得られた結果から、抗抑うつ性の指標として無動行動の発現時間（秒）を算出した。
＜１－２＞試験結果
　下記表５に試験結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＷＰＨの投与によって、コントロールに比較して、無動行動の発現時間が減少したことから、ＷＰＨには、抗抑うつ性があることが確認された。
＜２＞ペプチドＮＬＰＰＬＴ投与による試験
　本願発明者らは、ペプチドＮＬＰＰＬＴに着目して試験を行った。
＜２－１＞試験方法
　雄性ｄｄｙマウスに試験の３０分前に製造例２で合成したペプチドＮＬＰＰＬＴを体重１ｋｇ当たり１０μｇ、又は３０μｇとなる用量でそれぞれ投与し、その３０分後にマウスの尾を固定して吊り上げ、試験を行った（ペプチドＮＬＰＰＬＴ投与群、ｎ＝５－６）。開始後６分間、無動行動の発現時間を記録した。
　また、コントロールとして、試験物質である前記ペプチドを投与しない雄性ｄｄｙマウスでも同様の試験を実施した（コントロール群、ｎ＝５－６）。
　更に、作用機序検討のため、製造例２で合成したペプチドＮＬＰＰＬＴ１０μｇ／ｋｇ体重に加えて、ＡＭＰＡ受容体のアンタゴニストNBQX（Cayman chemical社製）を１０ｍｇ／ｋｇ経口投与した雄性ｄｄｙマウスでも同様の試験を実施した（ペプチドＮＬＰＰＬＴ＋ＡＭＰＡ受容体アンタゴニスト投与群、ｎ＝１０－１２）。
　得られた結果から、抗抑うつ性の指標として無動行動の発現時間（秒）を算出した。
＜２－２＞試験結果
　下記表６に試験結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　ペプチドＮＬＰＰＬＴの投与によって、コントロールに比較して、無動行動の発現時間が減少したことから、ペプチドＮＬＰＰＬＴには、抗抑うつ性があることが確認された。
　また、ＡＭＰＡ受容体アンタゴニストを使用した試験の結果は、下記表７のとおりとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　ペプチドＮＬＰＰＬＴとＡＭＰＡ受容体のアンタゴニストを同時に投与した場合には、無動行動の発現時間が、ペプチド単独での投与に比較して有意に増加した。したがって、ペプチドＮＬＰＰＬＴによる作用は、ＡＭＰＡ受容体の活性化を介した作用に基づくものであることが示唆された。ＡＭＰＡ受容体は抗うつ効果に関与することが知られており、本ペプチドが抗うつ作用を示すことと合致している。また、ＡＭＰＡ受容体は、記憶障害、及び学習障害にも関与することが知られていることから、本ペプチドが記憶障害改善作用、及び学習障害改善作用を示すことも示唆された。
　本技術に係るペプチドは、抗不安用、睡眠改善用、抗抑うつ用、並びに学習障害及び／又は記憶障害改善用として用いることができる。また、該ペプチドを有効成分として含有する組成物は、不安症状、精神的ストレスの低減、うつ病、双極性障害、統合失調症、不安神経症、又は睡眠障害の治療、予防及び／又は改善のための医薬品又は飲食品等の広範な分野で利用することが可能である。

Claims (9)

  1. 　下記（ａ）又は（ｂ）のアミノ酸配列からなる、ペプチド。
    （ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列
    （ｂ）配列番号１に記載のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、又は付加されたアミノ酸列
  2. 　抗不安作用を有する、請求項１に記載のペプチド。
  3. 　睡眠改善作用を有する、請求項１に記載のペプチド。
  4. 　抗抑うつ作用を有する、請求項１に記載のペプチド。
  5. 　学習障害及び／又は記憶障害の改善作用を有する、請求項１に記載のペプチド。
  6. 　請求項１から５のいずれか一項に記載のペプチドを有効成分として含有する組成物。
  7. 　前記組成物が飲食品である、請求項６に記載の組成物。
  8. 　前記組成物が医薬品である、請求項６に記載の組成物。
  9. 　うつ病、双極性障害、統合失調症、不安神経症、又は睡眠障害の治療、予防及び／又は改善に用いられる、請求項８に記載の組成物。
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